CN115074376B - 一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成d-阿洛酮糖的方法 - Google Patents

一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成d-阿洛酮糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成D‑阿洛酮糖的方法。以大肠杆菌为底盘宿主菌，通过敲除果糖特异性PTS转移蛋白基因FruA，同时过表达果糖非磷酸化转运蛋白基因pstG‑F、果糖激酶基因maK、D‑阿洛酮糖‑6‑磷酸差向异构酶基因alsE、阿洛酮糖‑6‑磷酸磷酸酶基因a6PP，建立从D‑果糖到D‑阿洛酮糖的合成途径；进一步敲除D‑果糖‑6‑磷酸激酶基因pfkA和pfkB，调控重组大肠杆菌的碳代谢通量；再过表达磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因pckA并以甘油为碳源，提高胞内ATP浓度。本发明构建的重组大肠杆菌用于发酵生产，可有效提高底物转化率，为生物合成D‑阿洛酮糖的工业化发展提供优化方案。

Description

一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成D-阿洛酮糖的方法
技术领域
本发明属于微生物代谢工程领域，具体涉及一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成D-阿洛酮糖的方法。
技术背景
D-阿洛酮糖是一种超低热量的稀有糖，甜度是蔗糖的70%而能量仅为蔗糖的0.3%。大量研究报道，D-阿洛酮糖在预防肥胖、治疗动脉粥样硬化、抗高血脂、抗炎、抗氧化、抗高血糖、神经保护等方面具有独特生理特性，还能改善食品胶凝状态、增加食品风味，甚至可以缓解食品加工和储存过程中的氧化作用。D-阿洛酮糖已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准为公认安全产品（GRAS），在食品、饮料、保健等领域拥有巨大的市场前景。
由于D-阿洛酮糖十分稀缺，对其生产方法的开发已引起极大地关注。D-阿洛酮糖的化学合成研究始于1960年，但因副反应多、提纯繁琐、污染严重等原因，尚未在工业应用中取得突破。相比之下，生物合成D-阿洛酮糖具有高度特异性和环境友好性。尽管酶法在产物转化率和产品纯化方面具有优势，但是酶的生产和固定化成本高、耗时长，尤其是关键酶的热稳定性难题尚未完全解决，导致生物催化剂的可重复使用性差。相比之下，微生物发酵用于生产D-阿洛酮糖是酶催化的理想替代方案。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题，而提供一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成D-阿洛酮糖的方法。通过重组载体构建在大肠杆菌中建立从D-果糖到D-阿洛酮糖的合成途径，借助基因敲除合理调控碳代谢流量，同时引入ATP胞内合成途径，最终实现D-阿洛酮糖的高效合成。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成D-阿洛酮糖的方法，所述重组大肠杆菌是在E. coli JM109(DE3) 中敲除果糖特异性PTS转移蛋白基因fruA，同时过表达果糖非磷酸化转运蛋白基因ptsG-F、果糖激酶基因maK、D-阿洛酮糖-6-磷酸差向异构酶基因alsE和阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶基因a6PP四个基因，构建D-阿洛酮糖的合成途径；进一步通过敲除D-果糖-6-磷酸激酶基因pfkA和pfkB，阻断胞内果糖-6-磷酸转化为果糖-1, 6-二磷酸，使D-果糖的碳通量最大限度地进入产物合成途径；再引入异源的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因pckA用于表达PckA蛋白，实现ATP的胞内循环；最后使用含有甘油的M9基础培养基作为重组大肠杆菌的发酵培养基进行限氧发酵，实现D-阿洛酮糖的高效合成。
上述一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成D-阿洛酮糖的方法，具体包括以下步骤：
（1）敲除E. coli JM109(DE3) 的果糖特异性PTS转移蛋白基因fruA，并过表达果糖非磷酸化转运蛋白基因ptsG-F、果糖激酶基因maK、D-阿洛酮糖-6-磷酸差向异构酶基因alsE和阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶基因a6PP四个基因，得到E. coli (ΔFruA, PtsG-F, MaK,AlsE, A6PP) 菌株；
（2）在菌株E. coli (ΔFruA, PtsG-F, MaK, AlsE, A6PP)的基础上，敲除D-果糖-6-磷酸激酶基因pfkA和pfkB，得到E. coli (ΔFruA, ΔPfkA, ΔPfkB, PtsG-F, MaK,AlsE, A6PP) 菌株；
