JP6851967B2 - トランスガラクトシル化活性を有する酵素を用いてガラクトースとフルクトース部分とを含むサッカリドを生成する方法 - Google Patents

トランスガラクトシル化活性を有する酵素を用いてガラクトースとフルクトース部分とを含むサッカリドを生成する方法 Download PDF

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Description

本発明は、酵素を使用してサッカリド（限定されないが特にラクツロースまたはラクトスクロース）を生成する方法に関する。
ラクツロース（４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−Ｄ−フルクトフラノース）は、単糖であるフルクトースおよびガラクトースそれぞれ１分子から形成される二糖である。このラクツロースは緩下剤として使用されており、なぜならば、このラクツロースはヒトの腸で吸収されずヒト酵素で分解もされず、そのため、経過の大部分を通じて消化ボーラス（ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｂｏｌｕｓ）中にとどまり、浸透により水が保持されてより柔らかくなり、便が通りやすくなるからである。このラクツロースは結腸中で二次的な緩下剤効果を有しており、腸管内菌叢により発酵される。
ラクツロースは、味覚を改善し、腸の健康を改善し、腸内通過時間を早めるための食品添加剤として一般に使用されている。ラクツロースは、多くのその他の食品と同様に、限定された副作用で良好に許容されることが知られている。ラクツロースは、肝疾患の合併症である慢性の便秘および肝性脳症の処置で使用される。
Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２００４，５２，６９８３−６９９０で説明されているように、世界的規模でのチーズ生産の結果、毎年数百万トンの量でラクトースが乳清中に蓄積しており、この残留量は、乳清の廃棄による環境問題の増大を引き起こす。従って、ラクトースの代替の利用方法を開発することは商業的に興味深い。
ラクトースからラクツロースを合成する方法（化学的および酵素的の両方）は当分野で既知である。例えば、上記のＭａｙｅｒ他らの論文では、酵素ＣｅｌＢ（パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のα−グリコシダーゼ）およびアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のβ−ガラクトシダーゼを使用する、フルクトースの存在下でのラクトースの生物変換が説明されている。このプロセスは、１７、３４、６８、１３６、１９４および２７２ｇ／Ｌのラクトース濃度ならびに１８、９０、１４４、１８０、２７０および３６０ｇ／Ｌのフルクトース濃度で実行された。
しかしながら、Ｍａｙｅｒ他のプロセスにより達成されたラクツロースの収量は低く、ラクツロースの最大濃度は３．４ｇ／Ｌであり、加えた糖の総量（即ちラクトース出発物質およびフルクトース出発物質の総重量）を元に算出された２．７重量％の収率と等しい。具体的には、最低のフルクトース濃度で達成された収量は非常に低く、このことは、このフルクトース濃度ではラクトースの加水分解が優勢なためである。加えて、ＣｅｌＢ酵素は１０５℃の最適温度では熱安定性であり、工業プロセスにおいてＣｅｌＢ酵素を完全に不活性化することは困難である。
更に、上記Ｍａｙｅｒ他の論文で説明されている合成プロセスはｐＨ５．０で実施される。このｐＨで実施されるプロセスは、乳組成物中においてｉｎ ｓｉｔｕで実行するには不適切なはずであり、なぜならば、このｐＨは、乳中のカゼインがゲルを形成し始め、その結果、乳組成物の粘度が増加する典型的なレベルである５．５未満だからである。
Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４，６４，７８７−７９３には、β−ガラクトシダーゼが生成される透過性クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）細胞による、ラクトースおよびフルクトースからのラクツロースの酵素的製造が説明されている。このプロセスでは、ラクトース３０重量／体積％〜４０重量／体積％（３００〜４００ｇ／Ｌに相当する）と、１０重量／体積％〜２０重量／体積％（１００ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌに相当する）の濃度のフルクトースとが使用された。達成された収量も低く、４０重量／体積％のラクトースおよび２０重量／体積％のフルクトースを使用するプロセスでは、加えた糖の総量に基づいて算出された３．３３重量％のラクツロースの収率と等しい２０ｇ／Ｌのラクツロースが製造された。
Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，３９，９０３−９０８には、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）由来の熱安定性β−ガラクトシダーゼによる、ラクトースおよびフルクトースからのラクツロースの酵素的製造が説明されている。このプロセスでは、最低で１５重量／体積％のラクトース（１５０ｇ／Ｌに相当する）と、最低で１５重量／体積％のフルクトース（１５０ｇ／Ｌに相当する）とが使用された。達成された収量も低く、このプロセスにより、加えた糖の総量に基づいて算出された８．３３重量％のラクツロースの収率と等しい５０ｇ／Ｌのラクツロースが製造された。
Ｖａｈｅｒｉ ａｎｄ Ｋａｕｐｐｉｎｅｎ，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｆｅｎｎｉｃａ，１９７８，８７，７５−８３にも、様々な異なるβ−ガラクトシダーゼを使用する、ラクトースおよびフルクトースからのラクツロースの酵素的製造が説明されている。これらの方法により達成された収量も不十分であり、１２％（重量／体積）のラクトースおよび２０％（重量／体積）のフルクトースから出発して、達成された最大ラクツロース濃度は、加えた糖の総量に基づいて算出された２．８％の収率と等しい９ｇ／Ｌであった。
Ｆｏｅｒｓｔｅｒ−Ｆｒｏｍｍｅ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄａｉｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１１，２１，９４０−９４８にも、β−ガラクトシダーゼ酵素を使用してラクトースおよびフルクトースからラクツロースを製造する方法が説明されている。この文献で説明されているプロセスでは、９０ｇ／Ｌのフルクトースが使用される。しかしながら、このプロセスは、ラクツロースのビフィドジェニック効果（ｂｉｆｉｄｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）を試験するための予備的研究であり、この高濃度のフルクトースは、商品を許容できないほど甘くするだろう。
Ｇｕｅｒｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｔａｌ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２０１１，７２，２０６−２１２には、３種の異なる市販のβ−ガラクトシダーゼを使用する、ラクトースおよびフルクトースからのラクツロースの酵素的製造が説明されている。しかしながら、この文献で説明されているプロセスの大部分はｐＨ４．５で実行される。Ｍａｙｅｒ他に関して上記に記載したのと同様の理由で、このｐＨで実行されるプロセスは、乳組成物中においてｉｎ ｓｉｔｕで実行するには不適切であろう。５．５超のｐＨで実行される、この文献で説明されているプロセスでは、１：１のラクトース：フルクトースのモル比で合計５０重量／重量％の糖（ラクトースおよびフルクトース両方とも０．９５７ｍｏｌ／Ｌに相当する）が使用された。
Ａｄａｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ Ｐａｐ．２００９，６３，１１１−１１６には、２種の異なる市販のβ−ガラクトシダーゼを使用する、ラクトースおよびフルクトースからのラクツロースおよびガラクト−オリゴ糖の酵素的製造が説明されている。この方法は一般に、乳清の限外ろ過後の透過物（ｐｅｒｍｅａｔｅ）の溶液中で実行される。しかしながら、この文献で開示されている方法では、最低で１００ｇ／Ｌのラクトースが使用される。
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３，９７，６１６７−６１８０はラクツロースの酵素的製造に関する文献の総説であり、上記のＡｄａｍｃｚａｋ他およびＧｕｅｒｒｅｒｏ他の論文を参照する。
従って、先行技術の方法は、そのような酵素的方法を使用して達成可能なラクツロースの収量は不十分であり、特に低フルクトース濃度で不十分であることを教示する。より高いフルクトース濃度で収量は改善され得るが、そのような高濃度では、製品が商業的に許容される甘味レベルを超える。従って、当分野では、高濃度のフルクトースの使用を必要とすることなく、先行技術で可能であったのと比べて良好な収量でラクツロースを製造する酵素的方法が必要とされている。
ラクトスクロース（β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−フルクトフラノース）は、ヒトにより消化されず、プレバイオティックと認識される別のオリゴ糖である。アレルギー疾患の予防、がんリスクの低減およびカルシウム吸収の増強等のその他の健康上の利点も説明されている（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｙ．；ｅｔ ａｌ．．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００７，７１，２７６６−２７７３およびＴｅｒａｍｏｔｏ，Ｆ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．２００６，５２，３３７−３４６を参照されたい）。ラクトスクロースの健康上の利点および有利な特性により、ラクトスクロースの食品成分としての使用が急速に増大しており、特に欧州および日本で急速に増大している。
Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２００９，５７には、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来のβ−ガラクトシダーゼ酵素を使用する、スクロースおよびラクトースからのラクトスクロースの酵素的製造が説明されている。しかしながら、この論文で使用される方法では全て、最低で３０重量／体積％のスクロースおよびラクトースが使用される。更に、Ｌｉ他は、そのような高濃度のスクロースおよびラクトースが、トランスガラクトシル化が働くのを可能にするために必要であることを示していると思われ、より低濃度のスクロースおよび／またはスクロースでは、これらの二糖の加水分解が優性であると予想されるだろう。
Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９，１９（１０），１１５３−１１６０にも、スクロースおよびラクトースからのラクトスクロースの酵素的製造が説明されている。しかしながら、使用される酵素はレバンスクラーゼであり、このレバンスクラーゼはフルクトシルトランスフェラーゼ酵素である。
Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ２００４，６０，２６０１−２６０８には、ウシ精巣由来のβ−ガラクトシダーゼを使用する、スクロースおよびラクトースからのラクトスクロースの位置異性体であるβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−フルクトフラノースならびにその他の三糖および四糖の酵素的製造が説明されている。しかしながら、この文献で説明されている方法は全て、ｐＨ４．３で実行される。Ｍａｙｅｒ他に関して上記に記載したのと同様の理由で、このｐＨで実行されるプロセスは、乳組成物中においてｉｎ ｓｉｔｕで実行するには不適切であろう。
Ｆａｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ２００３，５，６９９−７０６には、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来のβ−ガラクトシダーゼ酵素を使用する、スクロースおよびラクトースからのラクトスクロースならびにその他の三糖および四糖の酵素的製造が説明されている。しかしながら、ラクトスクロースを生成するためにこの論文で使用される方法では、最低で０．５ｍｏｌ／Ｌのラクトースが使用される。
上記に示したように、先行技術の方法は、高濃度のスクロースおよびラクトースが、トランスガラクトシル化が働くのを可能にするために必要であることを教示しており、より低濃度のラクトースおよび／またはスクロースでは、これらの二糖の加水分解が優性であると予想されるだろう。
本発明は、ガラクトース部分とフルクトース部分とを含むサッカリドを生成する方法であって、
（ａ）ガラクトース部分がフルクトース部分に連結されており、または
（ｂ）ガラクトース部分とフルクトース部分とがガラクトースまたはフルクトース以外の少なくとも１個の単糖部分により離れており、
この方法が、
ガラクトース部分を含む第１のサッカリドとフルクトース部分を含む第２のサッカリドとを接触させることであり、第１のサッカリドと第２のサッカリドとが異なり、フルクトース部分を含む第２のサッカリドへのガラクトース部分の転移を触媒することができる酵素の存在下で接触させること
を含み、
この方法を５．５〜９．５のｐＨで実行し、
但し、
（ｉ）ガラクトース部分がフルクトース部分に連結されている場合、第１のサッカリドの濃度が０．４３ｍｏｌ／Ｌ未満であり、第２のサッカリドの濃度が０．８ｍｏｌ／Ｌ未満であり、
（ｉｉ）ガラクトース部分とフルクトース部分とがガラクトースまたはフルクトース以外の少なくとも１個の単糖部分により離れている場合、第１のサッカリドの濃度および／または第２のサッカリドの濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌ未満である、方法を提供する。
本発明はまた、ガラクトース部分とフルクトース部分とを含むサッカリドを生成する方法であって、
（ａ）ガラクトース部分がフルクトース部分に連結されており、または
（ｂ）ガラクトース部分とフルクトース部分とがガラクトースまたはフルクトース以外の少なくとも１個の単糖部分により離れており、
この方法が、
ガラクトース部分を含む第１のサッカリドとフルクトース部分を含む第２のサッカリドとを接触させることであり、第１のサッカリドと第２のサッカリドとが異なり、フルクトース部分を含む第２のサッカリドへのガラクトース部分の転移を触媒することができる酵素の存在下で接触させること
を含み、
酵素が、
ａ）配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、最大で９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｂ）少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、
ｉ）配列番号１のポリペプチドをコードする配列番号９に含まれる核酸配列、または
ｉｉ）ｉ）の相補鎖
とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
からなる群から選択される、方法を提供する。
一態様では、本発明は、ガラクトース部分がフルクトース部分に連結されているサッカリドを生成する方法であって、
ガラクトース部分を含む第１のサッカリドと、フルクトース部分を含む第２のサッカリドとを接触させることであり、第１のサッカリドと第２のサッカリドとが異なり、フルクトース部分を含む第２のサッカリドへのガラクトース部分の転移を触媒することができる酵素の存在下で接触させること
を含み、
この方法を５．５〜９．５のｐＨで実行し、
第１のサッカリドの濃度が０．４３ｍｏｌ／Ｌ未満であり、
第２のサッカリドの濃度が０．８ｍｏｌ／Ｌ未満である、方法を提供する。
一態様では、本発明は、ガラクトース部分がフルクトース部分に連結されているサッカリドを生成する方法であって、
ガラクトース部分を含む第１のサッカリドとフルクトース部分を含む第２のサッカリドとを接触させることであり、第１のサッカリドと第２のサッカリドとが異なり、フルクトース部分を含む第２のサッカリドへのガラクトース部分の転移を触媒することができる酵素の存在下で接触させること
を含み、
第２のサッカリドの濃度が０．０８３〜０．４７２ｍｏｌ／Ｌである、方法を提供する。
別の態様では、ガラクトース部分がフルクトース部分に連結されているサッカリドを生成する方法であって、
ガラクトース部分を含む第１のサッカリドとフルクトース部分を含む第２のサッカリドとを接触させることであり、第１のサッカリドと第２のサッカリドとが異なり、フルクトース部分を含む第２のサッカリドへのガラクトース部分の転移を触媒することができる酵素の存在下で接触させること
を含み、
酵素が、
ａ）配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、最大で９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｂ）少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、
ｉ）配列番号１のポリペプチドをコードする配列番号９に含まれる核酸配列、または
ｉｉ）ｉ）の相補鎖
とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
からなる群から選択される、方法が提供される。
更なる態様では、本発明の方法により得られるラクツロース含有組成物が提供される。
更なる態様では、ラクツロースを生成するための、上記で定義した酵素の使用が提供される。この酵素を、ガラクトース部分がフルクトース部分に連結されているその他のサッカリドの生成に使用することもできる。
一態様では、ガラクトース部分とフルクトース部分とを含むサッカリドを生成する方法であって、ガラクトース部分とフルクトース部分とがガラクトースまたはフルクトース以外の少なくとも１個の単糖部分により離れており、
この方法が、
ガラクトース部分を含む第１のサッカリドとフルクトース部分を含む第２のサッカリドとを接触させることであり、第１のサッカリドと第２のサッカリドとが異なり、フルクトース部分を含む第２のサッカリドへのガラクトース部分の転移を触媒することができる酵素の存在下で接触させること
を含み、
第１のサッカリドの濃度および／または第２のサッカリドの濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌ未満である、方法が提供される。
別の態様では、ガラクトース部分とフルクトース部分とを含むサッカリドを生成する方法であって、ガラクトース部分とフルクトース部分とがガラクトースまたはフルクトース以外の少なくとも１個の単糖部分により離れており、
この方法が、
ガラクトース部分を含む第１のサッカリドとフルクトース部分を含む第２のサッカリドとを接触させることであり、第１のサッカリドと第２のサッカリドとが異なり、フルクトース部分を含む第２のサッカリドへのガラクトース部分の転移を触媒することができる酵素の存在下で接触させること
を含み、
酵素が、
ａ）配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、最大で９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｂ）少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、
ｉ）配列番号１のポリペプチドをコードする配列番号９に含まれる核酸配列、または
ｉｉ）ｉ）の相補鎖
とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
からなる群から選択される、方法が提供される。
更なる態様では、ラクトスクロースを生成するための、上記で定義した酵素の使用が提供される。
利点および驚くべき発見
本発明者らは、驚いたことに、ガラクトース部分がフルクトース部分に連結されているサッカリド（具体的にはラクツロース）を、ガラクトース含有サッカリド（具体的にはラクトース）とフルクトース含有サッカリド（具体的にはフルクトース）とから、たとえフルクトース含有サッカリドの濃度が低くても高収率で生成することができることを発見した。このことは先行技術の教示に反しており、なぜならば、フルクトースが酵素的サッカリド縮合反応における良好なアクセプターではないことが一般に知られているからである。具体的には、低フルクトース濃度では、酵素によって触媒される主な反応はラクトースの加水分解および／またはガラクトオリゴ糖の生成であろうと予想され、平衡状態をラクツロースの形成へと傾けるにはフルクトースが（製品が商業的に許容される甘味レベルを超える）高濃度で存在する必要があると考えられているからである。
本発明者らはまた、驚いたことに、ガラクトース部分とフルクトース部分とを含むサッカリドであって、少なくとも１個のその他の単糖部分がガラクトース部分とフルクトース部分とを離している、サッカリド（具体的にはラクトスクロース）を、ガラクトース含有サッカリド（具体的にはラクトース）とフルクトース含有サッカリド（具体的にはスクロース）とから、たとえいずれかのサッカリドの濃度が低くても高収率で生成することができることも発見した。このことは先行技術の教示に反しており、なぜならば、低ラクトース濃度および／または低スクロース濃度では、酵素によって触媒される主な反応はラクトースおよび／またはスクロースの加水分解であろうと予想されており、平衡状態をラクトスクロースの形成へと傾けるにはラクトースまたはスクロースが高濃度で存在する必要があると考えられているからである。
４．８％（重量／体積）のラクトースと様々な濃度のフルクトースとで開始する本発明の方法により製造されるラクツロースの量を説明するグラフである。 ７．０％（重量／体積）のラクトースと様々な濃度のフルクトースとで開始する本発明の方法により製造されるラクツロースの量を示すグラフである。 ９．０％（重量／体積）のラクトースと様々な濃度のフルクトースとで開始する本発明の方法により製造されるラクツロースの量を示すグラフである。 反応の４時間後の、酵素的に生成された糖混合物を示すクロマトグラムである。１：３０．３分でのラクトース、２：３２．１分での４−ラクツロース、３：ラクツロース異性体反応生成物３４．５分、４：３６．７でのグルコース、および５：３９．７分でのガラクトース、フルクトース。 実施例３で説明する方法により生成されたラクトスクロースの１００μｇ／ｍｌ溶液の抽出イオンクロマトグラム（ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）（ＥＩＣ）の一例を示す図であり、未標識のラクトスクロース（Ｈｅｘ−ＤＰ３）（上部、黒色）を示し、続いて２時間の生体内変換および１０倍希釈の後に採取した試料中のガラクト１３Ｃ１２−Ｈｅｘ−ＤＰ３〜ＤＰ６オリゴマー（ラクトスクロースＧａｌ−Ｇｌｕ−Ｆｒｕ、ガラクトシル−ラクトスクロースＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｕ−Ｆｒｕ、ジガラクトシル−ラクトスクロースＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｕ−Ｆｒｕおよびトリガラクトシル−ラクトスクロースＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｕ−Ｆｒｕ）のＥＩＣを示す。 生体内変換期間中でのプロファイルの変化を示す１３Ｃ１２−Ｈｅｘ−ＤＰ３〜６オリゴマーの組み合わされた抽出イオンクロマトグラムであり、９．３〜１３．０分の挿入図は、ｔ＝２時間試料での１３Ｃ１２−Ｈｅｘ−ＤＰ３オリゴマーと比べて大きい最大存在およびその後の試料での量の減少を示す。
配列表
配列番号１（本明細書では（ＢＩＦ＿９１７）とも称する）は、配列番号２２の８８７アミノ酸切断断片である。
配列番号２（本明細書では（ＢＩＦ＿９９５）とも称する）は、配列番号２２の９６５アミノ酸切断断片である。
配列番号３（本明細書では（ＢＩＦ＿１０６８）とも称する）は、配列番号２２の１０３８アミノ酸切断断片である。
配列番号４（本明細書では（ＢＩＦ＿１１７２）とも称する）は、配列番号２２の１１４２アミノ酸切断断片である。
配列番号５（本明細書では（ＢＩＦ＿１２４１）とも称する）は、配列番号２２の１２１１アミノ酸切断断片である。
配列番号６（本明細書では（ＢＩＦ＿１３２６）とも称する）は、配列番号２２の１２９６アミノ酸切断断片である。
配列番号７は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）グリコシドヒドロラーゼ触媒コアである。
配列番号８は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＳＭ２０２１５由来の細胞外ラクターゼをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号９は、ＢＩＦ＿９１７をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、ＢＩＦ＿９９５をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１１は、ＢＩＦ＿１０６８をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１２は、ＢＩＦ＿１１７２をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１３は、ＢＩＦ＿１２４１をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１４は、ＢＩＦ＿１３２６をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１５は、上記のＢＩＦ変異体を生成するためのフォワードプライマーである。
配列番号１６は、ＢＩＦ９１７のためのリバースプライマーである。
配列番号１７は、ＢＩＦ９９５のためのリバースプライマーである。
配列番号１８は、ＢＩＦ１０６８のためのリバースプライマーである。
配列番号１９は、ＢＩＦ１２４１のためのリバースプライマーである。
配列番号２０は、ＢＩＦ１３２６のためのリバースプライマーである。
配列番号２１は、ＢＩＦ１４７８のためのリバースプライマーである。
配列番号２２は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＳＭ２０２１５由来の細胞外ラクターゼである。
配列番号２３は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＳＭ２０２１５由来の細胞外ラクターゼのシグナル配列である。
詳細な説明
本発明の方法は概して、ガラクトース部分を含む第１のサッカリドとフルクトース部分を含む第２の異なるサッカリドとを接触させることであって、その結果、ガラクトース部分が第１のサッカリドから第２のサッカリドへと転移され、ガラクトース部分とフルクトース部分とを含む生成物サッカリドが生成される、接触させることを含む。一実施形態では、ガラクトース部分はフルクトース部分に連結されている。別の実施形態では、ガラクトース部分とフルクトース部分とがガラクトースまたはフルクトース以外の少なくとも１個の単糖部分（グルコースが挙げられるがこれに限定されない）により離れている。下記の段落において、第１のサッカリドを「ドナー」とも称し、第２のサッカリドを「アクセプター」とも称する。
サッカリド
本明細書では、最も広い意味での用語「サッカリド」は、天然に存在するおよび合成のおよび半合成のサッカリド等の全てのサッカリド（糖）を包含するように意図されている。この用語には、単糖（即ち、より単純な糖へと加水分解され得ないサッカリド）、二糖（即ち、グリコシド結合により互いに連結されている２個の単糖単位（部分）を有する化合物）、オリゴ糖（即ち、分枝鎖または非分枝鎖または環（任意選択でサッカリド側鎖を有する）でグリコシド結合により互いに連結されている３〜１０個の単糖単位を有する化合物）、および多糖（即ち、分枝鎖または非分枝鎖または環（任意選択でサッカリド側鎖を有する）でグリコシド結合により互いに連結されている１０個超の単糖単位を有する化合物）が包含される。
このサッカリドはその他の分子に結合していてもよく、例えば生体分子（例えばペプチド／タンパク質、脂質および核酸）に結合していてもよい。しかしながら、本発明の目的のためには、このサッカリドは単糖単位のみから形成されていることが好ましい。
一実施形態では、このサッカリドは単糖であり、即ち、より単純な糖へと加水分解され得ないサッカリドである。この単糖はＤ−立体配置を有してもよいしＬ−立体配置を有してもよく、アルドースであってもよいしケトースであってもよい。単糖の例として、ヘキソース、例えばアルドヘキソース、例えばグルコース、ガラクトース、アロース、アルトロース、マンノース、グロース、イドースおよびタロース、ならびにケトヘキソース、例えばフルクトース、タガトース、プシコースおよびソルボース、ならびにペントース（この例として、アルドペントース、例えばリボース、アラビノース、キシロースおよびリキソースが挙げられる）、ならびにケトペントース、例えばリブロースおよびキシルロースが挙げられる。
代替実施形態では、このサッカリドは高級サッカリド（ｈｉｇｈｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）であり、即ち、グリコシド結合により互いに連結されている複数個の単糖部分を含むサッカリドであって、このサッカリドの構成単糖へと概して加水分解可能であるサッカリドである。そのような高級サッカリドの例として、二糖（２個の単糖部分）、オリゴ糖（３〜１０個の単糖部分）および多糖（１０個超の単糖部分）が挙げられる。これに関して、この高級サッカリドを形成する単糖部分は同一であってもよいし異なっていてもよく、それぞれ独立してＤ−立体配置を有してもよいしＬ−立体配置を有してもよく、それぞれ独立してアルドース部分であってもよいしケトース部分であってもよい。
この高級サッカリドを形成する単糖単位は同数の炭素原子を有してもよいし異なる数の炭素原子を有してもよい。一実施形態では、この高級サッカリドの単糖部分はヘキソース部分であり、このヘキソース部分の例として、アルドヘキソース、例えばグルコース、ガラクトース、アロース、アルトロース、マンノース、グロース、イドースおよびタロース、ならびにケトヘキソース、例えばフルクトース、タガトース、プシコースおよびソルボースが挙げられる。別の実施形態では、この高級サッカリドの単糖部分は、アルドペントース部分、例えばリボース、アラビノース、キシロースおよびリキソースならびにケトペントース、例えばリブロースおよびキシルロースである。
この高級サッカリドを形成する単糖部分はグリコシド結合により互いに連結されている。これらの単糖部分がヘキソース部分である場合、グリコシド結合は、１，４’−グリコシド結合（１，４’−α−グリコシド結合であってもよいし１，４’−β−グリコシド結合であってもよい）、１，６’−グリコシド結合（１，６’−α−グリコシド結合であってもよいし１，６’−β−グリコシド結合であってもよい）、１，２’−グリコシド結合（１，２’−α−グリコシド結合であってもよいし１，２’−β−グリコシド結合であってもよい）もしくは１，３’−グリコシド結合（１，３’−α−グリコシド結合であってもよいし１，３’−β−グリコシド結合であってもよい）またはこれらの任意の組合せであることができる。
一実施形態では、この高級サッカリドは２個の単糖単位を含む（即ち二糖である）。二糖の例として、ラクトース、ガラクトビオース、マルトース、セロビオース、スクロース、トレハロース、イソマルツロースおよびトレハルロースが挙げられる。別の実施形態では、この高級サッカリドは３〜１０個の単糖単位を含む（即ちオリゴ糖である）。
第１のサッカリド（ドナー）
