JPH0753104B2 - 細菌の培養法 - Google Patents

細菌の培養法

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JPH0753104B2 JP1046818A JP4681889A JPH0753104B2 JP H0753104 B2 JPH0753104 B2 JP H0753104B2 JP 1046818 A JP1046818 A JP 1046818A JP 4681889 A JP4681889 A JP 4681889A JP H0753104 B2 JPH0753104 B2 JP H0753104B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性の高いロドコッカ
ス属ロドクロウス種の菌体を高収量で生産する方法に関
する。
近年、微生物、酵素またはそれらを固定化して種々の単
位化学反応や複合化学反応の触媒として利用しようとす
る動きが盛んになってきている。
ニトリルヒドラターゼはニトリル類を水和して相当する
アミド類を生成させる酵素として、本発明者の中の山田
らにより見出されており〔Agric.Biol.Chem.46 1165(1
982)参照〕、その具体的利用例としてニトリルヒドラ
ターゼを有する細菌を用いてニトリル類からアミド類を
製造する方法が提案されている〔特公昭59−37951号公
報参照〕。
さらに、本発明者らは先に、本発明のロドコッカス属ロ
ドクロウス種の細菌を用いた、特に芳香続ニトリル類か
らのアミド類の製造に適した、アミド類の製造方法を提
案している〔特願昭63−231744号明細書参照〕。このよ
うな場合に、ニトリルヒドラターゼ活性の高いロドコッ
カス属ロドクロウス種の細菌菌体が高収率で取得できれ
ば裨益するところは大きい。
〔発明の概要〕
要旨 本発明は上記の点に解決を与えることを目的とし、該細
菌の培養に際して、培地中に特定の物質、すなわち特定
の尿素誘導体およびコバルトイオン、を存在させること
によって、この目的を達成しようとするものである。
従って、本発明によるニトリルヒドラターゼ活性の高い
ロドコッカス属ロドクロウス種の細菌の培養方法は、ロ
ドコッカス属ロドグロウス種(Rhodococcus rhodochrou
s)に属してニトリルヒドラターゼを産生する能力を有
する細菌を培養してニトリルヒドラターゼ酵素活性を有
する細菌菌体を製造するに際し、クロトンアミドを含ま
ない培地中に下記IまたはII式で示される尿素誘導体の
少なくとも1種およびコバルトイオンを存在させるこ
と、を特徴とするものである。
R1R2NCONR3R4 〔I〕 (ここでR1、R2、R3およびR4は、それぞれ−H、−C
H3、または−C2H5基を表す。ただし、すべてが−Hであ
る場合を除く。) R5R6NCOOC2H5 〔II〕 (ここでR5およびR6は、それぞれ−H、−CH3、または
−C2H5基を表す。) 効 果 クロトンアミドを含まない培地中に式IまたはII式で示
される特定の尿素誘導体の少なくとも1種およびコバル
トイオンを存在させてロドコッカス属ロドクロウス種の
細菌の培養を行なうと、単位培養液当りのニトリルヒド
ラターゼ活性が極めて顕著に増大する。
この単位培養液当りのニトリルヒドラターゼ活性の増大
は、菌体の濃度(すなわち、菌体の収量)および(また
は)菌体の活性(すなわち、菌体内のニトリルヒドラタ
ーゼの量)の増大に因るものと解される。
本発明において、尿素誘導体およびコバルトイオンの存
在は特に後者に有効である。
〔発明の具体的説明〕
1.ロドコッカス属ロドクロウス種細菌 本発明において使用する細菌は、ニトリルヒドラターゼ
活性を有し、ニトリル、特に芳香属ニトリル、を水和し
て対応アミドを生成させることができるロドコッカス属
ロドクロウス種の細菌である。具体的には、例えば、前
記特願昭63−231744号明細書に記載のロドコッカス・ロ
ドクロウスJ−1株(Rhodococcus rhodochrous J−
1)微工研条寄第1478号(FERM BP−1478)を挙げるこ
とができる。この菌の詳細は、前記特願昭63−231744号
明細書に記載されていて、具体的には下記の通りであ
る。
(1)由来および寄託 J−1株は、本発明者らが京都市左京区の土壌から採取
したものであって、昭和62年9月18日に工業技術院微生
物工業技術研究所に寄託されて、FERM BP−1478号の受
託番号を得ている。
(2)菌学的性質 (a)形態 (1)細胞の形および大きさ 0.9〜1.0μ×3〜10μ (2)細胞の多形性の有無 培養初期に長桿状を呈し、
棍棒状で湾曲なくスナッピングを伴った発育を示し、の
ちに短桿菌状に断裂する (3)運動性 なし (4)胞子の有無 なし (5)グラム染色性 陽性 (6)抗酸性 陰性 (7)異染小体 認められる (b)各培地における生育状態(30℃) (1)肉汁寒天平板培養 直径1mm(48時間)円形、不
規則、平滑で表面乾き気味、扁平、不透明、淡オレンジ
