植物基因组定点修饰方法 技术领域
本发明涉及生物技术领域, 具体地, 涉及 RNA引导的植物基因组定点修饰方法。 背景技术
过去十多年里, 序列特异性核酸酶的发明和改进已经在创建定点突变方面展现出了 强大威力。 锌指核酸酶(Zinc finger 皿 cl eases , ZFNs)和类转录激活因子效应物核酸 SI (Transcript ion activator-l ike effector nucl ease , TALENs)即是其中的主要代表 (Carro l l et al., 2006 ; Chri stian et al ., 2010)。 它们是识别一段特定核酸序列的 结合结构域阵列与一种非特异性核酸酶 Fokl组成的融合蛋白。 这些蛋白切割核酸序列 产生双链断裂以后, 生物体会通过非同源末端连接或者同源重组两种机制进行修复, 从 而引入定点改变或修饰。上述技术已经在多个物种里获得成功应用, 包括线虫, 人细胞, 老鼠, 斑马鱼, 玉米, 水稻, 短柄草等(Beumer et al ., 2006 ; Meng et al. , 2008 ; Shukla et al. , 2009 ; Meyer et al. , 2010 ; Cui et al. , 2011 ; Mahfouz et al . , 201 1 ; Li et al. , 2012 ; Meyer et al. , 2012 ; Shan et al. , 2013 ; Weinthal et al. , 2013)。 然而, 这些技术的最大缺陷是通过蛋白元件来识别特定核酸序列, 构建比较麻烦, 识别 特异性有待提高。
2012年人们发现并改进了一种突破性的新技术, CRISPR/Cas。 CRISPR (clustered regulatory interspaced short pal indromic repeats), 是一段被一禾中短重复序列分 隔的核酸序列, 它们转录形成的 CRISPR RNA (crRNAs)与另一种反式作用型 crRNA (trans-activating crRNA, tracrRNA)部分区域配对开成二元复合体。 然后, 该二元 复合体一起引导具有非特异核酸酶活性的 Cas蛋白, 切割与 crRNAs匹配的 DNA序列, 从而形成双链断裂。
此外, 人们进一步将 crRNAs与 tracrRNA融合在一起, 形成单一的 chimeric RNA
(chiRNA) 分子, 并发现 chiRNA同样能介导 Cas9蛋白切割目的序列(Jinek et al., 2012)。 这种可编辑型 CRISPR/Cas***很快在多个物种里面取得成功应用, 包括人细胞 系, 斑马鱼, 大肠杆菌和老鼠等(Jinek et al., 2012 ; Hwang et al., 2013 ; Jiang et al. , 2013 ; Jinek et al. , 2013 ; Mal i et al. , 2013 ; Shen et al. , 2013 ; Wang et al. , 2013)。这项技术的最大优势是构建简易, 而且可以同时对多个目标位点基因修饰。 对于动物, 可将 chiRNA和 Cas9的体外转录产物直接施用(如通过注射)于动物, 从而引 起基因突变。 在老鼠中, 已有同时对多达 5个目标位点基因突变的成功报道。 然而, 由 于种种未知的原因, 目前尚未在植物中成功开发和应用类似的技术。
综上所述, 为了植物基因工程的需要, 本领域迫切需要开发简便高效的植物基因组 的定点修饰方法。 发明内容
本发明的目的就是简便高效的植物基因组的定点修饰方法。
本发明的另一目的是提供适用于植物的 CRISPR/Cas技术, 并在稳定植株中实现特异
DNA序列的切割。 在本发明的第一方面, 提供了一种植物基因组定点修饰方法, 包括步骤:
(a)将一表达嵌合 RNA和 Cas蛋白的核酸构建物导入植物细胞, 获得转化的植物细胞, 其 中所述嵌合 RNA是由特异性识别待定点修饰(或待切割位点)的 CRISPR RNA (crRNAs)和反式作 crRNA (trans-activating crRNA, tracrRNA)所构成的嵌合体(chimera); 禾口
(b)在合适的条件下,使转化的植物细胞中的所述核酸构建物转录形成嵌合 RNA (chiRNA), 并且使所述转化的植物细胞表达所述的 Cas蛋白, 从而使得在所述嵌合 RNA的引导下, 在 所述转化的植物细胞中, 通过所述 Cas蛋白对基因组 DNA进行定点切割, 从而进行基因组定 点修饰。
在另一优选例中,所述的定点修饰包括定点随机修饰和定点非随机修饰 (定点精确修饰)。 在另一优选例中, 在嵌合 RNA和 Cas蛋白对基因组 DNA进行定点切割之前, 向植物细 胞中导入供体 DNA, 从而进行基因组定点精确修饰, 所述供体 DNA为单链或双链 DNA, 并 包含待***或待替换的 DNA序列,所述 DNA序列可以为单个核苷酸、或多个核苷酸(包括 DNA 片段或者编码基因) 。
在另一优选例中, 所述核酸构建物包括第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物, 其中第 一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物是相互独立的, 或是一体的;
其中, 第一亚核酸构建物包括从 5'至 3'的以下元件:
第一植物启动子;
与所述第一植物启动子操作性相连的嵌合 RNA的编码序列,所述嵌合 RNA的编码序 列的结构如式 I所示:
A-B (I)
式中,
A为编码 CRISPR RNA (crRNAs)的 DNA序列;
B为编码反式作用型 crRNA (trans-activating crRNA, tracrRNA)的 DNA序列;
" -"表示 A和 B之间的连接键或连接序列; 其中, 由所述嵌合 RNA的编码序列 转录形成一个完整的 RNA分子, 即嵌合 RNA (chiRNA) ; 和
RNA转录终止子;
第二亚核酸构建物包括 5'至 3'的以下元件:
第二植物启动子;
与所述第二植物启动子操作性相连的 Cas蛋白的编码序列,并且所述 Cas蛋白的 是 N端、 C端或两侧与核定位序列(NLS序列)融合的融合蛋白; 和
植物转录终止子。
在另一优选例中, 所述第一亚核酸构建物的数量为一个或者多个 (针对多个待切割位 点) , 并与第二亚核酸构建物是相互独立的, 或是一体的。
在另一优选例中, 各第一亚核酸构建物与第二亚核酸构建物的相对位置是任意的。
在另一优选例中,所述的第二植物启动子和与所述所述 Cas蛋白的编码序列之间 5'至 3' 还操作性相连有:
第三亚核酸构建物, 较佳地, 所述的第三亚核酸构建物为来源于番茄矮壮病毒 (TBSV)
的 P 19蛋白编码序列; 和
自剪切序列, 较佳地, 所述的自剪切序列为 2A多肽编码序列(SEQ ID NO.: 98)。
在另一优选例中, 所述的 P19蛋白编码序列包括 pl9基因的全长序列或 cDNA序列。 在另一优选例中, 所述的 2A多肽序列如 SEQ ID NO.: 99所示
在另一优选例中, 所述的 P19蛋白编码序列如 SEQ ID NO.: 100所示。
在另一优选例中, 所述的 P19蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO.: 101所示。
在另一优选例中, 所述定点修饰包括:
(i)在没有供体 DNA的情况下, 对植物基因组特定位点进行随机***和缺失; 和
(ϋ)在存在供体 DNA的情况下, 以供体 DNA为模板, 对植物基因组特定位点进行精确插 入、 缺失或者替换 DNA序列;
较佳地, 所述定点修饰包括对植物基因组的基因敲除, 基因敲入 (转基因)以及调控 (上调 或下调)內源基因的表达水平。
