CN116057179A - 糖的差向异构化反应催化用酶剂、差向异构化反应产物的制造方法和差向异构化反应产物 - Google Patents

糖的差向异构化反应催化用酶剂、差向异构化反应产物的制造方法和差向异构化反应产物 Download PDF

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Abstract

本发明以提供副产物少、且有效地催化差向异构化反应的酶剂为课题。根据本发明，提供糖的差向异构化反应催化用酶剂，其包含以下的(a)～(c)中的任一种蛋白，其中，上述糖为选自葡萄糖、甘露糖、塔罗糖和半乳糖的任一种。(a)蛋白，其由SEQ ID NO:1或3所记载的氨基酸序列构成；(b)蛋白，其由相对于SEQ ID NO:1或3所记载的氨基酸序列具有90％以上的氨基酸序列同一性的氨基酸序列构成，并且具有催化糖的差向异构化反应的活性；(c)蛋白，其由在SEQ IDNO:1或3所记载的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、***、缺失和/或添加而得的氨基酸序列构成，并且具有催化糖的差向异构化反应的活性。

Description

糖的差向异构化反应催化用酶剂、差向异构化反应产物的制造方法和差向异构化反应产物
相关申请
本申请要求2020年7月31日申请的日本特愿2020-130365的优先权，其全部记载内容均作为公开而特别引用于此。
技术领域
本发明涉及：糖的差向异构化反应催化用酶剂、差向异构化反应产物的制造方法和通过该制造方法得到的差向异构化反应产物，所述制造方法包括：使该酶剂作用以得到差向异构化反应产物的工序。
背景技术
甘露糖是葡萄糖的异构体，作为由魔芋等提取的葡甘露聚糖、半纤维素、或存在于细胞表面等的糖链的构成糖而熟知。另外，已知甘露糖本身包含在蔓越莓中。
甘露糖的生物利用度低，口服摄取的甘露糖中的大部分被快速排到尿中。认为***症的病原菌是通过该菌所具有的甘露糖结合凝集素与存在于尿路表面细胞的糖链的结合而附着于尿路表面并感染。由于口服摄取的甘露糖被快速排到尿中，因此排出的甘露糖通过阻碍该菌的甘露糖结合凝集素与细胞表面糖链的结合，被期待预防***症的效果(非专利文献1)。
专利文献1中公开了：以含甘露糖的糖组合物为有效成分的有害菌感染抑制剂或用于防止有害菌感染的饲料的相关技术。专利文献2中有关于以甘露糖为有效成分的饮食品的口感改良剂的阐述。
作为甘露糖的调制方法，已知有多种化学反应法和酶法。以下，对各调制方法进行探讨。
第一化学反应法如下：通过将蔗糖还原生成山梨醇和甘露醇，分取甘露醇，再将甘露醇氧化，从而调制甘露糖。然而，由于该方法需要多阶段的步骤和高温高压下的催化反应，因此在效率方面有问题。
第二化学反应法是通过水解葡甘露聚糖或甘露聚糖来调制甘露糖。然而，该方法存在底物昂贵且底物的调制需要劳力的问题。
第三化学反应法是水解椰子粕(coprameal)等的半纤维素的方法。然而，该方法存在以下问题：因构成糖多种多样故甘露糖的收率差，在酸水解的情况下收率进一步恶化，纯化负荷变大。
第四化学反应法是通过在碱性条件下将葡萄糖异构化来调制甘露糖。然而，该方法存在以下问题：因发生糖的分解故收率差，纯化负荷大。
第五化学反应法同样是通过在碱性条件下将果糖异构化来调制甘露糖。然而，该方法与第四化学反应法同样地在收率和纯化负荷方面存在问题，另外还存在以下方面的问题：果糖与葡萄糖相比较贵；以及果糖残留在反应***内，难以与甘露糖分离。
作为第一酶法，其是通过使甘露糖异构酶与果糖作用来调制甘露糖的方法。然而，在作为原料的果糖的价格方面和残留在反应***内的果糖的分离方面存在问题。
作为第二酶法，其是通过使醛糖-酮糖异构酶(Aldose-ketose isomerase，以下记作“AKI”)与葡萄糖或果糖作用来调制甘露糖的方法。然而，该方法在残留于反应***内的果糖的分离方面仍存在问题。
另外，关于由纤维二糖等的还原末端糖残基通过β-1,4键进行键合的2个以上的糖残基构成的糖，作为催化将上述还原末端糖残基的2位羟基进行2-差向异构化(异构化)的反应或其逆反应的酶，已知有纤维二糖2-差向异构酶(Cellobiose2-epimerase、以下记作“CE”)(专利文献3、专利文献4)。可通过该酶催化由葡萄糖进行β-1,4键合而得的纤维二糖向4-O-β-葡糖基甘露糖的转化或其逆反应。另外，专利文献4中记载了：若使该CE与葡萄糖作用，则得到甘露糖(第三酶法)。然而，在专利文献4所记载的使用CE的第三酶法中，CE除了催化差向异构化反应还催化醛糖-酮糖异构化反应。因此，在生成甘露糖的同时还生成果糖，在副产的果糖的分离方面存在问题。
作为第四酶法，其是使用催化将葡萄糖、甘露糖、半乳糖和塔罗糖的2位羟基进行差向异构化的反应的酶的方法(专利文献5、6)。在该方法中，几乎不副产果糖和塔格糖方面比第一～第三酶法优异(专利文献5、6)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利4694667号；
专利文献2：日本特开2001-275583号；
专利文献3：日本专利5092049号；
专利文献4：国际公开2010/090095号；
专利文献5：日本特开2019-033702号；
专利文献6：日本专利6657453号；
非专利文献
非专利文献1：Sharma V,Ichikawa M,Freeze HH.Mannose metabolism:morethan meets the eye.Biochem Biophys Res Commun.2014；453(2):220-228.doi:10.1016/j.bbrc.2014.06.021。
专利文献1～6和非专利文献1的全部记载均作为公开而特别引用于此。
发明内容
发明所要解决的课题
基于酶法的差向异构化反应产物的生产效率很大程度上依赖于使用的酶的特性。要求适于工业规模中利用的、更有效地催化底物的差向异构化反应的酶剂。而且，副产物不仅降低目标反应产物的收率，还需要分离的时间，因此存在降低生产效率的问题。
本发明以提供副产物少、有效地催化差向异构化反应的酶剂作为所要解决的课题。
用于解决课题的手段
本发明人试图探索针对甘露糖的差向异构化酶，对编码各种蛋白的基因进行了表达和诸多性质的分析。其中，着眼于存在于洛纳尔湖半月单胞菌(Lunatimonaslonarensis)的基因组上、且编码推断为N-酰基葡糖胺2-表异构酶的蛋白(GenBank：WP_010853281.1)的基因进行了表达分析。其结果，发现了该蛋白具有将甘露糖和葡萄糖、半乳糖和塔罗糖分别相互转换的2-差向异构化活性。
另外，本发明人判明：若使用该蛋白，则可有效地制造甘露糖，从而完成了本发明。
本发明如下。
[1]糖的差向异构化反应催化用酶剂，其是包含以下的(a)～(c)中任一种蛋白的糖的差向异构化反应催化用酶剂，上述糖为选自葡萄糖、甘露糖、塔罗糖和半乳糖的任一种，
(a)蛋白，其由SEQ ID NO:1或3所记载的氨基酸序列构成；
(b)蛋白，其由相对于SEQ ID NO:1或3所记载的氨基酸序列具有90％以上的氨基酸序列同一性的氨基酸序列构成，并且具有催化糖的差向异构化反应的活性；
(c)蛋白，其由在SEQ ID NO:1或3所记载的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、***、缺失和/或添加而得的氨基酸序列构成，并且具有催化糖的差向异构化反应的活性。
[2]糖的差向异构化反应催化用酶剂，其是包含引入了以下的(d)～(f)中任一种多核苷酸的转化细胞的培养上清的糖的差向异构化反应催化用酶剂，上述糖为选自葡萄糖、甘露糖、塔罗糖和半乳糖的任一种，
