KR101988878B1

KR101988878B1 - 풍미와 항산화 및 면역기능이 증진된 고체발효마늘 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101988878B1
Application number: KR1020170174837A
Authority: KR
Inventors: 오덕환; 김형서; 김희성; 김정미
Original assignee: 강원대학교산학협력단; 주식회사 다움푸드앤케어
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2017-12-19
Publication date: 2019-06-14

Abstract

본 발명은 젖산 균주와 고체상태의 발효시스템을 이용하여 풍미와 항산화 및 면역기능이 증진된 발효마늘의 제조방법 및 상기 발효마늘의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 면역 개선용 조성물을 제공한다.

Description

풍미와 항산화 및 면역기능이 증진된 고체발효마늘 조성물 및 이의 제조방법{Composition for enhanced flavor, antioxidation and immune function comprising fermented garlic using solid state fermentation}

본 발명은 풍미와 항산화 및 면역기능이 증진된 고체발효마늘 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 젖산 균주와 고체상태의 발효시스템을 이용하여 풍미와 항산화 및 면역기능이 증진된 발효마늘의 제조방법 및 상기 발효마늘의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 면역 개선용 조성물에 관한 것이다.

식품 첨가물, 농약, 화학비료, 의약품, 불규칙적인 식습관, 서구화된 식사 등으로 인해 면역력 감소로 인한 잦은 질병, 고혈압, 당뇨, 비만 등 성인병 환자가 계속 증가하고 있으며, 이에 따라 자연지향적인 삶이 강해짐과 동시에 건강 및 의료 정보 등 건강에 대한 관심이 계속적으로 증가하여 최근에는 기능성을 갖는 건강기능식품, 보조식품에 많은 관심이 증가하고 있다.

마늘은 항산화, 항암, 항노화, 항균효과와 혈행개선, 심혈관계에 좋은 효과를 주는 것을 보고되어, 2002년 미국 시사주간지 타임이 선정한 10가지 건강식품에 포함되었고, 미국 국립암연구소는 항암작용이 있는 48개 식품 중 마늘을 첫 번째로 선정할 만큼 그 효능이 탁월하다고 알려져 있다.

마늘은 많은 효능이 있음에도 불구하고, 생으로 섭취하게 되면 위와 간에 자극을 줄 수 있으며, 마늘 특유의 아리고 매운 맛, 냄새로 인하여 섭취를 꺼리는 경향이 있으므로 굽거나, 발효, 숙성시키는 방법 등을 통하여 단점을 개선함과 동시에 마늘의 효능을 유지시키는 다양한 연구들이 진행되고 있다.