在另一优选例中, 所述的 RNA转录终止子为 U6转录终止子,为至少连续的 7个 τ (τττττττ)。
在另一优选例中, 第一植物启动子为来自于待改造植物的内源启动子。
在另一优选例中, 第一植物启动子为来自于待改造植物的 RNA聚合酶 III依赖的启 动子。
在另一优选例中, 所述 RNA聚合酶 III依赖的启动子包括 AtU6-26、 0sU6_2、 AtU6_l、 AtU3-B、 At7SL或其组合。
在另一优选例中, 所述的植物转录终止子为 Nos。
在另一优选例中, 所述的第二植物启动子为 RNA聚合酶 II依赖的启动子, 较佳地, 包 括组成型表达的启动子或拟南芥生殖细胞特异性表达的 sporocyteless (SPL)启动子。
在另一优选例中, 所述第二亚核酸构建物中, 在所述 Cas蛋白的编码序列后, 自 5'至 3'还依次操作性连接有 SPL基因的表达框架。
在另一优选例中, 所述的 SPL基因表达框架包括 SPL基因的内含子、外显子、非翻译区、 和终止子。
在另一优选例中,所述的 SPL基因表达框架自 5'至 3'依次操作性连接有一个或多个选自 SEQ ID NO.: 103 (内含子 1)、 104 (外显子 2)、 105 (内含子 2)、 106 (外显子 3)、 107 (3'非翻 译区)、 108 (终止子)所示的序列。
在另一优选例中,所述的第二亚核酸构建物中的植物转录终止子序列如 SEQ ID NO.: 108 所示。
在另一优选例中, 所述的核酸构建物是一个同时表达嵌合 RNA和 Cas蛋白的质粒。
在另一优选例中, 所述的植物包括单子叶植物、 双子叶植物和裸子植物;
较佳地, 所述的植物包括林业植物、 农用植物、 经济作物、 观赏植物。
在另一优选例中, 所述的植物包括以下科的植物: 十字花科、 禾本科。
在另一优选例中, 所述的植物包括但不限于拟南芥、 水稻、 小麦、 大麦、 玉米、 高粱、 燕麦、 黑麦、 甘蔗、 油菜、 白菜、 棉花、 大豆、 苜蓿、 烟草、 番茄、 辣椒、 南瓜、 西瓜、 黄瓜、 苹果, 桃、 李、 海棠、 甜菜、 向日葵、 莴苣、 莴笋、 青蒿、 菊芋、 甜叶菊、 杨树、 柳树、 桉树、 丁子香、 橡胶树、 木薯、 蓖麻、 花生、 豌豆、 黄芪、 烟草, 番茄, 辣椒等。
在另一优选例中, 所述的 cas蛋白包括 cas9蛋白。
在另一优选例中, 所述的第二植物启动子为 RNA聚合酶 I I依赖的启动子。
在另一优选例中,所述的 RNA聚合酶 I I依赖的启动子包括组成型启动子和拟南芥生殖细 胞特异性表达的 sporocyteless (SPL)启动子。
在另一优选例中,所述的第一植物启动子包括 AtU6-26、 0sU6-2、 AtU6_l、 AtU3_B、 At7SL 或其组合。
在另一优选例中, 所述的第二植物启动子包括 35s、 UBQ、 SPL启动子或其组合。
在另一优选例中, 所述方法还包括: 在步骤 (b)之前或之后, 将所述的转化的植物细胞再 生成植株。
在另一优选例中, 所述方法还包括: 检测所述转化的植物细胞中基因组的突变或修饰情 况。
在另一优选例中, 所述植物细胞包括来自培养物、 愈伤组织、 或植株的植物细胞。
在本发明的第二方面, 提供了一种用于植物基因组定点修饰的核酸构建物, 所述核酸构 建物包括第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物,其中第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建 物是相互独立的, 或是一体的;
其中, 第一亚核酸构建物包括从 5'至 3'的以下元件:
第一植物启动子;
与所述第一植物启动子操作性相连的嵌合 RNA的编码序列,所述嵌合 RNA的编码序 列的结构如式 I所示:
A-B (I)
式中,
A为编码 CRISPR RNA (crRNAs)的 DNA序列;