(d)多核苷酸，其由SEQ ID NO:2或4所示的核苷酸序列构成；
(e)多核苷酸，其是在严格条件下与由SEQ ID NO:2或4所示的核苷酸序列构成的多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸，并且编码具有催化糖的差向异构化反应的活性的蛋白；
(f)多核苷酸，其是相对于由SEQ ID NO:2或4所示的核苷酸序列构成的多核苷酸具有90％以上的核苷酸序列同一性的多核苷酸，并且编码具有催化糖的差向异构化反应的活性的蛋白。
[3]糖的差向异构化反应产物的制造方法，其包括以下工序：使[1]或[2]所述的酶剂与糖底物作用，得到糖的差向异构化反应产物。
[4]食品、饲料、饵料、化妆品或药品的制造方法，其包括以下工序：使用实施[3]所述的方法而得到的糖的差向异构化反应产物，得到食品、饲料、饵料、化妆品或药品。
发明效果
根据本发明，可提供具有差向异构化活性的新型酶剂。
附图说明
[图1A]图1A是来自洛纳尔湖半月单胞菌的假想蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。带下划线的区域是推断为信号肽序列的部分。
[图1B]图1B是编码来自洛纳尔湖半月单胞菌的假想蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)。带下划线的区域是对应于信号肽序列的核苷酸序列。从SEQ ID NO:2的核苷酸序列中删除了对应于信号肽序列的核苷酸序列后的序列是SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
[图1C]图1C是来自洛纳尔湖半月单胞菌的假想蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列是从SEQ ID NO:1的氨基酸序列中删除了推断为信号肽的部分后的序列。
[图2A]图2A是用作比较例的来自Melioribacter roseus的蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。
[图2B]图2B是用作比较例的编码来自Melioribacter roseus的蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO:10)。
[图3]图3是实施例1中培养而得到的来自洛纳尔湖半月单胞菌的蛋白(用过滤器过滤培养上清而得的蛋白)的SDS-PAGE分析。来自洛纳尔湖半月单胞菌的蛋白的谱带用箭头表示。M：标志物、S：样品。
[图4]图4是实施例2中培养而得到的来自洛纳尔湖半月单胞菌的蛋白(用过滤器过滤培养上清而得的蛋白)的SDS-PAGE分析。来自洛纳尔湖半月单胞菌的蛋白的谱带用箭头表示。M：标志物、S：样品。
[图5]图5是酶反应产物的TLC分析。以下，记载简称的说明。Glc：葡萄糖、Man：甘露糖、Mal：麦芽糖、Gal：半乳糖、Tal：塔罗糖、B：酶反应前、R：酶反应后。黑色圆(●)表示反应产物。
[图6]图6是显示使本酶溶液1、比较用酶溶液和空载体对照在pH6.0条件下与葡萄糖作用72小时时的反应产物中的甘露糖含量和果糖含量的曲线图。酶添加量为10.3、20.6、41.3、82.5、165.0和330.0μL/g-ds。甘露糖含量和果糖含量由HPLC分析的峰面积比算出。●：本酶溶液1(甘露糖含量)、〇：本酶溶液1(果糖含量)、▲：比较用酶溶液(甘露糖含量)、△：比较用酶溶液(果糖含量)、■：空载体对照(甘露糖含量)、□：空载体对照(果糖含量)。
[图7]图7是显示使本酶溶液1、比较用酶溶液和空载体对照在pH6.0条件下与葡萄糖作用时的反应产物中的甘露糖含量和果糖含量的经时变化的曲线图。酶添加量为330.0μL/g-ds。甘露糖含量和果糖含量由HPLC分析的峰面积比算出。●：本酶溶液1(甘露糖含量)、〇：本酶溶液1(果糖含量)、▲：比较用酶溶液(甘露糖含量)、△：比较用酶溶液(果糖含量)、■：空载体对照(甘露糖含量)、□：空载体对照(果糖含量)。
[图8]图8是显示使本酶溶液1、比较用酶溶液和空载体对照在pH7.0条件下与葡萄糖作用72小时时的反应产物中的甘露糖含量和果糖含量的曲线图。酶添加量为10.3、20.6、41.3、82.5、165.0和330.0μL/g-ds。甘露糖含量和果糖含量由HPLC分析的峰面积比算出。●：本酶溶液1(甘露糖含量)、〇：本酶溶液1(果糖含量)、▲：比较用酶溶液(甘露糖含量)、△：比较用酶溶液(果糖含量)、■：空载体对照(甘露糖含量)、□：空载体对照(果糖含量)。
[图9]图9是显示使本酶溶液1、比较用酶溶液和空载体对照在pH7.0条件下与葡萄糖作用时的反应产物中的甘露糖含量和果糖含量的经时变化的曲线图。酶添加量为330.0μL/g-ds。甘露糖含量和果糖含量由HPLC分析的峰面积比算出。●：本酶溶液1(甘露糖含量)、〇：本酶溶液1(果糖含量)、▲：比较用酶溶液(甘露糖含量)、△：比较用酶溶液(果糖含量)、■：空载体对照(甘露糖含量)、□：空载体对照(果糖含量)。
[图10]图10是显示使本酶溶液1、比较用酶溶液和空载体对照在pH8.0条件下与葡萄糖作用72小时时的反应产物中的甘露糖含量和果糖含量的曲线图。酶添加量为10.3、20.6、41.3、82.5、165.0和330.0μL/g-ds。甘露糖含量和果糖含量由HPLC分析的峰面积比算出。●：本酶溶液1(甘露糖含量)、〇：本酶溶液1(果糖含量)、▲：比较用酶溶液(甘露糖含量)、△：比较用酶溶液(果糖含量)、■：空载体对照(甘露糖含量)、□：空载体对照(果糖含量)。
[图11]图11是显示使本酶溶液1、比较用酶溶液和空载体对照在pH8.0条件下与葡萄糖作用时的反应产物中的甘露糖含量和果糖含量的经时变化的曲线图。酶添加量为330.0μL/g-ds。甘露糖含量和果糖含量由HPLC分析的峰面积比算出。●：本酶溶液1(甘露糖含量)、〇：本酶溶液1(果糖含量)、▲：比较用酶溶液(甘露糖含量)、△：比较用酶溶液(果糖含量)、■：空载体对照(甘露糖含量)、□：空载体对照(果糖含量)。
具体实施方式
以下记载的本发明的说明有时是基于代表性的实施方式或具体例而进行的，但本发明并不限定于这样的实施方式。需要说明的是，关于本说明书，在没有特别说明的情况下，糖质的记载表示D型。另外，用“～”表示的数值范围是指包含“～”的前后所记载的数值作为下限值和上限值的范围。本说明书中，在数值伴有“约”的术语的情况下，是指包括其值的±10％的范围。
本发明的基于酶的反应产物的糖组成(％)是作为将通过HPLC检测的峰的总面积设为100的情况下的与各糖类对应的峰的面积比(％)而算出的。
(酶剂)
本发明提供糖的差向异构化反应催化用酶剂，其包含以下的(a)～(c)中的任一种蛋白：
(a)蛋白，其由SEQ ID NO:1或3所记载的氨基酸序列构成；
(b)蛋白，其由相对于SEQ ID NO:1或3所记载的氨基酸序列具有90％以上的氨基酸序列同一性的氨基酸序列构成，并且具有催化糖的差向异构化反应的活性；
(c)蛋白，其由在SEQ ID NO:1或3所记载的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、***、缺失和/或添加而得的氨基酸序列构成，并且具有催化糖的差向异构化反应的活性。
需要说明的是，在本说明书中，有时将上述(a)～(c)中的任一种蛋白称为本发明的酶剂中所含的蛋白或本蛋白。
“糖的差向异构化”或“针对糖的差向异构化”是指使糖所具有的多个不对称碳中的1个不对称碳上的立体反转的反应，具体而言，作为一例，可列举：将糖的2位的羟基进行差向异构化(异构化)的反应或其逆反应。
