WO2023101356A1 - 류코노스톡 메센테로이데스 cjlm119 균주 및 이의 배양물을 포함하는 식품용 발효 조성물 - Google Patents

류코노스톡 메센테로이데스 cjlm119 균주 및 이의 배양물을 포함하는 식품용 발효 조성물 Download PDF

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fermented
culture
fermented product
strain
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전경찬
정희경
최승혜
안희윤
이은용
노지은
손소현
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씨제이제일제당 (주)
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present application is fermented with a composition for fermentation comprising at least one selected from Leuconostoc mesenteroides CJLM119 strain or its culture, Leuconostoc mesenteroides CJLM119 strain culture, its lysate, It relates to a composition for enhancing immunity or improving intestinal health comprising at least one selected from extracts thereof or components derived therefrom.
  • Fermented foods refer to foods or beverages whose components are converted through the growth of specific microorganisms and the action of enzymes.
  • Beneficial bacteria including lactic acid bacteria, increase the bioavailability of nutrients by converting chemical components constituting food ingredients during the fermentation process, enhance food safety as a biological preservative, decompose toxic substances and nutritional inhibitors, and produce physiologically active substances. It has been reported (Tamang JP, et al., Front Microbiol (2016), 7, 578.).
  • Leuconostoc mesenteroides is known as a representative lactic acid bacteria involved in lactic acid fermentation of vegetables, and is found in fermented vegetables such as kimchi.
  • the present application is fermented with a composition for fermentation comprising at least one selected from Leuconostoc mesenteroides CJLM119 strain or its culture, Leuconostoc mesenteroides CJLM119 strain culture, its lysate, It provides a composition for enhancing immunity or improving intestinal health comprising at least one selected from extracts thereof or components derived therefrom.
  • One object of the present application is to provide a composition for fermentation, including any one or more selected from Leuconostoc mesenteroides CJLM119 strain or its culture.
  • Another object of the present application is to provide a food composition for enhancing immunity, including a fermented product fermented with Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain or its culture.
  • Another object of the present application is to provide a food composition for improving intestinal health, including a fermented product fermented with Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain or its culture.
  • Another object of the present application is to provide a health functional food for immune enhancement, including fermented product fermented with Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain or its culture.
  • Another object of the present application is to provide a health functional food for improving intestinal health, including fermented product fermented with Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain or its culture.
  • Another object of the present application is to provide a method for enhancing the immune enhancing effect of a composition comprising fermenting the composition with Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain or a culture thereof.
  • Another object of the present application is to provide a method for enhancing the intestinal health improvement effect of the composition, comprising the step of fermenting the composition with Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain or its culture.
  • composition of the present application has an immune enhancing effect and an intestinal health improving effect.
  • Figure 2 is a mouse immune cell J774A.1 cells Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain 5 x 10 6 cfu / mL (fermentation composition A), 10 6 cfu / mL (fermentation composition B) and 5 x 10 5 cfu /mL (fermentation composition C) and the result of confirming the cytotoxicity after treating the supernatant thereof.
  • Figure 3 is a mouse immune cell J774A.1 cells after treatment with a fermented composition containing Leuconostoc Mecenteroides CJLM119 strain or KCTC 3505 strain at 1.25 x 10 6 cfu / mL and 6.25 x 10 6 cfu / mL Cells This is the result of confirming toxicity.
  • mouse immune cells J774A.1 cells, contain Leuconostoc Mesenteroides CJLM119 strain or KCTC 3505 strain at 1.25 x 10 6 cfu/mL, 2.5 x 10 6 cfu/mL, and 5.0 x 10 6 cfu/mL This is the result of confirming the cytotoxicity after processing the fermented composition.
  • TNF- ⁇ Tumor necrosis factor- ⁇
  • Figure 6 is a result of analyzing the expression level of IL-6 (Interleukin-6) in J774A.1 cells, which are mouse immune cells, in cells treated with the fermented compositions of Preparation Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 2 ( *** p ⁇ 0.001).
  • IL-6 Interleukin-6
  • mice immune cell J774A.1 is a mouse immune cell J774A.1 cells treated with a fermentation composition containing Leuconostoc Mecenteroides CJLM119 strain at 5 x 10 6 cfu/mL, 10 6 cfu/mL and 5 x 10 5 cfu/mL This is the result of analyzing the amount of TNF- ⁇ expression ( *** p ⁇ 0.001, ** p ⁇ 0.01).
  • FIG. 8 shows mouse immune cells J774A.1 cells treated with a fermented composition containing Leuconostoc Mecenteroides CJLM119 strain at 5 x 10 6 cfu/mL, 10 6 cfu/mL and 5 x 10 5 cfu/mL This is the result of analyzing the amount of IL-6 expression ( *** p ⁇ 0.001, ** p ⁇ 0.01).
  • FIG. 9 shows mouse immune cells, J774A.1 cells, treated with a fermented composition containing 1.25 x 10 6 cfu/mL and 6.25 x 10 6 cfu/mL of Leuconostoc Mesenteroides CJLM119 strain or KCTC 3505 strain, and then treated with TNF. This is the result of analyzing the amount of - ⁇ expression ( *** p ⁇ 0.001, ## p ⁇ 0.01, # p ⁇ 0.05).
  • mouse immune cells J774A.1 cells contained Leuconostoc Mecenteroides CJLM119 strain or KCTC 3505 strain at 1.25 x 10 6 cfu/mL, 2.5 x 10 6 cfu/mL, and 5.0 x 10 6 cfu/mL. This is the result of analyzing the TNF- ⁇ expression level after treating the fermented composition ( ** p ⁇ 0.01, * p ⁇ 0.05).
  • Figure 11 shows the IL after treatment with a fermented composition containing 1.25 x 10 6 cfu / mL and 6.25 x 10 6 cfu / mL of Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain or KCTC 3505 strain in J774A.1 cells, which are mouse immune cells. -6 This is the result of analyzing the expression level ( *** p ⁇ 0.001, ## p ⁇ 0.01, # p ⁇ 0.05).
  • mouse immune cells J774A.1 cells contained Leuconostoc Mesenteroides CJLM119 strain or KCTC 3505 strain at 1.25 x 10 6 cfu/mL, 2.5 x 10 6 cfu/mL, and 5.0 x 10 6 cfu/mL. This is the result of analyzing the IL-6 expression level after processing the fermented composition ( *** p ⁇ 0.001, ** p ⁇ 0.01, * p ⁇ 0.05).
  • Leuconostoc mesenteroides Des Provides a composition for fermentation, including any one or more selected from the CJLM119 strain or its culture.
  • the strain of the present application may be a Leuconostoc sp. strain, specifically a Leuconostoc mesenteroides, and more specifically, a Leuconostoc mesenteroid deposited under accession number KCTC 13043BP Des CJLM119 strain (US Publication No. US 2019-0297908 A1).
  • culture refers to the strain obtained by culturing the strain for a certain period of time in a medium capable of supplying nutrients so that the strain of the present application can grow and survive in vitro, its metabolites, extra nutrients, etc. It may mean the entire medium including.
  • culture is a composition containing a strain, and in the present invention, the culture may be used for the same purpose as the strain.
  • the "culture” may be used interchangeably with "culture medium”, “culture supernatant”, “conditional culture medium” or "conditioned medium”.
  • the term "cultivation” means to grow the microorganisms in appropriately controlled environmental conditions.
  • the culturing process of the present application may be performed according to appropriate media and culture conditions known in the art. This culturing process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected strain.
  • the culture may be batch, continuous and fed-batch, but is not limited thereto.
  • Carbon sources included in the medium include sugars and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, and cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, and coconut oil, palmitic acid, Fatty acids such as stearic acid and linoleic acid, alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as acetic acid may be included, and these materials may be used individually or as a mixture, but are not limited thereto.
  • sugars and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, and cellulose
  • oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, and coconut oil, palmitic acid
  • Fatty acids such as stearic acid and linoleic acid
  • alcohols such as glycerol and ethanol
  • organic acids such as acetic acid
  • Nitrogen sources included in the medium include organic nitrogen sources such as peptone, yeast extract, broth, malt extract, corn steep liquor and soybean wheat, and inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate. These nitrogen sources may be used alone or in combination, but are not limited thereto.
  • Persons included in the medium may include potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, and corresponding sodium-containing salts, but are not limited thereto.
  • the medium may contain metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate, and may also contain amino acids, vitamins, and appropriate precursors. These media or precursors may be added to the culture in batches or continuously, but are not limited thereto.
  • chemicals such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid may be added to the culture in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • foaming can be suppressed by using an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the culture, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected without gas injection or to maintain the anaerobic and non-aerobic state.
  • the culture can be obtained by culturing the strain of the present application at 10 ° C to 40 ° C for 6 hours to 48 hours, for example, at 20 ° C to 40 ° C for 12 hours to 36 hours, or at 30 ° C to 40 ° C for 16 hours. It can be obtained by culturing for 24 hours.
  • the culture of the present application includes a live cell culture (ie, the result of culturing live cells in a medium), a culture obtained by killing live cells in the live cell culture, and a culture filtrate (ie, dead cells or live cells removed from the culture) product), concentrates or lyophilizates thereof may be included.
  • a live cell culture ie, the result of culturing live cells in a medium
  • a culture obtained by killing live cells in the live cell culture and a culture filtrate (ie, dead cells or live cells removed from the culture) product)
  • concentrates or lyophilizates thereof may be included.
  • the culture filtrate is obtained by leaving the culture medium still for a certain period of time and taking only the liquid of the upper layer except for the part sunk in the lower layer, removing the cells through filtration, or centrifuging the culture medium to remove the lower sediment and taking only the upper liquid can
  • the "culture filtrate” may be used interchangeably with "supernatant”.
  • the cells can be obtained by centrifuging the culture solution and taking the part that has sunk in the lower layer, or it can be obtained by leaving it for a certain period of time and then removing the upper liquid as it sinks to the lower layer of the culture medium by gravity.
  • the concentrate may be obtained by concentrating the supernatant obtained after filtering the strain culture medium itself or the culture medium using a centrifugal separation or filter.
  • the lyophilisate may be obtained by freeze-drying the strain culture medium itself or the culture medium.
  • composition for fermentation of the present application may be used in the manufacture of various fermented foods, and specifically, may be for fermenting seasonings such as garlic, red pepper powder, seasoning, etc., but is not limited thereto.
  • a food having an immune enhancing effect and/or an intestinal health improving effect can be prepared, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present application provides a food composition for enhancing immunity, including a fermented product fermented with Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain or its culture.
  • Another aspect of the present application provides a food composition for improving intestinal health, including a fermented product fermented with Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain or its culture.
  • the Leuconostoc mesenteroides CJLM119 strain and culture were as described above.
  • the food composition of the present application may include a fermented product fermented with the fermentation composition of the previous embodiment.
  • the fermented product may include a fermented product fermented with a Leuconostoc Mesenteroides CJLM119 strain or a culture thereof.
  • the fermented product may include a fermented product obtained by further fermenting the above fermented product fermented with Leuconostoc mesenteroides CJLM119 strain or its culture.
  • the food composition of the present application may include garlic fermented with the fermentation composition of the previous embodiment, red pepper powder, a nitrogen source, and the like.
  • the term “fermentation” refers to any activity or process involving enzymatic or metabolic degradation of organic matter using microorganisms.