（3）在菌株E. coli (ΔFruA, ΔPfkA, ΔPfkB, PtsG-F, MaK, AlsE, A6PP) 的基础上，过表达磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因pckA，得到重组大肠杆菌E. coli (ΔFruA, ΔPfkA, ΔPfkB, PtsG-F, MaK, AlsE, A6PP, PckA)；
（4）使用含有甘油的M9基础培养基发酵培养E. coli (ΔFruA, ΔPfkA, ΔPfkB,PtsG-F, MaK, AlsE, A6PP, PckA) 菌株。
上述步骤（1）具体过程如下：使用引物fruA-F（SEQ ID NO. 1）和fruA-R（SEQ IDNO. 2）以pKD13质粒为模板进行PCR扩增，随后将PCR产物转染至含有pKD46质粒的E. coliJM109(DE3) 中进行同源重组，挑取单菌落活化并制备感受态细胞，转染pcp20质粒后，在30℃、220 rpm的摇床中过夜培养以消除抗性标记，最后在42 ℃、220 rpm的培养条件下丢失pcp20质粒，得到E. coli (ΔFruA) 菌株；再将人工合成的pETDuet-ptsG-F-maK和pRSFDuet-alsE-a6PP重组质粒转染至E. coli (ΔFruA) ，得到E. coli (ΔFruA, PtsG-F, MaK, AlsE, A6PP) 菌株；其中，ptsG-F、maK、alsE和a6PP的基因序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
上述步骤（2）具体过程如下：使用引物pfkA-F/pfkA-R和pfkB-F/pfkB-R按照步骤（1）中的方法敲除pfkA和pfkB基因，得到E. coli (ΔFruA, ΔPfkA, ΔPfkB, PtsG-F,MaK, AlsE, A6PP) 菌株；其中，pfkA-F和pfkA-R引物序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示，pfkB-F和pfkB-R引物序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
上述步骤（3）具体过程如下：将琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）来源的pckA基因根据大肠杆菌的密码子偏好性进行优化后人工合成（SEQ ID NO.11），以此为模板，使用引物pckA-F（SEQ ID NO.12）和pckA-R（SEQ ID NO.13）进行PCR扩增，利用XhoI和Avr II将基因片段***pRSFDuet-alsE-a6PP，得到重组载体pRSFDuet-alsE-a6PP- pckA，转染E. coli (ΔFruA, ΔPfkA, ΔPfkB, PtsG-F, MaK, AlsE, A6PP)后得到重组大肠杆菌E. coli (ΔFruA, ΔPfkA, ΔPfkB, PtsG-F, MaK, AlsE, A6PP, PckA)。
上述步骤（4）具体过程如下：使用M9基础培养基发酵培养E. coli (ΔFruA, ΔPfkA, ΔPfkB, PtsG-F, MaK, AlsE, A6PP, PckA)菌株，向其中加入8 g/L甘油作为细胞生长的碳源，加入2.2 g/L D-果糖作为D-阿洛酮糖的合成底物，使用0.1 mM IPTG诱导蛋白表达，发酵过程中使用胶塞封堵瓶口。
上述一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成D-阿洛酮糖的方法在生产D-阿洛酮糖中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明利用重组大肠杆菌实现D-阿洛酮糖的发酵制备法，与现有的酶催化法相比，操作更加简便，反应规模更大，有效解决酶重复利用性和固定化带来的高成本问题。与现有的基于可逆差向异构化合成途径的发酵法相比，本发明中的D-阿洛酮糖合成途径的底物转化率明显提高，为发酵法合成D-阿洛酮糖的工业化发展提供优化方案。
附图说明
图1为重组大肠杆菌E. coli (ΔFruA, ΔPfkA, ΔPfkB, PtsG-F, MaK, AlsE,A6PP, PckA)合成D-阿洛酮糖的代谢示意图。
图2为重组质粒pETDuet-ptsG-F-maK和pRSFDuet-alsE-a6PP的图谱。A：pETDuet-ptsG-F-maK；B：pRSFDuet-alsE-a6PP。
图3为E. coli (ΔFruA, PtsG-F, MaK, AlsE, A6PP) 的发酵结果。A：使用LB培养基加入4 g/L D-果糖的发酵结果；B：使用LB培养基加入4 g/L D-果糖并添加50 mM磷酸钾缓冲液的发酵结果。
图4为敲除PfkA和PfkB后的发酵结果。A：E. coli (ΔFruA, ΔPfkA, PtsG-F,MaK, AlsE, A6PP) 菌株的发酵结果；B：E. coli (ΔFruA, ΔPfkA, ΔPfkB, PtsG-F,MaK, AlsE, A6PP) 菌株的发酵结果。
图5为重组质粒pRSFDuet-alsE-a6PP-pckA的图谱。
图6为重组大肠杆菌E. coli (ΔFruA, ΔPfkA, ΔPfkB, PtsG-F, MaK, AlsE,A6PP, PckA)的发酵结果。
