WO2021261564A1 - ジペプチドの製造法 - Google Patents
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Definitions
- Patent Document 5 shows that a dipeptide having a branched-chain amino acid on the N-terminal side is efficiently produced by modifying L-methionine at position 334 of the amino acid sequence of YwfE.
- Non-Patent Document 3 in the L-amino acid ligase TabS possessed by Pseudomonas syringae, when the 85th serine corresponding to the 110th amino acid residue in the amino acid sequence of YwfE is replaced with threonine, the synthetic activity of the prolyl glycine of TabS Has been shown to improve.
- the present invention relates to the following 1 to 8. 1.
- amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 one or more amino acid residues selected from the group consisting of the 107th, 108th, and 110th amino acids are the amino acid residues described in [1] to [3] below, respectively.
- One or more amino acid residues thereof are proteins consisting of amino acid sequences substituted with the amino acid residues described in [1'] to [3'], respectively, and the substrate specificity is higher than that of the original protein.
- a protein with enhanced L-amino acid ⁇ -ligase activity [1'] From the group consisting of L-serine, L-alanine, L-histidine, L-glutamine, L-aspartic acid, L-glutamic acid, glycine and L-methionine for the 107th amino acid residue.
- the enzyme source and two L-amino acids are allowed to exist in an aqueous medium, and a dipeptide is produced and accumulated in the aqueous medium, and the dipeptide is produced from the aqueous medium.
- a method for producing a dipeptide which comprises collecting a dipeptide. 7.
- Production of a dipeptide which comprises culturing a microorganism capable of producing the protein according to 1 or 2 above in a medium, producing and accumulating a dipeptide in the culture, and collecting the dipeptide from the culture. Law. 8.
- the dipeptide is of formula (I) R 1- R 2 (I) (In the formula, R 1 is L-alanine, R 2 is L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-valine, L-leucine, L-isoleucine, L-proline, L-phenylalanine, L-tryptophan, L- Represented by amino acid residues selected from methionine, L-serine, L-threonine, L-cysteine, L-aspartin, L-tyrosine, L-lysine, L-arginine, L-histidine and L-aspartic acid).
- amino acid residues selected from the group consisting of the 107th, 108th, and 110th amino acids are the amino acids according to the following [1] to [3], respectively.
- Residue [2] Consists of L-phenylalanine, L-methionine, L-serine, L-proline, L-threonine, L-alanine, L-tyrosine, glycine and L-leucine for the 108th amino acid residue.
- Amino acid residue selected from the group [3] A group consisting of L-methionine, L-valine, L-alanine, L-asparagin, L-cysteine, L-tryptophane and L-phenylalanine for the 110th amino acid residue.
- the original protein described in (2) above is the mutant protein described in [4] or the homologous protein described in [5].
- the amino acid residues corresponding to the 107th, 108th, and 110th positions of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 are the amino acid sequence of the original protein and the amino acid of SEQ ID NO: 2. Refers to each amino acid residue that is aligned at the same position as the 107th, 108th, and 110th amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 when aligned with the sequence.
- amino acid residues corresponding to the 107th, 108th, and 110th positions of the above are collectively referred to as "amino acid residues corresponding to the 107th, 108th, and 110th positions of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.”
- amino acid sequence of the protein according to (1) or (2) above one or more selected from the group consisting of the amino acid residues corresponding to the 107th, 108th and 110th amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2.
- the fact that the amino acid residue is replaced with the amino acid residue described in (1) [1] to [3] or (2) [1'] to [3'] is the above (1) or (2).
- Amino acid sequence alignment can be created, for example, using the known alignment program ClustalW [Nucelic Acids Research 22,4673, (1994)].
- ClustalW is, for example, http: // www. ebi.ac. It can be used from uk / lustalw / (European Bioinformatics Institute). For example, default values can be used as parameters when creating an alignment using ClustalW.
- the amino acid residue corresponding to the 107th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is preferably L-serine, L-alanine, L-histidine, glycine and among the amino acids of [1] or [1'] above. It is desirable to replace it with an amino acid residue selected from the group consisting of L-methionine, more preferably an amino acid residue selected from the group consisting of L-alanine, L-histidine and glycine.
- the amino acid residue corresponding to the 108th position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is preferably L-phenylalanine, L-methionine, L-serine, L- among the amino acids of [2] or [2'] above.
- the amino acid residue corresponding to the 110th position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is preferably L-methionine, L-cysteine, L-tryptophan and L- among the amino acids of the above [3] or [3']. It is desirable to replace it with an amino acid residue selected from the group consisting of phenylalanine, more preferably an amino acid residue selected from the group consisting of L-methionine, L-tryptophan and L-phenylalanine.
- the L-amino acid ⁇ -ligase activity refers to an activity in which ATP and two different types of L-amino acids are used as substrates to produce a dipeptide in which the two amino acids are peptide-bonded with a carboxyl group at the ⁇ -position.
- the L-amino acid also includes glycine having no character isomerism.
- L-Amino Acids As L-amino acids used as substrates for ⁇ -ligase active proteins, L-alanine, L-aspartin, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L- Examples include leucine, L-lysine, L-arginine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine and the like. can.
- the protein according to (1) or (2) above has improved substrate specificity as compared with the original protein.
- a recombinant DNA having a DNA encoding the protein whose activity is to be confirmed is prepared by the method described later.
- the recombinant DNA is used to culture a microorganism obtained by transforming a microorganism having no L-amino acid ⁇ -ligase activity, for example, Escherichia coli W3110 strain, and cell extraction containing the protein from the obtained culture.
- the cell extract containing the protein is brought into contact with an aqueous solution containing the substrate ATP and two L-amino acids to generate a dipeptide in the aqueous solution.
- the substrate specificity is improved as compared with the original protein. You can confirm that.
- a mutant protein is a protein obtained by artificially deleting or substituting an amino acid residue in the original protein, or artificially inserting or adding an amino acid residue in the protein.
- an amino acid is deleted, substituted, inserted or added means that 1 to 20 amino acids are deleted, substituted or added at an arbitrary position in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. It may be inserted or added, for example, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 5 amino acids may be deleted, substituted, inserted or added.
- Amino acids to be substituted, inserted or added may be natural or non-natural.
- Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-arginine, L. -Methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine and the like can be mentioned.
- amino acids contained in the same group can be replaced with each other.
- Amino acids contained in the same group can be replaced with each other.
- Group A leucine, isoleucine, norleusin, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
- Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosveric acid
- Group C aspartic acid, glutamic acid D group: lysine, arginine, ornitine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
- Group E proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
- F group serine, threonine, homoser
- It consists of a base sequence having at least 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, most preferably 98% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and L. -DNA encoding a mutant or homologous protein with amino acid ⁇ -ligase activity
- the various conditions described above can also be set by adding or changing the blocking reagent used to suppress the background of the hybridization experiment.
- the addition of the blocking reagent described above may be accompanied by a change in hybridization conditions in order to adapt the conditions.
- the DNA of the present invention uses, for example, a DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and is located on the DNA at positions 107 and 108 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. And the base sequence of the part encoding one or more amino acid residues selected from the group consisting of the 110th corresponding amino acid residues, for example, Molecular Cloning 4th Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)) and Current. -Introduce a mutation by the site-specific mutagenesis method described in Protocols in Molecular Biology (JOHN WILEY & SONS, INC.), Etc., and replace it with a base sequence encoding another amino acid residue. Can be obtained by. Alternatively, the DNA of the present invention can also be obtained by using PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) or the like.
- Vectors that can be used to determine the base sequence of the DNA of the present invention include pBluescriptII KS (+), pPCR-Script Amp SK (+) (all manufactured by Agilent Technologies), and pT7Blue (manufactured by Agilent Technologies). ), PCRII (manufactured by Thermo Fisher Scientific), pCR-TRAP (manufactured by Genehunter), and pDIRECT [Nucleic Acids Res. , 18, 6069 (1990)] and the like.
- Escherichia coli DH1 Escherichia coli MC1000, Escherichia coli W1485, Escherichia coli W3110, Escherichia coli MP347, Escherichia coli 22 etc.
- the recombinant DNA of the present invention is a DNA that can be autonomously replicated in a host cell, and the DNA of the present invention is incorporated into an expression vector containing a promoter at a position where the DNA of the present invention can be transcribed. DNA.
- DNA that can be incorporated into a chromosome in a host cell and has the DNA of the present invention is also the recombinant DNA of the present invention.
