JP6657453B1 - 糖のエピメリ化触媒用の酵素剤、エピメリ化反応生成物の製造方法およびエピメリ化反応生成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は以下の通りである。
[1]以下の(a)から(c)のいずれかのタンパク質を含む、糖のエピメリ化触媒用の酵素剤。
(a) 配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b) 配列番号2に記載のアミノ酸配列に対して90%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖のエピメリ化活性を有するタンパク質;
(c) 配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および/または付加されたアミノ酸配列からなり、糖のエピメリ化活性を有するタンパク質。
[2]上記糖はN−アシル−D−グルコサミンを含まない、[1]に記載の酵素剤。
[3]メリオリバクター・ロセウス(Melioribacter roseus)に由来し、下記の性質を有するタンパク質を含む、糖のエピメリ化触媒用の酵素剤。
(1)糖のエピメリ化活性を有する;
(2)N−アシル−D−グルコサミンを実質的に基質としない;
(3)SDS−PAGEにより測定された分子量が48〜58kDaである;
(4)最適pHが6.8〜8.6の範囲である;
(5)pH5.8〜9.9の範囲で安定である;
(6)最適温度が56℃〜60℃の範囲である;
(7)50℃以下で安定である。
[4]糖のエピメリ化が、D−グルコース、D−マンノース、D−タロース、D−ガラクトース、セロビオース、ラクトース、エピラクトース、β−(1→4)−マンノビオース、β−(1→4)−グルコシルマンノース、およびβ−(1→4)−マンノシルグルコースからなる群から選択されるいずれかの糖のエピメリ化である[1]〜[3]の何れか一に記載の酵素剤。
[5]糖のエピメリ化反応生成物の製造に用いられる、[1]〜[4]のいずれか一に記載の酵素剤。
[6]糖基質に、[1]〜[5]のいずれか一に記載の酵素剤を作用させて、糖のエピメリ化反応生成物を得る工程を含む、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法。
[7][6]に記載の方法を実施して糖のエピメリ化反応生成物を得る工程、および上記工程で得られた糖のエピメリ化反応生成物を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
本発明は、以下の(a)から(c)のいずれかのタンパク質を含む、糖のエピメリ化触媒用の酵素剤を提供する。
(a) 配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b) 配列番号2に記載のアミノ酸配列に対して90%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖のエピメリ化活性を有するタンパク質;
(c) 配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および/または付加されたアミノ酸配列からなり、糖のエピメリ化活性を有するタンパク質。
なお、本明細書中において、上記(a)から(c)のいずれかのタンパク質を、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質、または本タンパク質ということがある。
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質の製造方法については、後述の<タンパク質の製造>を参照されたい。
(1)糖のエピメリ化活性を有する;
(2)N−アシル−D−グルコサミンを実質的に基質としない;
(3)SDS-PAGEにより測定された分子量が48〜58kDaである;
(4)最適pHが6.8〜8.6の範囲である;
(5)pH5.8〜9.9の範囲で安定である;
(6)最適温度が56℃〜60℃の範囲である;
(7)50℃以下で安定である。
(8)基質として、D−グルコース、D−マンノース、D−タロース、D−ガラクトース、セロビオース、ラクトース、エピラクトース、β−(1→4)−グルコシルマンノース、β−(1→4)−マンノシルグルコース、およびβ−(1→4)−マンノビオースからなる群から選択されるいずれかに作用する。
糖のエピメリ化活性を有するタンパク質の上記固定化担体への固定方法は、特に制限されず、例えば、緩衝液等の溶媒に本タンパク質と上記固定化担体とを添加し、この混合液を振とうすることで行うことができる。
本発明は、糖基質に、本発明の糖のエピメリ化触媒用の酵素剤を作用させて、糖のエピメリ化反応生成物を得る工程を含む、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法を提供する。糖基質に、本発明の酵素剤を作用させることは、例えば、糖基質の水溶液を調製し、必要に応じてpHを調整した後、当該水溶液に本発明の酵素剤を添加することにより実施することができる。さらには、本発明の糖のエピメリ化活性を有するタンパク質を担体に固定して酵素剤とし、当該酵素剤に糖基質の水溶液を接触させることにより実施することができる。本発明の酵素剤を用いた糖のエピメリ化反応は、反応液中で実施することができるためである。
