WO2022025022A1 - 糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤、エピメリ化反応生成物の製造方法およびエピメリ化反応生成物 - Google Patents

糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤、エピメリ化反応生成物の製造方法およびエピメリ化反応生成物 Download PDF

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WO2022025022A1
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WO
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sugar
enzyme
amino acid
epimerization reaction
acid sequence
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PCT/JP2021/027632
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美生夏 谷
貴久 飯塚
研太 金井
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日本食品化工株式会社
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    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/90—Isomerases (5.)
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    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
    • C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)
    • C12Y501/03008—N-Acylglucosamine 2-epimerase (5.1.3.8)

Definitions

  • the present invention includes an enzyme agent for an epimerization reaction catalyst of sugar, a method for producing an epimerization reaction product, and an epimeri obtained by the production method, which comprises a step of allowing the enzyme agent to act to obtain an epimerization reaction product.
  • an enzyme agent for an epimerization reaction catalyst of sugar a method for producing an epimerization reaction product, and an epimeri obtained by the production method, which comprises a step of allowing the enzyme agent to act to obtain an epimerization reaction product.
  • chemical reaction products is a chemical reaction products.
  • Mannose is an isomer of glucose and is well known as glucomannan extracted from konjac, hemicellulose, or a constituent sugar of a sugar chain present on the cell surface. It is also known that mannose itself is contained in cranberries.
  • the bioavailability of mannose is low, and most of the orally ingested mannose is rapidly excreted in the urine.
  • the causative bacterium of a urinary tract infection is considered to adhere to and infect the urinary tract surface via the binding of the mannose-binding lectin possessed by the bacterium and the sugar chain existing in the urinary tract surface cells. Since orally ingested mannose is rapidly excreted in urine, the excreted mannose is expected to have the effect of preventing urinary tract infections by inhibiting the binding of the bacterium to the mannose-binding lectin and cell surface sugar chains. (Non-Patent Document 1).
  • Patent Document 1 discloses a technique relating to a harmful bacterial infection inhibitor or a feed for preventing harmful bacterial infection, which contains a mannose-containing sugar composition as an active ingredient.
  • Patent Document 2 describes a texture improving agent for foods and drinks containing mannose as an active ingredient.
  • the first chemical reaction method is a method of producing sorbitol and mannitol by reducing sucrose, separating mannitol, and further oxidizing mannitol to prepare mannose.
  • This method requires a multi-step step and a catalytic reaction at high temperature and high pressure, which is problematic in terms of efficiency.
  • the second chemical reaction method is a method of preparing mannose by hydrolyzing glucomannan or mannan.
  • this method has a problem that the substrate is expensive and labor is required to prepare the substrate.
  • the third chemical reaction method is a method of hydrolyzing hemicellulose such as coprameal.
  • this method has a problem that the yield of mannose is poor due to the variety of constituent sugars, and in the case of acid hydrolysis, the yield is further deteriorated and the purification load is increased.
  • the fourth chemical reaction method is a method for preparing mannose by isomerizing glucose under alkaline conditions.
  • this method has a problem that the yield is poor and the purification load is large because sugar is decomposed.
  • the fifth chemical reaction method is also a method for preparing mannose by isomerizing fructose under alkaline conditions.
  • this method has problems in terms of yield and purification load like the fourth chemical reaction method, fructose is relatively expensive compared to glucose, and fructose remains in the reaction system. There is also a problem that it is difficult to separate from mannose.
  • the first enzymatic method is to prepare mannose by allowing mannose isomerase to act on fructose.
  • mannose isomerase to act on fructose.
  • the second enzymatic method is a method for preparing mannose by allowing an aldose-ketose isomerase (hereinafter referred to as "AKI") to act on glucose or fructose.
  • AKI aldose-ketose isomerase
  • CE Cellobiose 2-epimerase
  • the enzyme can catalyze ⁇ -1,4 bound cellobiose to 4-O- ⁇ -glucosylmannose or vice versa.
  • Patent Document 4 describes that mannose was obtained by allowing the CE to act on glucose (third enzyme method).
  • the fourth enzyme method is a method using an enzyme that catalyzes the reaction of epimerizing the hydroxyl groups at the 2-positions of glucose, mannose, galactose and talose (Patent Documents 5 and 6). This method is superior to the first to third enzyme methods in that fructose and tagatose are hardly by-produced (Patent Documents 5 and 6).
  • Non-Patent Document 1 is incorporated herein by reference in particular.
  • the production efficiency of the epimerization reaction product by the enzymatic method largely depends on the characteristics of the enzyme used. There has been a need for an enzymatic agent that catalyzes the epimerization reaction of the substrate more efficiently, which is suitable for use on an industrial scale. Further, the by-product not only lowers the yield of the target reaction product, but also requires labor for separation, which causes a problem of lowering the production efficiency.
  • the present invention is a problem to be solved to provide an enzyme agent which has few by-products and efficiently catalyzes an epimerization reaction.
  • the present inventors have attempted to search for an epimerizing enzyme for mannose, and have analyzed the expression and various properties of genes encoding various proteins. Among them, expression analysis was performed focusing on a gene (GenBank: WP_010853281.1) that exists on the genome of Lunatimonas lonareniss and is presumed to be N-acylglucosamine 2-epimerase. As a result, it was found that the protein has a 2-epimerization activity that mutually converts mannose and glucose, and galactose and talos, respectively.
  • the present invention is as follows. [1] An enzyme agent for an epimerization reaction catalyst of a sugar containing any of the following proteins (a) to (c), wherein the sugar is selected from the group consisting of glucose, mannose, talose and galactose. An enzyme agent for the epimerization reaction catalyst of sugar, which is one of the above.
  • a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3 (b) A protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more amino acid sequence identity with respect to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3 and having an activity of catalyzing the epimerization reaction of sugar; (c) In the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3, the amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, inserted, deleted and / or added, and has an activity of catalyzing the epimerization reaction of sugar. Protein to have.
  • An enzyme agent for an epimerization reaction catalyst of sugar which comprises a culture supernatant of transformed cells into which any of the following polynucleotides (d) to (f) has been introduced, wherein the sugar is glucose. , Mannose, talose and galactose, one of which is an enzyme agent for an epimerization reaction catalyst of sugar.
  • Polynucleotide to be (F) A polynucleotide having a base sequence identity of 90% or more with respect to the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, and having an activity of catalyzing the epimerization reaction of sugar. Polynucleotide to be.
  • a method for producing a sugar epimerization reaction product which comprises a step of allowing the enzyme agent according to [1] or [2] to act on a sugar substrate to obtain a sugar epimerization reaction product.
  • Foods, feeds, feeds including the step of obtaining foods, feeds, feeds, cosmetics, or pharmaceuticals using the sugar epimerization reaction products obtained by carrying out the method according to [3]. How to make cosmetics or medicines.
  • FIG. 1A is an amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of a virtual protein derived from Luna Timonas ronalensis.
  • the underlined region is the presumed signal peptide sequence.
  • FIG. 1B is a base sequence (SEQ ID NO: 2) encoding the amino acid sequence of a virtual protein derived from Luna Timonas ronalensis.
  • the underlined region is the base sequence corresponding to the signal peptide sequence.
  • the sequence in which the base sequence corresponding to the signal peptide sequence is deleted from the base sequence of SEQ ID NO: 2 is the base sequence of SEQ ID NO: 4.
  • FIG. 1C is an amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) of a virtual protein derived from Luna Timonas ronalensis.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is a sequence obtained by removing the portion presumed to be a signal peptide from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 2A is an amino acid sequence (SEQ ID NO: 9) of a protein derived from Meriolibacter Roseus used as a comparative example.
  • FIG. 2B is a base sequence (SEQ ID NO: 10) encoding a protein derived from Meriolibacter Roseus used as a comparative example.
  • FIG. 3 is an SDS-PAGE analysis of a protein derived from Luna Timonas lonalensis (filter-filtered culture supernatant) obtained by culturing in Example 1.
  • FIG. 4 is an SDS-PAGE analysis of a protein derived from Luna Timonas lonalensis (filter-filtered culture supernatant) obtained by culturing in Example 2.
  • the band of protein derived from Luna Timonas ronalensis is indicated by an arrow.
  • M Marker, S: Single.
  • FIG. 5 is a TLC analysis of the enzyme reaction product. The following is a description of the abbreviations. Glc: Glucose, Man: Mannose, Mal: Maltose, Gal: Galactose, Tal: Talose, B: Before enzyme reaction, R: After enzyme reaction.
  • FIG. 6 shows the mannose content and fructose content in the reaction product when the enzyme solution 1, the comparative enzyme solution and the empty vector control were allowed to act on glucose under pH 6.0 conditions for 72 hours. It is a graph which shows.
  • the amount of enzyme added is 10.3, 20.6, 41.3, 82.5, 165.0 and 330.0 ⁇ L / g-ds.
  • the mannose content and fructose content were calculated from the peak area ratio of the HPLC analysis.
  • FIG. 7 shows the time course of mannose content and fructose content in the reaction product when the enzyme solution 1, the comparative enzyme solution and the empty vector control were allowed to act on glucose under pH 6.0 conditions. It is a graph which shows.
  • the amount of enzyme added is 330.0 ⁇ L / g-ds.
  • the mannose content and fructose content were calculated from the peak area ratio of the HPLC analysis.
  • FIG. 8 shows the mannose content and fructose content in the reaction product when the enzyme solution 1, the comparative enzyme solution and the empty vector control were allowed to act on glucose under pH 7.0 conditions for 72 hours. It is a graph which shows.
  • the amount of enzyme added is 10.3, 20.6, 41.3, 82.5, 165.0 and 330.0 ⁇ L / g-ds.
  • FIG. 9 shows the time course of mannose content and fructose content in the reaction product when the enzyme solution 1, the comparative enzyme solution and the empty vector control were allowed to act on glucose under pH 7.0 conditions. It is a graph which shows.
  • the amount of enzyme added is 330.0 ⁇ L / g-ds.
  • FIG. 10 shows the mannose content and fructose content in the reaction product when the enzyme solution 1, the comparative enzyme solution and the empty vector control were allowed to act on glucose under pH 8.0 conditions for 72 hours. It is a graph which shows.
  • the amount of enzyme added is 10.3, 20.6, 41.3, 82.5, 165.0 and 330.0 ⁇ L / g-ds.
  • the mannose content and fructose content were calculated from the peak area ratio of the HPLC analysis.
  • ⁇ This enzyme solution 1 (mannose content), ⁇ : This enzyme solution 1 (fructose content), ⁇ : Comparative enzyme solution (mannose content), ⁇ : Comparative enzyme solution (fructose content), ⁇ : Empty vector control (mannose content), ⁇ : Empty vector control (fructose content).
  • FIG. 11 shows the time course of the mannose content and fructose content in the reaction product when the enzyme solution 1, the comparative enzyme solution and the empty vector control were allowed to act on glucose under pH 8.0 conditions.
  • the sugar composition (%) of the reaction product produced by the enzyme of the present invention is calculated as the area ratio (%) of the peak corresponding to each sugar when the total area of the peaks detected by HPLC is 100. ..
  • the present invention provides an enzymatic agent for an epimerization reaction catalyst of a sugar, which comprises any of the following proteins (a) to (c).
  • any of the proteins (a) to (c) above may be referred to as a protein contained in the enzyme preparation of the present invention or the present protein.
  • “Sugar epimerization” or “sugar epimerization” is a reaction of reversing a solid on one asymmetric carbon among a plurality of asymmetric carbons of a sugar, and specifically, as an example, a sugar.
  • the reaction of epimerizing (isomerizing) the hydroxyl group at the 2-position of the above, or the reverse reaction thereof can be mentioned.
  • the enzyme that catalyzes epimerization is usually called epimerase, and for example, cellobiose 2-epimerase (CE) can be mentioned as a well-studied epimerase.
  • CE catalyzes the reaction of isomerizing the reducing end glucose residue of cellobiose to a mannose residue.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence (NCBI Reference: WP_010853281.1) obtained from the genomic information of Lunatimonas lonarenissis.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is annotated with the N-acylglucosamine 2-epimerase family, the specific properties when expressed as a protein were not known at the time of filing the application.
  • the present inventors expressed a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 as a recombinant protein by a bacillus expression system, and analyzed its enzymatic activity. As a result, the protein acted on at least glucose to produce mannose. , It was discovered that it acts on galactose and produces talose, respectively. That is, the present inventors have described that the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is an enzyme that catalyzes epimerization of the hydroxyl group bonded to the carbon at the 2-position in a monosaccharide such as glucose, mannose, talose and galactose. I found that there is.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is a sequence obtained by removing the portion presumed to be a signal peptide from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the reaction that catalyzes epimerization with respect to the hydroxyl group bonded to the carbon at the 2-position in monosaccharides such as glucose, mannose, talose and galactose is reversible. For example, when the hydroxyl group bonded to the carbon at the 2-position of glucose is epimerized, it becomes mannose, and when the hydroxyl group bonded to the carbon at the 2-position of mannose is epimerized, it becomes glucose.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 derived from Luna Timonas ronalensis had a primary amino acid sequence identity of about 50% with respect to the amino acid sequence of a known CE.
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 has 50% primary amino acid sequence identity to CE (GenBank: AFN7349.1) derived from Merioribacter roseus (identity is ClustalW). (Evaluated using Larkin M.A. et al., 2007, Bioinformatics, 2007; 23: 2947-2948).
  • the protein contained in the enzymatic agent of the present invention is a protein having an amino acid sequence having 90% or more amino acid sequence identity with respect to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3, and exhibiting sugar epimerization activity. There may be.
  • the protein contained in the enzymatic agent of the present invention is 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, based on the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3. It may be a protein having an amino acid sequence having 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more amino acid sequence identity and exhibiting sugar epimerization activity.
  • Amino acid sequence identity is the amino acid residues that are identical between the two amino acid sequences after aligning the two amino acid sequences to be compared and introducing a gap if necessary to obtain maximum percent sequence identity. Defined as a percentage. Amino acid sequence identity can be determined by using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN, or Megaligin (DNASTAR) software.
  • the protein contained in the enzymatic agent of the present invention is a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, inserted, deleted and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3. It may be a protein consisting of and having an activity of catalyzing the epimerization reaction of sugar.
