TWI729305B

TWI729305B - 阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、對所述酶進行編碼的核酸、用於生產d-阿洛酮糖的包括所述酶的組成物以及使用所述酶生產d-阿洛酮糖的方法

Info

Publication number: TWI729305B
Application number: TW107126353A
Authority: TW
Inventors: 孫秉三; 趙顯國; 梁成才; 金成俌; 金承煥; 朴炫俊
Original assignee: 南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司
Priority date: 2017-07-31
Filing date: 2018-07-30
Publication date: 2021-06-01
Also published as: US20210355461A1; WO2019027173A3; EP3663397A2; JP6973898B2; CA3071275A1; WO2019027173A2; AU2018310072B2; TW201920667A; EP3663397A4; KR102086494B1; RU2020104267A; JP2020529205A; RU2020104267A3; RU2757229C2; CN111819278A; BR112020001938A2; KR20190013558A; CA3071275C; CN111819278B; AR112587A1

Abstract

本發明是有關於一種包括模體A及模體B的阿洛酮糖-6- 磷酸磷酸酶、對所述酶進行編碼的核酸、用於生產D-阿洛酮糖的包括所述酶的組成物以及使用所述酶生產D-阿洛酮糖的方法。

Description

阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、對所述酶進行編碼的核酸、用於生產D-阿洛酮糖的包括所述酶的組成物以及使用所述酶生產D-阿洛酮糖的方法

本發明是有關於一種新的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、用於生產D-阿洛酮糖的包括所述酶的組成物以及使用所述酶生產D-阿洛酮糖的方法。

D-阿洛酮糖-3-差向異構酶(EC 5.1.3.30)及D-塔格糖-3-差向異構酶(EC 5.1.3.31)被視為催化D-果糖的3-差向異構化以生產D-阿洛酮糖的酶。當藉由使用所述酶的單一酵素反應來生產D-阿洛酮糖時，底物(即，D-果糖)與產物(即，D-阿洛酮糖)之間的反應均衡存在於恆定不變的水平(產物/底物=~20%至35%)下。因此，生產高純度D-阿洛酮糖需要額外的製程來自酵素反應產物分離及移除相對高濃度的D-果糖。

另一方面，詹(Chan)等人(2008年，生物化學(Biochemistry)47：9608-9617)報導了能夠催化D-果糖-6-磷酸及D-阿洛酮糖-6-磷酸的3-差向異構化的自釀膿鏈球菌衍生的D-核酮糖-5-磷酸-3-差向異構酶(EC 5.1.3.1)以及自大腸桿菌衍生的D-阿洛酮糖6-磷酸-3-差向異構酶(EC 5.1.3.-)。然而，該些酶因其耐熱性差而在工業上並不適用。

在該些情況下，本發明人已認真地進行了研究以開發一種在工業規模上以經濟的方式提高D-阿洛酮糖的轉化率的方法。結果，本發明人發現了，在將作為廉價原材料的蔗糖或澱粉(例如，麥芽糖糊精)轉化成D-阿洛酮糖-6-磷酸之後，使用特定於D-阿洛酮糖-6-磷酸並參與不可逆反應途徑的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶能夠藉由利用D-阿洛酮糖生產途徑中所涉及的二或更多種酶進行一鍋酵素轉化(one-pot enzymatic conversion)來生產D-阿洛酮糖，且可顯著地提高向D-阿洛酮糖的轉化率。基於此發現達成了本發明。

本發明的一個目的是提供一種包括模體(motif)A及模體B的新的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶。

本發明的另一目的是提供一種對本文所述的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶進行編碼的核酸以及一種包含所述核酸的轉化體。

本發明的再一目的是提供一種用於生產D-阿洛酮糖的組成物，所述組成物包括肌醇-單-磷酸酶、表達肌醇-單-磷酸酶的微生物或所述微生物的培養物。

本發明的又一目的是提供一種用於生產D-阿洛酮糖的方法，所述方法包括：使肌醇-單-磷酸酶、表達肌醇-單-磷酸酶的微生物或所述微生物的培養物接觸D-阿洛酮糖-6-磷酸，以將D-阿洛酮糖-6-磷酸轉化成D-阿洛酮糖。

本發明提供一種阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶，所述阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶包括由X_a1-X_a2-X_a3-DPLDG-X_a4表示的模體A，其中X_a1為W、F、V、I或A，X_a2為I、F、V、A或間隙，X_a3為V、I或L，且X_a4為T或S；以及由Y_a1-D-Y_a2-W_a1-Y_a3-W_a2-Y_a4-W_a3表示的模體B，其中Y_a1為W、Y、T、L或V，Y_a2為V、I、C、F或A，W_a1為AAG、AAS、SAG、APG、APF、AGG、APL或AGA，Y_a3為W、I、P、M、V、Y、F、R、L、T或S，W_a2為LLV、LIV、LLI、LII、ILI、FIA、ALV、IIA、VLV、VIL、TIG、NFC或PIF，Y_a4為E、R、S、T、L、K或P，且W_a3為EAGG、EGGG、EAKG、KAGG、AAGG、YVDG、EAGA或RLGV。

在本發明的一實施例中，在所述模體A中，X_a1為W或F，X_a2為I或V，X_a3為V或I，且X_a4為T；且在所述模體B中，Y_a1為W，Y_a2為V或I，W_a1為AAG，Y_a3為W、I或V，W_a2為LLV、LIV、LII或LLI，Y_a4為E、R或S，且W_a3為EAGG或EGGG。

在本發明的一實施例中，所述阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶包括以SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及20陳述的胺基酸序列中的任一者，或在以SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及20陳述的序列中與除所述模體A及所述模體B以外的胺基酸序列具有至少85%的同一性的序列。

在本發明的一實施例中，所述阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶是由以SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20陳述的胺基酸序列組成，分別是藉由以SEQ ID NO：21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40陳述的核苷酸序列來編碼。

本發明提供一種核酸，對上述阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶進行編碼。

本發明提供一種生產D-阿洛酮糖的組成物，包括肌醇-單-磷酸酶、表達所述肌醇-單-磷酸酶的微生物或表達所述肌醇-單-磷酸酶的微生物的培養物。

在本發明的一實施例中，肌醇-單-磷酸酶是上述阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶。

在本發明的一實施例中，用於生產D-阿洛酮糖的組成物，更包括：(a)(i)澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合、(ii)磷酸鹽、(iii)D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶、(iv)D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶、(v)磷酸葡萄醣變位酶或葡萄糖激酶及(vi)α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糖糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、α-澱粉酶、普魯蘭酶、異澱粉酶、葡萄糖澱粉酶或蔗糖酶；或(b)表達(a)中的酶的微生物或表達(a)中的酶的微生物的培養物。

本發明提供一種用於生產D-阿洛酮糖的方法，包括使肌醇-單-磷酸酶、表達所述肌醇-單-磷酸酶的微生物或表達所述肌醇-單-磷酸酶的微生物的培養物接觸D-阿洛酮糖-6-磷酸，以將所述D-阿洛酮糖-6-磷酸轉化成D-阿洛酮糖。

在本發明的一實施例中，所述肌醇-單-磷酸酶是上述阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶。

在本發明的一實施例中，用於生產D-阿洛酮糖的方法更包括：在所述將D-阿洛酮糖-6-磷酸轉化成所述D-阿洛酮糖之前，使D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶、表達所述D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶的微生物或表達所述D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶的微生物的培養物接觸D-果糖-6-磷酸，以將所述D-果糖-6-磷酸轉化成所述D-阿洛酮糖-6-磷酸。

在本發明的一實施例中，用於生產D-阿洛酮糖的方法更包括：在將D-果糖-6-磷酸轉化成所述D-阿洛酮糖-6-磷酸之前，使D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶、表達所述D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物或表達所述D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物的培養物接觸D-葡萄糖-6-磷酸，以將所述D-葡萄糖-6-磷酸轉化成所述D-果糖-6-磷酸。

在本發明的一實施例中，用於生產D-阿洛酮糖的方法，更包括：在將所述D-葡萄糖-6-磷酸轉化成所述D-果糖-6-磷酸之前，使磷酸葡萄糖變位酶、表達所述磷酸葡萄糖變位酶的微生物或表達所述磷酸葡萄糖變位酶的微生物的培養物接觸D-葡萄糖-1-磷酸，以將所述D-葡萄糖-1-磷酸轉化成所述D-葡萄糖-6-磷酸。

在本發明的一實施例中，用於生產D-阿洛酮糖的方法，更包括在將所述D-葡萄糖-6-磷酸轉化成所述D-果糖-6-磷酸之前，使葡萄糖激酶、表達所述葡萄糖激酶的微生物或表達所述葡萄糖激酶的微生物的培養物及磷酸鹽接觸葡萄糖，以將所述葡萄糖轉化成所述D-葡萄糖-6-磷酸。

