KR101194798B1 - 김치로부터 분리된 유산균 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 김치로부터 분리되고 위해 미생물, 구체적으로 살모넬라 티피뮤리움, 마이크로코커스 류테우스, 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 세레우스 및 대장균에 대한 항균 활성을 가지고, 내담즙성을 가지며, 장내부착성이 있는 류코노스톡 메센테로이데스 균주(Leuconostoc mesenteroides)와 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 항균조성물 및 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 생균활성제(probiotics)에 관한 것으로, 본 발명의 경우 위해 미생물에 대한 항균활성이 뛰어날 뿐만 아니라, 장내환경에서 생존 가능하여 생균활성제로서 사용이 가능하므로 다양한 산업분야에 이용될 수 있다.

Description

김치로부터 분리된 유산균 및 그의 용도{LACTIC ACID BACTERIUM SEPARATED FROM KIMCHII AND USES THEREOF}

본 발명은 위해 미생물에 대한 항균 활성을 가지며, 산성 환경 및 장내 환경에서 생존 가능한 균주 및 상기 균주를 이용한 생균활성제(probiotics)에 관한 것이다.

유산균은 당류를 발효해서 50% 이상 젖산을 생성하는 세균으로, 인간이 이용할 수 있는 가장 유익한 미생물이다. 음식물뿐만 아니라 포유동물의 구강과 소화관, 토양 등 자연계에 널리 분포하고 있으며, 식품의 보존과 관능적 특성과 관련된 중요한 역할 등을 수행하는 인간생활에 유익한 균주이다. 전 세계적으로 오랜 기간에 걸쳐 유산균 함유 발효 식품으로 널리 식품으로 사용된 유산균은 최근에 GRAS(Generally Recognized As Safe) 미생물로 안정성을 인정받고 있다.

이러한 유산균의 안정성 및 유산균이 건강에 좋다는 인식을 기초로 하여 유산균 함유 식품을 통하여 건강을 유지하고, 질병을 예방하려는 노력이 증대되었으며, 최근 유산균을 기능성 식품에 사용하기 위하여 잠재력을 평가하기 위한 프로바이오틱 유산균에 대한 연구가 전 세계적으로 광범위하게 진행되고 있다.

프로바이오틱 유산균은 유래 및 이용에 대한 안정성이 인정될 뿐만 아니라 위장관 상부의 산성 조건 및 담즙 존재 하에서도 존재하여야 하고, 대장에서 부착이 가능해야 하며, 균주 안정성이나 생존력이 뛰어나야 한다. 현재 상기 요구 조건을 만족하는 프로바이오틱 유산균은 락토바실러스 속 균주(Lactobacillus sp.)와 비피도박테리움 균주(Bifidobacterium strain)가 대부분이다.

한편, 김치는 특별한 지식 없이도 가정에서 누구나 전래의 보편적인 방법으로 제조 가능한 식품으로, 보다 구체적으로는 삼국시대부터 발달한 한국의 대표적 전통발효식품으로 소금물에 절인 배추나 무 등의 채소류에 고춧가루, 파, 마늘 등의 양념류를 혼합하여 생활환경 주변에 존재하는 미생들에 의한 발효과정을 거쳐 숙성되는 대표적인 한국의 발효식품 중 하나이다.

최근에는 김치의 유용성에 관한 연구가 다수 발표되었으며, 일 예로 면역활성 증진 및 항암효과 등의 생리활성 기능이 밝혀지면서 영양공급 외에도 건강유지에 꼭 필요한 식품으로 인식되고 있고, 신선한 야채를 열처리하지 않고 담그기 때문에 야채의 모든 영양소가 유지되어 유산균에게 좋은 서식환경을 제공할 수 있으므로 유산균의 함유량이 발효유제품에 비하여 놓은 것으로 보고되어 있다.

상기 유산균에 대한 연구는 주로 유제품에 대해서 진행되어 왔으며, 오랜 역사에 비해 김치발효과정에 관여하는 유산균에 대해서는 최근에서야 체계적이고 과학적인 연구가 진행되고 있다.

따라서, 우리의 전통 발효음식인 김치발효과정에 관여하는 유산균 중에서 프로바이오틱 유산균 또는 위해 미생물에 대한 항균작용을 할 수 있는 유산균에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.

본 발명은 김치로부터 분리되고 위해 미생물에 대한 항균활성을 가지며, 프로바이오틱 유산균이 되기 위하여 내담즙성이 인정되고, 장내부착능이 우수한 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 활성성분으로 포함하는 항균조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 활성성분으로 포함하는 생균활성제(probiotics)를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 김치로부터 분리되고 위해 미생물에 대한 항균활성을 가진 류코노스톡 메센테로이데스 균주(Leuconostoc mesenteroides)를 제공한다. 바람직하게는 상기 위해 미생물은 모노코커스 류테우스 균주(Monococcus leteus), 살모넬라 티피뮤리움 균주(Salmonella typhymurium), 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균주(Vibrio parahaemoliticus), 바실러스 서브틸리스 균주(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스 균주(Bacillus cereus) 및 대장균(Escherichia coli)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균주일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 활성성분으로 포함하는 항균조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 활성성분으로 포함하는 생균활성제(probiotics)를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에 있어서, 배양물이란 특정 미생물을 배양배지 또는 배양액에서 배양한 것을 의미하며, 상기 배양물은 상기 특정 미생물을 포함하는 것일 수 있다. 상기 배양물은 그 제형이 한정되지 아니하고, 일 예로 액체 또는 고체일 수 있다. 이러한 측면에서, 배양액이란 액체배지에 특정 미생물을 접종하여 배양한 것을 의미한다. 또한, 본 발명에 있어서, 배양액의 농축액이란 상기 배양액을 농축한 것을 말하고, 배양액의 건조물이란 상기 배양액의 물기를 없앤 것 또는 제거한 것을 의미한다.