  • the range of "1 or several" in the "amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, inserted, deleted and / or added" as used herein is not particularly limited, but is, for example, 1 to 20. It means, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, still more preferably 1 to 5, and particularly preferably about 1 to 3.
  • For the method for producing the protein contained in the enzyme preparation of the present invention refer to ⁇ Protein Production> described later.
  • the present invention is an enzyme agent for an epimerization reaction catalyst of sugar, which comprises a culture supernatant of transformed cells into which any of the following polynucleotides (d) to (f) has been introduced, wherein the sugar is used.
  • an enzyme agent for an epimerization reaction catalyst of sugar which is selected from the group consisting of glucose, mannose, talose and galactose.
  • Polynucleotide to be (F) A polynucleotide having a base sequence identity of 90% or more with respect to the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, and having an activity of catalyzing the epimerization reaction of sugar. Polynucleotide to be.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a base sequence encoding the amino acid sequence (NCBI Reference: WP_010853281.1) of SEQ ID NO: 1 obtained from the genomic information of Lunatimonas lonarenissis.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 is a sequence obtained by removing the base sequence encoding the portion presumed to be a signal peptide from the base sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with the complementary strand of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 and encodes a protein having an activity of catalyzing an epimerization reaction is introduced. Culture supernatants of the transformed cells are also included in the present invention.
  • the "polynucleotide that hybridizes with the complementary strand of the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 under stringent conditions" is the complementary strand of the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4.
  • Stringent conditions are, for example, 55-65 using a 0.1-5 x SSC solution (1 x SSC composition: 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate) after Southern hybridization. Conditions for cleaning the filter under °C conditions include (Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed (Sambrook, Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))). In one embodiment of the invention, the stringent condition is a condition of washing at 60-65 ° C. after Southern hybridization at a salt concentration corresponding to 0.1-1 ⁇ SSC, 0.1% SDS. ..
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide is 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96.
  • Transformed cells into which a polynucleotide encoding a polynucleotide having a nucleotide sequence identity of% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more and having an activity of catalyzing an epimerization reaction has been introduced.
  • the culture supernatant of is also included in the present invention.
  • Sequence identity is defined as the percentage of bases that are identical between the two sequences after aligning the two sequences to be compared and introducing a gap if necessary to obtain maximum percent sequence identity. Defined. Sequence identity can be determined by using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN, or Megaligin (DNASTAR) software.
  • the transformed cells are preferably Bacillus subtilis.
  • the culture supernatant of the present invention is substantially free of cells, and the cells are removed by a filter or centrifugation.
  • the culture supernatant of the present invention contains a protein which is an expression product of the polynucleotides (d) to (f) above.
  • the protein contained in the culture supernatant of the present invention which is an expression product of the polynucleotides (d) to (f) above, is referred to as a protein contained in the enzyme preparation of the present invention or the present protein. There is.
  • the protein of the present invention was allowed to act on any of glucose, mannose, talose and galactose as a substrate, and the obtained epimerization reaction product was obtained. Is performed by detecting.
  • the reaction product can be detected by a RI detector, a charged particle detector, etc. using high performance liquid chromatography (HPLC). Detection can also be performed using thin layer chromatography (TLC) and high performance ion exchange chromatography / pulsed amperometry detection (HPAEC-PAD).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Detection can also be performed using thin layer chromatography (TLC) and high performance ion exchange chromatography / pulsed amperometry detection (HPAEC-PAD).
  • Mannose is produced by the epimerization of glucose
  • glucose is produced by the epimerization of mannose
  • galactose is produced by the epimerization of talose
  • talose is produced by the epimerization of galactose.
  • the enzyme agent for the sugar epimerization reaction catalyst of the present invention can be used to catalyze the epimerization of the hydroxyl group bonded to the carbon at the 2-position in the reducing sugar residue of the monosaccharide or the disaccharide.
  • the enzyme agent for the sugar epimerization reaction catalyst of the present invention is not limited to these, but at least one sugar epimerization reaction selected from glucose, mannose, galactose and talose. It can be used to catalyze. This is because the protein contained in the enzyme preparation of the present invention acts on at least glucose, mannose and galactose. The protein contained in the enzyme preparation of the present invention can epimerize the hydroxyl group at the 2-position of the monosaccharide.
  • the enzyme agent for the sugar epimerization reaction catalyst of the present invention can be used for producing the sugar epimerization reaction product.
  • the enzyme agent for the sugar epimerization reaction catalyst of the present invention can be used to produce mannose using glucose as a substrate, and can be used to produce glucose using mannose as a substrate. Can be done.
  • the enzyme agent is preferably used to produce mannose using glucose as a substrate. This is because glucose is industrially mass-produced and inexpensive, and therefore can be easily procured in order to produce mannose, which has a problem in the industrial production method.
  • the enzyme agent for the sugar epimerization reaction catalyst of the present invention can be used for producing talos using galactose as a substrate, and can be used for producing galactose using galactose as a substrate.
  • the enzyme preparation is preferably used for producing talos using galactose as a substrate. This is because galactose is obtained by hydrolysis of lactose, which is abundant in nature, and can be easily procured for producing talos, which is one of the rare sugars.
  • the enzyme preparation for the sugar epimerization reaction catalyst of the present invention may or may not use N-acylglucosamine as a substrate, but is preferably not substantially used as a substrate.
  • a specific sugar is not substantially used as a substrate means that, for example, when the activity using mannose as a substrate is 100%, the relative activity using the specific sugar as a substrate is 5% or less. That is, it is preferably 1% or less, more preferably 0%, still more preferably the activity using the above-mentioned specific sugar as a substrate is unmeasurable, and particularly preferably the above-mentioned specific sugar as a substrate. It means that the catalytic reaction is not completely generated.
  • the protein contained in the enzyme preparation of the present invention has a molecular weight in the range of 45 to 55 kDa or about 50 kDa as measured by SDS-PAGE.
  • the molecular weight of this protein shown here is the molecular weight of a protein in which DNA encoding this protein is inserted into a plasmid and bacillus is expressed as a host cell.
  • the theoretical value of the molecular weight of this protein measured in the range of 45 to 55 kDa or about 50 kDa in Examples 1 and 2 is 50.0 kDa.
  • the protein contained in the enzyme preparation of the present invention is not limited to these, but can act on at least glucose, mannose, talose and galactose to catalyze the epimerization reaction of these sugars.
  • Some conventional cellobiose 2-epimerases produce mannose and fructose from glucose (Patent Documents 3 and 4).
  • the protein contained in the enzyme preparation of the present invention can mainly convert glucose into mannose.
  • a small amount of fructose may be produced from glucose, but the amount is very small.
  • the protein contained in the enzyme preparation of the present invention can efficiently produce mannose from glucose as compared with the conventional cellobiose 2-epimerase.
  • the protein contained in the enzyme preparation of the present invention is CE derived from Merioribacter roseus described in Patent Document 6.
  • Mannose can be produced in the reaction product at a content of 1.3 times or more, and further 1.4 times or more, 1.5 times or more, 1.6 times or more, 1.7 times or more.
  • Mannose can be produced at a content of fold or more, 1.8 times or more, 1.9 times or more, or 2.0 times or more.
  • the enzyme preparation of the present invention may be an enzyme composition containing a protein having an activity of catalyzing the epimerization reaction of the above-mentioned sugar isolated and purified as an active ingredient, and catalyzes the epimerization reaction of the above-mentioned sugar.
  • an additional component can be contained as long as it does not inhibit the epimerization reaction of sugar.
  • These may be components used in ordinary enzyme preparations, such as buffers, stabilizers, and excipients. Such additional components are known from the prior art and are well known to those of skill in the art.
  • the enzyme agent of the present invention is not particularly limited in shape, and may be a solid (for example, powder) or a liquid.
  • the enzyme preparation of the present invention can be used, for example, by adding a solid or liquid substance to a solution of a sugar substrate.
  • the enzyme agent of the present invention can be provided, for example, as an enzyme agent in which a protein having an activity of catalyzing the epimerization reaction of the sugar of the present invention is immobilized on an immobilized carrier.
  • the immobilized enzyme agent for example, the reaction product can be produced at a high substrate concentration and a high temperature, and the reaction product can be produced by a bioreactor method.
  • the immobilized carrier is not particularly limited, and can be used, for example, as long as a protein having an activity of catalyzing the epimerization reaction of sugar is adsorbed or crosslinked and the activity of this protein is maintained.
  • the immobilized carrier examples include an anion exchange carrier, a cation exchange carrier, and a hydrophobic carrier.
  • a specific example of the immobilized carrier is, for example, an ion exchange gel.
  • the ion exchange gel is, for example, Diaion (registered trademark) SK1B, Diaion (registered trademark) PK212, Diaion (registered trademark) HPA25, Diaion (registered trademark) UBK555 and the like Diaion (registered trademark) series (Mitsubishi).
  • Sepabeads registered trademark
  • Sepabeads registered trademark
  • SP-207 Sepabeads
  • SP-850 Sepabeads
  • other Sepabeads registered trademark
  • Duolite A568, Duolite PWA7 Duolite XAD761 etc.
  • Duolite series manufactured by Sumika Chemtex, etc. can be mentioned.
  • the enzyme agent of the present invention can be used as long as the protein contained in the enzyme agent of the present invention can catalyze epimerization.
  • the shape of the immobilized carrier is not particularly limited, and examples thereof include a membrane, beads, and a plate.
  • the method for fixing the protein having an activity of catalyzing the epimerization reaction of sugar to the above-mentioned immobilization carrier is not particularly limited, and for example, the present protein and the above-mentioned immobilization carrier are added to a solvent such as a buffer solution, and the mixture thereof. It can be done by shaking the liquid.
  • the present invention comprises a method for producing a sugar epimerization reaction product, which comprises a step of allowing an enzyme agent for the sugar epimerization reaction catalyst of the present invention to act on a sugar substrate to obtain a sugar epimerization reaction product. offer.
  • the action of the enzyme agent of the present invention on the sugar substrate is carried out, for example, by preparing an aqueous solution of the sugar substrate, adjusting the pH as necessary, and then adding the enzyme agent of the present invention to the aqueous solution. be able to. Further, it can be carried out by immobilizing a protein having an activity of catalyzing the epimerization reaction of the sugar of the present invention on a carrier to prepare an enzyme agent, and contacting the enzyme agent with an aqueous solution of a sugar substrate. This is because the sugar epimerization reaction using the enzyme agent of the present invention can be carried out in the reaction solution.
  • the sugar substrate that can be used in the method for producing the epimerization reaction product of sugar may be any one selected from, but not limited to, glucose, mannose, galactose and talose, and other sugars.
  • the protein contained in the enzyme preparation of the present invention can catalyze epimerization, it can be used as a sugar substrate.
  • the sugar substrate a pure product may be used, but a sugar composition containing other sugars may be used from the viewpoint of cost and the like.
  • a sugar composition containing maltose, maltotriose, etc. produced by decomposition of starch in addition to glucose may be used.
  • the reaction temperature when the protein contained in the enzyme preparation of the present invention is allowed to act on the sugar substrate is not particularly limited as long as it is in the temperature range in which the enzyme activity is expressed.
  • the protein contained in the enzyme preparation of the present invention can react at a temperature of 53 ° C. or lower when reacting at pH 6.0.
  • Some conventional epimerases have restrictions on their use on an industrial scale due to their thermal stability.
  • the protein contained in the enzyme preparation of the present invention exhibits high heat resistance and has thermal stability suitable for use on an industrial scale.
  • the reaction temperature (liquid temperature of the reaction solution) when the enzyme agent of the present invention is allowed to act can be set in a wide temperature range such as 35 to 55 ° C.
  • this protein is advantageous in that it can be used stably in a wide temperature range.
  • the reaction temperature can be set in the range of 35 to 55 ° C, but is preferably set in the range of 45 to 53 ° C. This is because when the reaction temperature is 45 ° C. or higher, contaminating bacteria using sugar as a nutrient are difficult to propagate, and when the reaction temperature is 53 ° C. or lower, this protein exhibits temperature stability.
  • the enzyme agent of the present invention and other enzymes can be used in combination as described later.
  • the reaction temperature may be in a temperature range in which the protein contained in the enzyme preparation of the present invention acts stably.
  • the protein contained in the enzyme preparation of the present invention is stable in a wide temperature range, all the enzymes used in the reaction system are considered in consideration of the temperature at which the other enzymes used in combination are stably activated. In many cases, the temperature can be set within the range where the activity can be fully utilized.
  • the reaction temperature does not have to be constant throughout the reaction time, and if it is desirable to increase the activity of other enzymes used in combination at the beginning of the reaction time, the reaction initial stage should be in a temperature range in which the activity of the enzyme is high. In the middle and late stages of the reaction time, the temperature can be appropriately adjusted, for example, by setting the temperature in a temperature range in which the activity of the protein contained in the enzyme preparation of the present invention is high.
  • the pH of the reaction solution when the protein contained in the enzyme agent of the present invention is allowed to act on the sugar substrate is not particularly limited as long as it is in the pH range where the enzyme activity is expressed, but is in the range of pH 5.5 to 8.5. Can be set to. This is because the protein contained in the enzyme preparation of the present invention can react at least in the range of pH 6.0 to 8.0 as described in Examples. In order to efficiently obtain the epimerization reaction product of sugar, it is preferable to set the pH of the reaction solution when the protein contained in the enzyme preparation of the present invention is allowed to act in the range of pH 6.0 to 8.0.
  • the pH of the reaction solution can be adjusted by adding an acid or an alkali, if necessary.
  • reaction time between the substrate and the protein contained in the enzyme preparation of the present invention in the method for producing the epimerization reaction product of sugar depends on the reaction temperature, the concentration of the substrate, the characteristics of the enzyme used when other enzymes are used in combination, and the like. It can be decided as appropriate in consideration. Further, based on the prior art in this field, an appropriate reaction time for efficiently producing an epimerization reaction product can be appropriately determined. Specific examples of reaction times include, but are not limited to, 10 minutes to 72 hours. During the reaction, the enzyme preparation of the present invention can be appropriately added.
  • the substrate concentration in the reaction solution is not particularly limited, and for example, the higher the substrate concentration is, the more economically advantageous it is in the range in which the above enzymatic reaction can proceed.
  • glucose used as the substrate
  • the glucose concentration is in the range of 0.1 g to 300 g per 100 g of solvent.