- the recombinant DNA of the present invention is a recombinant DNA composed of a promoter, a ribosome-binding sequence, the above-mentioned 2 DNA of the present invention, and a transcription termination sequence. Is preferable. In addition, genes that control promoters may be included.
- the expression vectors include, for example, pColdI, pSTV28, pUC118 (all manufactured by Takara Bio), pET21a, pCDF-1b, pRSF.
- pTrS30 [adjusted from Escherichia coli JM109 / pTrS30 (FERM BP-5407)]
- pTrS32 [adjusted from Escherichia coli JM109 / pTrS32 (FERM BP-5408)]
- pTK31 [AP AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2007, Vol. 73, No. 20, p6378-6385]
- pPE167 Appl. Environ. Microbiol.
- the expression vectors include, for example, pCG1 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-134500) and pCG2 (Japanese Patent Laid-Open No. 58-35197). , PCG4 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-183799), pCG11 (Japanese Patent Laid-Open No.
- Protozoa such as D-0110, or Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon purlulans, Schizosaccharomyces pichia spp.
- a homologous recombination method As a method for incorporating recombinant DNA into the chromosome of a host cell, for example, a homologous recombination method can be mentioned.
- a homologous recombination method for example, a method using a plasmid for homologous recombination that can be produced by ligating with a plasmid DNA having a drug resistance gene that cannot autonomously replicate in the host cell to be introduced can be mentioned.
- a method using homologous recombination frequently used in Escherichia coli for example, a method of introducing recombinant DNA using a homologous recombination system of lambda phage [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645 (2000)].
- Selection method utilizing the fact that Escherichia coli becomes susceptible to streptomycin by [Mol. Microbiol. , 55, 137 (2005), Biosci. Biotechnol. Biochem. , 71,295 (2007)] and the like can be used to obtain Escherichia coli in which the target region on the chromosomal DNA of the host cell is replaced with recombinant DNA.
- the transformant obtained by the above method has the DNA of the present invention described in 2 above means that, for example, the transformant is cultured in a medium and the dipeptide of interest accumulated in the culture. Can be confirmed by comparing the amount of the strain produced with that of the parent strain.
- an extract containing the protein of the present invention is prepared from the culture, the extract is made to have two different L-amino acids present in an aqueous medium, and the amount of dipeptide accumulated in the aqueous medium is determined. , Can also be confirmed by comparing with that of the parent strain.
- the protein according to (1) or (2) is used as an enzyme source, the enzyme source and two kinds of L-amino acids are present in an aqueous medium, and a dipeptide is produced and accumulated in the aqueous medium.
- the dipeptide can be collected from the aqueous medium.
- the enzyme source may be the purified protein according to (1) or (2), or the transformant of 4 above, that is, the ability to produce the protein according to (1) or (2) above. It may be a culture obtained by culturing a microorganism having a protein in a medium or a processed product of the culture.
- ATP is present in the aqueous solvent together with the two L-amino acids.
- the culture includes the cultured microorganism having the ability to produce the protein according to (1) or (2) and the medium, and is expressed by the microorganism in the culture (the above).
- the protein according to 1) or (2) is contained.
- the above-mentioned culture or a processed product of the culture contains the protein and ATP according to (1) or (2) as an enzyme source.
- the processed product of the culture includes a concentrate of the culture, a dried product of the culture, a bacterial cell obtained by centrifuging the culture, a dried product of the bacterial cell, a frozen dried product of the bacterial cell, and the bacterial cell.
- the transformant of 4 above that is, a microorganism capable of producing the protein according to (1) or (2) above is cultured in a medium.
- a method for producing a dipeptide by a fermentation method which comprises producing and accumulating a dipeptide in a culture and collecting the dipeptide from the culture.
- the culture includes the cultured microorganism having the ability to produce the protein according to (1) or (2) and the medium, and is expressed by the microorganism in the culture (the above).
- the protein according to 1) or (2) is contained.
- the medium for culturing the transformant is a medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the transformant, and the transformant can be efficiently cultured.
- Natural medium or synthetic medium may be used.
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Abstract
本発明の課題は、基質特異性が向上したジペプチド合成活性を有する蛋白質、及び、該蛋白質又は該蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いることにより、目的とするジペプチド以外の副生ジペプチドを低減させ、かつ、目的のジペプチドを効率的に製造するための方法を提供することにある。本発明によれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質の変異蛋白質若しくは相同蛋白質のアミノ酸配列において、１０７番目、１０８番目及び１１０番目からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質が提供され、並びに、該蛋白質を生産する微生物を用いることにより、効率的にジペプチドを製造することができる。
Description
本発明は、基質特異性が向上したジペプチド合成活性を有する蛋白質、及び、該蛋白質又は該蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いることにより、目的とするジペプチド以外の副生ジペプチドを低減させ、かつ、目的のジペプチドを効率的に製造する方法に関する。
バチルス属に属する微生物は、ＡＴＰと２分子のＬ－アミノ酸からα位のカルボキシル基でペプチド結合したジペプチドを生成する、Ｌ－アミノ酸αリガーゼを有することが報告されている（特許文献１及び非特許文献１）。Ｌ－アミノ酸αリガーゼは、アミノ酸の修飾や特殊な補酵素を必要とせずにジペプチドを合成できるため、ジペプチドの効率的な製造に極めて有用である。しかし、Ｌ－アミノ酸αリガーゼは基質特異性が低く、目的とするジペプチド以外のジペプチドを副生成物として生成することが課題であった。例えば、非特許文献２には、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＬ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する蛋白質ＹｗｆＥをコードするＤＮＡを大腸菌に形質転換し、該形質転換体を用いてＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを生産する方法が開示されているが、このときＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン以外に、副生ジペプチドとしてＬ－アラニル－Ｌ－アラニンが顕著に生成されることが報告されている。
ＹｗｆＥの特徴として、ＹｗｆＥのアミノ酸配列のうち１０８番目のＬ－アスパラギン、１０９番目のＬ－グルタミン酸、及び１１０番目のＬ－ロイシンは、生成産物であるジペプチドのＣ末端側アミノ酸近傍に位置することが知られている（非特許文献３）。このうち１０９番目のＬ－グルタミン酸は、ＹｗｆＥの酵素活性に重要なマグネシウムイオンとの相互作用に寄与している（非特許文献３）。該Ｌ－グルタミン酸に相当する残基は、種々微生物が有するＬ－アミノ酸αリガーゼに広く保存されていることから（非特許文献４）、このＬ―グルタミン酸はＬ－アミノ酸αリガーゼの酵素活性において重要なアミノ酸残基である可能性が示唆されている。
基質特異性を改変したＹｗｆＥについてはこれまでに多くの研究がなされている（特許文献２～６、非特許文献３）。
特許文献２では、ＹｗｆＥのアミノ酸配列のうち６２番目のＬ－フェニルアラニン、９２番目のＬ－イソロイシン、３３２番目のＬ－トリプトファン、３３３番目のＬ－アスパラギン、３３４番目のＬ－メチオニン、３５９番目のＬ－アスパラギン酸、及び３６１番目のＬ－アスパラギン酸を改変することで、Ｎ末端側に酸性アミノ酸を有するジペプチドを効率的に生成できることが示されている。
特許文献３では、ＹｗｆＥのアミノ酸配列のうち１１２番目のＬ－イソロイシン及び３７８番目のＬ－ヒスチジンを改変することで、カルノシンを効率的に生成できることが示されている。
特許文献４では、ＹｗｆＥのアミノ酸配列のうち１０７番目のＬ－アスパラギン、２８３番目のＬ－アスパラギン酸、３３２番目のＬ－トリプトファン、及び３７６番目のＬ－アスパラギン酸を改変することで、Ｎ末端側に塩基性アミノ酸を有するジペプチドを効率的に生成できることが示されている。
特許文献５では、ＹｗｆＥのアミノ酸配列のうち３３４番目のＬ－メチオニンの改変により、Ｎ末端側に分岐鎖アミノ酸を有するジペプチドが効率的に生成されることが示されている。
特許文献６では、ＹｗｆＥのアミノ酸配列のうち１０８番目のＬ－アスパラギン、１１２番目のＬ－イソロイシン、及び３７８番目のＬ－ヒスチジンを改変することで、イミダゾールペプチドを効率的に製造できることが示されている。
非特許文献３では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅが有するＬ－アミノ酸リガーゼＴａｂＳにおいて、ＹｗｆＥのアミノ酸配列のうち１１０番目のアミノ酸残基に相当する８５番目のセリンをスレオニンに置換すると、ＴａｂＳのプロリルグリシンの合成活性が向上することが示されている。
一方で、ＹｗｆＥのアミノ酸配列のうちある特定のアミノ酸残基の改変により、Ｌ－アミノ酸αリガーゼの基質特異性が改善され、目的とするジペプチド以外の副生ジペプチドの生成を低減させたという報告はまだない。