在本發明的一實施例中，用於生產D-阿洛酮糖的方法，更包括：在所述將所述D-葡萄糖-1-磷酸轉化成所述D-葡萄糖-6-磷酸之前，使α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糖糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶、表達磷酸化酶的微生物或表達所述磷酸化酶的微生物的培養物及磷酸鹽接觸澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合，以將所述澱粉、所述麥芽糖糊精、所述蔗糖或其組合轉化成所述D-葡萄糖-1-磷酸。

在本發明的一實施例中，用於生產D-阿洛酮糖的方法，更包括在所述將所述葡萄糖轉化成所述D-葡萄糖-6-磷酸之前，使α-澱粉酶、普魯蘭酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶、表達所述α-澱粉酶、所述普魯蘭酶、所述葡萄糖澱粉酶、所述蔗糖酶或所述異澱粉酶的微生物或表達所述α-澱粉酶、所述普魯蘭酶、所述葡萄糖澱粉酶、所述蔗糖酶或所述異澱粉酶的微生物的培養物接觸澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合，以將所述澱粉、所述麥芽糖糊精、所述蔗糖或其組合轉化成所述葡萄糖。

本發明提供一種用於生產D-阿洛酮糖的方法，包括使以下物質接觸澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合及磷酸鹽：(a)如上述阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶、D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶、磷酸葡萄醣變位酶或葡萄糖激酶以及α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糖糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、α-澱粉酶、普魯蘭酶、異澱粉酶、葡萄糖澱粉酶或蔗糖酶；或(b)表達(a)中的酶的微生物或表達(a)中的酶的微生物的培養物。

在本發明的一實施例中，接觸反應是在5.0至9.0的pH下、在40℃至80℃的溫度下進行及/或進行2小時至24小時。

本發明的新的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶為耐熱肌醇-單-磷酸酶。由於其耐熱性，本發明的酶可參與將D-阿洛酮糖-6-磷酸轉化成D-阿洛酮糖的途徑，以使得能夠在工業規模上生產D-阿洛酮糖。使用根據本發明的酶能夠進行自作為廉價原材料的葡萄糖或澱粉(例如，麥芽糖糊精)合成D-阿洛酮糖的途徑。另外，當使用本發明的酶時，可藉由D-阿洛酮糖-6-磷酸的不可逆去磷酸化來生產D-阿洛酮糖。因此，使用根據本發明的酶會極大地提高向 D-阿洛酮糖的轉化率。

此外，基於使用肌醇-單-磷酸酶的本發明的方法使得能夠以高的轉化率生產高濃度的D-阿洛酮糖、簡化或省略對反應產物的分離及純化。因此，本發明的方法可簡單地實施且自經濟角度看是有利的。

圖1示意性地示出用於自澱粉(例如，麥芽糖糊精)或葡萄糖生產D-阿洛酮糖的酵素反應途徑。

圖2示出在蛋白質電泳分析之後拍攝的大小標記物(M)、所表達的輔酶(S)及經純化的重組酶(E)(pET21a-CJ_Rma、pET21a-CJ_Tle、pET21a-CJ_Mrub、pET21a-CJ_Dtu、pBT7-C-His-CJ_Pfe、pBT7-C-His-CJ_Twi、pBT7-C-His-CJ_Tth、pBT7-C-His-CJ_Tli、pBT7-C-His-CJ_Gst、pBT7-C-His-CJ_Ath、pBT7-C-His-CJ_Sac、pBT7-C-His-CJ_Tta、pBT7-C-His-CJ_Pfu、pBT7-C-His-CJ_Afu、pBT7-C-His-CJ_Aac、pET21a-CJ_Msi、pET21a-CJ_Mruf、pET21a-CJ_Mta、pET21a-CJ_Mch、pET21a-CJ_Mce)的十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠影像，以確定其分子量。

圖3a示出用於去磷酸化的肌醇-單-磷酸酶 (pET21a-CJ_Rma、pET21a-CJ_Tle、pET21a-CJ_Mrub、pET21a-CJ_Dtu、pBT7-C-His-CJ_Pfe、pBT7-C-His-CJ_Twi、pBT7-C-His-CJ_Tth、pBT7-C-His-CJ_Tli、pBT7-C-His-CJ_Gst、pBT7-C-His-CJ_Ath、pBT7-C-His-CJ_Sac、pBT7-C-His-CJ_Tta、pBT7-C-His-CJ_Pfu、pBT7-C-His-CJ_Afu、pBT7-C-His-CJ_Aac)的相對活性(%，左側Y軸，直方圖)以及肌醇-單-磷酸酶在含有D-葡萄糖-6-磷酸、D-葡萄糖-1-磷酸、D-果糖-6-磷酸及D-阿洛酮糖-6-磷酸的去磷酸化混合物中的選擇性去磷酸化率(%，右側Y軸，正方形點)。

圖3b對用於去磷酸化的肌醇-單-磷酸酶(pET21a-CJ_Mrub、pET21a-CJ_Msi、pET21a-CJ_Mruf、pET21a-CJ_Mta、pET21a-CJ_Mch、pET21a-CJ_Mce)的相對活性(%)進行比較。

圖4a示出高效液相層析(high performance liquid chromatography，HPLC)層析圖，以確認藉由利用α-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖變位酶、D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶、4-α-葡聚糖酶、D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶及阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶進行多種酵素反應而自麥芽糖糊精生產D-阿洛酮糖。

圖4b示出根據本發明的HPLC層析圖，以確認藉由在含有D-葡萄糖-1-磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸及D-阿洛酮糖-6-磷酸的反應溶液中在肌醇-單-磷酸酶存在下對D-阿洛酮糖-6-磷酸進行選擇性去磷酸化來生產D-阿洛酮糖。

將參照以下實例詳細解釋本發明。然而，提供該些實例是為了幫助理解本發明而非限制本發明的範圍。

現在將詳細闡述本發明。同時，對本發明中所揭露的態樣及實施例的解釋亦可應用於對其他態樣及實施例的解釋。另外，本發明中所揭露的各種元素的所有組合皆落在本發明的範圍內。此外，認為本發明的範圍不受以下詳細說明限制。

為了達成本發明的以上及其他目的，本發明的一個態樣提供一種阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶，所述阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶包括由X_a1-X_a2-X_a3-DPLDG-X_a4表示的模體A，其中X_a1為W、F、V、I或A，X_a2為I、F、V、A或間隙，X_a3為V、I或L，且X_a4為T或S；以及由Y_a1-D-Y_a2-W_a1-Y_a3-W_a2-Y_a4-W_a3表示的模體B，其中Y_a1為W、Y、T、L或V，Y_a2為V、I、C、F或A，W_a1為AAG、AAS、SAG、APG、APF、AGG、APL或AGA，Y_a3為W、I、P、M、V、Y、F、R、L、T或S，W_a2為LLV、LIV、LLI、LII、ILI、FIA、ALV、IIA、VLV、VIL、TIG、NFC或PIF，Y_a4為E、R、S、T、L、K或P，且W_a3為EAGG、EGGG、EAKG、KAGG、AAGG、YVDG、EAGA或RLGV。

具體而言，在模體A中，X_a1可為W或F，X_a2可為I或V，X_a3可為V或I，且X_a4可為T。具體而言，在模體B中，Y_a1可為W，Y_a2可為V或I，W_a1可為AAG，Y_a3可為W、I或V， W_a2可為LLV、LIV、LII或LLI，Y_a4可為E、R或S，且W_a3可為EAGG或EGGG。

一或多種胺基酸可存在於模體A與模體B之間、模體A的一端或模體B的一端。除模體A及模體B外的胺基酸序列可由已知肌醇-單-磷酸酶的序列(例如，在SEQ ID NO：1至20陳述的序列中除模體A及模體B外的序列)。

模體A及/或模體B是肌醇-單-磷酸酶的序列中的活性位點。模體A及/或模體B亦被視為作為酶的底物的磷酸肌醇的結合位點(參見歐洲生物化學協會聯合會，第294卷，第1、2期，第16至18頁，1991年12月)。本發明人發現了肌醇-單-磷酸酶表現出阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶活性。本發明人亦發現了肌醇-單-磷酸酶的模體A及/或模體B可為磷酸酶的底物結合位點。

阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶可包括例如以SEQ ID NO：1至20陳述的胺基酸序列中的任一者。

本發明的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶可為具有已知肌醇-單-磷酸酶的功能的酶。

本發明的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶更選擇性地催化D-阿洛酮糖-6-磷酸的去磷酸化，且可對D-葡萄糖-1-磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸或D-果糖-6-磷酸具有非特異性。

