WO2013151362A1 - 신규 바실러스 서브틸리스 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a novel Bacillus subtilis CJMPB957 (KCCM11271P) strain and a probiotic agent comprising the same, and a method for preventing or treating diseases of a domestic animal using the same.
- KCCM11271P Bacillus subtilis CJMPB957
- Bacterial diseases causing livestock infections include diarrheal disease caused by Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC), colibailosis caused by avian pathogenic Escherichia coli (APEC), Salmonellosis causing sepsis and acute enteritis. ), Necrotic enteritis caused by the Clostridium sp.
- aspergillosis caused by Aspergillus sp. which grows on grains, is a fungal disease that causes appetite, fever, shortness of breath, diarrhea and cramps. .
- probiotics include the following.
- Korean Patent Laid-Open Publication No. 2010-0076263 discloses Lactobacillus Fermentum BLAB19 having E. coli and Salmonella inhibitory effect for preventing calf diarrhea.
- Republic of Korea Patent No. 10-0878799 discloses antibiotics-resistant pathogenic microorganisms or enteropathogenic microorganisms Ed woji Ella the tar (Edwardsiella tarda), Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Bacillus amyl Lowry kwipe sieon to inhibit the growth of (Staphylococcus epidermidis) bus (Bacillus amyloliquefaciens ) K37.
- Korean Laid-Open Patent Publication No. 2006-0026371 discloses Lactobacillus Fermentum 12-1 (KACC91135) that inhibits Escherichia coli that causes pig diarrhea.
- An object of the present invention is to provide a Bacillus subtilis CJMPB957 (KCCM11271P) excellent in antibacterial and antifungal activity, excellent in complex digestive enzyme production capacity, acid resistance and bile resistance.
- an object of the present invention is to provide a probiotic formulation, feed additives and feed comprising the Bacillus subtilis CJMPB957 (KCCM11271P) strain or its culture.
- an object of the present invention is to provide a method for preventing or treating bacterial or fungal diseases of livestock by administering the Bacillus subtilis CJMPB957 (KCCM11271P) strain or its culture to livestock.
- the present invention relates to a novel isolated Bacillus subtilis CJMPB957 (KCCM11271P) strain and a probiotic agent comprising the same, and a method for preventing or treating diseases of a domestic animal using the same.
- KCCM11271P Bacillus subtilis CJMPB957
- One aspect of the present invention provides a novel Bacillus subtilis CJMPB957 (KCCM11271P) strain having antibacterial and antifungal activity and having complex digestive enzyme production ability, acid resistance and bile resistance.
- KCCM11271P Bacillus subtilis CJMPB957
- it provides a culture of the Bacillus subtilis CJMPB957 (KCCM11271P) strain.
- a Probiotics preparation comprising the Bacillus subtilis CJMPB957 (KCCM11271P) strain or a culture of the strain.
- a feed additive comprising the probiotic formulation.
- a feed comprising the feed additive.
- It provides a method for preventing or treating a bacterial or fungal disease of a livestock, comprising administering to the livestock one or more selected from the group consisting of the above probiotic formulations, feed additives and feed.
- the present invention provides a probiotic, feed additives and feed comprising a Bacillus subtilis CJMPB957 (KCCM11271P) strain or a culture thereof having excellent antibacterial and antifungal activity and excellent complex digestive enzyme production ability, acid resistance and bile resistance. It provides a method of preventing or treating bacterial or fungal diseases of animals by administering it to livestock, thereby improving disease management and digestion of livestock, as well as maintaining the balance of intestinal microorganisms and improving the efficiency of livestock feed. Has the effect of contributing to.
- KCCM11271P Bacillus subtilis CJMPB957
- FIG. 1 is an electron micrograph of the Bacillus subtillis CJMPB957 (KCCM11271P) strain of the present invention.
- Figure 2a is a graph showing the in vitro antibacterial activity against the enterotoxic E. coli O122 of three candidate strains of Example 2.
- Figure 2b is a graph showing the in vitro antimicrobial activity against three enterococci E. coli O149 of the candidate strain of Example 2.
- FIG. 3 is a photograph showing the antimicrobial activity of Bacillus subtilis CJMPB957 (KCCM11271P) of the present invention.
- FIG. 4 is a photograph showing antifungal activity against Aspergillus flavus of Bacillus subtilis CJMPB957 (KCCM11271P) of the present invention.
- FIG. 5 is a photograph showing the complex digestive enzyme activity of Bacillus subtilis CJMPB957 (KCCM11271P) of the present invention.
- FIG. 6 is a graph showing the survival rate when Bacillus subtilis CJMPB957 (KCCM11271P) of the present invention is treated with artificial gastric juice or artificial bile.
- Figure 7 is a photograph showing the presence or absence of hemolytic Bacillus subtilis CJMPB957 (KCCM11271P) of the present invention.
- Figure 8 shows the 16s rDNA base sequence of Bacillus subtilis CJMPB957 (KCCM11271P) of the present invention.
- One aspect of the present invention provides a novel isolated Bacillus subtilis CJMPB957 (KCCM11271P) (hereinafter 'CJMPB957') strain.
- the CJMPB957 morphologically corresponds to Gram-positive bacilli (see FIG. 1), and has a homology of 98% to Bacillus subtilis as a result of analysis of the 16s rDNA nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1, FIG. 8).
- the CJMPB957 was deposited on March 22, 2012 at the Korean Culture Center of Microorganisms (361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul) under the accession number KCCM11271P.
- the CJMPB957 has complex antibacterial and antifungal activity.
- the bacterium of the antimicrobial or antifungal activity of CJMPB957 includes Aspergillus sp., And enteroxigenic Escherichia coli (ETEC), avian pathogenic Escherichia coli (APEC), and Salmonella spp. It may include one or more selected from the group consisting of ( Salmonella sp.) And Clostridium sp.
- the CJMPB957 may preferably exhibit antimicrobial or antifungal activity against all of the genus Aspergillus, enterococci E. coli, algae Escherichia coli, Salmonella and Clostridium.
- the CJMPB957 has a complex digestive enzyme production capacity.
- Digestive enzyme having the production capacity of CJMPB957 is composed of protease (Cellulase), Cellulase (Cellulase), Amylase (Amylase), Xylanase (Xylanase), Mannanase, Lipase (Pipase) and Phytase (Phytase) It may include one or more selected from the group.
- the CJMPB957 may more preferably produce all of protease, cellulase, amylase, xylanase, mannanase, lipase and phytase.
- the CJMPB957 has excellent heat resistance.
- the CJMPB957 is incubated for 24 hours at 37 °C, 200 rpm condition, then the endogenous spore formation rate after heat treatment at 95 °C 10 minutes may be preferably 95% or more, more preferably 100% day Can be.
- the endogenous spores are resistant to extreme environments such as UV, low temperature, drying and / or high pressure, as well as high temperature conditions, and the higher the endogenous spore formation rate, the higher the survival rate of the strain.
- the CJMPB957 has excellent acid resistance.
- the CJMPB957 is a survival rate after incubation for 3 hours in a medium containing artificial gastric juice prepared by adding 1% (w / v) of pepsin (Pepsin) to a solution adjusted to pH 2.5 is preferably 95 It may be at least%, more preferably 100%.
- the CJMPB957 has excellent bile resistance.
- the CJMPB957 may preferably have a survival rate of 95% or more after incubating for 3 hours in a medium containing artificial bile containing 1% (w / v) Pancreatin. May be 100%.
- the novel isolated strain CJMPB957 of the present invention can be cultured through a conventional method for culturing Bacillus strains.
- the CJMPB957 is preferably obtained by incubating for 12 hours to 4 days at a culture temperature in the range of 20 to 40 °C.
- the culture is a concept including a culture medium or culture medium in which the CJMPB957 strain is cultured, and the resultant cultured in the culture medium or culture medium, and the culture may or may not include the CJMPB957 strain.
- the culture is not particularly limited in its dosage form, and may be a dosage form commonly used in the art.
- the culture may be a liquid or a solid, and may be in a circular state of the culture or in a concentrated form or in a dried form thereof.
- a natural medium or a synthetic medium can be used as a medium for culturing CJMPB957 of the present invention.