ピンク色 (2)肉汁寒天斜面培養 糸状、表面平滑、断面はやや
***状で乾き気味、淡オレンジピンク色 (3)肉汁液体培養 菌膜を形成し、旺盛に発育する。
生育するにしたがって、中程度の濁り、沈澱を生ずる。
(4)肉汁ゼラチン穿刺培養 表面に良く生育、穿刺部
にそってロート状に発育するが、下層部にはほとんど発
育しない。ゼラチンは、液化は認められない。
(5)リトマスミルク 変化しない (c)生理学的性質 (1)硫酸塩の還元 陽性 (2)脱室反応 陰性 (3)MRテスト 陰性 (4)VPテスト 陰性 (5)インドールの生成 陽性 (6)硫化水素の生成 陽性 (7)デンプンの加水分解 陰性 (8)クエン酸の利用 コーサーの培地:陰性 クリステンセンの培地:陽性 (9)無機窒素源の利用 硝酸塩:陽性 アンモニウム塩:陽性 (10)色素の生成 陰性 (11)ウレアーゼ 陽性 (12)オキシダーゼ 陰性 (13)カタラーゼ 陽性 (14)セルロースの加水分解 陰性 (15)生育の範囲 pH:5〜10 温度:10〜41℃ (16)酸素に対する態度 好気性 (17)チロシンの分解 陽性 (18)アデニンの分解 陽性 (19)ホスファターゼ 陽性 (20)Tween80加水分解 陽性 (21)O−Fテスト 0(弱い) (22)耐熱性(10%スキムミルク中72℃、15分) なし (23)糖から酸およびガスの生成 酸の生成 ガスの生成 L−アラビノース − − D−キシロース − − D−グルコース + − D−マンノース − − D−フラクトース + − 麦芽糖 + − ショ糖 + − 乳糖 − − トレハロース − − D−ソルビット + − D−マンニット + − グリセリン + − (24)単一炭素源として生育 イノシトール − 麦芽糖 + D−マンニット + ラムノース − D−ソルビット + m−ハイドロキシ安息香酸 + アジピン酸ナトリウム + 安息香酸ナトリウム + クエン酸ナトリウム + 乳酸ナトリウム + テストテトロン + L−チロシン + グリセロール(1%)(W/V) (+) トレハロース (+) p−ハイドロキシ 安息香酸(1%)(W/V) + (+)弱いが陽性である。
(25)脂肪酸と細胞壁分析不飽和、飽和直鎖脂肪酸、お
よびツベルクロステアリン酸を含む。ミコール酸のTLC
は単一スポットを与える。
以上の菌体的性質をバージーの細菌分類書(Bergy′s M
anual of Systematic Bacteriology)(1986)に基づい
て分類すると、J−1株は、好気性、グラム陽性、弱抗
酸性、カタラーゼ陽性の内生胞子を生じない桿菌であ
り、鞭毛を着生しない。また、発育の初期過程で長桿菌
状で菌糸状を呈し、枝分れ(Branching)を伴なった発
育を示し、後に短桿菌状に断裂することよりノカルディ
ア型の細菌に属するものと認められる。
脂肪酸組成の分析は、ツベルクロスステアリン酸を含む
不飽和、飽和の直鎖脂肪酸を含む。ミコール酸のTLCは
標準菌Rodococcus rhodochrous(IFO 3338)と同じRfを
示す単一スポットを与えることから、Mycobacterium属
とは区別される。またミコール酸の組成(炭素数)から
Nocardia属とは区別される。その他生化学的諸性質の検
討から、本菌はRhodococcus rhodochousと認められる。
2.尿素誘導体 本発明において尿素誘導体は酵素誘導剤として作用する
が、本発明のようにニトリルヒドラターゼの誘導に尿素
誘導体が有効であることは、従来の知見からは全く意外
なことである。
式Iで示される化合物としては、例えばメチル尿素、エ
チル尿素、1,1−ジメチル尿素、1,3−ジメチル尿素等が
挙げられる。
式IIで示される化合物としては、例えばウレタン、メチ
ルウレタン等が挙げられる。
尿素誘導体を培地中に存在させるには、これを培地に一
時に、あるいは遂次的に添加する。「遂次的」とは、連
続的または間歇的いずれをも意味するものである。
3.コバルトイオン 上記の酵素誘導剤である尿素誘導体を培地に存在させて
もニトリルヒドラターゼは得られないので、本発明では
培地にコバルトイオンを存在させることが必須である
(本発明の細菌のニトリルヒドラターゼの産生にコバル
トイオンの存在が必須であることは、前記特願昭63−23
144号明細書に記載の通りである)。
コバルトイオンは、培地が水性であるところより、水溶
性コバルト化合物を培地に添加することによって生成さ
せることがふつうである。水溶性のコバルト化合物は化
学辞典類の明らかにするところであり、適当なものを選
択使用することは当業者にとって容易であろう。代表的
なコバルト化合物は例えばCo++またはCo+++を与えるも
の、特に、CO++を与えるもの、であって、具体的には塩
化コバルト、硫酸コバルト、酢酸コバルト、臭化コバル
ト、硼酸コバルトを例示することができる。
この他、本発明ではビタミンB12および金属コバルトも
コバルト源として使用することができる。ビタミンB12
中にはコバルトが錯体として含まれており、培養の際イ
オン化する。また、金属コバルトは培養中微生物による