최근에는 발효기법을 활용하여 마늘의 단점을 보완하면서 면역증진 효능을 갖는 연구가 진행되었지만 (공개특허공보 제10-2012-0102933호, 공개특허공보 제10-2011-0022280호 등), 액상발효 기법이 대부분으로 산업적으로 회수율이 낮고 맛과 풍미를 증진시키기에는 부족한 실정이므로, 항산화 및 면역 증강용 식품소재로서 유산균과 고체상태의 발효시스템을 기반으로 하는 발효마늘의 개발이 절실히 요구되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 젖산 균주와 고체상태의 발효시스템을 이용하여 풍미와 항산화 및 면역기능이 증진된 발효마늘의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기에서 제조한 발효마늘을 포함함으로써, 풍미와 항산화 및 면역기능이 증진된 고체발효 마늘 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, (a) 외피 및 내피를 제거한 마늘을 건조시키고, 분쇄하여 마늘 분말을 수득하는 단계, (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 마늘 분말에 탄소원 및 질소원을 첨가하고, 혼합하여 수득한 고체 배지를 증숙시키는 단계, (c) 상기 (b) 단계에서 수득한 증숙된 고체 배지를 멸균하는 단계, 및 (d) 상기 (c) 단계에서 수득한 멸균된 고체 배지에 젖산 균주를 접종하여 고체 발효시키는 단계를 포함하는, 풍미와 항산화 및 면역기능이 증진된 발효마늘의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 외피 및 내피를 제거한 마늘을 건조시키고, 분쇄하여 마늘 분말을 수득하는 단계, (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 마늘 분말에 탄소원 및 질소원을 첨가하고, 혼합하여 수득한 고체 배지를 끓는 물에서 블랜칭하는 단계, (c) 상기 (b) 단계에서 수득한 블랜칭된 고체 배지를 멸균하는 단계, 및 (d) 상기 (c) 단계에서 수득한 멸균된 고체 배지에 젖산 균주를 접종하여 고체 발효시키는 단계를 포함하는, 풍미와 항산화 및 면역기능이 증진된 발효마늘의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 방법에 의해 제조된 발효마늘에 추출 용매를 첨가하여 추출한 발효마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 면역 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명은 젖산 균주와 고체상태의 발효시스템을 이용하여 발효마늘을 제조함으로써, 풍미와 항산화 및 면역기능이 증진되고 대량생산이 가능한 발효마늘의 제조방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면 상기의 방법에 의해 제조된 발효마늘을 항산화 및 면역 개선용 소재로 활용할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 고체 발효를 활용한 발효마늘의 제조 공정도를 나타낸 것이다.
도 2는 고체 발효를 활용한 발효마늘이 DPPH 라디컬 소거능에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 3은 고체 발효를 활용한 발효마늘이 림프구의 세포 증식율에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 4는 고체 발효를 활용한 발효마늘이 대식세포의 일산화질소(NO) 활성에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 5는 고체 발효를 활용한 발효마늘이 대식세포의 사이토카인 TNF-α 분비능에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

본 발명은 (a) 외피 및 내피를 제거한 마늘을 건조시키고, 분쇄하여 마늘 분말을 수득하는 단계, (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 마늘 분말에 탄소원 및 질소원을 첨가하고, 혼합하여 수득한 고체 배지를 증숙시키는 단계, (c) 상기 (b) 단계에서 수득한 증숙된 고체 배지를 멸균하는 단계, 및 (d) 상기 (c) 단계에서 수득한 멸균된 고체 배지에 젖산 균주를 접종하여 고체 발효시키는 단계를 포함하는, 풍미와 항산화 및 면역기능이 증진된 발효마늘의 제조방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 (a) 외피 및 내피를 제거한 마늘을 건조시키고, 분쇄하여 마늘 분말을 수득하는 단계, (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 마늘 분말에 탄소원 및 질소원을 첨가하고, 혼합하여 수득한 고체 배지를 끓는 물에서 블랜칭하는 단계, (c) 상기 (b) 단계에서 수득한 블랜칭된 고체 배지를 멸균하는 단계, 및 (d) 상기 (c) 단계에서 수득한 멸균된 고체 배지에 젖산 균주를 접종하여 고체 발효시키는 단계를 포함하는, 풍미와 항산화 및 면역기능이 증진된 발효마늘의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 용어 "고체 발효(solid state fermentation, SSF)"는 수분활성(Aw) 0.40~0.90 정도의 낮은 수분을 함유한 고체 매체에 접종한 미생물이 배지 표면에서 자란 후 점차 기질 내부 입자 사이의 공간을 통해 증식하면서 목적 물질을 생산하게 하는 형태의 발효 기술을 의미한다.

상기 고체 발효(SSF)는 기질의 가격이 저렴할 뿐만 아니라, 기질의 낮은 수분함량으로 인해 공정 중 잡균의 오염가능성이 낮고, 용적량이 많으며, 생성물의 추출 분리시 액침 발효(submerged fermentation)에 비해 적은 용매가 사용되어 폐용출수 처리 비용과 멸균 비용이 적다는 장점이 있다. 또한 배양 형태가 미생물이 자연적으로 서식하던 환경조건에 가깝기 때문에, 생성량 자체나 생성물의 활성이 액침 발효(액체 발효)에 비해 증가하는 장점을 가지고 있다.