- the carbon source of the medium is not particularly limited, and any known in the art may be used.
- Non-limiting examples of the carbon source include glucose, sucrose, dextrin, glycerol or starch. These can be used individually or in mixture of 2 or more types.
- the nitrogen source of the medium is not particularly limited, and any known in the art may be used.
- Non-limiting examples of such nitrogen sources include peptone, meat extract, yeast extract, dried yeast, soybean, ammonium salt, nitrate and other organic or inorganic nitrogen containing compounds. These can be used individually or in mixture of 2 or more types.
- the inorganic salt contained in the medium is not particularly limited and may be any known in the art.
- Non-limiting examples of the inorganic salts include magnesium, manganese, calcium, iron, potassium and the like. These can be used individually or in mixture of 2 or more types.
- the medium for culturing CJMPB957 of the present invention may be added with amino acids, vitamins, nucleic acids, and / or other components that may be contained in the culture medium.
- the culture solution of the CJMPB957 strain of the present invention may be a culture stock solution, and may be a solution from which the culture supernatant is removed from the culture stock solution and / or a solution thereof.
- the culture medium may contain the CJMPB957 strain.
- the composition of the culture medium is not particularly limited, and may include not only components known to be required for culturing Bacillus strains, but also components that synergistically act on the growth of Bacillus, and the composition thereof is conventional in the art. It can be easily chosen by one with knowledge.
- the culture solution may be in a liquid state or a dry state.
- the method of drying the culture solution is not particularly limited and may be a method commonly used in the art.
- Non-limiting examples of the drying method include ventilation drying, natural drying, spray drying or freeze drying. These may be used alone or in combination of two or more methods.
- a probiotic formulation comprising the CJMPB957 strain or a culture of the strain.
- Probiotics means a microorganism or a component that exhibits a beneficial effect on the health of the host, such as humans and animals, and settles on the gut wall of the host intestine and serves to inhibit the settlement of other harmful bacteria and the growth of pathogens.
- the beneficial digestive enzymes produced by probiotics are known to facilitate the absorption and utilization of nutrients.
- Probiotic formulations of the present invention may be one comprising the CJMPB957 strain and / or culture of the strain.
- Probiotics of the present invention may preferably comprise the CJMPB957 strain 5 ⁇ 10 4 to 5 ⁇ 10 10 CFU / ml, more preferably 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 9 CFU / ml have.
- the probiotic formulation may further include a pharmaceutically acceptable carrier, and may be provided in combination with the carrier.
- the pharmaceutically acceptable carrier refers to a carrier or diluent that does not stimulate an organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered compound.
- carriers usable in probiotic formulations that are formulated as liquid solutions are suitable for sterilization and living bodies, such as saline solution, sterile water, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution or glycerol. Can be. These can be used individually or in mixture of 2 or more types, and can add other conventional additives, such as antioxidant, buffer, and / or bacteriostatic agent, as needed.
- Diluents, dispersants, surfactants, binders and / or lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
- Formulations for oral administration comprising the probiotic formulations of the present invention as an active ingredient are not particularly limited and may be used as formulations known in the art.
- Non-limiting examples of such oral dosage forms include tablets, troches, lozenges, water-soluble or oily suspensions, preparation powders or granules, emulsions, hard or soft capsules, syrups or elixirs, and the like.
- lactose For formulation into such tablets or capsules, lactose, saccharose, sorbitol, mannitol, starch, amylopectin, binders such as cellulose or gelatin, excipients such as dicalcium phosphate, disintegrants such as corn starch or sweet potato starch, stearic acid Lubricating oils such as magnesium, calcium stearate, sodium stearyl fumarate or polyethylene glycol wax and the like, and the capsule formulation may further contain a liquid carrier such as fatty oil in addition to the above-mentioned materials.
- binders such as cellulose or gelatin
- excipients such as dicalcium phosphate, disintegrants such as corn starch or sweet potato starch
- stearic acid Lubricating oils such as magnesium, calcium stearate, sodium stearyl fumarate or polyethylene glycol wax and the like
- the capsule formulation may further contain a liquid carrier such as fatty oil in addition to the above-mentioned materials.
- a feed additive comprising the probiotic formulation.
- Probiotic formulations comprising the CJMPB957 strain of the present invention and / or cultures thereof may be separately prepared in the form of feed additives and mixed into the livestock feed, or may be mixed in such a manner as to add the probiotic preparations directly during feed preparation.
- the form of the feed additive is not particularly limited and may be preferably in the liquid or dry state, more preferably in the form of dry powder.
- the drying method of the dry powdered probiotic formulation is not particularly limited and may be a method known in the art.
- Non-limiting examples of the drying method include ventilation drying, natural drying, spray drying or freeze drying. These may be used alone or in combination of two or more methods.
- the feed additive may further include other additives that can increase the shelf life of the feed in addition to the probiotic formulations comprising the CJMPB957 of the present invention and / or its culture.
- Additives that may be additionally included in the feed additives of the present invention are not particularly limited and may be those known in the art.
- Non-limiting examples of the additives include, but are not limited to, binders, emulsifiers, preservatives, and the like, which prevent degradation of feed additives; Amino acids, vitamins, enzymes, flavors, non-protein nitrogen compounds, silicates, buffers, extractants, oligosaccharides, etc., which increase their utility. It may include. These can be used individually or in mixture of 2 or more types.
- the probiotic formulations or feed additives of the present invention may be administered to animals alone or in combination with other feed additives in an edible carrier. It may also be administered directly to top dressings, livestock feed, oral formulations separate from the feed, or in combination with other ingredients.
- a feed comprising the feed additive.
- the feed of the present invention may include the feed additive preferably 0.05 to 10 parts by weight based on 100 parts by weight of feed, more preferably 0.1 to 1 parts by weight. Within this range, it is possible to effectively increase the digestibility of the livestock, thereby increasing the efficiency of the feed.
- the ingredient of the feed of the present invention is not particularly limited and may be known in the art.
- Non-limiting examples of the feed ingredients include, but are not limited to, cereals, fruits, food processing by-products, algae, fibres, oils, starches, gourds, grain by-products, etc .
- Animals include proteins, inorganic substances, fats and oils, minerals, fats and oils, single cell proteins, zooplankton, fish meal and the like. These can be used individually or in mixture of 2 or more types.
- Livestocks that can use the probiotic formulations, feed additives or feed comprising the feed additives of the present invention include, for example, edible cows, cows, calves, pigs, piglets, sheep, goats, horses, rabbits, dogs, cats, and the like.
- livestock and poultry such as chicks, chickens, domestic chickens, roosters, ducks, geese, turkeys, quails and the like.
- prevention means any action that inhibits or delays the disease by providing the CJMPB957 strain and / or a culture of the strain to a target animal in the form of a pharmaceutical preparation or in an ingestible form such as a feed additive. it means.
- treatment refers to any action that improves the pathological condition of a pre-infected disease by providing the CJMPB957 strain and / or a culture of the strain to a target animal in the form of a pharmaceutical preparation or in an ingestible form such as a feed additive. it means.
- the bacterial diseases include, for example, diarrheal disease caused by enterococcal coliform bacillus, colibailosis caused by avian pathogenic E. coli, sepsis, Salmonellosis causing acute acute enteritis, Salmonellosis caused by Clostridium (Gangrenous enteritis) And the like, but is not limited thereto.
- the fungal disease may include, but is not limited to, aflatoxin poisoning (Aspergillosis) that causes, for example, decreased appetite, fever, shortness of breath, diarrhea, and convulsions caused by the genus Aspergillus.
- Aspergillosis aflatoxin poisoning
- the probiotic formulations may be administered to animals in the form of pharmaceutical preparations, or mixed with animal feed or drinking water and fed to them, and more preferably, mixed with feeds in the form of feed additives. .
- the route of administration of the probiotic agent may be administered through various routes of oral or parenteral without particular limitation as long as it can reach the target tissue, and specifically, oral, rectal, topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, arterial It may be administered in a conventional manner through intradermal, transdermal, nasal, inhalation, and the like.