  • the solvent of the reaction solution is not particularly limited, and examples thereof include water and a buffer solution. If the selected substrate has low solubility in a solvent, it may not be completely dissolved at a desired concentration, for example.
  • the enzymatic reaction is carried out in a batch manner, for example, the substrate does not have to be completely dissolved at the initial stage of the reaction, and the concentration of the substrate to be dissolved at the end of the enzymatic reaction may be selected.
  • a column filled with an immobilized enzyme agent when used for an enzymatic reaction, for example, it is preferable that the substrate is completely dissolved in order to avoid pressure loss due to clogging of the column.
  • a column filled with an immobilized enzyme agent when used for the enzymatic reaction, for example, it is preferable to reflux the substrate solution through the column and continuously pass the solution.
  • mannose is produced using glucose as a substrate by using the enzyme agent of the present invention, starch syrup, powdered candy, hydrol (a syrup produced during the production of crystalline glucose) and the like can be used.
  • a sugar containing glucose such as dextrin and starch as a constituent sugar is used as a raw material, and a hydrolase is added together with the enzyme agent of the present invention to produce mannose from glucose while producing glucose as a substrate from the raw material. Can be done.
  • an aqueous glucose solution having a solid content concentration of about 1 to 65% is prepared, and if necessary, acid or acid or Adjust the pH of the aqueous solution to about 6.0 to 8.0 using an alkali, add the enzyme agent of the present invention to the aqueous solution, and keep the temperature in the range of 30 to 53 ° C. for about 1 to 72 hours.
  • Mannose can be manufactured at.
  • the enzyme agent of the present invention and other enzymes can be used in combination.
  • Other enzymes are not limited to this, and may be those that produce a sugar that can be a substrate of an enzyme having an activity of catalyzing the epimerization reaction of the sugar of the present invention.
  • an enzyme that hydrolyzes a sugar containing galactose such as lactose as a constituent sugar can be used as another enzyme.
  • the enzyme agent of the present invention that is, the enzyme agent for the epimerization reaction catalyst of sugar
  • a sugar containing galactose such as lactose as a constituent sugar can be hydrolyzed. While producing galactose, it is possible to produce talose from galactose by epimerization.
  • an aqueous sugar solution containing an epimerization reaction product can be obtained.
  • the sugar aqueous solution containing the epimerization reaction product can be decolorized, desalted, purified, or the like by using a conventional method, if necessary.
  • the unreacted substrate is subjected to a resin fractionation treatment, a precipitation method using an organic solvent such as ethanol, a chromatofraction method, a treatment with an ultrafiltration membrane, etc., on the sugar aqueous solution containing the epimerization reaction product.
  • Etc. can be removed to increase the purity of the epimerization reaction product.
  • the purification process can more efficiently purify the epimerization reaction product by a single operation or by combining several operations.
  • the present invention causes a sugar substrate to act on an enzymatic agent for an epimerization reaction catalyst of the sugar of the present invention under pH 5.5 to 7.0 conditions to obtain an epimerization reaction product of sugar.
  • a method for producing an epimerization reaction product of a sugar in which by-products in the reaction product, including the obtaining step, are suppressed to 5% or less of the target epimerization reaction product.
  • glucose can be treated with the enzyme agent for the epimerization reaction catalyst of the sugar of the present invention under the conditions of pH 5.5 to 7.0 to produce mannose, which is a fructose by-product in the reaction product. Can be suppressed to 5% or less of mannose.
  • the pH condition is preferably in the range of pH 5.5 to 6.5.
  • By-products in the reaction product are 4.5% or less, 4.0% or less, 3.5% or less, 3.0% or less, 2.5% or less, 2.0% of the target epimerization reaction product. Below, it is preferable to suppress it to 1.5% or less, 1.0% or less, or 0.5% or less.
  • the present invention comprises a step of obtaining a food, feed, feed, cosmetic, or pharmaceutical using the sugar epimerization reaction product obtained by carrying out the method for producing a sugar epimerization reaction product.
  • the sugar epimerization reaction product can be obtained by carrying out the above-mentioned method for producing a sugar epimerization reaction product.
  • the epimerization reaction product is used as a raw material.
  • the production of foods, feeds, feeds, cosmetics, or pharmaceuticals, or the preparation of the epimerization reaction product itself in suitable forms (powder, liquid, etc.) foods, feeds, feeds, cosmetics. , Or can be provided as a drug.
  • Examples of foods produced by the method of the present invention are not limited to, but are not limited to, various beverages (bread, noodles, rice, rice cakes), various Japanese sweets (beverages, hail, okoshi, fertilizer, rice cakes, etc.).
  • Manju Dorayaki, Uiro, Beverages, Sheep, Water Sheep, Kindama, Castella, Candy (Bread, Biscuit, Crackers, Cookies, Pies, Donuts, Steamed Cakes, Puddings, Jelly, Moose, Bavaroa , Custard cream, cream puff, waffle, sponge cake, chocolate, chewing gum, caramel, nougat, candy, syrups), various ice creams (ice cream, sherbet, gelato, shaved ice), various pasty foods (flower paste, peanut paste, margarine) , Fruit paste), various beverages (fruit-containing beverages, fruit juices, vegetable juices, ciders, ginger ales, isotonic beverages, amino acid beverages, jelly beverages, coffee beverages, green tea, tea, o
  • feeds and feeds produced by the method of the present invention include, but are not limited to, feeds and feeds for livestock, poultry, seafood, insects (honeybees, silk moths, etc.). Its forms include powders, pellets, tablets, baits, capsules and the like.
  • cosmetics produced by the method of the present invention include, but are not limited to, moisturizers and cosmetological agents. Their forms include emulsions, creams and emulsions.
  • Examples of the pharmaceutical product produced by the method of the present invention include, but are not limited to, anti-obesity agents, blood glucose increase inhibitor, and the like, and examples thereof include tablets, powders, and liquids. , Capsules, etc.
  • the method for obtaining the protein contained in the enzyme preparation of the present invention is not particularly limited, and may be a protein synthesized by chemical synthesis or a recombinant protein prepared by a gene recombination technique. The case of producing a recombinant protein will be described below.
  • Proteins with amino acid sequences in which one or several amino acids have been substituted, inserted, deleted and / or added can be prepared by genetic engineering techniques.
  • the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 is inserted into an expression vector as a DNA molecule that can be replicated in a host cell or is integrated into a chromosome and contains the gene in an expressible state.
  • a protein can be produced by transforming a host cell in the above-mentioned form and culturing the host cell.
  • This DNA molecule is described in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3, the amino acid sequence having 90% or more amino acid sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3, or SEQ ID NO: 1 or 3. It can be obtained by incorporating into a vector molecule a DNA fragment encoding an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, inserted, deleted and / or added in the amino acid sequence of. According to a preferred embodiment of the invention, this vector is a plasmid.
  • the DNA molecule in the present invention can be produced according to the method described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
  • the vector that can be used in the present invention can be appropriately selected from viruses, plasmids, cosmid vectors, etc., taking into consideration the type of host cell used. For example, if the host cell is Bacillus subtilis, pJEXOPT2 system (see Patent No.
  • pHT system plasmid if Escherichia coli, ⁇ phage system bacteriophage, pET system, pUC system, pCold system, pGEX system plasmid, In the case of yeast, YEp, YCp-based and YIp-based vectors, pLeu4, pPPLeu4, pJPLeu4 series (described in JP-A-4-218382) and the like can be mentioned, but the present invention is not limited thereto.
  • This plasmid may contain a marker for selecting a transformant, and drug resistance marker or auxotrophy marker gene can be used as the selection marker, but is not limited thereto.
  • the expression vector that can be used in the present invention can have a DNA sequence necessary for expression of an enzyme gene, for example, a promoter, a terminator, a ribosome binding site, a transcriptional regulatory signal such as a transcriptional termination signal, a translational regulatory signal, and the like.
  • a promoter include promoters such as subtilisin and SPAC in Bacillus subtilis, alcohol dehydrogenase (ADH), acidic phosphatase (PHO), galactose gene (GAL), and glyceraldevido triphosphate dehydrogenase gene (GAP) in yeast. Etc., but are not limited to these.
  • the addition of the signal peptide is preferable because it has the advantage that the target enzyme is secreted into the culture supernatant and purification is facilitated.
  • the signal peptide can be replaced with one derived from Bacillus subtilis or yeast (for example, invertase signal, acidic phosphatase signal, ⁇ -factor signal, etc.).
  • Bacillus subtilis or yeast for example, invertase signal, acidic phosphatase signal, ⁇ -factor signal, etc.
  • a cspA promoter or the like can be used to simultaneously express molecular chaperones, and other measures can be taken to improve the efficiency of expression.
  • the host cell For the culture of the transformed host cell, a general method can be used for the host cell to be used. Usually, the enzyme is produced and accumulated in the intracellular or extracellular culture by culturing for about 1 to 4 days. Regarding the culture conditions (medium, pH, temperature, etc.), for example, it is generally 25 to 37 ° C for bacteria, 25 to 30 ° C for yeast, and 37 ° C for eukaryotic cells. For the culture conditions, the gene expression experiment manual (Kodansha) and the like can be referred to.
  • Host cells include bacteria such as Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae, yeasts such as Candida utilis, Rhizopus cerevisiae, and Pichia pastoris, as well as yeasts such as Pichia pastoris and Rhizopus zibeus. Rhizopus delemar and higher eukaryotic organisms (eg, CHO cells, etc.) can be used.
  • Bacillus subtilis it is preferable to use a microorganism belonging to the genus Bacillus. It is known that there are strains in the genus Bacillus that secrete proteins out of the cells (for example, Bacillus subtilis).
  • strains that secrete almost no protease are also known, and it is also preferable to use such strains as a host.
  • yeast, filamentous fungi or bacteria are preferable as host cells, but bacteria are more preferable, and Escherichia coli and Bacillus subtilis are particularly preferable.
  • the protein produced by the transformant can be isolated and purified by appropriately combining known separation methods and purification methods.
  • separation / purification methods utilize differences in solubility such as salt precipitation and solvent precipitation, and differences in molecular weight such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration and SDS-polyacrylic electrophoresis.
  • Methods, methods that utilize charge differences such as ion exchange chromatography, methods that utilize hydrophobic differences such as hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, and isoelectric focusing such as isoelectric focusing.
  • a method using the difference, affinity chromatography and the like can be mentioned.
  • a basic experimental method for proteins / enzymes Naankodo
  • a general separation / purification method can be referred to for a general separation / purification method.
  • Example 1 Extracellular expression of this enzyme using Bacillus subtilis as a host (1) 1-1. Construction of expression plasmids We searched for new enzymes for various microorganisms, selected amino acid sequences (NCBI Reference: WP_010853281.1) derived from Lunatimonas lonarenissis, and performed functional analysis. The base sequences (SEQ ID NO: 2) of this amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) and the gene encoding the amino acid sequence (hereinafter referred to as target gene 1) are shown in FIGS. 1A and 1B, respectively. The amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 shown in FIG.
  • 1C is a sequence obtained by removing a portion presumed to be a signal peptide from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2 and 4 have been codon-optimized with the intention of good expression in Bacillus subtilis.
  • An expression plasmid for expressing the target gene 1 in Bacillus subtilis was constructed.
  • the antisense strand is amplified by using the plasmid in which the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 is inserted into the pUC57 vector as a template, and using a primer to which the nucleotide sequence homologous to the end of the signal peptide sequence of the vector is added.
  • the target gene was PCR amplified using a primer to which a part of the terminator sequence was added. The composition of the reaction solution for PCR amplification is shown below.
  • the primers used are shown in Table 1.
  • the PCR amplification reaction program was first held at 96 ° C for 1 minute, then 35 cycles at 98 ° C for 10 seconds ⁇ 55 ° C for 5 seconds ⁇ 72 ° C for 10 seconds as one cycle, and then at 72 ° C for another 5 minutes. Retained.
  • the obtained PCR product was electrophoresed on an agarose gel, and the band corresponding to the amplified fragment (1,299 bp) was excised from the gel and extracted and purified using an illustra TM GFX TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare). did.
  • Table 2 shows the vector pJEXOPT2 (see Patent 51266879) modified to optimize for this example as a template for the preparation of the linearized plasmid used in the In-Fusion® cloning reaction. PCR was performed using the above primers. For the amplification of the antisense strand, a primer assembled to amplify from the end of the signal peptide sequence of the vector was used.
  • the primers used are shown in Table 2.
  • the composition of the reaction solution for PCR amplification was the same as that used for amplification of the target gene 1 except for the primer and the template.
  • the PCR amplification reaction program was first held at 96 ° C for 1 minute, then 35 cycles at 98 ° C for 10 seconds ⁇ 55 ° C for 5 seconds ⁇ 72 ° C for 35 seconds as one cycle, and then at 72 ° C for another 5 minutes. Retained.
  • the obtained PCR product was electrophoresed on an agarose gel, the band corresponding to the amplified fragment (6, 935 bp) was excised from the gel, and extracted and purified using the illustra TM GFX TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare). did.
  • the amplified DNA fragment of the target gene 1 and the amplified fragment of the vector pJEXOPT2 were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio). The ligation reaction was carried out by holding at 50 ° C. for 15 minutes.
  • E. Coli DH5 ⁇ was transformed and plasmid DNA was prepared from the cultured culture medium by illustra TM plasmidPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare). The obtained plasmid was designated as a "plasmid for expressing this enzyme".
  • the obtained colonies were used, and after undergoing pre-culture, the main culture was cultured for 72 hours (cultured as described in Japanese Patent No. 51266879, but the composition of the medium was modified). Centrifugation (5,000 ⁇ g, 4 ° C., 5 minutes) was performed, and the supernatant was filtered through a filter (Merck) having a pore size of 0.45 ⁇ m to obtain the present enzyme solution 1. This enzyme solution 1 was subjected to SDS-PAGE, and it was confirmed that a band appeared near the target size (50,000) (FIG. 3).
  • Example 2 Extracellular expression of this enzyme using Bacillus subtilis as a host (2)
  • Example 2 was performed using the plasmid for expressing this enzyme constructed in Example 1-1. 2-1. Expression of recombinant protein
  • the plasmid for expressing this enzyme was introduced and cultured in Bacillus subtilis ISW1214 (Takara Bio) in the same manner as in Example 1-2.