本發明的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶可藉由以下方式來生產：利用酶本身或表達酶的去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)(例如，SEQ ID NO：21至40)對菌株進行轉化、對經轉化的菌株進行培養、破壞培養物、然後進行純化。純化可例如藉由管柱層析法來執行。菌株可包括但不限於屬於棒狀桿菌屬、麯黴屬、桿菌屬、埃希氏菌屬或沙雷氏菌屬的微生物的細胞。具體而言，寄主細胞可為大腸桿菌(Escherichia coli)、麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、米麯黴(Aspergillus oryzae)或枯草桿菌(Bacillus subtilis)。更具體而言，所述菌株可為大腸桿菌BL21，其被視為用於高水平重組蛋白生產的菌株且亦為市售的。任何市售的菌株可用於生產本發明的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶，但並非僅限於此。在生產阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶時所需要的轉化方法、培養方法或純化方法是此項技術中已知的，且因此熟習此項技術者可利用已知的方法來生產阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶，而無需任何詳細資訊。舉例而言，轉化方法可依據寄主細胞的類型藉由此項技術中已知的合適的標準技術來實施。此類轉化方法的實例包括但不限於電穿孔、磷酸鈣(CaPO₄)沈澱、氯化鈣(CaCl₂)沈澱、逆轉錄病毒感染、顯微注射、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)方法、二乙胺乙基(diethylamineethyl，DEAE)-聚葡糖方法、陽離子脂質體方法及乙酸鋰-二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO)方法。培養視需要隨著攪拌培養物可在25℃至40℃、尤其是30℃至38℃的條件下進行一小時至24小時。

根據本發明的一個實施例，本發明的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶可包括與模體A及/或模體B的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%的同源性、相似性或同一性且表現出阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶活性的酶。作為另一選擇，本發明的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶可為與除模體A及/或模體B外的序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%的同源性、相似性或同一性。在一個實施例中，本發明的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶可包括由以下序列組成的蛋白質：所述蛋白質與以SEQ ID NO：1至20陳述的序列中的模體A及/或模體B的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%的同源性、相似性或同一性，且與以SEQ ID NOS：1至20陳述的序列中除模體A及/或模體B外的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%的同源性、相似性或同一性，或具有處於由上述值中的任何兩者界定的範圍內的同源性、相似性或同一性。舉例而言，具有以上所界定的同源性、相似性或同一性且表現出與阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶蛋白質(例如，由以SEQ ID NO：1至20陳述的序列中的任一者組成的蛋白質)的效力對應的效力並且進行部分刪除、修改、取代或添加的任何胺基酸序列亦處於本發明的範圍內。

其中在模體A及模體B的序列的上游及下游添加無關序列的蛋白質處於本發明的範圍內，且不會自本發明的範圍排除蛋白質的自然發生的突變或沉默突變(silent mutation)，只要所述蛋白質具有與包括模體A及模體B的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶的活性對應的活性即可。具體而言，不會自本發明的範圍排除在以SEQ ID NO：1至20陳述的胺基酸序列中的任一者的上游及下游添加無關序列的蛋白質、其自然發生的突變及沉默突變，只要所述蛋白質具有與包括模體A及模體B的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶的活性對應的活性即可。包括模體A及模體B的蛋白質或包括以SEQ ID NO：1至20陳述的胺基酸序列的蛋白質亦處於本發明的範圍內，只要所述蛋白質具有與包括模體A及模體B的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶的活性對應的活性即可。

本發明的另一態樣提供一種對阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶進行編碼的核酸。

本文所使用的用語「核酸」囊括DNA分子及核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)分子，且作為核酸的基本單元的核苷酸包括天然核苷酸及具有經改質糖或鹼基的類似物(參見夏伊(Scheit)的核苷酸類似物(Nucleotide Analogs)，紐約州約翰威利出版社(John Wiley,New York)(1980)；阿爾曼及佩伊曼(Uhlman and Peyman)，化學評論，90：543-584(1990年))。

具體而言，對阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶進行編碼的核酸可包括包含可被轉譯成模體A及模體B的核苷酸的序列。在一個實施例中，本發明的核酸可由以SEQ ID NO：21至40陳述的核苷酸序列中的任一者組成。更具體而言，本發明的核酸可包括與可被轉譯成模體A及模體B且可在轉譯之後表現出期望的酶活性的核苷酸具有至少90%、至少95%、至少99%或100%的同源性、相似性或同一性的核酸。具體而言，本發明的核酸可包括與在以SEQ ID NO：21至40陳述的序列中可被轉譯成模體A及模體B的核苷酸具有至少90%、至少95%、至少99%或100%的同源性、相似性或同一性的核酸。作為另一選擇，本發明的核酸可為與在以SEQ ID NO：21至40陳述的序列中可被轉譯成除模體A及模體B外的模體的核苷酸具有至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%的同源性、相似性或同一性的核酸。以下亦處於本發明的範圍內：可因密碼子簡併性(codon degeneracy)而被轉譯成包括模體A及模體B的蛋白質的蛋白質，尤其是由以SEQ ID NO：1至20陳述的胺基酸序列中的任一者組成的蛋白質或可被轉譯成與由以SEQ ID NO：1至20陳述的胺基酸序列中的任一者組成的蛋白質具有同源性、相似性或同一性的蛋白質的多核苷酸。

根據本發明的包括模體A及模體B的酶可自耐熱或嗜熱菌株衍生出。具體而言，由以SEQ ID NO：1至20陳述的胺基酸序列中的任一者組成的酶可為自以下衍生的酶：海洋紅嗜熱鹽菌(Rhodothermus marinus)、萊廷格熱袍菌(Thermotoga lettingae)、紅色亞棲熱菌(Meiothermus ruber)、嗜熱圓錐網團菌(Dictyoglomus turgidum)、鐵還原熱棒菌(Pyrobaculum ferrireducens)、威吉利熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter wiegelii)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)、海濱棲熱高溫球菌(Thermococcus litoralis)、嗜熱脂肪土芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)、四膜蟲厭氧繩菌(Anaerolinea thermophila)、酸熱硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius)、塔卡伊熱硫化物桿菌 (Thermosulfidibacter takaii)、強烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、酸熱脂環酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、西爾瓦諾斯亞棲熱菌(Meiothermus silvanus)、魯弗斯亞棲熱菌(Meiothermus rufus)、台灣本土亞棲熱菌(Meiothermus taiwanensis)、克裡羅費魯斯亞棲熱菌(Meiothermus chliarophilus)或刻耳柏洛斯亞棲熱菌(Meiothermus cerbereus)。

本文所使用的用語「同源性」或「同一性」指示兩種給定胺基酸序列或核苷酸序列之間的關聯程度，其可表達為百分比。

用語「同源性」及「同一性」常互換使用。

保守的多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性是藉由標準對齊演算法來確定，且可與由所使用的程式建立的缺設間隙罰分(default gap penalty)一起使用。實質上，同源序列或相同序列通常將在中等嚴格條件下或高嚴格條件下一直沿著所關注的多核苷酸或多肽的整個長度的至少約50%、60%、70%、80%或90%進行雜交。亦設想到在對多核苷酸進行雜交時含有簡併密碼子來代替密碼子的多核苷酸。

任何兩種多核苷酸或多肽序列是否為同源的、相似的或相同的可利用例如「法斯塔(FASTA)」程式等已知的電腦演算法使用例如如在皮爾森(Pearson)等人(1988年)的美國國家科學院院刊85：2444中一樣的缺設參數來確定。作為另一選擇，序列同源性、相似性或同一性可利用在版本5.0.0或更新版本的 EMBOSS程式包(EMBOSS：歐洲分子生物學開放軟體套組(European Molecular Biology Open Software Suite)，裡斯(Rice)等人，2000年，遺傳學趨勢16：276-277)的尼德(Needle)程式中實施的尼德曼-翁施演算法(Needleman-Wunsch algorithm)(尼德曼及翁施，1970年，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)48：443-453)來確定。其他程式包括GCG程式包(德弗羅J.(Devereux,J.)等人的核酸研究12：387(1984年))、布萊斯特(BLASTP)、布萊斯汀(BLASTN)、FASTA(阿提斯庫爾(Atschul)[S.][F.][等人的分子生物學雜誌215]：403(1990年)；巨型電腦指南(Guide to Huge Computers)，馬丁J.(Martin J.)主教，[ED.]學術出版社，聖地亞哥，1994年及[卡裡洛(CARILLO)等人](1988年)工業及應用數學學會(Society for Industrial and Applied Mathematics，SIAM)應用數學雜誌48：1073)。舉例而言，可使用國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)資料庫的BLAST工具來確定同源性、相似性或同一性。亦可使用其他市售程式或公開可用的程式，例如克拉斯特瓦(ClustalW)。