  • the term "fermented product” refers to a product of enzymatic or metabolic decomposition caused by fermentation using microorganisms.
  • the fermented product may be liquid.
  • the fermented product may be a stock solution or a supernatant thereof, which is a product of fermentation.
  • the fermented product of the present application may include live cells.
  • the fermented product of the present application may additionally undergo fermentation.
  • the fermented product of the present application may be added to vegetables or the like for additional fermentation, or added to a liquid composition for further fermentation.
  • examples of the vegetable include, but are not limited to, Chinese cabbage and radish.
  • the fermented product of the present application may be fermented at 25 ° C to 40 ° C with at least one selected from the strain of the present application or its culture. Fermentation of the present application may be fermented for 10 hours to 30 hours with any one or more selected from the strain of the present application or its culture.
  • the temperature during fermentation of the present application is one lower limit selected from 25 ° C or higher, 27 ° C or higher, 28 ° C or higher and 29 ° C or higher and / or selected from 40 ° C or lower, 35 ° C or lower, 33 ° C or lower and 31 ° C or lower It can be implemented in a range consisting of one upper limit.
  • the time at the time of entry into force of the present application is one lower limit selected from 10 hours or more, 12 hours or more, 14 hours or more, 16 hours or more and 18 hours or more and/or 30 hours or less, 28 hours or less, 27 hours or less, 26 hours or less or less and one upper limit selected from 25 hours or less.
  • the fermented product of the present application may be a fermented composition containing at least one selected from the group consisting of garlic, red pepper powder, and a nitrogen source.
  • the fermentation target composition of the present application may be a composition containing at least one selected from the group consisting of garlic, red pepper powder, and a nitrogen source, but is not limited thereto.
  • the fermented product of the present application may be fermented by adding the strain of the present application and / or its culture to a composition containing at least one selected from the group consisting of garlic, red pepper powder, and a nitrogen source.
  • the fermented product of the present application is fermented by adding 0.5 to 4% by weight of the strain and / or its culture of the present application with respect to the total weight of the composition containing at least one selected from the group consisting of garlic, red pepper powder and nitrogen source can
  • the strain of the present application and / or its culture has a lower limit selected from 1% by weight or more, 1.2% by weight or more, 1.6% by weight or more and 1.8% by weight or more and / or 3.5% by weight or less based on the total weight of the composition. , 2.8 wt% or less, 2.6 wt% or less, and 2.2 wt% or less may be included in a range consisting of one upper limit selected.
  • the fermented product of the present application may be a fermented composition containing 4 to 10% by weight of garlic based on the total weight of the composition.
  • the fermentation target composition of the present application may be a composition containing at least one selected from the group consisting of garlic, red pepper powder, and a nitrogen source, but is not limited thereto.
  • a composition comprising at least one selected from the group consisting of garlic, red pepper powder, and a nitrogen source, which is a fermentation target of the present application may include 4 to 10% by weight of garlic based on the total weight of the composition.
  • the garlic is 4% by weight or more, 5% by weight or more, 6% by weight or more, and 6.5% by weight or more, and / or 10% by weight or less, 9% by weight or less, 8% by weight or more, based on the total weight of the composition. % or less and may be included in a range consisting of one upper limit selected from 7.5% by weight or less.
  • the garlic may be included in the composition of the present application in the form of minced garlic, extract, concentrate and powder, but is not limited thereto, and limited to commercially available garlic and products minced or processed in the form of extracts, concentrates and powders. can be used without
  • a composition containing at least one selected from the group consisting of garlic, red pepper powder, and a nitrogen source, which is a fermentation target of the present application may include red pepper powder in an amount of 0.5 to 4% by weight based on the total weight of the composition.
  • the red pepper powder is 0.5% by weight or more, 1% by weight or more, 1.2% by weight or more, 1.6% by weight or more, and 1.8% by weight or more, and / or 4% by weight or less, 3.5% by weight or more, based on the total weight of the composition. It may be included in a range consisting of one upper limit selected from % or less, 2.8% by weight or less, 2.6% by weight or less, and 2.2% by weight or less.
  • the red pepper powder may be dried and then pulverized or lyophilized to powder, but is not limited thereto, and commercially available red pepper powder may be used without limitation.
  • a composition containing at least one selected from the group consisting of garlic, red pepper powder, and a nitrogen source, which is a fermentation target of the present application may include 0.1 to 1.5% by weight of a nitrogen source based on the total weight of the composition.
  • the nitrogen source is 0.3 wt% or more, 0.6 wt% or more, 0.9 wt% or more, and 1.1 wt% or more, and/or 1.45 wt% or less, 1.4 wt% or less, 1.35 wt% or more, based on the total weight of the composition. % or less, may be included in a range consisting of one upper limit selected from 1.3% by weight or less.
  • the nitrogen source may be edible.
  • the nitrogen source may be, for example, seasoning, for example, TasteNrich ® (CJ CheilJedang), but is not limited thereto.
  • composition of the present application may include garlic.
  • the fermented product of the present application may be a fermented composition that further includes at least one selected from a carbon source or salt.
  • the composition subject to fermentation of the present application may include 2 to 4% by weight of a carbon source based on the total weight of the composition.
  • the carbon source is 2.2 wt% or more, 2.4 wt% or more, 2.6 wt% or more, and 2.8 wt% or more, and/or 3.8 wt% or less, 3.6 wt% or less, 3.4 wt% or more, based on the total weight of the composition. It may be included in a range consisting of one upper limit selected from % or less and 3.2% by weight or less.
  • the carbon source may be edible.
  • the carbon source may be, for example, fructose, sucrose, glucose, etc., for example, fructose, and specifically fructose, but is not limited thereto.
  • the composition subject to fermentation of the present application may include 0.1 to 2% by weight of salt based on the total weight of the composition.
  • the salt is 0.5% by weight or more, 0.8% by weight or more, 1% by weight or more, and 1.2% by weight or more, and / or 1.9% by weight or less, 1.8% by weight or less, 1.7% by weight or more, based on the total weight of the composition. It may be included in a range consisting of one upper limit selected from % or less and 1.6% by weight or less.
  • the fermented product of the present application may be a fermented composition further comprising ginger.
  • the fermentation target composition of the present application may include 0.1 to 1.5% by weight of ginger based on the total weight of the composition.
  • the ginger is 0.3% by weight or more, 0.6% by weight or more, 0.9% by weight or more, and 1.1% by weight or more, and / or 1.45% by weight or less, 1.4% by weight or less, 1.35% by weight or more, based on the total weight of the composition. % or less, may be included in a range consisting of one upper limit selected from 1.3% by weight or less.
  • the fermented product of the present application may be obtained by fermenting a composition further comprising water.
  • the water may be added until the total weight of the composition becomes 100% by weight after mixing all the raw materials included in the composition to be fermented in the present application.
  • the fermented product of the present application may include at least one selected from a culture of the Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain, a lysate thereof, an extract thereof, or a component derived therefrom.
  • lysate refers to a product obtained by disrupting the cell walls of microorganisms contained in the culture medium or its concentrate by chemical or physical force.
  • crushed material may be used interchangeably with the "lysed material”.
  • extract means a material obtained by removing microorganisms from the culture medium or its concentrate.
  • the component derived from the strain of the present application may include, for example, a metabolite derived from the strain, and the like, and may include a cytoplasmic fraction obtained by disrupting the microbial cell containing the metabolite derived from the strain.
  • a metabolite derived from the strain and the like, and may include a cytoplasmic fraction obtained by disrupting the microbial cell containing the metabolite derived from the strain.
  • the form of a strain suitable for inclusion in a food composition, a formulation method, and a method for separating components derived from the strain are well known to those skilled in the art.
  • the fermented product of the present application may be fermented including ingredients included in kimchi sauce (kimchi seasoning).
  • the food composition of the present application may have an immune enhancing effect.
  • the term "immune enhancement” refers to an effect of increasing an immune response in various specific or non-specific ways, and may further include an immune modulatory effect.
  • the immune enhancing effect may include, for example, defense against external pathogens by increasing the activity of macrophages, removing apoptotic cells, and increasing the secretion of immune mediators, and increasing the activity of the immune system by increasing the activity of immune modulators and generating new growth. It may include an effect of preventing immune-related diseases by inhibiting angiogenesis, increasing growth inhibitory power against pathogens, and the like.
  • the immune enhancing effect may be achieved by the immune mediator secretion enhancing effect.
  • the immune mediator may be, for example, a Th1 type pro-inflammatory cytokine, for example, TNF- ⁇ (Tumor necrosis factor- ⁇ ), IL-6 (Interleukin-6) and IL-1 ⁇ , etc. , but not limited thereto.
  • a Th1 type pro-inflammatory cytokine for example, TNF- ⁇ (Tumor necrosis factor- ⁇ ), IL-6 (Interleukin-6) and IL-1 ⁇ , etc. , but not limited thereto.
  • the composition of the present application may increase the expression of TNF- ⁇ or IL-6.
  • the food composition of the present application may have an effect of improving intestinal health.
  • the term "improvement of intestinal health” refers to the effect of maintaining the intestinal environment in a normal state by regulating the flora of beneficial and harmful bacteria in the intestine.
  • the intestinal health improvement effect may include, for example, an effect of promoting the flora of beneficial bacteria in the intestine and inhibiting the flora of harmful bacteria, and may include an effect of improving and activating the overall function of the intestine by strengthening the close junction barrier function of the intestine, , It may include an effect of increasing the content of short-chain fatty acids in the intestine, an effect of inducing proliferation of intestinal epithelial cells, and the like.
  • the "intestinal health improvement effect” may be used interchangeably with the "regulation effect”.
  • the effect of improving intestinal health may be achieved by increasing the flora of beneficial bacteria in the intestine and suppressing the flora of harmful bacteria by the effect of inhibiting the growth of harmful bacteria.
  • the food composition of the present application may have an effect of inhibiting the growth of harmful bacteria.
  • the harmful bacteria may be pathogenic microorganisms.
  • the pathogenic microorganism is not particularly limited as long as it causes a specific disease upon infection, but examples include Escherichia sp., Staphylococcus sp., Salmonella sp., Shigella genus ( Shigella sp.), Klebsiella ( Klebsiella sp.), Enterobacteriaceae sp., Pseudomonas ( Pseudomonas sp.), Moraxella ( Moraxella sp.), Helicobacter ( Helicobacter sp.), Notropomonas ( Stenotrophomonas sp.), Listeria ( Listeria sp.) and Vibrio ( Vibrio sp.) microorganisms, and the like, examples of which include Escherichia coli ( Escherichia coli ), Staphylococcus aureus ( Staphylococcus aureus ), Salmonella enteritidis , Salmonella typhi
  • the food composition of the present application may include a fermented product fermented with the fermentation composition of the previous embodiment.
  • the fermented product may include a fermented product fermented with a Leuconostoc Mesenteroides CJLM119 strain or a culture thereof.
  • the fermented product may include a fermented product obtained by further fermenting the above fermented product fermented with Leuconostoc mesenteroides CJLM119 strain or its culture. This is as described above.
  • the fermented product may be liquid.
  • the fermented product may be a stock solution or a supernatant thereof, which is a product of fermentation.
  • the fermented product may be further fermented.
  • the fermented product of the present application may be added to vegetables or the like for additional fermentation, or added to a liquid composition for further fermentation.
  • examples of the vegetable include, but are not limited to, Chinese cabbage and radish.