- Bacillus subtilis Bacillus subtilis (Bacillus subtilis Isolation of CJMBP957 Strain
- Meju and various enteric samples which are traditional fermented foods, were obtained, and the obtained samples were gradually diluted and incubated in BHI solid medium (Difco, USA) added with 3% sodium chloride (Difco, USA) for 24 hours at 37 ° C.
- ETEC Enteric coliform
- APEC avian pathogenic E. coli
- Salmonella typhimu Antimicrobial evaluation was carried out on three species of Salmonella typhimurium (ST). The antimicrobial evaluation was evaluated through the clear zone analysis of the pathogenic bacteria.
- an antimicrobial evaluation medium was prepared by mixing 0.4% of each of the three pathogenic bacteria shaking cultures. 1.5 ⁇ l of the enteric-derived bacteria culture medium was dropped on the prepared evaluation medium, followed by incubation at 37 ° C. for 18 hours, and the presence or absence of growth inhibition ring formed around the selected strain was observed. Among the enterobacteria derived bacteria, 13 strains showing antimicrobial activity against the three pathogenic bacteria were selected first.
- the 13 primary strains with excellent combined antimicrobial activity were evaluated for antimicrobial activity against three enterococci E. coli and Clostridium perfringens .
- E. coli used ETECO149 to produce K88 adherence pili, ETECO122 to produce K88 and 987p, and ETEC2617 to produce K99.
- Clostridium perfringens the culture supernatant of the selected strain was used, and the culture was carried out in the same manner as above except that the culture supernatant was cultured at 37 ° C under anaerobic conditions.
- ETECO122, and ETECO149 were respectively inoculated in BHI liquid medium at 0.1%, and incubated at 37 ° C. and 200 rpm for 15 hours.
- One candidate strain and one ETEC were inoculated simultaneously at about 1 ⁇ 10 5 CFU / mL in 1/2 BHI liquid medium and incubated at 37 ° C. and 200 rpm.
- the culture medium for each time period was plated on BHI solid medium and MacConkey (Difco, USA) solid medium to determine the number of candidate strains and ETEC.
- the final selected CJMPB957 was shown to have excellent antimicrobial activity against enterococci E. coli, avian pathogenic E. coli, Salmonella typhimurium, Clostridium perfringens, the antimicrobial activity results are shown in FIG.
- Table 3 shows the results of analyzing the sugar release pattern of the CJMPB957 strain.
- Sequencing was performed to amplify the gene of 16s rDNA using PCR premix (Bionia, Korea) and universal primer 27F (5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3 ': SEQ ID NO: 2) and 1492R (5'GGTTACCTTGTTACGACTT 3': SEQ ID NO: 3).
- the total reaction solution was adjusted to 20 ⁇ l, and a total of 30 times of 94 ° C 1 minute, 56 ° C 1 minute, and 72 ° C 1 minute was repeated, and the amplified DNA sequences were analyzed.
- the base sequence of the analyzed 16s rDNA of the CJMPB957 strain is shown in SEQ ID NO: 1 (FIG. 8).
- Bacillus subtilis CJMPB957 a novel microorganism of the present invention identified by the above method, was registered on March 22, 2012, Korean Culture Center of Microorganisms, 361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul. Deposited as KCCM11271P.
- Aspergillus was used by incubation at 30 ° C. for 72 hours in a PDA (Difco, USA) solid medium. Aspergillus incubated in solid medium was cut into 5 mm ⁇ 5 mm (horizontal ⁇ vertical) sizes and inoculated in the center of fresh PDA solid medium and incubated for 24 hours.
- Digestive enzyme activity was evaluated for the protease, cellulase, amylase, xylanase, metase, lipase and phytase to determine the digestive enzyme production capacity of the Bacillus subtilis CJMPB957.
- the enzyme activity ability was measured according to the degree of clear ring formation using a medium containing a substrate for each enzyme.
- the culture supernatant of CJMPB957 strain was cultured in BHI liquid medium for 24 hours and 48 hours, centrifuged at 4 ° C and 13,000 rpm for 5 minutes, and the final supernatant was used as crude enzyme solution for enzyme activity analysis.
- the degree of substrate degradation was determined using a medium containing each substrate of each enzyme.
- YM Yeast extract 3g / L, Malt extract 3g / L, Peptone 5g / L, Dextrose 10g / L, Agar 20g / L) with 2% skim milk (Skim milk, Sigma, USA); Difco, USA, 'YM medium') media were prepared. 1.5 ⁇ l of the crude enzyme solution collected above was dispensed into a substrate medium, and then reacted at 30 ° C. for 15 hours, and then enzyme activity was measured according to the degree of formation of a transparent ring.
- YM medium to which 1% CMC (carboxyl methyl cellulose) substrate was added was prepared.
- 1.5 ⁇ l of the coenzyme solution collected above was dispensed into a substrate medium, and then reacted at 37 ° C. for 15 hours, and then stained with 0.2% Congo red aqueous solution for 30 minutes and decolorized with 1M aqueous NaCl solution.
- the activity of the enzyme was measured according to the degree of formation of the transparent ring formed by decomposition of the substrate around the crude enzyme solution.
- YM medium was prepared to which 1% soluble starch substrate was added. 1.5 ⁇ l of the coenzyme solution collected above was dispensed into the substrate medium, and then reacted at 37 ° C. for 15 hours. After dyeing with an aqueous solution containing 0.1% and 2% of I 2 and KI, respectively, the activity of the enzyme was measured according to the degree of formation of a transparent ring formed by decomposition of the substrate around the crude enzyme solution.
- YM medium was prepared with 1% xylan added. 1.5 ⁇ l of the crude enzyme solution was dispensed into the substrate medium, reacted at 37 ° C. for 15 hours, and then stained with 0.2% aqueous solution of Congo Red for 30 minutes, and decolorized with 1M aqueous NaCl solution. Then, the enzyme activity was measured according to the degree of transparent ring formation.
- Substrate medium Yeast extract 3g / l, Peptone 5g / l, KH 2 PO 4 1g / l, Agar 20g / l, pH 5
- 1% mannan logust bean gum, sigma, USA
- YM medium was prepared to which 1% tricaprylin was added. 1.5 ⁇ l of the crude enzyme solution was dispensed into the substrate medium, and then reacted at 37 ° C. for 15 hours, and then enzyme activity was measured according to the degree of formation of the clear ring.
- Substrate medium (Glucose 15g / l, NH 4 NO 3 5g / l, MgSO 4 7H 2 O 0.5g / l, KCl 0.5g / l, with 1% phytic acid, sigma, USA) 0.01 g / L FeSO 4 7H 2 O, 0.01 g / L MnSO 4 4H 2 O, 20 ⁇ l of Agar, pH5.5). 1.5 ⁇ l of the crude enzyme solution was dispensed into a substrate medium, and then reacted at 37 ° C. for 24 hours, and then enzyme activity was measured according to the degree of formation of a transparent ring.
- Bacillus subtilis CJMPB957 was confirmed to be excellent in complex digestive enzyme activity as well as antibacterial and antifungal activity.
- Bacillus forms endogenous spores to survive when stressed, such as depletion of one or more of the essential nutrients. Endogenous spores are resistant to extreme environments such as ultraviolet light, high temperature, low temperature drying and high pressure, so the formation of endogenous spores is very important in maintaining the viability of Bacillus. For this reason, Bacillus subtilis CJMPB957 was cultured for a long time to confirm the endogenous spore formation ability.
- Table 5 shows the measurement results of the endogenous spores.
- Bacillus subtilis CJMPB957 of the present invention has a high endogenous spore forming ability when cultured for more than 24 hours, it is determined that it can maintain a high survival rate in the digestive organs of animals when used as probiotics.
- Probiotic strains must be resistant to strong acidic gastric juice and bile in order to survive and reach the intestine, the final target site. For this reason, in order to confirm the application of Bacillus subtilis CJMPB957 as a probiotic strain of the present invention, acid resistance and bile resistance were confirmed.
- Artificial gastric juice was prepared by adding 1% (w / v) of pepsin (Pepsin; Sigma, USA) to a 0.05M sodium phosphate solution adjusted to pH 2.5 using HCl.