상기 배양배지란 동물세포나 식물세포 또는 세균 따위를 기르는 데 필요한 영양소가 들어 있는 고체 또는 액체를 의미한다. 상기 배지는 배양대상 즉, 배양체가 되는 미생물이나 세포가 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로, 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 불리우며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다.

본 발명에 있어서, 항균 조성물이란 항미생물제를 총칭하는 의미일 수 있고, 항균제, 방부제, 생물학적 보존제 또는 천연 보존제와 같은 의미일 수 있으며, 구체적으로 그람양성균, 그람음성균, 진균(효모 및 곰팡이)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질 즉, 항세균 및/또는 항진균 효력이 있는 물질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 생균활성제란 사람과 가축의 장내 미생물 균총의 개선으로 건강에 유익한 효능을 갖는 생균제재를 의미한다. 미생물이 생균활성제로 기능하기 위해서는, 위장을 통과하는 과정에도 일정 균수가 생존하여야 하므로, 내담즙성이 있어야 하고, 장내 생존력이 좋아 섭취 후 일정기간 그 활성이 유지될 수 있어야 한다.

본 발명의 발명자는 기존 외국에서 동정된 유산균이 아닌 우리 유산균 특히, 우리나라의 대표적인 전통 발효식품인 김치로부터 생균활성제로 사용가능한 프로바이오틱 유산균을 동정하기 위하여 연구하던 중, 기존 우리나라에서 생균활성제로 보편적으로 사용되는 락토바실러스 람노서스 GG(Lactobacillus rhamnosus GG)와 비교하여, 내담즙성이 현저하게 우수할 뿐만 아니라, 장내 부착능도 우수하고, 다양한 위해 미생물에 대한 항균 활성이 있으며, 락토바실러스 람노서스 GG와 대등한 면역활성 증진효과가 있는 균주인 FYRY1을 분리하였고, 상기 균주를 동정하여 GRAS(Genrally regarded as safe) 미생물인 유산균에 속하는 류코노스톡 메센테로이데스 균주(Leuconostoc mesenteroides)임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 김치로부터 분리되고 위해 미생물에 대한 항균활성이 있는 류코노스톡 메센테로이데스 균주(Leuconostoc mesenteroides), 보다 구체적으로는 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1(Leuconostoc mesenteroides FYRY1)에 관한 것이다.

본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1은 김치, 구체적으로 열무김치로부터 분리되었고, 식품 부패나 식중독 등과 관련된 위해 미생물에 대한 항균활성이 있으며, 하기와 같은 균학적 성질을 갖는 균주이다.

구체적으로, 상기 열무김치로부터 분리된 FYRY1 균주는 그람 양성(Gram-positive)의 구균으로, 흰 우유 색의 원형 콜로니를 형성하는 것으로 확인되었고, 용혈시험(Hemolysis)을 거친 결과 음성이고, LBS 배지에서 생육이 가능한 것으로 확인되었다. 또한, D-자일로스(D-Xylose), 만니톨(Mannitol), 락토스(Lactose), 수크로스(Sucrose), 트레할로스(Trehalose) 등의 당을 이용하여 생육할 수 있는 즉, 당대사능이 있는 것으로 확인되었다.

또한, 상기 FYRY1 균주는 16S rDNA 염기서열 분석결과, 서열번호 3에 나타낸 바와 같이 총 1453 bp의 16S rDNA을 가지고, 상기 16S rDNA의 염기서열은 Leuc . mesenteroides ssp . dextranicum NRIC1539T (AB023246)와 99%의 서열상동성을 나타내어, 최종적으로 류코노스톡 메센테로이데스로 동정되어, 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1로 명명되었다.

상기 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1(Leuconostoc mesenteroides FYRY1)은 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제1동 361-221번지 유림빌딩 2층에 위치한 한국미생물보존센터에 2009년 06월 25일자로 기탁하여, 수탁번호 KFCC 11452P를 부여 받았다.

상기 류코노스톡 메센테로이데스 균주는 바람직하게는 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1, 더욱 바람직하게는 김치로부터 분리되고 위해미생물에 대해 항균활성이 있으며, 기탁번호 KFCC 11452P를 갖는 류코노스톡 메센테로이데스 균주(Leuconostoc mesenteroides KFCC 11452P)일 수 있다.

상기 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1은 우수한 내담즙성 및 장내부착능을 가지고 있어서, 생균활성제 또는 프로바이오틱 유산균(probiotics)으로 요구되는 사항을 우수하게 만족하는 것으로 확인되었다.

구체적으로, 상기 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1은 소의 담즙액(oxgall)을 0.5% 함유시킨 MRS 배지를 이용하여 실험한 결과, 기존에 우수한 생균활성제로 보고되어 상업적으로 이용되고 있는 락토바실러스 람노서스 GG(Lactobacillus rhamnosus GG) 보다 현저하게 우수한 내담즙성을 갖는 것으로 확인되었다.

또한, 상기 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1은 Caco-2 세포주, HT-29 세포주 및 galactose를 이용해 소장의 점액조성으로 유도된 galHT 세포주(galactose-induced HT-29 cell line)에 대하여 장내부착능을 시험한 결과, 락토바실러스 람노서스 GG 보다 뛰어난 장내부착능을 갖는 것으로 확인되었다. 보다 구체적으로, Caco-2 세포주를 이용한 실험 결과, 상기 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1은 락토바실러스 람노서스 GG 보다 2배 우수한 부착율을 갖는 것으로 확인되었고, galHT 세포주를 이용한 경우에는 약 2배, HT-29 세포주를 이용한 경우에는 약 8배 정도 더 우수한 부착율을 갖는 것으로 확인되어, 실제로 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1이 장내에 섭취되는 경우, 소장 및 대장의 점액층에서 더 높은 부착가능성을 가지어, 생균활성제로 우수하게 활용될 수 있을 것으로 예상되었다.