催化差向异构化的酶通常称为差向异构酶，例如，作为充分研究的差向异构酶，可列举：纤维二糖2-差向异构酶(CE)。CE催化将纤维二糖的还原末端葡萄糖残基异构化成甘露糖残基的反应。
SEQ ID NO:1所记载的氨基酸序列是由洛纳尔湖半月单胞菌(Lunatimonaslonarensis)的基因组信息获得的氨基酸序列(NCBI Reference：WP_010853281.1)。这里，SEQ ID NO:1所记载的氨基酸序列虽然被标注为N-酰基葡糖胺2-差向异构酶家族，但在以蛋白形式表达的情况下的具体性质在提出本申请时还未知。
本发明人在使由SEQ ID NO:1所记载的氨基酸序列构成的蛋白以基于枯草杆菌表达系的重组蛋白的形式表达、并分析其酶活性时发现了：该蛋白至少与葡萄糖作用生成甘露糖、与半乳糖作用生成塔罗糖。即，本发明人发现了：由SEQ ID NO:1所记载的氨基酸序列构成的蛋白是对与葡萄糖、甘露糖、塔罗糖和半乳糖等单糖中的2位碳键合的羟基催化差向异构化的酶。SEQ ID NO:3的氨基酸序列是从SEQ ID NO:1的氨基酸序列中删除了推断为信号肽的部分后的序列。对与葡萄糖、甘露糖、塔罗糖和半乳糖等单糖中的2位的碳键合的羟基催化差向异构化的反应是可逆的。例如，若与葡萄糖的2位碳键合的羟基发生差向异构化则成为甘露糖，若与甘露糖的2位碳键合的羟基发生差向异构化则成为葡萄糖。若与塔罗糖的2位碳键合的羟基发生差向异构化则成为半乳糖，若与半乳糖的2位碳键合的羟基发生差向异构化则成为塔罗糖。
来自洛纳尔湖半月单胞菌的SEQ ID NO:1所记载的氨基酸序列相对于已知的CE所具有的氨基酸序列，一级氨基酸序列同一性为50％左右。具体而言，SEQ ID NO:1所记载的氨基酸序列相对于来自Melioribacterroseus(メリオリバクター·ロセウス)的CE(GenBank：AFN73749.1)具有50％的一级氨基酸序列同一性(同一性利用ClustalW(LarkinM.A.等人,2007,Bioinformatics,2007；23：2947-2948)来评价)。
本发明的酶剂中所含的蛋白可以是由相对于SEQ ID NO:1或3所记载的氨基酸序列具有90％以上的氨基酸序列同一性的氨基酸序列构成、并且显示糖的差向异构化活性的蛋白。在一个实施方案中，本发明的酶剂中所含的蛋白可以是如下的蛋白：由相对于SEQ IDNO:1或3所记载的氨基酸序列具有91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的氨基酸序列同一性的氨基酸序列构成、并且显示糖的差向异构化活性的蛋白。
氨基酸序列同一性如下定义：使比较的2条氨基酸序列比对，为了得到最大百分比序列同一性，根据需要而引入间隙(空位)后，以2条氨基酸序列间同一的氨基酸残基的百分比来定义。氨基酸序列同一性例如可通过使用像BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件这样的可公开获取的计算机软件来确定。
而且，本发明的酶剂中所含的蛋白可以是如下的蛋白：包含由在SEQ ID NO:1或3所记载的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、***、缺失和/或添加而得的氨基酸序列构成的蛋白、并且具有催化糖的差向异构化反应的活性的蛋白。对本说明书中所说的“有1个或多个氨基酸被取代、***、缺失和/或添加而得的氨基酸序列”中的“1个或多个”的范围没有特别限定，例如是指1～20个、优选1～10个、更优选1～7个、进一步优选1～5个、特别优选1～3个左右。
关于本发明的酶剂中所含的蛋白的制造方法，请参照后述的＜蛋白的制造＞。
本发明提供糖的差向异构化反应催化用酶剂，其是包含引入了以下的(d)～(f)中的任一种多核苷酸的转化细胞的培养上清的糖的差向异构化反应催化用酶剂，上述糖为选自葡萄糖、甘露糖、塔罗糖和半乳糖的任一种，
(d)多核苷酸，其由SEQ ID NO:2或4所示的核苷酸序列构成；
(e)多核苷酸，其是在严格条件下与由SEQ ID NO:2或4所示的核苷酸序列构成的多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸，并且编码具有催化糖的差向异构化反应的活性的蛋白；
(f)多核苷酸，其是相对于由SEQ ID NO:2或4所示的核苷酸序列构成的多核苷酸具有90％以上的核苷酸序列同一性的多核苷酸，并且编码具有催化糖的差向异构化反应的活性的蛋白。
SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列是由洛纳尔湖半月单胞菌(Lunatimonaslonarensis)的基因组信息获得的编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列(NCBI Reference：WP_010853281.1)的核苷酸序列。SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列是从SEQ ID NO:2的核苷酸序列中删除了编码推断为信号肽的部分的核苷酸序列后的序列。
本发明中还包括引入了多核苷酸的转化细胞的培养上清，该多核苷酸是在严格条件下与由SEQ ID NO:2或4所示的核苷酸序列构成的多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸，并且编码具有催化差向异构化反应的活性的蛋白。“在严格条件下与由SEQ ID NO:2或4所示的核苷酸序列构成的多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸”是指，使用由SEQ ID NO:2或4所示的核苷酸序列构成的多核苷酸的互补链作为探针，通过采用菌落杂交法、噬菌斑杂交法、DNA印迹杂交法等可获得的多核苷酸(例如，DNA)。“严格条件”例如可列举：进行DNA印迹杂交后，使用0.1～5×SSC溶液(1×SSC的组成：150mM氯化钠、15mM枸橼酸钠)，在55～65℃条件下洗涤过滤器的条件(MolecularCloning:A Laboratory Manual第2版(Sambrook,Maniatis等人,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)))。在本发明的一个实施方案中，严格条件是指在DNA印迹杂交后、在相当于0.1～1×SSC、0.1％SDS的盐浓度、60～65℃下洗涤的条件。
另外，本发明中还包括引入了多核苷酸的转化细胞的培养上清，相对于由SEQ IDNO:2或4所示的核苷酸序列构成的多核苷酸，该多核苷酸的核苷酸序列具有90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的核苷酸序列同一性，并且编码具有催化差向异构化反应的活性的蛋白。核苷酸序列同一性如下定义：使比较的2条核苷酸序列比对，为了得到最大的序列同一性百分比，根据需要而引入间隙(空位)后，以2条核苷酸序列间同一的碱基的百分比来定义。核苷酸序列同一性例如可通过使用BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件这样的可公开获取的计算机软件来确定。
上述转化细胞优选为枯草杆菌(枯草芽孢杆菌、Bacillus subtilis)。另外，本发明的培养上清实质上不含细胞，细胞通过过滤器或离心分离来去除。