第１のサッカリドは、フルクトース含有サッカリドに転移され得るガラクトース部分を含むあらゆるサッカリドであることできる。本発明では、第１のサッカリドは、転移されるガラクトース部分がグリコシド結合により１個または複数個のその他の単糖部分（上記で定義しているおよび例示している）に連結されている高級サッカリドである。
一実施形態では、第１のサッカリドはラクトースである。
一実施形態では、第１のサッカリドはガラクトオリゴ糖である。ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）は、グリコシド結合により連結されているガラクトース部分の短鎖（典型的には２〜１０個のガラクトース部分）からなる。一実施形態では、ＧＯＳはガラクトース部分のみを含むことができ、即ち一般式（Ｇａｌ）ｎを有することができ、この一般式中、ｎは概して２〜１０であり、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、例としてガラクトビオース（Ｇａｌ−Ｇａｌ）、ガラクトトリオース（Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ）、ガラクトテトラオース（Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ）、ガラクトペンタオース（Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ）および同類のものが挙げられる。一実施形態では、ＧＯＳは、異なる単糖部分（上記で定義しており、および例示しており、特にグルコース部分）で終わるガラクトース部分の鎖を含むことができ、即ち一般式（Ｇａｌ）ｎ−Ｇｌｕを有することができ、この一般式中、ｎは概して２〜１０であり、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、具体例として、ガラクトビオシルグルコース（Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｕ）、ガラクトトリオシルグルコース（Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｕ）および同類のものが挙げられる。
第１のサッカリドは、測定可能な量のガラクトース部分が転移されるのを可能にするのに十分な量で存在する。正確な濃度は第１のサッカリドの性質に応じて変化する。一部の実施形態（具体的には、最終生成物においてガラクトース部分とフルクトース部分とが連結されている実施形態）では、第１のサッカリドの濃度は０．０１〜１０ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．０２〜５ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．０５〜２ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．１〜１ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．５ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４９ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４８ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４７ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４６ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４５ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４４ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４３ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４２ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４１ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３９ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３８ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３７ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３６ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３５ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３４ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３３ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３２ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３１ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．０８８〜０．３８０ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．１１７〜０．２９２ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．１３２〜０．２７７ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．１３２〜０．１６０ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．１９０〜０．２２０ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．２４９〜０．２７７ｍｏｌ／Ｌである。
一部の実施形態（具体的には、最終生成物においてガラクトース部分とフルクトース部分とがガラクトースまたはフルクトース以外の少なくとも１個の単糖部分により離れている実施形態）では、第１のサッカリドの濃度は０．５ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．００１〜０．５ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．００５〜０．４ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．０１〜０．２５ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．０５〜０．２ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．１〜０．１５ｍｏｌ／Ｌである。
一実施形態（具体的には、最終生成物においてガラクトース部分とフルクトース部分とが連結されている実施形態）では、第１のサッカリドはラクトースであり、このラクトースの濃度は１７１．２ｇ／Ｌ（０．５ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１６７．７ｇ／Ｌ（０．４９ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１６４．３ｇ／Ｌ（０．４８ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１６０．９ｇ／Ｌ（０．４７ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１５７．５ｇ／Ｌ（０．４６ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１５４．０ｇ／Ｌ（０．４５ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１５０．６ｇ／Ｌ（０．４４ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１４７．２ｇ／Ｌ（０．４３ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１４３．８ｇ／Ｌ（０．４２ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１４０．３ｇ／Ｌ（０．４１ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１３６．２ｇ／Ｌ（０．４ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１３３．５ｇ／Ｌ（０．３９ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１３０．１ｇ／Ｌ（０．３８ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１２６．７ｇ／Ｌ（０．３７ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１２３．３ｇ／Ｌ（０．３６ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１１９．８ｇ／Ｌ（０．３５ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１１６．４ｇ／Ｌ（０．３４ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１１３．０ｇ／Ｌ（０．３３ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１０９．５ｇ／Ｌ（０．３２ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１０６．１ｇ／Ｌ（０．３１ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１０２．７ｇ／Ｌ（０．３ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば３０〜１３０ｇ／Ｌ（０．０８８〜０．３８０ｍｏｌ／Ｌ）であり、例えば４０〜１００ｇ／Ｌ（０．１１７〜０．２９２ｍｏｌ／Ｌ）であり、例えば４５〜９５ｇ／Ｌ（０．１３２〜０．２７７ｍｏｌ／Ｌ）であり、例えば４５〜５５ｇ／Ｌ（０．１３２〜０．１６０ｍｏｌ／Ｌ）であり、例えば６５〜７５ｇ／Ｌ（０．１９０〜０．２２０ｍｏｌ／Ｌ）であり、例えば８５〜９５ｇ／Ｌ（０．２４９〜０．２７７ｍｏｌ／Ｌ）である。
別の実施形態（具体的には、最終生成物においてガラクトース部分とフルクトース部分とがガラクトースまたはフルクトース以外の少なくとも１個の単糖部分により離れている実施形態）では、第１のサッカリドはラクトースであり、このラクトースの濃度は１７１．２ｇ／Ｌ（０．５ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１６７．７ｇ／Ｌ（０．４９ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１６４．３ｇ／Ｌ（０．４８ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１６０．９ｇ／Ｌ（０．４７ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１５７．５ｇ／Ｌ（０．４６ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１５４．０ｇ／Ｌ（０．４５ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１５０．６ｇ／Ｌ（０．４４ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１４７．２ｇ／Ｌ（０．４３ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１４３．８ｇ／Ｌ（０．４２ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１４０．３ｇ／Ｌ（０．４１ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１３６．２ｇ／Ｌ（０．４ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１３３．５ｇ／Ｌ（０．３９ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１３０．１ｇ／Ｌ（０．３８ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１２６．７ｇ／Ｌ（０．３７ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１２３．３ｇ／Ｌ（０．３６ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１１９．８ｇ／Ｌ（０．３５ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１１６．４ｇ／Ｌ（０．３４ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１１３．０ｇ／Ｌ（０．３３ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１０９．５ｇ／Ｌ（０．３２ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１０６．１ｇ／Ｌ（０．３１ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１０２．７ｇ／Ｌ（０．３ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば０．００１〜０．５ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．００５〜０．４ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．０１〜０．２５ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．０５〜０．２ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．１〜０．１５ｍｏｌ／Ｌである。
第２のサッカリド（アクセプター）
第２のサッカリドは、フルクトース部分を含むおよび第１のサッカリド由来のガラクトース部分を受容することができるあらゆるサッカリドであることができる。第２のサッカリドは、グリコシド結合により１種または複数種のその他の単糖部分（上記で定義しているおよび例示している）に連結されている転移されるガラクトース部分をフルクトース部分が許容するフルクトースまたは高級サッカリドであることができる。
一実施形態では、第２のサッカリドはフルクトースである。一実施形態では、第１のサッカリドはラクトースであり、第２のサッカリドはフルクトースであり、その結果、生成されるサッカリドはラクツロースである。
一実施形態では、第２のサッカリドはスクロースである。一実施形態では、第１のサッカリドはラクトースであり、第２のサッカリドはスクロースであり、その結果、生成されるサッカリドはラクトスクロースである。
一実施形態では、第１のサッカリドはラクトースであり、第２のサッカリドはラクツロースであり、その結果、生成されるサッカリドはガラクトシル−ラクツロース（Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｒｕ）である。一実施形態では、第１のサッカリドはラクトースであり、第２のサッカリドはガラクトシル−ラクツロースであり、その結果、生成されるサッカリドは式Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｒｕである。これを繰り返して、フルクトース部分で終わる最大で１０個のガラクトース部分を有するガラクトオリゴ糖（上記で定義している）を生成することができる。
一実施形態では、第１のサッカリドはラクトースであり、第２のサッカリドはラクトスクロースであり、その結果、生成されるサッカリドはガラクトシル−ラクトスクロース（Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｕ−Ｆｒｕ）である。一実施形態では、第１のサッカリドはラクトースであり、第２のサッカリドはガラクトシル−ラクトスクロースであり、その結果、生成されるサッカリドは、ジガラクトシル−ラクトスクロース（Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｕ−Ｆｒｕ）である。一実施形態では、第１のサッカリドはラクトースであり、第２のサッカリドはジガラクトシル−ラクトスクロースであり、その結果、生成されるサッカリドは、トリガラクトシル−ラクトスクロース（Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｕ−Ｆｒｕ）である。これを繰り返して、フルクトース部分に連結されたグルコース部分で終わる最大で１０個のガラクトース部分を有するガラクトオリゴ糖（上記で定義している）を生成することができる。
一実施形態では、第２のサッカリドはフルクト−オリゴ糖（ＦＯＳ）である。ＦＯＳは、別の単糖部分（特にグルコース部分）で任意選択的に終わることができるフルクトース分子の短鎖からなる。一実施形態では、ＦＯＳはフルクトース部分のみを含むことができ、即ち一般式（Ｆｒｕ）ｎを有することができ、この一般式中、ｎは概して２〜７であり、例えば２、３、４、５、６、７であり、例として、イヌロビオース（Ｆｒｕ−Ｆｒｕ）、イヌロトリオース（Ｆｒｕ−Ｆｒｕ）およびイヌロテトラオース（Ｆｒｕ−Ｆｒｕ−Ｆｒｕ−Ｆｒｕ）が挙げられる。そのようなフルクトオリゴ糖は概して、イヌリンの分解により製造される。
一実施形態では、ＦＯＳは、一般式Ｇｌｕ−（Ｆｒｕ）ｎを有するもの等の異なる単糖部分（上記で定義しており、および例示しており、特にグルコース部分）で終わるフルクトース部分の鎖を含むことができ、この一般式中、ｎは概して１〜７であり、例えば１、２、３、４、５、６または７、８、９または１０であり、具体例として、スクロース（Ｇｌｕ−Ｆｒｕ）、ケストース（Ｇｌｕ−Ｆｒｕ−Ｆｒｕ）、ニストース（Ｇｌｕ−Ｆｒｕ−Ｆｒｕ−Ｆｒｕ）、フルクトシルニストース（Ｇｌｕ−Ｆｒｕ−Ｆｒｕ−Ｆｒｕ−Ｆｒｕ）および同類のものが挙げられる。この実施形態では、本発明の方法により、ガラクトース部分にグルコース部分またはフルクトース部分のいずれかへの結合が形成され得る。好ましくは、本発明の方法により、ガラクトース部分にグルコース部分への結合が形成される。
第２のサッカリドは、測定可能な量のガラクトース部分が転移されるのを可能にするのに十分な量で存在する。正確な濃度は、第２のサッカリドの性質に応じて変化する。一部の実施形態（具体的には、最終生成物においてガラクトース部分とフルクトース部分とが連結されている実施形態）では、第２のサッカリドの濃度は０．０１〜１０ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．０２〜５ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．０５〜２ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．１〜１ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．０２〜０．５ｍｏｌ／Ｌである。一部の実施形態では、第２のサッカリドの濃度は０．８ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．７９ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．７８ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．７７ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．７６ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．７５ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．７４ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．７３ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．７２ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．７１ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．７ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．６９ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．６８ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．６７ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．６６ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．６５ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．６４ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．６３ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．６２ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．６１ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．６ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．５９ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．５８ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．５７ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．５６ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．５５ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．５４ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．５３ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．５２ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．５１ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．５ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４９ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４８ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４７ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４６ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４５ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４４ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４３ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４２ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４１ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３９ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３８ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３７ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３６ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３５ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３４ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３３ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３２ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３１ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３ｍｏｌ／Ｌ未満である。一部の実施形態では、第２のサッカリドの濃度は０．１ｍｏｌ／Ｌ超であり、例えば０．１１ｍｏｌ／Ｌ超であり、例えば０．１２ｍｏｌ／Ｌ超であり、例えば０．１３ｍｏｌ／Ｌ超であり、例えば０．１４ｍｏｌ／Ｌ超であり、例えば０．１５ｍｏｌ／Ｌ超であり、例えば０．１６ｍｏｌ／Ｌ超であり、例えば０．１７ｍｏｌ／Ｌ超であり、例えば０．１８ｍｏｌ／Ｌ超であり、例えば０．１９ｍｏｌ／Ｌ超であり、例えば０．２ｍｏｌ／Ｌ超であり、例えば０．２１ｍｏｌ／Ｌ超であり、例えば０．２２ｍｏｌ／Ｌ超であり、例えば０．２３ｍｏｌ／Ｌ超であり、例えば０．２４ｍｏｌ／Ｌ超であり、例えば０．２５ｍｏｌ／Ｌ超であり、例えば０．２６ｍｏｌ／Ｌ超であり、例えば０．２７ｍｏｌ／Ｌ超である。一部の実施形態では、第２のサッカリドの濃度は０．０８３〜０．４７２ｍｏｌ／Ｌである。一部の実施形態では、第２のサッカリドの濃度は０．２７８〜０．４４４ｍｏｌ／Ｌである。
本発明の一部の実施形態（具体的には、最終生成物においてガラクトース部分とフルクトース部分とが連結されている実施形態）では、第２のサッカリドはフルクトースであり、このフルクトースの濃度は０．８ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．７９ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．７８ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．７７ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．７６ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．７５ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．７４ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．７３ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．７２ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．７１ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．７ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．６９ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．６８ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．６７ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．６６ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．６５ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．６４ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．６３ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．６２ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．６１ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．６ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．５９ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．５８ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．５７ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．５６ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．５５ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．５４ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．５３ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．５２ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．５１ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．５ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４９ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４８ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４７ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４６ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４５ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４４ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４３ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４２ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４１ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．４ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３９ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３８ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３７ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３６ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３５ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３４ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３３ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３２ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３１ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．３ｍｏｌ／Ｌ未満である。一部の実施形態では、フルクトースの濃度は１５〜８５ｇ／Ｌ（０．０８３〜０．４７２ｍｏｌ／Ｌ）であり、例えば２０〜８０ｇ／Ｌ（０．１１１〜０．４４４ｍｏｌ／Ｌ）であり、例えば４５〜８５ｇ／Ｌ（０．２５〜０．４７２ｍｏｌ／Ｌ）であり、例えば５０〜８０ｇ／Ｌ（０．２７８〜０．４４４ｍｏｌ／Ｌ）であり、例えば４５〜５５ｇ／Ｌ（０．２５〜０．３０６ｍｏｌ／Ｌ）であり、例えば５５〜６５ｇ／Ｌ（０．３０６〜０．３６１ｍｏｌ／Ｌ）であり、例えば６５〜７５ｇ／Ｌ（０．３６１〜０．４１７ｍｏｌ／Ｌ）であり、例えば７５〜８５ｇ／Ｌ（０．４１７〜０．４７２ｍｏｌ／Ｌ）である。驚いたことに、たとえフルクトースがこのように低濃度であってもガラクトース部分のフルクトースへの酵素的転移が起こり得ることを発見した。このことは先行技術の教示に反しており、なぜならば、低濃度のフルクトースでは、酵素によって触媒される主な反応はその他の反応（典型的には第１のサッカリドの加水分解および／またはガラクトオリゴ糖の生成）であろうと予想されていたからである。