- the supernatant was discarded by centrifugation at 13,000 rpm for 5 minutes, and the cells were recovered. Incubated. After incubation, the BHI medium was plated to measure the number of bacteria to determine acid resistance and resistance to artificial gastric juice.
- CJMPB957 strain incubated for 3 hours in the artificial gastric juice of (1) was centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes to discard the supernatant and the cells were recovered, and the artificial bile was added in the same amount to the supernatant and incubated at 37 ° C for 24 hours. . After incubation, the BHI medium was plated to measure the number of bacteria to determine acid resistance and resistance to artificial bile.
- CJMPB957 showed 100% survival rate when treated with artificial gastric juice of pH 2.5 for 2 hours, and 100% survival rate was maintained even after 24 hours of artificial bile treatment.
- Bacillus subtilis CJMPB957 of the present invention showed a high survival rate even after a chain treatment of artificial gastric juice and artificial bile, it could be confirmed that it can be useful as a probiotic strain.
- ⁇ -hemolysis is the action of producing phospholipid enzymes in harmful bacteria to hydrolyze erythrocytes by hydrolyzing phospholipids supplied by red blood cells.
- TSA Bacillus subtilis CJMPB957
- sheep blood serum, Kisan Biotech, Korea
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Abstract
본 발명은 신규한 바실러스 서브틸리스(Bacillus
subtilis) CJMPB957(KCCM11271P) 균주 및 이를 포함하는 프로바이오틱스 제제와, 이를 활용하여 가축의 질병을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신규 바실러스 서브틸리스(Bacillus
subtilis) CJMPB957(KCCM11271P) 균주 및 이를 포함하는 프로바이오틱스 제제와, 이를 활용하여 가축의 질병을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
가축의 감염증은 가축의 체중을 감소시키거나 여러 가지 병상을 일으키는 등 그 상품 가치를 현저하게 저하시킨다. 가축의 감염증을 일으키는 세균성 질병에는 장독성 대장균(ETEC, Enterotoxigenic Escherichia coli)에 의한 설사병, 조류 병원성 대장균(APEC, avian pathogenic Escherichia coli)에 의한 대장균증(Colibailosis), 패혈증, 급만성 장염을 일으키는 살모넬라증(Salmonellosis), 클로스트리듐 속(Clostridium sp.)에 의한 괴저성 장염 등이 있다.
또한 사료의 원료인 곡류에 증식하는 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.)에 의한 아플라톡신 중독증(Aspergillosis)은 급성일 경우에 식욕 저하, 발열, 호흡 곤란, 설사, 경련 등의 신경증을 일으키는 곰팡이성 질병이다.
이러한 질병을 치료, 예방하기 위해 많은 항생제들이 개발되어 왔다. 그러나 항생제의 무분별한 사용으로 내성균의 출현 빈도가 증가함에 따라서 질병치료 목적 외에 질병예방 및 성장 촉진 목적으로 사료에 첨가되는 항생제의 사용을 전면 금지시키거나 규제하고 있는 실정이다. 항생제 사용 규제에 따라 가축의 생산성이 저하되고 폐사율이 증가할 수 있어 이러한 문제점을 보완할 수 있는 항생제 대체제의 개발이 매우 시급한 실정이다.
최근 이러한 문제를 반영하여 항생제를 대체할 수 있는 생균제를 개발하려는 연구가 진행중에 있다. 생균제에 관한 선행 기술로는 다음과 같은 것들이 있다.
대한민국 공개특허 제2010-0076263호는 송아지 설사병 예방을 위한 대장균, 살모넬라 억제 효능을 가진 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus Fermentum) BLAB19를 개시하고 있다.
대한민국 등록특허 제10-0878799호는 항생제 내성 병원성 미생물 또는 장내 유해 미생물인 에드워지엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 대장균, 표피포도구균(Staphylococcus epidermidis)의 생장을 억제하는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus
amyloliquefaciens) K37을 개시하고 있다.
대한민국 공개특허 제2006-0026371호는 자돈 설사를 유발하는 대장균을 억제하는 유산균(Lactobacillus Fermentum 12-1, KACC91135)을 개시하고 있다.
그러나, 상기 선행 기술들은 양계 또는 양돈에서 문제가 되고 있는 대장균, 살모넬라 또는 클로스트리듐에 대한 항균력을 갖는 균주를 개시하고 있을 뿐, 사료의 재료가 되는 곡류에 증식하여 이를 섭취한 가축에게 아플라톡신 중독증 등을 유발하는 아스퍼질러스에 대한 항진균력을 함께 갖는 균주에 대해서는 보고된 바가 없다.
본 발명은 항균 및 항진균 활성이 우수하며, 복합 소화 효소 생산능, 내산성 및 내담즙성이 우수한 바실러스 서브틸리스 CJMPB957(KCCM11271P)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 CJMPB957(KCCM11271P) 균주의 배양물을 제공하는 것을 목적으로 한다,
또한, 본 발명은 상기의 바실러스 서브틸리스 CJMPB957(KCCM11271P) 균주 또는 그 배양물을 포함하는, 프로바이오틱스 제제, 사료 첨가제 및 사료를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기의 바실러스 서브틸리스 CJMPB957(KCCM11271P) 균주 또는 그 배양물을 가축에 투여함으로써 가축의 세균성 또는 곰팡이성 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 신규 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus
subtilis) CJMPB957(KCCM11271P) 균주 및 이를 포함하는 프로바이오틱스 제제와, 이를 활용하여 가축의 질병을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태는, 항균 및 항진균 활성을 가지며, 복합 소화 효소 생산능, 내산성 및 내담즙성을 갖는, 신규 바실러스 서브틸리스 CJMPB957(KCCM11271P) 균주를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 바실러스 서브틸리스 CJMPB957(KCCM11271P) 균주의 배양물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 바실러스 서브틸리스 CJMPB957(KCCM11271P) 균주 또는 상기 균주의 배양물을 포함하는, 프로바이오틱스(Probiotics) 제제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 프로바이오틱스 제제를 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 사료 첨가제를 포함하는 사료를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면,
상기 프로바이오틱스 제제, 사료 첨가제 및 사료로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 가축에 투여하는 단계를 포함하는, 가축의 세균성 또는 곰팡이성 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 항균 및 항진균 활성이 우수하며, 복합 소화 효소 생산능, 내산성 및 내담즙성이 우수한 바실러스 서브틸리스 CJMPB957(KCCM11271P) 균주 또는 그 배양물을 포함하는, 프로바이오틱스, 사료 첨가제 및 사료를 제공하며, 이를 가축에 투여하여 가축의 세균성 또는 곰팡이성 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공함으로써, 가축의 질병 관리 및 소화력 향상은 물론, 장내 미생물의 균형 유지를 도와 가축용 사료의 효율을 증진시켜 축산업 발전에 기여하는 효과를 갖는다.
도 1은 본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) CJMPB957(KCCM11271P) 균주의 전자현미경 사진이다.
도 2a는 실시예 2의 후보 균주 3종의 장독성 대장균 O122에 대한 생체 외(in vitro) 항균 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2b는 실시예 2의 후보 균주 3종의 장독성 대장균 O149에 대한 생체 외 항균 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 CJMPB957(KCCM11271P)의 항균 활성을 나타낸 사진이다.
도 4는 본 발명의 바실러스 서브틸리스 CJMPB957(KCCM11271P)의 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus)에 대한 항진균 활성을 나타낸 사진이다.
도 5는 본 발명의 바실러스 서브틸리스 CJMPB957(KCCM11271P)의 복합 소화 효소 활성을 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 CJMPB957(KCCM11271P)을 인공 위액 또는 인공 담즙으로 처리하였을 때의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 CJMPB957(KCCM11271P)의 용혈성 유무를 나타낸 사진이다.
도 8은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 CJMPB957(KCCM11271P)의 16s rDNA 염기 서열을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다. 본원 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 발명의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본 발명의 일 양태는, 신규 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus
subtilis) CJMPB957(KCCM11271P)(이하, 'CJMPB957')균주를 제공한다.
상기 CJMPB957은 형태학적으로 그람 양성 간균에 해당하며(도 1 참조), 16s rDNA 염기 서열(서열번호 1, 도 8)의 분석 결과, 바실러스 서브틸리스와 98%의 상동성을 가지는 균주이다.