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質の取得方法は、特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質であってもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質であってもよい。以下に、組換えタンパク質を作製する場合について説明する。
1.発現プラスミドの構築
メリオリバクター・ロセウス(DSM23840)から、N−アシルグルコサミン 2−エピメラーゼ(AGE)と推定されているタンパク質をコードする遺伝子をクローニングした。この遺伝子の塩基配列(配列番号1)および本遺伝子にコードされるアミノ酸配列(配列番号2)をそれぞれ図1A、および図1Bに示す。
上記形質転換体を100μg/mL アンピシリンを含む20mLのLB培地に植菌し、37℃にて一晩振盪培養した。この培養液20mLを1Lの同培地に植え継ぎ、濁度(波長600nm)が0.5に達するまで同条件で培養した。0.1M イソプロピルβ−D−チオガラクトシド(IPTG)を終濃度0.1mMになるように添加し、誘導培養を開始した。IPTG添加後、培養温度を18℃とし、24時間振盪培養した。遠心分離(6,000×g、4℃、10分間)を行い、菌体を回収した。菌体を0.3M NaClを含む10mM イミダゾール−HCl緩衝液(pH8.0)に懸濁し、超音波破砕により破砕した。得られた菌体破砕液を10,000×g、4℃、10分間の条件で遠心分離し、上清を回収した。ニッケルイオンをキレートしたキレーティングセファロースファストフロー(GEヘルスケア)に得られた菌体破砕液を供して、ヒスチジンタグ融合タンパク質を精製した。すなわち、0.5M NaClを含む0.03M イミダゾール−HCl緩衝液(pH7.0)で担体を洗浄後、0.3M NaClを含む0.5M イミダゾール−HCl緩衝液(pH8.0)により溶出した。得られた試料を10mM トリス−HCl緩衝液(pH7.0)に透析して以後の解析に用いた。試料をSDS−PAGEにより解析し、単一バンドであることを確認した(図2)。本組換えタンパク質の分子量は48〜58kDaまたは約53kDaと見積もられた。以下の実施例では、実施例1で調製した組換えタンパク質を、本酵素と記載する。
本実施例では、本酵素が触媒する酵素反応を検証した。酵素反応の基質には、D−グルコース、D−マンノース、D−フルクトース、D−タロース、D−ガラクトース、D−タガトース、D−キシロース、D−リキソース、D−キシルロース、セロビオース、ラクトース、エピラクトース、β−(1→4)−グルコシルマンノース、β−(1→4)−マンノシルグルコース、およびβ−(1→4)−マンノビオースを用いた。
本実施例では、N−アセチル−D−グルコサミンおよびN−アセチル−D−マンノサミンに対する本酵素の反応性について検証した。
5mM トリス−HCl緩衝液(pH8.0)、50mM 各種基質および1.74μM 本酵素からなる、反応液100μLを37℃にて24時間保持した。酵素反応液を以下の条件にて分析した。
分析条件はカラム:CarboPac PA−1(4×250mm、Thermo Fisher Scientific)、溶離液:0.5% 酢酸ナトリウム(0〜5分)、0.5% 酢酸ナトリウム−0.3% 酢酸ナトリウム/0.3% 酢酸(5〜35分)、0.5% 酢酸(35〜45分)、0.5% 酢酸ナトリウム(45〜70分)、流速:1.0mL/min、カラム温度:35℃、検出器:パルスドアンペロメトリ検出器とした。
結果、両物質共に反応前後でのクロマトグラムに変化は認められなかった。
1.β−(1→4)−マンノビオースに対する活性の測定
10mM β−(1→4)−マンノビオース、40mM HEPES−NaOH緩衝液(pH8.0)および本酵素からなる反応液250μLを37℃にて保持した。反応3、6、10分に反応液50μLを採取して1.0M HClを20μL添加し、100℃にて5分間保持して反応を停止した。酵素反応により生成したβ−(1→4)−マンノシルグルコースを以下の手法により定量した。
なお、Kawahara et al.(2012)は、ルミノコッカス・アルブスのマンナン代謝において、当該酵素が長鎖マンノオリゴ糖の加リン酸分解に機能していることが記載された文献である。
10mM マンノース、40mM HEPES−NaOH緩衝液(pH8.0)および本酵素を含む反応液300μLを37℃に保持した。反応5、10、15および20分に反応液50μLを採取して2.0M HClを10μL添加し、100℃にて5分間保持して反応を停止した。これに2.0M NaOHを10μL添加して中和し、13,400×g、4℃にて5分間遠心分離した。
本酵素のpHおよび温度に対する特性を、β−(1→4)−マンノビオースに対する活性を指標として調査した。本実施例において、下記の測定はいずれも、独立に3回繰り返して実施した。
1.最適pH