本发明的培养上清包含作为上述(d)～(f)的多核苷酸的表达产物的蛋白。本说明书中，有时将本发明的培养上清中所含的作为上述(d)～(f)的多核苷酸的表达产物的蛋白称为本发明的酶剂中所含的蛋白或本蛋白。
本发明的酶剂中所含的蛋白的差向异构化活性的评价通过以选自葡萄糖、甘露糖、塔罗糖和半乳糖的任一种为底物，使本发明的蛋白作用，检测所得到的差向异构化反应产物来进行。
反应产物可利用高效液相色谱法(HPLC)，通过RI检测器或带电粒子检测器等来检测。检测也可使用薄层色谱法(TLC)和高性能离子交换色谱法/脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)来进行。
通过葡萄糖的差向异构化生成甘露糖，通过甘露糖的差向异构化生成葡萄糖，通过塔罗糖的差向异构化生成半乳糖，以及通过半乳糖的差向异构化生成塔罗糖。
本发明的糖的差向异构化反应催化用酶剂可用于对与单糖或二糖的还原性糖残基中的2位碳键合的羟基催化差向异构化。在本发明的一个实施方案中，本发明的糖的差向异构化反应催化用酶剂并不限定于这些，至少可用于催化选自葡萄糖、甘露糖、半乳糖和塔罗糖的任一种糖的差向异构化反应。本发明的酶剂中所含的蛋白是至少用于与葡萄糖、甘露糖和半乳糖作用。本发明的酶剂中所含的蛋白可将单糖的2位羟基差向异构化。
本发明的糖的差向异构化反应催化用酶剂可用于制造糖的差向异构化反应产物。具体而言，本发明的糖的差向异构化反应催化用酶剂可用于以葡萄糖为底物制造甘露糖，另外，可用于以甘露糖为底物制造葡萄糖。在本发明的一个实施方案中，本酶剂优选用于以葡萄糖为底物制造甘露糖。这是由于：由于葡萄糖在工业上大量生产且廉价，因此为了制造在工业制造方法上存在课题的甘露糖可容易地供应。
本发明的糖的差向异构化反应催化用酶剂可用于以半乳糖为底物制造塔罗糖，另外，可用于以塔罗糖为底物制造半乳糖。在本发明的一个实施方案中，本酶剂优选用于以半乳糖为底物制造塔罗糖。这是由于：由于半乳糖是通过自然界中丰富存在的乳糖的水解等而得到的，因此为了制造作为稀有糖之一的塔罗糖可容易地供应。
本发明的糖的差向异构化反应催化用酶剂可以以N-酰基葡糖胺为底物，也可以实质上不设底物，优选实质上不设底物。本说明书中，实质上不以特定的糖为底物是指，例如在以甘露糖为底物的活性为100％的情况下，以上述特定的糖为底物的相对活性为5％以下，优选为1％以下、更优选为0％，进一步优选为以上述特定的糖为底物的活性无法测定，特别优选以上述特定的糖为底物的催化反应完全没有发生。
本发明的酶剂中所含的蛋白通过SDS-PAGE测定的分子量为45～55kDa的范围、或为约50kDa。需要说明的是，这里给出的本蛋白的分子量是指，在质粒中***编码本蛋白的DNA，以枯草杆菌为宿主细胞而表达的蛋白的分子量。在实施例1和2中，测定为45～55kDa的范围或约50kDa的本蛋白的分子量的理论值为50.0kDa。
本发明的酶剂中所含的蛋白并不限定于这些，至少可与葡萄糖、甘露糖、塔罗糖和半乳糖作用，催化这些糖的差向异构化反应。
在现有的纤维二糖2-差向异构酶中，有由葡萄糖生成甘露糖和果糖的酶(专利文献3、专利文献4)。然而，本发明的酶剂中所含的蛋白可将葡萄糖主要转化成甘露糖。在使用了本蛋白的反应***中，有时由葡萄糖生成少许的果糖，但为微量。
与现有的纤维二糖2-差向异构酶相比，本发明的酶剂中所含的蛋白可高效地由葡萄糖制造甘露糖。具体而言，在以实施例记载的相同条件与底物葡萄糖作用的情况下，本发明的酶剂中所含的蛋白与专利文献6记载的来自Melioribacterroseus的CE相比，可在反应产物中以1.3倍以上的含量生成甘露糖，而且可以以1.4倍以上、1.5倍以上、1.6倍以上、1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上或2.0倍以上的含量生成甘露糖。
本发明的酶剂可以是包含已分离/纯化的上述的具有催化糖的差向异构化反应的活性的蛋白作为有效成分的酶组合物，除上述的具有催化糖的差向异构化反应的活性的蛋白以外，只要不阻碍糖的差向异构化反应，则可包含其他成分。这些例如可以是缓冲液、稳定化剂、賦形剂等用于普通酶制剂的成分。这样的其他成分根据现有技术而已知，而且为本领域技术人员所熟知。另外，本发明的酶剂对其形状也没有特别限定，可以是固体(例如，粉末状)或液体。本发明的酶剂例如可通过将固体或液体的酶添加在糖底物的溶液中来使用。
本发明的酶剂例如可作为将本发明的具有催化糖的差向异构化反应的活性的蛋白固定于固定化载体的酶剂来提供。通过制成固定化的酶剂，例如可在高底物浓度和高温下进行反应产物的制造，另外，还可进行基于生物反应器方式的反应产物的制造。
对上述固定化载体没有特别限定，例如只要是吸附或交联具有催化糖的差向异构化反应的活性的蛋白、且保持本蛋白的活性的载体即可使用。
上述固定化载体例如可列举：阴离子交换载体、阳离子交换载体、疏水性载体等。上述固定化载体的具体例子例如为离子交换凝胶。上述离子交换凝胶例如可列举：DIAION(注册商标)SK1B、DIAION(注册商标)PK212、DIAION(注册商标)HPA25、DIAION(注册商标)UBK555等DIAION(注册商标)系列(三菱化学公司制造)；Sepabeads(注册商标)SP-207、Sepabeads(注册商标)SP-850等Sepabeads(注册商标)系列(三菱化学公司制造)；DuoliteA568、DuolitePWA7、Duolite XAD761等Duolite系列(住化Chemtex公司制造)等。
可以是除葡萄糖、甘露糖、塔罗糖和半乳糖以外的糖，只要是本发明的酶剂中所含的蛋白可催化差向异构化的糖，则可使用本发明的酶剂。
对上述固定化载体的形状没有特别限定，例如可列举：膜、珠粒、板等。
对具有催化糖的差向异构化反应的活性的蛋白在上述固定化载体上的固定方法没有特别限定，例如可通过在缓冲液等溶剂中添加本蛋白和上述固定化载体、并振荡该混合液来进行。
(糖的差向异构化反应产物的制造方法)
本发明提供糖的差向异构化反应产物的制造方法，其包括以下工序：使本发明的糖的差向异构化反应催化用酶剂与糖底物作用，得到糖的差向异构化反应产物。
使本发明的酶剂与糖底物作用例如可通过调制糖底物的水溶液，根据需要调节pH后在该水溶液中添加本发明的酶剂来实施。而且，可通过将本发明的具有催化糖的差向异构化反应的活性的蛋白固定于载体成为酶剂，使糖底物的水溶液与该酶剂接触来实施。这是由于：使用了本发明的酶剂的糖的差向异构化反应可在反应液中实施。
可用于糖的差向异构化反应产物的制造方法的糖底物可以是选自葡萄糖、甘露糖、半乳糖和塔罗糖的任一种，但并不限定于这些，即使是除此以外的糖，只要是本发明的酶剂中所含的蛋白可催化差向异构化的糖，即可用作糖底物。作为上述糖底物，可使用纯品，但从成本等方面考虑，也可使用包含其他糖质的糖组合物。具体而言，例如在主要底物中使用葡萄糖的情况下，可以是除葡萄糖以外还包含通过淀粉的分解产生的麦芽糖或麦芽三糖等的糖组合物。
使本发明的酶剂中所含的蛋白与糖底物作用时的反应温度只要是体现酶活性的温度范围即可，没有特别限定。本发明的酶剂中所含的蛋白如实施例记载所示在pH6.0下反应的情况下可在温度53℃以下进行反应。在现有的差向异构酶中，从热稳定性的角度考虑，对工业规模中的使用有限制。然而，本发明的酶剂中所含的蛋白显示高耐热性，具有适于工业规模中使用的热稳定性。
因此，使本发明的酶剂作用时的反应温度(反应液的液温)可设定为35～55℃的宽温度范围。在工业规模的反应***中有时难以进行准确的温度管理，但本蛋白在可在宽温度范围内稳定地使用方面有利。
上述反应温度可设定为35～55℃的范围，优选设定为45～53℃的范围。这是由于：如果反应温度为45℃以上，则以糖为营养成分的混入菌不易繁殖，本蛋白在53℃以下显示温度稳定性。