상기 CJMPB957은 2012년 3월 22일자로 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제1동 361-221)에 기탁번호 KCCM11271P로 기탁되었다.
상기 CJMPB957은 복합 항균 및 항진균 활성을 갖는다.
상기 CJMPB957의 항균 또는 항진균 활성의 대상균으로는 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.)을 포함하며, 장독성 대장균(ETEC, Enterotoxigenic Escherichia coli), 조류 병원성 대장균(APEC, avian pathogenic Escherichia coli), 살모넬라 속(Salmonella sp.) 및 클로스트리듐 속(Clostridium sp.)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 CJMPB957은 바람직하게는 아스퍼질러스 속, 장독성 대장균, 조류 병원성 대장균, 살모넬라 속 및 클로스트리듐 속 모두에 대한 항균 또는 항진균 활성을 나타낼 수 있다.
상기 CJMPB957은 복합 소화 효소 생산능을 갖는다.
상기 CJMPB957이 생산능을 갖는 소화 효소는 프로테아제(Protease), 셀룰라아제(Cellulase), 아밀라아제(Amylase), 자일라나아제(Xylanase), 만난아제(Mannanase), 리파아제(Lipase) 및 피타아제(Phytase)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 CJMPB957은 보다 바람직하게는 프로테아제, 셀룰라아제, 아밀라아제, 자일라나아제, 만난아제, 리파아제 및 피타아제를 모두 생산할 수 있다.
상기 CJMPB957은 내열성이 뛰어난 성질을 갖는다.
보다 구체적으로, 상기 CJMPB957은 37℃, 200 rpm 조건에서 24시간 동안 배양한 다음, 95℃에서 10분간 열처리한 후의 내생 포자 형성율이 바람직하게는 95% 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 100%일 수 있다.
상기 내생 포자는 고온 조건의 환경뿐만 아니라, 자외선, 저온, 건조 및/또는 고압 등의 극한 환경에 저항성을 가지는 것으로, 내생 포자 형성율이 높을수록 균주의 생존율이 높아진다.
상기 CJMPB957은 내산성이 뛰어난 성질을 갖는다.
보다 구체적으로, 상기 CJMPB957은 pH 2.5로 조정한 용액에 펩신(Pepsin)을 1%(w/v)로 첨가하여 제조된 인공 위액을 함유하는 배지에서 3시간 동안 배양한 후의 생존율이 바람직하게는 95% 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 100%일 수 있다.
상기 CJMPB957은 내담즙성이 뛰어난 성질을 갖는다.
보다 구체적으로, 상기 CJMPB957은 1%(w/v)의 판크레아틴(Pancreatin)이 포함된 인공 담즙을 함유하는 배지에서 3시간 동안 배양한 후의 생존율이 바람직하게는 95% 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 100%일 수 있다.
본 발명의 신규 분리한 균주 CJMPB957은 통상적인 바실러스 균주의 배양 방법을 통해 배양할 수 있다. 상기 CJMPB957은 바람직하게는 20 내지 40℃ 범위의 배양 온도에서 12시간 내지 4일간 배양하여 얻을 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 CJMPB957의 배양물을 제공한다.
상기 배양물이란 상기 CJMPB957 균주를 배양한 배양 배지 또는 배양액, 및 상기 배양 배지 또는 배양액에서 배양한 그 결과물을 포함하는 개념이며, 상기 배양물은 상기 CJMPB957 균주를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
상기 배양물은 그 제형이 특별히 한정되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 제형일 수 있다. 예를 들어 상기 배양물은 액체 또는 고체일 수 있으며, 배양물의 원형 상태이거나 그의 농축된 형태 또는 건조된 형태일 수 있다.
배양 배지
본 발명의 CJMPB957를 배양하는 배지로는 천연 배지 또는 합성 배지를 사용할 수 있다.
상기 배지의 탄소원은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 알려진 것을 사용할 수 있다. 상기 탄소원의 비제한적인 예로는 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤 또는 녹말 등을 들 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.
상기 배지의 질소원은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 알려진 것을 사용할 수 있다. 상기 질소원의 비제한적인 예로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두, 암모늄염, 질산염 및 기타 유기 또는 무기 질소 함유 화합물 등을 들 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.
상기 배지에 포함되는 무기염은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 알려진 것을 사용할 수 있다. 상기 무기염의 비제한적인 예로는 마그네슘, 망간, 칼슘, 철, 칼륨 등을 들 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 CJMPB957를 배양하는 배지에는 상기 탄소원, 질소원 및 무기염 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및/또는 기타 일반적으로 배양 배지에 함유될 수 있는 성분들이 첨가될 수 있다.
배양액
본 발명의 CJMPB957 균주의 배양액은 배양 원액일 수 있으며, 상기 배양 원액에서 배양 상등액을 제거한 액 및/또는 이를 농축한 액일 수 있다. 상기 배양액에는 상기 CJMPB957 균주가 포함되어 있을 수 있다.
상기 배양액의 조성은 특별히 제한되지 아니하며 통상적으로 바실러스 균주를 배양함에 있어 필요한 것으로 알려진 성분뿐만 아니라, 바실러스의 생장에 상승적으로 작용하는 성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이에 따른 조성은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 선택될 수 있다.
상기 배양액은 액상 상태 또는 건조 상태일 수 있다.
상기 배양액을 건조하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 상기 건조 방법의 비제한적인 예로는 통풍 건조, 자연 건조, 분무 건조 또는 동결 건조 등을 들 수 있다. 이들은 단독 또는 2가지 이상의 방법을 병합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 CJMPB957 균주 또는 상기 균주의 배양물을 포함하는, 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
상기 프로바이오틱스(Probiotics)는 인간이나 동물 등 숙주의 건강에 유익한 효과를 나타내는 미생물 또는 그 성분을 의미하는 것으로서, 숙주의 장내의 소화관 벽에 정착하여 다른 유해균의 정착 및 병원균의 증식을 억제하는 역할을 하며, 프로바이오틱스가 생산하는 유익한 소화 효소는 영양소의 흡수 및 이용을 용이하게 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 프로바이오틱스 제제는 상기 CJMPB957 균주 및/또는 상기 균주의 배양물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 프로바이오틱스는 바람직하게는 상기 CJMPB957 균주를 5 x 104 내지 5 x 1010 CFU/㎖로 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 1 x 106 내지 1 x 109 CFU/㎖로 포함할 수 있다.
상기 프로바이오틱스 제제는 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체와 함께 제제화되어 제공될 수 있다.
상기 약학적으로 허용 가능한 담체란, 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.
상기 담체에 있어서, 액상 용액으로 제제화되는 프로바이오틱스 제제에 사용 가능한 담체로 멸균 및 생체에 적합한 것으로는, 식염수, 멸균수, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액 또는 글리세롤 등을 들 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및/또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 프로바이오틱스 제제를 유효 성분으로 포함하는 경구 투여용 제형은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 알려진 제형으로 사용될 수 있다. 상기 경구 투여용 제형의 비제한적인 예로는 정제, 트로키제, 로젠(lozenge)지, 수용성 또는 유성 현탁액, 조제 분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.
상기 정제 또는 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유 등을 포함할 수 있으며, 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 프로바이오틱스 제제를 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 CJMPB957 균주 및/또는 그의 배양물이 포함된 프로바이오틱스 제제는 사료 첨가제 형태로 별도로 제조되어 가축 사료에 혼합될 수 있고, 또는 사료 제조시 상기 프로바이오틱스 제제를 직접 첨가하는 방식으로 혼합될 수 있다.
상기 사료 첨가제의 형태는 특별히 제한되지 아니하며 바람직하게는 액상 또는 건조 상태일 수 있으며, 보다 바람직하게는 건조 분말 형태일 수 있다.
상기 건조 분말형 프로바이오틱스 제제의 건조 방법은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 알려진 방법을 사용할 수 있다. 상기 건조 방법의 비제한적인 예로는 통풍 건조, 자연 건조, 분무 건조 또는 동결 건조 등을 들 수 있다. 이들은 단독 또는 2가지 이상의 방법을 병합하여 사용할 수 있다.