또한, 상기 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1은 위해 미생물에 대한 항균 활성을 갖는다. 상기 위해 미생물은 식품과 관련하여 식품을 오염하여 부패의 원인이 되고, 식중독 등의 원인이 되는 미생물인 식품 오염 미생물 또는 식중독 원인균일 수 있고, 상기 식품 오염 미생물로 크게 바실러스 속(Bacillus sp.), 마이크로코커스 속(Micrococcus sp.) 등이 있으며, 장염이나 식중독의 원인이 되는 상기 식중독 원인균은 살모넬라 속(Salmonella sp.), 비브리오 속(Vibrio sp.), 대장균(Escherichia coli) 등이 있다. 이 중, 마이크로코커스 속 균주는 그람 양성의 구균으로, 단백질 분해력이 강하고, 어패류, 유제품이나 면류의 식품의 오염의 원인으로 지목되며, 상기 마이크로코커스 류테우스 균주(Micrococcus leteus)는 가장 많이 발견되는 종으로 피부에서 분리되는 피부 상재균이다. 상기 살모넬라 속 균주는 식중독 등을 일으키는 위해 미생물로, 특히 상기 살모넬라 티피뮤리움 균주(Salmonella typhymurium)는 장티푸스의 원인균으로 알려져 있다. 상기 비브리오 속 균은 식중독 등의 원인균으로, 특히, 상기 장염 비브리오균(Vibrio parahaemolyticus)은 해산물 특히 갑각류와 연체류에 부착되어 있고, 사람들의 몸 속에 들어가 식중독이나 급성 위장염을 일으키는 것으로 보고 되고 있다. 상기 장염 비브리오균에 의해 장염이나 식중독이 발병하는 경우, 급성 위장염을 일으킬 수 있고 이 외의 증세로는 심한 복통, 설사, 발열, 구토, 구역질 및 복부의 심한 통증 등이 있다.

상기 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1은 바람직하게는 마이크로코커스 류테우스 균주(Micrococcus leteus), 살모넬라 티피뮤리움 균주(Salmonella typhymurium), 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균주(Vibrio parahaemoliticus), 바실러스 서브틸리스 균주(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스 균주(Bacillus cereus), 및 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균활성을 가지는 것일 수 있다.

또한, 상기 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1은 면역 증강 활성 또는 면역 개선 활성을 가지며, 구체적으로 면역세포로부터 사이토카인(cytokine) 중 TNF-α, IL-12 및 IL-1β의 분비를 촉진하는 것으로 확인되었다.

본 발명에 있어서, 사이토카인이란 면역세포 또는 백혈구가 자극에 의하여 분비되는 미량의 생물활성물질로, 면역세포, 백혈구, 조혈세포, 혈관구성세포, 신경세포 및 내분비세포 등 다양한 세포들에 작용하여 면역 반응 등의 다양한 반응을 유도하는 물질을 의미한다.

일 예로, TNF-α는 병원성 미생물에 대한 방어에 관련된 사이토카인(cytokine)으로 병원성 미생물이 감염되는 경우, 체내에서 가장 먼저 반응하는 대식세포로부터 분비된다. 따라서, 상기 TNF-α의 분비량이 높아지면, 대식세포의 식균작용을 활성화(activation)시키고, 그 외 자연사멸세포(NK-cell)나 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)를 활성화시켜, 병원성 미생물이 감염에 대하여 빠른 면역 반응을 유도함으로써, 병원성 미생물 사멸 증진효과를 얻게 된다.

또한, IL-12는 TH1(T helper cell type 1) 및 TH2(T helper cell type 2)의 면역조절기작에 대한 스위치 역할을 하는 사이토카인이다. 구체적으로, 염증반응을 유도하는 TH1 면역반응과 관련하여, 병원성 미생물이 감염되는 경우 등에 자연사멸세포를 활성화하여, 자연사멸세포에 의한 면역작용을 유도하거나 세포독성 T 세포를 활성화시킨다. 또한, IL-12는 알레르기를 일으키는 TH2 면역반응과 관련하여, 항알레르기 작용을 수행하며, 구체적으로 IL-4의 분비량을 감소시켜, 면역세포들이 분비하는 과도한 량의 IL-4 또는 IFN-gamma에 따른 알레르기 반응을 염증반응을 유도하는 Th1 면역반응으로 전환시킬 수 있다.

상기 확인된 사실은 상기 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1은 IL-4의 분비량을 감소시키는 IL-12의 분비를 촉진시켜 항 알레르기는 작용을 하고, TNF-α 및 IL-12의 분비를 촉진하여 대식세포의 식균작용을 활성화시키고, 자연사멸세포(NK-cell)나 cytotoxic T 세포의 면역작용을 활성화시켜 항암 작용을 수행하며, 위해 미생물에 감염되는 경우, 상기 위해 미생물 또는 병원성 미생물에 대한 방어에 관련된 사이토카인(cytokine)인 TNF-α 및 IL-12의 분비를 촉진하여 대식세포의 식균작용을 활성화시키고, 자연사멸세포(NK-cell)나 세포독성 T 세포의 면역작용을 활성화시켜 병원성 미생물에 대한 초기 면역 효과를 향상시킬 수 있는 것으로 예상된다.

또한, 상기 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1은 적혈구와 함께 배양한 경우에도 용혈반응이 일어나지 않아 인체에는 무독하다는 것이 확인되었다.