  • the fermented product of the present invention may include both the liquid fermented product and/or a fermented product obtained by further fermenting the liquid fermented product.
  • the additionally fermented fermented product may be a liquid or solid fermented product, but is not limited thereto.
  • the food composition of the present application may be in the form of a food additive in addition to the food composition, but is not limited thereto.
  • the food composition of the present application may additionally include food additives, and the suitability as a "food additive" is determined according to the general rules of the Food Additive Code and general test methods approved by the Korea Food and Drug Administration unless otherwise specified. It can be judged according to standards and standards.
  • Food Additives Codex examples include chemical synthetic products such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid, natural additives such as dark pigment, licorice extract, crystalline cellulose, and guar gum, L- and mixed preparations such as sodium glutamate preparations, noodle-added alkali preparations, preservative preparations, and tar color preparations.
  • Foods of the present application include drinks such as fruit drinks, vegetable drinks, carbonated drinks, soybean milk, lactic acid bacteria drinks such as yogurt, and mixed drinks; kimchi, kimchi sauce (kimchi seasoning), fermented foods; confectionery such as bread, rice cakes, dried confections, candies, chocolates, chewing gum, and jam; ice cream products such as ice creams, ice creams, and ice cream powders; Dairy products such as milk, low-fat milk, lactose-degraded milk, processed milk, goat milk, fermented milk, butter milk, concentrated milk, milk cream, butter milk, natural cheese, processed cheese, powdered milk, and whey; meat products such as processed meat products, processed egg products, and hamburgers; fish meat products such as fish cakes, ham, sausages, and processed fish products such as bacon; noodles such as ramen, dried noodles, fresh noodles, fried noodles, luxury dried noodles, improved soft noodles, frozen noodles, and pasta; seasonings such as soy sauce, soybean paste, gochujang, ch
  • the food composition of the present application includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol , carbonation agents used in carbonated beverages, and the like.
  • the food composition of the present application may include fruit flesh for preparing natural fruit juice, fruit juice beverages, and vegetable beverages. These components may be used independently or in combination.
  • Another aspect of the present application provides a health functional food for immune enhancement, including fermented product fermented with Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain or its culture.
  • Another aspect of the present application provides a health functional food for improving intestinal health, including fermented product fermented with Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain or its culture.
  • the Leuconostoc mesenteroides CJLM119 strain and culture were as described above.
  • the fermented product of the present application may be fermented for 10 hours to 30 hours at 32 ° C to 42 ° C with at least one selected from the strain of the present application or its culture, as described above.
  • the fermented product of the present application may be a fermented composition containing at least one selected from the group consisting of garlic, red pepper powder, and a nitrogen source, as described above.
  • the fermented product of the present application may be a fermented composition containing 5 to 9% by weight of garlic based on the total weight of the composition, as described above.
  • the fermented product of the present application may be a fermented composition further comprising at least one selected from a carbon source or salt, as described above.
  • the fermented product of the present application may include at least one selected from a culture of the Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain, a lysate thereof, an extract thereof, or a component derived therefrom, as described above.
  • health functional food refers to food manufactured and processed using raw materials or ingredients having functionality useful to the human body in accordance with the Health Functional Food Act (Article 3, Subparagraph 1), and "functional "” means to obtain useful effects for health purposes such as regulating nutrients for the structure and function of the human body or for physiological action (Article No. 2).
  • the health functional food of the present application may be in the form of a food additive.
  • the health functional food When using the health functional food of the present application as a food additive, the health functional food may be added as a composition or used together with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method. Active ingredients can be appropriately used depending on their purpose of use (prevention or improvement).
  • the health functional food composition of the present invention is added in an amount of 15 parts by weight or less, preferably 10 parts by weight or less, based on the raw material.
  • the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount above the above range.
  • the health functional food may further include a food additive, as described above.
  • Another aspect of the present application provides a feed composition for enhancing immunity, including a fermented product of Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain or a culture thereof.
  • Another aspect of the present application provides a feed composition for improving intestinal health, including a fermented product of Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain or culture thereof.
  • the Leuconostoc mesenteroides CJLM119 strain and culture were as described above.
  • the fermented product of the present application may be fermented for 10 hours to 30 hours at 32 ° C to 42 ° C with at least one selected from the strain of the present application or its culture, as described above.
  • the fermented product of the present application may be a fermented composition containing at least one selected from the group consisting of garlic, red pepper powder, and a nitrogen source, as described above.
  • the fermented product of the present application may be a fermented composition containing 5 to 9% by weight of garlic based on the total weight of the composition, as described above.
  • the fermented product of the present application may be a fermented composition further comprising at least one selected from a carbon source or salt, as described above.
  • the fermented product of the present application may include at least one selected from a culture of the Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain, a lysate thereof, an extract thereof, or a component derived therefrom, as described above.
  • the feed composition of the present application may be in the form of a feed additive composition in addition to the feed composition.
  • the composition of the present application When the composition of the present application is prepared as a feed additive, the composition may be 20 to 90% high concentration or prepared in powder or granular form.
  • the feed additives are organic acids such as citric acid, fumaric acid, adipic acid, lactic acid, and malic acid, sodium phosphate, potassium phosphate, acid pyrophosphate, polyphosphate (polyphosphate), polyphenol, catechin, alpha-tocopherol, and rosemary. extract, vitamin C, green tea extract, licorice extract, chitosan, tannic acid, phytic acid, and the like, or any one or more natural antioxidants may be further included.
  • the composition When prepared as a feed, the composition may be formulated in a conventional feed form, and may include common feed ingredients together.
  • the feed and feed additives include grains such as milled or ground wheat, oats, barley, corn and rice; vegetable protein feeds such as those based on rape, soybean, and sunflower; animal protein feed such as blood meal, meat meal, bone meal and fish meal; It may further include sugar and dairy products, for example, dry ingredients composed of various powdered milk and whey powder, etc., and may further include nutritional supplements, digestion and absorption enhancers, growth promoters, and the like.
  • the feed additive may be administered to animals alone or in combination with other feed additives in an edible carrier.
  • the feed additives can be easily administered to animals as a top dressing, directly mixed with animal feed, or in an oral formulation separate from feed.
  • a pharmaceutically acceptable edible carrier can be solid or liquid, for example corn starch, lactose, sucrose, soybean flakes, peanut oil, olive oil, sesame oil and propylene glycol.
  • the feed additive may be a tablet, capsule, powder, troche or sugar-containing tablet or top dressing in a microdispersible form.
  • the feed additive may be in the form of a gelatin soft capsule, or a syrup, suspension, emulsion, or solution formulation.
  • the feed and feed additives may contain auxiliary agents, such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifying agents, solution accelerators, and the like.
  • the feed additive may be used by adding it to an animal's feed by steeping, spraying or mixing.
  • the feed or feed additive of the present application can be applied to a number of animal diets including mammals, poultry and fish.
  • the mammal it can be used for pigs, cows, horses, sheep, rabbits, goats, rats, hamsters, and guinea pigs, which are rodents and laboratory rodents, as well as companion animals (eg, dogs and cats), and as the poultry, chickens, It can also be used for turkeys, ducks, geese, pheasants, and quails, and can be used for carp, crucian carp, and trout as the fish, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present application is for immune enhancement, comprising fermenting a composition comprising any one or more selected from the group consisting of garlic, red pepper powder, and a nitrogen source with Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain or its culture
  • a method for preparing the composition is provided.
  • Another aspect of the present application is improving intestinal health, including the step of fermenting a composition containing at least one selected from the group consisting of garlic, red pepper powder, and a nitrogen source with Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain or its culture
  • a method for preparing a composition for use is provided.
  • the Leuconostoc mesenteroides CJLM119 strain and culture were as described above.
  • a composition prepared according to the method of the present application may be a fermented product.
  • the fermented product of the present application may be fermented for 10 to 30 hours at 32 ° C to 42 ° C with at least one selected from the strain or culture thereof of the present application, as described above.
  • the fermented product of the present application may be a fermented composition containing 5 to 9% by weight of garlic based on the total weight of the composition, as described above.
  • the fermented product of the present application may be a fermented composition further comprising at least one selected from a carbon source or salt, as described above.
  • the fermented product of the present application may include at least one selected from a culture of the Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain, a lysate thereof, an extract thereof, or a component derived therefrom, as described above.
  • Another aspect of the present application provides a method for enhancing the immune enhancing effect of a composition comprising fermenting the composition with Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain or a culture thereof.
  • Another aspect of the present application provides a method for enhancing the intestinal health improvement effect of the composition, comprising fermenting the composition with Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain or a culture thereof.
  • the Leuconostoc mesenteroides CJLM119 strain, culture, immune enhancement, and improvement of intestinal health are the same as described above in the previous embodiment.
  • compositions were prepared by mixing the raw materials except for the strain according to Table 1 below.
  • Table 1 7% by weight of garlic, 1.2% by weight of ginger, 2% by weight of red pepper powder, 3% by weight of carbon source (fructose), 1.5% by weight of salt, and 1.2% by weight of seasoning (TasteNrich ® , TNR, CJ CheilJedang) as a nitrogen source were added. and then mixed.
  • seasoning TasteNrich ® , TNR, CJ CheilJedang
  • Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides
  • CJLM119 strain accession number KCTC 13043BP, US Publication No.
  • the supernatant of the fermented composition was obtained by centrifuging the fermented composition at 13,000 rpm for 5 minutes and removing cells by filtering the supernatant with a 0.45 ⁇ m syringe filter.
  • Leuconostoc mesenteroides strains in the fermentation compositions consistently dominated at 10 8 CFU/mL or more.
  • WST-1 assay was performed using the cell proliferation reagent WST-1 assay kit (Roche, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • J774A.1 a mouse macrophage cell line
  • KCLB Korea Cell Line Bank
  • Cells were cultured in DMEM (Gibco, USA) supplemented with heat-inactivated 10% fetal bovine serum (FBS), 1% L-glutamine, penicillin G (100 IU/mL), and streptomycin (100 mg/mL).
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin G 100 IU/mL
  • streptomycin 100 mg/mL
  • the cells were dispensed in a 96-well plate (Corning, USA) so that the number of cells per well was 5 x 10 4 cells/well (volume 150 ⁇ L), and cultured for about 3 hours until a complete monolayer was formed, which was used for the experiment. used
  • the fermentation compositions of Preparation Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 2 were diluted with antibiotic-free DMEM medium, and each 100 ⁇ L was dispensed into a 96-well plate.
  • a DMEM medium without antibiotics added [negative control (negative control)] or a DMEM medium with 1 ⁇ g/mL LPS (Lipopolysaccharide) and no antibiotics added (positive control) was placed in a 96 well-plate, respectively. It was dispensed by 100 ⁇ L. J774A.1 cells in each fermentation composition or control were seeded at 3.3 x 10 5 cells/mL. The 96-well plate was incubated at 37°C for 24 hours in the presence of 5% CO 2 .
  • the fermentation composition of Preparation Example 4 was diluted with DMEM medium to which antibiotics were not added, and the Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain in the fermentation composition was 5 x 10 6 cfu / mL (fermentation composition A), 10 6 cfu / mL (fermentation Composition B) and 5 x 10 5 cfu/mL (fermentation composition C) were then dispensed in 100 ⁇ L each in a 96-well plate.
  • the supernatant of the fermentation composition AC was diluted in DMEM to which antibiotics were not added at the same dilution factor, and then 100 ⁇ L of this was dispensed into a 96-well plate.