상기 사료 첨가제는 본 발명의 CJMPB957 및/또는 그의 배양물을 포함하는 프로바이오틱스 제제 이외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 기타 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제에 추가로 포함될 수 있는 첨가제는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 알려진 것을 사용할 수 있다. 상기 첨가제의 비제한적인 예로는, 사료 첨가제의 품질 저하를 방지하는 결착제, 유화제, 보존제 등; 효용을 증대시키는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 향미제, 비단백질태질소화합물(非蛋白質態窒素化合物), 규산염제, 완충제, 추출제, 올리고당 등을 들 수 있으며, 그 밖에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 프로바이오틱스 제제 또는 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한 탑 드레싱, 가축 사료에 직접 혼합하거나, 사료와는 별도인 경구 제형으로 투여할 수 있고, 또는 다른 성분과 조합하여 투여할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 사료 첨가제를 포함하는 사료를 제공한다.
본 발명의 상기 사료는 상기 사료 첨가제를 바람직하게는 사료 100 중량부에 대하여 0.05 내지 10 중량부로 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1 중량부로 포함할 수 있다. 상기의 범위 내에서 가축의 소화력을 효과적으로 증진시켜 사료의 효율을 높일 수 있다.
본 발명의 상기 사료의 성분은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 알려진 것일 수 있다. 상기 사료 성분의 비제한적인 예로는, 식물성으로 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류 등; 동물성으로 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질, 동물성 플랑크톤류, 어분 등을 들 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 프로바이오틱스 제제, 사료 첨가제 또는 상기 사료 첨가제를 포함하는 사료를 사용할 수 있는 가축으로는 예를 들어 식용우, 젖소, 송아지, 돼지, 새끼 돼지, 양, 염소, 말, 토끼, 개, 고양이 등과 같은 가축 및 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기 등과 같은 가금류를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면,
본 발명의 CJMPB957 균주 및/또는 상기 균주의 배양물을 포함하는 프로바이오틱스 제제, 상기 프로바이오틱스 제제를 포함하는 사료 첨가제 및 상기 사료 첨가제를 포함하는 사료로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상을 가축에 투여하는 단계를 포함하는, 가축의 세균성 또는 곰팡이성 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 "예방"이란, 상기 CJMPB957 균주 및/또는 상기 균주의 배양물을 대상 동물에게 약제학적 제제 형태로, 또는 사료 첨가제 등 섭식 가능한 형태로 제공하여 해당 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 "치료"란, 상기 CJMPB957 균주 및/또는 상기 균주의 배양물을 대상 동물에게 약제학적 제제 형태로, 또는 사료 첨가제 등 섭식 가능한 형태로 제공하여 기감염된 해당 질병의 병적 상태를 개선시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 세균성 질병으로는 예를 들어, 장독성 대장균에 의한 설사병, 조류 병원성 대장균에 의한 대장균증(Colibailosis), 패혈증, 급만성 장염을 일으키는 살모넬라증(Salmonellosis), 클로스트리듐 속에 의한 괴저성 장염(Gangrenous enteritis) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 곰팡이성 질병으로는 예를 들어, 아스퍼질러스 속에 의한 식욕 저하, 발열, 호흡 곤란, 설사, 경련 등을 일으키는 아플라톡신 중독증(Aspergillosis)을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 프로바이오틱스 제제는 약학적 제제의 형태로 동물에 투여되거나, 가축의 사료 또는 음수에 혼합하여 이를 섭식시키는 방법으로 투여될 수 있으며, 보다 바람직하게는 사료 첨가제의 형태로 사료에 혼합되어 투여될 수 있다.
상기 프로바이오틱스 제제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 특별한 제한없이 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입 등을 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.
이하, 실시예를 기술함으로써 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 일 예시에 불과하며, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
실시예 1
바실러스 서브틸리스
(Bacillus
subtilis
) CJMBP957 균주의 분리
(1) 시료 확보 및 균주 분리
전통 발효 식품인 메주 및 각종 장류 시료를 확보하고, 확보된 시료를 단계적으로 희석하여 3% 염화나트륨이 첨가된 BHI 고체 배지(Difco, USA)에 도말 후 37℃ 조건으로 24시간 동안 배양하였다.
상기 각 시료에서 분리된 균주들은 콜로니 관찰에 따라 그룹화하여 균주들을 분리하였다. 선별된 콜로니는 3차에 걸쳐 새로운 배지에 옮겨 배양하는 방법으로 순수 분리하였으며, 순수 배양된 균을 20% 글리세롤(glycerol)이 첨가된 배지에 담아 영하 70℃ 이하에서 보존하였다.
(2) 복합 항균 활성 우수 균주 선발
양계 및 양돈에서 문제시되는 대표적인 병원성 세균인 대장균과 살모넬라에 대한 항균 활성이 있는 균주를 1차 선발하기 위해서 분리된 장류 유래균에 대해서 장독성 대장균(ETEC), 조류 병원성 대장균(APEC), 살모넬라 타이피뮤리움(ST, Salmonella typhimurium) 3 종에 대한 항균 평가를 실시하였다. 상기 항균 평가는 병원성 균에 대한 생육 저해환(clear zone) 분석을 통해 평가하였다.
YM(Difco, USA) 고체 배지 제조 시에 상기 병원성 세균 3종의 진탕 배양액을 각각 0.4% 혼합하여 항균 평가 배지를 제조하였다. 상기 제조된 평가 배지 위에 장류 유래균 배양액 1.5 ㎕를 떨어뜨려 37℃에서 18시간 동안 배양한 후 선발 균주 주위에 형성되는 생육 저해환의 유무를 관찰하였다. 장류 유래균 중에서 상기 병원성 세균 3종에 대해서 항균성을 나타내는 균주 13종을 1차적으로 선발하였다.
복합 항균 활성이 우수한, 1차 선발된 13종 균주에 대해서 장독성 대장균 3종과 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens)에 대한 항균 활성을 평가하였다. 장독성 대장균은 K88 흡착섬모(adherence pili)를 생산하는 ETECO149, K88와 987p를 생산하는 ETECO122, K99를 생산하는 ETEC2617을 사용하였다. 클로스트리듐 퍼프린겐스 평가시에 선발 균주의 배양 상등액을 사용하고, 37℃, 혐기 조건에서 배양한 것을 제외하고, 위와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이 복합항균 활성이 우수한 균주 3종(739, 823, 957)을 후보 균주로 선발하였다.
표 1
ETEC | APEC | ST | Clostridium perfringens | |||
0122 | 0149 | 2617 | ||||
739 | +++ | +++ | ++ | +++++ | +++++ | - |
823 | +++ | +++ | ++ | ++++ | ++++ | ++ |
957 | +++ | +++ | ++ | +++ | +++ | +++ |
실시예 2
장독성 대장균에 대한 생체 외(in vitro) 항균 활성 평가
상기 복합 항균 활성이 우수한 3개 후보 균주에 대해서 장독성 대장균 2종에 대한 활성 억제 효과를 생체 외에서 측정하였다.
BHI 액체 배지에 상시 후보 균주 3종과 ETECO122, ETECO149를 각각 0.1%씩 접종하여, 37℃, 200 rpm에서 15시간 배양하였다. 1/2 BHI 액체 배지에 후보 균주 1종과 ETEC 1종을 각각 약 1 × 105 CFU/㎖가 되도록 동시 접종하여 37℃, 200 rpm에서 배양하였다. 각 시간대별 배양액을 BHI 고체 배지와 맥콘키(MacConkey) (Difco, USA)고체 배지에 도말하여 후보 균주와 ETEC의 균수를 측정하였다.
상기 결과는 하기 표 2 및 도 2a, 2b에 나타내었으며, 24시간 이상 배양시에 957 균주가 ETEC O122 및 ETEC O149에 대해서 성장 억제 효과가 더 우수함을 확인할 수 있었다. 이에, 항균 활성 우수 균주로 957을 최종 선발하였고, 이를 CJMPB957이라 명명하였다.