图7为重组大肠杆菌E. coli (ΔFruA, ΔPfkA, ΔPfkB, PtsG-F, MaK, AlsE,A6PP, PckA) 在M9培养基加入8 g/L甘油和2.2 g/L D-果糖的发酵结果。
具体实施方式
以下结合实施实例对本发明做进一步说明，需要指出的是，本实施实例仅用于解释本发明，而非对本发明的限制。
本发明中重组大肠杆菌E. coli (ΔFruA, ΔPfkA, ΔPfkB, PtsG-F, MaK,AlsE, A6PP, PckA) 合成D-阿洛酮糖的代谢示意图如图1所示。
实施例1
在底盘宿主菌E. coli JM109(DE3) 的基础上敲除果糖特异性PTS转移蛋白基因fruA，使用引物fruA-F（SEQ ID NO.1）和fruA-R（SEQ ID NO.2）以pKD13质粒为模板进行PCR扩增，将扩增产物转染至含有pKD46质粒的E. coli JM109(DE3) 中进行同源重组，挑取单菌落活化并制备感受态细胞，转染pcp20质粒后，在30 ℃、220 rpm的摇床中过夜培养以消除抗性标记，最后在42 ℃、220 rpm的培养条件下丢失pcp20质粒，得到E. coli (ΔFruA)菌株。将果糖非磷酸化转运蛋白基因ptsG-F、果糖激酶基因maK***pRSFDuet-1，得到pETDuet-ptsG-F-maK重组质粒（质粒图谱见图2A）。将D-阿洛酮糖-6-磷酸差向异构酶基因alsE和阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶基因a6PP***pRSFDuet-1，得到pRSFDuet-alsE-a6PP重组质粒（质粒图谱见图2B）。其中，果糖非磷酸化转运蛋白基因ptsG-F、果糖激酶基因maK、D-阿洛酮糖-6-磷酸差向异构酶基因alsE和阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶基因a6PP的基因序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，ptsG-F基因是大肠杆菌E. coli JM109(DE3)中ptsG基因的第34个核苷酸由G突变为T而来，maK和alsE基因是大肠杆菌E. coli JM109(DE3)自身基因的过表达，a6PP基因来源于脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）；在本发明中，果糖非磷酸化转运蛋白基因ptsG-F、果糖激酶基因maK、D-阿洛酮糖-6-磷酸差向异构酶基因alsE和阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶基因a6PP均是人工合成。将人工合成的pETDuet-ptsG-F-maK和pRSFDuet-alsE-a6PP重组质粒转染至E. coli (ΔFruA)，得到E. coli (ΔFruA, PtsG-F, MaK, AlsE, A6PP) 菌株。
将E. coli (ΔFruA, PtsG-F, MaK, AlsE, A6PP) 菌株过夜活化，以1%接种量转接至含4 g/L D-果糖的50 mL LB液体培养基中，向其中添加终浓度100 mg/mL氨苄霉素和终浓度50 mg/mL卡那霉素，在37 ℃、220 rpm的摇床中发酵培养72 h，在发酵培养3小时后加入终浓度0.1 mM IPTG诱导蛋白表达，发酵培养期间每间隔12小时进行取样，使用配备Sugar-PakTM I（6.5×300 mm, 85, Waters）色谱柱和示差折光检测器（RID）的高效液相色谱仪（Chromaster HPLC, HITACHI）测定发酵液中D-果糖含量及D-阿洛酮糖含量，流动相为去离子水，流速0.5 mL/min，柱温85 ℃，检测器温度55 ℃，进样量20 µL。结果如图3A所示，细胞在发酵过程中生长能力较弱，发酵液最终OD600仅有约0.5，可能是由于脱磷酸反应导致发酵液pH降低，影响细胞生长，进一步使用pH计对最终发酵液的pH进行了测定，测定pH值在3.9左右；但是，发酵液中明显有D-阿洛酮糖产生，产量为0.351 g/L，得率为0.159 g/g。
将E. coli (ΔFruA, PtsG-F, MaK, AlsE, A6PP) 菌株过夜活化，以1%接种量转接至含4 g/L D-果糖的50 mL LB液体培养基中，向培养基中加入终浓度50 mM磷酸钾缓冲液（购买自源叶生物，货号R26329）以调节pH，再向其中添加终浓度100 mg/mL氨苄霉素和终浓度50 mg/mL卡那霉素，在37 ℃、220 rpm的摇床中发酵培养72 h，在发酵培养3小时后加入终浓度0.1 mM IPTG诱导蛋白表达，发酵培养期间每间隔12小时进行取样，使用配备Sugar-PakTM I（6.5×300 mm, 85, Waters）色谱柱和示差折光检测器（RID）的高效液相色谱仪（Chromaster HPLC, HITACHI）测定发酵液中D-果糖含量及D-阿洛酮糖含量，流动相为去离子水，流速0.5 mL/min，柱温85 ℃，检测器温度55 ℃，进样量20 µL。结果如图3B所示，细胞生长得到缓解，发酵液最终OD600达到约2.4，D-阿洛酮糖产量提高至0.510 g/L。
实施例2