一部の実施形態（具体的には、最終生成物においてガラクトース部分とフルクトース部分とがガラクトースまたはフルクトース以外の少なくとも１個の単糖部分により離れている実施形態）では、第２のサッカリドの濃度は０．５ｍｏｌ／Ｌ未満であり、例えば０．００１〜０．５ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．００５〜０．４ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．０１〜０．３５ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．１〜０．３ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．１５〜０．２ｍｏｌ／Ｌである。
一部の実施形態（具体的には、最終生成物においてガラクトース部分とフルクトース部分とがガラクトースまたはフルクトース以外の少なくとも１個の単糖部分により離れている実施形態）では、第２のサッカリドはスクロースであり、このスクロースの濃度は０．５ｍｏｌ／Ｌ未満であり、１７１．２ｇ／Ｌ（０．５ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１６７．７ｇ／Ｌ（０．４９ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１６４．３ｇ／Ｌ（０．４８ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１６０．９ｇ／Ｌ（０．４７ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１５７．５ｇ／Ｌ（０．４６ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１５４．０ｇ／Ｌ（０．４５ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１５０．６ｇ／Ｌ（０．４４ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１４７．２ｇ／Ｌ（０．４３ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１４３．８ｇ／Ｌ（０．４２ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１４０．３ｇ／Ｌ（０．４１ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１３６．２ｇ／Ｌ（０．４ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１３３．５ｇ／Ｌ（０．３９ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１３０．１ｇ／Ｌ（０．３８ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１２６．７ｇ／Ｌ（０．３７ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１２３．３ｇ／Ｌ（０．３６ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１１９．８ｇ／Ｌ（０．３５ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１１６．４ｇ／Ｌ（０．３４ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１１３．０ｇ／Ｌ（０．３３ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１０９．５ｇ／Ｌ（０．３２ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１０６．１ｇ／Ｌ（０．３１ｍｏｌ／Ｌ）未満であり、例えば１０２．７ｇ／Ｌ（０．３ｍｏｌ／Ｌ）未満である。一部の実施形態では、スクロースの濃度は３．４ｇ／Ｌ（０．０１ｍｏｌ／Ｌ）超であり、例えば６．８ｇ／Ｌ（０．０２ｍｏｌ／Ｌ）超であり、例えば１０．３ｇ／Ｌ（０．０３ｍｏｌ／Ｌ）超であり、例えば１３．７ｇ／Ｌ（０．０４ｍｏｌ／Ｌ）超であり、例えば１７．１ｇ／Ｌ（０．０５ｍｏｌ／Ｌ）超であり、例えば２０．５ｇ／Ｌ（０．０６ｍｏｌ／Ｌ）超であり、例えば２４．０ｇ／Ｌ（０．０７ｍｏｌ／Ｌ）超であり、例えば２７．３ｇ／Ｌ（０．０８ｍｏｌ／Ｌ）超であり、例えば３０．８ｇ／Ｌ（０．０９ｍｏｌ／Ｌ）超であり、例えば３４．２ｇ／Ｌ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）超であり、例えば３７．７ｇ／Ｌ（０．１１ｍｏｌ／Ｌ）超であり、例えば４１．１ｇ／Ｌ（０．１２ｍｏｌ／Ｌ）超であり、例えば４４．５ｇ／Ｌ（０．１３ｍｏｌ／Ｌ）超であり、例えば４７．９ｇ／Ｌ（０．１４ｍｏｌ／Ｌ）超であり、例えば５１．３ｇ／Ｌ（０．１５ｍｏｌ／Ｌ）超であり、例えば０．００１〜０．５ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．００５〜０．４ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．０１〜０．３５ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．１〜０．３ｍｏｌ／Ｌであり、例えば０．１５〜０．２ｍｏｌ／Ｌである。
酵素
本発明で使用する酵素は、ガラクトースを含有する第１のサッカリド（特にラクトース）からフルクトースを含有する第２のサッカリド（特にフルクトース）へのガラクトース部分の転移を触媒することができる限り、特に限定されない。ガラクトース含有サッカリドから水以外の分子（具体的には第２のサッカリド）へのガラクトース部分の転移を触媒することができる酵素は一般に、「トランスガラクトシラーゼ」と称される。トランスガラクトシル化活性を、国際公開第２０１３／１８２６８６号パンフレットで説明されているＨＰＬＣ定量アッセイまたは酵素アッセイにより測定することができる。
この酵素は、この酵素のトランスガラクトシダーゼ活性に加えて、その他の副活性を有してもよい。典型的な副活性として、サッカリド加水分解活性（例えば、サッカリド（特に、ガラクトースを含有する第１のサッカリドおよび／またはフルクトースを含有する第２のサッカリド）中のグリコシド結合を加水分解する能力）、プロテアーゼ活性、リパーゼ活性、ホスホリパーゼ活性が挙げられる。好ましくは、この酵素の相対トランスガラクトシラーゼ活性は、この酵素の総活性の少なくとも５０％を占めており、例えば少なくとも６０％を占めており、例えば少なくとも７０％を占めており、例えば少なくとも７５％を占めており、例えば少なくとも８０％を占めており、例えば少なくとも８５％を占めており、例えば少なくとも９０％を占めており、例えば少なくとも９５％を占めており、例えば少なくとも９７％を占めており、例えば少なくとも９８％を占めており、例えば少なくとも９９％を占めている。本文脈において、用語「トランスガラクトシル化活性」は、ガラクトース部分の水以外の分子への転移を意味する。この活性を、反応中の任意の時点で生成される［グルコース］−［ガラクトース］として、または反応中の任意の時点で生成されるＧＯＳの直接的定量により、測定することができる。次いで、相対トランスガラクトシル化活性を、（［グルコース］−［ガラクトース］）／［グルコース］×１００として算出することができる。グルコースおよびガラクトースの濃度を測定する手段は当業者に既知である、または国際公開第２０１３／１８２６８６号パンフレットで既知である。
一実施形態では、この酵素はβ−ガラクトシダーゼである。β−ガラクトシダーゼは、β−ガラクトシドの単糖への加水分解を触媒するヒドロラーゼ酵素である。そのような酵素は概して、Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｅ．Ｃ．）３．２．１．２３に分類される。
一実施形態では、この酵素は細菌起源または真菌起源である。一実施形態では、この酵素は細菌起源である。一実施形態では、この酵素はビフィドバクテリア（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）起源である。一実施形態では、この酵素はビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）起源である。
一実施形態では、この酵素は、
ａ）配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドであって、最大で９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｂ）少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、ｉ）配列番号１のポリペプチドをコードする配列番号９に含まれる核酸配列またはｉｉ）ｉ）の相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
からなる群から選択される。そのような酵素は一般に開示されており、国際公開第２０１３／１８６２８６号パンフレットで具体的に開示されている。
一実施形態（具体的には、ラクツロース等の最終生成物においてガラクトース部分とフルクトース部分とが連結されている実施形態）では、酵素の濃度は、トランスガラクトシル化反応が起こる組成物１ｋｇ当たり５００〜１０，０００ユニットの酵素活性（Ｕ）が適切である。好ましくは、酵素の濃度は、この組成物１ｋｇ当たり１０００〜５０００ユニットの酵素活性（Ｕ）である。この酵素の活性のユニットを、方法４としての国際公開第２０１３／１８６２８６号パンフレットで開示されているアッセイに従って測定し、本明細書において実施例４、方法４として再現する。
一実施形態では、この反応を乳組成物中においてｉｎ ｓｉｔｕで実行する場合、酵素の濃度は、乳組成物１リットル当たり５００〜１０，０００ユニットの酵素活性（Ｕ）が適切である。好ましくは、酵素の濃度は乳組成物１リットル当たり１０００〜５０００ユニットの酵素活性（Ｕ）である。
一実施形態（具体的には、ラクトスクロース等の最終生成物においてガラクトース部分とフルクトース部分とがガラクトースまたはフルクトース以外の少なくとも１個の単糖部分により離れている実施形態）では、酵素の濃度は、トランスガラクトシル化反応が起こる組成物１ｋｇ当たり５００〜１０，０００ユニットの酵素活性（Ｕ）が適切である。好ましくは、酵素の濃度は、この組成物１ｋｇ当たり１０００〜５０００ユニットの酵素活性（Ｕ）である。この酵素の活性のユニットを、方法４としての国際公開第２０１３／１８６２８６号パンフレットで開示されているアッセイに従って測定し、本明細書において実施例４、方法４として再現する。
一実施形態では、この反応を乳組成物中においてｉｎ ｓｉｔｕで実行する場合、酵素の濃度は、乳組成物１リットル当たり５００〜１０，０００ユニットの酵素活性（Ｕ）が適切である。好ましくは、酵素の濃度は乳組成物１リットル当たり１０００〜５０００ユニットの酵素活性（Ｕ）である。
一実施形態（具体的には、ラクツロース等の最終生成物においてガラクトース部分とフルクトース部分とが連結されている実施形態）では、酵素の濃度は、トランスガラクトシル化反応が起こる組成物１ｋｇ当たり純粋な酵素タンパク質０．２〜４ｇが適切である。好ましくは、酵素の濃度は、この組成物１ｋｇ当たり純粋な酵素タンパク質０．４〜２ｇである。
この実施形態では、この反応を乳組成物中においてｉｎ ｓｉｔｕで実行する場合、酵素の濃度は、乳組成物１リットル当たり純粋な酵素タンパク質０．２〜４ｇが適切である。好ましくは、酵素の濃度は乳組成物１リットル当たり純粋な酵素タンパク質０．４〜２ｇである。
一実施形態（具体的には、ラクトスクロース等の最終生成物においてガラクトース部分とフルクトース部分とがガラクトースまたはフルクトース以外の少なくとも１個の単糖部分により離れている実施形態）では、酵素の濃度は、トランスガラクトシル化反応が起こる組成物１ｋｇ当たり純粋な酵素タンパク質０．２〜４ｇが適切である。好ましくは、酵素の濃度は、この組成物１ｋｇ当たり純粋な酵素タンパク質０．４〜２ｇである。
この実施形態では、この反応を乳組成物中においてｉｎ ｓｉｔｕで実行する場合、酵素の濃度は、乳組成物１リットル当たり純粋な酵素タンパク質０．２〜４ｇが適切である。好ましくは、酵素の濃度は乳組成物１リットル当たり純粋な酵素タンパク質０．４〜２ｇである。
一態様では、本明細書で開示されているのは、配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、前記ポリペプチドをコードする核酸を含む適切な宿主株（例えばバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））中での発現産物である場合、トランスガラクトシル化活性を示す前記核酸配列のポリペプチド発現産物のみである、ポリペプチドである。
一態様では、本明細書で開示されているのは、
ａ．配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｂ．配列番号２との少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸を含むポリペプチドであって、最大で９７５個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｃ．配列番号３との少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で１３００個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｄ．少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、ｉ）配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３に含まれる核酸配列またはｉｉ）ｉ）の相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
ｅ．配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対してまたは成熟ポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびに
ｆ．配列番号１、２、３、４または５の１個または複数個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または保存的置換を含むポリペプチド
からなる群から選択される、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドである。
別の態様では、本明細書で開示されているのは、
ａ．配列番号３との少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で１３００個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｂ．配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｃ．少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、ｉ）配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３に含まれる核酸配列またはｉｉ）ｉ）の相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
ｄ．配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対してまたは成熟ポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびに
ｅ．配列番号１、２、３、４または５の１個または複数個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または保存的置換を含むポリペプチド
からなる群から選択される、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドである。
一態様では、本明細書で開示されているのは、トランスガラクトシル化活性を有する配列番号２２のＣ末端がトランケートされた断片であるおよびバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の適切な生物中で産生された場合にタンパク質分解等の更なるトランケーションに対して安定であるおよび／または最終製剤化後の貯蔵中に更なるトランケーションに対して安定であるポリペプチドである。一態様では、本明細書で開示されているのは、配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドである。一態様では、本明細書で開示されているのは、配列番号２との少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で９７５個のアミノ酸残基からなるポリペプチドである。
一態様では、本明細書で開示されているのは、配列番号３との少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で１３００個のアミノ酸残基からなるポリペプチドである。一態様では、本明細書で開示されているのは、本明細書で開示するポリペプチドをコードすることができる核酸である。一態様では、本明細書で開示されているのは、本明細書で説明する核を含むまたは本明細書で説明するポリペプチドを発現することができる発現ベクターおよび／またはプラスミドである。一態様では、本明細書で開示されているのは、本明細書で説明するポリペプチドを発現することができる細胞である。
用語「単離（された）」は、そのポリペプチドが、その配列が天然では自然に関連していて自然に見いだされる少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含んでいないことを意味する。１つの態様では、「単離ポリペプチド」はＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定したときに、少なくとも３０％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも８０％純粋、少なくとも９０％純粋および少なくとも９５％純粋であるポリペプチドを意味する。
用語「実質的に純粋なポリペプチド」は、本明細書においてそれが自然に関連している他のポリペプチド物質を最大１０重量％、好ましくは最大８重量％、より好ましくは最大６重量％、より好ましくは最大５重量％、より好ましくは最大４重量％、最大３重量％、いっそうより好ましくは最大２重量％、最も好ましくは最大１重量％およびいっそう最も好ましくは最大０．５重量％を含有していることを意味する。このため、実質的に純粋なポリペプチドは、調製物中に存在する総ポリペプチド物質の重量に比して少なくとも９２重量％純粋、好ましくは少なくとも９４重量％純粋、より好ましくは少なくとも９５重量％純粋、より好ましくは少なくとも９６重量％純粋、より好ましくは少なくとも９７重量％純粋、より好ましくは少なくとも９８重量％純粋、いっそうより好ましくは少なくとも９９重量％純粋、最も好ましくは９９．５重量％純粋、いっそう最も好ましくは１００重量％純粋であることが好ましい。本明細書に開示したポリペプチドは、好ましくは実質的に純粋形にある。特に、ポリペプチドは、「本質的に純粋形」である、すなわちポリペプチド調製物は、それと自然に関連している他のポリペプチド物質を本質的に含んでいないことが好ましい。これは、例えば、周知の組換え法または伝統的な精製方法によってポリペプチドを調製することによって達成できる。本明細書では、用語「実質的に純粋なポリペプチド」は、用語「単離ポリペプチド」および「単離形にあるポリペプチド」と同義語である。
用語「精製（された）」または「純粋」の語は、所定の成分が高レベル状態−例えば、少なくとも約５１％純粋、例えば少なくとも５１％純粋、または少なくとも約７５％純粋、例えば少なくとも７５％純粋、または少なくとも約８０％純粋、例えば少なくとも８０％純粋、または少なくとも約９０％純粋、例えば少なくとも９０％純粋、または少なくとも約９５％純粋、例えば少なくとも９５％純粋または少なくとも約９８％純粋、例えば少なくとも９８％純粋で存在することを意味する。この成分は、望ましくは組成物中に存在する主要な活性成分である。
本発明に関連する用語「微生物」には、本発明によるヌクレオチド配列または本明細書に定義した特異性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができた任意の「微生物」およびまたはそれらから得られた生成物が含まれる。本発明の状況では、「微生物」は、ミルク基質を発酵させることのできる任意の細菌もしくは真菌を含むことができる。
本発明に関連する用語「宿主細胞」には、本明細書で定義した特異性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または上記に定義され、本明細書で定義した特異性を有するポリペプチドの製造に使用される発現ベクターのいずれかを含む任意の細胞が含まれる。１つの態様では、この製造は組換え製造である。
本発明の状況では、用語「Ｐｆａｍドメイン」は、タンパク質配列内で複数の配列アラインメントおよび隠れマルコフモチーフの存在に基づいてＰｆａｍ−ＡもしくはＰｆａｍ−Ｂのいずれかであると同定される領域を意味する（“Ｔｈｅ Ｐｆａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ”：Ｒ．Ｄ．Ｆｉｎｎ，Ｊ．Ｍｉｓｔｒｙ，Ｊ．Ｔａｔｅ，Ｐ．Ｃｏｇｇｉｌｌ，Ａ．Ｈｅｇｅｒ，Ｊ．Ｅ．Ｐｏｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｏ．Ｌ．Ｇａｖｉｎ，Ｐ．Ｇｕｎｅｓｅｋａｒａｎ，Ｇ．Ｃｅｒｉｃ，Ｋ．Ｆｏｒｓｌｕｎｄ，Ｌ．Ｈｏｌｍ，Ｅ．Ｌ．Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｓ．Ｒ．Ｅｄｄｙ，Ａ．Ｂａｔｅｍａｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１０）Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ ３８：Ｄ２１１−２２２．）。Ｐｆａｍドメインの例としては、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ（ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）および細菌性Ｉｇ様ドメイン（第４群）（ＰＦ０７５３２）を挙げることができる。
本明細書で使用する「位置に対応する１つの位置」は、本明細書で記載されるアラインメントが特定のクエリーポリペプチドと参照ポリペプチドとの間で作成されることを意味する。参照ポリペプチドにおける特定の位置に対応する位置は、次に最高配列同一性でそのアラインメント内の対応するアミノ酸に対応すると同定される。
「１つの変異体」もしくは「複数の変異体」は、ポリペプチドもしくは核酸のいずれかに関する。用語「変異体」は、用語「突然変異体」と互換的に使用される。変異体には、アミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列それぞれにおける１つ以上の場所での挿入、置換、塩基転換、切断および／または転化が含まれる。語句「変異ポリペプチド」、「ポリペプチド変異体」、「ポリペプチド」、「変異体」および「変異酵素」は、例えば配列番号１、２、３、４もしくは５などの選択されたアミノ酸配列を有するか、または配列番号１、２、３、４もしくは５などの選択されたアミノ酸配列と比較して修飾されているのいずれかであるアミノ酸配列を有するポリペプチド／タンパク質を意味する。
本明細書で使用する「参照酵素」、「参照配列」、「参照ポリペプチド」は、変異ポリペプチドのいずれかが例えば、配列番号１、２、３、４もしくは５に基づく酵素およびポリペプチドを意味する。「参照核酸」は、参照ポリペプチドをコードする核酸配列を意味する。
本明細書で使用する用語「参照配列」および「主題配列」は、互換的に使用される。
本明細書で使用する「クエリー配列」は、それが本発明の範囲内に含まれるかどうかを確かめるために、参照配列とアラインメントされる外来配列を意味する。したがって、そのようなクエリー配列は、例えば、先行技術の配列または第三者配列であってよい。
本明細書で使用する用語「配列」は、その状況に依存して、ポリペプチド配列または核酸配列であると言うことができる。
本明細書で使用する用語「ポリペプチド配列」および「アミノ酸配列」は、互換的に使用される。
「変異体」のシグナル配列は、野生型バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属シグナルペプチドのシグナル配列もしくはポリペプチドを分泌する任意のシグナル配列と同一であってよい、または相違していてよい。変異体は、異種ポリペプチドを含有する融合タンパク質として発現することができる。例えば、変異体は、例えばＨｉｓ−Ｔａｇ配列などの発現融合タンパク質の同定もしくは精製に役立つように設計されたまた別のタンパク質もしくは配列のシグナルペプチドを含むことができる。
本開示に含まれることが企図されている様々な変異体を記載するためには、下記の命名法が参照の容易さのために採用されるであろう。置換が数および文字、例えば、５９２Ｐを含む場合は、これは｛ナンバリングシステムによる位置／置換されたアミノ酸｝に関する。したがって、例えば、５９２位にあるプロリンとのアミノ酸の置換は５９２Ｐと指定される。置換が文字、数および文字、例えば、Ｄ５９２Ｐを含む場合は、これは｛元のアミノ酸／ナンバリングシステムによる位置／置換されたアミノ酸｝を意味する。
したがって、例えば、５９２位にあるプロリンとのアラニンの置換はＡ５９２Ｐと指定される。
２つ以上の置換が特定位置で可能な場合は、これは任意選択的にスラッシュ記号「／」によって分離されてよい連続する文字、例えば、Ｇ３０３ＥＤもしくはＧ３０３Ｅ／Ｄによって指定されることになる。
位置および置換は、例えば、配列番号１、２、３、４もしくは５のいずれかを参照して列挙される。例えば、また別の配列における同等の位置は、最高同一性率を備えるアラインメントを見いだすために、この配列を配列番号１、２、３、４もしくは５のいずれかと整列させ、その後にどのアミノ酸が１、２、３、４もしくは５のいずれかの特定位置の１つのアミノ酸に対応して整列するのかを決定することによって見いだすことができる。第１参照としての１つの配列のそのようなアラインメントおよび使用は、単純に当業者にとっては日常的問題である。
本明細書で使用する用語「発現」は、それによりポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生成される工程を意味する。この工程は、転写および翻訳の両方を含む。
本明細書で使用する「ポリペプチド」は、用語「アミノ酸配列」、「酵素」、「ペプチド」および／または「タンパク質」と互換的に使用される。本明細書で使用する「ヌクレオチド配列」もしくは「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド配列もしくはポリヌクレオチド配列およびそれらの変異体、相同体、断片および誘導体を意味する。ヌクレオチド配列は、ゲノム、合成もしくは組換え起源であってよく、センスもしくはアンチセンス鎖のいずれを表すかにはかかわらず、二本鎖もしくは一本鎖であってよい。本明細書で使用する用語「ヌクレオチド配列」には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。
「相同体」は、主題アミノ酸配列および主題ヌクレオチド配列との所定の同一性率もしくは「相同性」を有する実体を意味する。１つの態様では、主題アミノ酸配列は、配列番号１、２、３、４もしくは５であり、主題ヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３である。
「相同配列」には、また別の配列との所定のパーセント、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドもしくはポリペプチドが含まれる。同一性率は、整列させた場合に、塩基もしくはアミノ酸残基の百分率が２つの配列を比較した場合と同一であることを意味する。アミノ酸配列は、アミノ酸が主題配列と比較して置換されている、欠失しているまたは付加されている場合は同一ではない。配列同一性率は、典型的には、主題タンパク質の成熟配列と比較して、つまり、例えばシグナル配列の除去後に測定される。典型的には、相同体は、主題アミノ酸配列と同一活性部位残基を含むであろう。相同体はさらに酵素活性を保持するが、相同体は野生型とは異なる酵素特性を有する場合がある。
本明細書で使用する「ハイブリダイゼーション」は、それにより核酸の鎖が塩基対合を通して相補鎖と結合する工程ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）テクノロジーにおいて実施されるような増幅の工程を含んでいる。変異核酸は、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖もしくはＲＮＡ／ＤＮＡコポリマーとして存在することができる。本明細書で使用する用語「コポリマー」は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含む一本鎖核酸を意味する。変異核酸は、さらに発現を増加させるためにコドン最適化されてよい。
本明細書で使用する「合成」化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ化学的合成もしくは酵素的合成によって生成される。合成化合物には、宿主生物のための最適なコドン使用を用いて作成された変異核酸、例えば酵母細胞宿主もしくは最適な他の発現宿主が含まれるがそれらに限定されない。