이하, 상기 고체 발효를 활용한 발효마늘의 제조방법을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 발효마늘을 제조하기 위해, 먼저 마늘의 외피 및 내피를 제거하고 건조시킨 후, 분쇄하여 마늘 분말을 수득한다. 마늘의 외피 및 내피를 제거한 후에는 증류수로 깨끗하게 세척하고, 실온에서 건조시키는 것이 바람직하다.

이후, 상기에서 수득한 마늘 분말에 탄소원 및 질소원을 첨가하고, 혼합하여 고체 배지를 수득하고, 상기에서 수득한 고체 배지는 증숙 또는 블랜칭하는 전처리 단계를 거치게 된다.

본 발명에서, 용어 "증숙"은 쪄서 숙성시킨 것을 의미하는 것으로, 바람직하게는, 상기 증숙은 상기 고체 배지를 90~150℃의 온도에서 20~80분 동안 수행할 수 있으며, 보다 바람직하게는 110~130℃의 온도에서 30~60분 동안 수행할 수 있다.

또는, 전처리 단계로서 상기 단계에서 얻어진 고체 배지를 끓는물에서 데치는 단계, 즉, 블랜칭 단계를 거치게 된다. 본 발명에서 사용되는 용어, "블랜칭(blanching)"은 100℃ 이상의 끓는 물에서 데치는 것을 의미한다. 일 구체예에 따르면, 블랜칭은 상기 얻어진 마늘 분쇄물을 20~80분 동안 수행할 수 있으며, 30~60분 동안 수행하는 것이 바람직하다.

상기 탄소원 및 질소원으로 현미, 콩가루, 마가루 및 글루코오스가 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 탄소원 및 질소원으로 상기 마늘 분말 100 중량부에 대하여, 현미 3~7 중량부, 콩가루 0.1~1.0 중량부, 마가루 0.1~1.0 중량부 및 글루코오스 1~5 중량부, 보다 바람직하게는, 상기 마늘 100 중량부에 대하여, 상기 글루코오스 3~4 중량부, 현미 5~6 중량부, 콩가루 0.5~0.6 중량부 및 마가루 0.5~0.6 중량부를 포함할 수 있다.

본 발명의 풍미와 항산화 및 면역기능이 증진된 발효마늘의 제조방법은 상기에서 전처리한 고체 배지를 멸균하는 단계를 거치게 된다. 상기 멸균하는 방법에 대해서는 당업계에서 널리 알려진 방법으로 수행하는 것으로 족하므로, 이에 대한 구체적인 설명은 생략한다.

본 발명의 풍미와 항산화 및 면역기능이 증진된 발효마늘의 제조방법은 상기 단계에서 수득한 고체 배지에 젖산 균주를 접종하여 고체 발효시키는 단계를 거치게 된다.

상기 젖산 균주로는 Lactobacillus plantarum , Leuconostoc mesenteroides또는 이들 균주의 혼합물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 고체 발효시키는 단계는 젖산 균주가 상기 증숙 또는 블랜칭 마늘 분말의 발효 효율을 높이기 위하여, 최적의 온도 및 시간 조건으로 고체 발효시킬 수 있으며, 바람직하게는 상기 고체 배지에 젖산 균주 1~3%(w/v), 바람직하게는 2%(w/v)를 접종하고, 상기 고체 배지의 수분 함량이 45~55%(w/w), 바람직하게는 50%(w/w)가 되도록 멸균수를 첨가한 후, 35~38℃, 바람직하게는 37℃의 온도에서 24~72시간, 바람직하게는 24~36시간 동안 고체 발효시키는 단계를 거치게 된다.

본 발명의 풍미와 항산화 및 면역기능이 증진된 발효마늘의 제조방법은 상기 단계에서 고체 발효시킨 발효마늘을 멸균한 후, 영하 30~80℃, 바람직하게는 영하 35~45℃에서 동결건조시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 방법에 의해 제조된 발효마늘에 추출 용매를 첨가하여 추출한 발효마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 면역 개선용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, 용어 "항산화(antioxidation)"는 산화를 억제하는 작용을 의미하고, 용어 "면역 개선(immune improvement)"은 생체내 면역 시스템의 면역 반응 또는 활성을 증가시키는 것을 의미한다.