在实施例1得到的菌株E. coli (ΔFruA, PtsG-F, MaK, AlsE, A6PP)的基础上，按照实例1中的基因敲除方法，使用相应敲除引物pfkA-F和pfkA-R敲除6-磷酸果糖激酶基因pfkA，得到E. coli (ΔFruA, ΔPfkA, PtsG-F, MaK, AlsE, A6PP) 菌株。在菌株E. coli (ΔFruA, ΔPfkA, PtsG-F, MaK, AlsE, A6PP) 的基础上，按照实例1中的基因敲除方法，使用相应敲除引物pfkB-F和pfkB-R敲除6-磷酸果糖激酶基因pfkB，以调控D-果糖的碳代谢通量，得到E. coli (ΔFruA, ΔPfkA, ΔPfkB, PtsG-F, MaK, AlsE, A6PP) 菌株。pfkA-F和pfkA-R引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。pfkB-F和pfkB-R引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
按照实例1中的方法发酵培养菌株。菌株过夜活化，以1%接种量转接至含4 g/L D-果糖的50 mL LB液体培养基中，向培养基中加入终浓度50 mM磷酸钾缓冲液（购买自源叶生物，货号R26329）以调节pH，再向其中添加终浓度100 mg/mL氨苄霉素和终浓度50 mg/mL卡那霉素，在37 ℃、220 rpm的摇床中发酵培养72 h，在发酵培养3小时后加入终浓度0.1 mMIPTG诱导蛋白表达，发酵培养期间每间隔12小时进行取样，使用配备Sugar-PakTM I（6.5×300 mm, 85, Waters）色谱柱和示差折光检测器（RID）的高效液相色谱仪（ChromasterHPLC, HITACHI）测定发酵液中D-果糖含量及D-阿洛酮糖含量，流动相为去离子水，流速0.5mL/min，柱温85 ℃，检测器温度55 ℃，进样量20 µL。结果如图4所示，图4A中的E. coli (ΔFruA, ΔPfkA, PtsG-F, MaK, AlsE, A6PP) 菌株72 h后产生0.721 g/L D-阿洛酮糖，得率为0.180 g/g；图4B中的E. coli (ΔFruA, ΔPfkA, ΔPfkB, PtsG-F, MaK, AlsE,A6PP) 菌株的产量和得率均明显提高，分别为0.816 g/L和0.614 g/g，表明合理限制D-果糖的碳代谢通量有利于合成反应的高效转化。
实施例3
将琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）来源的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因pckA根据大肠杆菌的密码子偏好性进行优化后人工合成，合成的模板序列为SEQ IDNO.11。使用引物pckA-F（SEQ ID NO.12）和pckA-R（SEQ ID NO.13）对人工合成的pckA模板进行PCR扩增后，利用Xho I和Avr II将基因片段***pRSFDuet-alsE-a6PP后，得到pRSFDuet-alsE-a6PP-pckA重组质粒（质粒图谱如图5所示），再转染至E. coli (ΔFruA,ΔPfkA, ΔPfkB, PtsG-F, MaK, AlsE, A6PP)，得到重组大肠杆菌E. coli (ΔFruA, ΔPfkA, ΔPfkB, PtsG-F, MaK, AlsE, A6PP, PckA)。
按照实例1中的方法发酵培养菌株。菌株过夜活化，以1%接种量转接至含4 g/L D-果糖的50 mL LB液体培养基中，向培养基中加入终浓度50 mM磷酸钾缓冲液（购买自源叶生物，货号R26329）以调节pH，再向其中添加终浓度100 mg/mL氨苄霉素和终浓度50 mg/mL卡那霉素，在37 ℃、220 rpm的摇床中发酵培养72 h，在发酵培养3小时后加入终浓度0.1 mMIPTG诱导蛋白表达，发酵培养期间每间隔12小时进行取样。发酵培养期间使用胶塞封堵瓶口，通过注射器添加诱导剂或取样。使用配备Sugar-PakTM I（6.5×300 mm, 85, Waters）色谱柱和示差折光检测器（RID）的高效液相色谱仪（Chromaster HPLC, HITACHI）测定发酵液中D-果糖含量及D-阿洛酮糖含量，流动相为去离子水，流速0.5 mL/min，柱温85 ℃，检测器温度55 ℃，进样量20 µL。使用实例1中涉及的发酵培养基进行发酵实验，结果如图6所示，菌株E. coli (ΔFruA, ΔPfkA, ΔPfkB, PtsG-F, MaK, AlsE, A6PP, PckA)发酵液中的D-阿洛酮糖产量进一步提高，约为1.23 g/L，得率约为0.683 g/g。
实施例4
本实例中以M9基础培养基进行限氧发酵实验。菌株E. coli (ΔFruA, ΔPfkA,ΔPfkB, PtsG-F, MaK, AlsE, A6PP, PckA)过夜活化，以1%接种量转接至M9基础培养基，向其中加入8 g/L甘油和2.2 g/L D-果糖，同时添加终浓度100 mg/mL氨苄霉素和终浓度50mg/mL卡那霉素，在37 ℃、220 rpm的摇床中发酵培养96 h，在发酵培养3小时后加入终浓度0.1 mM IPTG诱导蛋白表达，发酵培养期间每间隔20小时进行取样。发酵培养期间使用胶塞封堵培养瓶瓶口，通过注射器添加诱导剂或取样。结果如图7所示，2.2 g/L D-果糖在96 h后全部转化为D-阿洛酮糖（1.590 g/L），得率约为0.722 g/g。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学，清源创新实验室