  • DMEM medium to which no antibiotics were added [negative control (negative control)] or DMEM medium to which 1 ⁇ g/mL of LPS was added and no antibiotics (positive control) was added to a 96-well plate, each 100 ⁇ L. Busy. J774A.1 cells in each fermentation composition, its supernatant or control were seeded at 3.3 x 10 5 cells/mL.
  • the 96-well plate was incubated at 37°C for 24 hours in the presence of 5% CO 2 . After culturing, absorbance was measured at 500 nm using a spectrophotometer in the same manner as in Example 1-1.
  • Leuconostoc Mesenteroides CJLM119 strain was included at 5 x 10 6 cfu/mL (fermentation composition A), 10 6 cfu/mL (fermentation composition B) and 5 x 10 5 cfu/mL (fermentation composition C) Cell viability was maintained in the cells treated with the fermented composition and its supernatant, confirming that there was no cytotoxicity (FIG. 2).
  • the fermentation composition of Preparation Example 4 was diluted with DMEM medium to which antibiotics were not added, and the Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain in the fermentation composition was 1.25 x 10 6 cfu / mL, 2.5 x 10 6 cfu / mL, 5.0 x 10 6 After adjusting to cfu/mL and 6.25 x 10 6 cfu/mL, 100 ⁇ L each was dispensed into a 96-well plate.
  • the Leuconostoc mecenteroides KCTC 3505 strain in the fermentation composition was 1.25 x 10 6 cfu / mL, 2.5 x 10 6 cfu / mL, 5.0 x 10 6 cfu / mL and 6.25 x 10 6 cfu/mL, and then 100 ⁇ L each was dispensed into a 96-well plate.
  • DMEM medium to which no antibiotics were added [negative control (negative control)] or DMEM medium to which 1 ⁇ g/mL of LPS was added and no antibiotics (positive control) was added to a 96-well plate, each 100 ⁇ L. Busy. J774A.1 cells in each fermentation composition or control were seeded at 3.3 x 10 5 cells/mL. The 96-well plate was incubated at 37°C for 24 hours in the presence of 5% CO 2 . After culturing, absorbance was measured at 500 nm using a spectrophotometer in the same manner as in Example 1-1.
  • TNF- ⁇ Tumor necrosis factor- ⁇
  • IL-6 Interleukin-6 secretion ability
  • the fermentation compositions of Preparation Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 2 were diluted with antibiotic-free DMEM medium, and each 100 ⁇ L was dispensed into a 96-well plate.
  • DMEM medium to which no antibiotics were added [negative control (negative control)] or DMEM medium to which 1 ⁇ g/mL of LPS was added and no antibiotics (positive control) was added to a 96-well plate, each 100 ⁇ L.
  • Busy. J774A.1 cells in each fermentation composition or control were seeded at 3.3 x 10 5 cells/mL.
  • the 96-well plate was incubated at 37°C for 24 hours in the presence of 5% CO 2 .
  • the culture solution was centrifuged at 1,400 rpm for 10 minutes to obtain a cell supernatant from which cells of J774A.1 and Leuconostoc mesenteroides were removed.
  • ELISA assay was performed using Duoset ELISA ancillary reagent kit 2 (R&D systems, cat DY008, USA).
  • a mouse TNF- ⁇ DuoSet ELISA kit (R&D systems, cat number DY 406-05, USA) containing TNF- ⁇ antibody and biotinylated secondary antibody, IL-6 antibody and A Mouse IL-6 DuoSet ELISA kit (R&D systems, cat number DY 410-05, USA) containing biotinylation as a secondary antibody was used.
  • the fermentation composition of Preparation Example 4 was diluted with DMEM medium to which antibiotics were not added, and the Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain in the fermentation composition was 5 x 10 6 cfu / mL, 10 6 cfu / mL and 5 x 10 5 cfu / After making it mL, it was dispensed into 96 well-plates by 100 ⁇ L. J774A.1 cells in each fermentation composition were seeded at 3.3 x 10 5 cells/mL. The 96-well plate was incubated at 37°C for 24 hours in the presence of 5% CO 2 . After culturing, absorbance was measured at 470 nm (correction value 540 nm) using a spectrophotometer after the color reaction was terminated in the same manner as in Example 2-1.
  • TNF- ⁇ (FIG. 7) and IL-6 (FIG. 8) expressions were significantly increased or similar to the negative control ( *** p ⁇ 0.001, ** p ⁇ 0.01).
  • the fermentation composition of Preparation Example 4 was diluted with DMEM medium to which antibiotics were not added, and the Leuconostoc mecenteroides CJLM119 strain in the fermentation composition was 1.25 x 10 6 cfu / mL, 2.5 x 10 6 cfu / mL, 5.0 x 10 6 After adjusting to cfu/mL and 6.25 x 10 6 cfu/mL, 100 ⁇ L each was dispensed into a 96-well plate.
  • the Leuconostoc mecenteroides KCTC 3505 strain in the fermentation composition was 1.25 x 10 6 cfu / mL, 2.5 x 10 6 cfu / mL, 5.0 x 10 6 cfu / mL and 6.25 x 10 6 cfu/mL, and then 100 ⁇ L each was dispensed into a 96-well plate.
  • DMEM medium to which no antibiotics were added [negative control (negative control)] or DMEM medium to which 1 ⁇ g/mL of LPS was added and no antibiotics (positive control) was added to a 96-well plate, each 100 ⁇ L. Busy. J774A.1 cells in each fermentation composition or control were seeded at 3.3 x 10 5 cells/mL. The 96-well plate was incubated at 37°C for 24 hours in the presence of 5% CO 2 . After culturing, absorbance was measured at 470 nm (correction value 540 nm) using a spectrophotometer after the color reaction was terminated in the same manner as in Example 2-1.
  • the expression of TNF- ⁇ was significantly lower than that of the LM119 fermentation composition (2.5 x 10 6 cfu / mL).
  • IL-6 expression was significantly lower than that of the LM119 fermented composition (2.5 x 10 6 cfu/mL and 5.0 x 10 6 cfu/mL) (Figs. 10 and 12, *** p ⁇ 0.001, ** p ⁇ 0.01, * p ⁇ 0.05).
  • aureus strains were each seeded at 1 ⁇ 10 6 cells/well.
  • the 96 well-plate was incubated at 37°C for 24 hours. After culturing, the OD 600 value was measured using a spectrophotometer. Growth of harmful bacteria by concentration of the fermentation composition by comparing the OD 600 value in the medium containing the fermentation composition at 0% and the OD 600 value in the diluted medium containing the fermentation composition at 25, 40 and 50% (v / v) Inhibition ratio (%) was confirmed.
  • the growth inhibition rate was calculated from the following formula, and the OD 600 value of each diluted medium without strain inoculation was taken as blank.
  • the fermented composition of Preparation Example 1 exhibited a strong growth inhibition rate of 90% or more against E. coli and S. aureus , which are food poisoning-inducing bacteria, at all concentrations (FIG. 13).

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Abstract

본 출원은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) CJLM119 균주 또는 이의 배양물 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 발효용 조성물로 발효되어, 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 또는 이로부터 유래하는 성분 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 면역 증강용 또는 장건강 개선용 조성물에 관한 것이다.

Description

류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 및 이의 배양물을 포함하는 식품용 발효 조성물
본 출원은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) CJLM119 균주 또는 이의 배양물 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 발효용 조성물로 발효되어, 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 또는 이로부터 유래하는 성분 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 면역 증강용 또는 장건강 개선용 조성물에 관한 것이다.
발효 식품은 특정 미생물의 성장과 효소의 작용을 통해 성분이 전환된 식품이나 음료를 의미한다. 유산균을 비롯한 유익균은 발효 과정 동안 식품 원료를 구성하는 화학 성분을 전환시켜 영양분의 생체이용률을 높이고, 생물학적 보존제로서 식품의 안전성을 강화시키며, 독성 물질 및 영양 저해 인자의 분해 및 생리활성 물질을 생산하는 것으로 보고되고 있다(Tamang JP, et al., Front Microbiol (2016), 7, 578.).
상기 유산균 중에서 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)는 채소류의 유산 발효에 관여하는 대표적인 유산균으로 알려져 있으며, 김치 등의 발효 채소류에서 발견된다.
본 출원은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) CJLM119 균주 또는 이의 배양물 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 발효용 조성물로 발효되어, 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 또는 이로부터 유래하는 성분 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 면역 증강용 또는 장건강 개선용 조성물을 제공한다.
본 출원의 하나의 목적은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) CJLM119 균주 또는 이의 배양물 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 발효용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 발효한 발효물을 포함하는, 면역 증강용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 하나의 목적은 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 발효한 발효물을 포함하는, 장건강 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 하나의 목적은 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 발효한 발효물을 포함하는, 면역 증강용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 하나의 목적은 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 발효한 발효물을 포함하는, 장건강 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 하나의 목적은 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 조성물을 발효하는 단계를 포함하는, 조성물의 면역 증강 효과를 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원 또 하나의 목적은 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 조성물을 발효하는 단계를 포함하는, 조성물의 장건강 개선 효과를 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 조성물은 면역 증강 효과 및 장건강 개선 효과를 갖는다.
도 1은 마우스 면역 세포인 J774A.1 세포에 제조예 1~3의 발효 조성물 및 비교예 1~2를 처리한 후 세포 독성을 확인한 결과이다.
도 2는 마우스 면역 세포인 J774A.1 세포에 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주가 5 x 106 cfu/mL(발효 조성물 A), 106 cfu/mL(발효 조성물 B) 및 5 x 105 cfu/mL(발효 조성물 C)로 포함된 발효 조성물 및 이의 상등액을 처리한 후 세포 독성을 확인한 결과이다.
도 3은 마우스 면역 세포인 J774A.1 세포에 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 KCTC 3505 균주가 1.25 x 106 cfu/mL 및 6.25 x 106 cfu/mL로 포함된 발효 조성물을 처리한 후 세포 독성을 확인한 결과이다.
도 4는 마우스 면역 세포인 J774A.1 세포에 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 KCTC 3505 균주가 1.25 x 106 cfu/mL, 2.5 x 106 cfu/mL 및 5.0 x 106 cfu/mL로 포함된 발효 조성물을 처리한 후 세포 독성을 확인한 결과이다.
도 5는 마우스 면역 세포인 J774A.1 세포에 제조예 1~3의 발효 조성물 및 비교예 1~2를 처리한 세포에서 TNF-α(Tumor necrosis factor-α) 발현량을 분석한 결과이다(***p<0.001).
도 6은 마우스 면역 세포인 J774A.1 세포에 제조예 1~3의 발효 조성물 및 비교예 1~2를 처리한 세포에서 IL-6(Interleukin-6) 발현량을 분석한 결과이다(***p<0.001).
도 7은 마우스 면역 세포인 J774A.1 세포에 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주가 5 x 106 cfu/mL, 106 cfu/mL 및 5 x 105 cfu/mL로 포함된 발효 조성물을 처리한 후 TNF-α 발현량을 분석한 결과이다(***p<0.001, **p<0.01).
도 8은 마우스 면역 세포인 J774A.1 세포에 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주가 5 x 106 cfu/mL, 106 cfu/mL 및 5 x 105 cfu/mL로 포함된 발효 조성물을 처리한 후 IL-6 발현량을 분석한 결과이다(***p<0.001, **p<0.01).