최종 선발된 CJMPB957은 장독성 대장균, 조류 병원성 대장균, 살모넬라 타이피뮤리움, 클로스트리듐 퍼프린겐스에 대해서 항균 활성이 우수한 것으로 나타났으며, 상기 항균활성 결과를 도 3에 나타내었다.
실시예 3
CJMPB957 균주의 형태학적, 생화학적 특성 조사 및 동정
(1) 형태학적, 생화학적 특성 조사
복합 소화 효소 활성 우수 균주로 최종 선발된 CJMPB957 균주의 동정을 위하여, 일차적으로 형태학적, 생화학적 조사를 수행하였다. 형태적인 특징으로는 그람 양성 간균임을 확인하였고(도 1), 생화학적 특성을 분석하기 위하여 API 50 CHB 시스템(biomerieux, 프랑스)으로 CJMPB957 균주의 당 발효 패턴을 분석하였다.
하기 표 3은 CJMPB957 균주의 당 발표 패턴을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
표 3
대조구 | - | 에스쿨린 | + |
글리세롤(Glycerol) | + | 살리신 | + |
에리스리톨(Erythritol) | - | 셀로비오스 | + |
D-아라비노스 | - | 말토스 | + |
L-아라비노스 | + | 락토스 | + |
리보스 | + | 멜리비오스 | - |
D-자일로스 | + | 사카로스 | + |
L-자일로스 | - | 트레할로스 | + |
아도니톨 | - | 이눌린 | - |
β메틸-자일로시드 | - | 멜레지토스 | - |
갈락토스 | _ | D-라피노스 | + |
D-글루코스 | + | 아미돈 | + |
D-프럭토스 | + | 글리코진 | + |
D-만노스 | + | 자일리톨 | - |
L-솔보스 | - | β겐티오비오스 | - |
람노스 | - | D-튜라노스 | - |
둘씨톨 | - | D-리쏘스 | - |
이노시톨 | + | D-타가토스 | - |
만니톨 | + | D-푸코스 | - |
소비톨 | + | L-푸코스 | - |
α메틸-디만노시드 | - | D-아라비톨 | - |
α메틸-글루코시드 | + | L-아라비톨 | - |
N 아세틸 글루코사민 | - | 글루코네이트 | - |
아미그달린 | + | 2 세토-글루코네이트 | - |
아뷰틴 | + | 5세토-글루코네이트 | - |
상기 표 3에서 '+'는 양성을, '-'는 음성을 나타내며, 대조구는 기질이 없는 실험군이다.
상기 표 3의 결과에 의하면, CJMPB957 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus
subtilis)와 92.2%의 상동성을 갖는 것으로 확인되었다.
(2) CJMPB957 균주의 동정
CJMPB957 균주의 보다 정확한 동정을 위하여, DNA 염기서열에 의한 분자 계통 분류학적 방법을 실시하였다.
염기 서열 분석은 PCR premix(바이오니아, 대한민국)와 유니버셜 프라이머 27F(5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3': 서열번호 2) 및 1492R(5'GGTTACCTTGTTACGACTT 3': 서열번호 3)을 사용하여 16s rDNA의 유전자를 증폭시켰다. 유전자 증폭 시 총 반응액은 20 ㎕로 맞추어 94℃ 1분, 56℃ 1분, 72℃ 1분을 총 30회 반복하여, 증폭된 DNA 염기 서열을 분석하였다. CJMPB957 균주의 분석된 16s rDNA의 염기 서열은 서열번호 1(도 8)과 같다.
상기 분석결과, 바실러스 서브틸리스와 98% 상동성을 가지는 미생물로 동정되었다.
상기와 같은 방법으로 동정된 본 발명의 신규한 미생물인 바실러스 서브틸리스(Bacillus
subtilis) CJMPB957은 2012년 3월 22일자로 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제1동 361-221)에 기탁번호 KCCM11271P로 기탁되었다.
실시예 4
CJMPB957 균주의 항진균 활성
항균 활성 우수 균주인 CJMPB957의 항진균 활성을 알아보기 위해서 사료에서 문제가 되고 있는 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus
flavus)에 대한 항진균 활성을 평가하였다.
아스퍼질러스를 PDA(Difco, USA) 고체 배지에서 30℃, 72시간 정치 배양하여 사용하였다. 고체 배지에서 배양된 아스퍼질러스를 5 mm × 5 mm(가로 × 세로)크기로 절단하여 새로운 PDA 고체 배지 중앙에 접종하여 24시간 배양하였다.
활성화된 CJMPB957을 아스퍼질러스가 배양되어 있는 고체 배지에 10 ㎕를 분주하여 30℃에서 48시간 배양하여 형성되는 아스퍼질러스의 생육 저해환의 형성 유무를 관찰하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 CJMPB957이 아스퍼질러스의 생육을 저해함을 확인함으로써 상기 균주가 항진균 활성이 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5
CJMPB957 균주의 소화 효소 활성
상기 바실러스 서브틸리스 CJMPB957의 소화 효소 생산능을 알아보기 위해서 프로테아제, 셀룰라아제, 아밀라아제, 자일라나아제, 만난아제, 리파아제 및 피타아제에 대해서 소화 효소 활성 평가를 실시하였다.
상기 효소 활성 평가는 각 효소에 대한 기질이 들어있는 배지를 사용하여 투명환 형성 정도에 따라 효소 활성 능력을 측정하였다.
1) 조효소액 채취
CJMPB957 균주를 BHI 액체 배지에서 24시간, 48시간 배양한 배양 상등액을 채취하여, 4℃, 13,000 rpm에서 5분 동안 원심 분리한 후, 최종 상층액을 효소 활성 분석을 위한 조효소액으로 하여 아래와 같이 각 효소별 각각의 기질이 들어있는 배지를 사용하여 기질 분해 정도를 판정하였다.
2) 프로테아제 활성
탈지 분유(skim milk, Sigma, USA)를 2% 첨가한 YM(Yeast extract 3g/ℓ, Malt extract 3g/ℓ, Peptone 5g/ℓ, Dextrose 10g/ℓ, Agar 20g/ℓ; Difco, USA, 이하, 'YM 배지')배지를 제조하였다. 상기에서 채취한 조효소액 1.5 ㎕를 기질 배지에 분주한 후, 30℃에서 15시간 동안 반응시킨 후, 투명환의 형성 정도에 따라 효소 활성 능력을 측정하였다.
3) 셀룰라아제 활성
1% CMC(carboxyl methyl cellulose) 기질이 첨가된 YM 배지를 제조하였다. 상기에서 채취한 조효소액 1.5 ㎕를 기질 배지에 분주한 후, 37℃에서 15시간 동안 반응시킨 후, 0.2% 콩고 레드(Congo red) 수용액으로 30분 동안 염색하였으며, 1M NaCl 수용액으로 탈색하였다. 조효소액 주위의 기질이 분해되어 생기는 투명환의 형성 정도에 따라 효소의 활성 능력을 측정하였다.
4) 아밀라아제 활성
1% 가용성 녹말(soluble starch) 기질이 첨가된 YM 배지를 제조하였다. 상기에서 채취한 조효소액 1.5 ㎕를 기질 배지에 분주한 후, 37℃에서 15시간 동안 반응시켰다. I2와 KI가 각각 0.1%, 2% 첨가된 수용액으로 염색한 후, 조효소액 주위의 기질이 분해되어 생기는 투명환의 형성 정도에 따라 효소의 활성 능력을 측정하였다.
5) 자일라나아제 활성
1% 자일란(xylan)이 첨가된 YM 배지를 제조하였다. 상기 조효소액 1.5 ㎕를 기질 배지에 분주하고, 37℃에서 15시간 동안 반응시킨 후, 0.2% 콩고 레드 수용액으로 30분 동안 염색하였으며, 1M NaCl 수용액으로 탈색하였다. 그 다음, 투명환 형성 정도에 따라 효소 활성능력을 측정하였다.
6) 만난아제 활성
1% 만난(logust bean gum, sigma, USA)이 첨가된 기질 배지(Yeast extract 3g/ℓ, Peptone 5g/ℓ, KH2PO4 1g/ℓ, Agar 20g/ℓ, pH 5)를 제조하였다. 상기 조효소액 1.5 ㎕를 기질 배지에 분주한 후, 37℃에서 24시간 동안 반응시킨 다음, 투명환 형성 정도에 따라 효소 활성 능력을 측정하였다.