多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性百分比可例如藉由使用間隙分析程式(GAP)電腦程式(例如，尼德曼等人，(1970年)，分子生物學雜誌48：443，由史密斯及沃特曼校訂，高等應用數學(1981年)2：482)對序列資訊進行比較來確定。簡言之，GAP程式將相似性定義為相似的經對齊符號(即，核苷酸或胺基酸)的數目除以所述兩種序列中的較短序列中的符號的總數目。GAP程式的缺設參數可包括：(1)哥博斯科夫(Gribskov)等人(1986年)核酸研究14：6745的一元比較矩陣(包含對於同一性為1且對於非同一性為0的值)以及加權比較矩陣，如由編者施瓦茨(Schwartz)及戴霍夫(Dayhoff)所述，蛋白質序列及結構圖集，國家生物學研究基金會，第353至358頁(1979年)；(2)對於每一間隙為3.0的罰分及對於每一間隙中的每一符號的額外的0.10的罰分(或間隙開放罰分10.0，間隙延伸罰分0.5)；以及(3)對於端隙無罰分。因此，本文所使用的用語「同源性」或「同一性」指示多肽或多核苷酸之間的比較。

本發明的再一態樣提供一種包含對本文所述的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶進行編碼的核酸的載體或包含對阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶進行編碼的核酸的轉化體或者包含對阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶進行編碼的核酸的載體。

本文所使用的用語「載體」是指用於將鹼基選殖及/或轉殖至寄主細胞內的任何載體。載體可為可附連另一DNA片段以引起對所附連片段的複製的複製子。「複製子」是指充當在活體內進行DNA複製的自主單元、即能夠在其自身控制下進行複製的任何遺傳因子(genetic element)(例如，質體、噬菌體、黏接質體、染色體或病毒)。用語「載體」可包括用於在試管內、活體外或活體內將鹼基引入至寄主細胞內的病毒性載體及非病毒性載體二者。用語「載體」亦可包括微環DNA。具體而言，包含根據本發明的對阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶進行編碼的核酸的載體可為 pET21a-CJ_Rma、pET21a-CJ_Tle、pET21a-CJ_Mrub、pET21a-CJ_Dtu、pET21a-CJ_Msi、pET21a-CJ_Mruf、pET21a-CJ_Mta、pET21a-CJ_Mch、pET21a-CJ_Mce、pBT7-C-His-CJ_Pfe、pBT7-C-His-CJ_Twi、pBT7-C-His-CJ_Tth、pBT7-C-His-CJ_Tli、pBT7-C-His-CJ_Gst、pBT7-C-His-CJ_Ath、pBT7-C-His-CJ_Sac、pBT7-C-His-CJ_Tta、pBT7-C-His-CJ_Pfu、pBT7-C-His-CJ_Afu或pBT7-C-His-CJ_Aac。

本文所使用的用語「轉化」是指將包含對靶蛋白質進行編碼的核酸的載體引入至寄主細胞內，以在寄主細胞內表達由核酸編碼的蛋白質。經轉化的核酸可***並位於寄主細胞的染色體內或者可存在於染色體外，只要可在寄主細胞內表達經轉化的核酸即可。核酸包括對靶蛋白質進行編碼的DNA及RNA。核酸可以任何形式被引入，只要核酸可被引入寄主細胞內並在寄主細胞內得到表達即可。舉例而言，核酸可以表達盒(expression cassette)(其為包括核酸自主表達所需要的所有元素的基因構建體)形式被引入至寄主細胞內，但其形式並非僅限於此。通常，表達盒包括可操作地連接至核酸的啟動子(promoter)、轉錄終止訊號、核糖體結合域及轉譯終止訊號。表達盒可呈可自複製的表達載體形式。核酸本身可被引入至寄主細胞內且可操作地連接至在寄主細胞中進行表達所需要的序列。

本文所使用的用語「可操作地連接」是指起始並介導本發明的對靶蛋白質進行編碼的核酸的轉錄的啟動子序列與基因序列之間的功能性連接。

對本發明中所提及的胺基酸使用以下縮寫及名稱。

可利用將核酸引入至細胞內的任何轉化方法。轉化方法可依據寄主細胞的類型而藉由此項技術中已知的合適的標準技術來進行。此類轉化方法的實例包括但不限於電穿孔、磷酸鈣(CaPO₄)沈澱、氯化鈣(CaCl₂)沈澱、逆轉錄病毒感染、顯微注射、聚乙二醇(PEG)方法、DEAE-聚葡糖方法、陽離子脂質體方法及乙酸鋰-DMSO方法。

寄主細胞較佳為高效地引入DNA且以高水平來表達所引入的DNA的寄主細胞。寄主細胞的實例包括但不限於屬於棒狀桿菌屬、麯黴屬、桿菌屬、埃希氏菌屬或沙雷氏菌屬的微生物的細胞。具體而言，寄主細胞可為大腸桿菌、麩胺酸棒狀桿菌、米麯黴或枯草桿菌。更具體而言，上述菌株可為大腸桿菌BL21，其被視為用於高水平重組蛋白生產的菌株且亦為市售的。任何市售的菌株可用於生產本發明的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶，但並非僅限於此。

本發明的轉化體可為大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Rma(大腸桿菌_P1_CJ_Rma)、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Tle(大腸桿菌_P2_CJ_Tle)、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mrub(大腸桿菌_P3_CJ_Mrub)、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Dtu(大腸桿菌_P4_CJ_Dtu)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfe(大腸桿菌_P5_CJ_Pfe)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Twi(大腸桿菌_P6_CJ_Twi)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tth(大腸桿菌_P7_CJ_Tth)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tli(大腸桿菌_P8_CJ_Tli)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Gst(大腸桿菌_P9_CJ_Gst)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Ath(大腸桿菌_P10_CJ_Ath)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Sac(大腸桿菌_P11_CJ_Sac)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tta(大腸桿菌_P12_CJ_Tta)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfu(大腸桿菌_P13_CJ_Pfu)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Afu(大腸桿菌_P14_CJ_Afu)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Aac (大腸桿菌_P15_CJ_Aac)、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Msi(大腸桿菌_P16_CJ_Msi)、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mruf(大腸桿菌_P17_CJ_Mruf)、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mta(大腸桿菌_P18_CJ_Mta)、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mch(大腸桿菌_P19_CJ_Mch)或大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mce(大腸桿菌_P20_CJ_Mce)。

本發明的另一態樣提供一種用於生產D-阿洛酮糖的組成物，所述組成物包括肌醇-單-磷酸酶、表達肌醇-單-磷酸酶的微生物或表達肌醇-單-磷酸酶的微生物的培養物。

本發明的肌醇-單-磷酸酶可包括由X_a1-X_a2-X_a3-DPLDG-X_a4表示的模體A，其中X_a1為W、F、V、I或A，X_a2為I、F、V、A或間隙，X_a3為V、I或L，且X_a4為T或S；以及由Y_a1-D-Y_a2-W_a1-Y_a3-W_a2-Y_a4-W_a3表示的模體B，其中Y_a1為W、Y、T、L或V，Y_a2為V、I、C、F或A，W_a1為AAG、AAS、SAG、APG、APF、AGG、APL或AGA，Y_a3為W、I、P、M、V、Y、F、R、L、T或S，W_a2為LLV、LIV、LLI、LII、ILI、FIA、ALV、IIA、VLV、VIL、TIG、NFC或PIF，Y_a4為E、R、S、T、L、K或P，且W_a3為EAGG、EGGG、EAKG、KAGG、AAGG、YVDG、EAGA或RLGV。亦即，肌醇-單-磷酸酶可與阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶互換使用。因此，阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶的解釋可應用於肌醇-單-磷酸酶。在一個實施例中，肌醇-單-磷酸酶可為由以SEQ ID NO：1至20陳述的胺基酸序列中的任一者組成的酶。

本發明的組成物可更包括D-阿洛酮糖生產途徑中所涉及的酶及/或底物(參見圖1)[(i)澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合；(ii)磷酸鹽；(iii)D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶；(iv)D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶；(v)磷酸葡萄醣變位酶或葡萄糖激酶；及/或(vi)α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糖糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、α-澱粉酶、普魯蘭酶、異澱粉酶、葡萄糖澱粉酶或蔗糖酶]；表達D-阿洛酮糖生產途徑中所涉及的酶的微生物；或表達D-阿洛酮糖生產途徑中所涉及的酶的微生物的培養物。其他酶及底物僅為說明性的而不受限制，只要D-阿洛酮糖可使用本發明的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶生產即可。

澱粉/麥芽糖糊精磷酸化酶(EC 2.4.1.1)及α-葡聚糖磷酸化酶可包括在磷醯基轉移至葡萄糖時呈活性以自澱粉或麥芽糖糊精生產D-葡萄糖-1-磷酸的任何蛋白質。具體而言，在自澱粉或麥芽糖糊精生產D-葡萄糖-1-磷酸時呈活性的蛋白質可由以SEQ ID NO：59陳述的胺基酸序列組成。在自澱粉或麥芽糖糊精生產D-葡萄糖-1-磷酸時呈活性的蛋白質可藉由以SEQ ID NO：60陳述的序列進行編碼。

蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7)可包括在磷醯基轉移至葡萄糖時呈活性以自蔗糖生產D-葡萄糖-1-磷酸的任何蛋白質。

α-澱粉酶(EC 3.2.1.1)、普魯蘭酶(EC 3.2.1.41)、葡萄糖澱粉酶(EC 3.2.1.3)及異澱粉酶是澱粉液化酶，且可包括在將澱粉或麥芽糖糊精轉化成葡萄糖時呈活性的任何蛋白質。

蔗糖酶(EC 3.2.1.26)可包括在將蔗糖酶轉化成葡萄糖時呈活性的任何蛋白質。

磷酸葡萄糖變位酶(EC 5.4.2.2)可包括在將D-葡萄糖-1-磷酸轉化成D-葡萄糖-6-磷酸時呈活性的任何蛋白質。具體而言，在將D-葡萄糖-1-磷酸轉化成D-葡萄糖-6-磷酸時呈活性的蛋白質可包括以SEQ ID NO：61陳述的胺基酸序列。在將D-葡萄糖-1-磷酸轉化成D-葡萄糖-6-磷酸時呈活性的蛋白質可藉由以SEQ ID NO：62陳述的序列進行編碼。

葡萄糖激酶可包括在磷醯基至葡萄糖時呈活性以將葡萄糖轉化成D-葡萄糖-6-磷酸的任何蛋白質。具體而言，葡萄糖激酶可為多磷酸鹽相依性葡萄糖激酶。更具體而言，葡萄糖激酶可為由以SEQ ID NO：77或78陳述的胺基酸序列組成的蛋白質。D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶可包括在將D-葡萄糖-6-磷酸轉化成D-果糖-6-磷酸時呈活性的任何蛋白質。具體而言，D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶可為包括以SEQ ID NO：63陳述的胺基酸序列的蛋白質。D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶可藉由以SEQ ID NO：64陳述的序列進行編碼。

D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶可包括在將D-果糖-6-磷酸轉化成D-阿洛酮糖-6-磷酸時呈活性的任何蛋白質。具體而言，D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶可為包括以SEQ ID NO：65陳述的胺基酸序列的蛋白質。D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶可藉由以SEQ ID NO：66陳述的序列進行編碼。

根據本發明的用於D-阿洛酮糖生產的組成物可更包括在將葡萄糖轉化成澱粉、麥芽糖糊精或蔗糖時呈活性的蛋白質。蛋白質可為例如4-α-葡聚糖轉移酶。在將葡萄糖轉化成澱粉、麥芽糖糊精或蔗糖時呈活性的蛋白質可為包括以SEQ ID NO：67陳述的胺基酸序列的酶。具體而言，在將葡萄糖轉化成澱粉、麥芽糖糊精或蔗糖時呈活性的蛋白質可藉由以SEQ ID NO：68陳述的核苷酸序列進行編碼。根據本發明的用於D-阿洛酮糖生產的組成物可更包括此項技術中已知的任何合適的賦形劑。此類賦形劑的實例包括但不限於防腐劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、緩衝劑、穩定劑或等滲劑。

根據本發明的用於D阿洛酮糖生產的組成物可更包括金屬離子或金屬鹽。在一個實施例中，金屬離子可為二價金屬陽離子。具體而言，金屬離子可選自由Ni離子、Mg離子、Co離子、Mn離子、Fe離子及Zn離子組成的群組。更具體而言，根據本發明的用於D-阿洛酮糖生產的組成物可更包括金屬鹽。再更具體而言，金屬鹽可選自由NiSO₄、MgSO₄、MgCl₂、NiCl₂、CoSO₄、CoCl₂、MnCl₂、FeSO₄、ZnSO₄及其混合物組成的群組。

本發明的另一態樣提供一種用於生產D-阿洛酮糖的方法，所述方法包括：使肌醇-單-磷酸酶、表達此酶的微生物或所述微生物的培養物接觸D-阿洛酮糖-6-磷酸以將D-阿洛酮糖-6-磷酸轉化成D-阿洛酮糖。

肌醇-單-磷酸酶可包括由X_a1-X_a2-X_a3-DPLDG-X_a4表示的模體A及由Y_a1-D-Y_a2-W_a1-Y_a3-W_a2-Y_a4-W_a3表示的模體B。本文中，肌醇-單-磷酸酶可與阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶互換使用。

本發明的方法可更包括：在將D-阿洛酮糖-6-磷酸轉化成D-阿洛酮糖之前，使D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶、表達D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶的微生物或表達D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶的微生物的培養物接觸D-果糖-6-磷酸以將D-果糖-6-磷酸轉化成D-阿洛酮糖-6-磷酸。

本發明的方法可更包括：在將D-果糖-6-磷酸轉化成D-阿洛酮糖-6-磷酸之前，使D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶、表達D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物或表達D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物的培養物接觸D-葡萄糖-6-磷酸以將D-葡萄糖-6-磷酸轉化成D-果糖-6-磷酸。

本發明的方法可更包括：在將D-葡萄糖-6-磷酸轉化成D-果糖-6-磷酸之前，使磷酸葡萄糖變位酶、表達磷酸葡萄糖變位酶的微生物或表達磷酸葡萄糖變位酶的微生物的培養物接觸D-葡萄糖-1-磷酸以將D-葡萄糖-1-磷酸轉化成D-葡萄糖-6-磷酸。

本發明的方法可更包括：在將D-葡萄糖-6-磷酸轉化成D-果糖-6-磷酸之前，使葡萄糖激酶、表達葡萄糖激酶的微生物或表達葡萄糖激酶的微生物的培養物及磷酸鹽接觸葡萄糖以將葡萄糖轉化成D-葡萄糖-6-磷酸。

本發明的方法可更包括：在將D-葡萄糖-1-磷酸轉化成D-葡萄糖-6-磷酸之前，使α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糖糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶、表達上述磷酸化酶的微生物或表達上述磷酸化酶的微生物的培養物及磷酸鹽接觸澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合以將澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合轉化成D-葡萄糖-1-磷酸。

本發明的方法可更包括：在將葡萄糖轉化成D-葡萄糖-6-磷酸之前，使α-澱粉酶、普魯蘭酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶、表達α-澱粉酶、普魯蘭酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶的微生物或者表達α-澱粉酶、普魯蘭酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶的微生物的培養物接觸澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合以將澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合轉化成葡萄糖。

本發明的又一態樣提供一種用於生產D-阿洛酮糖的方法，所述方法包括：使以下物質接觸澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合及磷酸鹽：(a)肌醇-單-磷酸酶、D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶、D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶、磷酸葡萄醣變位酶或葡萄糖激酶以及α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糖糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、α-澱粉酶、普魯蘭酶、異澱粉酶、葡萄糖澱粉酶或蔗糖酶或者(b)表達上述酶(a)的微生物或所述微生物的培養物。

在本發明的方法中，接觸反應可在5.0至9.0的pH、尤其是6.0至8.0的pH下進行。

在本發明的方法中，接觸反應可在40℃至80℃的溫度、尤其是40℃至60℃或50℃至60℃的溫度下進行。

在本發明的方法中，接觸反應可進行2小時至24小時、尤其是6小時至24小時。

在本發明的方法中，接觸反應可在5.0至9.0的pH下、在40℃至80℃的溫度下進行及/或進行2小時至24小時。具體而言，接觸反應可在6.0至8.0的pH下、在40℃至60℃或50℃至60℃的溫度下進行及/或進行6小時至24小時。

本發明的方法可更包括：對反應產物D-阿洛酮糖進行純化。D-阿洛酮糖的純化方法無特別限定。可藉由此項技術中已知的任何合適的方法對D-阿洛酮糖進行純化。此類純化方法的非限制性實例包括可單獨進行或以組合方式進行的層析、分段結晶(fractional crystallization)及離子純化。舉例而言，D-阿洛酮糖可藉由層析進行純化。在此種情形中，可基於醣類與附連至離子樹脂的金屬離子之間的結合力的小的差異來分離靶醣類。

根據本發明的方法中的每一種可更包括在純化步驟之前或之後進行漂白及/或除礦物質處理。漂白及/或除礦物質處理使得D-阿洛酮糖更純且無雜質。

實例

實例1：生產肌醇-單-磷酸酶的重組表達載體及經轉化微生物

為了提供D-阿洛酮糖生產途徑所需要的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶，篩選出耐熱肌醇-單-磷酸酶基因。具體而言，自基因庫中登記的以下者的基因組序列篩選出肌醇-單-磷酸酶基因(Rma、 Tle、Mrub、Dtu、Msi、Mruf、Mta、Mch及Mce)：海洋紅嗜熱鹽菌、萊廷格熱袍菌、紅色亞棲熱菌、嗜熱圓錐網團菌、鐵還原熱棒菌、威吉利熱厭氧桿菌、嗜熱棲熱菌、海濱棲熱高溫球菌、嗜熱脂肪土芽孢桿菌、四膜蟲厭氧繩菌、酸熱硫化葉菌、塔卡伊熱硫化物桿菌、強烈火球菌、閃爍古生球菌、酸熱脂環酸芽孢桿菌、西爾瓦諾斯亞棲熱菌、魯弗斯亞棲熱菌、台灣本土亞棲熱菌、克裡羅費魯斯亞棲熱菌或刻耳柏洛斯亞棲熱菌。