Kazuhiko Tabata et al., "ywfE in Bacillus subtilis Codes for a Novel Enzyme, L-Amino Acid Ligase", J. Bacteriol., 187, p5195-5202 (2005)
Kazuhiko Tabata et al., "Fermentative Production of L-Alanyl-L-Glutamine by a Metabolically Engineered Escherichia coli Strain Expressing L-Amino Acid _-Ligase", Appl. Environ. Microbiol., 73, 20, p6378-6385 (2007)
Yasuhito Shomura, "Structural and enzymatic characterization of BacD, an L-amino acid dipeptide ligase from Bacillus subtilis", Protein Science, 21, p707-716 (2012)
Haruka Kino, "Effective production of Pro-Gly by mutagenesis of l-amino acid ligase", J. Biosci. Bioen., 122, 2, p155-159 (2016)
本発明の目的は、ジペプチド合成酵素活性を有する蛋白質及び該蛋白質又は該蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いたジペプチド製造法において、該蛋白質の基質特異性を改善させることにより目的とするジペプチド以外のジペプチドの副生成物を低減させ、かつ、目的のジペプチドを効率的に製造する方法を提供することにある。
本発明は、以下の１～８に関する。
１．配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１０７番目、１０８番目及び１１０番目からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が、それぞれ以下の［１］～［３］に記載のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列ならなる蛋白質であり、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する元となる蛋白質に比べて基質特異性が向上したＬ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する蛋白質。
［１］１０７番目のアミノ酸残基に対して、Ｌ－セリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、グリシン及びＬ－メチオニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［２］１０８番目のアミノ酸残基に対して、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－プロリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－チロシン、グリシン及びＬ－ロイシンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［３］１１０番目のアミノ酸残基に対して、Ｌ－メチオニン、Ｌ－バリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン、Ｌ－トリプトファン及びＬ－フェニルアラニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
２．以下の［４］又は［５］に記載の元となる蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１０７番目、１０８番目及び１１０番目に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が、それぞれ［１´］～［３´］に記載のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつ、元となる蛋白質に比べて基質特異性が向上したＬ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する蛋白質。
［１´］１０７番目に対応するアミノ酸残基に対して、Ｌ－セリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、グリシン及びＬ－メチオニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［２´］１０８番目に対応するアミノ酸残基に対して、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－プロリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－チロシン、グリシン及びＬ－ロイシンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［３´］１１０番目に対応するアミノ酸残基に対して、Ｌ－メチオニン、Ｌ－バリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン、Ｌ－トリプトファン及びＬ－フェニルアラニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［４］配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち１～２０個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質であり、かつ、Ｌ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する変異蛋白質
［５］配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同蛋白質であり、かつ、Ｌ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する相同蛋白質
３．上記１又は２に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
４．上記３に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
５．上記４に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
６．上記１又は２に記載の蛋白質を酵素源として用い、該酵素源及び２種のＬ－アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中からジペプチドを採取することを特徴とする、ジペプチドの製造法。
７．上記１又は２に記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にジペプチドを生成、蓄積せしめ、該培養物から該ジペプチドを採取することを特徴とする、ジペプチドの製造法。
８．ジペプチドが、式（Ｉ）
Ｒ１－Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１はＬ－アラニン、Ｒ２はＬ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－プロリン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－システイン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－チロシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－ヒスチジン及びＬ－アスパラギン酸から選ばれるアミノ酸残基を表す）で表されるジペプチドである、上記６又は７に記載の製造法。
１．配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１０７番目、１０８番目及び１１０番目からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が、それぞれ以下の［１］～［３］に記載のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列ならなる蛋白質であり、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する元となる蛋白質に比べて基質特異性が向上したＬ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する蛋白質。
［１］１０７番目のアミノ酸残基に対して、Ｌ－セリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、グリシン及びＬ－メチオニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［２］１０８番目のアミノ酸残基に対して、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－プロリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－チロシン、グリシン及びＬ－ロイシンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［３］１１０番目のアミノ酸残基に対して、Ｌ－メチオニン、Ｌ－バリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン、Ｌ－トリプトファン及びＬ－フェニルアラニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
２．以下の［４］又は［５］に記載の元となる蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１０７番目、１０８番目及び１１０番目に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が、それぞれ［１´］～［３´］に記載のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつ、元となる蛋白質に比べて基質特異性が向上したＬ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する蛋白質。
［１´］１０７番目に対応するアミノ酸残基に対して、Ｌ－セリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、グリシン及びＬ－メチオニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［２´］１０８番目に対応するアミノ酸残基に対して、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－プロリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－チロシン、グリシン及びＬ－ロイシンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［３´］１１０番目に対応するアミノ酸残基に対して、Ｌ－メチオニン、Ｌ－バリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン、Ｌ－トリプトファン及びＬ－フェニルアラニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［４］配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち１～２０個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質であり、かつ、Ｌ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する変異蛋白質
［５］配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同蛋白質であり、かつ、Ｌ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する相同蛋白質
３．上記１又は２に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
４．上記３に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
５．上記４に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
６．上記１又は２に記載の蛋白質を酵素源として用い、該酵素源及び２種のＬ－アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中からジペプチドを採取することを特徴とする、ジペプチドの製造法。
７．上記１又は２に記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にジペプチドを生成、蓄積せしめ、該培養物から該ジペプチドを採取することを特徴とする、ジペプチドの製造法。
８．ジペプチドが、式（Ｉ）
Ｒ１－Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１はＬ－アラニン、Ｒ２はＬ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－プロリン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－システイン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－チロシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－ヒスチジン及びＬ－アスパラギン酸から選ばれるアミノ酸残基を表す）で表されるジペプチドである、上記６又は７に記載の製造法。
本発明によれば、基質特異性が向上したジペプチド合成活性を有する蛋白質、及び該蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いて、副生ジペプチドを低減させ特定のジペプチドを効率的に生産するための製造方法を提供することができる。
１．本発明の蛋白質
本発明の蛋白質は、以下の（１）又は（２）に記載の蛋白質である。
本発明の蛋白質は、以下の（１）又は（２）に記載の蛋白質である。
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１０７番目、１０８番目及び１１０番目からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が、それぞれ以下の［１］～［３］に記載のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列ならなる蛋白質であり、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する元となる蛋白質に比べて基質特異性が向上したＬ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する蛋白質。