상기 추출 용매로는 극성 용매를 이용할 수 있는데, 상기 극성 용매로서 적합한 것은, 정제수, 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), 아세트산, DMFO(dimethyl-formamide) 및 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함하고, 보다 바람직하게는, 정제수, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급 알코올과 정제수와의 혼합용매를 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는, 정제수, 메탄올, 에탄올 및 이의 혼합물일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "추출물"은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다.

즉, 발효마늘 추출물은 상술한 추출 용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제 과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예를 들어, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 상기 추출물에 포함되는 것이다.

또한, 상기 발효마늘의 추출물은 재추출, 감압 증류, 동결 건조, 분무 건조 또는 이들의 조합과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 상기 항산화 및 면역 증강용 조성물은 식품 조성물 또는 약학 조성물일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다.

상기 유형들은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들어, 건강식품으로는 본 발명의 마늘 발효물을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 발효마늘과 항산화 및 면역기능 증진 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 상기 발효마늘 뿐만 아니라, 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다.

상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 향미제로는 천연 향미제(타우마틴; 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등과 같은 스테비아 추출물) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

예를 들어, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 상기 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 발효마늘의 바람직한 함량은 0.01 내지 50 중량%이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 상기 약학 조성물 상술한 본 발명의 발효마늘의 약학적 유효량; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 용어, "약학적 유효량"은 상술한 상기 발효마늘의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 상기 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있으며, 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 상기 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 실험 방법

1-1. 실험재료

본 실험에 사용한 마늘은 의성마늘로 새의성농협에서 구입하여 사용하였고, RPMI 1640, FBS는 Life Technology Co.(Gibco, USA)에서 구입하였으며, 표준품 Rinin과 Qurcetin, DMSO(Dimethyl Silfoxide)와 MTT [ 3-(4,5-dimethy lthiazo l-2-yl) 2,5-diphenyl tetra zolium bromide]는 Sigma-Aldrich Co.(St.Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

1-2. 발효균주

Lacobacillus plantarum(KCTC 21004)균주, Leuconostoc mesenteroides(KCTC 13302)균주는 한국생명공학연구원 미생물자원센터로부터 분양받아 사용하였으며, 배양 배지는 DIFCO^TM Agar (Becton, Dickinson and Company, ISA)를 사용하였다.

1-3. 면역세포 분리를 위한 혈액 채취

본 연구에 사용된 혈액은 강원대학교 식품생명공학 전공 재학생들 중 질병이 없고 건강한 지원자 5명을 선발하였으며, 각 지원자들로부터 혈액채취는 강원대학교 부속 병원 임상병리과 간호사의 지원을 받아 50 ㎖씩 2회 채취한 후, 신속히 아이스박스에 넣어서 20분 이내 실험실로 운반하여 림프구와 단핵구를 분리하여 실험에 사용하였다.

1-4. 전처리 및 발효와 추출 방법

1-4-1. 전처리 과정

도 1은 유산균을 이용하여 고체상태의 발효 조성물 제조를 위한 고체상태 발효 마늘의 제조 공정도를 나타낸 것이다.

마늘 시료 850g의 외피와 내피를 모두 제거한 후, 증류수로 세척하고 60℃ 열풍건조기에서 48시간 건조하여 분쇄한 다음, 증숙; 121℃, 15분)하여 전처리를 수행하였다.

상기 전처리된 마늘 분말을 실온에서 냉각시킨 다음, 발효 공정에 사용하였다. 또한 고체 발효를 위하여 탄소원(현미), 질소원(콩가루), 마가루도 전처리하여 발효공정에 사용하였다.