<120> 一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成D-阿洛酮糖的方法
<130>
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctgacagcag gagaggcata atgaaaacgc tgctgattat tgacgctaat attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 2
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gccctgtaac acacctttta ttacgctgct ttcgctactg cgtccacttc gtgtaggctg 60
gagctgcttc g 71
<210> 3
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgtttaaga atgcatttgc taacctgcaa aagttcggta aatcgctgat gctgccggta 60
tccgtactgc ctatcgcagg tattctgctg ggcgtcggtt ccgcgaattt cagctggctg 120
cccgccgttg tatcgcatgt tatggcagaa gcaggcggtt ccgtctttgc aaacatgcca 180
ctgatttttg cgatcggtgt cgccctcggc tttaccaata acgatggcgt atccgcgctg 240
gccgcagttg ttgcctatgg catcatggtt aaaaccatgg ccgtggttgc gccactggta 300
ctgcatttac ctgctgaaga aatcgcctct aaacacctgg cggatactgg cgtactcgga 360
gggattatct ccggtgcgat cgcagcgtac atgtttaacc gtttctaccg tattaagctg 420
cctgagtatc ttggcttctt tgccggtaaa cgctttgtgc cgatcatttc tggcctggct 480
gccatcttta ctggcgttgt gctgtccttc atttggccgc cgattggttc tgcaatccag 540
accttctctc agtgggctgc ttaccagaac ccggtagttg cgtttggcat ttacggtttc 600
atcgaacgtt gcctggtacc gtttggtctg caccacatct ggaacgtacc tttccagatg 660
cagattggtg aatacaccaa cgcagcaggt caggttttcc acggcgacat tccgcgttat 720
atggcgggtg acccgactgc gggtaaactg tctggtggct tcctgttcaa aatgtacggt 780
ctgccagctg ccgcaattgc tatctggcac tctgctaaac cagaaaaccg cgcgaaagtg 840
ggcggtatta tgatctccgc ggcgctgacc tcgttcctga ccggtatcac cgagccgatc 900
gagttctcct tcatgttcgt tgcgccgatc ctgtacatca tccacgcgat tctggcaggc 960
ctggcattcc caatctgtat tcttctgggg atgcgtgacg gtacgtcgtt ctcgcacggt 1020
ctgatcgact tcatcgttct gtctggtaac agcagcaaac tgtggctgtt cccgatcgtc 1080
ggtatcggtt atgcgattgt ttactacacc atcttccgcg tgctgattaa agcactggat 1140
ctgaaaacgc cgggtcgtga agacgcgact gaagatgcaa aagcgacagg taccagcgaa 1200
atggcaccgg ctctggttgc tgcatttggt ggtaaagaaa acattactaa cctcgacgca 1260
tgtattaccc gtctgcgcgt cagcgttgct gatgtgtcta aagtggatca ggccggcctg 1320
aagaaactgg gcgcagcggg cgtagtggtt gctggttctg gtgttcaggc gattttcggt 1380
actaaatccg ataacctgaa aaccgagatg gatgagtaca tccgtaacca ctaa 1434
<210> 4
<211> 909
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtgcgtatag gtatcgattt aggcggcacc aaaactgaag tgattgcact gggcgatgca 60