在糖的差向异构化反应产物的制造方法中，如下所述，可并用本发明的酶剂和其他酶。在并用其他酶的情况下，上述反应温度只要是本发明的酶剂中所含的蛋白稳定地作用的温度范围即可。如上所述，由于本发明的酶剂中所含的蛋白在宽温度范围内具有稳定性，所以考虑并用的其他酶稳定地活化的温度，往往可在反应***中使用的所有酶的活性均可充分利用的范围内进行温度设定。
反应温度无需在整个反应时间内恒定，可适当调节如下：在反应时间的初期希望提高并用的其他酶的活性的情况下，可在其酶的活性提高的温度范围内设定反应初期的温度，在反应时间的中期或后期将温度设定为本发明的酶剂中所含的蛋白的活性提高的温度范围等。
使本发明的酶剂中所含的蛋白与糖底物作用时的反应液的pH只要是体现酶活性的pH范围即可，没有特别限定，可设定为pH5.5～8.5的范围。这是由于：如实施例所记载，本发明的酶剂中所含的蛋白至少可在pH6.0～8.0的范围内反应。为了高效地得到糖的差向异构化反应产物，优选将使本发明的酶剂中所含的蛋白作用时的反应液的pH设定为pH6.0～8.0的范围。反应液的pH的调节可根据需要通过添加酸或碱来进行。
糖的差向异构化反应产物的制造方法中的底物与本发明的酶剂中所含的蛋白的反应时间可考虑反应温度或底物的浓度、并用其他酶的情况下使用的酶的特性等而适当确定。另外，根据本领域的现有技术，可适当确定用于高效率地制造差向异构化反应产物的适当的反应时间。作为具体的反应时间的例子，可列举：10分钟～72小时，但并不限定于此。反应中可适当添加本发明的酶剂。
对反应液中的底物浓度没有特别限定，例如，在上述酶反应可进行的范围内，底物浓度越高，在经济上越有利。在使用葡萄糖作为底物的情况下，每100g溶剂中葡萄糖浓度为0.1g～300g的范围。对上述反应液的溶剂没有特别限定，例如可列举：水、缓冲液等。需要说明的是，在所选择的底物在溶剂中的溶解度低的情况下，例如，存在在以所期望的浓度下没有完全溶解的情况。在以间歇式进行酶反应的情况下，例如在反应初期不必是底物完全溶解的状态，只要选择在酶反应结束时溶解的底物浓度即可。另一方面，在酶反应中使用填充有固定化的酶剂的柱的情况下，例如，为了避免由柱的堵塞引起的压力损失，优选为底物完全溶解的状态。另外，在酶反应中使用填充有固定化的酶剂的柱的情况下，例如优选使底物溶液在上述柱中回流，连续地通液。另外，在使用本发明的酶剂以葡萄糖为底物生成甘露糖的情况下，可使用糖稀、粉状糖稀、玉米糖母液(hydrol)(制造结晶葡萄糖时产生的分蜜液)等。而且，例如可以以糊精、淀粉等包含葡萄糖作为构成糖的糖质为原料，同时添加水解酶和本发明的酶剂，由原料生成成为底物的葡萄糖，同时由葡萄糖制造甘露糖。
使用本发明的酶剂的差向异构化反应产物的制造，作为具体例子，在使用葡萄糖作为底物的情况下，可调制固体成分浓度为1～65％左右的葡萄糖水溶液，根据需要使用酸或碱将该水溶液的pH调节至6.0～8.0左右，在该水溶液中添加本发明的酶剂，在温度30～53℃的范围内保持约1～72小时，从而制造甘露糖。
另外，在糖的差向异构化反应产物的制造方法中，可并用本发明的酶剂和其他酶。其他酶并不限定于此，可以是生成可成为具有催化本发明的糖的差向异构化反应的活性的酶的底物的糖的酶。例如，作为其他酶，可使用将乳糖等包含半乳糖作为构成糖的糖质水解的酶。通过并用本发明的酶剂(即，糖的差向异构化反应催化用酶剂)和作为其他酶的该水解酶，可由乳糖等包含半乳糖作为构成糖的糖质通过水解生成半乳糖，同时通过差向异构化由半乳糖生成塔罗糖。
通过上述制造方法，得到包含差向异构化反应产物的糖水溶液。根据需要，可利用常规方法对该包含差向异构化反应产物的糖水溶液施行脱色、脱盐、纯化处理等。另外，通过对包含差向异构化反应产物的糖水溶液施行树脂分馏处理、基于使用乙醇等的有机溶剂沉淀法、基于色谱分馏法或超滤膜的处理等，可去除未反应的底物等，提高差向异构化反应产物的纯度。纯化处理可通过单独的操作、或组合若干个操作，更有效地纯化差向异构化反应产物。
在另一个实施方案中，本发明提供糖的差向异构化反应产物的制造方法，其包含以下工序：使本发明的糖的差向异构化反应催化用酶剂在pH5.5～7.0条件下与糖底物作用，得到糖的差向异构化反应产物，其中，反应产物中的副产物被抑制在目标差向异构化反应产物的5％以下。例如，可使本发明的糖的差向异构化反应催化用酶剂在pH5.5～7.0条件下与葡萄糖作用制造甘露糖，该方法中可将反应产物中的果糖副产物抑制在甘露糖的5％以下。上述pH条件优选为pH5.5～6.5的范围。反应产物中的副产物优选抑制在目标差向异构化反应产物的4.5％以下、4.0％以下、3.5％以下、3.0％以下、2.5％以下、2.0％以下、1.5％以下、1.0％以下或0.5％以下。
本发明提供食品、饲料、饵料、化妆品或药品的制造方法，其包括以下工序：使用实施糖的差向异构化反应产物的制造方法而得到的糖的差向异构化反应产物，得到食品、饲料、饵料、化妆品或药品。
糖的差向异构化反应产物可实施上述的糖的差向异构化反应产物的制造方法而得到。
在使用实施糖的差向异构化反应产物的制造方法而得到的糖的差向异构化反应产物得到食品、饲料、饵料、化妆品或药品的工序中，以差向异构化反应产物作为原料之一，制造食品、饲料、饵料、化妆品或药品，或者，将差向异构化反应产物本身调制成适当的形态(粉末、液体等)，作为食品、饲料、饵料、化妆品或药品来提供。
对通过本发明的方法制造的食品的例子没有限定，可列举：各种碳水化合物类(面包、面条、米饭、年糕)、各种日式点心类(仙贝、小块年糕、米花糖、牛皮糖、年糕类、日式馒头、铜锣烧、米粉糕、馅类、羊羹、水羊羹、锦球、蛋糕(castella，长崎蛋糕)、糖球)、各种西式点心类(面包、饼干、咸饼干、曲奇、馅饼、甜甜圈、蒸蛋糕、布丁、果冻、奶油冻、巴伐露(bavarois)、卡仕达酱(custard cream，乳蛋糕乳脂)、泡芙、华夫饼、海绵蛋糕、巧克力、口香糖、焦糖、牛轧糖、糖果、糖浆类)、各种冰冻点心(冰激凌、冰冻果子露、意式冰淇淋、刨冰)、各种糊状食品(糖花膏(flower paste)、花生酱、人造黄油(margarine)、果泥)、各种饮料(含果汁饮料、果汁、蔬菜汁、苹果汁、姜汁汽水、等渗饮料、氨基酸饮料、果冻饮料、咖啡饮料、绿茶、红茶、乌龙茶、大麦茶、乳饮料、乳酸菌饮料、可可茶、啤酒、发泡酒、准啤酒、无酒精饮料、啤酒风味饮料、利口酒(liqueur)、烧酎高杯酒、清酒、果酒、蒸馏酒、营养饮料、健康饮料、粉末饮料)、果物/蔬菜加工品(果酱、橘子酱(marmalade)、糖渍、糖果、腌菜)、各种乳制品(芝士、酸奶、黄油、炼乳、奶粉)、粉末食品(粉末汤、粉末奶油冻、粉末果冻、粉末甜味剂)、营养食品、减肥食品、运动用营养食品、流食、半固态流食、护理食品、吞咽食品等。
对通过本发明的方法制造的饲料和饵料的例子没有限定，可列举：家畜、家禽、海鲜类、昆虫(蜜蜂、蚕等)用饲料和饵料。作为其形态，有粉体、颗粒、片剂、钓饵、胶囊等。
对通过本发明的方法制造的化妆品的例子没有限定，可列举：保湿剂和美容剂等。作为它们的形态，有乳液、霜剂和乳剂等。
对通过本发明的方法制造的药品的例子没有限定，例如可列举：减肥药、血糖值上升抑制剂等，作为它们的形态，有片剂、粉末剂、液体制剂、胶囊剂等。
＜蛋白的制造＞
对本发明的酶剂中所含的蛋白的获得方法没有特别限定，可以是通过化学合成而合成的蛋白，也可以是通过基因重组技术制作的重组蛋白。以下，对制作重组蛋白的情况进行说明。