1-4-2. 발효 조건

유산균 균주를 고체 발효 기법으로 배양하기 위하여, 테스트 튜브에 배양액 MRS 브로쓰를 10 ㎖씩 분주하여 고압 멸균시킨 다음, 상온에서 충분히 냉각시켜 젖산 균주를 접종하고 37℃, 48시간 동안 배양시켜 스타터를 준비하였다.

발효 조건은 고체 배지(마늘, 현미, 콩가루, 마가루, 글루코오스)에 유산균 접종량 2%, 수분 50%를 첨가하고 랩으로 밀봉한 후, 5~6개의 구멍을 만들어 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.

이때, 상기 고체 배지는 마늘 89 중량%, 글루코오스 3.0 중량%, 현미 5.0 중량%, 콩가루 0.5 중량%, 마가루 0.5 중량% 및 유산균 2 중량%로 조성되었다.

발효마늘은 2가지 균주를 사용하여 제조되었다. 이하 Lactobacillus plantarum (KCTC 21004) 균주에 의해 발효된 고체마늘 1, Leuconostoc mesenteroides (KCTC 13302) 균주에 의해 발효된 고체마늘 2로 명명하기로 하였다.

1-4-3. 추출조건

항산화 및 면역증강을 확인하기 위하여, 2L 삼각플라스크에 60℃ 열풍건조된 마늘, 고체발효 마늘을 넣고 1L의 70% 에탄올을 첨가한 후 80℃, 24시간 동안 환류냉각하여 3회 추출하였으며, 50℃ 진공 회전농축기로 에탄올을 제거한 후 동결건조한 시료를 사용하였다.

1-5. 휘발성 향미성분 및 지표성분 분석

1-5-1. 휘발성 향미성분 분석( GC -MS)

마늘의 주요 향기 성분은 휘발성 황화합물로 알려져 있으며, 그 종류로는 메틸 설파이드(methyl sulfide), 에틸 설파이드(ethyl sulfide), 알릴 트리설파이드(allyl trisulfide) 등이 있으며, 발효 후 이러한 향미성분의 변화를 확인하였다.

마늘의 휘발성 향기성분의 분석을 위해 purge & trap 장치를 이용하여 휘발성 향기성분을 수집하였고, 휘발성 향기성분의 분리와 동정은 가스 크로마토그래피 매스(GC-Mass)를 이용하여 분석한 후, 각 피크의 매스 스펙트럼(mass spectrum)을 Wiley library data를 이용하여 동정하였다.

1-5-2. 지표성분 S- 알릴시스테인 (SAC), 감마- 글루타밀 -S- 알릴시스테인 ( GSAC ) 분석

마늘의 기능성을 나타내는 함화합물인 SAC과 GSAC을 분석하기 위하여, 아미노산 분석용 전처리 시약인 Accq-Tag chemisrty paclage(waters Co., Milford, MA, USA)를 사용하여 형광 유도체화 한 후, HPLC를 이용하여 분석하였다.

1-6. 항산화와 면역활성측정

1-6-1. 총 폴리페놀 함량 측정

시료의 총 폴리페놀 함량을 측정하기 위하여, 1mg/mL로 제조된 추출액 0.5 mL에 Folin-Denis reagent를 0.5 mL가하여 혼합한 후, 3분간 실온에 반응시켰다. 반응 후 10% 소디움 카보네이트(sodium carbonate) 용액 0.5 mL을 가하여 혼합한 후 1시간 동안 방치한 다음, 상층액을 취하여 스펙트로포토미터로 760 nm 흡광도에서 측정하였다.

1-6-2. 총 플라보노이드 함량 측정

시료의 총 플라보노이드 함량을 측정하기 위하여, 1mg/mL로 제조된 시료 250μL에 멸균 정제수 1,250 μL와 5% 소디움 니트릴(NaNO₂) 75 μL를 첨가하고 6분간 반응시킨 후, 10% 염화알루미늄 수화물(aluminum chloride hydrate) 150 μL를 첨가하여 5분간 상온에서 반응시켰다. 그런 다음, 1 M NaOH 500 μL를 첨가하여 스펙트로포토미터로 510 nm 흡광도에서 측정하였다.