基於關於所篩選基因的核苷酸序列(按照基因的次序，SEQ ID NO：21、22、23、24、36、37、38、39及40)以及胺基酸序列(按照基因的次序，SEQ ID NO：1、2、3、4、16、17、18、19及20)的資訊，設計出正向引子(SEQ ID NO：41、43、45、47、49、51、53、55及57)及反向引子(SEQ ID NO：42、44、46、48、50、52、54、56及58)。藉由使用經合成引子的聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)自海洋紅嗜熱鹽菌、萊廷格熱袍菌、紅色亞棲熱菌、嗜熱圓錐網團菌、西爾瓦諾斯亞棲熱菌、魯弗斯亞棲熱菌、台灣本土亞棲熱菌、克裡羅費魯斯亞棲熱菌及刻耳柏洛斯亞棲熱菌的基因組DNA擴增上述基因。使用限制酶NdeI及XhoI或SalI將經擴增的肌醇-單-磷酸酶基因***用於大腸桿菌表達的質體載體pET21a(諾瓦金(Novagen))內，以構建重組表達載體，所述重組表達載體被命名為pET21a-CJ_Rma(Nde I/Xho I)、pET21a-CJ_Tle(Nde I/Xho I)、pET21a-CJ_Mrub(Nde I/Xho I)、pET21a-CJ_Dtu(Nde I/Xho I)、pET21a-CJ_Msi (Nde I/Sal I)、pET21a-CJ_Mruf(Nde I/Sal I)、pET21a-CJ_Mta(Nde I/Sal I)、pET21a-CJ_Mch(Nde I/Sal I)及pET21a-CJ_Mce(Nde I/Sal I)。

另外，篩選出自以下衍生的肌醇-單-磷酸酶基因(Pfe、Twi、Tth、Tli、Gst、Ath、Sac、Tta、Pfu、Afu及Aac)：鐵還原熱棒菌、威吉利熱厭氧桿菌、嗜熱棲熱菌、海濱棲熱高溫球菌、嗜熱脂肪土芽孢桿菌、四膜蟲厭氧繩菌、酸熱硫化葉菌、塔卡伊熱硫化物桿菌、強烈火球菌、閃爍古生球菌及酸熱脂環酸芽孢桿菌。基於關於所篩選基因的核苷酸序列(按照基因的次序，SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34及35)以及胺基酸序列(按照基因的次序，SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14及15)的資訊，向比昂公司(Bioneer)(韓國(Korea))請求進行DNA合成。將DNA***載體pBT7-C-His(比昂公司)內以構建重組表達載體，所述重組表達載體被命名為pBT7-C-His-CJ_Pfe、pBT7-C-His-CJ_Twi、pBT7-C-His-CJ_Tth、pBT7-C-His-CJ_Tli、pBT7-C-His-CJ_Gst、pBT7-C-His-CJ_Ath、pBT7-C-His-CJ_Sac、pBT7-C-His-CJ_Tta、pBT7-C-His-CJ_Pfu、pBT7-C-His-CJ_Afu及pBT7-C-His-CJ_Aac。

藉由一般轉化技術(參見薩姆布魯克(Sambrook)等入，1989年)將表達載體轉化成菌株大腸桿菌BL21(DE3)以生產經轉化微生物，所述經轉化微生物被命名為大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Rma(大腸桿菌_P1_CJ_Rma)、大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Tle(大腸桿菌_P2_CJ_Tle)、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mrub(大腸桿菌_P3_CJ_Mrub)、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Dtu(大腸桿菌_P4_CJ_Dtu)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfe(大腸桿菌_P5_CJ_Pfe)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Twi(大腸桿菌_P6_CJ_Twi)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tth(大腸桿菌_P7_CJ_Tth)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tli(大腸桿菌_P8_CJ_Tli)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Gst(大腸桿菌_P9_CJ_Gst)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Ath(大腸桿菌_P10_CJ_Ath)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Sae(大腸桿菌_P11_CJ_Sac)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tta(大腸桿菌_P12_CJ_Tta)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfu(大腸桿菌_P13_CJ_Pfu)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Afu(大腸桿菌_P14_CJ_Afu)、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Aac(大腸桿菌_P15_CJ_Aac)、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Msi(大腸桿菌_P16_CJ_Msi)、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mruf(大腸桿菌_P17_CJ_Mruf)、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mta(大腸桿菌_P18_CJ_Mta)、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mch(大腸桿菌_P19_CJ_Mch)及大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mce(大腸桿菌_P20_CJ_Mce)。

實例2：生產用於D-阿洛酮糖生產途徑所需要的酶

為了提供自新阿波羅棲熱袍菌衍生的α-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖激酶、D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶及D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶作為用於D-阿洛酮糖生產途徑所需要的酶，篩選出與所述酶對應的基因(按照酶的次序，ct1、ct2、tn1及fp3e)。

基於所篩選基因的核苷酸序列(按照酶的次序，SEQ ID NO：60、62、64及66)及胺基酸序列(按照酶的次序，SEQ ID NO：59、61、63及65)，設計出正向引子(SEQ ID NO：69、71、73及75)及反向引子(SEQ ID NO：70、72、74及76)。藉由使用所述引子的聚合酶鏈反應(PCR)自作為模板的新阿波羅棲熱袍菌的基因組DNA擴增酶基因。利用以下條件將PCR執行了總計25個循環：在95℃下變性30秒、在55℃下黏合30秒以及在68℃下聚合2分鐘。使用限制酶NdeI及XhoI將經擴增的酶基因***用於大腸桿菌表達的質體載體pET21a(諾瓦金)內以構建重組表達載體，所述重組表達載體被命名為pET21a-CJ_ct1、pET21a-CJ_ct2、pET21a-CJ_tn1及pET21a-CJ_fp3e。藉由一般轉化技術(參見薩姆布魯克等人，1989年)將重組表達載體轉化成菌株大腸桿菌BL21(DE3)以生產經轉化微生物，所述經轉化微生物被命名為大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1及大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_tn_fp3e。

實例3：生產重組酶

在此實例中，生產了重組酶。首先，利用在實例1及實例2中生產的經轉化微生物中的每一者對含有5毫升盧利亞-貝爾塔尼(Luria-Bertani，LB)液體培養基的培養管進行了接種。將接種體在37℃下在搖床恒溫箱中進行了培養，直至達到在600奈米下為2.0的吸光度。將培養肉湯添加至培養燒瓶中的LB液體培養基中，然後進行了主要培養。當培養物在600奈米下的吸光度達到2.0時，添加了1毫莫耳異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)以誘導重組酶的表達及生產。隨著在180轉/分鐘下進行攪拌將培養溫度維持在37℃下。將培養肉湯在8,000×g及4℃下離心分離了20分鐘以收集細菌細胞。利用50毫莫耳Tris-HCl緩衝劑(pH為8.0)將所收集的細菌細胞洗滌了兩次並在同一緩衝劑中進行了懸浮。然後，使用超音波均質器對細胞進行了破壞。將細胞溶解產物在13,000×g及4℃下離心分離了20分鐘。藉由組胺酸標籤親和層析法(His-tag affinity chromatography)自上清液對重組酶進行了純化。藉由50毫莫耳Tris-HCl緩衝劑(pH為8.0)對經純化的重組酶進行了透析，然後用於隨後的反應。藉由SDS-PAGE確定了經純化重組酶的分子量。