具有下述氨基酸序列的蛋白可通过基因工程学方法调制：SEQ ID NO:1或3所示的氨基酸序列、或相对于SEQ ID NO:1或3所示的氨基酸序列具有90％以上的氨基酸序列同一性的氨基酸序列、以及在SEQ ID NO:1或3所记载的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、***、缺失和/或添加而得的氨基酸序列。例如，编码SEQ ID NO:1或3的氨基酸序列的基因作为可在宿主细胞内复制、或者以整合到染色体内且可表达该基因的状态包含的DNA分子，特别是以***到表达载体内的形态进行宿主细胞的转化，通过培养宿主细胞可产生蛋白。该DNA分子可通过将编码下述氨基酸序列的DNA片段整合到载体分子内而得到：SEQ IDNO:1或3所示的氨基酸序列、相对于SEQ ID NO:1或3所示的氨基酸序列具有90％以上的氨基酸序列同一性的氨基酸序列、或者在SEQ ID NO:1或3所记载的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、***、缺失和/或添而得到的氨基酸序列。根据本发明的优选方案，该载体为质粒。本发明中的DNA分子的制作可依据Molecular Cloning：A Laboratory Manual中记载的方法进行。
本发明中可利用的载体，可在考虑使用的宿主细胞的种类的同时从病毒、质粒、粘粒载体等中适当选择。例如，在宿主细胞为枯草杆菌的情况下，可列举：pJEXOPT2系(参照日本专利5126879号)、pHT系的质粒；在大肠杆菌的情况下，可列举：λ噬菌体系的噬菌体、pET系、pUC系、pCold系、pGEX系的质粒；在酵母的情况下，可列举：YEp、YCp系、YIp系的载体或pLeu4、pPPLeu4、pJPLeu4系(记载于日本特开平4-218382号公报中)等，但并不限定于这些。该质粒可包含用于选择转化体的标志物，作为该选择标志物，可使用耐药性标志物或营养要求标志物基因，但并不限定于这些。
而且，本发明中可利用的表达载体可具有酶基因的表达所必需的DNA序列、例如启动子、终止子、核糖体结合位点、转录终止信号等转录调节信号、翻译调节信号等。作为该启动子，在枯草杆菌中可使用枯草杆菌蛋白酶、SPAC等启动子，在酵母中使用醇脱氢酶(ADH)、酸性磷酸酶(PHO)、半乳糖基因(GAL)、甘油醛3磷酸脱氢酶基因(GAP)等启动子，但并不限定于这些。信号肽的赋予具有目标酶分泌到培养上清中、且容易纯化的优点，因此优选使用。另外，可将信号肽置换成来自枯草杆菌或酵母的信号(例如，蔗糖酶信号、酸性磷酸酶信号、λ-因子信号等)。另外，在大肠杆菌中，除通常惯用的lac启动子或T7启动子以外，也可使用cspA启动子等同时表达分子伴侣等，从而使表达更有效。
已进行转化的宿主细胞的培养可采用与使用的宿主细胞相关的普通方法。通常，通过1～4天左右的培养，在细胞内或细胞外的培养物中生成酶并蓄积。关于培养条件(培养基、pH、温度等)，例如，在细菌中为25～37℃、在酵母中为25～30℃、在真核细胞中为37℃左右。关于培养条件，可参照基因表达实验手册(讲谈社)等。
作为宿主细胞，除大肠杆菌、枯草杆菌等细菌、产朊假丝酵母(Candidautilis)、酿酒酵母(Saccaromycescerevisiae)、毕赤酵母(Pichiapastoris)等酵母以外，还可使用雪白根霉(Rhizopus niveus)、戴尔根霉(Rhizopusdelemar)或高等真核生物(例如CHO细胞等)。作为枯草杆菌，优选使用属于芽孢杆菌(Bacillus)属的微生物。已知在芽孢杆菌属中存在将蛋白分泌到菌体外的菌株(例如，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等)。另外，还已知几乎不分泌蛋白酶的菌株，还优选使用这样的菌株作为宿主。本发明中，作为宿主细胞，优选酵母、丝状菌或细菌，更优选细菌，特别是优选大肠杆菌或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
转化体产生的蛋白的分离/纯化可适当组合已知的分离方法或纯化方法来进行。作为它们的分离/纯化方法，例如可列举：盐沉淀、溶剂沉淀这样的利用溶解性之差的方法；透析、超滤、凝胶过滤和SDS-聚丙烯酸电泳这样的利用分子量之差的方法；离子交换色谱法这样的利用电荷之差的方法；疏水色谱法、反向色谱法这样的利用疏水性之差的方法；以及等电点电泳这样的利用等电点之差的方法；此外还有亲和色谱法等。除实施例中记载的纯化方法以外，关于一般的分离/纯化方法，例如可参照蛋白质/酶的基础实验法(南江堂)等。
实施例
根据以下的例子，更具体地说明本发明，但本发明并不限定于这些例子。需要说明的是，在本说明书中，只要没有特别记载，则“％”为质量基准，数值范围以包括其端点的形式记载。另外，只要没有特别记载，则操作步骤按照Molecular Cloning：A LaboratoryManual(Sambrook、Maniatis等人,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989))中记载的方法。
在本实施例中，由洛纳尔湖半月单胞菌(Lunatimonas lonarensis)克隆编码推断为N-酰基葡糖胺2-差向异构酶(AGE)的功能未确认的蛋白(NCBI Reference：WP_010853281.1)的基因，得到重组蛋白，对其酶活性进行特性评价。
实施例1：以枯草杆菌为宿主的本酶的菌体外表达(1)
1-1.表达质粒的构建
对各种微生物进行新型酶探索，选出来自洛纳尔湖半月单胞菌(Lunatimonaslonarensis)的氨基酸序列(NCBI Reference：WP_010853281.1)，进行功能分析。该氨基酸序列(SEQ ID NO:1)和编码氨基酸序列的基因(以下，称为目标基因1)的核苷酸序列(SEQID NO:2)分别见图1A和B。图1C所示的SEQ ID NO:3的氨基酸序列是从SEQ ID NO:1的氨基酸序列中删除了推断为信号肽的部分后的序列。对SEQ ID NO:2和4所示的核苷酸序列进行密码子最优化，试图在枯草杆菌中的良好表达。
构建了用于使目标基因1在枯草杆菌(Bacillus subtilis)中表达的表达质粒。首先，以在pUC57载体中***有SEQ ID NO:2所记载的核苷酸序列的质粒为模板，有义链的扩增使用添加有与载体的信号肽序列的末端相同的核苷酸序列的引物，反义链的扩增使用添加了一部分终止子序列的引物，对目标基因进行PCR扩增。PCR扩增用反应液的组成如下所示。
2×Primestar Max Premix(TAKARA BIO)          50μL；
10μM引物(LlAGE-Fw)                           2μL；
10μM引物(LlAGE-Rv)                           2μL；
1ng/μL模板                                   2μL；
H2O                                          44μL。
所用引物见表1。
[表1]
Figure BDA0004113599710000231
PCR扩增反应的程序如下：首先，在96℃下保持1分钟，之后以98℃、10秒→55℃、5秒→72℃、10秒为1个循环进行35个循环，之后再于72℃下保持5分钟。将所得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，由凝胶切取相当于扩增片段(1、299bp)的谱带，使用illustraTMGFXTMPCR DNA and Gel Band纯化试剂盒(GE HealthCare)进行提取并纯化。