B为编码反式作用型 crRNA (trans-activating crRNA, tracrRNA)的 DNA序列; " -"表示 A和 B之间的连接键或连接序列; 其中, 由所述嵌合 RNA的编码序列 转录形成一个完整的 RNA分子, 即嵌合 RNA (chiRNA) ; 和
RNA转录终止子;
第二亚核酸构建物包括 5'至 3'的以下元件:
第二植物启动子;
与所述第二植物启动子操作性相连的 Cas蛋白的编码序列,并且所述 Cas蛋白的 是 N端、 C端或两侧与核定位序列(NLS序列)融合的融合蛋白; 和
植物转录终止子。
在另一优选例中, 所述的第二植物启动子和与所述所述 Cas蛋白的编码序列之间 5'至 3'还操作性相连有:
第三亚核酸构建物, 较佳地, 所述的第三亚核酸构建物为来源于番茄矮壮病毒 (TBSV) 的 p 19蛋白编码序列; 和
2A序列。
在另一优选例中, 所述的 P19蛋白编码序列包括 pl9基因的全长序列或 cDNA序列。 在另一优选例中, 所述的 P19蛋白编码序列如 SEQ ID NO.: 98所示。
在另一优选例中, 所述的 RNA转录终止子为 U6转录终止子,为至少连续的 7个
终占;
τ (τττττττ)。
在在在在在在在在在在在。
另另另另另一优选例中 所述的植物转录终止子为 Nos。
另- -优选例中 所述的核酸构建物为 DNA构建物。
另- -优选例中 所述的第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物是一体的。
另- -优选例中 所述的第一亚核酸构建物的数量为一个或者多个(针对多个待切割位 另一优选例中, 第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物位于同一个质粒中。
另一优选例中, 第一亚核酸构建物位于第二亚核酸构建物的上游或下游。
另一优选例中, 所述的第一植物启动子和 /或第二植物启动子是组成型或诱导型启动 子'
尤选例中, 所述的 Cas蛋白的编码序列还包括位于 0RF两侧的 NLS序列。 -优选例中, 所述第二亚核酸构建物还包括: 位于 Cas蛋白编码序列下游的 Nos 尤选例中, 所述的 Cas蛋白还带有标签序列。
-优选例中, 所述第二亚核酸构建物还包括: 位于第二植物启动子与位于 Cas 蛋白编码序列之间的标签序列(如 3 X Flag序列)。
在另一优选例中, 位于 N端的 NLS序列位于所述的标签序列的下游。
在本发明的第三方面, 提供了一种载体, 所述载体携带本发明第二方面所述的核酸构建 物;
本发明还提供一种载体组合, 所述载体组合包括第一载体和第二载体, 其中第一载体携 带本发明第二方面所述的核酸构建物的第一亚核酸构建物, 而第二载体携带本发明第二方面 所述的核酸构建物的第二亚核酸构建物。
在另一优选例中, 所述的第一亚核酸构建物的数量为一个或者多个。
在另一优选例中, 所述的第一载体可以为一个或者多个, 并携带一个或者多个本发明第 二方面所述的核酸构建物的第一亚核酸构建物。
在本发明的第四方面, 提供了一种基因工程的细胞, 所述细胞含有本发明第三方面中所 述的载体或载体组合。
在本发明的第五方面, 提供了一种植物细胞, 所述的植物细胞的基因组中整合有本发明 第二方面所述的核酸构建物。
在本发明的第六方面, 提供了一种制备植物的方法, 包括步骤: 将本发明第五方面所述 的植物细胞再生成形成植株。
在本发明的第七方面, 提供了一种植物, 所述植物的植物细胞的基因组中整合有本发明 第二方面所述的核酸构建物。
在本发明的第八方面, 提供了一种植物, 所述植物是第六方面所述的方法制备的。 应理解, 在本发明范围内中, 本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体 描述的各技术特征之间都可以互相组合, 从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅, 在此不再 累述。