［１］１０７番目のアミノ酸残基に対して、Ｌ－セリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、グリシン及びＬ－メチオニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［２］１０８番目のアミノ酸残基に対して、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－プロリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－チロシン、グリシン及びＬ－ロイシンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［３］１１０番目のアミノ酸残基に対して、Ｌ－メチオニン、Ｌ－バリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン、Ｌ－トリプトファン及びＬ－フェニルアラニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［１］１０７番目のアミノ酸残基に対して、Ｌ－セリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、グリシン及びＬ－メチオニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［２］１０８番目のアミノ酸残基に対して、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－プロリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－チロシン、グリシン及びＬ－ロイシンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［３］１１０番目のアミノ酸残基に対して、Ｌ－メチオニン、Ｌ－バリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン、Ｌ－トリプトファン及びＬ－フェニルアラニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
（２）下記［４］又は［５］に記載の元となる蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１０７番目、１０８番目及び１１０番目に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が、それぞれ［１´］～［３´］に記載のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつ、［４］又は［５］に記載の元となる蛋白質に比べて基質特異性が向上したＬ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する蛋白質。
［１´］１０７番目に対応するアミノ酸残基に対して、Ｌ－セリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、グリシン及びＬ－メチオニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［２´］１０８番目に対応するアミノ酸残基に対して、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－プロリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－チロシン、グリシン及びＬ－ロイシンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［３´］１１０番目に対応するアミノ酸残基に対して、Ｌ－メチオニン、Ｌ－バリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン、Ｌ－トリプトファン及びＬ－フェニルアラニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［４］配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質であり、かつ、Ｌ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する変異蛋白質。
［５］配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同蛋白質であり、かつ、Ｌ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する相同蛋白質。
［１´］１０７番目に対応するアミノ酸残基に対して、Ｌ－セリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、グリシン及びＬ－メチオニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［２´］１０８番目に対応するアミノ酸残基に対して、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－プロリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－チロシン、グリシン及びＬ－ロイシンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［３´］１１０番目に対応するアミノ酸残基に対して、Ｌ－メチオニン、Ｌ－バリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン、Ｌ－トリプトファン及びＬ－フェニルアラニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［４］配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質であり、かつ、Ｌ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する変異蛋白質。
［５］配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同蛋白質であり、かつ、Ｌ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する相同蛋白質。
上記（２）に記載の元となる蛋白質は、［４］に記載の変異蛋白質又は［５］に記載の相同蛋白質である。元となる蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１０７番目、１０８番目及び１１０番目に対応するアミノ酸残基とは、当該元となる蛋白質のアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列とをアライメントした時に、配列番号２のアミノ酸配列における１０７番目、１０８番目及び１１０番目のアミノ酸残基と同じ位置にアライメントされるそれぞれのアミノ酸残基をいう。以下、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１０７番目、１０８番目及び１１０番目のアミノ酸残基、並びに、［４］又は［５］に記載のアミノ酸配列の、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１０７番目、１０８番目及び１１０番目に対応するアミノ酸残基を併せて、「配列番号２で表されるアミノ酸配列の１０７番目、１０８番目及び１１０番目に対応するアミノ酸残基」という。
上記（２）に記載の元となる蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１０７番目、１０８番目及び１１０番目に対応するアミノ酸残基は、例えば、元となる蛋白質が、配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である場合には、それぞれ配列番号３で表されるアミノ酸配列の１０７番目、１０８番目及び１１０番目のアミノ酸残基を示す。
上記（１）又は（２）に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１０７番目、１０８番目及び１１０番目に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が、上記（１）［１］～［３］又は（２）［１´］～［３´］に記載のアミノ酸残基に置換されていることは、上記（１）又は（２）に記載の蛋白質のアミノ酸配列と、元となる蛋白質のアミノ酸配列とをアライメントすることにより確認することができる。
アミノ酸配列のアライメントは、例えば、公知のアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ［Ｎｕｃｅｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２，４６７３，（１９９４）］を用いて作成することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ.ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より利用することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアライメントを作成する際のパラメータは、例えばデフォルトの値を用いることができる。
配列番号２で表されるアミノ酸配列の１０７番目に対応するアミノ酸残基は、上記［１］又は［１´］のアミノ酸のうち、好ましくはＬ－セリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－ヒスチジン、グリシン及びＬ－メチオニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基、より好ましくはＬ－アラニン、Ｌ－ヒスチジン及びグリシンからなる群より選ばれるアミノ酸残基に置換されることが望ましい。
配列番号２で表されるアミノ酸配列の１０８番目に対応するアミノ酸残基は、上記［２］又は［２´］のアミノ酸のうち、好ましくはＬ－フェニルアラニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－チロシン及びＬ－ロイシンからなる群より選ばれるアミノ酸残基、より好ましくはＬ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－アラニン及びＬ－チロシンからなる群より選ばれるアミノ酸残基に置換されることが望ましい。
配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１０番目に対応するアミノ酸残基は、上記［３］又は［３´］のアミノ酸のうち、好ましくはＬ－メチオニン、Ｌ－システイン、Ｌ－トリプトファン及びＬ－フェニルアラニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基、より好ましくはＬ－メチオニン、Ｌ－トリプトファン及びＬ－フェニルアラニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基に置換されることが望ましい。
Ｌ－アミノ酸αリガーゼ活性とは、ＡＴＰ及び種類の異なる２分子のＬ－アミノ酸を基質として、当該２種のアミノ酸がα位のカルボキシル基でペプチド結合したジペプチドを生成する活性をいう。ここで、Ｌ－アミノ酸は、立体異性を有さないグリシンも含む。
Ｌ－アミノ酸αリガーゼ活性蛋白質の基質として用いるＬ－アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システイン等を挙げることができる。
上記（１）又は（２）に記載の蛋白質が、元となる蛋白質に比べて基質特異性が向上していることは、例えば以下の方法により確認することできる。まず、後述の方法により、上記活性を確認しようとする蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを作製する。次に、該組換え体ＤＮＡで、Ｌ－アミノ酸αリガーゼ活性を有さない微生物、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を形質転換して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を含む細胞抽出液を調製する。該蛋白質を含む細胞抽出液を、基質であるＡＴＰ及び２種のＬ－アミノ酸を含む水溶液と接触させ、該水溶液中にジペプチドを生成させる。最後に、後述のＨＰＬＣを用いて反応液中のジペプチドを検出し、目的のジペプチド及び副生ジペプチドの生成量を比較することにより、元となる蛋白質に比べて、基質特異性が向上していることを確認することができる。
変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、又は該蛋白質中に人為的にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。
［４］の変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の任意の位置において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されていてもよく、例えば、１～１５個、１～１０個、１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されていてもよい。
置換、挿入又は付加されるアミノ酸は天然型と非天然型を問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システイン等が挙げられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
相同蛋白質とは、自然界に存在する生物が有する蛋白質であって、進化上の起源が同一の蛋白質に由来する一群の蛋白質をいう。相同蛋白質は、互いに構造及び機能が類似している。
［５］の相同蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有することが望ましい。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮを使用して塩基配列を解析する場合には、パラメータは、例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸを使用してアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐ ｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
相同蛋白質の具体例としては、配列番号３で表されるＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓの蛋白質（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ－Ｑ８ＫＷＳ８）を挙げることができる。
上記の変異蛋白質又は相同蛋白質が、Ｌ－アミノ酸αリガーゼ活性を有していることは、例えば以下の方法により確認することできる。まず、後述の方法により、上記活性を確認しようとする変異蛋白質又は相同蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを作製する。次に、該組換え体ＤＮＡで、Ｌ－アミノ酸αリガーゼ活性を有さない微生物、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を形質転換して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を含む細胞抽出液を調製する。該蛋白質を含む細胞抽出液を、基質であるＡＴＰ及び２種のＬ－アミノ酸を含む水溶液と接触させ、該水溶液中にジペプチドを生成させる。最後に、後述のＨＰＬＣを用いて反応液中のジペプチドを検出することにより、変異蛋白質又は相同蛋白質がＬ－アミノ酸αリガーゼ活性を有していることを確認することができる。
２．本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、上記（１）又は（２）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡである。
本発明のＤＮＡは、上記（１）又は（２）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡである。