为了调制在In-Fusion(注册商标)克隆反应中使用的线性化质粒，以对载体pJEXOPT2(参照日本专利5126879号)进行改变使在本实施例中最优化而得的质粒为模板，使用表2所示的引物进行PCR。反义链的扩增使用了以由载体的信号肽序列的末端扩增的方式组合的引物。
所用引物见表2。
[表2]
Figure BDA0004113599710000232
PCR扩增的反应液的组成除引物和模板以外，与用于目标基因1的扩增的组成相同。PCR扩增反应的程序如下：首先，在96℃下保持1分钟后，以98℃、10秒→55℃、5秒→72℃、35秒为1个循环进行35个循环，之后再于72℃下保持5分钟。将所得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，由凝胶切取相当于扩增片段(6、935bp)的谱带，使用illustraTM GFXTMPCRDNA and Gel Band纯化试剂盒(GE HealthCare)进行提取并纯化。使用In-Fusion HD克隆试剂盒(TAKARA BIO)连接目标基因1的扩增DNA片段和载体pJEXOPT2的扩增片段。连接反应通过在50℃下保持15分钟来进行。
使用2.5μL连接反应溶液转化大肠杆菌DH5α并进行培养，利用illustraTMplasmidPrep Mini Spin试剂盒(GE HealthCare)由所得的培养液调制质粒DNA。将所得质粒作为“本酶表达用质粒”。
1-2.重组蛋白的表达
将上述的本酶表达用质粒引入至已原生质体化的枯草杆菌ISW1214(TAKARA BIO)中，使用包含7.5μg/mL四环素的DM3再生琼脂培养基(组成：8.1％琥珀酸钠、1％琼脂、0.5％酪蛋白氨基酸、0.5％酵母提取物、0.15％磷酸二氢钾、0.35％磷酸氢二钾、0.5％葡萄糖、0.4％氯化镁、0.01％牛血清白蛋白、0.001％蛋氨酸和0.001％亮氨酸)在30℃下培养2天。使用所得到的菌落，经过预培养后，进行72小时的正式培养(如日本专利5126879号所记载进行培养，但培养基的组成使用已变更的组成)。进行离心分离(5,000×g、4℃、5分钟)，将上清用孔径0.45μm的过滤器(Merck)过滤后作为本酶溶液1。将该本酶溶液1供于SDS-PAGE，确认了在目标尺寸(50,000)附近出现谱带(图3)。
实施例2：以枯草杆菌为宿主的本酶的菌体外表达(2)
使用实施例1-1中构建的本酶表达用质粒进行实施例2。
2-1.重组蛋白的表达
按照与实施例1-2同样的方法向枯草杆菌ISW1214(TAKARA BIO)中引入本酶表达用质粒并实施培养。对所得到的培养液进行离心分离(5,000×g、4℃、5分钟)，将上清用孔径为0.45μm的过滤器(Merck)过滤后作为培养上清。将该培养上清供于SDS-PAGE，确认了在目标尺寸(50,000)附近出现谱带(图4)。而且，使用Amicon Ultra-15离心式过滤器单元(Merck)将该培养上清浓缩10倍左右，作为本酶溶液2。
比较例1：比较用酶溶液的调制
1.表达质粒的构建
为了与实施例1记载的来自洛纳尔湖半月单胞菌的差向异构化酶进行功能比较，对专利文献6中记载的来自Melioribacter roseus的CE(氨基酸序列的NCBI Reference：AFN73749.1)在枯草杆菌中进行菌体外表达。该氨基酸序列(SEQ ID NO:9)和编码氨基酸序列的基因(以下，称为比较用基因)的核苷酸序列(SEQ ID NO:10)分别见图2A和B。对SEQ IDNO:10所示的核苷酸序列进行密码子最优化，试图在枯草杆菌中的良好表达。
构建了用于使比较用基因在枯草杆菌(Bacillus subtilis)中表达的表达质粒。首先，以在pUC57载体中***SEQ ID NO:10所记载的核苷酸序列而得的质粒作为模板，有义链的扩增使用添加有与载体的信号肽序列的末端相同的核苷酸序列的引物，反义链的扩增使用添加有一部分终止子序列的引物，对比较用基因进行PCR扩增。PCR扩增用反应液的组成如下所示。
Figure BDA0004113599710000251
所用引物见表3。
[表3]
Figure BDA0004113599710000252
PCR扩增反应的程序如下：首先，在96℃下保持1分钟后，以98℃、10秒→55℃、5秒→72℃、10秒为1个循环进行35个循环，之后再于72℃下保持5分钟。将所得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，由凝胶切取相当于扩增片段(1,383bp)的谱带，使用illustraTMGFXTMPCRDNAand GelBand纯化试剂盒(GEHealthCare)进行提取并纯化。
In-Fusion(注册商标)克隆反应中使用的线性化质粒的调制如下进行：进行与实施例1-1同样的操作，使用In-FusionHD克隆试剂盒(TAKARABIO)连接比较用基因的扩增DNA片段和改变载体pJEXOPT2(参照专利5126879号)以在本实施例中最优化而得的质粒的扩增片段。连接反应通过在50℃下保持15分钟来进行。
使用2.5μL连接反应溶液转化大肠杆菌DH5α并进行培养，使用illustraTMplasmidPrepMiniSpin试剂盒(GEHealthCare)由所得的培养液调制质粒DNA。将所得质粒作为“比较酶表达用质粒”。
2.重组蛋白的表达
将上述的比较酶表达用质粒引入至已原生质体化的枯草杆菌ISW1214(TAKARABIO)中，使用包含7.5μg/mL四环素的再生琼脂培养基(组成：8.1％琥珀酸钠、1％琼脂、0.5％酪蛋白氨基酸、0.5％酵母提取物、0.15％磷酸二氢钾、0.35％磷酸氢二钾、0.5％葡萄糖、0.4％氯化镁、0.01％牛血清白蛋白、0.001％蛋氨酸和0.001％亮氨酸)在30℃下培养2天。使用所得到的菌落，与实施例1-2同样地进行预培养和正式培养。将所得培养液进行离心分离(5,000×g、4℃、5分钟)，将上清用孔径为0.45μm的过滤器(Merck)过滤后作为比较用酶溶液。
比较例2：空载体对照(阴性对照)的调制
调制了用空载体转化的细胞的培养上清作为阴性对照。使用改变载体pJEXOPT2(参照日本专利5126879号)以在本实施例中最优化而得的质粒引入至原生质体化的枯草杆菌ISW1214(TAKARABIO)中，使用包含7.5μg/mL四环素的再生琼脂培养基(组成：8.1％琥珀酸钠、1％琼脂、0.5％酪蛋白氨基酸、0.5％酵母提取物、0.15％磷酸二氢钾、0.35％磷酸氢二钾、0.5％葡萄糖、0.4％氯化镁、0.01％牛血清白蛋白、0.001％蛋氨酸和0.001％亮氨酸)在30℃下培养2天。使用所得到的菌落，与实施例1-2同样地进行预培养和正式培养。对所得到的培养液进行离心分离(5,000×g、4℃、5分钟)，将上清用孔径为0.45μm的过滤器(Merck)过滤后作为空载体对照(阴性对照)。
实施例3：酶反应产物的TLC分析
在本实施例中，验证了本酶所作用的底物。在酶反应的底物中使用了甘露糖和半乳糖。
将由10μL50mM的HEPES-NaOH缓冲液(pH7.0)、10μL500mM的各种底物、10μL本酶溶液1和70μL超纯水构成的100μL反应液在37℃下保持24小时，将其中的0.5μL供于薄层色谱法(TLC)。
展开溶剂使用2-丙醇/1-丁醇/水的混合液(依次为2：2：1的混合比(均为体积比))。
糖的检测通过将作为显色剂的茴香醛/硫酸/乙酸的混合液(依次为1：2：97的混合比(均为体积比))喷雾于TLC板后进行加热来实施。