ggggagcagt tgtaccgcca tcgtctgccc acgccgcgtg atgattaccg gcagactatt 120
gaaacgatcg ccacgttggt tgatatggcg gagcaggcga cggggcagcg cggaacggta 180
ggtatgggca ttcctggctc aatttcgcct tacaccggtg tggtgaagaa tgccaattca 240
acctggctca acggtcagcc attcgataaa gacttaagcg cgaggttgca gcgggaagtg 300
cggctggcaa atgacgctaa ctgtctggcg gtttcagaag cagtagatgg cgcggcagcg 360
ggagcgcaga cggtatttgc cgtgattatc ggcacgggat gcggcgcggg cgtggcattc 420
aatgggcggg cgcatatcgg cggcaatggc acggcaggtg agtggggaca caatccgcta 480
ccgtggatgg acgaagacga actgcgttat cgcgaggaag tcccttgtta ttgcggtaaa 540
caaggttgta ttgaaacctt tatttcgggc acgggattcg cgatggatta tcgtcgtttg 600
agcggacatg cgctgaaagg cagtgaaatt atccgcctgg ttgaagaaag cgatccggta 660
gcggaactgg cattgcgtcg ctacgagctg cggctggcaa aatcgctggc acatgtcgtg 720
aatattctcg atccggatgt gattgtcctg gggggcggga tgagcaatgt agaccgttta 780
tatcaaacgg ttgggcagtt gattaaacaa tttgtcttcg gcggcgaatg tgaaacgccg 840
gtgcgtaagg cgaagcacgg tgattccagc ggcgtacgcg gcgctgcgtg gttatggcca 900
caagagtaa 909
<210> 5
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgaaaatct ccccctcgtt aatgtgtatg gatctgctga aatttaaaga acagatcgaa 60
tttatcgaca gccatgccga ttacttccac atcgatatca tggacggtca ctttgtcccc 120
aatctgacac tctcaccgtt cttcgtaagt caggttaaaa aactggcaac taaaccgctc 180
gactgtcatc tgatggtgac gcggccgcag gattacattg ctcaactggc gcgtgcggga 240
gcagatttca tcactctgca tccggaaacc atcaacggcc aggcgttccg cctgattgat 300
gaaatccgcc gtcatgacat gaaagtgggg ctgatcctta acccggagac gccagttgag 360
gccatgaaat actatatcca taaggccgat aaaattacgg tcatgactgt cgatcccggc 420
tttgccggac aaccgttcat tcctgaaatg ctggataaac ttgccgaact gaaggcatgg 480
cgtgaacgag aaggtctgga gtacgaaatt gaggtggacg gttcctgcaa ccaggcaact 540
tacgaaaaac tgatggcggc aggggcggat gtctttatcg tcggcacttc cggcctgttt 600
aatcatgcgg aaaatatcga cgaagcatgg agaattatga ccgcgcagat tctggctgca 660
aaaagcgagg tacagcctca tgcaaaaaca gcataa 696
<210> 6
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgaaataca ctgtttattt attcgacttt gactatacac tggcagactc ttcgcgtggc 60
atcgtaacct gcttcagaag cgtactcgag agacatggct acaccggtat cactgatgat 120
atgatcaaac gcaccattgg gaaaacgctt gaagaatcgt tcagcatcct tacgggaatt 180
actgacgccg accaactgga atcattcaga caagagtatt ccaaagaggc agatatatac 240
atgaatgcaa ataccattct tttcccggat actctcccca cgcttacaca cctgaaaaaa 300
cagggaatcc gtatcggaat catttcaacc aaataccgat tccggatact gagtttcctg 360