本明細書で使用する「形質転換細胞」には、細菌細胞および真菌細胞の両方を含む、組換えＤＮＡ技術の使用によって形質転換されている細胞が含まれる。形質転換は、典型的には細胞内への１つ以上のヌクレオチド配列の挿入によって発生する。挿入されたヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列であってよい、すなわち、例えば融合タンパク質などの形質転換されなければならない細胞にとって自然ではない配列である。
本明細書で使用する「機能的に連結した」は、本明細書に記載した成分がそれらの所定の方法において機能することを許容する関係にあることを意味する。例えば、コーディング配列に機能的に連結した調節配列は、コーディング配列の発現がコントロール配列と適合する条件下で達成されるような方法でライゲートされる。
本明細書で使用する用語「断片」は、本明細書ではアミノ末端および／またはカルボキシル末端から１つ以上（数個）のアミノ酸が欠失しているポリペプチドであると定義されており、このとき断片は活性を有する。
１つの態様では、本明細書で使用する用語「断片」は、本明細書では配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末端から１つ以上（数個）のアミノ酸が欠失しているポリペプチドであると定義されており、このとき断片はトランスガラクトシル化活性を有する。
本明細書で使用する用語「ガラクトース結合ドメイン様」は、用語「ＧＢＤ」と略記され、用語「ＧＢＤ」と互換可能である。
同一性の程度
２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメーター「同一性」によって記載される。
１つの実施形態では、クエリー配列と参照配列との配列同一性の程度は、１）２つの配列を任意の好適なアラインメントプログラムによってデフォルトのスコアリングマトリックスおよびデフォルトのｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙを使用して整列させる工程、２）正確なマッチ数を同定する工程であって、このとき正確なマッチはアラインメントプログラムがアラインメントにおいて所定の位置上にある２つの整列させた配列内の同一アミノ酸もしくはヌクレオチドを同定している場合である工程、および３）正確なマッチ数を参照配列の長さで割る工程によって決定される。
１つの実施形態では、クエリー配列と参照配列との配列同一性の程度は、１）２つの配列を任意の好適なアラインメントプログラムによってデフォルトのスコアリングマトリックスおよびデフォルトのｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙを使用して整列させる工程、２）正確なマッチ数を同定する工程であって、このとき正確なマッチはアラインメントプログラムがアラインメントにおいて所定の位置上にある２つの整列させた配列内の同一アミノ酸もしくはヌクレオチドを同定している場合である工程、および３）正確なマッチ数を２つの配列の内で最長配列の長さで割る工程によって決定される。
また別の実施形態では、クエリー配列と参照配列との配列同一性の程度は、１）２つの配列を任意の好適なアラインメントプログラムによってデフォルトのスコアリングマトリックスおよびデフォルトのｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙを使用して整列させる工程、２）正確なマッチ数を同定する工程であって、このとき正確なマッチはアラインメントプログラムがアラインメントにおいて所定の位置上にある２つの整列させた配列内の同一アミノ酸もしくはヌクレオチドを同定している場合である工程、および３）正確なマッチ数を「アラインメント長」で割る工程であって、このときアラインメント長は、配列のｇａｐおよび突出部分を含む全アラインメントの長さである工程によって決定される。
配列同一性の比較は、目測で、または通常は、容易に利用可能な配列比較プログラムを活用して実施することができる。これらの市販で入手可能なコンピュータープログラムは、２つ以上の配列を整列させて、２つ以上の配列間の相違を生じさせた可能性がある進化的事象を裁量に反映する複雑な比較アルゴリズムを使用する。このため、これらのアルゴリズムは、同一もしくは類似のアミノ酸のアラインメントを与える、およびｇａｐ、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎのｐｅｎａｌｔｙを与えるスコアリングシステムおよび非類似アミノ酸のアラインメントを用いて機能する。比較アルゴリズムのスコアリングシステムには：
ｉ）ｇａｐが挿入された時間毎のｐｅｎａｌｔｙスコアの指定（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙスコア）、
ｉｉ）既存のｇａｐが割増位置を伴って伸長する各時間のｐｅｎａｌｔｙスコアの指定（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙスコア）、
ｉｉｉ）同一アミノ酸がアライメントされた時点の高スコアの指定、および
ｉｖ）非同一アミノ酸がアラインメントされた時点の可変スコアの指定、が含まれる。
大多数のアラインメントプログラムは、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙが修飾されることを許容する。しかし、配列比較のためにそのようなソフトウエアを使用する場合にはデフォルト値を使用することが好ましい。
非同一アミノ酸のアラインメントに対して与えられるスコアは、置換マトリックスとも呼ばれるスコアリングマトリックスにしたがって指定される。そのような置換マトリックスにおいて提供されるスコアは、進化中に１つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換される可能性が変動し、置換対象のアミノ酸の物理的／化学的性質に依存するという事実を反映している。例えば、１つの極性アミノ酸がまた別の極性アミノ酸と置換される可能性は、疎水性アミノ酸と置換される場合に比較して高い。このため、スコアリングマトリックスは同一アミノ酸に対して最高スコア、非同一であるが類似のアミノ酸に対してはより低いスコア、および非同一で非類似のアミノ酸に対してはいっそう低いスコアを指定するであろう。最も頻回に使用されるスコアリングマトリックスは、ＰＡＭマトリックス（Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８），Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２））、ＢＬＯＳＵＭマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２））およびＧｏｎｎｅｔマトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２））である。
そのようなアラインメントを実施するために好適なコンピュータープログラムには、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）ならびにＣｌｕｓｔａｌＶ、ＣｌｕｓｔａｌＷおよびＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ ＆ Ｓｈａｒｐ ＰＭ（１９８８），Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｌａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）が含まれるがそれらに限定されない。選りすぐりの様々なアラインメントツールは、ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ．のＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓサーバーから入手できる。配列アラインメントを実施できるソフトウエアのまた別の例は、現在はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／に見いだすことができる全米バイオテクノロジー情報センターのウェブページから入手でき、最初にＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５；４０３−４１０に記載されたＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）である。
本発明の好ましい実施形態では、アラインメントプログラムは、配列の全長にわたるアラインメントを最適化する、グローバルアラインメントプログラムを実施する。また別の好ましい実施形態では、グローバルアラインメントプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓａｕｌ Ｂ．；およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｄ．（１９７０），“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４８（３）：４４３−５３）に基づく。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いてグローバルアラインメントを実施する最新プログラムの例は、どちらもｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／から入手可能であるＥＭＢＯＳＳ ＮｅｅｄｌｅおよびＥＭＢＯＳＳ Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒプログラムである。ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅは、２つの配列の全体の長さの最適な（ｇａｐを含む）アラインメントを見いだすために、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメントアルゴリズムを使用して最適なグローバル配列アラインメントを実施する。ＥＭＢＯＳＳ Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒは、より大きな配列をグローバルに整列させることを可能にするＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメントの修飾を使用する。１つの実施形態では、配列はグローバルアラインメントプログラムによって整列させられ、配列同一性はプログラムによって同定された正確なマッチの数を「アラインメント長」で割ることによって計算されるが、このときアラインメント長はｇａｐおよび配列の突出部分を含む全アラインメントの長さである。
また別の実施形態では、グローバルアラインメントプログラムはＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用し、配列同一性はプログラムによって同定された正確なマッチの数を「アラインメント長」で割ることによって計算されるが、このときアラインメント長はｇａｐおよび配列の突出部分を含む全アラインメントの長さである。
さらに別の実施形態では、グローバルアラインメントプログラムは、ＥＭＢＯＳＳ ＮｅｅｄｌｅおよびＥＭＢＯＳＳ Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒからなる群から選択され、配列同一性はプログラムによって同定された正確なマッチの数を「アラインメント長」で割ることによって計算されるが、このときアラインメント長はｇａｐおよび配列の突出部分を含む全アラインメントの長さである。
ソフトウエアがアラインメントを生成すると、類似性率（％）および配列同一性率（％）を計算することが可能である。ソフトウエアは、典型的にはこれを配列比較の一部として実行し、数的結果を生成する。
１つの実施形態では、配列アラインメントを実施するためにＣｌｕｓｔａｌＷソフトウエアを使用するのが好ましい。好ましくは、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いたアラインメントは、ペアワイズアラインメントのために下記のパラメーターを用いて実施される：
Figure 0006851967
ＣｌｕｓｔａｌＷ２は、例えば、インターネット上でＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ研究所によってＥＭＢＬ−ＥＢＩウェブページｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋのｔｏｏｌｓ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ−ＣｌｕｓｔａｌＷ２の下で入手可能にされている。現在、ＣｌｕｓｔａｌＷ２ツールの正確なアドレスは、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２である。
また別の実施形態では、配列アラインメントを実施するためにプログラムＡｌｉｇｎ Ｘ ｉｎ Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するのが好ましい。１つの実施形態では、Ｅｘｐ１０がデフォルト設定を用いて使用可能にされている：
Ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ：１０
Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ：０．０５
Ｇａｐ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ ｒａｎｇｅ：８
また別の実施形態では、１つのアミノ酸配列とまた別のアミノ酸配列との、またはまた別のアミノ酸配列とのアラインメントは、スコアマトリックス：ｂｌｏｓｕｍ６２ｍｔ２およびＶｅｃｔｏｒＮＴＩペアワイズアラインメント設定の使用によって決定される。
Figure 0006851967
１つの実施形態では、１つのアミノ酸配列とまた別のアミノ酸配列との、またはまた別のアミノ酸配列との同一性率（％）は、ワードサイズ３および置換マトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ ６２を用いるＢｌａｓｔによって決定される。
ポリペプチド
１つの実施形態では、本明細書に開示されるのは、３重量／重量％の初期ラクトース濃度以上の濃度で、少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１もしくは少なくとも１２のトランスガラクトシル化活性：β−ガラクトシダーゼ活性の比率を有するポリペプチドである。
１つの態様では、本明細書に開示されるのは、グリコシドヒドロラーゼ触媒コアが配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
１つの態様では、本明細書に開示されるのは、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ（ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）および／またはＧｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）ドメインを含有するポリペプチドである。
１つの態様では、本明細書において、細菌性Ｉｇ様ドメイン（第４群）（ＰＦ０７５３２）を含有するポリペプチドが開示される。
１つの実施形態では、本明細書において、下記からなる群から選択されるトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドが開示される：
ａ．配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｂ．配列番号２との少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大９７５個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｃ．配列番号３との少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大１，３００個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｄ．ｉ）配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３からなる核酸配列、またはｉｉ）ｉ）の相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、
ｅ．配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または１つの成熟ポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３からなるヌクレオチド配列との少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、および
ｆ．配列番号１、２、３、４もしくは５の１つ以上のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または保存的置換を含むポリペプチド。
また別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、下記からなる群から選択されるトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドである：
ａ．配列番号３との少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大１，３００個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｂ．配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｃ．ｉ）配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３からなる核酸配列、またはｉｉ）ｉ）の相補鎖を含む、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、
ｄ．配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または１つの成熟ポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３からなるヌクレオチド配列との少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、および
ｅ．配列番号１、２、３、４もしくは５の１つ以上のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または保存的置換を含むポリペプチド。
１つの態様では、本明細書に開示されるのは、アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４もしくは５の成熟アミノ酸配列との少なくとも６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチドである。
１つの態様では、本明細書に開示されるのは、配列番号１の成熟アミノ酸配列との９０％配列同一性を有するポリペプチドである。
１つの態様では、本明細書に開示されるのは、配列番号２の成熟アミノ酸配列との９０％配列同一性を有するポリペプチドである。
１つの態様では、本明細書に開示されるのは、配列番号３の成熟アミノ酸配列との９６．５％配列同一性を有するポリペプチドである。
１つの態様では、本明細書に開示されるのは、配列番号４の成熟アミノ酸配列との９６．５％配列同一性を有するポリペプチドである。
１つの態様では、本明細書に開示されるのは、配列番号５の成熟アミノ酸配列との９６．５％配列同一性を有するポリペプチドである。
１つの実施形態では、本明細書に開示されるのは、配列番号１、２、３、４もしくは５のアミノ酸配列を含む、またはそれらからなるポリペプチドである。
１つの態様では、本明細書に開示されるのは、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）に由来するポリペプチドである。
１つの態様では、本明細書に開示されるのは、６．５〜７．５の最適ｐＨを有するポリペプチドである。
１つの態様では、本明細書に開示されるのは、例えば４２〜６０℃などの３０〜６０℃の最適温度を有するポリペプチドである。
炭水化物への活性を有するポリペプチドは、それらの基質特異性に基づくＩＵＢＭＢ分類システムまたは現行の１２５種のグリコシドヒドロラーゼファミリーの１つへのＣａＺｙ割当てのいずれかを使用して分類することができる。ＣａＺｙデータベースでは、割当ては、基質および生成物の立体化学の知識と組み合わせた配列および構造の両方に関する情報に基づいている。
本明細書では、前記ポリペプチドをコードする核酸配列を含む好適な宿主菌株（例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））中で発現生成物である場合に、トランスガラクトシル化活性を示す前記核酸配列の唯一のポリペプチド発現生成物であるポリペプチドが開示される。これは、当業者には公知の下記の技術を使用することによって評価することができる。評価対象のサンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥを受けさせられ、例えばＢｉｏ−Ｒａｄ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎシステムなどのタンパク質定量のために適切な染料を使用して可視化される。ゲルは、次に例えばＢｉｏ−Ｒａｄ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎシステムなどの適切な密度計スキャナーを使用してスキャンされ、結果として生じた画像がダイナミックレンジ内にあることが確証される。配列番号８に由来する任意の変異体／断片に対応するバンドが定量され、ポリペプチドのパーセンテージは以下：問題のポリペプチドの百分率＝問題のポリペプチド／（トランスガラクトシル化活性を示す全ポリペプチドの合計）＊１００として計算される。組成物中の配列番号８に由来するポリペプチド変異体／断片の総数は、当業者には公知の方法によってポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロッティングによって配列番号８に由来する断片を検出することによって決定できる。
本明細書に開示したポリペプチドは、酵素内に含有された少なくとも２つの別個の機能的ドメインを含む。最初に、ポリペプチドは、下記に記載するようなグリコシドヒドロラーゼ触媒コアを含有するはずである。触媒コアは、関連するグリコシドヒドロラーゼファミリーのＧＨ−Ａクランに属するはずである。ＧＨ−Ａクランは、保持機構によってグリコシド結合を開裂することを特徴とし、ＴＩＭバレルフォールドに基づく触媒ドメインを有する（Ｗｉｅｒｅｎｇａ，２００１，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４９２（３），ｐ１９３−８）。この触媒ドメインは、バレルドメインの第４および第７ストランドから生じるプロトン供与体および求核基として作用する２つのグルタミン酸残基を含有する（Ｊｅｎｋｉｎｓ，１９９５，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３６２（３），ｐ２８１−５）。ＴＩＭバレルの全体構造は、８本のβストランドおよび８本のαヘリックスからなる（β／α）８フォールドである。１つの態様では、本明細書に開示したグリコシドヒドロラーゼ触媒コアは、グリコシドヒドロラーゼファミリーＧＨ−２およびＧＨ−Ａクランに属する全ＴＩＭバレル酵素であるＧＨ−３５のいずれかに属する。また別の態様では、グリコシドヒドロラーゼ触媒コアは、ＧＨ−２もしくはＧＨ−３５ファミリーに属する。また別の態様では、グリコシドヒドロラーゼ触媒コアは、ＧＨ−２ファミリーに属する。一般的基準は、これらの酵素がいわゆる保持酵素であるので、基質の立体化学が生成物内で保存されていることである（Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，１９９７，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，７（５），６３７−４４）。
１つの態様では、本明細書に開示したポリペプチドは、β（１→４）構造を有する炭水化物結合への活性を有する。この活性は効果的に、これらの酵素をβ−ガラクトシダーゼのＩＵＭＢＭＢ ＥＣ３．２．１．２３クラスに分類する。この活性は、例えば、色素生成アグリコン（ＸＧａｌ）とともにパラ−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰＧ）、オルト−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）またはβ−Ｄ−ガラクトピラノシドなどの合成基質を利用することによって決定できるが、それらに限定されない。酵素がβ−ガラクトシダーゼのＥＣ３．２．１．２３クラスに属するかどうかを決定する代替法としては、ラクトースなどの基質とともにインキュベートし、例えば酵素決定法、ＨＰＬＣ、ＴＬＣもしくは当業者には公知の他の方法によってグルコースの遊離を測定することである。
ポリペプチドの機能的実体を予測するためには、数種の利用可能な好適な公衆リポジトリ、例えばＰｆａｍ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１０）３８（ｓｕｐｐｌ １）：Ｄ２１１−Ｄ２２２．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｐ９８５）およびＩｎｔｅｒｐｒｏ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００９）３７（ｓｕｐｐｌ １）：Ｄ２１１−Ｄ２１５．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｎ７８５）などを適用できる。そのような分析を実施する場合は、分析は、好適な保存データベースから入手できるポリペプチドの全長配列上で実施されなければならないことを明白にすべきである。
また別の態様では、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ（ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）および細菌性Ｉｇ様ドメイン（第４群）（ＰＦ０７５３２）から選択される１つ以上のＰｆａｍドメインを含有するポリペプチドが提供される。さらにまた別の態様では、ＰｆａｍドメインＧｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ（ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）および細菌性Ｉｇ様ドメイン（第４群）（ＰＦ０７５３２）を含有するポリペプチドが提供される。さらにまた別の態様では、ポリペプチドの触媒ドメインを構成するＧｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ（ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）およびＧｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）ドメインを含有するポリペプチドが提供される。
更なる態様では、本明細書で開示されており、１８０分等の１５分、３０分または１８０分の反応後の３７℃および５重量／重量％のラクトースでの乳ベースのアッセイにおいて１００ｐｐｍの濃度で測定した場合にトランスガラクトシル化活性：β−ガラクトシダーゼ活性の比が少なくとも１、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１または少なくとも１２であるポリペプチドが提供される。更なる態様では、このポリペプチドはビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）に由来する。
一態様では、本明細書で開示するポリペプチドは、１８０分等の１５分、３０分または１８０分の反応後の３７℃および５重量／重量％のラクトースでの乳ベースのアッセイにおいて１００ｐｐｍの濃度で測定した場合に最初のラクトースの２０％超、３０％超、４０％超、最大で５０％がトランスガラクトシル化されるようなトランスガラクトシル化活性を有する。
更なる態様では、本明細書で開示するポリペプチドは、１８０分等の１５分、３０分または１８０分の反応後の３７℃および５重量／重量％のラクトースでの乳ベースのアッセイにおいて１００ｐｐｍの濃度で測定した場合にラクトースの８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満が加水分解されているようなβ−ガラクトシダーゼ活性を有する。
一態様では、β−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性を、国際公開第２０１３／１８２６２６号パンフレットの方法４で詳述されている２．１３ＬＡＵに対応する１００ｐｐｍの濃度で測定する。
また別の態様では、本明細書に開示したポリペプチドは、下記の特徴：
ａ）１５、３０もしくは１８０分間、例えば１８０分間の反応後に、３７℃および５重量／重量％のラクトースでのミルクベースのアッセイにおいて１００ｐｐｍの濃度で測定して、少なくとも１、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１または少なくとも１２のトランスガラクトシル化活性：β−ガラクトシダーゼ活性の比率を有する、および／または
ｂ）１５、３０もしくは１８０分間、例えば１８０分間の反応後に、３７℃および５重量／重量％のラクトースでのミルクベースアッセイにおいて１００ｐｐｍの濃度で測定して、初期ラクトースの２０％超、３０％超、４０％超および５０％までがトランスガラクトシル化されているようなトランスガラクトシル化活性を有する、の内の１つ以上を有する。
１つの態様では、配列番号３との少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドは、最大１，３００個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。また別の態様では、配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性、例えば前記配列同一性が例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。また別の態様では、配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。さらにまた別の態様では、配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有する、例えば前記ポリペプチドが配列番号１との例えば少なくとも９０％、例えば，少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドが提供される。また別の態様では、配列番号２との少なくとも９６．５％の配列同一性を有する、例えば前記ポリペプチドが配列番号２との少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド。１つの態様では、本明細書に開示したポリペプチドは、最大９７５個のアミノ酸残基、例えば最大９７０個のアミノ酸残基、例えば最大９５０個のアミノ酸残基、例えば最大９４０個のアミノ酸残基、最大９３０個のアミノ酸残基、最大９２０個のアミノ酸残基、最大９１０個のアミノ酸残基、最大９００個のアミノ酸残基、最大８９５個のアミノ酸残基もしくは最大８９０個のアミノ酸残基からなり、提供される。１つの態様では、特定のポリペプチドは８８７もしくは９６５個のアミノ酸残基からなり、提供される。１つの態様では、配列番号２との少なくとも９７％の配列同一性、例えば前記配列同一性が例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の同一性であるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大９７５個のアミノ酸残基、例えば最大９７０個もしくは少なくとも９６５個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。１つの態様では、配列番号２と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大９７５個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。