  • the obtained culture broth was centrifuged (5,000 ⁇ g, 4 ° C., 5 minutes), and the supernatant was filtered through a filter (Merck) having a pore size of 0.45 ⁇ m to obtain a culture supernatant.
  • a filter Merck
  • This culture supernatant was subjected to SDS-PAGE, and it was confirmed that a band appeared near the target size (50,000) (FIG. 4). Further, this culture supernatant was concentrated about 10 times using an Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit (Merck) to obtain this enzyme solution 2.
  • Comparative Example 1 Preparation of a comparative enzyme solution 1. Construction of expression plasmid In order to compare the function with the lunatimonas lonalensis-derived epimerizing enzyme described in Example 1, CE (Amino Acid Sequence NCBI Reference: NCBI Reference: Amino Acid Sequence NCBI Reference: For AFN73749.1), extracellular expression was performed with Bacillus subtilis.
  • the base sequences (SEQ ID NO: 10) of this amino acid sequence (SEQ ID NO: 9) and the gene encoding the amino acid sequence (hereinafter referred to as a comparative gene) are shown in FIGS. 2A and 2B, respectively.
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 has been codon-optimized with the intention of good expression in Bacillus subtilis.
  • An expression plasmid for expressing the comparative gene in Bacillus subtilis was constructed. First, using the plasmid in which the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 is inserted into the pUC57 vector as a template, and using a primer to which the base sequence homologous to the end of the signal peptide sequence of the vector is added for sense strand amplification, the antisense strand. For amplification, the comparative gene was PCR amplified using a primer to which a part of the terminator sequence was added. The composition of the reaction solution for PCR amplification is shown below.
  • the primers used are shown in Table 3.
  • the PCR amplification reaction program was first held at 96 ° C for 1 minute, then 35 cycles at 98 ° C for 10 seconds ⁇ 55 ° C for 5 seconds ⁇ 72 ° C for 10 seconds as one cycle, and then at 72 ° C for another 5 minutes. Retained.
  • the obtained PCR product was electrophoresed on an agarose gel, the band corresponding to the amplified fragment (1,383 bp) was excised from the gel, and extracted and purified using the illustra TM GFX TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare). did.
  • Example 1-1 To prepare the linearized plasmid used in the In-Fusion (registered trademark) cloning reaction, the same procedure as in Example 1-1 was carried out, and the amplified DNA fragment of the comparative gene and the vector pJEXOPT2 (see Patent No. 5126879) were used. Amplified fragments of the plasmid modified for optimization in the examples were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio). The ligation reaction was carried out by holding at 50 ° C. for 15 minutes.
  • E. Coli DH5 ⁇ was transformed and plasmid DNA was prepared from the cultured culture medium by illustra TM plasmidPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare). The obtained plasmid was designated as a "plasmid for expressing a comparative enzyme".
  • the above plasmid for expressing the comparative enzyme was introduced into protoplastized bacillus ISW1214 (Takarabio), and a regenerated agar medium containing 7.5 ⁇ g / mL tetracycline (composition: 8.1% sodium succinate, 1). % Agar, 0.5% Cazaminoic Acid, 0.5% Yeast Extract, 0.15% Potassium Dihydrogen Phosphate, 0.35% Potassium Dihydrogen Phosphate, 0.5% Glucose, 0.4% Magnesium Chloride, It was cultured in 0.01% bovine serum albumin, 0.001% methionine, and 0.001% leucine) at 30 ° C.
  • Example 1-2 pre-culture and main culture were carried out in the same manner as in Example 1-2.
  • the obtained culture solution was centrifuged (5,000 ⁇ g, 4 ° C., 5 minutes), and the supernatant was filtered through a filter (Merck) having a pore size of 0.45 ⁇ m to obtain a comparative enzyme solution.
  • Comparative Example 2 Preparation of an empty vector control (negative control) As a negative control, a culture supernatant of cells transformed with an empty vector was prepared. Regenerated agar medium (composition) containing 7.5 ⁇ g / mL tetracycline was introduced into protoplastized bacillus ISW1214 (Takarabio) with a plasmid modified to optimize the vector pJEXOPT2 (see Patent No. 5126879) for this example.
  • Example 1-2 8.1% sodium succinate, 1% agar, 0.5% casaminoic acid, 0.5% yeast extract, 0.15% potassium dihydrogen phosphate, 0.35% potassium dihydrogen phosphate, 0.5 % Glucose, 0.4% magnesium chloride, 0.01% bovine serum albumin, 0.001% methionine, and 0.001% leucine) at 30 ° C. for 2 days.
  • the obtained colonies pre-culture and main culture were carried out in the same manner as in Example 1-2.
  • the obtained culture solution was centrifuged (5,000 ⁇ g, 4 ° C., 5 minutes), and the supernatant was filtered through a filter (Merck) having a pore size of 0.45 ⁇ m, which was used as an empty vector control (negative control). ..
  • Example 3 TLC analysis of enzyme reaction product
  • the substrate on which this enzyme acts was verified.
  • Mannose and galactose were used as substrates for the enzymatic reaction.
  • a reaction solution consisting of 10 ⁇ L of 50 mM HEPES-NaOH buffer (pH 7.0), 10 ⁇ L of various substrates of 500 mM, 10 ⁇ L of this enzyme solution 1 and 70 ⁇ L of ultrapure water was held at 37 ° C. for 24 hours, of which 0.5 ⁇ L. was subjected to thin layer chromatography (TLC).
  • a mixed solution of 2-propanol / 1-butanol / water in order, a mixing ratio of 2: 2: 1 (all by volume ratio) was used.
  • the sugar was detected by spraying a mixed solution of anisaldehyde / sulfuric acid / acetic acid (in order, a mixture ratio of 1: 2: 97 (all by volume ratio)) as a color-developing agent on a TLC plate and then heating the mixture.
  • Example 4 Mannose synthesis test 4-1.
  • Method A synthetic test of mannose using glucose as a substrate was carried out for this enzyme solution 1 and the comparative enzyme solution. That is, 10.3 to 330.0 ⁇ L / g-ds enzyme (this enzyme solution 1 or comparative enzyme solution), 50% glucose, 40 mM buffers (MES-NaOH buffer (pH 6.0), sodium phosphate). 1 mL of the reaction solution consisting of buffer (pH 7.0) or HEPES-NaOH buffer (pH 8.0)) and 0.02% sodium hydroxide was held at 50 ° C. for 24-72 hours.
  • buffer pH 7.0
  • HEPES-NaOH buffer pH 8.0
  • reaction solution using an empty vector control was also prepared and retained in the same manner as described above.
  • the reaction was stopped by boiling the reaction solution collected at each reaction time at a pH of 4.0 or less for 10 minutes. Then, 10 ⁇ L of the reaction solution and 800 ⁇ L of pure water were mixed and diluted.
  • the sugar composition of the product of this enzyme using glucose as a substrate was analyzed by HPLC.
  • Analytical conditions are column: HILICpak VG-50 4E (Shodex), HILICpak VG-50G 4A (Shodex), eluent: 80% acetonitrile, flow rate: 0.6 mL / min, column temperature: 40 ° C., detector: charged particles. It was a detector.
  • mannose was produced from glucose in all the test groups having pH 6.0, 7.0 and 8.0. Comparing the mannose content in the reaction product between the enzyme solution 1 addition group and the comparison enzyme solution addition group, the enzyme solution 1 was about 1.3 to 2.0 times higher in all the test groups. The mannose content was shown. On the other hand, in the test group to which the empty vector control was added, mannose was not produced at any of the pH tested.
  • fructose is produced by a non-enzymatic reaction (eg, glucose-to-fructose isomerization under the influence of buffer or pH) or a contaminating enzyme reaction (glucose-to-fructose conversion by an isomerase). It was suggested that it was done. Furthermore, it was clarified that the production of fructose can be suppressed by carrying out the reaction at pH 7.0 or lower, particularly pH 6.0.
  • Example 5 Talos synthesis test 1.
  • Method A synthetic test of talos using galactose as a substrate was carried out for this enzyme solution 2. That is, after 1 kg of galactose was dissolved in water, 178.5 g of this enzyme solution 2 was added, the pH was further adjusted to 6.0, and water was added so that the weight of the reaction solution was 2 kg, and the mixture was mixed. .. The reaction solution was reacted at 53 ° C. for 24-72 hours. The reaction solution collected at each reaction time was adjusted to pH 4.0 or less, and the reaction was stopped by boiling for 10 minutes. Then, 10 ⁇ L of the reaction solution and 800 ⁇ L of pure water were mixed and diluted.
  • the sugar composition of galactose, talose and galactose in the obtained reaction diluent was analyzed by HPLC.
  • Analytical conditions are column: HILICpak VG-50 4E (Shodex), HILICpak VG-50G 4A (Shodex), eluent: 80% acetonitrile, flow rate: 0.6 mL / min, column temperature: 40 ° C., detector: charged particles. It was a detector.
  • This enzyme can react at a reaction temperature of 53 ° C, and talose and tagatose were produced from galactose.
  • the maximum talos content was 17.5%.
  • SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence of a protein derived from Luna Timonas lonalensis
  • SEQ ID NO: 2 Nucleotide sequence encoding a protein derived from Luna Timonas lonalensis