80mM ブリトン−ロビンソン緩衝液(pH2.0〜12.0)、10mM β−(1→4)−マンノビオースおよび6.64nM 本酵素からなる反応液50μLを37℃に10分間保持して酵素反応に供した後、実施例4−1に記載の方法にて反応を停止し、反応液中の生成物β−(1→4)−マンノシルグルコースの濃度を測定した。
100mM ブリトン−ロビンソン緩衝液(pH2.0〜12.0)および553nM 本酵素からなる溶液100μLを4℃に24時間保持し、保持後の残存活性を以下の系にて測定した。10mM β−(1→4)−マンノビオース、369nM 本酵素、および40mM HEPES−NaOH緩衝液(pH8.0)からなる反応液50μLを37℃に10分間保持した。実施例4−1に記載の方法で反応を停止し、生成物β−(1→4)−マンノシルグルコースの濃度を測定した。各pHに保持する前の活性を100%とし、保持後の残存活性を相対値にて表した(図4、黒丸)。本酵素は5.8〜9.9の範囲において95%以上の残存活性を示し、安定であることが明らかになった。なお、調べた範囲において80%以上の残存活性が確認された。
10mM β−(1→4)−マンノビオース、0.377nM 本酵素および40mM HEPES−NaOH緩衝液(pH8.0)からなる反応液50μLを30〜70℃に10分間保持した。実施例4−1に記載の方法で反応を停止し、生成物β−(1→4)−マンノシルグルコースの濃度を求めた。その結果を図5(白丸)に示した。本酵素は56℃で最大活性を示し、56〜60℃の範囲で最大活性の80%以上の活性を示した。尚、図5(白丸)では56℃における活性を100%とし、各反応温度における活性を相対値として示した。
9.21nM 本酵素および66.7mM HEPES−NaOH緩衝液(pH8.0)を含む30μLの溶液を30℃〜80℃に20分間保持した。保持後の残存活性を以下の系にて測定した。10mM β−(1→4)−マンノビオース、5.53nM 本酵素および40mM HEPES−NaOH緩衝液(pH8.0)からなる反応液50μLを37℃にて10分間保持した。実施例4−1の手順で反応を停止し、生成物β−(1→4)−マンノシルグルコースの濃度を求めた。各温度に保持する前の活性を100%とし、保持後の残存活性を相対値にて表した(図5、黒丸)。本酵素は、50℃以下で97%以上の残存活性を示し安定であった。
1.本酵素のβ−(1→4)−マンノビオースに対する速度パラメーター
1〜15mM β−(1→4)−マンノビオース、40mM HEPES−NaOH緩衝液(pH8.0)および4.56nM 本酵素からなる反応液250μLを37℃に保持した。反応3、6および10分に反応液50μLを採取して実施例4−1の手順にて反応を停止し、生成物β−(1→4)−マンノシルグルコースの濃度を求めた。反応曲線の傾きから得られた反応速度をプロットしたところ、飽和曲線が得られた。これをミカエリス・メンテンの速度式に回帰し、kcat/Km 122s-1mM-1を得た。
10〜100mM マンノース、40mM HEPES−NaOH緩衝液(pH8.0)および0.251μM 本酵素からなる反応液250μLを37℃に保持し、反応5、10および15分に反応液50μLを採取して実施例4−2の手順にて反応停止し、生成したグルコースを定量した。得られた反応速度をプロットしたところ、飽和曲線が得られた。これをミカエリス・メンテンの速度式に回帰し、kcat/Km 8.89×10-2s-1mM-1を得た。
50〜250mM ガラクトース、40mM HEPES−NaOH緩衝液(pH8.0)および41.5〜82.9μM 本酵素からなる反応液500μLを37℃に保持し、反応5、10、15および20分に反応液100μLを採取して、2.0M HClを10μL添加し、100℃にて5分間保持して反応を停止した。これに2.0M NaOHを10μL添加して中和し、内部標準として13% ラクチトールを10μL添加した後、MB4で脱塩し、HPLCによりタロースを定量した。
分析条件はカラム:VG−50 4E(Shodex)、溶離液:75% アセトニトリル/20% メタノール、流速:1.0mL/min、カラム温度:40℃、検出器:RI検出器とした。
得られた反応速度をプロットしたところ、飽和曲線が得られた。これをミカエリス・メンテンの速度式に回帰し、kcat/Km 6.42s-1M-1を得た。
Jaito N.et al., 2014, J. Appl. Glycosci.,2014; 61:117−119に記載の方法に従いRmCE組換え酵素を調製し、50〜500mM マンノース、15mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)および9.75μM RmCE組換え酵素からなる反応液100μLを60℃に保持し、反応15分の時点で0.1M HClを25μL添加し、100℃にて3分間保持し、反応を停止した。0.2M リン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)25μL添加し、反応液を中和させ、生成したグルコースを定量した。得られた反応速度をプロットしたところ、飽和曲線が得られた。これをミカエリス・メンテンの速度式に回帰し、kcat/Km 5.28s-1M-1を得た。