酸化力でイオン化する。
4.培養/ニトリルヒドラターゼの産生 本発明のロドコッカス属ロドクロウス種細菌の培養は、
培地に尿素誘導体およびコバルトイオンを存在させると
いうことを除けば、他の条件に関してはそれが合目的的
なものである限り制限はない。
例えば、下記のような基本培地に尿素誘導体およびコバ
ルトイオンを所定量存在させて15〜50℃程度、好ましく
は20〜45℃程度、特に好ましくは30℃前後、の温度で、
pH7〜9で、約30時間以上、好ましくは40時間以上(上
限は、例えば120時間)、培養を行なえばよい。
培地中の尿素誘導体の濃度は1〜30g/リットル、好まし
くは2〜20g/リットル、より好ましくは5〜15g/リット
ル、程度およびコバルトイオンの濃度はCoCl2換算で5
〜15mg/リットル程度である。
基本培地: 培地A 成 分 量(培地1リットル中) K2HPO4 13.4g KH2PO4 6.5g NaCl 1.0g MgSO4・7H2O 0.2g ビタミン混合物*1 0.1ml 蒸溜水 残部(pH7.0) *1 組成(溶液1リットル中) ビオチン 2.0μg パントテン酸カルシウム 0.4mg イノシトール 2.0mg ニコチン酸 0.4mg 塩酸チアミン 0.4mg 塩酸ピリドキシン 0.4mg p−アミノ安息香酸 0.2ng リボフラビン 0.2mg 葉酸 0.01ng 蒸留水 残部 培地B K2HPO4 0.5g KH2PO4 0.5g MgSO4・7H2O 0.5g イーストエキス 3.0g 蒸留水 残部(pH7.2) 培地C グルコース 10g K2HPO4 0.5g KH2PO4 0.5g MgSO4・7H2O 0.5g イーストエキス 1.0g ペプトン 7.5g 蒸留水 残部(pH7.2) 5.実験例 活性の測定および定義 (1)ニトリルヒドラターゼ活性の測定法 ニトリルヒドラターゼ活性は、基質として3−シアノピ
リジン(1M)、1.0mlリン酸カリウムバッファー(0.1
M、pH7.0)0.5mlおよび所定量の菌体(培養液から分離
したもの)を含む反応混合液2mlについて、20℃で所定
時間反応を行なわせてから0.2mlの1N HC1を添加して反
応を停止させることによって測定した。
(2)活性の定義 活性は、比活性(S.A.)および全活性(T.A.)について
調べた。これらは、下記の通り定義される。
S.A.:μモル各アミド/mg−菌体・分 T.A.:μモル各アミド/ml−培地・分 実施例1 CoCl2 10mg/リットルを含む前記基本培地Cに所定量の
尿素を添加し、それぞれの培地60mlにロドコッカス・ロ
ドクロウスJ−1株(FERM BP−1478)の前培養液(前
記基本培地C使用)4mlを加えて、28℃で96時間振盪培
養を行なった。
なお、比較のため、尿素誘導体としてメチル尿素または
CoCl2のみを添加したものについても、また式[I]お
よび[II]以外の尿素誘導体としてチオ尿素およびアセ
トアミドをそれぞれ添加したものについても、素または
CoCl2のみを添加したものについても同様に培養を行な
った。
結果を表−1に示した。表−1には、その間の活性の測
定において、それぞれ最高の全活性(T.A.)が得られた
ときの数値を示した。
これより、特定の尿素誘導体およびCoCl2両者の添加が
ニトリルヒドラターゼの生産増大に必須であることが分
かる。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】ロドコッカス属ロドクロウス種(Rhodococ
    cus rhodochrous)に属してニトリルヒドラターゼを産
    生する能力を有する細菌を培養してニトリルヒドラター
    ゼ酵素活性を有する細菌菌体を製造するに際し、クロト
    ンアミドを含まない培地中に下記IまたはIIで示される
    尿素誘導体の少なくとも1種およびコバルトイオンを存
    在させることを特徴とする、ロドコッカス属ロドクロウ
    ス種の細菌の培養法。 R1R2NCONR3R4 [I] (ここでR1、R2、R3およびR4は、それぞれ−H、−C
    H3、または−C2H5基を表す。ただし、すべてが−Hであ
    る場合を除く。) R5R6NCOOC2H5 [II] (ここでR5およびR6は、それぞれ−H、−CH3、または
    −C2H5基を表す。)
  2. 【請求項2】ロドコッカス属ロドクロウス種に属してニ
    トリルヒドラターゼを産生する能力を有する細菌が、ロ
    ドコッカス属ロドクロウスJ−1株(FERM BP−1478)
    である、請求項1記載の細菌の培養法。
  3. 【請求項3】培地中の尿素誘導体の濃度が1〜30g/リッ
    トルである、請求項1〜2のいずれか1項記載の細菌の
    培養法。
  4. 【請求項4】培地中のコバルトイオンの濃度がCoCl2
    算で5〜15mg/リットルである、請求項1〜3のいずれ
    か1項記載の細菌の培養法。
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