도 9는 마우스 면역 세포인 J774A.1 세포에 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 KCTC 3505 균주가 1.25 x 106 cfu/mL 및 6.25 x 106 cfu/mL로 포함된 발효 조성물을 처리한 후 TNF-α 발현량을 분석한 결과이다(***p<0.001, ##p<0.01, #p<0.05).
도 10은 마우스 면역 세포인 J774A.1 세포에 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 KCTC 3505 균주가 1.25 x 106 cfu/mL, 2.5 x 106 cfu/mL 및 5.0 x 106 cfu/mL로 포함된 발효 조성물을 처리한 후 TNF-α 발현량을 분석한 결과이다(**p<0.01, *p<0.05).
도 11은 마우스 면역 세포인 J774A.1 세포에 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 KCTC 3505 균주가 1.25 x 106 cfu/mL 및 6.25 x 106 cfu/mL로 포함된 발효 조성물을 처리한 후 IL-6 발현량을 분석한 결과이다(***p<0.001, ##p<0.01, #p<0.05).
도 12는 마우스 면역 세포인 J774A.1 세포에 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 KCTC 3505 균주가 1.25 x 106 cfu/mL, 2.5 x 106 cfu/mL 및 5.0 x 106 cfu/mL로 포함된 발효 조성물을 처리한 후 IL-6 발현량을 분석한 결과이다(***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05).
도 13은 제조예 4의 발효 조성물의 유해균 성장 억제 효과를 비교한 결과이다. 용어: 발효 조성물, Fermentation; 발효 조성물 상등액, Metabolite.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 출원이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 출원의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 출원의 하나의 양태는, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) CJLM119 균주 또는 이의 배양물 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 발효용 조성물을 제공한다.
본 출원의 균주는 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) 균주일 수 있고, 구체적으로 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)일 수 있으며, 보다 구체적으로 수탁번호 KCTC 13043BP로 기탁된 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주(미국 공개번호 US 2019-0297908 A1)일 수 있다.
본 출원에서 용어, "배양물"은 본 출원의 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다. 또한, "배양물"은 균주를 포함하고 있는 조성물로서, 본 발명에서 배양물은 균주와 동일한 목적으로 사용될 수 있다. 본 출원에 있어서, 상기 "배양물"은 "배양액", "배양 상층액", "조건 배양액" 또는 "조정 배지"와 혼용될 수 있다.
본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배지에 포함되는 탄소원은 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산을 포함할 수 있으며, 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배지에 포함되는 질소원으로서 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함될 수 있으며, 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배지에 포함되는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐 함유염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 배지는 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있고, 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화학물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리클리콜에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포생성을 억제할 수 있다. 또한 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.
상기 배양물은 본 출원의 균주를 10℃ 내지 40℃에서 6시간 내지 48시간 동안 배양하여 수득할 수 있고, 일 예로 20℃ 내지 40℃에서 12시간 내지 36시간, 또는 30℃ 내지 40℃에서 16시간 내지 24시간 동안 배양하여 수득할 수 있다.
본 출원의 배양물에는 생균 배양물(즉, 생균을 배지에서 배양한 결과물), 상기 생균 배양물에서 생균을 사균화한 배양물, 배양여액(즉, 상기 배양물에서 사균체 또는 생균체가 제거된 결과물), 이의 농축물 또는 동결건조물이 포함될 수 있다.
상기 배양여액은 배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나,　배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다. 본 출원에 있어서, 상기 "배양여액"은 "상등액"과 혼용될 수 있다.
상기 균체는　배양액을 원심분리하여 하층에 가라앉은 부분을 취하여 획득할 수 있고, 또는 중력에 의해　배양액의 하층으로 가라앉으므로 일정 시간 동안 가만히 두었다가 상부의 액체를 제거함으로써 획득할 수 있다.
상기 농축물은 상기 균주 배양액 자체, 또는 상기 배양액을 원심분리나 필터를 이용하여 여과한 후 수득된 상층액을 농축하여 수득될 수 있다.
상기 동결건조물은 상기 균주 배양액 자체, 또는 상기 배양액을 동결건조하여 수득될 수 있다.
본 출원의 발효용 조성물은 다양한 발효식품의 제조에 사용될 수 있으며, 구체적으로, 마늘, 고춧가루, 조미료 등의 양념소를 발효시키기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 발효용 조성물로 발효시킬 경우 면역 증강 효과 및/또는 장건강 개선 효과를 갖는 식품을 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 발효된 발효물을 포함하는, 면역 증강용 식품 조성물을 제공한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 발효된 발효물을 포함하는, 장건강 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 및 배양물은 전술한 바와 같다.
본 출원의 식품 조성물은 이전 양태의 발효용 조성물로 발효된 발효물을 포함하는 것일 수 있다. 일 예로, 상기 발효물은, 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 발효된 발효물을 포함할 수 있다. 또는, 상기 발효물은, 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 발효된 상기의 발효물을 추가로 발효한 발효물을 포함할 수 있다.
본 출원의 일 구현예에서, 본 출원의 식품 조성물은 이전 양태의 발효용 조성물로 발효된 마늘, 고춧가루, 질소원 등을 포함하는 것일 수 있다.
본 출원에서 사용된 용어, "발효"는 미생물을 이용한 유기물질의 효소적 또는 대사적 분해를 포함하는 모든 활성 또는 과정을 의미한다.
본 출원에서 용어, "발효물"은 미생물을 이용한 발효에 따른 효소적 또는 대사적 분해의 결과물을 의미한다. 일 예로, 상기 발효물은 액상일 수 있다. 또한, 상기 발효물은 발효의 결과물인 원액 또는 이의 상등액일 수 있다.
본 출원의 다른 일 구현예에서, 본 출원의 발효물은 생균체가 포함될 수 있다.
본 출원의 또 다른 일 구현예에서, 본 출원의 발효물은 추가적으로 발효를 더 진행할 수 있다. 일 예로, 본 출원의 발효물을 채소 등에 첨가하여 추가로 발효시키거나, 액상 조성물 등에 첨가하여 추가로 발효시킬 수 있다. 상기 채소의 예로는, 배추, 무 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 발효물은 본 출원의 균주 또는 이의 배양물 중 선택되는 어느 하나 이상으로 25℃ 내지 40℃에서 발효시킨 것일 수 있다. 본 출원의 발효는 본 출원의 균주 또는 이의 배양물 중 선택되는 어느 하나 이상으로 10 시간 내지 30 시간 동안 발효시킨 것일 수 있다.
일 예로, 본 출원의 발효시 온도는 25℃ 이상, 27℃ 이상, 28℃ 이상 및 29℃ 이상에서 선택된 하나의 하한선 및/또는 40℃ 이하, 35℃ 이하, 33℃ 이하 및 31℃ 이하에서 선택된 하나의 상한선으로 구성된 범위에서 실시할 수 있다. 또한, 본 출원의 발효시 시간은 10 시간 이상, 12 시간 이상, 14 시간 이상, 16 시간 이상 및 18 시간 이상에서 선택된 하나의 하한선 및/또는 30 시간 이하, 28 시간 이하, 27 시간 이하, 26 시간 이하 및 25 시간 이하에서 선택된 하나의 상한선으로 구성된 범위에서 실시할 수 있다.
본 출원의 발효물은 마늘, 고춧가루 및 질소원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 조성물을 발효시킨 것일 수 있다. 일 구현예로, 본 출원의 발효 대상인 조성물은 마늘, 고춧가루 및 질소원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 다른 일 구현예로, 본 출원의 발효물은 마늘, 고춧가루 및 질소원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 조성물에 본 출원의 균주 및/또는 이의 배양물을 첨가하여 발효한 것일 수 있다.
본 출원의 발효물은 마늘, 고춧가루 및 질소원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 조성물 전체 중량에 대하여 본 출원의 균주 및/또는 이의 배양물을 0.5 내지 4 중량%로 첨가하여 발효한 것일 수 있다.
일 예로, 본 출원의 균주 및/또는 이의 배양물은 조성물 전체 중량에 대하여 1 중량% 이상, 1.2 중량% 이상, 1.6 중량% 이상 및 1.8 중량% 이상에서 선택된 하나의 하한선 및/또는 3.5 중량% 이하, 2.8 중량% 이하, 2.6 중량% 이하 및 2.2 중량% 이하에서 선택된 하나의 상한선으로 구성된 범위로 포함될 수 있다.
본 출원의 발효물은 조성물 전체 중량에 대하여 마늘을 4 내지 10 중량%로 포함하는 조성물을 발효시킨 것일 수 있다. 일 구현예로, 본 출원의 발효 대상인 조성물은 마늘, 고춧가루 및 질소원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 다른 일 구현예로, 본 출원의 발효 대상인 마늘, 고춧가루 및 질소원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 마늘을 4 내지 10 중량%로 포함하는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 마늘은 조성물 전체 중량에 대하여 4 중량% 이상, 5 중량% 이상, 6 중량% 이상 및 6.5 중량% 이상에서 선택된 하나의 하한선 및/또는 10 중량% 이하, 9 중량% 이하, 8 중량% 이하 및 7.5 중량% 이하에서 선택된 하나의 상한선으로 구성된 범위로 포함될 수 있다.
상기 마늘은 다진 마늘, 추출물, 농축액 및 분말 등의 형태로 본 출원의 조성물에 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 시판 마늘 및 이를 다지거나, 추출물, 농축액 및 분말 등의 형태로 가공한 제품을 제한 없이 사용할 수 있다.
또 다른 일 구현예로, 본 출원의 발효 대상인 마늘, 고춧가루 및 질소원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 고춧가루를 0.5 내지 4 중량%로 포함하는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 고춧가루는 조성물 전체 중량에 대하여 0.5 중량% 이상, 1 중량% 이상, 1.2 중량% 이상, 1.6 중량% 이상 및 1.8 중량% 이상에서 선택된 하나의 하한선 및/또는 4 중량% 이하, 3.5 중량% 이하, 2.8 중량% 이하, 2.6 중량% 이하 및 2.2 중량% 이하에서 선택된 하나의 상한선으로 구성된 범위로 포함될 수 있다.
상기 고춧가루는 고추를 건조한 다음 분쇄하거나, 동결건조하여 분말화한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 시판 고춧가루를 제한 없이 사용할 수 있다.
또 다른 일 구현예로, 본 출원의 발효 대상인 마늘, 고춧가루 및 질소원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 질소원을 0.1 내지 1.5 중량%로 포함하는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 질소원은 조성물 전체 중량에 대하여 0.3 중량% 이상, 0.6 중량% 이상, 0.9 중량% 이상 및 1.1 중량% 이상에서 선택된 하나의 하한선 및/또는 1.45 중량% 이하, 1.4 중량% 이하, 1.35 중량% 이하, 1.3 중량% 이하에서 선택된 하나의 상한선으로 구성된 범위로 포함될 수 있다.
상기 질소원은 식용일 수 있다. 상기 질소원은 일 예로 조미료일 수 있고, 그 예로 TasteNrich®(CJ제일제당)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 출원의 조성물은 마늘을 포함하는 것일 수 있다.