1-6-3. DPPH 라디칼 소거(radical scavenging) 활성 측정

DPPH 라디칼 소거능은 시료 0.2 mL에 ethanol로 용해한 0.4 mM DPPH 용액 0.8 mL을 첨가하여 혼합한 후 상온에서 10분간 반응한 다음, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 490 nm에서 흡광도 값을 측정한 후, 다음 식을 이용하여 결과 값을 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거능(%) = (1-

)

100

1-6-4. 림프구의 세포 증식능 측정

림프구의 세포분열 증식에 미치는 추출물의 영향을 측정하기 위하여, 1x10⁶cell/mL의 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰에 분주한 후 24시간 배양하고, 추출물 시료를 500 μg/mL 농도로 제조한 다음, 각 웰에 20 μL 첨가한 후 37℃, 5% CO₂ 조건에서 48시간 배양하였다.

상기 배양 후 MTT를 DPBS를 사용하여 5 mg/mL의 농도로 제조한 다음, 각 웰에 20 μL씩 첨가하고 알루미늄 호일로 보양하여 3시간 동안 배양한 후, 각 웰에 DMSO 100 μL를 넣어주고 암실에서 30분 동안 쉐이킹한 다음, ELISA reader (ELx808 BIO-TEK Instruments, Vinooski, VT, USA)를 사용하여 570 nm 흡광도에서 측정하였다.

1-6-5. 대식세포의 일산화질소(NO) 활성 측정

대식세포로부터 생성되는 NO의 양을 측정하기 위하여, 1×10⁶ cells/mL의 대식세포를 96 웰 플레이트의 각 웰에 200 μL씩 분주하고, 3시간 동안 배양한 후 비부착 세포를 완전히 제거하였다.

그런 다음, 배지를 교체한 후 추출물 시료를 500 μg/mL 농도로 제조하고, 각 웰에 20 μL를 첨가하고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 48시간 동안 배양한 후에 생성된 NO 생성양을 96 웰 플레이트 배양액 100 μL와 100 μL Griess 시약을 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 후, 540 nm 흡광도에서 측정하였다.

1-6-6. 대식세포의 사이토카인 TNF -α 분비능 측정

대식세포로부터 분비되는 사이토카인 TNF-α (tumor necrosis factor-α)의 양을 측정하기 위하여, 1×10⁶ cells/mL의 대식세포를 96 웰 플레이트의 각 웰에 분주하고 24시간동안 배양 후, 추출물 시료를 500 μg/mL 농도로 제조한 다음, 각 웰에 20 μL를 첨가한 후 37℃, 5% CO₂ 조건에서 48시간 동안 배양한 다음, TNF-α의 분비능의 변화를 측정하였다.

TNF-α의 분비능 활성 측정은 ELISA 키트(Human Biotrak ELISA System, Amersham Biosciences)를 사용하여 수하였다. 희석 용액 50 μL를 96 웰 플레이트에 분주하고 배양액 시료와 표준 용액을 각각 50 μL씩 첨가하고 실온에서 2시간동안 배양한 후, 96 웰 플레이트에 반응액을 제거하고 PBS로 3회 세척한 다음, 혼합반응 용액 Streptavidin-HRP (horse radish peroxidase conjugated enzyme) 100 μL를 첨가하여 실온에서 30분간 배양하였다.

96 웰 플레이트의 반응액을 제거한 후 PBS로 3회 세척한 다음, 기질로 사용하는 테트라메틸벤지딘(TMB) 100 μL를 각 웰에 첨가하고, 알루미늄 호일로 보양하여 실온에서 30분간 배양하였다. 그런 다음, 각 웰에 반응 정지 용액 50 μL를 첨가한 후, ELISA reader (BIO-TEK Instruments)를 사용하여 450 nm 흡광도에서 측정하였다.