使用經轉化微生物生產的經純化酶的名稱及分子量如下(圖2)：30.3kDa自大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Rma(大腸桿菌_P1_CJ_Rma)生產的酶(RMA)；28.5kDa自大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Tle(大腸桿菌_P2_CJ_Tle)生產的酶(TLE)； 28kDa自大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mrub(大腸桿菌_P3_CJ_Mrub)生產的酶(MRUB)；30.2kDa自大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Dtu(大腸桿菌_P4_CJ_Dtu)生產的酶(DTU)；27.2kDa自大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfe(大腸桿菌i_P5_CJ_Pfe)生產的酶(PFE)；28.8kDa自大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Twi(大腸桿菌_P6_CJ_Twi)生產的酶(TWI)；28.6kDa自大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tth(大腸桿菌_P7_CJ_Tth)生產的酶(TTH)；28kDa自大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tli(大腸桿菌_P8_CJ_Tli)生產的酶(TLI)；29.6kDa自大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Gst(大腸桿菌_P9_CJ_Gst)生產的酶(GST)；28.7kDa自大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Ath(大腸桿菌_P10_CJ_Ath)生產的酶(ATH)；29.9kDa自大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Sac(大腸桿菌_P11_CJ_Sac)生產的酶(SAC)；28.6kDa自大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tta(大腸桿菌_P12-CJ_Tta)生產的酶(TTA)；27.9kDa自大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfu(大腸桿菌_P13_CJ_Pfu)生產的酶(PFU)； 28kDa自大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Afu(大腸桿菌_P14-CJ_Afu)生產的酶(AFU)；29kDa自大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Aac(大腸桿菌_P15_CJ_Aac)生產的酶(AAC)；28.1kDa自大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Msi(大腸桿菌_P16_CJ_Msi)生產的酶(MSI)；28kDa自大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mruf(大腸桿菌_P17_CJ_Mruf)生產的酶(MRUF)；28.1kDa自大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mta(大腸桿菌_P18_CJ_Mta)生產的酶(MTA)；28.4kDa自大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mch(大腸桿菌_P19_CJ_Mch)生產的酶(MCH)；28.1kDa自大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mce(大腸桿菌_P20_CJ_Mce)生產的酶(MCE)；自大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1生產的酶(CT1)；自大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2生產的酶(CT2)；自大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1生產的酶(TN1)；以及自大腸桿菌BL21(DE3)/CJ_tn_fp3e生產的酶(FP3E)。

實例4：分析肌醇-單-磷酸酶的活性

4-1.分析阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶的活性

很難購買到阿洛酮糖-6-磷酸。因此，本發明人直接自 D-果糖-6-磷酸生產了D-阿洛酮糖-6-磷酸，並探究了用於D-阿洛酮糖生產的肌醇-單-磷酸酶的活性。

具體而言，將50毫莫耳D-果糖-6-磷酸懸浮於50毫莫耳Tris-HCl(pH為7.0)中，然後向其中添加了在實例3中生產的D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶(D-fructose-6-phosphate-3-epimerase，FP3E)及0.1單位/毫升20種肌醇-單-磷酸酶中的每一者。將此混合物在70℃下反應了1小時。藉由HPLC(SP_0810層析柱(昭和公司(Shodex))、安美納斯(Aminex)HPX-87C層析柱(伯樂公司(Bio-RAD))、80℃、流動相流速0.6毫升/分鐘、折射率偵測器)對D-阿洛酮糖的生產進行了確認。

探究了用於D-阿洛酮糖-6-磷酸的全部20種肌醇-單-磷酸酶的去磷酸化效價(圖3a及圖3b)。

4-2.分析用於D-阿洛酮糖-6-磷酸的特異性去磷酸化的肌醇-單-磷酸酶的活性

量測了D-阿洛酮糖-6-磷酸在含有D-葡萄糖-6-磷酸、D-葡萄糖-1-磷酸、D-果糖-6-磷酸及D-阿洛酮糖-6-磷酸的混合物中在肌醇-單-磷酸酶存在下的特異性去磷酸化率。

具體而言，將0.1單位/毫升肌醇-單-磷酸酶中的每一者及5毫莫耳MgCl₂添加至1%(w/v)的D-葡萄糖-6-磷酸、D-葡萄糖-1-磷酸、D-果糖-6-磷酸及D-阿洛酮糖-6-磷酸的混合物中。將反應在50℃下進行了12小時。藉由HPLC(安美納斯HPX-87C 層析柱(伯樂公司)、80℃、流動相流速0.6毫升/分鐘)對反應產物進行了分析。使用折射率偵測器對D-阿洛酮糖及其他醣類(果糖及葡萄糖)的生產進行了偵測。

結果，酶MRUB顯示出D-阿洛酮糖-6-磷酸的最高特異性去磷酸化率(圖3a)。

實例5：藉由多種酵素反應分析酶的活性

為了自麥芽糖糊精生產D-阿洛酮糖，使酶CT1、CT2、TN1、FP3E及MRUB同時與麥芽糖糊精反應。將5%(w/v)的麥芽糖糊精添加至0.1單位/毫升各種酶、5毫莫耳MgCl₂及20毫莫耳磷酸鈉(pH為7.0)中。將此混合物在50℃的溫度下反應了12小時。藉由HPLC(安美納斯HPX-87C層析柱(伯樂公司)、80℃、流動相流速0.6毫升/分鐘、折射率偵測器)對反應產物進行了分析。

結果，確認了藉由多種酵素反應自麥芽糖糊精生產D-阿洛酮糖(圖4a)。圖4b示出根據本發明的HPLC層析圖，以確認藉由在含有D-葡萄糖-1-磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸及D-阿洛酮糖-6-磷酸的反應溶液中在肌醇-單-磷酸酶存在下對D-阿洛酮糖-6-磷酸進行選擇性去磷酸化來生產D-阿洛酮糖。

儘管已詳細闡述了本發明的實施例，然而熟習此項技術者應理解，在不改變本發明的精神或本質特徵的條件下本發明可以其他具體形式來實作。因此，應注意，前述實施例就所有態樣而言僅為說明性的，且不應被視為限制本發明。本發明的範圍是由隨附申請專利範圍而非本發明的詳細說明來界定。在申請專利範圍的含義及範圍內作出的所有變化或修改或者其等效形式皆應被視為落在本發明的範圍內。

<110> CJ第一製糖股份有限公司

<120> 阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、對所述酶進行編碼的核酸、用於生產D-阿洛酮糖的包括所述酶的組成物以及使用所述酶生產D-阿洛酮糖的方法