本発明のＤＮＡとして、具体的には、下記［６］～［８］のいずれか１に記載のＤＮＡでコードされる蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１０７番目、１０８番目及び１１０番目に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が、上記［１］～［３］又は［１´］～［３´］のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを挙げることができる。
［６］配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［７］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェンドな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する変異タンパク質又は相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［８］配列番号１で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、Ｌ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する変異タンパク質又は相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［６］配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［７］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェンドな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する変異タンパク質又は相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［８］配列番号１で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、Ｌ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する変異タンパク質又は相同蛋白質をコードするＤＮＡ
上記において、ハイブリダイズするとは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。従って、該特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。
プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡを挙げることができ、プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡを挙げることができる。
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第４版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２））、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ（１９９４））、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（１９９７））の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を挙げることができる。
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／Ｌの変性させたサケ***ＤＮＡを含む溶液中にて４２℃で一晩インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加又は変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算した時に、配列番号１で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。
本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、該ＤＮＡ上に位置する、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１０７番目、１０８番目及び１１０番目に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基をコードする部分の塩基配列に、例えば、モレキュラー・クローニング第４版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２））及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）等に記載された部位特異的変異導入法により変異を導入し、他のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより取得することができる。あるいは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）等を用いることでも、本発明のＤＮＡを得ることができる。
同様の方法により、例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質であり、かつ、Ｌ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する変異蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、該変異蛋白質のアミノ酸配列とその元となる配列番号２で表されるアミノ酸配列とを上記１に記載の方法によってアライメントしたときに、該変異蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２の１０７番目、１０８番目及び１１０番目に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基をコードする部分の塩基配列に変異を導入することによっても取得することができる。
また、配列番号２で表わされるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、該相同蛋白質のアミノ酸配列とその元となる配列番号２で表されるアミノ酸配列とを上記１の方法によってアライメントした時に、該相同蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２の１０７番目、１０８番目及び１１０番目に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれるアミノ酸残基のうち１以上のアミノ酸残基をコードする部分の塩基配列に変異を導入することによっても取得することができる。
配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて設計することができるプローブを用い、微生物、好ましくはバチルス属、より好ましくはバチルス・サチリス１６８（ＡＴＣＣ２３８５７）株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションにより、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、バチルス・サチリス１６８（ＡＴＣＣ２３８５７）株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得することができる。配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、具体的には、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。
上記１（２）［４］記載の、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質であり、かつＬ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得することができる。
または、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列をそれぞれの５’端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲによる部分特異的変異導入法［Ｇｅｎｅ，７７，５１（１９８９）］によっても、上記１（２）［４］の配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質であり、かつＬ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する変異蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。
また、市販の部分特異的変異導入キットに付属した説明書に従うことによっても、該ＤＮＡを取得することができる。市販の部分特異的変異導入キットとしては、例えば、目的の変異を導入したい位置に変異（欠失、置換、挿入又は付加）を導入することができるＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を挙げることができる。
すなわち、まず、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列を有するプラスミドを鋳型に、５’側が１５塩基オーバーラップした一対の変異導入用プライマーを設計する。このとき、オーバーラップ部分には目的の変異を含む。次に、該変異導入用プライマーを用いて、目的の変異を導入したい塩基配列を有するプラスミドを鋳型にＰＣＲを行う。これにより得られた増幅断片を大腸菌に形質転換すると、目的の変異が導入された塩基配列を有するプラスミドを得ることができる。
上記１（２）［５］に記載の、配列番号２で表わされるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同蛋白質であり、かつＬ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、以下の方法により取得することができる。具体的には、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１で表わされる塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて設計することができるプローブＤＮＡ又はプライマーＤＮＡ、及び当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、上記の配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡを取得する方法と同様の方法によって、該相同蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。
塩基配列やアミノ酸配列の同一性は、上記１と同様の方法で決定することができる。
上記の方法で取得した本発明のＤＮＡは、そのまま、あるいは適当な制限酵素等で切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］、又はアプライド・バイオシステムズ３５００ジェネティックアナライザやアプライド・バイオシステムズ３７３０ＤＮＡアナライザ（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
本発明のＤＮＡの塩基配列を決定する際に用いることができるベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）、ｐＰＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（メルクミリポア社製）、ｐＣＲＩＩ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＣＲ－ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）、及びｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，６０６９（１９９０）］等を挙げることができる。
上記の宿主細胞としては、上記ベクターを導入し増殖可能なものであれば何でもよいが、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０４ ｄａｍ－／ｄｃｍ－、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１－１８ ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２等を挙げることができる。
本発明のＤＮＡを組み込んで得られる、組み換えＤＮＡの宿主細胞への導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等を挙げることができる。
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、日本テクノサービス社製ＮＴＳ ＭシリーズＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより、目的とするＤＮＡを調製することもできる。
３．本発明の組換え体ＤＮＡ
本発明の組換え体ＤＮＡは、宿主細胞において自律複製可能なＤＮＡであって、上記２の本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに本発明のＤＮＡが組み込まれているＤＮＡである。
本発明の組換え体ＤＮＡは、宿主細胞において自律複製可能なＤＮＡであって、上記２の本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに本発明のＤＮＡが組み込まれているＤＮＡである。
宿主細胞において染色体への組込が可能なＤＮＡであって、本発明のＤＮＡを有するＤＮＡもまた、本発明の組換え体ＤＮＡである。
組換え体ＤＮＡが、染色体への組込が可能な組換え体ＤＮＡである場合は、プロモーターを含有していなくてもよい。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、上記２の本発明のＤＮＡ、及び転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。さらに、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
ここで、リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンの間は、適当な距離、例えば６～１８塩基に調節することが好ましい。
また、本発明の組換え体ＤＮＡにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞としてエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＳＴＶ２８、ｐＵＣ１１８（いずれもタカラバイオ社製）、ｐＥＴ２１ａ、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもメルクミリポア社製）、ｐＭＡＬ－ｃ５ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１、ｐＴｒｃ９９Ａ（いずれもＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＳＥ２８０（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０、ｐＱＥ－６０、ｐＱＥ８０Ｌ（いずれもキアゲン社製）、ｐＥＴ－３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（－）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＴｒＳ３０ ［エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０７）より調整］、ｐＴｒＳ３２ ［エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０８）より調整］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，２００７，Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．２０，ｐ６３７８－６３８５］、ｐＰＥ１６７（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，７３：６３７８－６３８５）、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＰＡ１（特開昭６３－２３３７９８号公報）等を挙げることができる。