其结果见图5。在两种底物中观察到酶反应前的糖(底物)和反应后的糖的移动距离不同。在以甘露糖为底物的分析中，在反应后的样品中观察到与葡萄糖的移动度一致的斑点。另外，在以半乳糖为底物的分析中，在反应后的样品中观察到与塔罗糖的移动度一致的斑点。判明了：来自洛纳尔湖半月单胞菌的本酶至少与甘露糖和半乳糖作用。
实施例4：甘露糖合成试验
4-1.方法
对本酶溶液1和比较用酶溶液实施了以葡萄糖为底物的甘露糖的合成试验。即，将由10.3～330.0μL/g-ds的酶(本酶溶液1或比较用酶溶液)、50％葡萄糖、40mM各缓冲液(MES-NaOH缓冲液(pH6.0)、磷酸钠缓冲液(pH7.0)或HEPES-NaOH缓冲液(pH8.0))和0.02％叠氮化钠构成的1mL反应液在50℃下保持24～72小时。另外，为了研究基于共存的缓冲液成分等的异构化，对使用了空载体对照的反应液也进行与上述同样地调制、保持。将在各反应时间采集的反应液调节至pH4.0以下，通过煮沸10分钟使反应停止。之后，混合10μL反应液和800μL纯水进行稀释。
通过HPLC分析以葡萄糖为底物的本酶的产物的糖组成。分析条件如下，柱：HILICpakVG-504E(Shodex)、HILICpakVG-50G4A(Shodex)、洗脱液：80％乙腈、流速：0.6mL/分钟、柱温：40℃、检测器：带电粒子检测器。
4-2.结果
关于如上所述使酶与葡萄糖作用时的反应产物，其糖组成分析的结果见图6～11。反应产物中的甘露糖含量和果糖含量由HPLC分析的峰面积比算出。
在本酶溶液1添加区和比较用酶溶液添加区，在pH6.0、7.0和8.0的全部试验区由葡萄糖生成了甘露糖。若比较本酶溶液1添加区与比较用酶溶液添加区的反应产物中的甘露糖含量，则在所有的试验区本酶溶液1显示出约1.3～2.0倍高的甘露糖含量。另一方面，在添加了空载体对照的试验区，在进行试验的任一pH下均未生成甘露糖。
添加330.0μL/g-ds的本酶溶液1，在反应温度50℃、保持72小时的条件下甘露糖含量的最大值如下：pH6.0下为28.7％、pH7.0下为27.2％、pH8.0下为29.6％。其是在相同条件下使用比较用酶的情况的约1.3倍。
在pH6.0的试验区，在使用本酶溶液1、比较用酶溶液和空载体对照的任一者的情况下，几乎均未检测到果糖。另一方面，在pH7.0和8.0的试验区，在使用本酶溶液1、比较用酶溶液和空载体对照的任一者的情况下，均确认到果糖的生成。在pH7.0下作用72小时的情况下，在使用本酶溶液1、比较用酶溶液和空载体对照的任一者的情况下，果糖含量也为1.1～1.6％。在pH8.0下作用72小时的情况下，在使用本酶溶液1、比较用酶溶液和空载体对照的任一者的情况下，果糖含量为3.2～7.2％。在pH7.0和pH8.0下，若酶添加量增多，则均发现了反应产物中的果糖含量下降的倾向。
在添加330.0μL/g-ds的本酶溶液1、于pH8.0下作用72小时的情况下，反应产物中的甘露糖含量为29.6％、果糖含量为3.4％，反应产物中的果糖副产物相当于甘露糖的约11.4％。另外，在添加330.0μL/g-ds的本酶溶液1、于pH7.0下作用72小时的情况下，反应产物中的甘露糖含量为27.2％、果糖含量为1.2％，反应产物中的果糖副产物相当于甘露糖的约4.4％。另一方面，在添加330.0μL/g-ds的本酶溶液1、于pH6.0下作用72小时的情况下，反应产物中的甘露糖含量为28.7％、果糖含量为0.9％，反应产物中的果糖副产物相当于甘露糖的约3.1％。
由这些结果暗示：果糖是通过非酶促反应(例如，因缓冲液或pH的影响而由葡萄糖向果糖的异构化等)或夹杂酶的反应(通过异构化酶由葡萄糖转化成果糖)而生成的。进一步判明：通过在pH7.0以下、特别是pH6.0下进行反应，可抑制果糖的生成。
实施例5：塔罗糖的合成试验
1.方法
对本酶溶液2实施了以半乳糖为底物的塔罗糖的合成试验。即，在将1kg半乳糖溶解于水后，添加178.5g的本酶溶液2，再将pH调节至6.0，添加水使反应液的重量为2kg，进行混合。使该反应液在53℃下反应24～72小时。将在各反应时间采集的反应液调节至pH4.0以下，通过煮沸10分钟使反应停止。之后，混合10μL反应液和800μL纯水，进行稀释。
通过HPLC分析了所得到的反应稀释液中的半乳糖、塔罗糖和半乳糖的糖组成。分析条件如下，柱：HILICpakVG-504E(Shodex)、HILICpakVG-50G4A(Shodex)、洗脱液：80％乙腈、流速：0.6mL/分钟、柱温：40℃、检测器：带电粒子检测器。
2.结果
使本酶溶液2与半乳糖作用时的反应产物的糖组成分析结果见表4。
[表4]
Figure BDA0004113599710000301
＊由HPLC分析的峰面积比算出。
本酶可在反应温度53℃下反应，由半乳糖生成塔罗糖和塔格糖。塔罗糖含量的最大值为17.5％。
序列表文本
SEQ ID NO:1来自洛纳尔湖半月单胞菌的蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO:2编码来自洛纳尔湖半月单胞菌的蛋白的核苷酸序列；
SEQ ID NO:3来自洛纳尔湖半月单胞菌的蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO:4编码来自洛纳尔湖半月单胞菌的蛋白的核苷酸序列；
SEQ ID NO:5～8引物序列；
SEQ ID NO:9来自Melioribacterroseus的蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO:10编码来自Melioribacterroseus的蛋白的核苷酸序列；
SEQ ID NO:11～12引物序列。

Claims (4)

1.糖的差向异构化反应催化用酶剂，其是包含以下的(a)～(c)中的任一种蛋白的糖的差向异构化反应催化用酶剂，上述糖为选自葡萄糖、甘露糖、塔罗糖和半乳糖的任一种，
(a)蛋白，其由SEQ ID NO:1或3所记载的氨基酸序列构成；
(b)蛋白，其由相对于SEQ ID NO:1或3所记载的氨基酸序列具有90％以上的氨基酸序列同一性的氨基酸序列构成，并且具有催化糖的差向异构化反应的活性；
(c)蛋白，其由在SEQ ID NO:1或3所记载的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、***、缺失和/或添加而得的氨基酸序列构成，并且具有催化糖的差向异构化反应的活性。
2.糖的差向异构化反应催化用酶剂，其是包含引入了以下的(d)～(f)中的任一种多核苷酸的转化细胞的培养上清的糖的差向异构化反应催化用酶剂，上述糖为选自葡萄糖、甘露糖、塔罗糖和半乳糖的任一种：
(d)多核苷酸，其由SEQ ID NO:2或4所示的核苷酸序列构成；
(e)多核苷酸，其是在严格条件下与由SEQ ID NO:2或4所示的核苷酸序列构成的多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸，并且编码具有催化糖的差向异构化反应的活性的蛋白；
(f)多核苷酸，其是相对于由SEQ ID NO:2或4所示的核苷酸序列构成的多核苷酸具有90％以上的核苷酸序列同一性的多核苷酸，并且编码具有催化糖的差向异构化反应的活性的蛋白。
3.糖的差向异构化反应产物的制造方法，其包括以下工序：使权利要求1或2所述的酶剂与糖底物作用，得到糖的差向异构化反应产物。
4.食品、饲料、饵料、化妆品或药品的制造方法，其包括以下工序：使用实施权利要求3所述的方法而得到的糖的差向异构化反应产物，得到食品、饲料、饵料、化妆品或药品。
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