附图说明
图 1显示来自酿脓链球菌 SF370的 SpCas9可以在拟南芥原生质体中造成 DNA的定点 双链断裂。 (A) SpCas9的表达由 2 X 35S启动子驱动, 而引导 RNA (chiRNA)则由拟南芥中 的 AtU6-26启动子驱动。 NLS, 核定位序列; Flag, Flag标签序列; Nos, Nos终止子。 (B)基于同源重组的 YF-FP报告***。 图中显示了设计的 chiRNA目标位点。 PAM序列标 记为***, 20个碱基的目的序列标记为蓝绿色。 (O YF-FP报告***检测的 CRI SPR/Cas 活性。 YFP阳性细胞由流式细胞仪检测。
图 2显示稳定转化载体和目的基因 chiRNA设计位点示意图。 (A)用于农杆菌介导稳 定转化水稻和拟南芥的双元载体示意图, 其同时带有 chiRNA和 Cas9表达框。 SpCas9的 表达由 2 X 35 S启动子驱动,拟南芥 ch i RNA由 A tU6 -26启动子驱动,水稻 ch i RNA为 0sU6-2 启动子驱动。 (B) Cas9/chiRNA目标位点示意图。 PAM序列标记为***, chiRNA目标位 点标记为蓝绿色。 限制性内切酶位点由方框标注。 用于 RFLP检测的酶切位点用黑框标 注。
图 3显示 SpCas9可以在拟南芥和水稻植株中多个基因位点进行 DNA的定点切割。(A) 和(B) 位点 1的代表性 T1代转基因植株。左边显示的是生长正常的植株, 右边的 是显示与 r 7突变体类似表型的植株。 植株在 MS培养基上筛选 5天后移栽到培养土中 生长 1周(A)或 3周(B)后拍照。 (C) 6¾/位点 1的代表性 T1代转基因植株。 左边显示 的是生长正常的植株, 右边的是显示与 突变体类似表型的植株。 植株在 MS培养基 上筛选 5天后移栽到培养土中生长 4周后拍照。 (D) 处于生根期的腸 H 1的代表 性 T1转基因植株。 (E) ?/7位点 1的 12株 T1代转基因苗的限制性酶切分析。 PCR产 物由 EcoRV进行酶切。 M, DNA分子量标准。 (F) 位点 1的 14株 T1代转基因苗的 限制性酶切分析。 PCR产物由 Ahdl进行酶切。 M, DNA分子量标准。 (G)和(H) 願 1 位点 1 (G)和 位点 1 (H)的一株 T1代转基因苗中检测到的目标位点区域突变代表类 型。 野生型对照序列在顶部, ΡΑΜ序列标记为***, 目标位点标记为蓝绿色。 红线表 示缺失的碱基, 红色字母表示***或者突变的碱基。 序列的完整变化情况标注在右侧, +表示***, D表示缺失。 (I) 水稻和拟南芥的 T1代转基因苗观察到表型和突变情况鉴 定统计。 标尺长度为 1 cm (A,B,C,D)。
图 4显示在拟南芥中 ?/7基因位点 1上由工程化的 chiRNA: Cas9诱导产生的靶向 位点缺失突变。 所示突变类型是来自于 12个独立 T1代转基因植株的基因组 DNA扩增并 克隆到载体后进行测序得到。 最上面显示的是野生型对照的序列, PAM序列标记为紫红 色, 目标位点标记为蓝绿色。红线表示缺失的碱基, 红色字母表示***或者突变的碱基。 序列的完整变化情况标注在右侧, +表示***, D表示缺失。 值得注意的是有的序列既有 ***又有缺失。 98个克隆中检测到了 75个突变。
图 5显示在拟南芥中 ?/7基因位点 2上由工程化的 chiRNA: Cas9诱导产生的靶向 位点缺失突变。 所示突变类型是来自于 3个独立 T1代转基因植株的基因组 DNA扩增并 克隆到载体后进行测序得到。 野生型序列如顶部所示, PAM序列标记为***, 目标位 点标记为蓝绿色。 红线表示缺失的碱基, 红色字母表示***或者突变的碱基。 序列的完 整变化情况标注在右侧, +表示***, D表示缺失。 检测到的次数标记在括号中。 71个 克隆中检测到了 28个突变。