  • SEQ ID NO: 3 Amino acid sequence of a protein derived from Lunatimonas lonalensis
  • SEQ ID NO: 4 Derived from Lunatimonas ronalensis
  • SEQ ID NO: 9 Amino acid sequence of protein derived from Meriolibacter Roseus
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Abstract

本発明は、副生成物が少なく、効率的にエピメリ化反応を触媒する酵素剤を提供することを課題とする。本発明によれば、以下の(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質を含む、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤であって、前記糖がグルコース、マンノース、タロースおよびガラクトースからなる群から選択されるいずれかである、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤が提供される。 (ａ) 配列番号１または３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質； (ｂ) 配列番号１または３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質； (ｃ) 配列番号１または３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質。

Description

糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤、エピメリ化反応生成物の製造方法およびエピメリ化反応生成物
　関連出願の相互参照
　本出願は、２０２０年７月３１日出願の特願２０２０－１３０３６５の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
　本発明は、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤、当該酵素剤を作用させて、エピメリ化反応生成物を得る工程を含む、エピメリ化反応生成物の製造方法および当該製造方法で得られるエピメリ化反応生成物に関する。
　マンノースはグルコースの異性体であり、コンニャクなどから抽出されるグルコマンナン、ヘミセルロース、あるいは細胞表面などに存在する糖鎖の構成糖として良く知られている。また、マンノースそのものはクランベリーに含まれることが知られている。
　マンノースの生体利用性は低く、経口摂取したマンノースのほとんどは速やかに尿中に排出される。***症の原因菌は、当該菌が有するマンノース結合レクチンと、尿路表面細胞に存在する糖鎖の結合を介して尿路表面へ付着し感染すると考えられている。経口摂取したマンノースは尿中に速やかに排出されるため、排出されたマンノースは当該菌のマンノース結合レクチンと細胞表面糖鎖への結合を阻害することで、***症を予防する効果が期待されている（非特許文献１）。
　特許文献１にはマンノース含有糖組成物を有効成分とする有害菌感染抑制剤または有害菌感染防止用飼料に関わる技術が開示されている。特許文献２にはマンノースを有効成分とする飲食品の食感改良剤についての記述がある。
　マンノースの調製法としては、化学反応法および酵素法が複数知られている。以下に、各調製法について検討する。
　第一の化学反応法は、蔗糖を還元することでソルビトールとマンニトールを生成し、マンニトールを分取し、さらにマンニトールを酸化することでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は多段階のステップおよび高温高圧での触媒反応を必要とするため、効率面で問題がある。
　第二の化学反応法は、グルコマンナンやマンナンを加水分解することでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は、基質が高価でありかつ基質の調製に労力を要するという問題がある。
　第三の化学反応法は、コプラミールなどのヘミセルロースを加水分解する手法である。しかし、この方法は、構成糖が多様であるためマンノースの収率が悪く、酸加水分解の場合はさらに収率が悪化し精製負荷が大きくなるという問題がある。
　第四の化学反応法は、グルコースをアルカリ条件下で異性化することでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は、糖の分解が生じるため収率が悪く、精製負荷が大きいという問題がある。
　第五の化学反応法は、同じくフルクトースをアルカリ条件下で異性化することでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は、第四の化学反応法と同様に収率および精製負荷の点で問題があり、またフルクトースがグルコースに比べて比較的高価である点およびフルクトースが反応系に残存してしまいマンノースとの分離が困難である点も問題がある。
　第一の酵素法としては、フルクトースにマンノースイソメラーゼを作用させることでマンノースを調製する方法である。しかし、原料となるフルクトースの価格面および反応系に残存するフルクトースの分離の点で問題がある。
　第二の酵素法としては、グルコースあるいはフルクトースに対してアルドース―ケトースイソメラーゼ（Ａｌｄｏｓｅ－ｋｅｔｏｓｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、以下「ＡＫＩ」と記載する）を作用させることでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は、反応系に残存するフルクトースの分離の点でやはり問題がある。
　また、セロビオースなどの還元末端糖残基がβ－１，４結合で結合している２つ以上の糖残基からなる糖について、前記還元末端糖残基の２位の水酸基を２－エピメリ化（異性化）する反応、またはその逆反応を触媒する酵素として、セロビオース　２－エピメラーゼ（Ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ　２－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、以下「ＣＥ」と記載する）が知られている（特許文献３、特許文献４）。当該酵素により、グルコースがβ－１，４結合したセロビオースを４－O－β－グルコシルマンノースへ変換、またはその逆反応を触媒することができる。また、特許文献４には当該ＣＥをグルコースに作用させると、マンノースが得られたことが記載されている（第三の酵素法）。しかし、特許文献４に記載のＣＥを用いる第三の酵素法では、ＣＥがエピメリ化反応に加えアルドース－ケトース異性化反応も触媒する。そのため、マンノースと共にフルクトースも生成してしまい、副生するフルクトースの分離の点で問題がある。
　第四の酵素法としては、グルコース、マンノース、ガラクトースおよびタロースの２位の水酸基をエピメリ化する反応を触媒する酵素を用いる方法である（特許文献５、６）。当該方法では、フルクトースおよびタガトースがほとんど副生されない点が第一から第三の酵素法より優れている（特許文献５、６）。
特許４６９４６６７号 特開２００１－２７５５８３号 特許５０９２０４９号 国際公開２０１０／０９００９５号 特開２０１９－０３３７０２号 特許６６５７４５３号
Sharma V, Ichikawa M, Freeze HH. Mannose metabolism: more than meets the eye. Biochem Biophys Res Commun. 2014;453(2):220‐228. doi:10.1016/j.bbrc.2014.06.021　　　　　　　　　　　　　　　　　　特許文献１～６及び非特許文献１の全記載は、ここに特に開示として援用される。
　酵素法によるエピメリ化反応生成物の生産効率は、使用する酵素の特性に依る部分が大きい。工業的規模での利用に適した、基質をより効率的にエピメリ化反応を触媒する酵素剤が求められていた。さらに、副生成物は、目的反応生成物の収率を下げるばかりでなく、分離の手間を要するため、生産効率を下げるという問題があった。
　本発明は、副生成物が少なく、効率的にエピメリ化反応を触媒する酵素剤を提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは、マンノースに対するエピメリ化酵素の探索を企図し、種々のタンパク質をコードする遺伝子について発現と諸性質の解析を行ってきた。その中で、ルナティモナス・ロナレンシス（Ｌｕｎａｔｉｍｏｎａｓ　ｌｏｎａｒｅｎｓｉｓ）のゲノム上に存在し、Ｎ－ａｃｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ２－ｅｐｉｍｅｒａｓｅと推定されるタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＷＰ_０１０８５３２８１．１）をコードする遺伝子に着目して発現解析を行った。その結果、当該タンパク質はマンノースとグルコース、ガラクトースとタロースをそれぞれ相互に変換する２－エピメリ化活性を有することを見出した。
　また本発明者らは、当該タンパク質を用いると効率的にマンノースを製造できることを解明し、本発明の完成に至った。
　本発明は以下の通りである。
［１］　以下の(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質を含む、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤であって、前記糖がグルコース、マンノース、タロースおよびガラクトースからなる群から選択されるいずれかである、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤。
(ａ) 配列番号１または３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｂ) 配列番号１または３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質；
(ｃ) 配列番号１または３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質。
［２］　以下の（ｄ）から（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞の培養上清を含む、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤であって、前記糖がグルコース、マンノース、タロースおよびガラクトースからなる群から選択されるいずれかである、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤。
（ｄ）配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して９０%以上の塩基配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［３］　糖基質に、［１］または［２］に記載の酵素剤を作用させて、糖のエピメリ化反応生成物を得る工程を含む、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法。
［４］　［３］に記載の方法を実施して得られた糖のエピメリ化反応生成物を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
　本発明によれば、エピメリ化活性を有する新規な酵素剤を提供することができる。
図１Ａは、ルナティモナス・ロナレンシス由来の仮想タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）である。下線を付した領域は、シグナルペプチド配列と推定された部分である。 図１Ｂは、ルナティモナス・ロナレンシス由来の仮想タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号２）である。下線を付した領域はシグナルペプチド配列に対応する塩基配列である。配列番号２の塩基配列から、シグナルペプチド配列に対応する塩基配列を削除した配列は、配列番号４の塩基配列である。 図１Ｃは、ルナティモナス・ロナレンシス由来の仮想タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）である。配列番号３に示すアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列からシグナルペプチドと推定された部分を削った配列である。 図２Ａは、比較例として使用したメリオリバクター・ロセウス由来のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号９）である。 図２Ｂは、比較例として使用したメリオリバクター・ロセウス由来のタンパク質をコードする塩基配列（配列番号１０）である。 図３は、実施例１で培養して得られたルナティモナス・ロナレンシス由来のタンパク質（培養上清をフィルターろ過したもの）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。ルナティモナス・ロナレンシス由来のタンパク質のバンドを矢印で示す。Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ、Ｓ：Ｓａｍｐｌｅ。 図４は、実施例２で培養して得られたルナティモナス・ロナレンシス由来のタンパク質（培養上清をフィルターろ過したもの）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。ルナティモナス・ロナレンシス由来のタンパク質のバンドを矢印で示す。Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ、Ｓ：Ｓａｍｐｌｅ。 図５は、酵素反応生成物のＴＬＣ分析である。以下に、略称の説明を記載する。Ｇｌｃ：グルコース、Ｍａｎ：マンノース、Ｍａｌ：マルトース、Ｇａl：ガラクトース、Ｔａｌ：タロース、Ｂ：酵素反応前、Ｒ：酵素反応後。黒い丸（●）は反応生成物を示す。 図６は、グルコースに対して、本酵素溶液１、比較用酵素溶液および空ベクター対照を、ｐＨ６．０条件下で７２時間作用させたときの反応生成物中のマンノース含有率およびフルクトース含有率を示すグラフである。酵素添加量は、１０．３、２０．６、４１．３、８２．５、１６５．０および３３０．０μＬ／ｇ－ｄｓである。マンノース含有率およびフルクトース含有率はＨＰＬＣ分析のピーク面積比より算出した。●：本酵素溶液１(マンノース含有率)、〇：本酵素溶液１（フルクトース含有率）、▲：比較用酵素溶液(マンノース含有率)、△：比較用酵素溶液（フルクトース含有率）、■：空ベクター対照（マンノース含有率）、□：空ベクター対照（フルクトース含有率）。 図７は、グルコースに対して、本酵素溶液１、比較用酵素溶液および空ベクター対照を、ｐＨ６．０条件下で作用させたときの反応生成物中のマンノース含有率およびフルクトース含有率の経時変化を示すグラフである。酵素添加量は３３０．０μＬ／ｇ－ｄｓである。マンノース含有率およびフルクトース含有率はＨＰＬＣ分析のピーク面積比より算出した。●：本酵素溶液１(マンノース含有率)、〇：本酵素溶液１（フルクトース含有率）、▲：比較用酵素溶液(マンノース含有率)、△：比較用酵素溶液（フルクトース含有率）、■：空ベクター対照（マンノース含有率）、□：空ベクター対照（フルクトース含有率）。 図８は、グルコースに対して、本酵素溶液１、比較用酵素溶液および空ベクター対照を、ｐＨ７．０条件下で７２時間作用させたときの反応生成物中のマンノース含有率およびフルクトース含有率を示すグラフである。酵素添加量は、１０．３、２０．６、４１．３、８２．５、１６５．０および３３０．０μＬ／ｇ－ｄｓである。マンノース含有率およびフルクトース含有率はＨＰＬＣ分析のピーク面積比より算出した。●：本酵素溶液１(マンノース含有率)、〇：本酵素溶液１（フルクトース含有率）、▲：比較用酵素溶液(マンノース含有率)、△：比較用酵素溶液（フルクトース含有率）、■：空ベクター対照（マンノース含有率）、□：空ベクター対照（フルクトース含有率）。 図９は、グルコースに対して、本酵素溶液１、比較用酵素溶液および空ベクター対照を、ｐＨ７．０条件下で作用させたときの反応生成物中のマンノース含有率およびフルクトース含有率の経時変化を示すグラフである。酵素添加量は３３０．０μＬ／ｇ－ｄｓである。マンノース含有率およびフルクトース含有率はＨＰＬＣ分析のピーク面積比より算出した。●：本酵素溶液１(マンノース含有率)、〇：本酵素溶液１（フルクトース含有率）、▲：比較用酵素溶液(マンノース含有率)、△：比較用酵素溶液（フルクトース含有率）、■：空ベクター対照（マンノース含有率）、□：空ベクター対照（フルクトース含有率）。 図１０は、グルコースに対して、本酵素溶液１、比較用酵素溶液および空ベクター対照を、ｐＨ８．０条件下で７２時間作用させたときの反応生成物中のマンノース含有率およびフルクトース含有率を示すグラフである。酵素添加量は、１０．３、２０．６、４１．３、８２．５、１６５．０および３３０．０μＬ／ｇ－ｄｓである。マンノース含有率およびフルクトース含有率はＨＰＬＣ分析のピーク面積比より算出した。●：本酵素溶液１(マンノース含有率)、〇：本酵素溶液１（フルクトース含有率）、▲：比較用酵素溶液(マンノース含有率)、△：比較用酵素溶液（フルクトース含有率）、■：空ベクター対照（マンノース含有率）、□：空ベクター対照（フルクトース含有率）。 図１１は、グルコースに対して、本酵素溶液１、比較用酵素溶液および空ベクター対照を、ｐＨ８．０条件下で作用させたときの反応生成物中のマンノース含有率およびフルクトース含有率の経時変化を示すグラフである。酵素添加量は３３０．０μＬ／ｇ－ｄｓである。マンノース含有率およびフルクトース含有率はＨＰＬＣ分析のピーク面積比より算出した。●：本酵素溶液１(マンノース含有率)、〇：本酵素溶液１（フルクトース含有率）、▲：比較用酵素溶液(マンノース含有率)、△：比較用酵素溶液（フルクトース含有率）、■：空ベクター対照（マンノース含有率）、□：空ベクター対照（フルクトース含有率）。
　以下に記載する本発明の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書について、糖質の記載は特に明記しない場合はＤ体を表す。また、「～」を用いて表される数値範囲は「～」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。
　本発明の酵素による反応生成物の糖組成（％）は、ＨＰＬＣで検出されたピークの総面積を１００とした場合の、各糖類に対応するピークの面積比率（％）として算出したものである。
（酵素剤）
　本発明は、以下の(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質を含む、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤を提供する。
(ａ) 配列番号１または３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｂ) 配列番号１または３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質；
(ｃ) 配列番号１または３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質。
　なお、本明細書中において、上記(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質を、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質、または本タンパク質ということがある。
　「糖のエピメリ化」または「糖に対するエピメリ化」とは、糖の複数ある不斉炭素のうち、１つの不斉炭素上の立体を反転させる反応であり、具体的には、一例として、糖の２位の水酸基をエピメリ化（異性化）する反応、またはその逆反応を挙げることができる。
　エピメリ化を触媒する酵素を、通常、エピメラーゼといい、例えば、よく研究されているエピメラーゼとして、セロビオース　２－エピメラーゼ（ＣＥ）を挙げることができる。ＣＥは、セロビオースの還元末端グルコース残基をマンノース残基に異性化する反応を触媒する。
　配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ルナティモナス・ロナレンシス（Ｌｕｎａｔｉｍｏｎａｓ　ｌｏｎａｒｅｎｓｉｓ）のゲノム情報から取得したアミノ酸配列（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＷＰ_０１０８５３２８１．１）である。ここで、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、Ｎ－アシルグルコサミン　２－エピメラーゼファミリーとアノテーションされているものの、タンパク質として発現させた場合の具体的性質は、本願出願時において知られていなかった。