agaaatcaca tgccggatga ttggtttgac atcattatcg gaggtgaaga tgtgacacat 420
cataaacccg atcctgaagg tttgctactt gccatcgacc gattgaaggc atgccccgaa 480
gaagtattat acatcggtga cagtacagtg gatgcaggaa cagccgccgc tgccggagtt 540
tcttttaccg gtgttaccag cggtatgact actgcccaag agtttcaggc ctatccctac 600
gacagaatca tcagtactct tggccagcta atctccgttc cggaagacaa atccggctgt 660
ccgctctga 669
<210> 7
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgattaaga aaatcggtgt gttgacaagc ggcggtgatg cgccaggcat gtgtaggctg 60
gagctgcttc g 71
<210> 8
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ttaatacagt tttttcgcgc agtccagcca gtcacctttg aacggacgct attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 9
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atggtacgta tctatacgtt gacacttgcg ccctctctcg atagcgcaac gtgtaggctg 60
gagctgcttc g 71
<210> 10
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttagcgggaa aggtaagcgt aaattttttg cgtatcgtca tgggagcaca attccgggga 60
tccgtcgacc 70
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atgaaaatct ccccctcgtt aatgtgtatg gatctgctga aatttaaaga acagatcgaa 60
tttatcgaca gccatgccga ttacttccac atcgatatca tggacggtca ctttgtcccc 120
aatctgacac tctcaccgtt cttcgtaagt caggttaaaa aactggcaac taaaccgctc 180
gactgtcatc tgatggtgac gcggccgcag gattacattg ctcaactggc gcgtgcggga 240
gcagatttca tcactctgca tccggaaacc atcaacggcc aggcgttccg cctgattgat 300
gaaatccgcc gtcatgacat gaaagtgggg ctgatcctta acccggagac gccagttgag 360
gccatgaaat actatatcca taaggccgat aaaattacgg tcatgactgt cgatcccggc 420
tttgccggac aaccgttcat tcctgaaatg ctggataaac ttgccgaact gaaggcatgg 480
cgtgaacgag aaggtctgga gtacgaaatt gaggtggacg gttcctgcaa ccaggcaact 540
tacgaaaaac tgatggcggc aggggcggat gtctttatcg tcggcacttc cggcctgttt 600
aatcatgcgg aaaatatcga cgaagcatgg agaattatga ccgcgcagat tctggctgca 660
aaaagcgagg tacagcctca tgcaaaaaca gcataa 696
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccgctcgaga aggagatgaa aatctccccc tcgttaatgt gtatg 45
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ccccatggtt agtggttacg gatgtactca t 31

Claims (3)

1.一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：以E.coli JM109 DE3为底盘宿主菌，敲除果糖特异性PTS转移蛋白基因fruA并过表达果糖非磷酸化转运蛋白基因ptsG-F、果糖激酶基因maK、D-阿洛酮糖-6-磷酸差向异构酶基因alsE和阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶基因a6PP四个基因，建立从D-果糖到D-阿洛酮糖的生物合成途径；进一步敲除D-果糖-6-磷酸激酶基因pfkA和pfkB，实现对D-果糖碳通量的合理调控；再过表达磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因pckA，以提高胞内ATP浓度；最后以D-果糖为底物原料、甘油为碳源供给进行限氧发酵，进而保证D-阿洛酮糖的高效转化；