图 6显示在拟南芥中 ?/7基因位点 3上由工程化的 chiRNA: Cas9诱导产生的靶向 位点缺失突变。 所示突变类型是来自于 4个独立 T1代转基因植株的基因组 DNA扩增并 克隆到载体后进行测序得到。 野生型序列如顶部所示, PAM序列标记为***, 目标位 点标记为蓝绿色。 红线表示缺失的碱基, 红色字母表示***或者突变的碱基。 序列的完 整变化情况标注在右侧, +表示***, D表示缺失。 检测到的次数标记在括号中。 34个 克隆中检测到了 22个突变。
图 7显示在拟南芥中 6¾/基因位点 1上由工程化的 chiRNA: Cas9诱导产生的靶向位 点缺失突变。 所示突变类型是来自于 3个独立 T 1代转基因植株的基因组 DNA扩增并克 隆到载体后进行测序得到。 野生型序列如顶部所示, PAM序列标记为***, 目标位点 标记为蓝绿色。 红线表示缺失的碱基, 红色字母表示***或者突变的碱基。 序列的完整 变化情况标注在右侧, +表示***, D表示缺失。 检测到的次数标记在括号中。 53个克 隆中检测到了 17个突变。
图 8显示在水稻中 基因位点 1上由工程化的 chiRNA: Cas9诱导产生的靶向位 点缺失突变。 所示突变类型是来自于 5个独立 T 1代转基因植株的基因组 DNA扩增并克 隆到载体后进行测序得到。 野生型序列如顶部所示, PAM序列标记为***, 目标位点 标记为蓝绿色。 红线表示缺失的碱基, 红色字母表示***或者突变的碱基。 序列的完整 变化情况标注在右侧, +表示***, D表示缺失。 检测到的次数标记在括号中。 165个克 隆中检测到了 136个突变。
图 9显示了 Pa7-YFP的载体图谱。
图 10显示了 AtU6-26 chiRNA序列(未***目的位点识别序列 SEQ ID NO.: 1)。 其中, 灰色标注的为 AtU6-26启动子, 下划线标注的为***目的位点 ol igo的两个 Bbsl酶切位点, 方框标注的为与目的位点融合的反式作用型 crRNA 区域。
图 11显示了 AtU6-26 chiRNA序列(已***目的位点识别序列 SEQ ID NO.: 2)。
图 12显示了 0sU6-2 chiRNA序列 (未***目的位点识别序列 SEQ ID NO.: 3): 其中, 灰色标注的为 0sU6-2启动子, 下划线标注的为***目的位点 ol igo的两个 Bbsl酶切位点, 方框标注的为与目的位点融合的反式作用型 crRNA 区域。
图 13显示了 0sU6-2 chiRNA序列 (已***目的位点识别序列 SEQ ID NO.: 4)。
图 14显示了 2 X 35S-Cas9-Nos序列(SEQ ID NO.: 39)。
图 15A-B显示了 CRISPR-Cas同时在 T1代拟南芥转基因植株中同时造成 CHLIl CHLI2 基因定点突变。 所示突变类型是来自于 3个独立 T1 代转基因植株的基因组 DNA扩增并 克隆到载体后进行测序得到。 最上面显示的是野生型对照的序列, 目标位点用下划线标 记。 序列的完整变化情况标注在右侧, +表示***, -表示缺失。
图 16显示了 CRISPR-Cas在 T1代拟南芥转基因植株中同时造成 77 基因内两个位 点的定点突变及位点之间大片度序列缺失。 所示突变类型是来自于 1 1个独立 T 1代转基 因植株的基因组 DNA扩增并克隆到载体后进行测序得到。 最上面显示的是野生型对照的 序列, 目标位点用下划线标记。 两个目的位点的序列完整变化情况及检测到的比例标注 在右侧, 用 "; " 分隔, +表示***, -表示缺失。
图 17显示了植物基因打靶载体构建示意图。 pSPL-Cas9-sgR :生殖系特异表达的植 物基因打靶载体。 pUBQ-Cas9-sgR : 组成型表达的植物基因打靶载体。 PAtU6 : 拟南芥 U6