また別の好ましい態様では、配列番号１、２、３、４もしくは５を含むポリペプチドが提供される。さらに別の好ましい態様では、配列番号１、２、３、４もしくは５のアミノ酸配列からなるポリペプチド、特に配列番号１または２のアミノ酸配列からなるポリペプチドが提供される。
また別の態様では、配列番号３との少なくとも９６．５％の配列同一性、例えば前記配列同一性が例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは少なくとも１００％の配列同一性であるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大１，３００個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。
また別の態様では、前記ポリペプチドが配列番号５との少なくとも９８．５％、例えば少なくとも９９％もしくは少なくとも９９．５％の配列同一性を有するポリペプチドが提供される。１つの態様では、そのようなポリペプチドは、最大１，２９０個のアミノ酸残基、例えば最大１，２８０個、最大１，２７０個、最大１，２６０個、最大１，２５０個、最大１，２４０個、最大１，２３０個、最大１，２２０個もしくは最大１，２１５個のアミノ酸残基からなり、提供される。１つの好ましい態様では、１，２１１個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。
また別の態様では、前記ポリペプチドが配列番号４との少なくとも９６％、例えば少なくとも少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドが提供される。１つの態様では、最大１，２１０個のアミノ酸残基、例えば最大１，２００個、最大１，１９０個、最大１，１８０個、最大１，１７０個、最大１，１６０個、最大１，１５０個もしくは最大１，１４５個のアミノ酸残基、例えば１，１４２個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。
また別の態様では、前記ポリペプチドが配列番号３との少なくとも９６．５％、例えば少なくとも少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドが提供される。１つの態様では、最大１，１３０個のアミノ酸残基、例えば最大１，１２０個、最大１，１１０個、最大１，１００個、最大１，０９０個、最大１，０８０個、最大１，０７０個、最大１，０６０個、最大１，０５０個、最大１，０５５個もしくは最大１，０４０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。１つの好ましい態様では、１，０３８個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。
また別の態様では、本明細書に開示したポリペプチドは、１００％超、例えば１５０％超、１７５％超もしくは２００％超のトランスガラクトシル化活性の比率を有する。
タンパク質は、一般に、通例ドメインと呼ばれる１つ以上の機能的領域から構成される。異なるタンパク質中に様々な組み合わせで様々なドメインが存在することは、自然に見いだされる多様なタンパク質レパートリーを生じさせる。ドメインを記載する１つの方法は、“Ｔｈｅ Ｐｆａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ”：Ｒ．Ｄ．Ｆｉｎｎ，Ｊ．Ｍｉｓｔｒｙ，Ｊ．Ｔａｔｅ，Ｐ．Ｃｏｇｇｉｌｌ，Ａ．Ｈｅｇｅｒ，Ｊ．Ｅ．Ｐｏｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｏ．Ｌ．Ｇａｖｉｎ，Ｐ．Ｇｕｎｅｓｅｋａｒａｎ，Ｇ．Ｃｅｒｉｃ，Ｋ．Ｆｏｒｓｌｕｎｄ，Ｌ．Ｈｏｌｍ，Ｅ．Ｌ．Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｓ．Ｒ．Ｅｄｄｙ，Ａ．Ｂａｔｅｍａｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１０）Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ ３８：Ｄ２１１−２２２に記載されたタンパク質ドメインファミリーの大きな集団であるＰｆａｍデータベースを用いることによる。各ファミリーは、複数の配列アラインメントおよび隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）によって表示される。さらなる態様では、本発明者らは、本明細書で提供するポリペプチドが、ＰｆａｍドメインＧｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ（ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）および細菌性Ｉｇ様ドメイン（第４群）（ＰＦ０７５３２）の内の１つ以上を含有することを見い出した。１つの態様では、本明細書で提供するポリペプチドは、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ（ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）および細菌性Ｉｇ様ドメイン（第４群）（ＰＦ０７５３２）を含有する。
１つの態様では、このポリペプチドは、４〜９、例えば５〜８、例えば５．５〜７．５、例えば６．５〜７．５などのｐＨ範囲にわたって有用なトランスガラクトシル化活性を有する。
本発明は、本明細書に定義したアミノ酸または本明細書に定義した特定の特性を有するポリペプチドとの所定の程度の配列同一性もしくは配列相同性を有するポリペプチドを含む。本発明は、特に、下記に定義する配列番号１、２、３、４もしくは５またはそれらの相同体のいずれか１つとのある程度の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
１つの態様では、相同性アミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列は、配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドと比較して機能的トランスガラクトシル化活性を保持する、および／またはトランスガラクトシル化活性を増強するポリペプチドを提供する、および／またはコードするはずである。
本発明の状況では、相同配列は主題配列と少なくとも６６％、７０％、７５％、７８％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である可能性があるアミノ酸配列を含むと考えられる。典型的には、相同体は、主題アミノ酸配列と同一活性部位などを含むであろう。相同性は類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点から考慮することもできるが、本発明の状況では、相同性は配列同一性によって表現するのが好ましい。
したがって、本発明はさらに、本明細書に定義したタンパク質もしくはポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列、特別には下記に定義する配列番号１、２、３、４もしくは５のアミノ酸配列の変異体、相同体および誘導体を含む。
下記に定義した配列番号１、２、３、４もしくは５の変異体、相同体および誘導体は、さらにサイレントな変化を生成し、結果として機能的に同等の物質を生じさせるアミノ酸残基の欠失、挿入もしくは置換もまた有する可能性がある。意図的なアミノ酸置換は、その物質の二次的結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて行うことができる。例えば、負荷電アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる；正荷電アミノ酸には、リシンおよびアルギニンが含まれる；ならびに類似の親水性値を有する非荷電極性頭部基を備えるアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが含まれる。
本発明はさらに、発生する可能性がある、つまり同種置換、例えば塩基性と塩基性、酸性と酸性、極性と極性などの保存的置換（置換および交換は、本明細書ではどちらも既存のアミノ酸残基と代替残基との入れ替えを意味するために使用される）も含む。非保存的置換もまた、１クラスの残基からまた別のクラス、または非天然アミノ酸、例えばオルニチン（下記ではＺと呼ぶ）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下ではＢと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（以下ではＯと呼ぶ）、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンなどの包含を含むクラスの残基から発生する可能性がある。
作成できる可能性がある保存的置換は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、脂肪族アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、ヒドロキシルアミノ酸（セリン、トレオニン）、大きいアミノ酸（フェニルアラニンおよびトリプトファン）ならびに小さいアミノ酸（グリシン、アラニン）のグループ内にある。
１つの態様では、本発明において使用されるポリペプチド配列は、精製形にある。
１つの態様では、本発明において使用されるポリペプチドもしくはタンパク質は、単離形にある。
１つの態様では、本発明のポリペプチドは、組換え生成される。
変異ポリペプチドには、配列番号１または２との所定のパーセント、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。
変異ポリペプチドには、配列番号３、４または５との所定のパーセント、例えば少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。
１つの態様では、本明細書に開示されるポリペプチドは、本明細書では配列番号２２として示したビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＳＭ２０２１５に含有されるトランスガラクトシラーゼをコードするヌクレオチド配列によってコードされる成熟ポリペプチドのアミノ酸配列との少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。配列番号１、２、３、４もしくは５に関して検討される配列同一性および官能性に関する全ての考察および制限は、これらのポリペプチドおよびヌクレオチドの配列同一性および官能性に必要な変更を加えて適用される。
１つの態様では、主題アミノ酸配列は、配列番号１、２、３、４もしくは５であり、主題ヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３である。
１つの態様では、ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末端から１つ以上（数個）のアミノ酸が欠失している断片であり、このときこの断片はトランスガラクトシル化活性を有する。
１つの態様では、断片は、少なくとも５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０もしくは１，０００個のアミノ酸残基を含有する。
また別の態様では、ポリペプチド変異体の長さは、５００〜１，３００アミノ酸残基である。また別の態様では、ポリペプチド変異体の長さは、６００〜１，３００アミノ酸である。また別の態様では、ポリペプチド変異体の長さは、７００〜１，３００アミノ酸である。また別の態様では、ポリペプチド変異体の長さは、８００〜１，３００アミノ酸である。また別の態様では、ポリペプチド変異体の長さは、８００〜１，３００アミノ酸である。
配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチド変異体
１つの態様では、配列番号１、２、３、４もしくは５に比較して、例えば改良されたトランスガラクトシル化などの変化した特性を実行する１つ以上の位置で置換を有する配列番号１、２、３、４もしくは５の変異体が提供される。そのような変異ポリペプチドは、本文献においては便宜的に、「変異ポリペプチド」、「ポリペプチド変異体」または「変異体」とも呼ばれる。１つの態様では、本明細書に定義したポリペプチドは、配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドに比較して改良されたトランスガラクトシル化活性を有する。また別の態様では、本明細書に定義したポリペプチドは、配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドに比較して改良された反応速度を有する。
一態様では、本明細書で定義するポリペプチドおよび多様体は酵素活性を示す。一態様では、本明細書で説明するポリペプチドおよび多様体ポリペプチドは、トランスガラクトシル化活性を含む。
１つの態様では、トランスガラクトシル化活性：β−ガラクトシダーゼ活性の比率は、３重量／重量％の初期ラクトース濃度を超える濃度などの３０分間の反応後には、少なくとも０．５、例えば少なくとも１、例えば少なくとも１．５または例えば少なくとも２である。
１つの態様では、トランスガラクトシル化活性：β−ガラクトシダーゼ活性の比率は、３重量／重量％の初期ラクトース濃度を超える濃度などの３０分間の反応後に、少なくとも２．５、例えば少なくとも３、例えば少なくとも４、例えば少なくとも５、例えば少なくとも６、例えば少なくとも７、例えば少なくとも８、例えば少なくとも９、例えば少なくとも１０、例えば少なくとも１１もしくは例えば少なくとも１２である。
１つの態様では、本明細書に定義したポリペプチドおよび変異体は、微生物起源に、特に糸状真菌もしくは酵母または細菌に由来する可能性がある。酵素は、例えば、Ａｇａｒｉｃｕｓ、例えばＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ；Ａｓｃｏｖａｇｉｎｏｓｐｏｒａ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、例えばＡ．ｎｉｇｅｒ，Ａ．ａｗａｍｏｒｉ，Ａ．ｆｏｅｔｉｄｕｓ，Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ，Ａ．ｏｒｙｚａｅ；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ；Ｃｈａｅｔｏｔｏｍａｓｔｉａ；Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ、例えばＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ；Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、例えばＫ．ｆｒａｇｉｌｉｓ，Ｋ．ｌａｃｔｉｓ；Ｍｕｃｏｒ、例えばＭ．ｊａｖａｎｉｃｕｓ，Ｍ．ｍｕｃｅｄｏ，Ｍ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、例えばＮ．ｃｒａｓｓａ；Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、例えばＲ．ｐｕｓｉｌｌｕｓ；Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、例えばＲ．ａｒｒｈｉｚｕｓ，Ｒ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ，Ｒ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ；Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ、例えばＳ．ｌｉｂｅｒｔｉａｎａ；Ｔｏｒｕｌａ；Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ；Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ、例えばＴ．ｒｕｂｒｕｍ；Ｗｈｅｔｚｅｌｉｎｉａ、例えばＷ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ、例えばＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ，Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ，Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，Ｂ．ｎｏｖａｌｉｓ，Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ，Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、例えばＢ．Ｉｏｎｇｕｍ，Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ，Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ；Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、例えばＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、例えばＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ；Ｄｉｐｌｏｄｉａ、例えばＤ．ｇｏｓｓｙｐｉｎａ；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、例えばＥ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ，Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ，Ｅ．ｔａｒｄａ；Ｅｒｗｉｎｉａ、例えばＥ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えばＥ．ｃｏｌｉ；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、例えばＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｍｉｒｉｏｃｏｃｃｕｍ；Ｍｙｒｏｔｈｅｓｉｕｍ；Ｍｕｃｏｒ；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、例えばＮ．ｃｒａｓｓａ；Ｐｒｏｔｅｕｓ、例えばＰ．ｖｕｌｇａｒｉｓ；Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ、例えばＰ．ｓｔｕａｒｔｉｉ；Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ、例えばＰｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ，Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ；Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、例えばＲ．ｔｏｒｑｕｅｓ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えばＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えばＳ．ｌｉｑｕｅｆａｓｃｉｅｎｓ，Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ；Ｓｈｉｇｅｌｌａ、例えばＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，ｅ．ｇ．．Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ，Ｓ．ｃａｓｔａｎｅｏｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ，Ｓ．ｖｉｏｌｅｃｅｏｒｕｂｅｒ；Ｔｒａｍｅｔｅｓ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、例えばＴ．ｒｅｅｓｅｉ，Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ；Ｙｅｒｓｉｎｉａ、例えばＹ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａの菌株に由来する可能性がある。
本明細書に定義したポリペプチドもしくは変異ポリペプチドを含む単離および／または精製ポリペプチドが提供される。１つの実施形態では、変異ポリペプチドは、ポリペプチド（配列番号１、２、３、４もしくは５）の成熟形である。１つの態様では、変異体には、Ｃ末端ドメインが含まれる。
１つの態様では、本明細書に定義した変異ポリペプチドには、１〜約２５個の間のアミノ酸残基が配列番号１、２、３、４もしくは５と比較して付加されている、または欠失している変異体が含まれる。１つの態様では、本明細書に定義した変異ポリペプチドには、１〜２５個の間のアミノ酸残基が配列番号１、２、３、４もしくは５と比較して置換、付加されている、または欠失している変異体が含まれる。１つの態様では、変異体は、配列番号１、２、３、４もしくは５のアミノ酸配列を有し、このとき１〜約２５個の間の任意の数のアミノ酸が置換されている。また別の態様では、変異体は、配列番号１、２、３、４もしくは５のアミノ酸配列を有し、このとき３〜１２個の間の任意の数のアミノ酸が置換されている。また別の態様では、変異体は、配列番号１、２、３、４もしくは５のアミノ酸配列を有し、このとき５〜９個の間の任意の数のアミノ酸が置換されている。
１つの態様では配列番号１、２、３、４もしくは５の内の少なくとも２個、また別の態様では少なくとも３個、およびさらにまた別の態様では少なくとも５個のアミノ酸が置換されている。
１つの態様では、本明細書に開示したポリペプチドは、配列番号１、２、３、４もしくは５を有する。
１つの態様では、本明細書に開示したポリペプチドは、配列番号１、２、３、４もしくは５の配列を有するが、このときＮ末端における１０、例えば９、例えば８、例えば７、例えば６、例えば５、例えば４、例えば３、例えば２、例えば１個のアミノ酸が置換されている、および／または欠失している。
酵素およびそれらの酵素変異体は、それらの核酸および一次ポリペプチド配列、三次元構造モデリングおよび／またはそれらの特異的活性によって特徴付けることができる。本明細書に定義したポリペプチドもしくはポリペプチド変異体の追加の特徴には、例えば、安定性、ｐＨ範囲、酸化安定性および熱安定性が含まれる。発現および酵素活性のレベルは、当業者には公知の標準的アッセイを使用すると評価できる。また別の態様では、変異体は、配列番号１、２、３、４もしくは５を備えるポリペプチドに比較して改良された性能特性、例えば高温、例えば６５〜８５℃で改良された安定性を示す。
ポリペプチド変異体は、配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドとの少なくとも約６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７８％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有するアミノ酸配列を用いて本明細書に定義したように提供される。
ヌクレオチド
１つの態様では、本発明は、超低ストリンジェンシー条件下、好ましくは低ストリンジェンシー条件下、より好ましくは中ストリンジェンシー条件下、より好ましくは中−高ストリンジェンシー条件下、いっそうより好ましくは高ストリンジェンシー条件下、および最も好ましくは超高ストリンジェンシー条件下で、ｉ）配列番号１、２、３、４もしくは５の成熟ポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３に含まれる核酸配列；ｉｉ）ｉ）のｃＤＮＡ配列、またはｉｉｉ）ｉ）もしくはｉｉ）の相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる上述したトランスガラクトシル化活性を有する単離ポリペプチドに関する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３の部分配列は、少なくとも１００個の連続ヌクレオチドまたは好ましくは少なくとも２００個の連続ヌクレオチドを含有する。さらに、部分配列は、ラクターゼ活性を有するポリペプチド断片をコードする可能性がある。
配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３のヌクレオチド配列もしくはそれらの部分配列ならびに配列番号１、２、３、４もしくは５のアミノ酸配列もしくはそれらの断片は、当業者には周知の方法にしたがって様々な属もしくは種の菌株由来のトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定およびクローン化するための核酸プローブを設計するために使用できる。特に、そのようなプローブは、その中の対応する遺伝子を同定および単離するために、標準サウザンブロッティング手順にしたがって、問題の属もしくは種のゲノムもしくはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションのために使用できる。そのようなプローブは、全配列より相当に短い可能性があるが、長さが少なくとも１４個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個および最も好ましくは少なくとも７０個のヌクレオチドでなければならない。しかし、核酸プローブは、長さが少なくとも１００個のヌクレオチドであるのが好ましい。例えば、核酸プローブは、長さが少なくとも２００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４００ヌクレオチドまたは最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチドであってよい。いっそうより長いプローブ、長さが例えば少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも好ましくは７００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも８００ヌクレオチドまたは最も好ましくは少なくとも９００ヌクレオチドである核酸プローブを使用できる。ＤＮＡプローブおよびＲＮＡプローブの両方を使用できる。これらのプローブは、典型的には、対応する遺伝子を検出するために（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチンもしくはアビジンを用いて）標識される。そのようなプローブは、本発明によって含まれる。
このため、そのような他の生物から調製されたゲノムＤＮＡライブラリーは、上述したプローブとハイブリダイズする、およびラクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡについてスクリーニングすることができる。そのような他の生物からのゲノムもしくは他のＤＮＡは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動法または他の分離技術によって分離することができる。ライブラリー由来のＤＮＡもしくは分離ＤＮＡは、ニトロセルロースもしくは他の好適な担体材料上に移して固定化することができる。配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３もしくはそれらの部分配列と相同性であるクローンもしくはＤＮＡを同定するためには、サウザンブロットにおいて担体材料が使用される。
本発明のためには、ハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド配列が配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３に示したヌクレオチド配列、その相補鎖またはそれらの部分配列に、超低から超高ストリンジェンシー条件下で対応する標識核酸プローブにハイブリダイズすることを示している。これらの条件下で核酸プローブがそれにハイブリダイズする分子は、Ｘ線フィルムを使用して検出することができる。
また別の好ましい態様では、核酸プローブは、配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３の成熟ポリペプチドコーディング領域である。
長さが少なくとも１００ヌクレオチドの長いプローブに対しては、最適には１２〜２４時間の標準サウザンブロッティング手順にしたがって、超低〜超高ストリンジェンシー条件が５×のＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、２００ｇ／ｍＬの剪断および変性サケ***ＤＮＡならびに超低および低ストリンジェンシーに対しては２５％のホルムアミド、中および中高ストリンジェンシーに対しては３５％のホルムアミドまたは高および超高ストリンジェンシーに対しては５０％のホルムアミドいずれか中の４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションであると定義されている。
長さが少なくとも１００ヌクレオチドの長いプローブに対しては、担体材料は、２×のＳＳＣ、０．２％のＳＤＳを用いて、好ましくは少なくとも４５℃（超低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー）、より好ましくは５５℃（中ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも６０℃（中−高ストリンジェンシー）、いっそうより好ましくは少なくとも６５℃（高ストリンジェンシー）および最も好ましくは少なくとも７０℃（超高ストリンジェンシー）で最終的にそれぞれ１５分間ずつ３回洗浄される。
特定の実施形態では、洗浄は、０．２×のＳＳＣ、０．２％のＳＤＳを用いて、好ましくは少なくとも４５℃（超低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー）、より好ましくは５５℃（中ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも６０℃（中−高ストリンジェンシー）、いっそうより好ましくは少なくとも６５℃（高ストリンジェンシー）および最も好ましくは少なくとも７０℃（超高ストリンジェンシー）で実施される。また別の特定の実施形態では、洗浄は、０．１×のＳＳＣ、０．２％のＳＤＳを用いて、好ましくは少なくとも４５℃（超低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー）、より好ましくは５５℃（中ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも６０℃（中−高ストリンジェンシー）、いっそうより好ましくは少なくとも６５℃（高ストリンジェンシー）および最も好ましくは少なくとも７０℃（超高ストリンジェンシー）で実施される。