上記の発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、ｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ５プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも用いることもできる。
本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞としてコリネ型細菌を用いる場合、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＧ１（特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも特開昭５８－１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３［いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５（１９８４）］等を挙げることができる。
上記の発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネ型細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、Ｐ５４－６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，ｐ６７４－６７９（２０００）］を用いることができる。
本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞として酵母菌株を用いる場合、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５などを挙げることができる。
上記の発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
本発明の組換え体ＤＮＡは、例えば、上記２の方法により調製したＤＮＡ断片を制限酵素処理する等して、上記の適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することによって作製することができる。
ここで、本発明ＤＮＡの塩基配列を宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、該ＤＮＡがコードする蛋白質の発現量を向上させることもできる。宿主細胞におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手することができる。
４．本発明の形質転換体
本発明の形質転換体は、上記３に記載の本発明の組換え体ＤＮＡ、すなわち、上記２に記載の本発明のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体である。
本発明の形質転換体は、上記３に記載の本発明の組換え体ＤＮＡ、すなわち、上記２に記載の本発明のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体である。
本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞は、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれであってもよいが、好ましくは、原核生物又は酵母菌株を、より好ましくは、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、又はサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株を、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｃｏｄｏｎ ｐｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（メルクミリポア社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０４ ｄａｍ－／ｄｃｍ―、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１－１８ ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ９６３７、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ－０１１０等の原核生物、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、若しくはＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ等の酵母菌株を挙げることができる。
宿主細胞としては、好ましくは、ジペプチド分解活性を人工的に弱化した育種株、目的とするジペプチドの基質となるＬ－アミノ酸の生産能力を人工的に付与又は強化した育種株、又はその両方を施した育種株を用いることができる。
宿主細胞として用いる微生物のジペプチド分解活性を人工的に弱化する方法としては、ジペプチド分解活性を有する酵素の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法などを挙げることができる。
宿主細胞として用いる微生物に、Ｌ－アミノ酸を生産する能力を人工的に付与又は強化する方法としては、（ａ）目的のＬ－アミノ酸を生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法、（ｂ）目的のＬ－アミノ酸を生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、（ｃ）目的のＬ－アミノ酸を生成する生合成経路に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、（ｄ）目的のＬ－アミノ酸を生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法、などを挙げることができ、上記公知の方法は単独又は組み合わせて用いることができる。
上記、ジペプチド分解活性を弱化し、かつ基質となるＬ－アミノ酸の生産能力を付与又は強化する方法の具体例としては、各種遺伝子操作による方法（Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００７）７３（２０）：６３７８－６３８５）等、公知の方法を挙げることができる。
上記３の組換え体ＤＮＡを宿主細胞において自律複製可能なプラスミドとして導入する方法としては、例えば、上述のカルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、並びに、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等の方法を挙げることができる。
組換え体ＤＮＡを宿主細胞の染色体中に組み込む方法としては、例えば、相同組換え法を挙げることができる。相同組換え法としては、例えば、導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法を挙げることができる。エシェリヒア・コリで頻用される相同組換えを利用した方法としては、例えば、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体ＤＮＡを導入する方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４１－６６４５（２０００）］を挙げることができる。
さらに、組換え体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がスクロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５，１３７（２００５）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，２９０５（２００７）］等を用いて、宿主細胞の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された大腸菌を取得することができる。
上記の方法で得られた形質転換体が、上記２に記載の本発明のＤＮＡを有していることは、例えば、該形質転換体を培地に培養し、培養物中に蓄積した目的のジペプチドの生成量を、親株のそれと比較することにより確認することができる。または、該培養物から本発明の蛋白質を含有する抽出液を調製し、該抽出液、２種の異なるＬ－アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に蓄積したジペプチドの生成量を、親株のそれと比較することによっても確認することができる。
このような本発明の形質転換体の例としては、実施例において後述する形質転換体を挙げることができる。
５．本発明のジペプチドの製造法
本発明のジペプチドの製造法は、以下の５－１及び５－２に記載の方法である。
本発明のジペプチドの製造法は、以下の５－１及び５－２に記載の方法である。
５－１．Ｌ－アミノ酸を基質として用いるジペプチドの製造法
本発明のジペプチドの製造法としては、２種のＬ－アミノ酸を前駆体として用いるジペプチドの製造法を挙げることができる。
本発明のジペプチドの製造法としては、２種のＬ－アミノ酸を前駆体として用いるジペプチドの製造法を挙げることができる。
具体的には、（１）若しくは（２）に記載の蛋白質を酵素源として用い、該酵素源及び２種のＬ－アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、ジペプチドを該水性媒体中に生成、蓄積させ、該水性媒体中からジペプチドを採取することができる。酵素源としては、精製した（１）若しくは（２）に記載の蛋白質であってよく、又は、上記４の形質転換体、すなわち、上記（１）若しくは（２）に記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養して得られる培養物若しくは該培養物の処理物であってよい。酵素源をとして、精製した（１）若しくは（２）に記載の蛋白質を用いる場合、水性溶媒中に２種のＬ－アミノ酸とともにＡＴＰを存在せしめる。ここで、培養物とは、培養された上記（１）若しくは（２）に記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物及び培地を含むものであり、当該培養物中に微生物によって発現された上記（１）又は（２）に記載の蛋白質が含まれている。
ＡＴＰ及び２種のＬ－アミノ酸は、本発明の形質転換体が有する本発明の蛋白質の基質となるものであればその由来は問わないが、ＡＴＰ及び２種のＬ－アミノ酸を生産する能力を有する微生物の培養物又は該培養物の処理物をそのまま、あるいは該培養物又は該培養物の処理物から採取したＡＴＰ及び２種のＬ－アミノ酸を用いてもよい。
上記培養物若しくは該培養物の処理物は、酵素源としての（１）若しくは（２）に記載の蛋白質及びＡＴＰを含む。培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などを挙げることができる。
水性媒体としては、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノールやエタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などを挙げることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることもできる。
水性媒体中に生成したジペプチドは、高速液体クロマトグラフィーなどを用いる通常の方法によって分析することができる。上記の水性媒体からのジペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
５－２．発酵法によるジペプチドの製造法
本発明のジペプチドの製造法としては、上記４の形質転換体、すなわち、上記（１）又は（２）に記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にジペプチドを生成、蓄積させ、該培養物中からジペプチドを採取することを特徴とする、発酵法によるジペプチドの製造法を挙げることができる。ここで、培養物とは、培養された上記（１）若しくは（２）に記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物及び培地を含むものであり、当該培養物中に微生物によって発現された上記（１）又は（２）に記載の蛋白質が含まれている。
本発明のジペプチドの製造法としては、上記４の形質転換体、すなわち、上記（１）又は（２）に記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にジペプチドを生成、蓄積させ、該培養物中からジペプチドを採取することを特徴とする、発酵法によるジペプチドの製造法を挙げることができる。ここで、培養物とは、培養された上記（１）若しくは（２）に記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物及び培地を含むものであり、当該培養物中に微生物によって発現された上記（１）又は（２）に記載の蛋白質が含まれている。
発酵法によるジペプチドの製造法に用いる、本発明の形質転換体としては、ジペプチドの基質となるＬ－アミノ酸を生成する能力を有する形質転換体であることが好ましい。
上記４の形質転換体を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
該形質転換体を培養する培地としては、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素原、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地と合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプン若しくはデンプン加水分解物等の糖、酢酸若しくはプロピオン酸等の有機酸、又は、グリセロール、エタノール若しくはプロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素原としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム又はリン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を使用することができる。
発酵法によるジペプチドの製造法において、用いる形質転換体が基質となるＬ－アミノ酸を生成する能力を有していない場合には、培養中に、当該Ｌ－アミノ酸を培地に添加する。
また、発酵法によるジペプチドの製造法において、用いる形質転換体が基質となるＬ－アミノ酸を生成する能力を有していない場合には、培養中に、Ｌ－アミノ酸を培地に添加する代わりに、糖からＬ－アミノ酸を生成する能力を有する微生物を、本発明の形質転換体と共培養することにより、本発明の形質転換体にＬ－アミノ酸を供給してもよい。
培養は、通常、振盪培養又は深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は、通常１５～４０℃であり、培養時間は、通常５時間～７日間である。培養中の培養液ｐＨは、通常３．０～９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
上記の培養により、培養物中にジペプチドを生成、蓄積させ、該培養物中からジペプチドを採取することにより、ジペプチドを製造することができる。