　本発明者らは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を、枯草菌発現系による組換えタンパク質として発現させ、その酵素活性を解析したところ、当該タンパク質は、少なくともグルコースに作用しマンノースを、ガラクトースに作用しタロースをそれぞれ生成することを発見した。すなわち、本発明者らは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、グルコース、マンノース、タロースおよびガラクトース等の単糖における２位の炭素に結合した水酸基に対しエピメリ化を触媒する酵素であることを見出した。配列番号３のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列からシグナルペプチドと推定された部分を削った配列である。グルコース、マンノース、タロースおよびガラクトース等の単糖における２位の炭素に結合した水酸基に対しエピメリ化を触媒する反応は、可逆的である。例えば、グルコースの２位の炭素に結合した水酸基がエピメリ化されるとマンノースとなり、マンノースの２位の炭素に結合した水酸基がエピメリ化されるとグルコースとなる。タロースの２位の炭素に結合した水酸基がエピメリ化されるとガラクトースとなり、ガラクトースの２位の炭素に結合した水酸基がエピメリ化されるとタロースとなる。
　ルナティモナス・ロナレンシス由来の配列番号１に記載のアミノ酸配列は、既知のＣＥが有するアミノ酸配列に対して、一次アミノ酸配列同一性は５０％程度であった。具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、メリオリバクター・ロセウス（Ｍｅｌｉｏｒｉｂａｃｔｅｒ　ｒｏｓｅｕｓ）由来ＣＥ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＮ７３７４９．１）に対して５０％一次アミノ酸配列同一性を有する（同一性はＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｌａｒｋｉｎ　Ｍ. Ａ. ｅｔ　ａｌ.,　２００７, Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ, ２００７；　２３：２９４７－２９４８）を用いて評価した）。
　本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、配列番号１または３に記載のアミノ酸配列に対して、９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖のエピメリ化活性を示すタンパク質であってもよい。一実施態様では、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、配列番号１または３に記載のアミノ酸配列に対して、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖のエピメリ化活性を示すタンパク質であってもよい。
　アミノ酸配列同一性は、比較する２本のアミノ酸配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならばギャップを導入した後、２本のアミノ酸配列間で同一であるアミノ酸残基のパーセントとして定義される。アミノ酸配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより決定することができる。
　さらには、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、配列番号１または３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質からなり、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質であってもよい。本明細書で言う「１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列」における「１もしく数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
　本発明の酵素剤に含まれるタンパク質の製造方法については、後述の＜タンパク質の製造＞を参照されたい。
　本発明は、以下の（ｄ）から（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞の培養上清を含む、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤であって、前記糖がグルコース、マンノース、タロースおよびガラクトースからなる群から選択されるいずれかである、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤を提供する。
（ｄ）配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して９０%以上の塩基配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　配列番号２に示す塩基配列は、ルナティモナス・ロナレンシス（Ｌｕｎａｔｉｍｏｎａｓ　ｌｏｎａｒｅｎｓｉｓ）のゲノム情報から取得した配列番号１のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＷＰ_０１０８５３２８１．１）をコードする塩基配列である。配列番号４に示す塩基配列は、配列番号２の塩基配列からシグナルペプチドと推定された部分をコードする塩基配列を削った配列である。
　配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞の培養上清も、本発明に含まれる。「配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖をプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等を採用することにより取得できるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を意味する。「ストリンジェントな条件」は、例えば、サザンハイブリダイゼーションを行った後、０．１～５×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成：１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を使用して、５５～６５℃条件下でフィルターを洗浄する条件が挙げられる（Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed (Sambrook、 Maniatisら、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))）。本発明の一実施態様では、ストリンジェントな条件は、サザンハイブリダイゼーションの後、０．１～１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、６０～６５℃で洗浄する条件である。
　また、配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ポリヌクレオチドの塩基配列が９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の塩基配列同一性を有するポリヌクレオチドであり、かつエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞の培養上清も、本発明に含まれる。塩基配列同一性は、比較する２本の塩基配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならばギャップを導入した後、２本の塩基配列間で同一である塩基のパーセントとして定義される。塩基配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより決定することができる。
　上記形質転換細胞は、枯草菌（バチルス・スブチリス、Bacillus subtilis）であることが好ましい。また、本発明の培養上清は、細胞を実質的に含まないものであり、細胞はフィルターや遠心分離により除去される。
　本発明の培養上清は、上記(ｄ)から(ｆ)のポリヌクレオチドの発現産物であるタンパク質を含む。本明細書中において、本発明の培養上清に含まれる、上記(ｄ)から(ｆ)のポリヌクレオチドの発現産物であるタンパク質を、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質、または本タンパク質ということがある。
　本発明の酵素剤に含まれるタンパク質のエピメリ化活性の評価は、グルコース、マンノース、タロースおよびガラクトースから選択される何れかを基質として、本発明のタンパク質を作用させ、得られたエピメリ化反応生成物を検出することにより行なわれる。
　反応生成物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い、ＲＩ検出器や荷電化粒子検出器などで検出することができる。検出は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および高性能イオン交換クロマトグラフィー／パルスドアンペロメトリ検出法（ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ）を用いて行うこともできる。
　グルコースのエピメリ化によりマンノースが生成され、マンノースのエピメリ化によりグルコースが生成され、タロースのエピメリ化によりガラクトースが生成され、およびガラクトースのエピメリ化によりタロースが生成される。
　本発明の糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤は、単糖または二糖の還元性糖残基における２位の炭素に結合した水酸基に対しエピメリ化を触媒するために用いることができる。本発明の一実施態様において、本発明の糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤は、これらに限定されないが、少なくともグルコース、マンノース、ガラクトースおよびタロースから選択されるいずれかの糖のエピメリ化反応を触媒するために用いることができる。本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、少なくともグルコース、マンノースおよびガラクトースに作用するためである。本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、単糖の２位の水酸基をエピメリ化することができる。
　本発明の糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤は、糖のエピメリ化反応生成物の製造に用いることができる。具体的には、本発明の糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤は、グルコースを基質としてマンノースを製造するために使用することができ、またマンノースを基質としてグルコースを製造するために使用することができる。本発明の一実施態様において、本酵素剤は、グルコースを基質としてマンノースを製造するために使用することが好ましい。グルコースは、工業的に大量生産され安価であることから、工業的製造法に課題のあるマンノースを製造するために、容易に調達できるためである。
　本発明の糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤は、ガラクトースを基質としてタロースを製造するために使用することができ、またタロースを基質としてガラクトースを製造するために使用することができる。本発明の一実施態様において、本酵素剤は、ガラクトースを基質としてタロースを製造するために使用することが好ましい。ガラクトースは、自然界に豊富に存在するラクトースの加水分解等によりに得られることから、希少糖の一つであるタロースを製造するために、容易に調達できるためである。
　本発明の糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤は、Ｎ－アシルグルコサミンを基質としてもよいし、実質的に基質としなくてもよいが、好ましくは実質的に基質としない。本明細書において、特定の糖を実質的に基質にしないとは、例えば、マンノースを基質とした活性を１００％とした場合に、上記特定の糖を基質とした相対活性が５％以下であることを意味し、好ましくは１％以下であり、より好ましくは０％であり、さらに好ましくは、上記特定の糖を基質とする活性が測定不可であり、特に好ましくは、上記特定の糖を基質とする触媒反応が完全に生じないことを意味する。
　本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定される分子量が４５～５５ｋＤａの範囲であるか、または約５０ｋＤａである。なお、ここで示す本タンパク質の分子量は、プラスミドに本タンパク質をコードするＤＮＡを挿入し、枯草菌を宿主細胞として発現させたタンパク質の分子量である。実施例１および２において４５～５５ｋＤａの範囲又は約５０ｋＤａと測定された本タンパク質の分子量の理論値は、５０．０ｋＤａである。
　本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、これらに限定されないが、少なくとも、グルコース、マンノース、タロースおよびガラクトースに作用し、これらの糖のエピメリ化反応を触媒することができる。
　従来のセロビオース　２－エピメラーゼには、グルコースからマンノースおよびフルクトースを生成するものがある（特許文献３、特許文献４）。しかし、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、グルコースを主にマンノースに変換することができる。本タンパク質を用いた反応系においては、グルコースから、わずかにフルクトースが生成されることがあるが、微量である。
　本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、従来のセロビオース　２－エピメラーゼに比較して、グルコースからマンノースを効率よく製造することができる。具体的には、実施例記載の同条件で基質グルコースに作用させた場合に、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、特許文献６に記載のメリオリバクター・ロセウス（Ｍｅｌｉｏｒｉｂａｃｔｅｒ　ｒｏｓｅｕｓ）由来のＣＥに比較して、反応生成物中に１．３倍以上の含有率でマンノースを生成することができ、さらには１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上または２．０倍以上の含有率でマンノースを生成することができる。
　本発明の酵素剤は、単離・精製された上記の糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質を有効成分として含む酵素組成物であってもよく、上記の糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質以外に、糖のエピメリ化反応を阻害しないものであれば、さらなる成分を含むことができる。これらは、例えば、緩衝液、安定化剤、賦形剤など、通常の酵素製剤に用いる成分であってもよい。このようなさらなる成分は、先行技術より公知であり、また当業者によく知られている。また、本発明の酵素剤は、その形状も特に制限は無く、固体（たとえば、粉末状）や液体であり得る。本発明の酵素剤は、例えば、固体や液体のものを、糖基質の溶液に添加することにより使用することができる。
　本発明の酵素剤は、例えば、本発明の糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質が固定化担体に固定された酵素剤として提供することができる。固定化された酵素剤とすることで、例えば、高基質濃度および高温において、反応生成物の製造を行うことができ、また、バイオリアクター方式による反応生成物の製造を行うこともできる。
　上記固定化担体は、特に制限されず、例えば、糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質が吸着または架橋結合され、本タンパク質の活性が保持されるものであれば使用できる。
　上記固定化担体は、例えば、陰イオン交換担体、陽イオン交換担体、疎水性担体等があげられる。上記固定化担体の具体例は、例えば、イオン交換ゲルである。上記イオン交換ゲルは、例えば、ダイヤイオン（登録商標）ＳＫ１Ｂ、ダイヤイオン（登録商標）ＰＫ２１２、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰＡ２５、ダイヤイオン（登録商標）ＵＢＫ５５５等のダイヤイオン（登録商標）シリーズ（三菱ケミカル社製）；セパビーズ（登録商標）ＳＰ－２０７、セパビーズ（登録商標）ＳＰ－８５０等のセパビーズ（登録商標）シリーズ（三菱ケミカル社製）；デュオライトＡ５６８、デュオライトＰＷＡ７、デュオライトＸＡＤ７６１等のデュオライトシリーズ（住化ケムテックス社製）等があげられる。
　グルコース、マンノース、タロースおよびガラクトース以外の糖であっても、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質がエピメリ化を触媒できるものであれば、本発明の酵素剤を用いることができる。
　上記固定化担体の形状は、特に制限されず、例えば、膜、ビーズ、プレート等があげられる。
　糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質の上記固定化担体への固定方法は、特に制限されず、例えば、緩衝液等の溶媒に本タンパク質と上記固定化担体とを添加し、この混合液を振とうすることで行うことができる。
　（糖のエピメリ化反応生成物の製造方法）
　本発明は、糖基質に、本発明の糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤を作用させて、糖のエピメリ化反応生成物を得る工程を含む、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法を提供する。
　糖基質に、本発明の酵素剤を作用させることは、例えば、糖基質の水溶液を調製し、必要に応じてｐＨを調整した後、当該水溶液に本発明の酵素剤を添加することにより実施することができる。さらには、本発明の糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質を担体に固定して酵素剤とし、当該酵素剤に糖基質の水溶液を接触させることにより実施することができる。本発明の酵素剤を用いた糖のエピメリ化反応は、反応液中で実施することができるためである。
　糖のエピメリ化反応生成物の製造方法に用いることができる糖基質は、グルコース、マンノース、ガラクトースおよびタロースから選択されるいずれかであってもよいが、これらに限定されず、これ以外の糖であっても本発明の酵素剤に含まれるタンパク質がエピメリ化を触媒できるものであれば、糖基質として使用することができる。上記糖基質としては、純品を用いても良いが、コスト等の点から他の糖質が含まれる糖組成物を用いてもよい。具体的には、例えば、グルコースを主な基質に用いる場合、グルコースに加えて澱粉の分解で生じるマルトースやマルトトリオースなどを含む糖組成物でもよい。
　糖基質に、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質を作用させる際の反応温度は、酵素活性が発現する温度域であれば、特に制限はない。本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、実施例記載の通り、ｐＨ６．０で反応した場合、温度が５３℃以下で反応可能である。従来のエピメラーゼの中には、熱安定性の点から工業的規模での使用について制限があるものがあった。しかし、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、高い耐熱性を示し、工業的規模での使用に適した熱安定性を有している。
　よって、本発明の酵素剤を作用させる際の反応温度（反応液の液温）を、３５～５５℃といった幅広い温度域に設定することができる。工業的規模の反応系では正確な温度管理が難しい場合があるが、本タンパク質は、幅広い温度域で安定的に使用できる点で有利である。
　上記反応温度は、３５～５５℃の範囲に設定することができるが、４５～５３℃の範囲に設定することが好ましい。反応温度が４５℃以上であれば、糖を栄養分とする混入菌が繁殖しにくく、５３℃以下で、本タンパク質は温度安定性を示すためである。