基因的启动子; sgRNA:单链引导 RNA; pAtSPL: 拟南芥 SPL基因的启动子; pAtUBQ: 拟 南芥 UBQ基因的启动子; HspCas9: 人源化的链霉菌 Cas9基因; SPL intron: SPL基 因的内含子; SPL exon: SPL基因的外显子; tSPL: SPL基因的终止子; tUBQ: UBQ基因 的终止子。
图 18显示了 Cas9基因的原位杂交。 A,B,C: pSPL-Cas9-sgR的 Tl代转基因植物;
D,E,F: pUBQ-CaS9-SgR的 Tl代转基因植物。 A,D: 花药发育的 V期; B,E: 花药发育的 VII期; C,F: 胚珠发育的 II期。 标尺 =20μΜ。
图 19显示了生殖系专一性基因打靶***的效率统计。 Α: 测序结果比对发现, pSPL-Cas9-sgR-APl-27/194的 T1代转基因植物没有检测到突变,但在相应的 T2代植物 中却可以检测到突变。 B: 组成型基因敲除***和生殖细胞专一性基因敲除***在不同 组织和不同世代中敲除效率的比较。
图 20显示了不同植物打靶*** T2代 转化子的突变类型统计。 对于转化不同的载 体构建的 T2代群体, 随机选取 8个发生突变的株系, 分别检测 12个单株用于突变类型 的统计。
图 21显示了高效植物基因打靶载体示意图。 A: 常规拟南芥基因打靶载体 psgR-Cas9。 B: 共表达植物转录后基因沉默抑制蛋白的基因打靶载体 PsgR-Cas9-pl9。 pAtU6: 拟南芥 U6基因启动子; sgRNA: 单链引导 RNA; pUBQ: 拟南芥 UBQ基因启动子; hSpCas9: 人源化的链霉菌 Cas9基因; tUBQ: 拟南芥 UBQ基因的终止子; TBSV_pl9: 番 茄矮壮病毒 (TBSV) 的 pl9蛋白编码基因; 2A肽: 蛋白顺式切割元件; Bbsl: Bbsl内 切酶识别位点。
图 22显示了利用原生质体瞬时表达***, 检测 pl9共表达载体的基因打靶效率。 A: pl9的作用机制以及检测原理示意图。 pl9蛋白在植物细胞中以二聚体形式存在, 可 以起到抑制 sgRNA的降解, 提高 sgRNA与 Cas9的结合活性的功能。 sgRNA_Cas9复合体 能够结合 YFFP报道基因上的识别序列并剪切, 产生双链 DNA的断裂 (DSB) 。 部分重复 的 YFP序列会发生单链退火, 从而被 DNA损伤修复***切除并修复正确。 B: YFFP瞬时 表达***地荧光检测。 a, c, e, g, I, k: YFP荧光通道下的阳性细胞信号。 b, d, f, h, j, 1: RFP 荧光通道下的叶绿体自发荧光信号。 左下方的数值代表 YFP阳性细胞在整个细胞群体中 所占的比例。
图 23显示了 sgR-Cas9-pl9转基因植物的基因表达分析。 A: 在 sgR_Cas9- pl9 的转基因群体中出现三种不同程度的发育表型: 1/-: 叶片平展, 2/+: 叶片卷曲, 3/++: 叶片锯齿。 B: Northern结果表明,在叶片出现锯齿的转基因植物总, sgRNA和 miRNAme 168 的表达水平都有明显的提高。 C,D: Realtime PCR 的结果显示, 叶发育表型与 pl9的 表达水平正相关, 但是 Cas9基因的表达量相对稳定。
图 24显示了 sgR-Cas9-pl9转基因 T1代植物的表型分析。 在 sgR-Cas9-pl9_APl 和 sgR-CaS9-pl9-TT4这两个转基因群体中, 根据叶发育表型的严重程度, 共分为三类, 没有表型 (pl9/_) , 叶卷曲 (pl9/+) 和叶锯齿 (pl9/++) 。 同时根据靶基因突变的程 度, 也分为三类, 野生型 (WT) , 嵌合体 (chimera) 和突变体 (皿 tant) 。 分类统计 相应的植株数目, 计入表格。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究, 采用特定结构的核酸构建物, 从而首次在植物中 成功实现了 RNA引导的基因组定点修饰。 本发明方法不仅可进行定点切割和修饰, 而且 可以在特定位点高效引入各种不同类型的突变, 从而有利于筛选具有经改造的新植物, 而采用了生殖细胞中特异性表达的启动子还能提高从子代中的获得基因定点修饰植物 的比例, 此外, 本发明人还发现, 当本发明核酸构建物中引入特定的序列后, 能够有效 地改善植物打靶的效率并影响植物的发育表型。 在此基础上完成了本发明。