<150> KR 2017/0097334

<151> 2017-07-31

<160> 78

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 272

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RMA的胺基酸序列

<400> 1

<210> 2

<211> 255

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TLE的胺基酸序列

<400> 2

<210> 3

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MRUB的胺基酸序列

<400> 3

<210> 4

<211> 265

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DTU的胺基酸序列

<400> 4

<210> 5

<211> 251

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PFE的胺基酸序列

<400> 5

<210> 6

<211> 257

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TWI的胺基酸序列

<400> 6

<210> 7

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TTH的胺基酸序列

<400> 7

<210> 8

<211> 251

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TLI的胺基酸序列

<400> 8

<210> 9

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GST的胺基酸序列

<400> 9

<210> 10

<211> 259

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ATH的胺基酸序列

<400> 10

<210> 11

<211> 267

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SAC的胺基酸序列

<400> 11

<210> 12

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TTA的胺基酸序列

<400> 12

<210> 13

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PFU的胺基酸序列

<400> 13

<210> 14

<211> 252

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AFU的胺基酸序列

<400> 14

<210> 15

<211> 265

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AAC的胺基酸序列

<400> 15

<210> 16

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MSI的胺基酸序列

<400> 16

<210> 17

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MRUF的胺基酸序列

<400> 17

<210> 18

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MTA的胺基酸序列

<400> 18

<210> 19

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MCH的胺基酸序列

<400> 19

<210> 20

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MCE的胺基酸序列

<400> 20

<210> 21

<211> 819

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RMA的核苷酸序列

<400> 21

<210> 22

<211> 768

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TLE的核苷酸序列

<400> 22

<210> 23

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MRUB的核苷酸序列

<400> 23

<210> 24

<211> 798

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DTU的核苷酸序列

<400> 24

<210> 25

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PFE的核苷酸序列

<400> 25

<210> 26

<211> 774

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TWI的核苷酸序列

<400> 26

<210> 27

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TTH的核苷酸序列

<400> 27

<210> 28

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TLI的核苷酸序列

<400> 28

<210> 29

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GST的核苷酸序列

<400> 29

<210> 30

<211> 780

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ATH的核苷酸序列

<400> 30

<210> 31

<211> 804

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SAC的核苷酸序列

<400> 31

<210> 32

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TTA的核苷酸序列

<400> 32

<210> 33

<211> 765

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PFU的核苷酸序列

<400> 33

<210> 34

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AFU的核苷酸序列

<400> 34

<210> 35

<211> 798

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAC的核苷酸序列

<400> 35

<210> 36

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MSI的核苷酸序列

<400> 36

<210> 37

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MRUF的核苷酸序列

<400> 37

<210> 38

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MTA的核苷酸序列

<400> 38

<210> 39

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MCH的核苷酸序列

<400> 39

<210> 40

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MCE的核苷酸序列

<400> 40

<210> 41

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Rma的正向引子DNA序列

<400> 41

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Rma的反向引子DNA序列

<400> 42

<210> 43

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Tle的正向引子DNA序列

<400> 43

<210> 44

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Tle的反向引子DNA序列

<400> 44

<210> 45

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mrub的正向引子DNA序列

<400> 45

<210> 46

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mrub的反向引子DNA序列

<400> 46

<210> 47

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Dtu的正向引子DNA序列

<400> 47

<210> 48

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Dtu的反向引子DNA序列

<400> 48

<210> 49

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Msi的正向引子DNA序列

<400> 49

<210> 50

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Msi的反向引子DNA序列

<400> 50

<210> 51

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mruf的正向引子DNA序列

<400> 51

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mruf的反向引子DNA序列

<400> 52

<210> 53

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mta的正向引子DNA序列

<400> 53

<210> 54

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Mta的反向引子DNA序列

<400> 54

<210> 55

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mch的正向引子DNA序列

<400> 55

<210> 56

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mch的反向引子DNA序列

<400> 56

<210> 57

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mce的正向引子DNA序列

<400> 57

<210> 58

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mce的反向引子DNA序列

<400> 58

<210> 59

<211> 823

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CT1的胺基酸序列

<400> 59

<210> 60

<211> 2472

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CT1的核苷酸序列

<400> 60

<210> 61

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CT2的胺基酸序列

<400> 61

<210> 62

<211> 1326

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CT2的核苷酸序列

<400> 62

<210> 63

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TN1的胺基酸序列

<400> 63

<210> 64

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TN1的核苷酸序列

<400> 64

<210> 65

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FP3E的胺基酸序列

<400> 65

<210> 66

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FP3E的核苷酸序列

<400> 66

<210> 67

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TN2的胺基酸序列

<400> 67

<210> 68

<211> 1326

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TN2的核苷酸序列

<400> 68

<210> 69

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ct1的正向引子DNA序列

<400> 69

<210> 70

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ct1的反向引子DNA序列

<400> 70

<210> 71

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ct2的正向引子DNA序列

<400> 71

<210> 72

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ct2的反向引子DNA序列

<400> 72

<210> 73

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tn1的正向引子DNA序列

<400> 73

<210> 74

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tn1反向引子DNA序列

<400> 74

<210> 75

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> fp3e的正向引子DNA序列

<400> 75

<210> 76

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> fp3e的反向引子DNA序列

<400> 76

<210> 77

<211> 270

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生自熱泉奇異球菌的多磷酸鹽相依性葡萄糖激酶

<400> 77

<210> 78

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生自四膜蟲厭氧繩菌的多磷酸鹽相依性葡萄糖激酶

<400> 78

Claims

一種阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶用於生產D-阿洛酮糖的用途，所述阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶包括：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及20陳述的胺基酸序列中的任一者。
如申請專利範圍第1項所述的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶用於生產D-阿洛酮糖的用途，其中所述阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶是藉由以SEQ ID NO：21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40陳述的核苷酸序列來編碼。
一種核酸用於生產D-阿洛酮糖的用途，其中所述核酸對如申請專利範圍第1項所述的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶進行編碼。
一種用於生產D-阿洛酮糖的組成物，包括肌醇-單-磷酸酶、表達所述肌醇-單-磷酸酶的微生物或表達所述肌醇-單-磷酸酶的微生物的培養物以及D-阿洛酮糖-6-磷酸，表達所述肌醇-單-磷酸酶的微生物的培養物包含所述肌醇-單-磷酸酶，其中所述肌醇-單-磷酸酶包括SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及20陳述的胺基酸序列中的任一者。
如申請專利範圍第4項所述的用於生產D-阿洛酮糖的組成物，更包括： (a)(i)澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合、(ii)磷酸鹽、(iii)D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶、(iv)D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶、(v)磷酸葡萄醣變位酶或葡萄糖激酶及(vi)α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糖糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、α-澱粉酶、普魯蘭酶、異澱粉酶、葡萄糖澱粉酶或蔗糖酶；或(b)表達一種或多種(a)中的酶的微生物或表達一種或多種(a)中的酶的微生物的培養物，表達一種或多種(a)中的酶的微生物的培養物包含一種或多種(a)中的酶。
一種用於生產D-阿洛酮糖的方法，包括：使肌醇-單-磷酸酶、表達所述肌醇-單-磷酸酶的微生物或表達所述肌醇-單-磷酸酶的微生物的培養物接觸D-阿洛酮糖-6-磷酸，以將所述D-阿洛酮糖-6-磷酸轉化成D-阿洛酮糖，表達所述肌醇-單-磷酸酶的微生物的培養物包含所述肌醇-單-磷酸酶，其中所述肌醇-單-磷酸酶包括SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及20陳述的胺基酸序列中的任一者。
如申請專利範圍第6項所述的用於生產D-阿洛酮糖的方法，更包括：在所述將D-阿洛酮糖-6-磷酸轉化成所述D-阿洛酮糖之前，使D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶、表達所述D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶的微生物或表達所述D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶的微生物的培養物接觸D-果糖-6-磷酸，以將所述D-果糖-6-磷酸轉化成所述D-阿洛酮糖-6-磷酸，表達所述D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶的微生物的培養物包含所述D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶。
如申請專利範圍第7項所述的用於生產D-阿洛酮糖的方法，更包括：在將D-果糖-6-磷酸轉化成所述D-阿洛酮糖-6-磷酸之前，使D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶、表達所述D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物或表達所述D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物的培養物接觸D-葡萄糖-6-磷酸，以將所述D-葡萄糖-6-磷酸轉化成所述D-果糖-6-磷酸，表達所述D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物的培養物包含所述D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶。
如申請專利範圍第8項所述的用於生產D-阿洛酮糖的方法，更包括：在將所述D-葡萄糖-6-磷酸轉化成所述D-果糖-6-磷酸之前，使磷酸葡萄糖變位酶、表達所述磷酸葡萄糖變位酶的微生物或表達所述磷酸葡萄糖變位酶的微生物的培養物接觸D-葡萄糖-1-磷酸，以將所述D-葡萄糖-1-磷酸轉化成所述D-葡萄糖-6-磷酸，表達所述磷酸葡萄糖變位酶的微生物的培養物包含所述磷酸葡萄糖變位酶。
如申請專利範圍第9項所述的用於生產D-阿洛酮糖的方法，更包括在將所述D-葡萄糖-6-磷酸轉化成所述D-果糖-6-磷酸之前，使葡萄糖激酶、表達所述葡萄糖激酶的微生物或表達所述葡萄糖激酶的微生物的培養物及磷酸鹽接觸葡萄糖，以將所述葡萄糖轉化成所述D-葡萄糖-6-磷酸，表達所述葡萄糖激酶的微生物的培養物包含所述葡萄糖激酶。
如申請專利範圍第10項所述的用於生產D-阿洛酮糖的方法，更包括：在所述將所述D-葡萄糖-1-磷酸轉化成所述D-葡萄糖-6-磷酸之前，使α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糖糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶、表達磷酸化酶的微生物或表達所述磷酸化酶的微生物的培養物及磷酸鹽接觸澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合，以將所述澱粉、所述麥芽糖糊精、所述蔗糖或其組合轉化成所述D-葡萄糖-1-磷酸，表達所述磷酸化酶的微生物的培養物包含所述磷酸化酶。
如申請專利範圍第10項所述的用於生產D-阿洛酮糖的方法，更包括在所述將所述葡萄糖轉化成所述D-葡萄糖-6-磷酸之前，使α-澱粉酶、普魯蘭酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶、表達所述α-澱粉酶、所述普魯蘭酶、所述葡萄糖澱粉酶、所述蔗糖酶或所述異澱粉酶的微生物或表達所述α-澱粉酶、所述普魯蘭酶、所述葡萄糖澱粉酶、所述蔗糖酶或所述異澱粉酶的微生物的培養物接觸澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合，以將所述澱粉、所述麥芽糖糊精、所述蔗糖或其組合轉化成所述葡萄糖，表達所述α-澱粉酶、所述普魯蘭酶、所述葡萄糖澱粉酶、所述蔗糖酶或所述異澱粉酶的微生物的培養物包含所述α-澱粉酶、所述普魯蘭酶、所述葡萄糖澱粉酶、所述蔗糖酶或所述異澱粉酶。
一種用於生產D-阿洛酮糖的方法，包括使以下物質接觸澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合及磷酸鹽：(a)如申請專利範圍第1項所述的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶、D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶、磷酸葡萄醣變位酶或葡萄糖激酶以及α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糖糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、α-澱粉酶、普魯蘭酶、異澱粉酶、葡萄糖澱粉酶或蔗糖酶；或(b)表達一種或多種(a)中的酶的微生物或表達一種或多種(a)中的酶的微生物的培養物，表達一種或多種(a)中的酶的微生物的培養物包含一種或多種(a)中的酶。
如申請專利範圍第6項至第13項中任一項所述的用於生產D-阿洛酮糖的方法，其中接觸反應是在5.0至9.0的pH下、在40℃至80℃的溫度下進行及/或進行2小時至24小時。