상기와 같은 결과에 의하면, 상기 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1은 위해 미생물에 대한 항균 활성을 가지고, 내담즙성이 우수하며, 장내부착능이 뛰어나고 면역 개선 효과를 가지며, 안전성도 확보되어, 항균 조성물의 유효성분 또는 생균활성제로 응용될 수 있다.

이러한 측면에서, 본 발명은 상기 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 위해 미생물에 대한 항균 조성물에 관한 것이다.

상기 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1은 바람직하게는 기탁번호 KFCC 11452P를 갖는 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1 (Leuconostoc mesenteroides KFCC 11452P)일 수 있다.

상기 항균 조성물은 상기 위해 미생물에 대한 미생물 감염의 예방 및 개선용 조성물로 사용될 수 있고, 의약용 조성물이나 식품 조성물 등으로 응용될 수 있다.

또한, 상기 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1 또는 상기 균주를 배양한 배양배지는 위해 미생물에 대한 항균활성을 갖는다. 상기 균주를 배양한 배양배지는 일 예로 상기 균주가 배양된 배양액일 수 있다.

구체적으로, 상기 위해 미생물은 일 예로 식품 부패의 원인균인 마이크로코커스 속 균주(Micrococcus sp.), 바람직하게는 마이크로코커스 류테우스 균주(Micrococcus leteus), 식중독의 원인균인 살모넬라 속 균주(Salmonella sp.), 바람직하게는 살모넬라 티피뮤리움 균주(Salmonella typhimurium), 장염의 원인이 되는 비브리오 속 균주(Vibrio sp.), 바람직하게는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균주(Vibrio parahaemoliticus), 식품 또는 변패의 원인균인 바실러스 속 균주(Bacillus sp.), 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 균주(Bacillus subtilis) 및 바실러스 세레우스 균주(Bacillus cereus) 및 설사, 장염 등을 일으키는 대장균(Escherichia coli)일 수 있다.

상기 항균조성물에 포함되는 상기 유효성분의 함량은 사용목적 및 사용방법 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들어 전체 조성물을 기준으로 0.01 내지 99 중량부, 바람직하게는 0.1 내지 90 중량부, 더욱 바람직하게는 1 내지 75 중량부일 수 있다. 상기 항균조성물에는 통상적으로 사용되는 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 생균활성제를 제공한다.

상기 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1은 바람직하게는 기탁번호 KFCC 11452P를 갖는 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1 (Leuconostoc mesenteroides KFCC 11452P)일 수 있다.

본 발명에서 생균활성제란 사람과 가축의 장내 미생물 균총의 개선으로 건강에 유익한 효능을 갖는 생균제재를 의미한다. 미생물이 생균활성제로 기능하기 위해서는, 장내 생존력이 좋아 섭취 후 일정기간 그 활성이 유지되어야 한다. 상기 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1은 위해 미생물에 대한 항균활성을 나타낼 뿐만 아니라, 소의 담즙액을 포함하는 인공담즙에 대한 높은 저항성을 나타내며, 적혈구와 함께 배양한 경우 용혈반응이 일어나지 않는 것으로부터 확인된 바와 같이 인체에 무독하므로, 생균활성제로 기능하기 위한 조건을 모두 만족한다.

상기 생균활성제에 포함되는 항균조성물의 함량은 사용목적 및 사용방법 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있으며, 바람직하게는 전제 조성물을 기준으로 0.01 중량부 내지 99 중량부, 더욱 바람직하게는 0.1 중량부 내지 90 중량부일 수 있다. 상기 생균활성제에는 통상적으로 사용되는 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 생균활성제가 포함된 식품을 제공한다. 상기 생균활성제는 식품 부패 또는 변패의 원인균인 마이크로코커스 속 균주, 바람직하게는 마이크로코커스 류테우스 균주, 바실러스 속 균주, 바실러스 서브틸리스 균주 및 바실러스 세레우스 균주에 대한 항균활성을 가지므로 식품의 부패 또는 변패를 저지 또는 완화할 수 있으며, 식중독의 원인균인 살모넬라 속 균주, 살모넬라 타이피뮤리움 균주에 대한 항균활성을 가지므로, 식중독의 예방 또는 개선효과가 있다. 또한, 장염의 원인이 되는 비브리오 속 균주, 바람직하게는 비브리오 파라헤몰리티쿠스에 대한 항균활성을 가지므로 장염 예방 또는 완화 효과가 있을 수 있고, 설사, 장염 등을 일으키는 대장균에 대한 항균활성을 가지므로 설사 및 장염의 예방 또는 개선 효과가 있다.

본 발명에서 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며 그 예로는 과일, 야채, 과일이나 야채의 건조제품이나 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 이들의 혼합쥬스 이거나 칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효식품, 두류식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공류, 산성음료수, 감초류, 허브류 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 생균활성제를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 생균활성제는 식품류, 음료, 건강음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류의 제조시 원료 물질에 첨가되거나 조리된 식품에 적절히 혼합하는 방법으로 첨가될 수 있으며, 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제와 함께 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 생균활성제의 양은 전체 식품 중량의 0.01 중량% 내지 90 중량%로 가할 수 있으며, 음료의 경우 100 mL를 기준으로 0.02 g 내지 20 g, 바람직하게는 0.5 g 내지 10 g의 비율로 가할 수 있다.

상기 식품은 일 예로 발효식품, 건강식품 또는 음료일 수 있다.