所述方法具体包括以下步骤：
（1）以E.coli JM109 DE3为底盘宿主菌，利用同源重组技术敲除果糖特异性PTS转移蛋白基因fruA，并过表达果糖非磷酸化转运蛋白基因ptsG-F、果糖激酶基因maK、D-阿洛酮糖-6-磷酸差向异构酶基因alsE和阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶基因a6PP四个基因，得到E.coli-ΔFruAPtsG-FMaKAlsEA6PP菌株；
（2）在菌株E.coli-ΔFruAPtsG-FMaKAlsEA6PP的基础上，利用同源重组技术敲除D-果糖-6-磷酸激酶基因pfkA和pfkB，以阻断D-果糖-6-磷酸转化为D-果糖-1,6-二磷酸，得到E.coli-ΔFruAΔPfkAΔPfkBPtsG-FMaKAlsEA6PP菌株；
（3）在菌株E.coli-ΔFruAΔPfkAΔPfkBPtsG-FMaKAlsEA6PP的基础上，过表达磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因pckA，以实现ATP的胞内循环再生，得到重组大肠杆菌E.coli-ΔFruAΔPfkAΔPfkBPtsG-FMaKAlsEA6PPPckA；
（4）以D-果糖为底物原料，以甘油作为碳源，使用M9基础培养基对菌株E.coli-ΔFruAΔPfkAΔPfkBPtsG-FMaKAlsEA6PPPckA进行限氧发酵，以强化E.coli-ΔFruAΔPfkAΔPfkBPtsG-FMaKAlsEA6PPPckA菌株的ATP生成能力，并提高发酵液中的生物量；
所述步骤（1）具体过程如下：以pKD13质粒为模板，使用引物fruA-F和fruA-R进行PCR扩增，利用电化学转化法将扩增产物转染至含有pKD46质粒的E.coli JM109 DE3中进行重组，完成后使用pcp20质粒敲除抗性标记，得到E.coli-ΔFruA菌株，其中，fruA-F和fruA-R引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；人工合成pETDuet-ptsG-F-maK和pRSFDuet-alsE-a6PP重组表达载体，转染至E.coli-ΔFruA，得到E.coli-ΔFruAPtsG-FMaKAlsEA6PP菌株，其中，ptsG-F、maK、alsE和a6PP的基因序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示；
所述步骤（2）具体过程如下：使用引物pfkA-F/pfkA-R和pfkB-F/pfkB-R按照步骤（1）中的方法敲除E.coli-ΔFruAPtsG-FMaKAlsEA6PP菌株的pfkA和pfkB基因，得到E.coli-ΔFruAΔPfkAΔPfkBPtsG-FMaKAlsEA6PP菌株，其中，pfkA-F和pfkA-R引物序列分别如SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示，pfkB-F和pfkB-R引物序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；
所述步骤（3）具体过程如下：将琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes来源的pckA基因根据大肠杆菌的密码子偏好性进行优化后人工合成，使用引物pckA-F和pckA-R进行扩增，借助Xho I和Avr II两个酶切位点将pckA基因***pRSFDuet-alsE-a6PP重组表达载体，得到重组载体pRSFDuet-alsE-a6PP-pckA，再转染至E.coli-ΔFruAΔPfkAΔPfkBPtsG-FMaKAlsEA6PP，得到重组大肠杆菌E.coli-ΔFruAΔPfkAΔPfkBPtsG-FMaKAlsEA6PPPckA，其中，人工合成的pckA基因序列如SEQ ID NO.11所示，pckA-F和pckA-R引物序列分别如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示。
2.根据权利要求1所述的一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：所述步骤（4）具体过程如下：使用M9基础培养基发酵培养E.coli-ΔFruAΔPfkAΔPfkBPtsG-FMaKAlsEA6PPPckA菌株，向其中加入8g/L甘油作为细胞生长的碳源，加入2.2g/L D-果糖作为D-阿洛酮糖的合成底物，使用0.1mM IPTG诱导蛋白表达，发酵过程中使用胶塞封堵瓶口。
3.如权利要求1所述的一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成D-阿洛酮糖的方法在生产D-阿洛酮糖中的应用。
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