본 출원의 발효물은 탄소원 또는 소금 중 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 조성물을 발효시킨 것일 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 발효 대상인 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 탄소원을 2 내지 4 중량%로 포함하는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 탄소원은 조성물 전체 중량에 대하여 2.2 중량% 이상, 2.4 중량% 이상, 2.6 중량% 이상 및 2.8 중량% 이상에서 선택된 하나의 하한선 및/또는 3.8 중량% 이하, 3.6 중량% 이하, 3.4 중량% 이하 및 3.2 중량% 이하에서 선택된 하나의 상한선으로 구성된 범위로 포함될 수 있다.
상기 탄소원은 식용일 수 있다. 상기 탄소원은 일 예로 과당, 자당, 포도당 등일 수 있고, 그 예로 과당일 수 있고, 구체적으로 결정과당일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, 본 출원의 발효 대상인 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 소금을 0.1 내지 2 중량%로 포함하는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 소금은 조성물 전체 중량에 대하여 0.5 중량% 이상, 0.8 중량% 이상, 1 중량% 이상 및 1.2 중량% 이상에서 선택된 하나의 하한선 및/또는 1.9 중량% 이하, 1.8 중량% 이하, 1.7 중량% 이하 및 1.6 중량% 이하에서 선택된 하나의 상한선으로 구성된 범위로 포함될 수 있다.
본 출원의 발효물은 생강을 추가로 포함하는 조성물을 발효시킨 것일 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 발효 대상인 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 생강을 0.1 내지 1.5 중량%로 포함하는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 생강은 조성물 전체 중량에 대하여 0.3 중량% 이상, 0.6 중량% 이상, 0.9 중량% 이상 및 1.1 중량% 이상에서 선택된 하나의 하한선 및/또는 1.45 중량% 이하, 1.4 중량% 이하, 1.35 중량% 이하, 1.3 중량% 이하에서 선택된 하나의 상한선으로 구성된 범위로 포함될 수 있다.
본 출원의 발효물은 물을 추가로 포함하는 조성물을 발효시킨 것일 수 있다.
본 출원의 일 구현예에서, 상기 물은 본 출원의 발효 대상인 조성물에 포함되는 원료를 모두 혼합한 다음, 상기 조성물의 전체 중량이 100 중량%가 될 때까지 첨가하는 것일 수 있다.
본 출원의 발효물은 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 또는 이로부터 유래하는 성분 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 출원에서 용어, "파쇄물"은 상기 배양액 또는 그의 농축액에 포함된 미생물의 세포벽을 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 파쇄하여 얻은 산물을 의미한다. 본 출원에 있어서, 상기 "파쇄물"은 "용해물"과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어, "추출물"은 상기 배양액 또는 그의 농축액으로부터 미생물을 제거한 물질을 의미한다.
또한, 본 출원의 균주 유래의 성분으로는 예컨대, 균주 유래 대사물질 등이 포함될 수 있으며, 상기 균주 유래 대사물질 등을 함유하는 균체를 파쇄하여 얻은 세포질 분획물이 포함될 수 있다. 이외에 식품 조성물 내에 포함시키기 적합한 균주의 형태, 제제화 방법 및 균주 유래 성분의 분리 방법 등은 당업자에게 잘 알려져 있다.
전술한 바에 따른 본 출원의 일 구현예에서, 본 출원의 발효물은 김치소(김치양념)에 포함되는 성분들을 포함하여 발효시킨 것일 수 있다.
본 출원의 식품 조성물은 면역 증강 효과를 갖는 것일 수 있다.
본 출원에서 용어, "면역 증강"은 여러 가지 특이적 또는 비특이적 방법으로 면역 반응을 증가시키는 효과를 의미하며, 면역 조절 효과를 추가로 포함할 수 있다. 상기 면역 증강 효과는 예컨대, 대식세포의 활성을 높임에 따른 외부 병원균에 대한 방어, 사멸세포 제거 및 면역매개체 분비 증대 효과를 포함할 수 있고, 면역 조절 인자의 활성을 높여 면역 체계의 활성을 높이고 신생 혈관 생성 억제, 병원균에 대한 생육 억제력 증가 등으로 면역 관련 질병을 예방하는 효과 등을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 면역 증강 효과는 상기 면역매개체 분비 증대 효과에 의해 이루어지는 것일 수 있다.
상기 면역매개체는 일 예로, Th1 타입 전염증성(pro-inflammatory) 사이토카인일 수 있고, 그 예로 TNF-α(Tumor necrosis factor-α), IL-6(Interleukin-6) 및 IL-1β 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 일 구현예에서, 본 출원의 조성물은 TNF-α 또는 IL-6의 발현을 증대시키는 것일 수 있다.
본 출원의 식품 조성물은 장건강 개선 효과를 갖는 것일 수 있다.
본 출원에서 용어, "장건강 개선"은 장내 유익균 및 유해균의 균총을 조절하여 장내 환경을 정상적인 상태로 유지할 수 있는 효과를 의미한다. 상기 장건강 개선 효과는 예컨대, 장내 유익균의 균총을 증진시키고 유해균의 균총을 억제하는 효과를 포함할 수 있고, 장의 밀착연접 장벽 기능을 강화시켜 장의 전반적인 기능을 개선 및 활성화시키는 효과를 포함할 수 있고, 장내 단쇄 지방산의 함량을 증가시키는 효과를 포함할 수 있으며, 장내 상피세포의 증식을 유도하는 효과 등을 포함할 수 있다. 본 출원에 있어서, 상기 "장건강 개선 효과"는 "정장 효과"와 혼용될 수 있다.
구체적으로, 상기 장건강 개선 효과는 상기 유해균 생장 억제 효과에 의해 장내 유익균의 균총이 증진되고 유해균의 균총이 억제됨으로써 이루어지는 것일 수 있다.
본 출원의 식품 조성물은 유해균의 생장을 억제시키는 효과를 갖는 것일 수 있다.
상기 유해균은 병원성 미생물일 수 있다.
상기 병원성 미생물은 감염시 특정 질환을 일으키는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 일 예로 에스케리키아 속(Escherichia sp.), 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.), 살모넬라 속(Salmonella sp.), 쉬겔라 속(Shigella sp.), 클렙시엘라(Klebsiella sp.), 엔테로박테리아세 속(Enterobacteriaceae sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 모락셀라 속(Moraxella sp.), 헬리코박터 속(Helicobacter sp.), 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.), 리스테리아 속(Listeria sp.) 및 비브리오 속(Vibrio sp.) 미생물 등일 수 있고, 그 예로 대장균(Escherichia coli), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 쉬겔라 디센테리에(Shigella dysenteriae), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 리스테리아 모노사이토젠(Listeria monocytogene), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 및 비브리오 벌리피쿠스(Vibrio vulnificus) 등일 수 있으며, 구체적으로 대장균 또는 스타필로코커스 아우레우스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 식품 조성물은 이전 양태의 발효용 조성물로 발효된 발효물을 포함하는 것일 수 있다. 일 예로, 상기 발효물은, 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 발효된 발효물을 포함할 수 있다. 또는, 상기 발효물은, 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 발효된 상기의 발효물을 추가로 발효한 발효물을 포함할 수 있다. 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
일 예로, 상기 발효물은 액상일 수 있다. 또한, 상기 발효물은 발효의 결과물인 원액 또는 이의 상등액일 수 있다.
상기 발효물은 추가적으로 발효를 더 진행할 수 있다. 일 예로, 본 출원의 발효물을 채소 등에 첨가하여 추가로 발효시키거나, 액상 조성물 등에 첨가하여 추가로 발효시킬 수 있다. 상기 채소의 예로는, 배추, 무 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 발효물이 액상 발효물일 경우, 본 발명의 발효물은 상기의 액상 발효물 및/또는 상기의 액상 발효물을 추가로 발효한 발효물을 모두 포함할 수 있다. 이때, 추가로 발효한 발효물은 액상 또는 고체상 발효물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 식품 조성물은 식품 조성물 외에 식품 첨가제의 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 식품 조성물은 식품 첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정할 수 있다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 들을 들 수 있다.
본 출원의 식품으로는 과실음료, 채소류음료, 탄산음료, 두유류, 요구르트 등의 유산균음료, 혼합음료와 같은 음료; 김치, 김치소(김치양념), 발효 식품류; 빵, 떡류, 건과류, 캔디류, 초콜릿류, 츄잉껌, 쨈류와 같은 과자류 아이스크림류, 빙과류, 아이스크림 분말류와 같은 아이스크림 제품류; 우유류, 저지방 우유류, 유당분해 우유, 가공유류, 산양유, 발효유류, 버터유류, 농축유류, 유크림류, 버터유, 자연치즈, 가공치즈, 분유류, 유청류와 같은 유가공품류; 식육가공품, 알가공품, 햄버거와 같은 식육제품류; 어묵, 햄, 소세지, 베이컨 등의 어육가공품과 같은 어육제품류; 라면류, 건면류, 생면류, 유탕면류, 호화건먼류, 개량숙면류, 냉동면류, 파스타류와 같은 면류; 간장, 된장, 고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 식초, 소스류, 토마토케첩, 카레, 드레싱과 같은 조미식품; 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 외에 본 출원의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 출원의 식품 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 출원의 또 하나의 양태는 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 발효한 발효물을 포함하는, 면역 증강용 건강기능식품을 제공한다.
본 출원의 또 하나의 양태는 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 발효한 발효물을 포함하는, 장건강 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 및 배양물은 전술한 바와 같다.
본 출원의 발효물은 본 출원의 균주 또는 이의 배양물 중 선택되는 어느 하나 이상으로 32℃ 내지 42℃에서 10시간 내지 30시간 동안 발효시킨 것일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원의 발효물은 마늘, 고춧가루 및 질소원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 조성물을 발효시킨 것일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원의 발효물은 조성물 전체 중량에 대하여 마늘을 5 내지 9 중량%로 포함하는 조성물을 발효시킨 것일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원의 발효물은 탄소원 또는 소금 중 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 조성물을 발효시킨 것일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원의 발효물은 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 또는 이로부터 유래하는 성분 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률에 따라 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미(제3조 제1호)하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것(동조 제2호)을 의미한다.
본 출원의 건강기능식품은 식품 첨가제의 형태일 수 있다.
본 출원의 건강기능식품을 식품 첨가제로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품을 조성물로서 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품은 식품 첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원의 또 하나의 양태는 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물의 발효물을 포함하는, 면역 증강용 사료 조성물을 제공한다.
본 출원의 또 하나의 양태는 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물의 발효물을 포함하는, 장건강 개선용 사료 조성물을 제공한다.
상기 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 및 배양물은 전술한 바와 같다.
본 출원의 발효물은 본 출원의 균주 또는 이의 배양물 중 선택되는 어느 하나 이상으로 32℃ 내지 42℃에서 10시간 내지 30시간 동안 발효시킨 것일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원의 발효물은 마늘, 고춧가루 및 질소원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 조성물을 발효시킨 것일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원의 발효물은 조성물 전체 중량에 대하여 마늘을 5 내지 9 중량%로 포함하는 조성물을 발효시킨 것일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원의 발효물은 탄소원 또는 소금 중 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 조성물을 발효시킨 것일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원의 발효물은 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 또는 이로부터 유래하는 성분 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원의 사료 조성물은 사료 조성물 외에 사료 첨가제 조성물의 형태일 수 있다.
본 출원의 조성물이 사료 첨가제로서 제조될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립 형태로 제조될 수 있다. 상기 사료 첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산등의 유기산이나 인산 나트륨, 인산 칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 제조될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화될 수 있으며, 통상의 사료 성분을 함께 포함할 수 있다.