본 발명에서 발효식품이란 유산균이나 효모 등 미생물을 한 가지 또는 둘 이상 첨가하고 상기 미생물의 발효 작용을 이용하여 만든 식품을 의미하며, 상세하게는 식품 기재에 발효식품용 종균을 첨가하고 숙성시켜 제조하는 식품을 의미한다. 상기 발효식품으로는 주류, 빵류, 김치, 젖갈, 된장, 간장, 치즈, 버터, 요구르트 등 비살균 개방형 발효식품 모두가 포함된다.

또한, 상기 생균활성제는 발효식품용 종균으로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 김치의 종균으로 사용될 수 있다. 이때 종균의 사용량은 발효식품의 종류 및 종균의 종류에 따라 적절히 조절하는 것이 좋다. 바람직하기로는 식품 주재료 100 중량을 기준으로 0.0001 내지 0.01 중량부(습윤 중량부)로 접종하는 것이다.

본 발명에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.

본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하고 주류, 청량음료, 물, 시럽, 차, 커피, 과실음료 등이 이에 해당되며 유산균 음료를 포함한다. 유산균 음료란 유산균을 배양하여 유산발효시킨 것에 살균수를 가해서 희석하고 당분, 향료 등을 가한 음료를 의미한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 생균활성제를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1(Leuconostoc mesenteroides FYRY1)은 내담즙성이 뛰어나고, 장내 세포에 대한 부착능도 우수하고, 다양한 위해 미생물, 구체적으로 살모넬라 티피뮤리움 균주, 마이크로코커스 류테우스 균주, 바실러스 서브틸리스 균주, 바실러스 세레우스 균주, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균주 및 대장균에 대한 항균활성을 가짐으로써 생균활성제로 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1의 전자현미경 촬영 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1의 16S rRNA의 염기서열이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1의 16S rRNA의 염기서열을 기초로 한 다른 세균(bacteria)과의 계통발생론적 관계를 나타내는 그림이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균의 Caco-2 세포주에 대한 부착능을 확인한 사진으로, 도 4a는 비교예인 락토바실러스 람노서스 GG의 세포부착능을 확인한 사진이고, 도 4b는 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1의 세포부착능을 확인한 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1과 락토바실러스 람노서스 GG의 TNF-α 생산량을 비교하여 나타낸 그래프로, 세로축은 분비된 TNF-α 생산량을 1mL 상등액 당 사이토카인의 양을 ng으로 표시한 것이고, 가로축은 각 균주의 첨가된 양을 log CFU/mL 즉, 상등액 1mL 당 포함된 유산균의 수를 log 단위로 표시한 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1과 락토바실러스 람노서스 GG의 IL-12 생산량을 비교하여 나타낸 그래프로, 세로축은 분비된 IL-12 생산량을 1mL 상등액 당 사이토카인의 양을 ng으로 표시한 것이고, 가로축은 각 균주의 첨가된 양을 log CFU/mL 즉, 상등액 1mL 당 포함된 유산균의 수를 log 단위로 표시한 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1과 락토바실러스 람노서스 GG의 IL-1β 생산량을 비교하여 나타낸 그래프로, 세로축은 분비된 IL-1β 생산량을 1mL 상등액 당 사이토카인의 양을 ng으로 표시한 것이고, 가로축은 각 균주의 첨가된 양을 log CFU/mL 즉, 상등액 1mL 당 포함된 유산균의 수를 log 단위로 표시한 것이다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 유산균주의 분리 및 동정

1-1 유산균주의 분리

열무김치의 가식부위와 액상부위를 1:1로 혼합하여 10g을 잰 뒤, 90 mL의 멸균수에 넣고 마쇄하였다. 단계희석(serial dilution)을 수행하여 MRS(+0.5% CaCO₃) 고체배지에 분주하고 30℃에서 2일 동안 배양하였다. 생성된 콜로니 중 CaCO₃에 대하여 투명환을 보인 균주를 선별하여 그람 염색과 카타라제 시험(catalase test)을 통해 유산균을 분리하였다.

1-2 유산균주의 동정

실시예 1-1에서 분리된 유산균인 FYRY1는 그람염색을 비롯한 형태학적 특성을 이용한 형태학적 분석, 당대사능을 포함한 생화학적 분석 및 16S rDNA 염기서열 분석을 통하여 동정하였다.

상기 형태학적 특성에 대한 분석은 상기 실시예 1-1의 분리균주인 FYRY1의 콜로니의 모양 및 색을 관찰하고, 상기 균주를 그람염색한 후에, 광학현미경(SEM)으로 모양을 관찰하였으며(도 1 참조), 용혈여부도 관찰하여 그 결과를 표 1 및 도 1에 나타내었다.

특 성	FYRY1
Source	열무김치
형태(Morphology, Shape)	구균
그람염색(Gram-stain) 여부	+
카탈라아제 시험(catalase test)	-
Acid production(pH)	pH 4.48
Hemolysis	-
콜로니 색깔 (colony color)	흰 우유 색

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 상기 분리균주인 FYRY1은 광학현미경 관찰 결과 구균 형태이고, 흰 우유 색의 콜로니를 형성하며, 생육배지의 pH는 pH 4.48이었고, 용혈시험을 거친 결과 음성이었고, LBS 배지에서 생육이 가능한 것으로 확인되었다.

또한, 상기 16S rDNA 염기서열 분석을 통한 동정을 수행하였다. 구체적으로, 상기 분리균주 FYRY1로부터 16S ribosomal RNA를 추출한 후, 하기 표 2에 기재된 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써 16S rRNA 염기서열 분석을 수행하여, 상기 분리균주 FYRY1의 16S rRNA로 총 1,453 bp의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과를 도 2 및 서열번호 3에 나타내었다.