　糖のエピメリ化反応生成物の製造方法においては、後述の通り、本発明の酵素剤と、その他の酵素を併用することができる。その他の酵素を併用する場合には、上記反応温度は、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質が安定に作用する温度域であればよい。上記の通り、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は幅広い温度域で安定性を有するため、併用するその他の酵素が安定に活性化する温度を勘案して、反応系で使用するすべての酵素の活性が十分に利用できる範囲に、温度設定ができる場合が多い。
　反応温度は、反応時間の全体を通して一定である必要はなく、反応時間の初期に併用するその他の酵素の活性を高めることが望ましい場合には、その酵素の活性が高くなる温度域に、反応初期の温度を設定し、反応時間の中期や後期には、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質の活性が高くなる温度域に温度を設定するなど、適宜調整することができる。
　糖基質に、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質を作用させる際の反応液のｐＨは、酵素活性が発現するｐＨ域であれば、特に制限はないが、ｐＨ５．５～８．５の範囲に設定することができる。本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、実施例記載の通り、少なくともｐＨ６．０～８．０の範囲で反応が可能であるためである。効率よく糖のエピメリ化反応生成物を得るには、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質を作用させる際の反応液のｐＨを、ｐＨ６．０～８．０の範囲に設定することが好ましい。反応液のｐＨの調整は、必要に応じ、酸又はアルカリの添加により行うことができる。
　糖のエピメリ化反応生成物の製造方法における基質と本発明の酵素剤に含まれるタンパク質の反応時間は、反応温度や基質の濃度、その他の酵素を併用する場合には使用する酵素の特性等を考慮して適宜決定できる。また、本分野の従来技術に基づいて、効率よくエピメリ化反応生成物を製造するための、好適な反応時間を適宜決定することができる。具体的な反応時間の例としては、１０分から７２時間を挙げることができるが、これに限定する意図はない。反応中、本発明の酵素剤を、適宜添加することができる。
　反応液中の基質濃度は、特に制限されず、例えば、上記酵素反応が進行可能な範囲において、基質濃度が高いほど経済的に有利である。基質としてグルコースを使用する場合、グルコース濃度は、溶媒１００ｇあたり０．１ｇ～３００ｇの範囲である。上記反応液の溶媒は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等があげられる。なお、選択した基質の溶媒への溶解度が低い場合、例えば、所望の濃度で完全に溶解されない場合がある。バッチ式で酵素反応を行う場合、例えば、反応初期において基質が完全に溶解された状態である必要はなく、酵素反応の終了時に溶解される基質濃度を選択すればよい。一方、固定化された酵素剤を充填したカラムを酵素反応に使用する場合、例えば、カラムの目詰まりによる圧力損失を避けるために、基質が完全に溶解された状態であることが好ましい。また、固定化された酵素剤を充填したカラムを酵素反応に使用する場合、例えば、基質溶液を、上記カラムに還流させて、連続的に通液するのが好ましい。また、本発明の酵素剤を用いて、グルコースを基質としてマンノースを生成する場合、水飴、粉飴、ハイドロール（結晶グルコース製造の際に生ずる分蜜液）などを用いることができる。さらに、例えばデキストリン、澱粉等のグルコースを構成糖として含む糖質を原料とし、本発明の酵素剤と共に加水分解酵素を添加し、原料より基質となるグルコースを生成しつつグルコースからマンノースを製造することができる。
　本発明の酵素剤を用いるエピメリ化反応生成物の製造は、具体的な例として、基質としてグルコースを用いる場合、固形分濃度１～６５％程度のグルコース水溶液を調製し、必要に応じて酸またはアルカリを用いて当該水溶液のｐＨを６．０～８．０程度に調整し、当該水溶液に本発明の酵素剤を添加し、温度３０～５３℃の範囲で、約１～７２時間保持することでマンノースを製造することができる。
　また、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法において、本発明の酵素剤と、その他の酵素を併用することができる。その他の酵素は、これに制限されないが、本発明の糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有する酵素の基質となりうる糖を生成するものであってもよい。例えば、その他の酵素として、乳糖等のガラクトースを構成糖として含む糖質を加水分解する酵素を用いることができる。本発明の酵素剤（すなわち、糖のエピメリ化反応触媒用酵素剤）と、当該加水分解酵素をその他の酵素として併用することにより、乳糖等のガラクトースを構成糖として含む糖質から、加水分解によりガラクトースを生成しつつ、エピメリ化によりガラクトースからタロースを生成することができる。
　上記製造方法により、エピメリ化反応生成物を含む糖水溶液が得られる。このエピメリ化反応生成物を含む糖水溶液に対し、必要に応じて常法を用いて脱色、脱塩、精製処理などを施すことができる。また、エピメリ化反応生成物を含む糖水溶液に、樹脂分画処理、エタノール等を用いた有機溶媒による沈殿法、クロマト分画法や限外濾過膜による処理等を施すことにより、未反応の基質等を除去し、エピメリ化反応生成物の純度を高めることができる。精製処理は、単独の操作によって、またはいくつかの操作を組み合わせることにより、より効率的にエピメリ化反応生成物を精製することができる。
　別の実施態様において、本発明は、糖基質に、本発明の糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤をｐＨ５．５～７．０条件下で作用させて、糖のエピメリ化反応生成物を得る工程を含む、反応生成物中の副生が、目的エピメリ化反応生成物の５％以下に抑制された、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法を提供する。例えば、グルコースに本発明の糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤をｐＨ５．５～７．０条件下で作用させてマンノースを製造することができ、当該方法では反応生成物中のフルクトース副生をマンノースの５％以下に抑制することができる。上記ｐＨ条件は、ｐＨ５．５～６．５の範囲であることが好ましい。反応生成物中の副生は、目的エピメリ化反応生成物の４．５％以下、４．０％以下、３．５％以下、３．０％以下、２．５％以下、２．０％以下、１．５％以下、１．０％以下または０．５％以下に抑制することが好ましい。
　本発明は、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法を実施して得られた糖のエピメリ化反応生成物を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法を提供する。
　糖のエピメリ化反応生成物は、上述の糖のエピメリ化反応生成物の製造方法を実施して得ることができる。
　糖のエピメリ化反応生成物の製造方法を実施して得られた糖のエピメリ化反応生成物を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程では、エピメリ化反応生成物を原料の一つとして、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を製造すること、またはエピメリ化反応生成物そのものを適当な形態（粉末、液体など）に調製し、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品として提供することができる。
　本発明の方法で製造される食品の例には、限定されるものではないが、各種炭水化物類（パン、麺、米飯、もち）、各種和菓子類（せんべい、あられ、おこし、求肥、もち類、まんじゅう、どら焼き、ういろう、餡類、羊羹、水羊羹、錦玉、カステラ、飴玉）、各種洋菓子類（パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、ドーナツ、蒸しケーキ、プリン、ゼリー、ムース、ババロア、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディー、シロップ類）、各種氷菓（アイスクリーム、シャーベット、ジェラート、かき氷）、各種ペースト状食品（フラワーペースト、ピーナッツペースト、マーガリン、フルーツペースト）、各種飲料（果汁含有飲料、果汁ジュース、野菜ジュース、サイダー、ジンジャーエール、アイソトニック飲料、アミノ酸飲料、ゼリー飲料、コーヒー飲料、緑茶、紅茶、ウーロン茶、麦茶、乳飲料、乳酸菌飲料、ココア、ビール、発泡酒、第三のビール、ノンアルコール飲料、ビール風味飲料、リキュール、チューハイ、清酒、果実酒、蒸留酒、栄養ドリンク、健康飲料、粉末飲料）、果物・野菜加工品（ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果、漬物）、各種乳製品（チーズ、ヨーグルト、バター、練乳、粉乳）、粉末食品（粉末スープ、粉末ムース、粉末ゼリー、粉末甘味料）、栄養食、ダイエット食、スポーツ用栄養食、流動食、半固形流動食、介護食、嚥下食等が挙げられる。
　本発明の方法で製造される飼料および餌料の例には、限定されるものではないが、家畜、家禽、魚介類、昆虫（ミツバチ、蚕など）用飼料および餌料を挙げることができる。その形態としては、粉体、ペレット、錠剤、練り餌、カプセルなどである。
　本発明の方法で製造される化粧料の例には、限定されるものではないが、保湿剤および美容剤などを挙げることができる。それらの形態としては、乳液、クリームおよびエマルジョンなどである。
　本発明の方法で製造される医薬品の例には、限定されるものではないが、例えば抗肥満剤、血糖値上昇抑制剤などを挙げることができ、それらの形態としては、錠剤、粉剤、液剤、カプセル剤などである。
＜タンパク質の製造＞
　本発明の酵素剤に含まれるタンパク質の取得方法は、特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質であってもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質であってもよい。以下に、組換えタンパク質を作製する場合について説明する。
　配列番号１または３に示されるアミノ酸配列、または配列番号１または３に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号１または３に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、遺伝子工学的手法によって調製することができる。例えば、配列番号１または３のアミノ酸配列をコードする遺伝子は、宿主細胞内で複製可能であるか、あるいは染色体に組み込まれかつ同遺伝子を発現可能な状態で含むＤＮＡ分子として、特に発現ベクターに挿入された形態で宿主細胞の形質転換を行い、宿主細胞を培養することでタンパク質を産生させることができる。このＤＮＡ分子は、配列番号１または３に示されるアミノ酸配列、配列番号１または３に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１または３に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片をベクター分子に組み込むことによって得ることができる。本発明の好ましい態様によれば、このベクターはプラスミドである。本発明におけるＤＮＡ分子の作製は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌに記載の方法に準じて行なうことができる。
　本発明において利用できるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案しながら、ウイルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択できる。例えば、宿主細胞が枯草菌の場合はｐＪＥＸＯＰＴ２系（特許５１２６８７９号を参照）、ｐＨＴ系のプラスミド、大腸菌の場合はλファージ系のバクテリオファージ、ｐＥＴ系、ｐＵＣ系、ｐＣｏｌｄ系、ｐＧＥＸ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系のベクター、あるいはｐＬｅｕ４、ｐＰＰＬｅｕ４、ｐＪＰＬｅｕ４系（特開平４－２１８３８２号公報に記載）などが挙げられるが、これらに限定されない。このプラスミドは形質転換体を選択するためのマーカーを含んでいてもよく、該選択マーカーとしては薬剤耐性マーカーや栄養要求マーカー遺伝子を使用することができるが、これらに限定されない。
　さらに、本発明で利用できる発現ベクターは、酵素遺伝子の発現に必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター、ターミネーター、リボゾーム結合部位、転写終結シグナルなどの転写調節信号、翻訳調節信号などを有することができる。該プロモーターとしては、枯草菌においてはズブチリシン、ＳＰＡＣ等のプロモーター、酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、酸性フォスファターゼ（ＰＨＯ）、ガラクトース遺伝子（ＧＡＬ）、グリセルアルデビド３リン酸脱水素酵素遺伝子（ＧＡＰ）等のプロモーターを用いることができるが、これらに限定されない。シグナルペプチドの付与は、目的酵素が培養上清中に分泌され、精製が容易になるという利点があるので使用することが好ましい。また、シグナルペプチドを枯草菌や酵母由来のもの（例えば、インベルターゼシグナル、酸性フォスファターゼシグナル、λ－ファクターシグナルなど）に置き換えることができる。また、大腸菌においては、一般に慣用されるｌａｃプロモーターやＴ７プロモーターのほかに、ｃｓｐＡプロモーター等を用いて分子シャペロンを同時に発現させるなど、発現をより効率化する工夫を行うことができる
　形質転換を行なった宿主細胞の培養は、使用する宿主細胞に関して一般的な方法を用いることができる。通常は、１～４日程度の培養により細胞内または細胞外の培養物中に酵素が生成され蓄積される。培養条件（培地、ｐＨ、温度等）に関しては、例えば、細菌では２５～３７℃、酵母では２５～３０℃、真核細胞では３７℃程度が一般的である。培養条件については、遺伝子発現実験マニュアル（講談社）等を参照することができる。
　宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の細菌、カンディダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の酵母以外に、リゾープス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｎｉｖｅｕｓ）、リゾープス・デルマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ）や高等真核生物（例えばＣＨＯ細胞など）を用いることができる。枯草菌としてはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物を用いることが好ましい。バチルス属にはタンパク質を菌体外へ分泌する株（例えば、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など）が存在することが知られている。またプロテアーゼを殆ど分泌しない株も知られており、このような株を宿主として用いることも好ましい。本発明においては、宿主細胞として酵母、糸状菌または細菌が好ましいが、細菌がより好ましく、特に大腸菌やバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が好ましい。
　形質転換体が産生したタンパク質の単離・精製は、公知の分離方法や精製方法を適当に組み合わせて行なうことができる。これらの分離・精製方法としては例えば塩沈殿、溶媒沈殿のような溶解性の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過およびＳＤＳ－ポリアクリル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、さらに等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法、このほかにアフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。実施例に記載した精製方法のほかに、一般的な分離・精製法に関しては、例えば蛋白質・酵素の基礎実験法（南江堂）等を参照することができる。
　以下の例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、本明細書において、特に記載しない限り、「％」は質量基準であり、数値範囲はその端点を含むものとして記載される。また、操作手順は特に記載しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ(１９８９))に記載の方法に従った。
　本実施例では、ルナティモナス・ロナレンシス（Ｌｕｎａｔｉｍｏｎａｓ　ｌｏｎａｒｅｎｓｉｓ）からＮ－アシルグルコサミン　２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）と推定される機能未確認のタンパク質（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１０８５３２８１．１）をコードする遺伝子をクローニングして組換えタンパク質を得て、その酵素活性に関し特性評価を行った。
　実施例１：枯草菌を宿主とした本酵素の菌体外発現（１）
１－１．発現プラスミドの構築
　種々の微生物について新規酵素探索を行い、ルナティモナス・ロナレンシス（Ｌｕｎａｔｉｍｏｎａｓ　ｌｏｎａｒｅｎｓｉｓ）由来アミノ酸配列（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＷＰ_０１０８５３２８１．１）を選出し、機能解析を行った。このアミノ酸配列（配列番号１）およびアミノ酸配列をコードする遺伝子（以下、目的遺伝子１という）の塩基配列（配列番号２）を、それぞれ図１ＡおよびＢに示す。図１Ｃに示す配列番号３のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列からシグナルペプチドと推定された部分を削った配列である。配列番号２および４に示す塩基配列は、枯草菌での良好な発現を企図して、コドン最適化が行われている。
　目的遺伝子１を枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で発現させるための発現プラスミドを構築した。まず、ｐＵＣ５７ベクターに配列番号２に記載の塩基配列が挿入されたプラスミドを鋳型として、センス鎖増幅についてはベクターのシグナルペプチド配列の末端と相同な塩基配列を付加したプライマーを用いて、アンチセンス鎖増幅についてはターミネーター配列の一部を付加したプライマーを用いて、目的遺伝子をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅用の反応液の組成を以下に示す。
２×Ｐｒｉｍｅｓｔａｒ　Ｍａｘ　Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）５０μＬ
１０μＭ　プライマー（ＬｌＡＧＥ－Ｆｗ）　　　　　　　　　　　２μＬ
１０μＭ　プライマー（ＬｌＡＧＥ－Ｒｖ）　　　　　　　　　　　２μＬ
１ｎｇ／μＬ　テンプレート　　　　　　　　　　　　　　　　　　２μＬ
Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ４４μＬ
　使用プライマーを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ＰＣＲ増幅反応のプログラムは、まず、９６℃に１分間保持した後、９８℃で１０秒間→５５℃で５秒間→７２℃で１０秒間を１サイクルとして３５サイクル行った後にさらに７２℃で５分間保持した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、増幅断片（1、２９９ｂｐ）に相当するバンドをゲルから切り出し、ｉｌｌｕｓｔｒａＴＭ　ＧＦＸＴＭ　ＰＣＲ　ＤＮＡ　ａｎｄ　Ｇｅｌ　Ｂａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）を用いて抽出し精製した。
　Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニング反応で用いる線状化プラスミドの調製のため、ベクターｐＪＥＸＯＰＴ２（特許５１２６８７９号を参照）を本実施例に最適化するために改変したプラスミドを鋳型として、表２に示したプライマーを用いてＰＣＲを行った。アンチセンス鎖の増幅についてはベクターのシグナルペプチド配列の末端から増幅するように組んだプライマーを用いた。