1-7. 관능평가

유산균을 접종시켜 발효시킨 마늘의 맛과 향미가 개선시킨 마늘을 강원대학교 학생 20명을 대상으로 실험의 목적을 잘 인지하도록 반복 훈련시킨 후, 색, 향, 질감, 이취 및 전체적인 기호도의 5가지 항목을 5점 척도 (1점 : 매우 싫다, 3점: 보통이다, 5점: 매우 좋다)로 실시하였다.

이때, 비교를 위하여 대조군으로 동결건조 마늘을 함께 사용하여 기호도를 측정하였다.

2. 실험결과

2-1. 향미 증진을 위한 휘발성 황화합물 및 지표성분 분석

마늘 고유의 휘발성 황화합물과 발효마늘을 비교하기 위하여, GC-MS 분석법을 이용하여 휘발성 황화합물을 정량화한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 동결건조된 생마늘에서는 메틸설파이드, 에틸설파이드, 알릴 트리설파이드, 프로필 디설파이드가 검출된 반면, 유산균 발효된 고체 마늘에서는 휘발성 황화합물이 검출되지 않았다.

이때, 상기 유산균 발효된 고체 마늘에서 휘발성 황화합물이 검출되지 않은 이유는 열처리 및 발효 과정에서 휘발성 화합물이 휘발되어 버렸기 때문으로 판단된다.

또한, 지표성분인 S-알릴 시스테인(SAC), γ-글루타밀-S-알릴 시스테인 (GSAC)을 분석한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 마늘의 기능성을 나타내는 SAC 함량은 동결건조된 생마늘과 비교하여 발효된 마늘에서 지표성분의 함량이 증가하였으며, SAC의 전구물질로 황화합물의 82%를 차지하는 GSAC의 함량은 동결건조된 생마늘과 대비하여 발효된 마늘에서 함량이 감소하였다.

위와 같은 결과는 유산균 발효를 통하여 마늘이 갖고 있는 특유의 향미가 증진된 것을 의미한다.

2-2. 고체상태 발효마늘이 항산화 효과에 미치는 영향

하기 표 3에서 보는 바와 같이, 동결건조 및 60℃ 열풍건조 마늘과 대비하여 고체발효 마늘군의 두 균주로 발효한 마늘 모두에서 유의적으로 높은 총 폴리페놀과 총 페놀함량을 나타내었다.

또한, 도 2에서 보는 바와 같이, 항산화 효능을 측정하는 DPPH 라디칼 소거능 시험에서도 생마늘 보다 발효마늘에서 유의적으로 더 높은 결과를 보여주었다.

2-3. 고체상태 발효마늘이 면역 증진 효과에 미치는 영향

2-3-1. 림프구의 세포 증식율에 미치는 영향

세포 증식을 확인하기 위하여, 분리된 면역세포에 각각의 마늘군을 농도별(0, 250, 500, 750, 1,000 ug/mL)로 처리하여 세포 생존율을 확인한 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, 1,000 ㎍/mL의 농도에서 유의적인 세포 증식율이 증가됨을 확인할 수 있었다.

2-3-2. 고체상태 발효마늘에 의한 일산화질소(NO) 및 TNF - α생성능 측정

면역계에서 외부 물질에 대한 방어 작용을 하는 중요한 신호전달 물질인 NO를 확인한 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, 고체마늘 2(KCTC13302)은 대조군과 대비하여 수치적인 증가는 있었으나 유의적인 증가를 나타내지 못한 반면, 고체마늘 1(KCTC 21004) 발효군은 대조군과 대비하여 약 13%로 유의적으로 NO 생성을 증가시킴을 확인할 수 있었다.

또한, T 림프구를 활성 조절하는 TNF-α사이토카인의 발현을 확인한 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, 고체 발효군에서 대조군 보다 유의하게 증가함을 확인할 수 있었다. 특히 고체마늘 1(KCTC21004)에서 약 12%의 TNF-α사이토카인이 유의적으로 증가되었음을 알 수 있다.