得られたジペプチドは、高速液体クロマトグラフィーなどを用いる通常の方法によって分析することができる。上記の培養物又は該培養物の処理物中からのジペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。菌体内にジペプチドが蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清から活性炭やイオン交換樹脂等によって、ジペプチドを採取することができる。
本発明の製造法によって製造されるジペプチドは、式（Ｉ）
Ｒ１－Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１はＬ－アラニン、Ｒ２はＬ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－プロリン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－システイン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－チロシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－ヒスチジン及びＬ－アスパラギン酸から選ばれるアミノ酸残基を表す）
で表されるジペプチドである。
Ｒ１－Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１はＬ－アラニン、Ｒ２はＬ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－プロリン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－システイン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－チロシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－ヒスチジン及びＬ－アスパラギン酸から選ばれるアミノ酸残基を表す）
で表されるジペプチドである。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［分析例］
実施例において、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン及びＬ－アラニル－Ｌ－アラニンの分析、定量は以下に示す手順に従い、ＨＰＬＣ（島津製作所社製）にて分析した。
分析条件
カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ ３μｍ ３ｍｍ×１５０ｍｍ（ジーエルサイエンス社製）
カラム温度：４０℃
移動相：リン酸1カリウム４．０８ｇ／Ｌ、へプタンスルホン酸ナトリウム６．０７ｇ／Ｌ及びアセトニトリル１２５ｍＬ／Ｌ（ｐＨ２．５、リン酸で調整）
流速：０．４ｍＬ／分
検出波長：２１０ｎｍ
実施例において、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン及びＬ－アラニル－Ｌ－アラニンの分析、定量は以下に示す手順に従い、ＨＰＬＣ（島津製作所社製）にて分析した。
分析条件
カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ ３μｍ ３ｍｍ×１５０ｍｍ（ジーエルサイエンス社製）
カラム温度：４０℃
移動相：リン酸1カリウム４．０８ｇ／Ｌ、へプタンスルホン酸ナトリウム６．０７ｇ／Ｌ及びアセトニトリル１２５ｍＬ／Ｌ（ｐＨ２．５、リン酸で調整）
流速：０．４ｍＬ／分
検出波長：２１０ｎｍ
［実施例１］変異型ＹｗｆＥを発現する微生物の造成
（１）バチルス・サチルス １６８株由来Ｌ－アミノ酸αリガーゼ（ＹｗｆＥ）発現ベクターの調製
定法により調製したバチルス・サチルス １６８株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号４及び５で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ｙｗｆＥ遺伝子を含む約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
（１）バチルス・サチルス １６８株由来Ｌ－アミノ酸αリガーゼ（ＹｗｆＥ）発現ベクターの調製
定法により調製したバチルス・サチルス １６８株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号４及び５で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ｙｗｆＥ遺伝子を含む約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
上記で得られたｙｗｆＥ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて発現ベクターｐＥＴ－２１ａ（＋）（メルクミリポア社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＥＴ２１ａ－ｙｗｆＥを得た。
（２）変異型ＹｗｆＥを発現する微生物の造成
上記（１）で得られたプラスミドｐＥＴ２１ａ－ｙｗｆＥを鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、表１～３のいずれかに記載の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、ＹｗｆＥのアミノ酸配列上の１０７番目、１０８番目又は１１０番目のいずれかのアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換した全５７種類のプラスミドを造成した。
上記（１）で得られたプラスミドｐＥＴ２１ａ－ｙｗｆＥを鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、表１～３のいずれかに記載の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、ＹｗｆＥのアミノ酸配列上の１０７番目、１０８番目又は１１０番目のいずれかのアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換した全５７種類のプラスミドを造成した。
ＹｗｆＥのアミノ酸配列上の１０７番目のＬ－Ａｓｎを置換する場合は表１に記載のプライマーセット、１０８番目のＬ－Ａｓｎを置換する場合は表２に記載のプライマーセット、１１０番目のＬ－Ｌｅｕを置換する場合は表３に記載のプライマーセットを用いた。
上記（１）で得られた野生型ＹｗｆＥ発現プラスミドｐＥＴ２１ａ－ｙｗｆＥ、及び上記各変異点を有する計５７種類の変異型ＹｗｆＥ発現プラスミドを用いて、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（メルクミリポア社製）を形質転換し、各プラスミドを有する形質転換体を得た。
［実施例２］変異型ＹｗｆＥを用いるジペプチド生産
上記実施例１で得られた計５８種の形質転換体をＬＢプレート上で３０℃にて２４時間培養し、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った大型試験管に植菌して３０℃で２０時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５０ｍＬが入ったフラスコに０．１ｍＬ植菌し、３０℃で振盪培養した。菌体ＯＤ６００が０．４～０．６の範囲に達した後、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．５ｍＭになるよう添加し、更に６時間振盪培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を取得した。
上記実施例１で得られた計５８種の形質転換体をＬＢプレート上で３０℃にて２４時間培養し、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った大型試験管に植菌して３０℃で２０時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５０ｍＬが入ったフラスコに０．１ｍＬ植菌し、３０℃で振盪培養した。菌体ＯＤ６００が０．４～０．６の範囲に達した後、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．５ｍＭになるよう添加し、更に６時間振盪培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を取得した。
得られた菌体から定法により粗タンパク質抽出液を取得し、Ｈｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、該抽出液から野生型ＹｗｆＥ酵素又は各変異型ＹｗｆＥ酵素を回収した。該回収液を、Ｂｕｆｆｅｒ Ａ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール］に希釈し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４（メルクミリポア社製）を用いて濃縮、脱塩処理し、各ＹｗｆＥ精製酵素を得た。
取得した野生型ＹｗｆＥ精製酵素及び変異型ＹｗｆＥ精製酵素を用いて、以下の方法によりＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン（以下、Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎという）を生成し、各変異点の効果を比較した。
（１）１０７番目のＬ－Ａｓｎを置換した変異型ＹｗｆＥを用いるジペプチド生産
上記で得た野生型ＹｗｆＥ精製酵素、及び、ＹｗｆＥのアミノ酸配列上の１０７番目のＬ－Ａｓｎを上記表１に記載のアミノ酸残基に置換した変異型ＹｗｆＥの精製酵素計１９種を用いて、酵素反応によるＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎの生成検討を実施した。
上記で得た野生型ＹｗｆＥ精製酵素、及び、ＹｗｆＥのアミノ酸配列上の１０７番目のＬ－Ａｓｎを上記表１に記載のアミノ酸残基に置換した変異型ＹｗｆＥの精製酵素計１９種を用いて、酵素反応によるＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎの生成検討を実施した。
各精製酵素２２．５μｇ、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、３０ｍＭの硫酸マグネシウム、３０ｍＭのＡＴＰ・２ナトリウム、４０ｍＭのＬ－Ａｌａ並びに４０ｍＭのＬ－Ｇｌｎからなる反応液０．１ｍＬを調製し、３７℃で１時間ジペプチド合成反応を行った。反応後、生成したジペプチドをＨＰＬＣにて分析した。各精製酵素による酵素反応により生成されたＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎ及びＬ－アラニル－Ｌ－アラニン（以下、Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ａｌａという）の量（ｍＭ）、並びに各精製酵素の酵素活性（Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎ合成活性比及びＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ａｌａ比）を表４に示す。
表４中「Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎ合成活性比」は、単位時間当たりのＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎ生成量を反応液中の精製酵素濃度（ｍＭ）で割った値について、野生型ＹｗｆＥの値を１．００とした場合の各変異型ＹｗｆＥにおける値を表す。表４中「Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ａｌａ比」は、Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ａｌａの生成量（ｍＭ）をＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎの生成量（ｍＭ）で割った値について、野生型ＹｗｆＥの値を１．０とした場合の各変異型ＹｗｆＥにおける値を表す。
その結果、表４に示す通り、ＹｗｆＥのアミノ酸配列のうち１０７番目のＬ－Ａｓｎを、Ｌ－Ｓｅｒ、Ｌ－Ａｌａ、Ｌ－Ｈｉｓ、Ｌ－Ｇｌｎ、Ｌ－Ａｓｐ、Ｌ－Ｇｌｕ、Ｇｌｙ又はＬ－Ｍｅｔに置換した変異型ＹｗｆＥは、野生型ＹｗｆＥと比較してＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ａｌａの生成比が低減した。このうち、ＹｗｆＥのアミノ酸配列のうち１０７番目のＬ－Ａｓｎを、Ｌ－Ｓｅｒ、Ｌ－Ａｌａ、Ｌ－Ｈｉｓ、Ｇｌｙ又はＬ－Ｍｅｔに置換した変異型ＹｗｆＥは、野生型ＹｗｆＥと比較してＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎの生成量も向上した。
以上より、ＹｗｆＥのアミノ酸配列のうち１０７番目のＬ－Ａｓｎを、Ｌ－Ｓｅｒ、Ｌ－Ａｌａ、Ｌ－Ｈｉｓ、Ｇｌｙ又はＬ－Ｍｅｔに置換した変異型ＹｗｆＥを用いることで、野生型ＹｗｆＥに比べ、副生ジペプチドであるＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ａｌａの生成比が低減し、かつＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎの生成量が向上することが分かった。
（２）１０８番目のＬ－Ａｓｎを置換した変異型ＹｗｆＥを用いるジペプチドの生成
上記で得た野生型ＹｗｆＥ精製酵素、及び、ＹｗｆＥのアミノ酸配列上の１０８番目のＬ－Ａｓｎを上記表２に記載のアミノ酸残基に置換した変異型ＹｗｆＥの精製酵素計１９種を用いて、酵素反応によるＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎの生成検討を実施した。
上記で得た野生型ＹｗｆＥ精製酵素、及び、ＹｗｆＥのアミノ酸配列上の１０８番目のＬ－Ａｓｎを上記表２に記載のアミノ酸残基に置換した変異型ＹｗｆＥの精製酵素計１９種を用いて、酵素反応によるＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎの生成検討を実施した。
精製酵素１５μｇ（Ｌ－Ｐｈｅに置換した変異型ＹｗｆＥ精製酵素については１３．６μｇ）、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、３０ｍＭの硫酸マグネシウム、３０ｍＭのＡＴＰ・２ナトリウム、４０ｍＭのＬ－Ａｌａ、及び４０ｍＭのＬ－Ｇｌｎからなる０．１ｍＬの反応液を調製し、３７℃で１時間ジペプチド合成反応を行った。反応後、生成したジペプチドをＨＰＬＣにて分析した。各反応で使用したＹｗｆＥの１０８番目のアミノ酸残基、生成したＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎ及びＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ａｌａの量（ｍＭ）、並びに酵素活性を表５に示す。表５中「Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎ合成活性比」及び「Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ａｌａ比」については上記（１）と同様である。
その結果、ＹｗｆＥのアミノ酸配列のうち１０８番目のＬ－Ａｓｎを、Ｌ－Ｐｈｅ、Ｌ－Ｍｅｔ、Ｌ－Ｓｅｒ、Ｌ－Ｐｒｏ、Ｌ－Ｔｈｒ、Ｌ－Ａｌａ、Ｌ－Ｔｙｒ、Ｇｌｙ又はＬ－Ｌｅｕに置換した変異型ＹｗｆＥは、野生型ＹｗｆＥと比較してＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ａｌａの生成比が低減した。このうち、ＹｗｆＥのアミノ酸配列のうち１０８番目のＬ－Ａｓｎを、Ｌ－Ｐｈｅ、Ｌ－Ｍｅｔ、Ｌ－Ｓｅｒ、Ｌ－Ｔｈｒ、Ｌ－Ａｌａ、Ｌ－Ｔｙｒ又はＬ－Ｌｅｕに置換した変異型ＹｗｆＥは、野生型ＹｗｆＥと比較してＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎの生成量も向上した。