Primers	서열 (5′ → 3′)	서열번호
27F	AGAGTTTGATCCTGG CTCAG	1
1492R	GGTTACCTTGTTACGACTT	2

상기 결정된 염기서열을 기초로 염기서열의 검사는 3730 XL 염기서열분석기(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 분석하였으며, CLUSTRAL W 프로그램을 이용하여 각 균주의 상동성을 비교하였다.

상기 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 결정된 서열을 이용하여 상동성 검색을 실시한 결과를 기초로 다른 세균과의 계통발생론적 관계를 도 3에 나타내었다. 상기 도 3에 나타낸 바와 같이, Leuc . mesenteroides ssp . dextranicum NRIC1539T(AB023246)에 대해 99.45%(1443/1451), Leuc . pseudomesenteroides NRIC1777T(AB023237)에 대해 98.90%(1432/1448)의 유사성을 나타냈다. 또한, Leuc. mesenteroides ssp . mesenteroides DSM20343T (M23035)에 대해서는 99.10%(1540/1554), Leuc . mesenteroides ssp . cremoris DSM20346T (M23034)에 대해서는 98.46%(1468/1491)의 유사성을 나타내었다.

또한, 당 대사능을 검토하여 수행하였으며, 16S rDNA 염기서열 분석결과 높은 유사성을 지닌 균주들에 대한 탄수화물 이용성 자료가 없으므로, Leuc . mesenteroides ssp . mesenteroides DSM20343T(M23035) 및 Leuc . mesenteroides ssp. cremoris DSM20346T (M23034)와 99%의 유사성을 지닌 Leuconostoc sp . 51-3을 비교예로 하여, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 하기 표 3에 기재된 +은 양성 반응을 의미하고, -는 음성 반응을 의미한다.

	FYRY1	51-3		FYRY1	51-3
Glycerol	-	-	Salicin	D	+
Erythritol	-	-	Cellobiose	-	-
D-Arabinose	-	-	Maltose	+	+
L-Arabinose	+	+	Lactose	D	-
Ribose	D	+	Melibiose	+	+
D-Xylose	+	+	Sucrose	+	+
L-Xylose	-	-	Trehalose	+	+
Adonitol	-	-	Inulin	-	-
MD-Xyloside	-	-	Melezitose	-	-
Galactose	+	+	Raffinose	+	+
Glucose	+	+	Amidon	-	-
Fructose	+	+	Glycogen	-	-
Mannose	+	+	Xylitol	-	-
Sorbose	-	-	Gentiobiose	-	-
Rhamnose	-	-	D-Turanose	+	+
Dulcitol	-	-	D-Lyxose	-	-
Inositol	-	-	D-Tagatose	-	-
Mannitol	D	-	D-Fucose	-	-
Sorbitol	-	-	L-Fucose	-	-
α Methyl-D-mannoside	-	-	D-Arabitol	-	-
α Methyl-D-glucoside	+	+	L-Arabitol	-	-
N Acetyl glucosamine	D	+	Gluconate	D	-
Amygdalin	-	-	2 keto-gluconate	-	-
Arbutin	V	-	5 keto-gluconate	V	-
Esculin	+	+

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 상기 분리균주인 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1는 mannitol, lactose, gluconate, 5-keto-gluconate, arbutin은 이용하며, ribose, salicin, N-acetyl glucosamine도 이용하는 것으로 나타났으나 51-3 균주에 비해 이용성이 떨어지는 것으로 확인되었다.

상기 분석 결과, FYRY1 균주는 Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris로 동정되었고, 상기 균주를 2009년 06월 25일에 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제1동 361-221번지 유림빌딩 2층에 위치한 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KFCC 11452P를 부여 받았다.

< 실시예 2> 위해 미생물에 대한 항균 활성 측정

상기 실시예 1에서 동정된 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1의 항균활성의 확인은 하기 표 4에 기재한 지시 균주 각각에 대한 spot-array 실험을 통하여 수행하였다. 구체적인 실험방법은 하기와 같다.

상기 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1을 MRS 액체배지에 접종 후, 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양한 균체를 원심분리를 통해 회수하고, 멸균수로 OD₆₀₀값을 1.0으로 조절하여, MRS 고체배지에 10 μl를 점적하였다. 약 2시간 동안 건조시켜 위해 미생물에 대한 특정배지로 형성된 0.5% Agar를 포함한 top agar 배지에 하기 표 4에 기재된 위해 미생물을 0.1% 접종하여 현탁시킨 것을 상기 고체배지에 도말하였다. 상기 위해 미생물을 유산균의 생육온도에서 16시간 동안 배양하여 유산균 점적 주변으로 생긴 투명환 즉, 저해환의 지름을 측정하였으며, 그 결과를 상기 표 4에 기재하였다.

상기 표 4의 항균활성 표기와 관련하여 '+++'는 성장 저해 정도가 강함을 의미, '++'는 성장 저해 정도가 중간임을 의미, '+'는 성장 저해 정도가 약간 있음을 의미, '-'는 성장을 저해하지 않음을 의미한다.

위해 미생물	FYRY1의 항균활성
Bacillus cereus ATCC 27348	+
Bacillus subtilis ATCC 6633	++
Salmonella typhymurium KCTC 2515	++
Micrococcus luteus ATCC 13513	++
Lactobacillus plantarum ATCC 8014	-
Listeria monocytogenes ATCC 19113	-
Vibrio parahaemoliticus ATCC 27969	++
Escherichia coli ATCC 25922	+

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1는 Lactobacillus plantarum과 Listeria monocytogenes를 제외한 나머지 균주들에 대해 항균 능력을 나타냈으며, 특히 Micrococcus luteus 및 Escherichia coli에 대한 항균력이 있음이 확인되었다.