長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドである短いプローブに対しては、ストリンジェンシー条件は、標準サウザンブロッティング手順にしたがって、０．９ＭのＮａＣｌ、０．０９ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ−４０、１×のデンハルト溶液、１ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウム、０．１ｍＭのＡＴＰおよび０．２ｍｇ／ｍＬの酵母ＲＮＡ中で、ＢｏｌｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ４８：１３９０）にしたがった計算を使用して計算Ｔｍより約５℃〜約１０℃下でのプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション後洗浄として定義されている。
長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドである短いプローブに対しては、担体材料は、１５分間にわたり６×のＳＣＣ＋０．１％のＳＤＳ中で１回および計算Ｔｍより約５℃〜約１０℃下で６×のＳＳＣを使用してそれぞれ１５分間ずつ２回洗浄される。
塩含有ハイブリダイゼーション条件下では、有効Ｔｍは上首尾のハイブリダイゼーションのためにプローブとフィルター結合ＤＮＡとの間に必要とされる同一性の程度を制御するＴｍである。有効Ｔｍは、様々なストリンジェンシー条件下で２つのＤＮＡがハイブリダイズするために必要とされる同一性の程度を決定するために下記の式を使用して決定することができる。
有効Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ Ｍ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．７２（ホルムアミドの比率）
（ｗｗｗ．ｎｄｓｕ．ｎｏｄａｋ．ｅｄｕ／ｉｎｓｔｒｕｃｔ／ｍｃｃｌｅａｎ／ｐｌｓｃ７３１／ｄｎａ／ｄｎａ６．ｈｔｍを参照されたい）
配列番号１０のＧ＋Ｃ含量は４２％であり、配列番号１１のＧ＋Ｃ含量は４４％である。中ストリンジェンシーに対しては、ホルムアミドは３５％であり、５×のＳＳＰＥに対するＮａ＋濃度は０．７５Ｍである。
また別の重要な関係は、２つのＤＮＡの１％のミスマッチがＴｍを１．４℃低下させることである。４２℃の中ストリンジェンシー条件下で２つのＤＮＡがハイブリダイズするために必要とされる同一性の程度を決定するためには、下記の式が使用される：
相同性率（％）＝１００−［（有効Ｔｍ−ハイブリダイゼーション温度）／１．４］
（ｗｗｗ．ｎｄｓｕ．ｎｏｄａｋ．ｅｄｕ／ｉｎｓｔｒｕｃｔ／ｍｃｃｌｅａｎ／ｐｌｓｃ７３１／ｄｎａ／ｄｎａ６．ｈｔｍを参照されたい）
変異核酸には、配列番号１、２、３、４もしくは５をコードする核酸との所定のパーセント、例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドが含まれる。１つの態様では、本明細書に開示したポリペプチドをコードできる核酸が提供される。また別の態様では、本明細書に開示した核酸は、配列番号９、１０、１１、１２または１３と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である核酸配列を有する。
１つの態様では、本明細書に記載した核酸を含むプラスミドを提供する。１つの態様では、本明細書に記載した核酸を含む、または本明細書に記載したポリペプチドを発現できる発現ベクターを提供する。
本明細書に定義し、本明細書に規定したポリペプチド変異体のいずれかをコードする核酸に相補的な核酸が提供される。さらに、相補体にハイブリダイズすることができる核酸も提供される。また別の実施形態では、本明細書に記載した方法および組成物において使用するための配列は、合成配列である。それには、例えば酵母などの宿主生物内で発現するための最適なコドンを使用して作成された配列が含まれるがそれらに限定されない。本明細書に提供したポリペプチド変異体は、当技術分野において周知の手法にしたがって、合成的に、または宿主細胞内での組換え発現を通して生成することができる。１つの態様では、本明細書に開示したポリペプチドは、組換えポリペプチドである。本明細書に定義した発現ポリペプチド変異体は、任意選択的に使用前に単離される。
また別の実施形態では、本明細書に定義したポリペプチド変異体は、発現後に精製される。ポリペプチド変異体の遺伝子修飾および組換え生産の方法は、例えば、米国特許第７，３７１，５５２号明細書、同第７，１６６，４５３号明細書；同第６，８９０，５７２号明細書；および同第６，６６７，０６５号明細書および米国公開公報特許第２００７／０１４１６９３号明細書；同第２００７／００７２２７０号明細書；同第２００７／００２０７３１号明細書；同第２００７／００２０７２７号明細書；同第２００６／００７３５８３号明細書；同第２００６／００１９３４７号明細書；同第２００６／００１８９９７号明細書；同第２００６／０００８８９０号明細書；同第２００６／０００８８８８号明細書；および同第２００５／０１３７１１１号明細書に記載されている。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、プライマー、ベクター、選択方法、宿主細胞、発現ポリペプチド変異体の精製および再構成ならびに酵素アッセイのために有用なバッファー、ｐＨ範囲、Ｃａ２＋濃度、基質濃度および酵素濃度を含む本明細書に定義したポリペプチド変異体の特性解析を含むこれらの開示の重要な教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列番号１、２、３、４または５のタンパク質、または配列番号１、２、３、４もしくは５のタンパク質をコードする核酸との少なくとも約６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７８％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸配列をコードする核酸配列が提供される。１つの実施形態では、核酸配列は、配列番号９、１０、１１、１２または１３の核酸との少なくとも約６０％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７８％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
ベクター
１つの態様では、本発明は、ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。１つの態様では、細菌細胞がそのベクターを含む。一部の実施形態では、変異体をコードする核酸を含むＤＮＡ構築物は、コーディング配列と機能的に連結した調節配列を含む発現ベクター内の宿主細胞に移される。ベクターは、真菌宿主細胞ゲノム内に統合して、宿主細胞内に導入されると複製できる任意のベクターであってよい。ミズーリ大学のＦＧＳＣ菌株カタログは、好適なベクターを列挙している。好適な発現ベクターおよび／または組込み型ベクターの追加の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＵＡＬ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＲＥ ＧＥＮＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＦＵＮＧＩ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９１），ｐｐ．３９６−４２８；および米国特許第５，８７４，２７６号明細書に提供されている。典型的なベクターには、ｐＦＢ６、ｐＢＲ３２２、ＰＵＣ１８、ｐＵＣ１００およびｐＥＮＴＲ／Ｄ、ｐＤＯＮＴＭ２０１、ｐＤＯＮＲＴＭ２２１、ｐＥＮＴＲＴＭ、ｐＧＥＭ（登録商標）３ＺおよびｐＧＥＭ（登録商標）４Ｚが含まれる。細菌細胞中で使用するための典型には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での複製を許容するｐＢＲ３２２およびｐＵＣ１９ならびに例えばバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属における複製を許容するｐＥ１９４が含まれる。
一部の実施形態では、変異体をコードする核酸は、宿主細胞内での転写を可能にする好適なプロモーターに機能的に連結している。プロモーターは、宿主細胞にとって同種もしくは異種いずれかであるタンパク質をコードする遺伝子由来であってよい。プロモーターの好適な非限定的な例には、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１およびｅｇｌ２プロモーターが含まれる。１つの実施形態では、プロモーターは、宿主細胞にとって天然であるプロモーターである。例えば、Ｐ．サッカロフィラ（Ｐ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）が宿主である場合、プロモーターは天然Ｐ．サッカロフィラ（Ｐ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）プロモーターである。「誘導性プロモーター」は、環境的調節および発生的調節下で活性であるプロモーターである。また別の実施形態では、プロモーターは、宿主細胞にとって異種であるプロモーターである。
一部の実施形態では、コーディング配列は、シグナル配列をコードするＤＮＡ配列と機能的に連結している。また別の態様では、代表的なシグナルペプチドは、配列番号２７である。代表的なシグナルペプチドは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ前駆体の天然シグナル配列である配列番号９である。他の実施形態では、シグナル配列をコードするＤＮＡは、他の細胞外枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）前駆体由来のシグナル配列をコードするヌクレオチド配列で置換される。１つの実施形態では、シグナル配列をコードするポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのすぐ上流およびフレーム内にある。シグナル配列は、宿主細胞と同一種から選択することができる。追加の実施形態では、真菌宿主細胞内に導入すべきＤＮＡ構築物もしくはベクターを含むシグナル配列およびプロモーター配列は同一起源に由来する。一部の実施形態では、発現ベクターはさらに、終止配列を含む。１つの実施形態では、終止配列およびプロモーター配列は、同一起源に由来する。また別の実施形態では、終止配列は、宿主細胞にとって同種である。
一部の実施形態では、発現ベクターは選択可能なマーカーを含む。好適な選択可能なマーカーの例には、抗微生物剤、例えばハイグロマイシンもしくはフレオマイシンに耐性を付与するマーカーが含まれる。栄養選択的マーカーは、さらに好適であり、ａｍｄＳ、ａｒｇＢおよびｐｙｒ４が含まれる。１つの実施形態では、選択的マーカーは、酵素アセトアミダーゼをコードするａｍｄＳ遺伝子である：ａｍｄＳ遺伝子は、形質転換細胞が窒素源としてのアセトアミド上で増殖することを許容する。選択的マーカーとしてのＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ遺伝子の使用は、Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．４：４７５−４７９（１９８５）およびＰｅｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ６１：１５５−１６４（１９８７）に記載されている。
変異体をコードするポリヌクレオチドを備えるＤＮＡ構築物を含む好適な発現ベクターは、所定の宿主生物内で自律的に複製できる、または宿主のＤＮＡに組み込むことができる任意のベクターであってよい。一部の実施形態では、発現ベクターはプラスミドである。一部の実施形態では、遺伝子の発現を得るための２つのタイプの発現ベクターが企図されている。第１発現ベクターは、その中のプロモーター、コーディング領域およびターミネーター全部が発現対象の遺伝子を起源とするＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子切断は、その独自の転写および翻訳調節配列の制御下で発現対象のドメインから離れるために望ましくないＤＮＡ配列を欠失させることによって入手される。第２のタイプの発現ベクターは、前組立てされ、高レベルの転写および選択可能なマーカーのために必要とされる配列を含有する。一部の実施形態では、遺伝子またはその一部に対するコーディング領域は、それが発現構築物およびターミネーター配列の転写制御下にあるようにこの汎用発現ベクター内に挿入される。一部の実施形態では、遺伝子もしくはその一部は、強力なｃｂｈ１プロモーターの下流に挿入される。
宿主／宿主細胞の発現
また別の態様では、本明細書に記載したプラスミドまたは本明細書に記載した発現ベクターを含む、好ましくはそれらを用いて形質転換された宿主細胞が提供される。
また別の態様では、本明細書に記載したポリペプチドを発現できる細胞が提供される。
１つの態様では、本明細書に記載した宿主細胞または本明細書に記載した細胞は、細菌細胞、真菌細胞もしくは酵母細胞である。
また別の態様では、宿主細胞は、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、トルラ（Ｔｏｒｕｌａ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属からなる群より選択される。
また別の態様では、宿主細胞は、ルミノコッカス・ハンセニイ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）からなる群から選択される。
また別の実施形態では、好適な宿主細胞には、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィラス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ラウタス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．ツリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）もしくはＳ．ムリナス（Ｓ．ｍｕｒｉｎｕｓ）からなる群より選択されるグラム陽性細菌、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）もしくはシュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）であるグラム陰性細菌が含まれる。１つの態様では、宿主細胞は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｕｓ）もしくはＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。１つの態様では、宿主細胞は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であり、発現タンパク質は下記でさらに詳述するように、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）シグナル配列を含むように遺伝子組換えされる。１つの態様では、宿主細胞は、特許請求の範囲に規定したポリヌクレオチドを発現する。
一部の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１、２、３、４または５のポリペプチドとの少なくとも約６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７８％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有するアミノ酸配列を用いて本明細書に定義したポリペプチド変異体を発現するように遺伝子組換えされる。一部の実施形態では、本明細書に定義したポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４または５のタンパク質または配列番号１、２、３、４または５のタンパク質をコードする核酸との少なくとも約６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７８％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸配列をコードするであろう。１つの実施形態では、核酸配列は、配列番号９、１０、１１、１２または１３の核酸との少なくとも約６０％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７８％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
ポリペプチドを製造するための方法
また別の態様では、本明細書に記載したポリペプチドを発現する方法は、本明細書に記載した宿主細胞もしくは細胞を入手する工程およびその細胞もしくは宿主細胞からポリペプチドを発現させる工程、および任意選択的にそのポリペプチドを精製する工程を含む。
発現の特徴は、特定の宿主細胞内で変異体が生成された場合に、変化した変異体の発現レベルを意味する。発現は、一般に、所定の期間にわたり当技術分野において公知の標準技術を使用して発酵ブロスから回収可能な活性変異体の量に関する。発現はさらに、宿主細胞内で生成された、または宿主細胞によって分泌された変異体の量もしくは比率に関する可能性がある。発現はさらに、変異ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳の比率に関する可能性もある。
宿主細胞の形質転換、発現および培養
宿主細胞へのＤＮＡ構築物もしくはベクターの導入には、例えば、形質転換法；エレクトロポレーション法；核マイクロインジェクション法；形質導入；トランスフェクション、例えば、リポフェクション媒介性およびＤＥＡＥ−デキストリン媒介性トランスフェクション；リン酸カルシウムＤＮＡ沈降物とのインキュベーション；ＤＮＡ被覆微粒子弾丸を用いた高速衝撃法；およびプロトプラスト融合法などの技術が含まれる。一般的形質転換技術は、当技術分野において公知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７），上記参照，ｃｈａｐｔｅｒ ９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１），上記参照；およびＣａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６（１９８９）を参照されたい。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属内での異種タンパク質の発現は、例えば、米国特許第６，０２２，７２５号明細書；同第６，２６８，３２８号明細書；Ｈａｒｋｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：２２７−２３３（１９９１）；Ｈａｒｋｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．７：５９６−６０３（１９８９）；欧州特許第２４４，２３４号明細書；および欧州特許第２１５，５９４号明細書に記載されている。１つの実施形態では、遺伝的に安定性の形質転換体は、それにより変異体をコードする核酸が宿主細胞染色体内に安定性で統合されるベクター系を用いて構築される。形質転換体は、次に、公知の技術によって精製される。
１つの非限定的な例では、ａｍｄＳマーカーを含む安定性形質転換体は、非安定性形質転換体とは、それらのより高速の増殖速度およびアセトアミドを含有する固体培養培地上のギザギザではなくむしろ平滑な輪郭を備える環状コロニーの形成によって識別される。さらに、一部の場合には、安定性のまた別の試験は、固体の非選択的培地、例えばアセトアミドが欠如する培地上で形質転換体を増殖させる工程、この培養培地から胞子を採取する工程、および引き続いてアセトアミドを含有する選択的培地上で発芽および増殖するこれらの胞子の百分率を決定する工程によって実施される。形質転換体を選択するためには、当技術分野において公知の他の方法を使用できる。
活性の同定
宿主細胞内での変異体の発現を評価するために、アッセイは、発現タンパク質、対応するｍＲＮＡまたはβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することができる。例えば、好適なアッセイには、ノーザンブロッティングおよびサウザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）および適切に標識したハイブリダイジングプローブを使用するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。好適なアッセイには、さらにサンプル中の活性を測定する工程もまた含まれる。変異体の活性の好適なアッセイには、ＯＮＰＧベースアッセイまたは例えば本明細書の方法および実施例に記載したような反応混合物中のグルコースを決定する工程が含まれるがそれらに限定されない。
本明細書に開示したポリペプチドを精製するための方法
一般に、細胞培養内で生成された変異体は培地中に分泌され、例えば、細胞培養培地から望ましくない成分を除去することによって、精製もしくは単離することができる。一部の場合には、変異体は、細胞溶解物から回収できる。そのような場合には、酵素は当業者によって日常的に使用される技術を使用して生成された細胞から精製される。例には、例えば、アフィニティクロマトグラフィー、高分解能イオン交換を含むイオン交換クロマトグラフィー法、疎水性相互作用クロマトグラフィー、二相分配法、エタノール沈降法、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上もしくは例えばＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降法およびＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を使用するゲル濾過法が含まれるがそれらに限定されない。意図された用途に応じて、本明細書で開示するポリペプチドは、例えば凍結乾燥されていてもよいし溶液で調製されていてもよい。一態様では、本明細書で開示するポリペプチドは凍結乾燥形態である。別の態様では、本明細書で開示するポリペプチドは溶液である。
本明細書で開示するポリペプチドを固定化する方法および製剤化する方法
当分野で既知の方法に従ってポリペプチド組成物を調製することができ、このポリペプチド組成物は液体組成物の形態であってもよいし乾燥組成物の形態であってもよい。例えば、ポリペプチド組成物は顆粒状の形態であってもよいし微顆粒状の形態であってもよい。この組成物に含めるポリペプチドを、当分野で既知の方法に従って安定化させることができる。
下記に、本発明の方法で使用するポリペプチドまたはポリペプチド組成物の好ましい使用の例を示す。
方法
本発明の方法では、第１のサッカリドおよび第２のサッカリドを、ガラクトース部分の第１のサッカリドから第２のサッカリドへの転移を可能にする酵素と接触させる。一実施形態では、この酵素を、第１のサッカリドと第２のサッカリドとの混合物に添加する。一実施形態では、第２のサッカリドを、第１のサッカリドと酵素との混合物に添加する。一実施形態では、第１のサッカリドを、第２のサッカリドと酵素との混合物に添加する。
本発明の方法では、ガラクトース部分の第１のサッカリドから第２のサッカリドへの転移を酵素が触媒することができるような温度で、第１のサッカリドおよび第２のサッカリドと酵素とを接触させる。正確な温度は、酵素の性質および量ならびに第１のサッカリドおよび第２のサッカリドの性質および量等の因子によって決まる。
一実施形態（具体的には、ラクツロース等の最終生成物においてガラクトース部分とフルクトース部分とが連結されている実施形態）では、この方法を０〜１００℃の温度で実行する。一実施形態では、この方法を０〜１０℃の温度で実行する。一実施形態では、この方法を４５〜６０℃の温度で実行する。
別の実施形態（具体的には、ラクトスクロース等の最終生成物においてガラクトース部分とフルクトース部分とがガラクトースまたはフルクトース以外の部分により離れている実施形態）では、この方法を０〜１００℃の温度で実行する。一実施形態では、この方法を３０〜７０℃の温度で実行する。一実施形態では、この方法を４０〜６０℃の温度で実行し、特に４５〜５５℃の温度で実行し、最も好ましくは５０℃の温度で実行する。
本発明の方法では、ガラクトース部分の第１のサッカリドから第２のサッカリドへの転移を酵素が触媒するのを可能にするのに十分な時間にわたり、第１のサッカリドおよび第２のサッカリドと酵素とを接触させる。正確な反応時間は、酵素の性質および量ならびに第１のサッカリドおよび第２のサッカリドの性質および量等の因子によって決まる。
一実施形態（具体的には、ラクツロース等の最終生成物においてガラクトース部分とフルクトース部分とが連結されている実施形態）では、この方法を１分〜２４時間の期間にわたり実行する。一実施形態では、この方法を１０分〜６時間の期間にわたり実行する。一実施形態では、この方法を１５分〜５時間の期間にわたり実行する。
別の実施形態（具体的には、ラクトスクロース等の最終生成物においてガラクトース部分とフルクトース部分とがガラクトースまたはフルクトース以外の部分により離れている実施形態）では、この方法を１分〜４８時間の期間にわたり実行する。一実施形態では、この方法を１０分〜２４時間の期間にわたり実行する。一実施形態では、この方法を３０分〜１２時間の期間にわたり実行し、特に２〜８時間の期間にわたり実行する。
本発明の方法では、典型的にはガラクトース部分の第１のサッカリドから第２のサッカリドへの転移を酵素が触媒することができるようなｐＨで、第１のサッカリドおよび第２のサッカリドと酵素とを接触させる。正確なｐＨは、酵素の性質および量、第１のサッカリドおよび第２のサッカリドの性質および量ならびにこの方法を実行する組成物等の因子によって決まる。
一実施形態（限定されないが具体的には、この方法を乳組成物中においてｉｎ ｓｉｔｕで実行する実施形態）では、この方法を低くとも５．５のｐＨで実行し、例えば低くとも５．６のｐＨで実行し、例えば低くとも５．７のｐＨで実行し、例えば低くとも５．８のｐＨで実行し、例えば低くとも５．９のｐＨで実行し、例えば低くとも６．０のｐＨで実行し、例えば低くとも６．１のｐＨで実行し、例えば低くとも６．２のｐＨで実行し、例えば低くとも６．３のｐＨで実行し、例えば低くとも６．４のｐＨで実行し、例えば低くとも６．５のｐＨで実行し、例えば５．５〜９．５のｐＨで実行し、例えば５．７５〜８．５のｐＨで実行し、例えば６．０〜８．０のｐＨで実行し、例えば６．２５〜７．５のｐＨで実行し、例えば６．４〜７．０のｐＨで実行し、例えば６．５〜６．８のｐＨで実行する。
一実施形態（具体的には、ラクツロース等の最終生成物においてガラクトース部分とフルクトース部分とが連結されている実施形態）では、この方法を低くとも５．５のｐＨで実行し、例えば低くとも５．６のｐＨで実行し、例えば低くとも５．７のｐＨで実行し、例えば低くとも５．８のｐＨで実行し、例えば低くとも５．９のｐＨで実行し、例えば低くとも６．０のｐＨで実行し、例えば低くとも６．１のｐＨで実行し、例えば低くとも６．２のｐＨで実行し、例えば低くとも６．３のｐＨで実行し、例えば低くとも６．４のｐＨで実行し、例えば低くとも６．５のｐＨで実行し、例えば５．５〜９．５のｐＨで実行し、例えば５．７５〜８．５のｐＨで実行し、例えば６．０〜８．０のｐＨで実行し、例えば６．２５〜７．５のｐＨで実行し、例えば６．４〜７．０のｐＨで実行し、例えば６．５〜６．８のｐＨで実行する。
別の実施形態（具体的には、ラクトスクロース等の最終生成物においてガラクトース部分とフルクトース部分とがガラクトースまたはフルクトース以外の部分により離れている実施形態）では、この方法を低くとも５．５のｐＨで実行し、例えば低くとも５．６のｐＨで実行し、例えば低くとも５．７のｐＨで実行し、例えば低くとも５．８のｐＨで実行し、例えば低くとも５．９のｐＨで実行し、例えば低くとも６．０のｐＨで実行し、例えば低くとも６．１のｐＨで実行し、例えば低くとも６．２のｐＨで実行し、例えば低くとも６．３のｐＨで実行し、例えば低くとも６．４のｐＨで実行し、例えば低くとも６．５のｐＨで実行し、例えば５．５〜９．５のｐＨで実行し、例えば５．７５〜８．５のｐＨで実行し、例えば６．０〜８．０のｐＨで実行し、例えば６．２５〜７．５のｐＨで実行し、例えば６．４〜７．０のｐＨで実行し、例えば６．５〜６．８のｐＨで実行する。
好ましくは、温度、ｐＨおよび／またはインキュベーション時間の組合せは、少なくとも５％のトランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも１０％のトランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも１５％、２０％、２５％、２６％、２８％、３０％、４０％、５０％、６０％または７５％のトランスフェラーゼ活性が確実に存在するのに有効である。
一実施形態では、ラクツロースの収率は少なくとも１０％である。一実施形態では、ラクツロースの収率は少なくとも１２％である。一実施形態では、ラクツロースの収率は少なくとも１５％である。一実施形態では、ラクツロースの収率は少なくとも１８％である。一実施形態では、ラクツロースの収率は少なくとも２０％である。一実施形態では、ラクツロースの収率は少なくとも２２％である。一実施形態では、ラクツロースの収率は少なくとも２５％である。この収率は、出発物質として使用するラクトースおよびフルクトースの総重量に基づいて重量で算出される。
本発明の方法を食品組成物中においてｉｎ ｓｉｔｕで実行することができる。一実施形態では、この食品組成物は乳製品組成物（ｄａｉｒｙ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）である。一実施形態では、この食品組成物は乳または乳を含む組成物である。
用語「乳」は、本明細書で使用する場合、動物または野菜のいずれかを起源とする乳を含むことができ、全乳、脱脂乳および半脱脂乳が挙げられる。スイギュウ、（伝統的な）ウシ、ヒツジ、ヤギ等の動物源由来の乳を単独でまたは組み合わせて使用することができる。豆乳等の野菜乳を単独でまたは動物乳と組み合わせて使用することもできる。野菜乳を動物乳と組み合わせて使用する場合、この組合せは概して、約１５重量／重量％未満または２０重量／重量％未満または２５重量／重量％未満の低い割合（の野菜乳）を含む。
１つの態様では、本明細書において、ラクトースを含む基質を本明細書に記載したポリペプチドで処理することにより食品を製造するための方法が提供される。
１つの態様では、本明細書において、ラクトースを含むミルクベース基質を本明細書に記載したポリペプチドで処理することにより乳製品を製造するための方法が提供される。１つの態様では、ラクトースを含む基質は、さらにβ−ガラクトシダーゼを加水分解する工程により処理される。
本発明に従って調製した食品成分の形態等の酵素調製物は、用途および／または適用の様式および／または投与の様式に応じて、溶液の形態であってもよいし固体としての形態であってもよい。固体形態は、乾燥酵素粉末または顆粒状酵素のいずれかであることができる。
乾燥酵素製剤の例として、噴霧乾燥製品、ミキサー造粒製品、層状製品（例えば流動床顆粒）、押し出し顆粒またはペレット化顆粒、小球化製品および凍結乾燥製品が挙げられる。
一態様では、本明細書で開示する細胞またはポリペプチドを含む組成物（好ましくは食品組成物、より好ましくは乳製品組成物）が提供される。
一実施形態では、この乳製品組成物の初期成分としてラクトースが存在する。一実施形態では、この乳製品組成物にラクトースを添加する。
用途および製品
本発明の方法の生成物は、ガラクトース部分とフルクトース部分とを含むサッカリドである。