상기 사료 및 사료 첨가제는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
상기 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 탑드레싱으로서 또는 이들을 동물사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료 첨가제를 동물사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수전분, 락토오스, 수크로오스, 콩플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
또한, 상기 사료 및 사료 첨가제는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료 첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 출원의 사료 또는 사료 첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다.
상기 포유류로서 돼지, 소, 말, 양, 토끼, 염소, 설치동물 및 실험용 설치동물인 쥐, 햄스터, 기니피그 뿐만 아니라, 반려동물(예: 개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 잉어, 붕어 및 송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 또 하나의 양태는 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 마늘, 고춧가루 및 질소원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 조성물을 발효하는 단계를 포함하는, 면역 증강용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 출원의 또 하나의 양태는 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 마늘, 고춧가루 및 질소원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 조성물을 발효하는 단계를 포함하는, 장건강 개선용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
상기 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 및 배양물은 전술한 바와 같다.
본 출원의 방법에 따라 제조된 조성물은 발효물일 수 있다.
본 출원의 발효물은 본 출원의 균주 또는 이의 배양물 중 선택되는 어느 하나 이상으로 32℃내지 42℃에서 10시간 내지 30시간 동안 발효시킨 것일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원의 발효물은 조성물 전체 중량에 대하여 마늘을 5 내지 9 중량%로 포함하는 조성물을 발효시킨 것일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원의 발효물은 탄소원 또는 소금 중 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 조성물을 발효시킨 것일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원의 발효물은 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 또는 이로부터 유래하는 성분 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원의 또 하나의 양태는 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 조성물을 발효하는 단계를 포함하는, 조성물의 면역 증강 효과를 증진시키는 방법을 제공한다.
본 출원 또 하나의 양태는 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 조성물을 발효하는 단계를 포함하는, 조성물의 장건강 개선 효과를 증진시키는 방법을 제공한다.
상기 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주, 배양물, 면역 증강, 장건강 개선은 이전 양태에서 전술한 바와 같다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 출원이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 출원의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
제조예: 발효 조성물 제조
먼저 하기 표 1에 따라 균주를 제외한 원료를 혼합하여 조성물을 각각 제조하였다. 조성물 제조시 마늘 7 중량%, 생강 1.2 중량%, 고춧가루 2 중량%, 탄소원(결정과당) 3 중량%, 소금 1.5 중량%, 질소원으로써 조미료(TasteNrich®, TNR, CJ제일제당) 1.2 중량%을 첨가한 후 혼합하였다. 그 다음, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) CJLM119 균주(수탁번호 KCTC 13043BP, 미국 공개번호 US 2019-0297908 A1) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 KCTC 3505를 2 중량%로 첨가하고 물을 100 중량%가 될때까지 첨가하여 혼합한 후, 30℃에서 20시간 동안 배양하여 발효시킴으로써 제조예 1~4의 발효 조성물 및 비교예 1~3을 제조하였다. 발효 후 각 발효 조성물 내 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주의 균수는 2x108 cfu/mL 이었다.
발효 조성물의 상등액은 발효가 완료된 발효 조성물을 13,000 rpm, 5분간 원심분리하고 상등액에 대해 0.45μm syringe filter하여 균체를 제거함으로써 수득하였다. 발효 조성물 내 류코노스톡 메센테로이데스 균주는 일관되게 108 CFU/mL 이상 우점하였다.
원료 첨가량
(중량%)		 제조예 1
(발효후 마늘)		 제조예 2
(고춧
가루)		 제조예 3
(TNR)		 비교예 1
(모든
재료)		 비교예 2
(발효전 마늘)		 제조예 4
(마늘+고춧가루+조미료의 LM119
발효 조성물)		 비교예
3
(마늘+고춧가루+조미료의 KCTC 3505
발효 조성물)
LM119 균주 2 0 0 0 0 - 0 -
KCTC 3505 균주 2 - - - - - - O
결정과당 3 O O O O O O O
소금 1.5 O O O O O O O
마늘 7 O - - - O O O
고춧가루 2 - O - - O O O
조미료(TNR) 1.2 - - O - O O O
생강 1.2 - - - - - O O
물 나머지 O O O O O O O
총량(중량%) 100 100 100 100 100 100 100 100
실시예 1: 발효 조성물의 세포 독성 확인
각 발효 조성물에서 세포 독성이 나타나는지를 WST-1 어세이(Roche)를 통해 확인하였다. WST-1 어세이는 cell proliferation reagent WST-1 어세이 키트(Roche, USA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다.
구체적으로, 동물세포로서 마우스 대식세포주인 J774A.1을 한국 세포주은행(KCLB)에서 분양받아 사용하였다. 세포는 열 비활성화된 10% 우태아혈정(fetal bovine serum, FBS), 1% L-글루타민, 페니실린 G(100 IU/mL), 그리고 스트렙토마이신(100mg/mL)이 첨가된 DMEM(Gibco, USA) 배지를 이용하여 5% CO2 존재 하에 37℃에서 배양하였다. 세포를 웰당 5 x 104 세포/웰(부피 150 μL)의 수가 되도록 96 웰-플레이트(Corning, USA)에 분주하였고 완전하게 단일층(monolayer)을 형성할 때까지 약 3시간 동안 배양하여 실험에 사용하였다.
1-1. 재료별 발효 조성물의 세포 독성
상기 제조예 1~3의 발효 조성물 및 비교예 1~2를 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 희석하고 96 웰-플레이트에 각각 100 μL씩 분주하였다. 또한, 대조군으로 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지[음성 대조군(음의 대조군)] 또는 LPS(Lipopolysaccharide) 1 μg/mL가 첨가되고 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지(양성 대조군)를 96 웰-플레이트에 각각 100 μL씩 분주하였다. 각 발효 조성물 또는 대조군 내 J774A.1 세포가 3.3 x 105 cells/mL가 되도록 시딩하였다. 상기 96-웰 플레이트를 5% CO2 존재 하에서 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다.
배양 완료 후에 세포 상등액을 제거하고, WST-1을 DMEM에 10% 희석하여 각 웰에 100 μL씩 분주하고 5% CO2 존재 하에 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 그 후 Spectrophotometer(BioTek, USA)을 이용하여 500nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 제조예 1~3의 발효 조성물 및 비교예 1~2를 처리한 세포에서 모두 음성 대조군에 비해 세포 생존율이 증가하여, 세포 독성이 없는 것을 확인하였다(도 1).
1-2. 발효 조성물의 세포 독성
상기 제조예 4의 발효 조성물을 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 희석하여 발효 조성물 내 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주가 5 x 106 cfu/mL(발효 조성물 A), 106 cfu/mL(발효 조성물 B) 및 5 x 105 cfu/mL(발효 조성물 C)가 되도록 한 후, 이를 96 웰-플레이트에 100 μL씩 분주하였다. 상기 발효 조성물 A-C의 상등액을 동일 희석 배수로 항생제가 첨가되지 않은 DMEM에 희석한 후, 이를 96 웰-플레이트에 100 μL씩 분주하였다. 또한, 대조군으로 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지[음성 대조군(음의 대조군)] 또는 LPS 1 μg/mL가 첨가되고 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지(양성 대조군)를 96 웰-플레이트에 각각 100 μL씩 분주하였다. 각 발효 조성물, 이의 상등액 또는 대조군 내 J774A.1 세포가 3.3 x 105 cells/mL가 되도록 시딩하였다. 상기 96-웰 플레이트를 5% CO2 존재 하에서 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 Spectrophotometer을 이용하여 500nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주가 5 x 106 cfu/mL(발효 조성물 A), 106 cfu/mL(발효 조성물 B) 및 5 x 105 cfu/mL(발효 조성물 C)로 포함된 발효 조성물 및 이의 상등액을 처리한 세포에서 세포 생존율이 유지되어, 세포 독성이 없는 것을 확인하였다(도 2).
1-3. 발효 균주별 발효 조성물의 세포 독성
상기 제조예 4의 발효 조성물을 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 희석하여 발효 조성물 내 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주가 1.25 x 106 cfu/mL, 2.5 x 106 cfu/mL, 5.0 x 106 cfu/mL 및 6.25 x 106 cfu/mL가 되도록 한 후, 이를 96 웰-플레이트에 100 μL씩 분주하였다. 상기 비교예 3을 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 희석하여 발효 조성물 내 류코노스톡 메센테로이데스 KCTC 3505 균주가 1.25 x 106 cfu/mL, 2.5 x 106 cfu/mL, 5.0 x 106 cfu/mL 및 6.25 x 106 cfu/mL가 되도록 한 후, 이를 96 웰-플레이트에 100 μL씩 분주하였다. 또한, 대조군으로 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지[음성 대조군(음의 대조군)] 또는 LPS 1 μg/mL가 첨가되고 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지(양성 대조군)를 96 웰-플레이트에 각각 100 μL씩 분주하였다. 각 발효 조성물 또는 대조군 내 J774A.1 세포가 3.3 x 105 cells/mL가 되도록 시딩하였다. 상기 96-웰 플레이트를 5% CO2 존재 하에서 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 Spectrophotometer을 이용하여 500nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 KCTC 3505 균주가 1.25 x 106 cfu/mL 및 6.25 x 106 cfu/mL로 포함된 발효 조성물을 처리한 세포에서 모두 음성 대조군에 비해 세포 생존율이 증가하여, 세포 독성이 없는 것을 확인하였다(도 3).
또한, 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 KCTC 3505 균주가 1.25 x 106 cfu/mL, 2.5 x 106 cfu/mL 및 5.0 x 106 cfu/mL로 포함된 발효 조성물을 처리한 세포에서 모두 음성 대조군에 비해 세포 생존율이 증가하여, 세포 독성이 없는 것을 확인하였다(도 4).
실시예 2: 발효 조성물의 면역 증강 효과 확인
상기 제조예 1~4의 발효 조성물의 면역 증강 효과를 평가하기 위하여 Th1 타입 전염증성(pro-inflammatory) 사이토카인인 TNF-α(Tumor necrosis factor-α) 및 IL-6(Interleukin-6)의 분비능을 ELISA 어세이로 확인하였다.
2-1. 재료별 발효 조성물의 면역 증강 효과
상기 제조예 1~3의 발효 조성물 및 비교예 1~2를 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 희석하고 96 웰-플레이트에 각각 100 μL씩 분주하였다. 또한, 대조군으로 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지[음성 대조군(음의 대조군)] 또는 LPS 1 μg/mL가 첨가되고 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지(양성 대조군)를 96 웰-플레이트에 각각 100 μL씩 분주하였다. 각 발효 조성물 또는 대조군 내 J774A.1 세포가 3.3 x 105 cells/mL가 되도록 시딩하였다. 상기 96-웰 플레이트를 5% CO2 존재 하에서 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다.