以上より、ＹｗｆＥのアミノ酸配列のうち１０８番目のＬ－Ａｓｎを、Ｌ－Ｐｈｅ、Ｌ－Ｍｅｔ、Ｌ－Ｓｅｒ、Ｌ－Ｔｈｒ、Ｌ－Ａｌａ、Ｌ－Ｔｙｒ又はＬ－Ｌｅｕに置換した変異型ＹｗｆＥを用いることで、野生型ＹｗｆＥに比べ、副生ジペプチドであるＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ａｌａの生成比が低減し、かつＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎの生成量が向上することが分かった。
（３）１１０番目のＬ－Ｌｅｕを置換した変異型ＹｗｆＥを用いるジペプチドの生成
上記で得た野生型ＹｗｆＥ精製酵素、及び、ＹｗｆＥのアミノ酸配列上の１１０番目のＬ－Ｌｅｕを上記表３に記載のアミノ酸残基に置換した変異型ＹｗｆＥの精製酵素計１９種を用いて、酵素反応によるＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎの生成検討を実施した。
上記で得た野生型ＹｗｆＥ精製酵素、及び、ＹｗｆＥのアミノ酸配列上の１１０番目のＬ－Ｌｅｕを上記表３に記載のアミノ酸残基に置換した変異型ＹｗｆＥの精製酵素計１９種を用いて、酵素反応によるＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎの生成検討を実施した。
精製酵素２２．５μｇ、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、３０ｍＭの硫酸マグネシウム、３０ｍＭのＡＴＰ・２ナトリウム、４０ｍＭのＬ－Ａｌａ、及び４０ｍＭのＬ－Ｇｌｎからなる０．１ｍＬの反応液を調製し、３７℃で１時間ジペプチド合成反応を行った。反応後、生成したジペプチドをＨＰＬＣにて分析した。各反応で使用したＹｗｆＥの１１０番目のアミノ酸残基、生成したＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎ及びＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ａｌａの量（ｍＭ）、並びに酵素活性を表６に示す。表６中「Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎ合成活性比」及び「Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ａｌａ比」については上記（１）と同様である。
その結果、ＹｗｆＥのアミノ酸配列のうち１１０番目のＬ－Ｌｅｕを、Ｌ－Ｍｅｔ、Ｌ－Ｖａｌ、Ｌ－Ａｌａ、Ｌ－Ａｓｎ、Ｌ－Ｃｙｓ、Ｌ－Ｔｒｐ、又はＬ－Ｐｈｅに置換した変異型ＹｗｆＥは、野生型ＹｗｆＥと比較してＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ａｌａの生成比が低減した。このうち、ＹｗｆＥのアミノ酸配列のうち１１０番目のＬ－Ｌｅｕを、Ｌ－Ｍｅｔ、Ｌ－Ｃｙｓ、Ｌ－Ｔｒｐ、又はＬ－Ｐｈｅに置換した変異型ＹｗｆＥは、野生型ＹｗｆＥと比較してＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎの生成量も向上した。
以上より、ＹｗｆＥのアミノ酸配列のうち１１０番目のＬ－Ｌｅｕを、Ｌ－Ｍｅｔ、Ｌ－Ｃｙｓ、Ｌ－Ｔｒｐ、又はＬ－Ｐｈｅに置換した変異型ＹｗｆＥを用いることで野生型ＹｗｆＥに比べ、副生ジペプチドであるＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ａｌａの生成比が低減し、かつＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎの生成量が向上することが分かった。
［実施例３］変異型ＹｗｆＥを有する微生物を用いた発酵法によるジペプチドの製造
（１）微生物の造成
野生型ＹｗｆＥを含む非特許文献２に記載のプラスミドｐＰＥ１６７を鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、表７に記載の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、ＹｗｆＥのアミノ酸配列上の１０７番目、１０８番目又は１１０番目のいずれかのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した、全１０種類の変異型ＹｗｆＥ発現プラスミドを造成した。
（１）微生物の造成
野生型ＹｗｆＥを含む非特許文献２に記載のプラスミドｐＰＥ１６７を鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、表７に記載の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、ＹｗｆＥのアミノ酸配列上の１０７番目、１０８番目又は１１０番目のいずれかのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した、全１０種類の変異型ＹｗｆＥ発現プラスミドを造成した。
野生型ＹｗｆＥ発現プラスミドｐＰＥ１６７及び上記１０種類の変異型ＹｗｆＥ発現プラスミドを用いて、非特許文献２に記載のＪＫＹＰＱ３株を形質転換し、各プラスミドを有する形質転換体を得た。
（２）ジペプチドの製造
得られた形質転換体を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢプレート上で３０℃にて２４時間培養し、１０ｇ／Ｌのグルコース及び１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して３０℃で２０時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む生産培地［グルコース３０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物１ｇ／Ｌ、カザミノ酸５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、クエン酸三ナトリウム二水和物１ｇ／Ｌ、Ｌ－プロリン０．４ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後オートクレーブし、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合した）］が５ｍＬ入った太型試験管に０．１ｍＬ植菌し、３０℃で４８時間振盪培養した。
得られた形質転換体を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢプレート上で３０℃にて２４時間培養し、１０ｇ／Ｌのグルコース及び１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して３０℃で２０時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む生産培地［グルコース３０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物１ｇ／Ｌ、カザミノ酸５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、クエン酸三ナトリウム二水和物１ｇ／Ｌ、Ｌ－プロリン０．４ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後オートクレーブし、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合した）］が５ｍＬ入った太型試験管に０．１ｍＬ植菌し、３０℃で４８時間振盪培養した。
培養終了後、培養液を遠心分離し、上清のＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎ及びＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ａｌａの濃度（ｇ／Ｌ）をＨＰＬＣにて分析した。結果を表８に示す。表８中、「Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ａｌａ／Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎ」は、Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ａｌａの生成量（ｇ／Ｌ）をＬ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎの生成量（ｇ／Ｌ）で割った値（％）を表す。
その結果、ＹｗｆＥの１０７番目のＬ－ＡｓｎをＬ－Ａｌａ、Ｌ－Ｈｉｓ又はＧｌｙに、１０８番目のＬ－ＡｓｎをＬ－Ｓｅｒ、Ｌ－Ｔｈｒ、Ｌ－Ａｌａ又はＬ－Ｔｙｒに、１１０番目のＬ－ＬｅｕをＬ－Ｍｅｔ、Ｌ－Ｔｒｐ又はＬ－Ｐｈｅに置換した変異型ＹｗｆＥを発現する能力を有する微生物を用いることで、野生型ＹｗｆＥを発現する微生物に比べて、Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎの生産量が向上し、かつ、Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｎに対する副生Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ａｌａの比が低減し、上記変異により、ＹｗｆＥの基質特異性が向上することが分かった。
本発明により、基質特異性が向上したジペプチド合成活性を有する蛋白質、及び、該蛋白質又は該蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いて、目的とするジペプチド以外の副生ジペプチドを低減させ、かつ、目的のジペプチドを効率的に製造する方法が提供される。
Claims (8)
- 配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１０７番目、１０８番目及び１１０番目からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が、それぞれ以下の［１］～［３］に記載のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列ならなる蛋白質であり、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する元となる蛋白質に比べて基質特異性が向上したＬ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する蛋白質。
［１］１０７番目のアミノ酸残基に対して、Ｌ－セリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、グリシン及びＬ－メチオニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［２］１０８番目のアミノ酸残基に対して、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－プロリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－チロシン、グリシン及びＬ－ロイシンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［３］１１０番目のアミノ酸残基に対して、Ｌ－メチオニン、Ｌ－バリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン、Ｌ－トリプトファン及びＬ－フェニルアラニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基 - 以下の［４］又は［５］に記載の元となる蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１０７番目、１０８番目及び１１０番目に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が、それぞれ［１´］～［３´］に記載のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつ、元となる蛋白質に比べて基質特異性が向上したＬ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する蛋白質。
［１´］１０７番目に対応するアミノ酸残基に対して、Ｌ－セリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、グリシン及びＬ－メチオニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［２´］１０８番目に対応するアミノ酸残基に対して、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－プロリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－チロシン、グリシン及びＬ－ロイシンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［３´］１１０番目に対応するアミノ酸残基に対して、Ｌ－メチオニン、Ｌ－バリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン、Ｌ－トリプトファン及びＬ－フェニルアラニンからなる群より選ばれるアミノ酸残基
［４］配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち１～２０個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質であり、かつ、Ｌ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する変異蛋白質
［５］配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同蛋白質であり、かつ、Ｌ－アミノ酸αリガーゼ活性を有する相同蛋白質 - 請求項１又は２に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
- 請求項３に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
- 請求項４に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
- 請求項１又は２に記載の蛋白質を酵素源として用い、該酵素源及び２種のＬ－アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中からジペプチドを採取することを特徴とする、ジペプチドの製造法。
- 請求項１又は２に記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にジペプチドを生成、蓄積せしめ、該培養物から該ジペプチドを採取することを特徴とする、ジペプチドの製造法。
- ジペプチドが、式（Ｉ）
Ｒ１－Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１はＬ－アラニン、Ｒ２はＬ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－プロリン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－システイン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－チロシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－ヒスチジン及びＬ－アスパラギン酸から選ばれるアミノ酸残基を表す）
で表されるジペプチドである、請求項６又は７に記載の製造法。
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