7) 리파아제 활성
1% 트리카프릴린(tricaprylin)이 첨가된 YM 배지를 제조하였다. 상기 조효소액 1.5㎕를 기질 배지에 분주한 후, 37℃에서 15시간 반응시킨 다음, 투명환 형성 정도에 따라 효소 활성 능력을 측정하였다.
8) 피타아제 활성
1% 피트산(Phytic acid, sigma, USA)이 첨가된 기질 배지(글루코오스(Glucose) 15g/ℓ, NH4NO3 5g/ℓ, MgSO47H2O 0.5g/ℓ, KCl 0.5g/ℓ, FeSO47H2O 0.01g/ℓ, MnSO44H2O 0.01g/ℓ, Agar 20㎕, pH5.5)를 제조하였다. 상기 조효소액 1.5 ㎕를 기질 배지에 분주한 후, 37℃에서 24시간 반응시킨 다음, 투명환 형성 정도에 따라 효소 활성능력을 측정하였다.
상기 CJMPB957의 소화 효소 활성은 하기 표 4 및 도 5에 나타내었다.
표 4
프로테아제 | 셀룰라아제 | 아밀라아제 | 자일라나아제 | 만난아제 | 리파아제 | 피타아제 | |
CJMPB957 | ++ | +++ | ++ | ++ | +++++ | + | + |
상기 표 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이 바실러스 서브틸리스 CJMPB957는 항균 및 항진균 활성뿐만 아니라 복합 소화 효소 활성도 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 6
CJMPB957 균주의 내생 포자 형성능
바실러스는 필수 영양원들 중에 한 개 이상의 영양원이 고갈되는 등의 스트레스를 받으면 생존하기 위해 내생 포자를 형성한다. 내생 포자는 자외선, 고온, 저온 건조 및 고압 등의 극한 환경에 저항성을 가지기 때문에, 내생 포자의 형성은 바실러스의 생존율을 유지하는데 있어서 매우 중요하다. 이와 같은 이유로 바실러스 서브틸리스 CJMPB957을 장시간 배양하여 내생 포자 형성능을 확인하였다.
BHI 액체 배지에 균을 0.1% 접종하여, 37℃, 200 rpm에서 24시간, 48시간 동안 배양하였다. 각 시간대별 배양액을 BHI 고체 배지에 도말하여 총 균수를 측정하고, 95℃에서 10분간 열처리한 배양액을 BHI 아가(Agar) 배지에 도말하여 내생 포자의 수를 측정하였다.
하기 표 5는 상기 내생 포자 수의 측정 결과를 나타낸 것이다.
표 5
배양 시간(h) | 총 균수(CFU/㎖) | 내생 포자 수(CFU/㎖) | 포자 형성율(%) |
24 | 1.4 × 109 | 1.4 × 109 | 100 |
48 | 1.9 × 109 | 1.9 × 109 | 100 |
상기 표 5에 나타난 바와 같이 CJMPB957을 24시간 이상 배양하였을 때 100% 내생 포자를 형성하였다.
따라서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 CJMPB957은 24시간 이상 배양 시 높은 내생 포자 형성능을 가지고 있어 프로바이오틱스로 사용 시 동물의 소화기관 내에서 높은 생존율을 유지할 수 있을 것으로 판단된다.
실시예 7
CJMPB957 균주의 내산성 및 내담즙성
프로바이오틱스 균주는 구강으로 섭취되어 최종 목적 부위인 장까지 생존하여 도달하기 위해서는 강산성의 위액과 담즙액에 대한 저항성이 있어야 한다. 이와 같은 이유로, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 CJMPB957의 프로바이오틱스 균주로서의 응용 여부를 확인하기 위하여, 내산성 및 내 담즙성을 확인하였다.
(1) 내산성 및 인공 위액 저항성
인공 위액은 HCl을 사용하여 pH 2.5로 조정한 0.05M 인산 나트륨(sodium phosphate) 용액에 펩신(Pepsin; Sigma, USA) 1%(w/v)를 첨가하여 제조하였다.
CJMPB957 균주를 BHI 액체 배지에서 37℃, 200 rpm에서 24시간 동안 배양한 후, 13,000rpm에서 5분간 원심 분리하여 상등액은 버리고 균체를 회수하여 인공 위액을 상등액과 동량으로 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후 BHI 배지에 도말하여 균수를 측정하여 내산성 및 인공 위액에 대한 저항성을 확인하였다.
(2) 인공 담즙 저항성
인공 담즙은 0.05M 인산 나트륨 용액에 1%(w/v) 판크레아틴(Pancreatin; Sigma, USA)을 첨가하여 멸균한 후 멸균 10%(w/v) oxagall(Difco Co.)용액을 배지의 1%(v/v)가 되도록 첨가하고 pH를 6.8로 조정하여 제조하였다.
상기 (1)의 인공 위액에서 3시간 동안 배양한 CJMPB957 균주를, 13,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 상등액은 버리고 균체를 회수하여 상기 인공 담즙을 상등액과 동량으로 첨가하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 BHI 배지에 도말하여 균수를 측정하여 내산성 및 인공 담즙에 대한 저항성을 확인하였다.
상기 내산성 및 인공 위액과 인공 담즙에 대한 저항성 측정 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, CJMPB957을 pH 2.5의 인공 위액에서 2시간 동안 처리하였을 때 100%의 생존율을 나타내었으며, 인공 위액 처리 후 인공 담즙을 24시간 처리하였을 때에도 역시 100%의 생존율이 유지되었다.
따라서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 CJMPB957은 인공 위액과 인공 담즙의 연쇄 처리 후에도 높은 생존율을 보임으로써 프로바이오틱스 균주로 유용하게 사용 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예 8
CJMPB957 균주의 안정성
CJMPB957의 안정성을 알아보기 위해서 용혈성(β-hemolysis)을 조사하였다. β-용혈이란 유해균 중 인지질 효소를 생산하여 적혈구에 의해서 공급되는 인지질을 가수 분해하여 적혈구를 용혈시키는 작용이다.
바실러스 서브틸리스 CJMPB957의 용혈성을 알아보기 위하여 5% 양혈액(sheep blood, 기산바이오텍, 대한민국)이 함유되어 있는 TSA(Difco, USA)를 제조하였다. 상기 제조된 혈액 한천 배지에 선형 접종(streaking)한 후, 37℃에서 24시간 배양하여 용혈 여부를 확인한 결과, 도 7과 같이 용혈성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.
Claims (8)
- 항균 및 항진균 활성을 가지며, 복합 소화 효소 생산능, 내산성 및 내담즙성을 갖는, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CJMPB957(KCCM11271P) 균주.
- 제1항에 기재된 상기 바실러스 서브틸리스 CJMPB957(KCCM11271P) 균주의 배양물.
- 제1항에 기재된 상기 바실러스 서브틸리스 CJMPB957(KCCM11271P) 균주 또는 제2항에 기재된 상기 균주의 배양물을 포함하는, 프로바이오틱스(Probiotics) 제제.
- 제3항의 프로바이오틱스 제제를 포함하는 사료 첨가제.
- 제4항의 사료 첨가제를 포함하는 사료.
- 제1항에 기재된 상기 바실러스 서브틸리스 CJMPB957(KCCM11271P) 균주 또는 제2항에 기재된 상기 균주의 배양물이 포함된 조성물을 가축에 투여하는 단계를 포함하는, 가축의 세균성 또는 곰팡이성 질병을 예방 또는 치료하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 조성물은 프로바이오틱스 제제, 사료 첨가제 및 사료로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 가축의 세균성 또는 곰팡이성 질병을 예방 또는 치료하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 세균성 또는 곰팡이성 질병은, 설사병, 대장균증(Colibailosis), 패혈증, 살모넬라증(Salmonellosis), 괴저성 장염(Gangrenous enteritis) 및 아플라톡신 중독증(Aspergillosis)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는, 가축의 세균성 또는 곰팡이성 질병을 예방 또는 치료하는 방법.
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