상기한 결과는 식품의 제조 및 가공 등의 이용에 있어서 유산균체나 그 배양여액을 이용하여 통조림식품에서의 포자 형성균을 제어하거나 발효유, 발효알콜음료, 유제품 등 여러 가지 식품 및 사료에 천연보존제로 사용함으로써 저장성 향상뿐만 아니라 열 처리량 감소에 의한 영양적 가치, 맛 및 조직감을 향상시킬 수 있고, 저온성 균, 병원성 균 및 부패미생물의 제어에도 사용될 수 있을 것으로 예상되었다.

< 실시예 3> 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1 의 프로바이오틱 이용 가능성

류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1가 장에 도달하기 위해서는 그 전에 췌장과 십이지장을 통과하게 되는데, 이 부위에서는 담즙액이 분비된다. 따라서 최종적으로 장내로 들어오기 위해서는 담즙액에 대한 내성 또한 갖추어야 할 중요한 특성이다. 따라서, 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1에 대하여 내담즙성 시험을 수행하였다. 또한, 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1가 장에 도달하여, 프로바이오틱 미생물로 작용하기 위해서는 장 내에 오랜 시간 동안 존재하여야 하므로, 장내 부착성에 관한 시험을 수행하였다.

3-1. 내담즙성

상기 실시예 1의 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1의 내담즙성 시험은 황소의 담즙(oxgall)이 0.5% 함유된 배지를 이용하여 수행하였다.

상기 내담즙성의 측정은 구체적으로 전배양을 거친 상기 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1를 MRS 5 ml에 2.5×10⁶ CFU/ml이 되게 접종한 후, 30℃에서 24시간 배양하고, 상기 배양액 5 ml를 원심분리하여 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1를 회수한 다음, 멸균수에 2번 세척하고, 상기 각각의 배지에 접종하고 30℃에서 24시간 배양한 후, 단계별 희석을 통해 생균수를 측정하는 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

또한, 상기 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1의 비교예로, 프로바이오틱 미생물로 확인된 락토바실러스 람노서스 GG(L. rhamnosus GG)의 내담즙성을 확인하여 비교하였다. 상기 생균수는 실험에서의 오차를 줄이기 위해, 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1와 락토바실러스 람노서스 GG를 각각 3번씩 배양하여 측정하였고, 상기 각각의 측정값의 평균값을 측정결과로 사용하였다.

균종	No treatment	내담즙성(0.5% oxgall)
L. rhamnosus GG	10.045 log CFU/ml	8.875 log CFU/ml
FYRY1	9.447 log CFU/ml	9.279 log CFU/ml

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1는 락토바실러스 람노서스 GG 와 비교하여 내담즙성이 뛰어난 것으로 확인되었다. 보다 구체적으로, 아무런 처리를 하지 않은 경우 본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1은 락토바실러스 람노서스 GG에 비하여 균체수가 약간 적게 확인되었으나, 내담즙성 실험을 위하여 황소의 담즙이 0.5% 함유된 배지를 이용하여 배양한 결과, 배양 뒤에 오히려 균체수가 많은 것으로 확인되어, 기존에 생균활성제로 사용되는 락토바실러스 람노서스 GG에 비해 내담즙성이 우수한 것으로 확인되었다.

3-2. 장내 부착능

상기 실시예 1의 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1의 장내 부착능을 Caco-2, HT-29 및 갈락토스를 이용해 소장의 점액조성으로 유도된 galHT(galactose-induced HT-29 cell line)를 이용하여 측정하였다.

보다 구체적으로, 상기 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1를 배양한 후, 원심분리를 통해 회수하고, 상기 배양된 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1의 농도를 OD₆₀₀값을 1.0으로 조절하였다. 상기 농도를 조절한 균주 100 μl를 췌장 세포(colon cell) 즉, 상기 Caco-2, HT-29 또는 갈락토스에 의해 소장의 점액조성으로 유도된 galHT이 배양된 24 well plate의 각 well에 넣고 1시간 동안 배양하였다.

상기 plate에 배양한 후, PBS로 3번 세척하고, 0.1% TritonX 100을 사용하여 상기 췌장 세포 및 유산균을 well plate 바닥에서 떼어내고 일정 수준으로 희석 후, 생균수를 측정하였다. 비교예로는 장내 부착능이 우수한 것으로 확인된 락토바실러스 람노서스 GG(L. rhamnosus GG)와 장내 부착능이 없는 것으로 확인된 대조예(negative control)인 락토바실러스 아시도필러스를 사용하였으며, 상기와 동일한 방법으로 생균수를 측정하여, 부착능을 확인하였다.

상기 부착능을 확인한 결과를 하기 표 6 및 표 7과 도 4에 나타내었다. 하기 표 6 및 하기 표 7에 기재된 부착세포는 세포주 당 부착세포 즉, 해당 세포주 당 부착된 유산균의 수를 나타낸 것으로, 부착된 유산균의 수를 나타낸 단위는 log CFU/well이며, 부착율은 초기세포수에 대한 부착세포수를 나타낸 것이다.