本酵素と既知CEについて、マンノースに対する速度パラメーターkcat/Km値を用い、単糖に対する反応性を比較した。CvCEが0.461s-1M-1、RmCEが5.28s-1M-1であったのに対し、メリオリバクター・ロセウス由来の本酵素は88.9s-1M-1であった(図6)。尚、比較対象としたCvCEの反応速度パラメーターはSaburi W. et al., 2015, Biosci. Biotechnol. Biochem., 2015;79:969−977に記載の値を参照した。メリオリバクター・ロセウス由来の本酵素は比較対象の2酵素(CvCEおよびRmCE)と比較して、単糖にもよく作用できる酵素であることが明らかとなった。
1.方法
本酵素を基質濃度約30%のグルコースに作用させ、マンノースの合成反応を実施した。すなわち、2.90〜5.80μM 本酵素、40mM HEPES−NaOH緩衝液(pH8.0)、30% グルコースおよび0.02% アジ化ナトリウムからなる反応液100μLを40℃および50℃にて24〜72時間保持した。また、共存する緩衝液成分等による異性化反応への影響を調査するため、あらかじめ本酵素を30分間煮沸して得た失活酵素を用いた反応液についても同様に調製、保持した。各反応時間にて採取した反応液を、塩酸を用いてpHを3.5とし、10分間煮沸することで反応停止させた。その後、反応液10μLと純水800μLを混合させ希釈した。
D−グルコースに対して本酵素を作用させたときの反応生成物について、その糖組成解析結果を表2に示した。
1.方法
本酵素を基質濃度約20%のガラクトースに作用させ、タロースの合成反応を実施した。すなわち、1.55〜12.4μM 本酵素、10mM HEPES−NaOH緩衝液(pH8.0)、20% ガラクトースおよび0.02% アジ化ナトリウムからなる反応液100μLを40℃にて24〜72時間反応させた。また、共存する緩衝液成分等による異性化反応への影響を調査するため、あらかじめ本酵素を30分間煮沸して得た失活酵素を用いた反応液についても同様に保持した。各反応時間にて採取した反応液を、塩酸を用いてpHを3.5程度まで落とし、10分間煮沸することで反応停止させた。その後、反応液10μLと純水800μLを混合させ希釈した。
D−ガラクトースに対して本酵素を作用させたときの反応生成物について、その糖組成解析結果を表3に示した。
配列番号2:メリオリバクター・ロセウス由来のタンパク質をコードするアミノ酸配列
Claims (6)
- 以下の(a)から(c)のいずれかのタンパク質を含む、糖のエピメリ化触媒用の酵素剤であって、前記糖がN−アシル−D−グルコサミンを含まず、且つ前記糖が、D−グルコース、D−マンノース、D−タロース、D−ガラクトース、及びβ−1,4結合を有する二糖類からなる群から選択されるいずれかである、糖のエピメリ化触媒用の酵素剤。
(a) 配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b) 配列番号2に記載のアミノ酸配列に対して90%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖のエピメリ化活性を有するタンパク質;
(c) 配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および/または付加されたアミノ酸配列からなり、糖のエピメリ化活性を有するタンパク質。 - メリオリバクター・ロセウス(Melioribacter roseus)に由来し、下記の性質を有するタンパク質を含む、糖のエピメリ化触媒用の酵素剤。
(1)糖のエピメリ化活性を有し、前記糖が、D−グルコース、D−マンノース、D−タロース、D−ガラクトース、及びβ−1,4結合を有する二糖類からなる群から選択されるいずれかである;
(2)N−アシル−D−グルコサミンを実質的に基質としない;
(3)SDS−PAGEにより測定された分子量が48〜58kDaである;
(4)最適pHが6.8〜8.6の範囲である;
(5)pH5.8〜9.9の範囲で安定である;
(6)最適温度が56℃〜60℃の範囲である;
(7)50℃以下で安定である。 - 前記β−1,4結合を有する二糖類が、セロビオース、ラクトース、エピラクトース、β−(1→4)−マンノビオース、β−(1→4)−グルコシルマンノース、およびβ−(1→4)−マンノシルグルコースからなる群から選択されるいずれかである請求項1又は2に記載の酵素剤。
- 糖のエピメリ化反応生成物の製造に用いられる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の酵素剤。
- 糖基質に、請求項1〜4のいずれか一項に記載の酵素剤を作用させて、糖のエピメリ化反応生成物を得る工程を含む、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法。
- 請求項5に記載の方法を実施して糖のエピメリ化反応生成物を得る工程、および前記工程で得られた糖のエピメリ化反応生成物を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
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