배양 완료 후에 배양액을 1,400 rpm, 10분간 원심분리하여 J774A.1 및 류코노스톡 메센테로이데스의 균체를 제거한 세포 상등액을 얻었다. ELISA 어세이는 Duoset ELISA ancillary reagent kit 2(R&D systems, cat DY008, USA)을 사용하여 수행하였다. 제조사의 지침에 따라 TNF-α 항체와 2차 항체인 비오티닐화(biotinylated)가 포함된 mouse TNF-α DuoSet ELISA 키트(R&D systems, cat number DY 406-05, USA)와, IL-6 항체와 2차 항체인 비오티닐화가 포함된 Mouse IL-6 DuoSet ELISA 키트(R&D systems, cat number DY 410-05, USA)를 사용하였다. ELISA 플레이트를 상온에서 TNF-α capture 항체(R&D systems, cat number 840143)와 IL-6의 capture 항체(R&D systems, cat number 840171)로 각각 24 시간 동안 코팅한 후, 세포 상등액 100 μL과 TNF-α 표준 용액(R&D systems, cat number 840145) 또는 IL-6 표준 용액(R&D systems, cat number 840173)을 반응 희석액(R&D systems, cat number DY995)에 희석하고 플레이트에 100 μL씩 첨가하여 상온에서 2 시간 동안 배양하였다. 그 후 배양액을 제거하고, 2차 항체인 비오티닐화 TNF-α 항체(R&D systems, cat number 840144)와 IL-6 항체(R&D systems, cat number 840172)를 첨가하여 상온에서 2 시간 동안 코팅하였다. 발색 반응은 streptavidin-conjugated horseradish peroxidase(R&D systems, cat number 893975)과 그 기질인 TMB(tetramethylbenzidine, R&D systems, cat number DY999)에 의해 유도되었다. 발색 반응이 진행된 후, 반응을 멈추기 위해 50 μL 정지용액(2N H2SO4)을 각 웰에 첨가하였다. 이 때 발색 반응은 파란색에서 노란색으로 변화되며, 발색 반응 종료 후 Spectrophotometer를 이용하여 470 nm(보정값 540nm)에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 제조예 1~3의 발효 조성물 및 비교예 1~2를 처리한 세포에서 모두 음성 대조군에 비해 TNF-α(도 5) 및 IL-6(도 6) 발현이 유의적으로 증가하였다(***p<0.001).
특히, 마늘을 포함하는 조성물을 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주로 발효한 제조예 1의 발효 조성물의 경우 다른 발효 조성물 대비 TNF-α 및 IL-6 발현이 현저히 증가되어 우수한 면역 증강 효과를 나타내는 것을 확인하였으며, 마늘을 포함하는 조성물을 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주로 발효하지 않은 비교예 2 대비 TNF-α 및 IL-6 발현이 현저히 향상되었다.
구체적으로, 도 5에 도시한 바와 같이 마늘을 포함하는 조성물을 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주로 발효하지 않은 비교예 2를 처리한 세포에서 IL-6의 발현이 다른 발효 조성물 및 대조군 대비 높으나, 이보다 마늘을 포함하는 조성물을 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주로 발효한 제조예 1을 처리한 세포에서 IL-6 발현이 약 2배 가량 증가되어, 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주를 이용하여 발효한 발효 조성물이 면역 증강 효과가 현저히 우수함을 확인하였다.
2-2. 발효 조성물의 면역 증강 효과
상기 제조예 4의 발효 조성물을 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 희석하여 발효 조성물 내 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주가 5 x 106 cfu/mL, 106 cfu/mL 및 5 x 105 cfu/mL가 되도록 한 후, 이를 96 웰-플레이트에 100 μL씩 분주하였다. 각 발효 조성물 내 J774A.1 세포가 3.3 x 105 cells/mL가 되도록 시딩하였다. 상기 96-웰 플레이트를 5% CO2 존재 하에서 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 발색 반응 종료 후 Spectrophotometer를 이용하여 470 nm(보정값 540nm)에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주가 5 x 106 cfu/mL, 106 cfu/mL 및 5 x 105 cfu/mL로 포함된 발효 조성물을 처리한 세포에서 음성 대조군에 비해 TNF-α(도 7) 및 IL-6(도 8) 발현이 유의적으로 증가하거나, 음성 대조군과 유사하였다(***p<0.001, **p<0.01).
특히, 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주가 5 x 106 cfu/mL로 포함된 발효 조성물 A의 경우 다른 발효 조성물 대비 TNF-α 및 IL-6 발현이 현저히 향상되어 우수한 면역 증강 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
2-3. 발효 균주별 발효 조성물의 면역 증강 효과
상기 제조예 4의 발효 조성물을 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 희석하여 발효 조성물 내 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주가 1.25 x 106 cfu/mL, 2.5 x 106 cfu/mL, 5.0 x 106 cfu/mL 및 6.25 x 106 cfu/mL가 되도록 한 후, 이를 96 웰-플레이트에 100 μL씩 분주하였다. 상기 비교예 3을 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 희석하여 발효 조성물 내 류코노스톡 메센테로이데스 KCTC 3505 균주가 1.25 x 106 cfu/mL, 2.5 x 106 cfu/mL, 5.0 x 106 cfu/mL 및 6.25 x 106 cfu/mL가 되도록 한 후, 이를 96 웰-플레이트에 100 μL씩 분주하였다. 또한, 대조군으로 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지[음성 대조군(음의 대조군)] 또는 LPS 1 μg/mL가 첨가되고 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지(양성 대조군)를 96 웰-플레이트에 각각 100 μL씩 분주하였다. 각 발효 조성물 또는 대조군 내 J774A.1 세포가 3.3 x 105 cells/mL가 되도록 시딩하였다. 상기 96-웰 플레이트를 5% CO2 존재 하에서 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 발색 반응 종료 후 Spectrophotometer를 이용하여 470 nm(보정값 540nm)에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주가 1.25 x 106 cfu/mL 및 6.25 x 106 cfu/mL로 포함된 발효 조성물을 처리한 세포에서 모두 음성 대조군에 비해 TNF-α(도 9) 및 IL-6(도 11) 발현이 유의적으로 증가하였다(***p<0.001). 류코노스톡 메센테로이데스 KCTC 3505 균주가 1.25 x 106 cfu/mL 및 6.25 x 106 cfu/mL로 포함된 발효 조성물을 처리한 세포에서는 TNF-α 발현이 LM119 발효 조성물(1.25 x 106 cfu/mL, 6.25 x 106 cfu/mL)에 비해 유의적으로 낮았으며, IL-6 발현이 LM119 발효 조성물(1.25 x 106 cfu/mL)에 비해 유의적으로 낮았다(도 9 및 도 11, ##p<0.01, #p<0.05).
또한, 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주가 1.25 x 106 cfu/mL, 2.5 x 106 cfu/mL 및 5.0 x 106 cfu/mL로 포함된 발효 조성물을 처리한 세포에서 모두 음성 대조군에 비해 TNF-α(도 10) 및 IL-6(도 12) 발현이 유의적으로 증가하였다(***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05). 류코노스톡 메센테로이데스 KCTC 3505 균주가 2.5 x 106 cfu/mL 포함된 발효 조성물을 처리한 세포에서는 TNF-α 발현이 LM119 발효 조성물(2.5 x 106 cfu/mL)에 비해 유의적으로 낮았으며, IL-6 발현이 LM119 발효 조성물(2.5 x 106 cfu/mL 및 5.0 x 106 cfu/mL)에 비해 유의적으로 낮았다(도 10 및 도 12, ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05).
실시예 3: 재료별 발효 조성물의 유해균 성장 억제 효과 확인
상기 제조예 4의 발효 조성물의 유해균 성장 억제 효과를 확인하기 위하여 식중독 유발 균으로 알려진 병원성 미생물인 대장균(Escherichia coli), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 각각 BHI(Brain heart infusion) broth 배지(BD DIFCO)에 접종 후 37℃에서 24시간 동안 배양하여 종균을 확보하였다. 상기 제조예 4의 발효 조성물을 BHI broth 배지로 각각 0, 25, 40 및 50%(v/v) 농도가 되도록 희석한 배지를 준비하였다. 96 웰-플레이트에 상기 희석 배지를 각각 200 μl씩 분주하고, E. coli 및 S. aureus 균주를 각각 1 x 106 cells/well이 되도록 시딩하였다. 상기 96 웰-플레이트를 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, Spectrophotometer를 이용하여 OD600값을 측정하였다. 발효 조성물을 0%로 함유하는 배지에서의 OD600값과 발효 조성물을 25, 40 및 50%(v/v)로 포함하는 희석 배지에서의 OD600값을 비교하여, 발효 조성물의 농도별 유해균 성장 억제율(Inhibition ratio, %)을 확인하였다. 성장 억제율은 다음 식으로부터 산출하였으며, 균주 접종을 하지 않은 각 희석 배지의 OD600값을 Blank로 하였다.
Figure PCTKR2022019030-appb-img-000001
그 결과, 제조예 1의 발효 조성물은 모든 농도에서 식중독 유발 균인 E. coli 및 S. aureus에 대해 90% 이상의 강한 성장 억제율을 나타내었다(도 13).
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2022019030-appb-img-000002

Claims (21)

  1. 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) CJLM119 균주 또는 이의 배양물 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 발효용 조성물.
  2. 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 발효한 발효물을 포함하는, 면역 증강용 식품 조성물.
  3. 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 발효한 발효물을 포함하는, 장건강 개선용 식품 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 발효물은 마늘, 고춧가루 및 질소원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 조성물을 발효시킨 것인, 식품 조성물.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 발효물은 조성물 전체 중량에 대하여 마늘을 5 내지 9 중량%로 포함하는 조성물을 발효시킨 것인, 식품 조성물.
  6. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 식품 조성물은 TNF-α 또는 IL-6의 발현을 증대시키는 것인, 식품 조성물.
  7. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 식품 조성물은 유해균의 생장을 억제시키는 것인, 식품 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 유해균은 에스케리키아 속(Escherichia sp.), 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.), 살모넬라 속(Salmonella sp.), 쉬겔라 속(Shigella sp.), 클렙시엘라(Klebsiella sp.), 엔테로박테리아세 속(Enterobacteriaceae sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 모락셀라 속(Moraxella sp.), 헬리코박터 속(Helicobacter sp.), 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.), 리스테리아 속(Listeria sp.) 및 비브리오 속(Vibrio sp.)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 식품 조성물.
  9. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 발효물은 32℃ 내지 42℃에서 10시간 내지 30시간 동안 발효시킨 것인, 식품 조성물.
  10. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 발효물은 탄소원 또는 소금 중 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 조성물을 발효시킨 것인, 식품 조성물.
  11. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 발효물은 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 또는 이로부터 유래하는 성분 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 식품 조성물.
  12. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 발효물은 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 발효된 발효물; 또는 상기 발효물을 추가로 발효한 발효물을 포함하는 것인, 식품 조성물.
  13. 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 발효한 발효물을 포함하는, 면역 증강용 건강기능식품.
  14. 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 발효한 발효물을 포함하는, 장건강 개선용 건강기능식품.
  15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 발효물은 마늘, 고춧가루 및 질소원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 조성물을 발효시킨 것인, 건강기능식품.
  16. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 발효물은 조성물 전체 중량에 대하여 마늘을 5 내지 9 중량%로 포함하는 조성물을 발효시킨 것인, 건강기능식품.
  17. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 발효물은 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 발효된 발효물; 또는 상기 발효물을 추가로 발효한 발효물을 포함하는 것인, 건강기능식품.
  18. 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 조성물을 발효하는 단계를 포함하는, 조성물의 면역 증강 효과를 증진시키는 방법.
  19. 류코노스톡 메센테로이데스 CJLM119 균주 또는 이의 배양물로 조성물을 발효하는 단계를 포함하는, 조성물의 장건강 개선 효과를 증진시키는 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 마늘, 고춧가루 및 질소원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 방법.
  21. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물인 것인, 방법.
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