	초기 측정치	세포주 당 부착세포수	부착율
L. rhamnsosus GG	8.3243±0.5255	5.6288±0.2475	1.2912±0.2153
L. acidophilus	7.2715±0.7385	3.3880±0.6684	0.0118±0.0137
FYRY1	8.399±0.4152	5.8719±0.2952	2.2261±0.9683

	HT-29			Gal HT
	초기 세포수	세포주 당 부착세포수	부착율	초기 세포수	세포주 당 부착세포수	부착율
L. rhamnsosus GG	7.9938 ±0.2744	4.8745 ±0.5702	0.0784 ±0.0268	7.9212 ±0.6000	5.4327 ±0.2739	0.4357 ±0.0741
L. acidophilus	6.7285 ±0.6630	2.3211 ±0.9482	0.0007 ±0.0011	7.1774 ±0.4524	2.1809 ±0.4752	0.0003 ±0.0000
FYRY1	8.4231 ±0.1128	5.8273 ±0.2106	0.6006 ±0.4268	8.3877 ±0.1298	5.6154 ±0.7022	0.9355 ±0.8875

상기 표 6 및 도 4에 나타낸 바와 같이, Caco-2에 대한 부착율은 상기 류코노스톡 메센테로이데스 균주 FYRY1이 락토바실러스 아시도필러스는 물론, 장내 부착능이 우수한 것으로 보고된 락토바실러스 람노서스 GG에 비해서도 약 2배 높았고, 초기 주입된 생균수와 부착된 생균수를 비교한 결과에서도, 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1는 락토바실러스 람노서스 GG에 비해서 현저하게 우수한 부착능을 갖는 것으로 확인되었다. 또한, 표 7에 나타낸 바와 같이, HT-29 및 galHT를 이용하여 측정한 결과에서도, 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1는 락토바실러스 아시도필러스는 물론, 장내 부착능이 우수한 것으로 보고된 락토바실러스 람노서스 GG보다 각각 약 2배 및 약 8배 우수한 부착능을 갖는 것으로 확인되어, 소장 및 대장 점액층에서의 부착 가능성도 높은 것으로 확인되었다.

상기 결과로부터, 본 발명의 균주인 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1는 내담즙성이 우수하여, 경구섭취 시 다량의 생균이 장내에 도착할 수 있는 것은 물론, 장내에 부착하여 활동할 수 있으므로, 프로바이오틱 미생물 또는 생균활성제로 유용하게 사용할 수 있는 것으로 확인되었다.

< 실시예 4> 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1 의 면역활성 측정

상기 생균활성제로 이용가능한 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1가 면역증강 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 상기 균주가 사이토카인, 보다 구체적으로 TNF-α, IL-1β 및 IL-12의 분비에 미치는 영향을 확인하였다. 상기 TNF-α, IL-1β 및 IL-12는 병원성 미생물에 대한 방어에 관련된 사이토카인(cytokine)이다. 특히, 상기 TNF-α 및 상기 IL-12의 분비가 촉진되면 대식세포의 식균작용이 활성화되고, 자연사멸세포(NK-cell)나 세포독성 T 세포의 면역작용이 활성화되어 병원성 미생물에 대한 초기 면역 효과가 향상된다.

상기 실험은 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받은 male mouse macrophage인 RAW264.7 세포주(cell line)를 10% FBS(Fetal Bovine Serum), 1mM sodkum pyruvate, 100IU penicillin/streptomycin, 10mM HEPES가 첨가된 DMEM high glucose(Hyclone, USA)에서 37℃ 및 5% CO₂의 조건으로 2일마다 동일한 조성의 배지로 바꿔주면서 confluent state까지 배양하였다.

상기 RAW264.7 세포주를 24 well plate(Falcon CO., USA)에 각 well 당 5 X 10⁵ cells/mL로 분주한 후, 95% 이상 생육하여 단층을 구성하도록 배양하였고, 유산균체를 혼합하기 전 PBS(pH 7.4)로 세척하였다. MRS 액체배지에 배양된 유산균 현탁액을 12,000 rpm의 조건으로 5분간 원심분리를 수행하여 균체를 회수한 후, PBS(pH 7.4)로 세척하였다. 상기 PBS로 세척한 균체를 OD₆₀₀값이 1.0이 되도록 항생제가 없는 RPMI 배지에 현탁하였다. 상기 유산균 현탁액 100 μl를 항생제가 없는 RPMI 배지 0.9ml와 혼합하고, 이를 단층을 형성한 RAW264.7 세포주와 함께 24시간 동안 37℃ 및 5% CO₂의 조건으로 배양하였다.

상기 배양한 배양액으로부터 상등액만을 수득하였다. 상기 상등액에 대해 12,000 rpm의 조건으로 5분간 원심분리를 수행하여 유산균을 제거한 후, 상등액을 회수하였다. 상기 균체를 제거한 상등액 중에 분비된 사이토카인(cytokine)의 함량은 ELISA kit(Enogen, USA)를 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 5 내지 도 7에 나타내었다.

상기 도 5 내지 도 7에 나타낸 바와 같이, 류코노스톡 메센테로이데스 FYRY1은 사이토카인 중, IL-1β에 대해서는 락토바실러스 람노서스 GG와 유사수준의 분비 양상을 보였고 TNF-α 및 IL-12 분비에 대해서는 농도 의존적 자극효과를 보여, 면역활성 개선 효과가 있는 것으로 예상되었다.

한국미생물보존센터(국내) KFCC11452P 20090625

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Claims (4)

1. 김치로부터 분리되고 마이크로코커스 류테우스(Micrococcus leteus), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemoliticus), 바실러스 서브틸리스 균주(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스 균주(Bacillus cereus) 및 대장균(Escherichia coli)에 대해 항균활성을 가지며, 내담즙성을 가지는 기탁번호 KFCC 11452P를 갖는 류코노스톡 메센테로이데스 균주(Leuconostoc mesenteroides KFCC 11452P).
2. 제 1항에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이데스 균주는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 16S rRNA를 가지고, 장내부착성이 있으며, 면역세포로부터 TNF-α, 인터루킨-1β(Interleukin-1β, IL-1β) 및 인터루킨-12(Interleukin-12, IL-12)의 분비를 촉진시킬 수 있는 류코노스톡 메센테로이데스 균주(Leuconostoc mesenteroides)KFCC 11452P.
3. 제1항의 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항균조성물.
4. 제1항의 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 생균 활성제.

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