　使用プライマーを表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＰＣＲ増幅の反応液の組成は、プライマーおよび鋳型以外は目的遺伝子１の増幅に使用したものと同じであった。ＰＣＲ増幅反応のプログラムは、まず、９６℃に１分間保持した後、９８℃で１０秒間→５５℃で５秒間→７２℃で３５秒間を１サイクルとして３５サイクル行った後にさらに７２℃で５分間保持した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、増幅断片（６、９３５ｂｐ）に相当するバンドをゲルから切り出し、ｉｌｌｕｓｔｒａＴＭ　ＧＦＸＴＭ　ＰＣＲ　ＤＮＡ　ａｎｄ　Ｇｅｌ　Ｂａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）を用いて抽出し精製した。目的遺伝子１の増幅ＤＮＡ断片およびベクターｐＪＥＸＯＰＴ２の増幅断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて連結した。連結反応は５０℃にて１５分間保持することで行った。
　連結反応溶液を２．５μＬ用いてＥ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５αを形質転換し、培養した培養液からｉｌｌｕｓｔｒａＴＭ　ｐｌａｓｍｉｄＰｒｅｐ　Ｍｉｎｉ　Ｓｐｉｎ　Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）によりプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドを「本酵素発現用プラスミド」とした。
１－２．組換えタンパク質の発現
　上記の本酵素発現用プラスミドをプロトプラスト化した枯草菌ＩＳＷ１２１４（タカラバイオ）に導入し、７．５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むＤＭ３再生寒天培地（組成：８．１％コハク酸ナトリウム、１％寒天、０．５％カザミノ酸、０．５％酵母エキス、０．１５％リン酸２水素カリウム、０．３５％リン酸水素２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン、０．００１％メチオニン、および０．００１％ロイシン）にて３０℃で２日間培養した。得られたコロニーを用い、前培養を経た後、本培養を７２時間培養した（特許５１２６８７９号に記載の通り培養したが、培地の組成は改変したものを使用した）。遠心分離（５，０００×ｇ、４℃、５分間）行い、上清をポアサイズが０．４５μｍのフィルター（メルク）で濾過したものを本酵素溶液１とした。この本酵素溶液１をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、目的のサイズ（５０，０００）付近にバンドが出ていることを確認した（図３）。
実施例２：枯草菌を宿主とした本酵素の菌体外発現（２）
　実施例１－１にて構築した本酵素発現用プラスミドを用い、実施例２を行った。
２－１．組換えタンパク質の発現
　実施例１－２と同様の方法で枯草菌ＩＳＷ１２１４（タカラバイオ）への本酵素発現用プラスミドの導入および培養を実施した。得られた培養液について、遠心分離（５，０００×ｇ、４℃、５分間）行い、上清をポアサイズが０．４５μｍのフィルター（メルク）で濾過したものを培養上清とした。この培養上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、目的のサイズ（５０，０００）付近にバンドが出ていることを確認した（図４）。さらに、この培養上清をＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５遠心式フィルターユニット（メルク）を用い、１０倍程度濃縮し、本酵素溶液２とした。
　比較例１：比較用酵素溶液の調製
１．発現プラスミドの構築
　実施例１に記載のルナティモナス・ロナレンシス由来エピメリ化酵素と機能の比較を行うため、特許文献６に記載のメリオリバクター・ロセウス（Ｍｅｌｉｏｒｉｂａｃｔｅｒ　ｒｏｓｅｕｓ）由来のＣＥ（アミノ酸配列のＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　：ＡＦＮ７３７４９．１）について、枯草菌での菌体外発現を行った。このアミノ酸配列（配列番号９）およびアミノ酸配列をコードする遺伝子（以下、比較用遺伝子という）の塩基配列（配列番号１０）を、それぞれ図２ＡおよびＢに示す。配列番号１０に示す塩基配列は、枯草菌での良好な発現を企図してコドン最適化が行われている。
　比較用遺伝子を枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で発現させるための発現プラスミドを構築した。まず、ｐＵＣ５７ベクターに配列番号１０に記載の塩基配列が挿入されたプラスミドを鋳型として、センス鎖増幅についてはベクターのシグナルペプチド配列の末端と相同な塩基配列を付加したプライマーを用いて、アンチセンス鎖増幅についてはターミネーター配列の一部を付加したプライマーを用いて、比較用遺伝子をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅用の反応液の組成を以下に示す。
２×Ｐｒｉｍｅｓｔａｒ　Ｍａｘ　Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）５０μＬ
１０μＭ　プライマー（ＭＲＯＳＣＥ－Ｆｗ）　　　　　　　　　　２μＬ
１０μＭ　プライマー（ＭＲＯＳＣＥ－Ｒｖ）　　　　　　　　　　２μＬ
１ｎｇ／μＬ　テンプレート　　　　　　　　　　　　　　　　　　２μＬ
Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ４４μＬ
　使用プライマーを表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＰＣＲ増幅反応のプログラムは、まず、９６℃に１分間保持した後、９８℃で１０秒間→５５℃で５秒間→７２℃で１０秒間を１サイクルとして３５サイクル行った後にさらに７２℃で５分間保持した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、増幅断片（1，３８３ｂｐ）に相当するバンドをゲルから切り出し、ｉｌｌｕｓｔｒａＴＭ　ＧＦＸＴＭ　ＰＣＲ　ＤＮＡ　ａｎｄ　Ｇｅｌ　Ｂａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）を用いて抽出し精製した。
　Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニング反応で用いる線状化プラスミドの調製は、実施例１－１と同様の操作を行い、比較用遺伝子の増幅ＤＮＡ断片およびベクターｐＪＥＸＯＰＴ２（特許５１２６８７９号を参照）を本実施例に最適化するために改変したプラスミドの増幅断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて連結した。連結反応は５０℃にて１５分間保持することで行った。
　連結反応溶液を２．５μＬ用いてＥ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５αを形質転換し、培養した培養液からｉｌｌｕｓｔｒａＴＭ　ｐｌａｓｍｉｄＰｒｅｐ　Ｍｉｎｉ　Ｓｐｉｎ　Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）によりプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドを「比較酵素発現用プラスミド」とした。
２．組換えタンパク質の発現
　上記の比較酵素発現用プラスミドをプロトプラスト化した枯草菌ＩＳＷ１２１４（タカラバイオ）に導入し、７．５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含む再生寒天培地（組成：８．１％コハク酸ナトリウム、１％寒天、０．５％カザミノ酸、０．５％酵母エキス、０．１５％リン酸２水素カリウム、０．３５％リン酸水素２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン、０．００１％メチオニン、および０．００１％ロイシン）にて３０℃で２日間培養した。得られたコロニーを用い、実施例１－２と同様に前培養および本培養を行った。得られた培養液を遠心分離（５，０００×ｇ、４℃、５分間）し、上清をポアサイズが０．４５μｍのフィルター（メルク）で濾過したものを比較用酵素溶液とした。
比較例２：空ベクター対照（陰性対照）の調製
　陰性対照として空ベクターで形質転換した細胞の培養上清を調製した。ベクターｐＪＥＸＯＰＴ２（特許５１２６８７９号を参照）を本実施例に最適化するために改変したプラスミドをプロトプラスト化した枯草菌ＩＳＷ１２１４（タカラバイオ）に導入し、７．５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含む再生寒天培地（組成：８．１％コハク酸ナトリウム、１％寒天、０．５％カザミノ酸、０．５％酵母エキス、０．１５％リン酸２水素カリウム、０．３５％リン酸水素２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン、０．００１％メチオニン、および０．００１％ロイシン）にて３０℃で２日間培養した。得られたコロニーを用い、実施例１－２と同様に前培養および本培養を行った。得られた培養液を遠心分離（５，０００×ｇ、４℃、５分間）し、上清をポアサイズが０．４５μｍのフィルター（メルク）で濾過したものを空ベクター対照（陰性対照）とした。
実施例３：酵素反応生成物のＴＬＣ分析
　本実施例では、本酵素が作用する基質を検証した。酵素反応の基質には、マンノースおよびガラクトースを用いた。
　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）１０μＬ、５００ｍＭ　各種基質１０μＬ、本酵素溶液１を１０μＬおよび超純水７０μＬからなる、反応液１００μＬを３７℃にて２４時間保持し、このうち０．５μＬを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供した。
　展開溶媒は、２－プロパノール／１－ブタノール／水の混合液（順に２：２：１の混合比（すべて体積比））を用いた。
　糖の検出は、呈色剤としてアニスアルデヒド／硫酸／酢酸の混合液（順に１：２：９７の混合比（すべて体積比））をＴＬＣプレートに噴霧後、加熱することにより実施した。
　その結果を図５に示す。両基質において、酵素反応前の糖（基質）と反応後の糖の移動距離に違いが観察された。マンノースを基質とした分析では、反応後のサンプル中にグルコースの移動度と一致するスポットが認められた。また、ガラクトースを基質とした分析では、反応後のサンプル中にタロースの移動度と一致するスポットが認められた。ルナティモナス・ロナレンシス由来の本酵素は、少なくともマンノースおよびガラクトースに作用することが明らかとなった。
実施例４：マンノース合成試験
４－１．方法
　本酵素溶液１および比較用酵素溶液について、グルコースを基質としたマンノースの合成試験を実施した。すなわち、１０．３～３３０．０μＬ／ｇ－ｄｓの酵素（本酵素溶液１または比較用酵素溶液）、５０％　グルコース、４０ｍＭ　各緩衝液（ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液 (ｐＨ６．０)、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）またはＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０））、および０．０２％アジ化ナトリウムからなる、反応液１ｍＬを５０℃にて２４～７２時間保持した。また、共存する緩衝液成分等による異性化を調査するために、空ベクター対照を用いた反応液についても上記同様に調製、保持した。各反応時間にて採取した反応液を、ｐＨを４．０以下とし、１０分間煮沸することで反応を停止した。その後、反応液１０μＬと純水８００μＬを混合し希釈した。
　グルコースを基質とした本酵素の生成物の糖組成をＨＰＬＣで分析した。分析条件はカラム：ＨＩＬＩＣｐａｋ　ＶＧ－５０　４Ｅ（Ｓｈｏｄｅｘ）、ＨＩＬＩＣｐａｋ　ＶＧ－５０Ｇ　４Ａ（Ｓｈｏｄｅｘ）、溶離液：８０％アセトニトリル、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出器：荷電化粒子検出器とした。
４－２．結果
　グルコースに対して上記の通り酵素を作用させたときの反応生成物について、その糖組成分析の結果を図６～１１に示す。反応生成物中のマンノース含有率およびフルクトース含有率はＨＰＬＣ分析のピーク面積比より算出した。
　本酵素溶液１添加区および比較用酵素溶液添加区では、ｐＨ６．０、７．０および８．０の全ての試験区において、グルコースからマンノースが生成された。本酵素溶液１添加区と比較用酵素溶液添加区との反応生成物中のマンノース含有率を比較すると、すべての試験区において本酵素溶液１の方が、約１．３～２．０倍高いマンノース含有率を示した。一方で、空ベクター対照を添加した試験区では、試験した何れのｐＨにおいても、マンノースは生成されなかった。
　本酵素溶液１を３３０．０μＬ／ｇ－ｄｓ添加し、反応温度５０℃、７２時間保持した条件において、マンノースの含有率は最大でｐＨ６．０では２８．７％、ｐＨ７．０では２７．２％、ｐＨ８．０では２９．６％であった。これは、同条件で比較用酵素を用いた場合の約１．３倍であった。
　ｐＨ６．０の試験区では、本酵素溶液１、比較用酵素溶液および空ベクター対照のいずれを用いた場合も、フルクトースはほとんど検出されなかった。一方、ｐＨ７．０および８．０の試験区では、本酵素溶液１、比較用酵素溶液および空ベクター対照のいずれを用いた場合もフルクトースの生成が確認された。ｐＨ７．０で７２時間作用させた場合、本酵素溶液１、比較用酵素溶液および空ベクター対照のいずれを用いた場合も、フルクトースの含有率は１．１～１．６％であった。ｐＨ８．０で７２時間作用させた場合、本酵素溶液１、比較用酵素溶液および空ベクター対照のいずれを用いた場合も、フルクトースの含有率は３．２～７．２％であった。ｐＨ７．０およびｐＨ８．０ともに、酵素添加量が多くなると、反応生成物中のフルクトース含有率は低下する傾向がみられた。
　本酵素溶液１を３３０．０μＬ／ｇ－ｄｓ添加し、ｐＨ８．０で７２時間作用させた場合、反応生成物中のマンノース含有率は２９．６％であり、フルクトース含有率は３．４％であり、反応生成物中のフルクトース副生が、マンノースの約１１．４％に相当した。また、本酵素溶液１を３３０．０μＬ／ｇ－ｄｓ添加し、ｐＨ７．０で７２時間作用させた場合、反応生成物中のマンノース含有率は２７．２％であり、フルクトース含有率は１．２％であり、反応生成物中のフルクトース副生が、マンノースの約４．４％に相当した。一方で、本酵素溶液１を３３０．０μＬ／ｇ－ｄｓ添加し、ｐＨ６．０で７２時間作用させた場合、反応生成物中のマンノース含有率は２８．７％であり、フルクトース含有率は０．９％であり、反応生成物中のフルクトース副生が、マンノースの約３．１％相当であった。
　これらの結果から、フルクトースは非酵素的な反応（例えば、緩衝液やｐＨの影響によるグルコースからフルクトースへの異性化等）若しくは夾雑酵素の反応（異性化酵素によるグルコースからフルクトースへの変換）によって生成されたものであることが示唆された。さらにｐＨ７．０以下、特にｐＨ６．０にて反応を行うことで、フルクトースの生成を抑制することができることが明らかとなった。
実施例５：タロースの合成試験
１．方法
　本酵素溶液２について、ガラクトースを基質としたタロースの合成試験を実施した。すなわち、ガラクトース１ｋｇを水に溶解した後に、１７８．５ｇの本酵素溶液２を添加、更にｐＨを６．０に調整して、反応液の重量が２ｋｇとなるように水を添加し、混合した。当該反応液を５３℃にて２４～７２時間反応させた。各反応時間にて採取した反応液を、ｐＨ４．０以下に調整し、１０分間煮沸することで反応停止させた。その後、反応液１０μＬと純水８００μＬを混合させ、希釈した。
　得られた反応希釈液中のガラクトース、タロースおよびガラクトースの糖組成をＨＰＬＣで分析した。分析条件はカラム：ＨＩＬＩＣｐａｋ　ＶＧ－５０　４Ｅ（Ｓｈｏｄｅｘ）、ＨＩＬＩＣｐａｋ　ＶＧ－５０Ｇ　４Ａ（Ｓｈｏｄｅｘ）、溶離液：８０％アセトニトリル、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出器：荷電化粒子検出器とした。
２．結果
　ガラクトースに対して本酵素溶液２を作用させたときの反応生成物について、糖組成分析結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 ＊ＨＰＬＣ分析のピーク面積比より算出した。
　本酵素は反応温度５３℃にて反応可能であり、ガラクトースからタロースおよびタガトースが生成した。タロース含有率は最大１７．５％であった。
配列番号１：ルナティモナス・ロナレンシス由来のタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２：ルナティモナス・ロナレンシス由来のタンパク質をコードする塩基配列
配列番号３：ルナティモナス・ロナレンシス由来のタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４：ルナティモナス・ロナレンシス由来のタンパク質をコードする塩基配列
配列番号５～８：プライマー配列
配列番号９：メリオリバクター・ロセウス由来のタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０：メリオリバクター・ロセウス由来のタンパク質をコードする塩基配列
配列番号１１～１２：プライマー配列

Claims (4)

  1. 以下の(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質を含む、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤であって、前記糖がグルコース、マンノース、タロースおよびガラクトースからなる群から選択されるいずれかである、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤。
    (ａ) 配列番号１または３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
    (ｂ) 配列番号１または３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質；
    (ｃ) 配列番号１または３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質。
  2. 以下の（ｄ）から（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞の培養上清を含む、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤であって、前記糖がグルコース、マンノース、タロースおよびガラクトースからなる群から選択されるいずれかである、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤。
    （ｄ）配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （ｅ）配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｆ）配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して９０%以上の塩基配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  3. 糖基質に、請求項１または２に記載の酵素剤を作用させて、糖のエピメリ化反応生成物を得る工程を含む、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法。
  4. 請求項３に記載の方法を実施して得られた糖のエピメリ化反応生成物を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
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CN114934062B (zh) * 2022-07-01 2023-09-01 四川盈嘉合生科技有限公司 一种高效表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌及应用

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