2-4. 고체상태 발효마늘에 대한 관능검사

동결건조된 생마늘과 유산균으로 발효된 마늘의 색감, 향, 맛, 매운맛, 후미 및 전체적인 기호도를 20명을 대상으로 평가한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

상기 표 4에서 보는 바와 같이, 생마늘 대조군에 비하여 고체발효 마늘 시료에서 맛과 향 등을 포함하여 전체적인 기호도가 높았다.

상기의 결과들을 종합하면, 고체발효 마늘의 향미가 증진된 것을 의미한다.

상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명에 의하면, 젖산 균주와 고체상태의 발효시스템을 이용하여 발효마늘을 제조함으로써, 마늘의 회수율 및 맛과 풍미가 증가되고 대량생산이 가능한 발효마늘의 제조방법을 제공할 수 있고, 또한 상기의 방법에 의해 제조된 발효마늘을 항산화 및 면역증강용 건강식품 소재로 활용할 수 있는 장점이 있기 때문에, 본 발명이 속하는 기술분야에 유용하게 적용될 수 있다.

Claims

(a) 외피 및 내피를 제거한 마늘을 건조시키고, 분쇄하여 마늘 분말을 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 마늘 분말에 탄소원 및 질소원을 첨가하고, 혼합하여 수득한 고체 배지를 증숙시키는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 수득한 증숙된 고체 배지를 멸균하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 수득한 멸균된 고체 배지에 젖산 균주를 접종하여 고체 발효시키는 단계를 포함하는, 풍미가 증진된 발효마늘의 제조방법으로서,
상기 탄소원 및 질소원은 현미, 콩가루, 마가루 및 글루코오스이고,
상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계에서 수득한 고체 배지에 젖산 균주 2%(w/v)를 접종하고, 상기 고체 배지의 수분 함량이 50%(w/w)가 되도록 멸균수를 첨가한 후, 37℃의 온도에서 48시간 동안 고체 발효시키며,
상기 발효마늘은 휘발성 향기성분인 메틸설파이드, 에틸설파이드, 알릴트리설파이드 및 프로필디설파이드를 함유하지 아니하고, 동결건조된 생마늘에 비하여, S-알릴 시스테인의 함량은 증가하고, γ-글루타밀-S-알릴 시스테인의 함량은 감소하는 것을 특징으로 하는 풍미가 증진된 발효마늘의 제조방법.
(a) 외피 및 내피를 제거한 마늘을 건조시키고, 분쇄하여 마늘 분말을 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 마늘 분말에 탄소원 및 질소원을 첨가하고, 혼합하여 수득한 고체 배지를 끓는 물에서 블랜칭하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 수득한 블랜칭된 고체 배지를 멸균하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 수득한 멸균된 고체 배지에 젖산 균주를 접종하여 고체 발효시키는 단계를 포함하는, 풍미가 증진된 발효마늘의 제조방법으로서,
상기 탄소원 및 질소원은 현미, 콩가루, 마가루 및 글루코오스이고,
상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계에서 수득한 고체 배지에 젖산 균주 2%(w/v)를 접종하고, 상기 고체 배지의 수분 함량이 50%(w/w)가 되도록 멸균수를 첨가한 후, 37℃의 온도에서 48시간 동안 고체 발효시키며,
상기 발효마늘은 휘발성 향기성분인 메틸설파이드, 에틸설파이드, 알릴트리설파이드 및 프로필디설파이드를 함유하지 아니하고, 동결건조된 생마늘에 비하여, S-알릴 시스테인의 함량은 증가하고, γ-글루타밀-S-알릴 시스테인의 함량은 감소하는 것을 특징으로 하는 풍미가 증진된 발효마늘의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 증숙은 90~150℃의 온도에서 20~80분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, 풍미가 증진된 발효마늘의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 (b) 단계의 블랜칭은 100~150℃의 끓는 물에서 20~80분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, 풍미가 증진된 발효마늘의 제조방법.
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 젖산 균주는 Lactobacillus plantarum 및 Leuconostoc mesenteroides로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 풍미가 증진된 발효마늘의 제조방법.
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