一実施形態では、本発明の方法の生成物は、典型的にはグリコシド結合によりガラクトース部分がフルクトース部分に連結されているサッカリドである。この実施形態では、このグリコシド結合は、１，４’−グリコシド結合（１，４’−α−グリコシド結合であってもよいし１，４’−β−グリコシド結合であってもよい）、１，６’−グリコシド結合（１，６’−α−グリコシド結合であってもよいし１，６’−β−グリコシド結合であってもよい）、１，２’−グリコシド結合（１，２’−α−グリコシド結合であってもよいし１，２’−β−グリコシド結合であってもよい）または１，３’−グリコシド結合（１，３’−α−グリコシド結合であってもよいし１，３’−β−グリコシド結合であってもよい）であることができる。一実施形態では、このグリコシド結合は１，４’−グリコシド結合である。一実施形態では、このグリコシド結合は１，４’−α−グリコシド結合である。一実施形態では、このグリコシド結合は１，４’−β−グリコシド結合である。
一実施形態では、この生成物はラクツロース（即ち４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−Ｄ−フルクトフラノース）である。このラクツロースは概して、第１のサッカリドがラクトースであり第２のサッカリドがフルクトースである本発明の方法により形成される。
一実施形態では、本発明の方法の生成物は、ガラクトース部分とフルクトース部分とがガラクトースまたはフルクトース以外の少なくとも１個の単糖部分により離れているサッカリドである。典型的には、この生成物中において、ガラクトース部分とフルクトース部分とが、１〜１０個の、好ましくは１〜５個の、より好ましくは１個、２個または３個の、更により好ましくは１個または２個の、最も好ましくは１個のみの単糖部分により離れている。
この生成物中においてガラクトース部分とフルクトース部分とを離す単糖部分は、上記で列挙した単糖部分のいずれかであることができるが、但しガラクトースまたはフルクトースではない。一実施形態では、ガラクトース部分とフルクトース部分とを離す単糖部分はグルコース部分である。
ガラクトース部分とフルクトース部分とを離す単糖部分は概して、これらの部分にグリコシド結合により連結されている。この実施形態では、このグリコシド結合は、１，４’−グリコシド結合（１，４’−α−グリコシド結合であってもよいし１，４’−β−グリコシド結合であってもよい）、１，６’−グリコシド結合（１，６’−α−グリコシド結合であってもよいし１，６’−β−グリコシド結合であってもよい）、１，２’−グリコシド結合（１，２’−α−グリコシド結合であってもよいし１，２’−β−グリコシド結合であってもよい）または１，３’−グリコシド結合（１，３’−α−グリコシド結合であってもよいし１，６’−β−グリコシド結合であってもよい）であることができる。一実施形態では、このグリコシド結合は１，４’−グリコシド結合である。一実施形態では、このグリコシド結合は１，４’−α−グリコシド結合である。一実施形態では、このグリコシド結合は１，４’−β−グリコシド結合である。
一実施形態では、この生成物はラクトスクロース（即ちβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−フルクトフラノース）である。このラクトスクロースは概して、第１のサッカリドがラクトースであり第２のサッカリドがスクロースである本発明の方法を使用して形成される。
本発明の生成物（典型的にはラクツロースおよび／またはラクトスクロース）を食料品に組み込むことができる。用語「食料品」は、本明細書で使用する場合、ヒトおよび／または動物による消費に適している物質を意味する。
適切には、用語「食料品」は、本明細書で使用する場合、消費の準備ができている形態の食料品を意味することができる。しかしながら、或いはまたは加えて、用語食料品は、本明細書で使用する場合、食料品の調製で使用する１種または複数種の食品材料を意味することができる。食料品は、用途および／または適用の様式および／または投与の様式に応じて、溶液もしくは乳濁液の懸濁液の形態であってもよいし固体としての形態であってもよい。
機能性食品等の食品としてまたはこの食品の調製で使用する場合、本発明の組成物を、下記の内の１種または複数種と共に使用することができる：栄養的に許容される担体、栄養的に許容される希釈剤、栄養的に許容される賦形剤、栄養的に許容される添加剤、栄養的に許容されるアジュバント、栄養的に許容される活性成分。
食料品の例として下記の内の１種または複数種が挙げられるがこれらに限定されない：卵、卵ベースの製品、例えば限定されないがマヨネーズ、サラダドレッシング、ソース、アイスクリーム、卵粉、改質された卵黄およびこれらから作られた製品；ベークド製品、例えばパン、ケーキ、甘いパン生地製品（ｓｗｅｅｔ ｄｏｕｇｈ ｐｒｏｄｕｃｔ）、積層状生地、液状バター、マフィン、ドーナツ、ビスケット、クラッカーおよびクッキー；菓子、例えばチョコレート、キャンディ、キャラメル、ハラワ（ｈａｌａｗａ）、ガム、例えば無糖ガムおよび砂糖入りガム、バブルガム、ソフトバブルガム、チューイングガムおよびプディング；冷凍製品、例えばソルベ、好ましくは冷凍乳製品、例えばアイスクリームおよびアイスミルク；乳製品、例えばチーズ、バター、ミルク、コーヒークリーム、ホイップクリーム、カスタードクリーム、乳飲料およびヨーグルト；ムース、ホイップ野菜クリーム、肉製品、例えば加工肉製品；食用油および食用脂、気泡ホイップ製品および非気泡ホイップ製品、水中油型乳濁液、油中水型乳濁液、マーガリン、ショートニングおよびスプレッド、例えば低脂肪スプレッドおよび超低脂肪スプレッド；ドレッシング、マヨネーズ、ディップ、クリームベースのソース、クリームベースのスープ、飲料、スパイスエマルションおよびソース。
ある特定の実施形態では、本発明に従う食料品は「高付加価値食品」（例えばケーキ、ペストリー、菓子、チョコレート、ファッジおよび同類のもの）であることができる。
一態様では、本発明に従う食料品は、生地製品またはベークド製品、例えばパン、フライ製品、スナック、ケーキ、パイ、ブラウニー、クッキー、ヌードル、スナック品、例えばクラッカー、グラハムクラッカー、プレッツェルおよびポテトチップスおよびパスタであることができる。
更なる態様では、本発明に従う食料品は、植物由来の製品、例えば小麦粉、プレミックス、油、脂、カカオバター、コーヒーホワイトナー、サラダドレッシング、マーガリン、スプレッド、ピーナッツバター、ショートニング、アイスクリーム、食用油であることができる。
別の態様では、本発明に従う食料品は、乳製品、例えばバター、ミルク、クリーム、様々な形態（例えば細切り、ブロック、スライスまたは粉）のチーズ（例えばナチュラルチーズ、プロセスチーズおよび模造チーズ）、クリームチーズ、アイスクリーム、冷菓、ヨーグルト、ヨーグルト飲料、バター脂肪、無水乳脂肪、乳清を含有する食品および飲料、ならびにその他の乳製品であることができる。
用語「乳」は、本発明の文脈において、任意の動物（例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウまたはラクダ）から得られる乳状分泌物と理解すべきである。
本文脈において、用語「乳ベースの基質」は、あらゆる生のおよび／もしくは加工された乳物質または乳成分に由来する物質を意味する。有用な乳ベースの基質として、ラクトースを含むあらゆる乳または乳様製品の溶液／懸濁液、例えば全乳または低脂肪乳、脱脂乳、バター乳、再構成粉乳、練乳、粉乳の溶液、ＵＨＴ乳、乳清、乳清透過物、酸性乳清またはクリームが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、この乳ベースの基質は乳または脱脂粉乳の水溶液である。この乳ベースの基質は生乳と比べて濃縮されていてもよい。一実施形態では、この乳ベースの基質はタンパク質対ラクトースの比が少なくとも０．２であり、好ましくは少なくとも０．３であり、少なくとも０．４であり、少なくとも０．５であり、少なくとも０．６である、または最も好ましくは少なくとも０．７である。この乳ベースの基質を、当分野で既知の方法に従って均質化してもよい、および／または低温殺菌してもよい。
「均質化」は、本明細書で使用する場合、可溶性の懸濁液または乳濁液を得るための激しい混合を意味する。均質化を実施して、乳脂肪がもはや乳から分離しないように乳脂肪をより小さいサイズへと粉砕することができる。このことを、小さい開口部に高圧で乳を無理に通すことにより達成することができる。
「低温殺菌」は、本明細書で使用する場合、乳ベースの基質中において微生物等の生きた生物の存在を低減することまたは除去することを意味する。好ましくは、低温殺菌は特定の期間にわたり特定の温度を維持することにより達成される。この特定の温度は通常、加熱により達成される。温度および持続時間を、乳中のある特定の細菌（例えば有害な細菌）を死滅させるもしくは不活性化させるためにおよび／または酵素を不活性化させるために選択することができる。急冷工程が続いてもよい。本発明の文脈における「食品」または「食品組成物」は、動物またはヒトによる消費に適したあらゆる食品または飼料製品であることができる。
本発明の文脈における「乳製品」は、主成分の１種が乳ベースであるあらゆる食品であることができる。好ましくは、主成分は乳ベースである。より好ましくは、主成分は、トランスガラクトシル化活性を有する酵素で処理されている乳ベースの基質である。 本明細書に記載した乳製品は、例えば、スキムミルク、低脂肪乳、全乳、クリーム、ＵＨＴ乳、延長された貯蔵寿命を有するミルク、発酵乳製品、チーズ、ヨーグルト、バター、デイリースプレッド、バターミルク、酸性化ミルク飲料、サワークリーム、ホエイベース飲料、アイスクリーム、コンデンスミルク、加糖練乳もしくはフレーバードミルク飲料であってよい。乳製品は、当技術分野において公知の任意の方法によって製造できる。
乳製品は、追加して、非ミルク成分、例えば植物性成分、例えば植物油、植物性タンパク質および／または植物性炭水化物を含むことができる。乳製品は、さらに添加物、例えば酵素、矯味剤、微生物培養、例えばプロバイオティクス培養、塩、甘味料、糖、酸、果実、果汁または当技術分野において乳製品の成分もしくは添加物として公知の任意の他の成分を含むことができる。
本発明の１つの実施形態では、１つ以上のミルク成分および／またはミルク分画は、乳製品の少なくとも５０重量／重量％、例えば少なくとも７０重量／重量％、例えば少なくとも８０重量／重量％、好ましくは少なくとも９０重量／重量％を占める。
本発明の１つの実施形態では、トランスガラクトシル化活性を有する本明細書に定義した酵素を用いて処理されている１つ以上のミルクベース基質は、乳製品の少なくとも５０重量／重量％、例えば少なくとも７０重量／重量％、例えば少なくとも８０重量／重量％、好ましくは少なくとも９０重量／重量％を占める。
本文脈において、「主成分の１種」は、乳製品の総乾燥物質の２０％超を構成する、好ましくは３０％超を構成するまたは４０％超を構成する乾燥物質を有する成分を意味しており、「主成分」は、乳製品の総乾燥物質の５０％超を構成する、好ましくは６０％超を構成するまたは７０％超を構成する乾燥物質を有する成分を意味する。
本文脈における「発酵乳製品」は、製造プロセスの一部が任意のタイプの発酵で形成されいてるあらゆる乳製品と理解すべきである。発酵乳製品の例は、ヨーグルト、バターミルク、クリームフレッシュ、クォーク（ｑｕａｒｋ）およびフロマージュフレのような製品である。発酵乳製品の別例はチーズである。発酵乳製品を当分野で既知の任意の方法により製造することができる。
用語「発酵」は、スターター培養等の微生物の作用による炭水化物のアルコールまたは酸への変換を意味する。一態様では、発酵は、ラクトースの乳酸への変換を含む。この文脈において、「微生物」として、乳基質を発酵させることができるあらゆる細菌または真菌を挙げることができる。
大多数の発酵乳製品のために使用される微生物は、一般に乳酸菌と呼ばれる細菌の群から選択される。本明細書で使用する用語「乳酸菌」は、糖を発酵させて主として生成される酸としての乳酸、酢酸およびプロピオン酸を含む酸を生成するグラム陽性菌、微好気性菌もしくは嫌気性菌を指定する。工業的に最も有用な乳酸菌は、ラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、ロイコノストック種（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ．）、シュードロイコノストック種（Ｐｓｅｕｄｏｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ．）、ペプチドコッカス種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ブレビバクテリウム種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、エンテロコッカス種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）およびプロピオニバクテリウム種（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）を含むラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目内で見いだされる。さらに、嫌気性菌、単独もしくは乳酸菌と組み合わせて食品培養として頻回に使用されるビフィドバクテリア、すなわちビフィドバクテリウム種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）に属する乳酸産生菌は、一般に乳酸菌の群に含まれる。乳酸菌は、通常は、バルクスターター増殖のための冷凍もしくはフリーズドライ培養として、または発酵乳製品を製造するための発酵容器内もしくはバット内への直接接種のために企図されたいわゆる「Ｄｉｒｅｃｔ Ｖａｔ Ｓｅｔ」（ＤＶＳ）培養としてのいずれかで乳業に供給される。そのような培養は、一般に、「スターター培養物」もしくは「スターター」と呼ばれる。
乳酸菌の通例使用されるスターター培養物菌株は、一般に約３０℃の最適増殖温度を有する中温性生物および約４０〜４５℃の範囲内の最適増殖温度を有する高温性生物に分けられる。中温性群に属する典型的な生物には、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ロイコノストック・メセンテロイデス亜種クレモリス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、シュードロイコノストック・メセンテロイデス亜種クレモリス（Ｐｓｅｕｄｏｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス次亜種ジアセチルラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ ｂｉｏｖａｒ．ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ亜種カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｃａｓｅｉ）およびラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）が含まれる。高温性乳酸菌種には、例として、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ亜種ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）およびラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）が含まれる。さらに、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）を含むビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する嫌気性細菌も通例は乳製品スターター培養物として使用され、一般に乳酸菌の群に含まれる。さらに、プロピオニバクテリウムの種は、特にチーズの製造における乳製品スターター培養物として使用される。さらに、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する生物は、通例は食品スターター培養物として使用される。
微生物スターター培養物の別の群は、特に所定のタイプのチーズおよび飲料の製造において使用される酵母培養物および糸状菌の培養物を含む真菌培養物である。真菌の例には、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、ペニシリウム・カンディダム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ゲオトリクム・カンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）、トルラ・ケフィア（Ｔｏｒｕｌａ ｋｅｆｉｒ）、サッカロミセス・ケフィア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｅｆｉｒ）およびサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が含まれる。
本発明の１つの実施形態では、ミルクベース基質の発酵のために使用される微生物は、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）またはストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびラクトバチルス・デルブリュッキイ亜種ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）である。
本発明の方法において使用できる発酵工程は当技術分野において周知であり、当業者であれば、例えば温度、酸素、微生物の量および特性、例えば炭水化物、香味料、鉱物、酵素などの添加物および処理時間などを好適な工程条件を選択する方法を知っているであろう。発酵条件は、本発明の目的の製品を支持できるように選択される。
発酵の結果として、ミルクベース基質のｐＨが低下させられるであろう。本発明の発酵乳製品のｐＨは、３．５〜６の範囲内、例えば３．５〜５の範囲内、好ましくは３．８〜４．８の範囲内であってよい。
別の態様では、本発明に従う食料品は、動物由来成分を含む食品（例えば加工肉製品、食用油、ショートニング）であることができる。
更なる態様では、本発明に従う食料品は、飲料、果実、混合果実、野菜、マリネまたはワインであることができる。
一部の食品は栄養補助食品である。「栄養補助食品」は、栄養価に加えて健康上の利益をもたらす食品を意味する。健康食品は食品と薬との間の境界線を横切る。
本発明の方法の生成物（典型的にはラクツロース）を医薬組成物に組み込むこともできる。そのような組成物は、本発明の方法の生成物に加えて、従来の医薬用添加剤およびその他の従来の薬学的に不活性な薬剤を含むことができる。更に、この組成物は、本発明の方法の生成物に加えて活性剤を含むことができる。
この組成物は液体、半液体または固体の形態であることができ、使用する投与経路に適した様式で処方される。経口投与の場合、カプセルおよび錠剤が概して使用される。非経口投与の場合、本明細書で説明するように調製された凍結乾燥粉末の再構成が概して使用される。
本発明の方法の生成物を含む組成物を、経口的に、非経口的に、腹腔内に、静脈内に、動脈内に、経皮的に、舌下に、筋肉内に、直腸に、経口腔的に（ｔｒａｎｓｂｕｃｃａｌｌｙ）、鼻腔内に、リポソームに、吸入を介して、経膣的に、眼内に、（例えばカテーテルまたはステントによる）局所送達を介して、皮下に、脂肪内に、関節内に、または髄腔内に投与することができる、または共投与することができる。本発明の方法の生成物を徐放剤形で投与することもできる、または共投与することもできる。
本発明の方法の生成物を、あらゆる従来の剤形で投与することができる、または共投与することができる。本発明の文脈における共投与は、臨床転帰の改善を達成するための協調的処置の経過において複数種の治療薬（この治療薬の内の１種は本発明の方法の生成物を含む）の投与を意味するように意図されている。そのような共投与は同一の広がりを持っていてもよく、即ち重複する期間中に生じてもよい。
非経口投与、皮内投与、皮下投与または局所投与に使用する溶液または懸濁液は、下記の成分の内の１種または複数種を任意選択で含むことができる：無菌希釈剤、例えば注射用の水、生理食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒；抗微生物剤、例えばベンジルアルコールおよびメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸および亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝液、例えば酢酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩；浸透圧の調整用の薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはブドウ糖、ならびに組成物の酸性度またはアルカリ度の調整用の薬剤、例えばアルカリ剤または酸性化剤または緩衝液、例えば炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩、塩酸および有機酸（例えば酢酸およびクエン酸）。非経口製剤を、ガラス、プラスチックまたはその他の適切な材料で作られたアンプル、ディスポーザブルシリンジまたは単回用量バイアルもしくは複数回用量バイアルに任意選択で封入することができる。
本発明の方法の生成物を組成物に混合してまたは添加して、溶液、懸濁液、乳濁液または同類のものを形成することができる。結果として生じる組成物の形態を、意図される投与様式および選択される担体または賦形剤での化合物の溶解性等の多くの因子によって決めることができる。処置する疾患を寛解させるのに必要な有効濃度を経験的に決定することができる。
本発明に係る組成物は、本発明の方法の生成物を適量含む単位剤形（例えば錠剤、カプセル、丸剤、粉末、吸入用の乾燥粉末、顆粒、無菌非経口溶液または無菌非経口懸濁液、および経口溶液または経口懸濁液、油−水型乳濁液）にてヒトまたは動物への投与用に任意選択で提供される。この組成物は、本発明に係る１種または複数種の化合物に加えて下記を含むことができる：希釈剤、例えばラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムまたはカルボキシメチルセルロース；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルク；ならびに結合剤、例えばデンプン、天然ガム、例えばガムアカシア、ゼラチン、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびこの誘導体、ポビドン、クロスポビドンおよび当業者に既知のその他のそのような結合剤。
例えば担体（例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、グリコール、エタノールおよび同類のもの等）中に上記で定義した活性化合物および任意選択で薬学的アジュバントを溶解させて、分散させてまたは別の方法で混合して溶液または懸濁液を形成することにより、液状の薬学的に投与可能な組成物を調製することができる。
剤形または組成物は、本発明に係る方法の１種または複数種の生成物を０．００５％〜１００％（重量／重量）の範囲にて任意選択で含むことができ、明細書で説明するもの等の追加の物質が残余を構成する。経口投与の場合、薬学的に許容される組成物は任意の１種または複数種の一般に用いられる添加剤（例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルカム、セルロース誘導体、クロスカルメロースナトリウム、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム等）を任意選択で含むことができる。
これらの製剤を調製する方法は当業者に既知である。この組成物は、本発明に係る方法の生成物の内の１種または複数種を任意選択で０．０１％〜１００％（重量／重量）含むことができ、任意選択で０．１〜９５％含むことができ、任意選択で１〜９５％含むことができる。
実施例１−ラクツロースの生成
Ａｒｌａ Ｍｉｎｉｍａｅｌｋ０．５％脂肪（Ａｒｌａ、Ｂｒａｂｒａｎｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）（１リットル当たりラクトース約４５ｇを含む）をラクトース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で４５、７０および９０ｇ／ラクトースＬの濃度まで強化した。加えて、フルクトース（５０、６０、７０および８０ｇ／Ｌ）を個々のミルクに添加した。その後、実施例４で開示されている（国際公開第２０１３／１８２６２６号パンフレットにおいて「ＢＩＦ ９１７」としても開示されている）β−ガラクトシダーゼ（２６２５Ｕ／Ｌ）を添加し、このミルクを最大で８時間にわたり５０℃でインキュベートした後、ラクツロースの濃度をＨＰＬＣにより分析した。
全ての標準物質（ラクトース、グルコース、ガラクトースおよびＧＯＳ）を再蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）で調製し、０．４５μｍシリンジフィルタに通してろ過した。各標準物質のセットを１０〜２００，０００ｐｐｍの濃度範囲で調製した。
ヨーグルト／ミルクマトリックス中での上記糖のセットの定量を評価するために、上記標準物質をミルク試料およびヨーグルト試料に添加し、内部コントロールとして使用した。１０分にわたり９５℃まで試料を加熱することにより、活性なβ−ガラクトシダーゼを含む全てのミルク試料およびヨーグルト試料を不活性化した。全てのミルク試料を９６ウェルＭＴＰプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）中で調製し、最低２０倍に希釈し、０．２０μｍ９６ウェルプレートフィルタに通してろ過した後に分析した（Ｃｏｒｎｉｎｇフィルタプレート、ＰＶＤＦ親水性膜、ＮＹ、ＵＳＡ）。５０，０００ｐｐｍ（５重量／体積％）超のラクトースを含む試料を３０℃まで加熱して、適切な可溶化を確実なものとした。全てのヨーグルト試料を秤量し、ｄｄＨ２Ｏで１０倍に希釈した後、この試料を、数分にわたりＵｌｔｒａ ｔｕｒｒａｘ ＴＰ１８／１０（Ｊａｎｋｅ ＆ Ｋｕｎｋｅｌ Ｉｋａ−ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、Ｂｉｅ ＆ Ｂｅｒｎｔｓｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して均質化した。β−ガラクトシダーゼを加熱処理により不活性化し、試料を９６ウェルＭＴＰプレート中で更に希釈し、０．２０μｍ９６ウェルプレートフィルタに通してろ過した後に分析した（Ｃｏｒｎｉｎｇフィルタプレート、ＰＶＤＦ親水性膜、ＮＹ、ＵＳＡ）。全ての試料を、テープで密封した９６ウェルＭＴＰプレート中で分析した。
計器による計測
ガラクト−オリゴ糖（ＧＯＳ）、ラクトース、グルコースおよびガラクトースの定量をＨＰＬＣにより実施した。試料の分析を、ＤＧＰ−３６００ＳＤ Ｄｕａｌ−Ｇｒａｄｉｅｎｔ分析用ポンプ、ＷＰＳ−３０００ＴＳＬサーモスタットオートサンプラ、ＴＣＣ−３０００ＳＤサーモスタットカラムオーブンおよびＲＩ−１０１屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ、ＪＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を備えたＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実行した。データの取得および分析にＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎデータシステムソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．８０、ＤＵ１０Ａ Ｂｕｉｌｄ ２８２６、１７１９４８）を使用した。
クロマトグラフ条件
７０℃で操作する分析ガードカラム（Ｃａｒｂｏ−Ａｇ＋中性、ＡＪ０−４４９１、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を備えたＲＳＯオリゴ糖カラム、Ａｇ＋４％架橋（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用するＨＰＬＣにより試料を分析した。このカラムを、０．３ｍｌ／分の流速で再蒸留水（０．４５μｍの再生セルロース膜に通してろ過し、ヘリウムガスでパージした）により溶出させた。
総実行時間が３７分である分析の間中、０．３ｍｌ／分のアイソクラチックフロー（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｆｌｏｗ）を維持し、注入量を１０μＬに設定した。全ての成分の可溶化を確実なものとするために、サーモスタットオートサンプラのコンパートメント中において試料を３０℃で保持した。溶出液を屈折率検出器（ＲＩ−１０１、Ｓｈｏｄｅｘ、ＪＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）でモニタリングし、所与の標準物質のピーク面積に対するピーク面積によって定量を行なった。Ｖｉｖｉｎａｌ ＧＯＳシロップ（Ｆｒｉｅｓｌａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｄｏｍｏ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）での３以上の程度のピーク（ＤＰ３＋）を、この製品中のＧＯＳ含有量に関する製造業者の公表内容に従って、全てのガラクトオリゴ糖（ＤＰ３＋）の定量用の標準として使用した。全てのＤＰ３＋ガラクト−オリゴ糖成分に対する応答が同一であるという仮定を、物質収支により確認した。
ＨＰＬＣ分析の前に、このミルクを水で２０倍に希釈し（９５℃／１５分）、続いて０．２２μｍろ過した。
図１、図２および図３は、それぞれ４．５％、７．０％および９．０％（重量／体積）のラクトース（４５、７０および９０ｇ／Ｌのラクトースに相当する）を使用して達成された結果を示す。これらの図に示すように、生成されたラクツロースの濃度は、最初に加えたラクトースおよびフルクトースの濃度に依存した。
表１は、７％のラクトースと様々な濃度のフルクトースとを使用したラクツロースの収率（糖の合計）［％］を示す。
Figure 0006851967
実施例２−ラクツロースの生成
Ａｒｌａ Ｍｉｎｉｍａｅｌｋ０．５％脂肪（Ａｒｌａ、Ｂｒａｂｒａｎｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）（１リットル当たりラクトース約４５ｇを含む）を、フルクトース（ＭＷ：１８０．１６Ｄａ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）または１３Ｃ−標識フルクトース（ＭＷ：１８１．１６Ｄａ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のいずれかで、このミルク１リットル当たり８０ｇまで強化した。その後、実施例４で開示されている（国際公開第２０１３／１８２６２６号パンフレットにおいて「ＢＩＦ ９１７」としても開示されている）β−ガラクトシダーゼ（２６２５Ｕ／Ｌ）を添加し、このミルクを最大で４時間にわたり５０℃でインキュベートした後、ラクツロースの濃度をＨＰＬＣ−ＭＳにより分析した。ＨＰＬＣ分析の前に、このミルクを水で２０倍に希釈した（９５℃／１５分）。７５℃で維持したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＲＥＺＥＸ ＲＳＯ ４％Ａｇ＋ドープ２００×１０ｍｍＩＤを使用するＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＵＰＬＣでクロマトグラフィーを実施し、０．２５ｍｌ／分でオンライン真空脱気したｍｉｌｌｉ−Ｑ水で溶出させた。２５℃で維持した、水で１０倍に希釈した試料ならびに４−ラクツロース、ラクトース、グルコースおよびガラクトースの標準物質（全て１００μｇ／ｍｌ）５μｌを注入した。試料および標準物質を、５分にわたり１２５００×ｇで遠心分離した後に使用した。カラム溶出液をＢｒｕｋｅｒ Ｍａｘｉｓ四重極飛行時間型質量分析計（ＱＴＯＦ ＭＳ）で分析した。
図４に示すように、両方のクロマトグラムは、非標識フルクトース（ＭＷ：１８０．１６ｇ／ｍｏｌ）または１３Ｃ標識フルクトース（ＭＷ：１８１．１６ｇ／ｍｏｌ）の適用とは無関係に類似しているように見えた。３２．１分で溶出しているピークを、標準物質を用いる４−ラクツロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と割り当てることができた。加えて、３４．５分での、１３Ｃ標識フルクトースに関する３６６．１０８６ｍ／ｚの検出質量（図４（Ａ））および非標識フルクトースを用いる３６５．１０５４ｍ／ｚの検出質量（図４（Ｂ））を、ラクツロース異性体であるフルクトース含有二糖（即ちフルクトース分子のトランスガラクトシル化の結果）に割り当てることができた。
実施例３−ラクトスクロースおよびガラクトシル化オリゴマーの生成
材料＆方法
約４．６％（重量／体積）のラクトース、３．６％（重量／体積）のタンパク質および０．５％（重量／体積）の脂肪からなる半脱脂ミルク（Ｍｉｎｉｍａｅｌｋ；Ａｒｌａ ｆｏｏｄｓ、Ｖｉｂｙ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に、完全に１３Ｃ標識されたスクロース−１３Ｃ１２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ；分子量：３５４．２１ｇ／ｍｏｌ）または非標識スクロース［６％（重量／体積）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ；分子量：３４２．３ｇ／ｍｏｌ］を補充した。実施例４で開示されている（国際公開第２０１３／１８２６２６号パンフレットにおいて「ＢＩＦ ９１７」としても開示されている）β−ガラクトシダーゼを添加して、ラクトスクロースの生成を開始した。ミルク１リットル当たり２，６２５ＬＡＵ単位の全活性を添加し、これはミルク１ｍｌ当たり酵素１．０４ｍｇに相当する。最大で６時間にわたりＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中において５０℃でラクトスクロースの生成を実施し、０時間後に、２時間後に、４時間後におよび６時間後に試料を採取した。このミルクを、予め加熱した水（９５℃）で２０倍に希釈して１０分にわたり保持することにより、反応を停止させた。
試料および標準物質を４部のアセトニトリル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で希釈して遠心分離した後、注入バイアルに移した。生成された（オリゴ−ガラクト）−ラクトスクロースの検出および分析を、先に説明したように一部を改変して実行した（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｃａｌｖｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，２０１２，１２２０ ５７−６７）。
希釈した溶液を、プレカラムを有するＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ ２．１×１５０、１．７μｍ（１３０Å）（Ｗａｔｅｒｓ、Ｈｅｄｅｈｕｓｅｎｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）カラムおよび移動相アセトニトリル／水／２５％ＮＨ４ＯＨ（水性）８００／２００／１（体積／体積／体積）（Ａ）およびアセトニトリル／水／２５％ＮＨ４ＯＨ（水性）２００／８００／１（体積／体積／体積）を使用する親水性相互作用クロマトグラフィーにより分析した。流量が３５０μｌ＊分−１であるＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＵＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で液体クロマトグラフィーを実施した。注入体積は１０μｌであった。カラムオーブン温度は３５℃であった。勾配は下記の通りであった：０％Ｂ（０分）、５０％Ｂ（１５分）、サイクル時間３０分。エレクトロスプレーポジティブモードによりＢｒｕｋｅｒ ｍａＸｉｓ ＱＴＯＦ−ＭＳで検出を実施した。
下記の標準物質を使用した（高級のラクトスクロースオリゴマーの保持時間の予測を可能にするためにカラムでの反応時間を較正すべくマルトオリゴース（ｍａｌｔｏｏｌｉｇｏｓｅ）を使用する）。
マルトトリオースバッチ０１７Ｋ０６７９ Ｏｐｂ：Ｔ１０８ Ｋｅｍｉｋａｌｉｅｓｋａｂ ５（Ｈｙｌｄｅ ３）
マルトテトラオースバッチ０８４Ｋ１７５０ Ｏｐｂ：Ｔ１０８ Ｋｅｍｉｋａｌｉｅｓｋａｂ ５（Ｈｙｌｄｅ ３）
マルトペンタオースバッチ１１０Ｍ１４４２ Ｏｐｂ：Ｔ１０８ Ｋｅｍｉｋａｌｉｅｓｋａｂ ５（Ｈｙｌｄｅ ３）
マルトヘキサオースバッチ０４８Ｋ１４７２ Ｏｐｂ：Ｔ１０８ Ｋｅｍｉｋａｌｉｅｓｋａｂ ５（Ｈｙｌｄｅ ３）
マルトヘプタオースバッチ０２９Ｋ１１９４ Ｏｐｂ：Ｔ１０８ Ｋｅｍｉｋａｌｉｅｓｋａｂ ５（Ｈｙｌｄｅ ３）
スクロースバッチＫ２９９５９８８７ ２０４ Ｏｐｂ：Ｔ２１６
グルコース一水和物バッチ３２５ Ｋ１９７１４４７４ Ｏｐｂ：Ｔ１０８ Ｋｅｍｉｋａｌｉｅｓｋａｂ ５（Ｈｙｌｄｅ ２）
「ラクトスクロース」（即ち４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシルスクロース；Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）バッチＯＧ４４８５４１４０１ Ｏｐｂ：Ｔ２１６
ストック溶液を組み合わせて希釈し、各成分の濃度が約１００μｇ／ｍｌである試験溶液を形成した。完全に１３Ｃ標識された試料（スクロースの完全な溶解を確実なものとするために１５〜３０分後にサンプリングした）をラクトスクロースの１００μｇ／ｍｌ標準溶液と１：１の比で混合することにより、添加溶液を形成した。
結果
ヘキソーストリオース（Ｈｅｘ−ＤＰ３）ラクトスクロース（Ｇａｌ−Ｇｌｕ−Ｆｒｕ）の１００μｇ／ｍｌ参照試料の抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）を図５での上部トレースに示す。
ＥＩＣは、±０．００５の許容誤差での［Ｍ＋ＮＨ４］＋および［２Ｍ＋ＮＨ４］＋の付加物の正確なモノアイソトピック質量に基づく（図５）。同様に、形成された［Ｍ＋ＮＨ４］＋１３Ｃ１２標識ヘキソースＤＰ３〜６オリゴマー（即ち１３Ｃ１２−Ｈｅｘ−ＤＰ３〜６）のＥＩＣをトレースに示す（図５）。観測した質量は、±０．００５の許容誤差で理論質量に対応する。各ｍ／ｚトレース、例えば１３Ｃ１２−Ｈｅｘ−ＤＰ４に関するｍ／ｚトレースは、いくつかの異性体を示す一群のピークを示した。このピーク群は、ＨＩＬＩＣでの炭水化物オリゴマーの相同範囲に関して予想したように溶出し、保持時間はＨｅｘ−ＤＰの数と共に増加した。従って、クロマトグラムは、２時間の生体内変換後の標識試料中での１３Ｃ１２−Ｈｅｘ ＤＰ３〜６オリゴマーの形成および存在を示す。
分析の前に、試料を不活性化して１０倍希釈した。本研究は定性的ではあるが、ラクトスクロース標準溶液は約５×１０５のピーク高さで１００μｇ／ｍｌの公称濃度を有した。１３Ｃ１２−Ｈｅｘ−ＤＰ３〜４のピーク高さは同じ範囲内に現れており、このことは、形成された標識オリゴマーの濃度は０．１ｍｇ／ｍｌ（注入）の範囲内であることができ、希釈前は生体内変換混合物中で約１ｍｇ／ｍｌの範囲内であることができることを示す。１３Ｃ１２−Ｈｅｘ−ＤＰ５および１３Ｃ１２−Ｈｅｘ−ＤＰ６は容易に検出され、相対応答は１３Ｃ１２−Ｈｅｘ−ＤＰ３〜４レベルの１／１０および１／１００であった。
図２で概説したクロマトグラフＥＩＣトレースを組み合わせることにより、生体内変換反応（ｔ＝０、２、４および６時間）の場合の標識物質の相対的形成を、図６に示すように概説することができる。
生体内変換により、約ｔ＝０．２５〜０．５時間に実際に対応する第１サンプリング点（ｔ＝０）で既に有意な量の１３Ｃ１２−Ｈｅｘ−ＤＰ３（即ち、完全に１３Ｃ標識されたラクトスクロース）が最初に得られた。２時間後、生体内変換により、より多量のＤＰ３１３Ｃ１２−Ｈｅｘ−ＤＰ３およびＤＰ３１３Ｃ１２−Ｈｅｘ−ＤＰ３のより多くの異性体が得られたが、特に有利な量の高級オリゴマーが得られた。１３Ｃ１２−Ｈｅｘ−ＤＰ３オリゴマーと比べて高次のオリゴマーの量は６時間の生体内変換後に減少するように見えたが、１３Ｃ１２−Ｈｅｘ−ＤＰ３異性体（特に６．０、７．０および７．５分でのピーク）は増加した。
結論
１３Ｃ１２−標識スクロースを使用する生体内変換プロセスにより、１３Ｃ１２−Ｈｅｘ−ＤＰ３〜ＤＰ６オリゴマーが形成され、即ちＧａｌ−Ｇｌｕ−Ｆｒｕ（即ちラクトスクロース）、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｕ−Ｆｒｕ（即ちガラクトシル−ラクトスクロース）、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｕ−Ｆｒｕ（即ちジガラクソシル−ラクトスクロース）およびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｕ−Ｆｒｕ（即ちトリガラクトシル−ラクトスクロース）が形成された。形成された物質の大部分は１３Ｃ１２−Ｈｅｘ−ＤＰ３〜４オリゴマーであった。１３Ｃ１２−Ｈｅｘ−ＤＰ３オリゴマーと比べて高次の存在は２時間の反応まで増加し、次いで経時的に低下した。
従って、この実験は、アクセプター分子としてのスクロースに対する、用いたβ−ガラクトシダーゼの転移反応中に、ラクトスクロース（ガラクトース−グルコース−フルクトース；Ｇａｌ−Ｇｌｕ−Ｆｒｕ；ＤＰ３）、ガラクトシル−ラクトスクロース（Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｕ−Ｆｒｕ；ＤＰ４）およびオリゴ−ガラクトシル−ラクトスクロース（Ｇａｌｎ−Ｇｌｕ−Ｆｒｕ、ｎは２または３）が生成されていることを裏付ける。
実施例４−ポリペプチドの生成およびＬＡＵ活性の測定
方法１
ポリペプチドの生成
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））内での発現のために最適化されたコドンを備える（ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）全長（１，７５２残基）遺伝子をコードするために設計された合成遺伝子は、ＧｅｎｅＡＲＴ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）配列番号８から購入した。
ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）切断突然変異体は、合成遺伝子の選択した領域の特異的増幅を許容したリバースプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を使用して構築した。
フォワードプライマー：
Figure 0006851967
切断突然変異体および対応するリバースプライマーについての配列番号は、下記の表２に指示した。
Figure 0006851967
合成遺伝子は、固有の制限部位ＳｐｅＩおよびＰａｃＩを使用してｐＢＮｓｐｅ枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）発現ベクター内にクローン化し（図１）、単離プラスミドを枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＢＧ３５９４内に形質転換させた。形質転換体は、選択として１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有するＬＢプレート上で再画線培養した。
前培養は、１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有するＬＢ培地中に準備し、３７℃および１８０ｒｐｍで振とうしながら７時間にわたり培養した。この５００μＬの前培養を使用して、３３℃および１８０ｒｐｍで浸透しながら６８時間にわたり増殖させるために１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有する５０ｍＬのＧｒａｎｔ’ｓ改変培地を接種した。
細胞は、培養培地への１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１０Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ）最終濃度の直接的添加によって溶解させ、３３℃、１８０ｒｐｍで１時間にわたりインキュベートした。溶解物は、２０分間にわたる１０，０００×ｇでの遠心分離によって取り出し、引き続いて滅菌濾過した。
Ｇｒａｎｔ’ｓ改変培地は、下記の指示書にしたがって調製した：
ＰＡＲＴ Ｉ（オートクレーブ）
ソイトン １０ｇ
１Ｌ当たり５００ｍＬにする
ＰＡＲＴ ＩＩ
１ＭのＫ２ＨＰＯ４ ３ｍＬ
グルコース ７５ｇ
尿素 ３．６ｇ
Ｇｒａｎｔ’ｓ １０×のＭＯＰＳ １００ｍＬ
１Ｌ当たり４００ｍＬにする
ＰＡＲＴ Ｉ（２重量／重量％のソイトン）を調製し、１２１℃で２５分間にわたりオートクレーブ滅菌する。
ＰＡＲＴ ＩＩを調製し、ＰＡＲＴ １と混合し、ｐＨは、ＨＣｌ／ＮａＯＨを用いてｐＨを７．３に調整した。体積を全量にして、０．２２μｍのＰＥＳフィルターに通して滅菌した。
１０×のＭＯＰＳバッファーは、下記の指示書にしたがって調製した：
８３．７２ｇ トリシン
７．１７ｇのＫＯＨペレット
１２ｇのＮａＣｌ
２９．２２ｇ ０．２７６ＭのＫ２ＳＯ４
１０ｍＬの０．５２８ＭのＭｇＣｌ２
１０ｍＬのＧｒａｎｔ’ｓ微量栄養素 １００×
水を用いておよそ９００ｍＬにして、溶解させる。ＫＯＨを用いてｐＨを７．４に調整し、１Ｌまで満たし、この溶液を０．２μｍのＰＥＳフィルターに通して滅菌濾過する。
１００×の微量栄養素は、下記の指示書にしたがって調製した：
クエン酸ナトリウム２Ｈ２Ｏ １．４７ｇ
ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ１．４７ｇ
ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ０．４ｇ
ＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ０．１ｇ
ＺｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ０．１ｇ
ＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ０．０５ｇ
ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ０．１ｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ０．１ｇ
溶解させて、水を用いて体積を１Ｌに調整する。滅菌は、０．２μｍのＰＥＳフィルターに通して実施した。４℃で光線を回避して貯蔵した。
方法２
精製および酵素の調製
濾過した酵素単離体は、１０ｋＤａのＭＷカットオフ値を備えるＶｉｖａＳｐｉｎ超濾過装置（Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２０、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｌｏｔ番号１２ＶＳ２００４）を使用して濃縮し、この濃縮物はＰＤ１０脱塩化ラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｏｔ番号６２８４６０１）に装填し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）中で溶離させた。クロマトグラフィーは、Ａｋｔａ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で手動で実施した。およそ２０ｍｇのタンパク質を含有する４ｍＬの脱塩サンプルは、１ｍＬ／分の流量で２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）を用いて平衡させた２ｍＬのＨｙｐｅｒＱカラム（ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）Ｑ ｓｏｒｂｅｎｔ）上に装填した。カラムは、３０ＣＶ（カラム容積）洗浄バッファーを用いて完全に洗浄し、結合β−ガラクトシダーゼは１００ＣＶ長勾配を用いて２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、２５０ｍＭのＮａＣｌ中に溶出させた。カラム上の残留不純物は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、５００ｍＭのＮａＣｌを用いて一工程溶出により除去した。貫流液および溶離液中のタンパク質をβ−ガラクトシダーゼ活性についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰａｇｅ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ ４−１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、１．０ｍｍ、１０ウエル（製品番号ＮＰ０３２１ｂｏｘ）、Ｓｅｅ−Ｂｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２予備染色標準物質（製品番号ＬＣ５９２５）およびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファー（製品番号ＮＰ０００２）を用いて製造業者のプロトコルにしたがってランした。ゲルは、Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号ＬＣ６０６０）を用いて染色した（図２）。
方法３
β−ガラクトシダーゼ活性の測定
酵素活性は、市販で入手できる基質２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）（Ｓｉｇｍａ Ｎ１１２７）を使用して測定した。
ＯＮＰＧ（水なし）アクセプター
１００ｍＭのＫＸＨ３−ＸＰＯ４（リン酸バッファー）（ｐＨ６．０）
１２．３ｍＭのＯＮＰＧ
アクセプターが補給されたＯＮＰＧ
１００ｍＭのＫＸＨ３−ＸＰＯ４（リン酸バッファー）（ｐＨ６．０）
２０ｍＭのセロビオース
１２．３ｍＭのＯＮＰＧ
停止液：１０％のＮａ２ＣＯ３
精製酵素の１０μＬの希釈系列は、アクセプターを含む、または含まない９０μＬのＯＮＰＧバッファーを含有するマイクロタイタープレートのウエル内に加えた。サンプルを混合し、１０分間にわたり３７℃でインキュベートし、引き続いて１００μＬの停止液を各ウエルに加えて反応を終了させた。吸光度測定値は、Ｓｏｆｔｍａｘソフトウエアパッケージによって制御されるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー上で４２０ｎｍで記録した。
トランスガラクトシル化活性の比率は、下記のように計算した：
吸光度が０．５〜１．０の間にあった希釈液に対して、トランスガラクトシル化活性の比率＝（Ａｂｓ４２０＋セロビオース／Ａｂｓ４２０−セロビオース）＊１００（図３）。
方法４
ＬＡＵ活性の決定
原理：
本アッセイ法の原理は、ラクターゼが３７℃で２−ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を２−ｏ−ニトロフェノール（ＯＮＰ）およびガラクトースに加水分解することにある。反応は炭酸ナトリウムを用いて停止させ、遊離したＯＮＰを４２０ｎｍで分光光度計または比色計で測定する。
試薬：
ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．４）（１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．４）、１０ｍＭのＣａＣｌ２）：１９．５２ｇのＭＥＳ水和物（Ｍｗ：１９５．２ｇ／モル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号Ｍ８２５０−２５０Ｇ）および１．４７０ｇのＣａＣｌ２二水和物（Ｍｗ：１４７．０１ｇ／モル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１，０００ｍＬのｄｄＨ２Ｏ中に溶解させ、１０ＭのＮａＯＨによってｐＨを６．４に調整する。この溶液を０．２μｍフィルターに通して濾過し、１カ月間まで４℃で貯蔵する。ＯＮＰＧ基質（ｐＨ６．４）（１２．２８ｍＭのＯＮＰＧ、１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．４）、１０ｍＭのＣａＣｌ２）：０．３７０ｇの２−ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ、Ｍｗ：３０１．５５ｇ／モル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号Ｎ１１２７）を１００ｍＬのＭＥＳバッファー（ｐＨ６．４）中に溶解させ、４℃の暗所で７日間まで貯蔵する。停止試薬（１０％のＮａ２ＣＯ３）：２０．０ｇのＮａ２ＣＯ３を２００ｍＬのｄｄＨ２Ｏ中に溶解させ、この溶液を０．２μｍのフィルターに通して濾過し、室温で１カ月間まで貯蔵する。
手順：
酵素サンプルの希釈系列をＭＥＳバッファー（ｐＨ６．４）中で作成し、１０μＬの各サンプル希釈液を、９０μＬのＯＮＰＧ基質（ｐＨ６．４）を含有するマイクロタイタープレート（９６ウエルフォーマット）に移した。サンプルを混合し、５分間にわたり３７℃でサーモミキサー（Ｃｏｍｆｏｒｔ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用してインキュベートし、引き続いて１００μＬの停止液を各ウエルに加えて反応を終了させた。酵素サンプルの代わりにＭＥＳバッファー（ｐＨ６．４）を使用してブランクを構築した。４２０ｎｍでのブランクに比較した吸光度の増加をＥＬＩＳＡリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）で測定した。
酵素活性の計算：
ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．４）中の２−ｏ−ニトロフェノール（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号３３４４４−２５Ｇ）のモル吸光係数を決定した（０．５９９８×１０−６Ｍ−１×ｃｍ−１）。１単位（Ｕ）のラクターゼ活性（ＬＡＵ）は、１分当たり１モルのＯＮＰＧの加水分解に対応すると定義された。２００μＬの全反応体積を備えるマイクロタイタープレート（０．５２ｃｍの光路）を使用すると、酵素サンプル１ｍＬ当たりのラクターゼ活性は、下記の方程式を使用して計算することができる：
Figure 0006851967
本明細書に配列番号１として示したＢＩＦ９１７についての比活性の計算：
ＢＩＦ９１７濃度の決定：
標的酵素（ＢＩＦ９１７）および切断生成物の定量は、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｓｔａｉｎ ｆｒｅｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥシステム（ＢｉｏＲａｄ）を使用して決定した。任意のｋＤのＳｔａｉｎ ｆｒｅｅプレキャストゲル、４〜２０％のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１８ウエル（Ｃｏｍｂ、製品３４５−０４１８）をＳｅｒｖａ Ｔｒｉｓ−グリシン／ＳＤＳバッファー（ＢｉｏＲａｄ、製品番号４２５２９）とともに使用した。ゲルは、以下のパラメーターを用いてランした：２００Ｖ、１２０ｍＡ、２５Ｗ、５０分間。ＢＳＡ（１．４３ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号５００−０００７）をタンパク質標準物質として使用し、トリプトファン含量の相関を伴うバンド強度を用いた定量のためにはＳｔａｉｎ Ｆｒｅｅ Ｉｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）をＩｍａｇｅ Ｌａｂソフトウエア（ＢｉｏＲａｄ）とともに使用した。ＢＩＦ９１７の特異的ＬＡＵ活性は、２つの独立発酵の（方法１に記載したように）粗発酵素（限外濾過濃縮液）から５つの異なる希釈液を使用して決定した（表３を参照されたい）。ＢＩＦ９１７の比活性は２１．３ＬＡＵ／ｍｇまたは０．０２１３ＬＡＵ／ｐｐｍであることが分かった。
Figure 0006851967
上記の明細書に言及した全刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載した方法およびシステムの様々な修飾および変動は、本発明の範囲および精神から逸脱せずに、当業者には明白になるであろう。本発明は特定の好ましい実施形態と結び付けて記載してきたが、本明細書で要求した本発明はそのような特定の実施形態に過度に限定すべきではないと理解すべきである。実際に、化学、生化学、生物学または関連分野の当業者には明白である、本発明を実施するための本明細書に記載した様式の様々な修飾は、下記の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが企図されている。
配列表
Figure 0006851967
Figure 0006851967
Figure 0006851967
Figure 0006851967
Figure 0006851967
Figure 0006851967
Figure 0006851967
Figure 0006851967
Figure 0006851967
 ＞配列番号１６ ＢＩＦ９１７のためのリバースプライマー
ＧＣＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＴＧＴＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＧＴＴＣ
＞配列番号１７ ＢＩＦ９９５のためのリバースプライマー
ＧＣＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＣＡＧＴＧＣＧＣＣＡＡＴＴＴＣＡＴＣＡＡＴＣＡ
＞配列番号１８ ＢＩＦ１０６８のためのリバースプライマー
ＧＣＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＴＴＧＡＡＣＴＣＴＡＡＴＴＧＴＣＧＣＴＧ
＞配列番号１９ ＢＩＦ１２４１のためのリバースプライマー
ＧＣＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＴＴＣＡＡＴ
＞配列番号２０ ＢＩＦ１３２６のためのリバースプライマー
ＧＣＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴＣＴＴＧＴＴＣＴＧＴＧＣＣＣＡ
＞配列番号２１ ＢＩＦ１４７８のためのリバースプライマー
ＧＣＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＴＣＴＣＡＧＴＣＴＡＡＴＴＴＣＧＣＴＴＧＣＧＣ
Figure 0006851967
 ＞配列番号２３ ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＳＭ２０２１５由来の細胞外ラクターゼのシグナル配列
Ｖｒｓｋｋｌｗｉｓｌｌｆａｌａｌｉｆｔｍａｆｇｓｔｓｓａｑａ

Claims (17)

  1. ガラクトース部分とフルクトース部分とを含むラクツロースを生成する方法であって、
    前記ガラクトース部分が前記フルクトース部分に連結されており、
    前記方法が、
    ガラクトース部分を含むラクトースとフルクトース部分を含むフルクトースとを接触させることであり、前記フルクトース部分を含む前記フルクトースへのガラクトース部分の転移を触媒することができる酵素の存在下で接触させること
    を含み、
    前記酵素が、配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、最大で９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドである、方法。
  2. 前記方法を５．５〜９．５のｐＨで実行し、
    前記ラクトースの濃度が０．４３ｍｏｌ／Ｌ未満であり、
    前記フルクトースの濃度が０．８ｍｏｌ／Ｌ未満である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ラクトースの濃度が０．０８８〜０．３８０ｍｏｌ／Ｌである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ラクトースの濃度が４０〜１００ｇ／Ｌである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記フルクトースの濃度が０．２７８〜０．４４４ｍｏｌ／Ｌである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記フルクトースの濃度が５０〜８０ｇ／Ｌである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. ０〜１０℃の温度で実行する請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. ４５〜６０℃の温度で実行する請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  9. ラクツロースの収率が少なくとも１０％であり、例えば少なくとも１２％であり、例えば少なくとも１５％であり、例えば少なくとも１８％であり、例えば少なくとも２０％であり、例えば少なくとも２２％であり、例えば少なくとも２５％であり、出発物質として使用するラクトースおよびフルクトースの総重量に基づいて重量で算出される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記酵素がβ−ガラクトシダーゼである、請求項１〜９のいずれか一項の方法。
  11. 前記酵素がＥｎｚｙｍｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｅ．Ｃ．）３．２．１．２３に分類される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記酵素が細菌起源または真菌起源である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記酵素がビフィドバクテリア（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）起源である、請求項１２に記載の方法。
  14. 食品組成物中においてｉｎ ｓｉｔｕで実行する請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記食品組成物が乳製品組成物である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記乳製品組成物の初期成分としてラクトースが存在する、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記乳製品組成物にラクトースを添加する、請求項１５または１６に記載の方法。
JP2017525113A 2014-11-07 2015-11-06 トランスガラクトシル化活性を有する酵素を用いてガラクトースとフルクトース部分とを含むサッカリドを生成する方法 Active JP6851967B2 (ja)

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