实验表明, 本发明特别适用于植物, 可在稳定植株中对基因组实现特异的定点 DNA 序列的切割和基因修饰。 定义
如本文所用, 术语 " crRNA"指负责识别目标位点的 CRISPR RNA。
如本文所用, 术语 " tracrRNA "指与 crRNA配对的反式激活 crRNA。
如本文所用, 术语 "植物启动子" 指能够在植物细胞中启动核酸转录的核酸序列。 该植物启动子可以是来源于植物、 微生物(如细菌、 病毒)或动物等, 或者是人工合成或 改造过的启动子。
如本文所用, 术语 "植物转录终止子"指能够在植物细胞中可使转录停止的终止子。 该植物转录终止子可以是来源于植物、 微生物(如细菌、 病毒)或动物等, 或者是人工合 成或改造过的终止子。 代表性的例子包括(但并不限于): Nos终止子。
如本文所用, 术语 " Cas蛋白" 指一种核酸酶。 一种优选的 Cas蛋白是 Cas9蛋白。 典型的 Cas9蛋白包括(但并不限于): 来源于酿脓链球菌 SF370的 Cas9。
如本文所用, 术语 " Cas蛋白的编码序列"指编码具有切割活性的 Cas蛋白的核苷酸 序列。 在***的多聚核苷酸序列被转录和翻译从而产生功能性 Cas蛋白的情况下, 技术 人员会认识到, 因为密码子的简并性, 有大量多聚核苷酸序列可以编码相同的多肽。 另 夕卜, 技术人员也会认识到不同物种对于密码子具有一定的偏好性, 可能会根据在不同物 种中表达的需要, 会对 Cas蛋白的密码子进行优化, 这些变异体都被术语 " Cas蛋白的 编码序列"所具体涵盖。 此外, 术语特定地包括了全长的、 与 Cas基因序列基本相同的 序列, 以及编码出保留 Das蛋白功能的蛋白质的序列。
如本文所用, 术语 "植物"包括全植株、 植物器官(如叶、 茎、 根等)、 种子和植物 细胞以及它们的子代。 可用于本发明方法的植物的种类没有特别限制, 一般包括任何可 进行转化技术的高等植物类型, 包括单子叶、 双子叶植物和裸子植物。
如本文所用, 术语 "异源序列" 是来自不同种的序列, 或者如果来自同一种则是对 其最初形式经过充分修饰的序列。 例如, 可操作地连于启动子的异源结构基因可以是来 自不同于获得该结构基因的种, 或者, 如果来自同一种, 则其中之一或两者都对它们的 最初形式进行了充分的修饰。
如本文所用, "可操作地连于" 或 "操作性相连"指这样一种状况, 即线性 DNA序 列的某些部分能够影响同一线性 DNA序列其他部分的活性。 例如, 如果信号肽 DNA作为 前体表达并参与多肽的分泌, 那么信号肽(分泌前导序列) DNA就是可操作地连于多肽 DNA; 如果启动子控制序列的转录, 那么它是可操作地连于编码序列; 如果核糖体结合
位点被置于能使其翻译的位置时, 那么它是可操作地连于编码序列。 一般, "可操作地 连于" 意味着相邻, 而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
如本文所用, 术语 " 2A多肽编码序列" 、 "自剪切序列" 、 " 2A序列"指的是是发 现于病毒中的一段不依赖于蛋白酶的自剪切氨基酸序列, 类似于 I RES , 利用 2A可以实 现单一启动子同时表达两个基因。 它也广泛存在于各类真核细胞。 与 I RES不同的是, 下游蛋白表达量不会减少。 但剪切后 2A多肽残基与上游蛋白连为一体, 可在上游蛋白 和 2A多肽间加入一种 Furin蛋白酶剪切点(4个碱性氨基酸残基,如 Arg-Lys-Arg-Arg ) 以从上游蛋白末端完全切除 2A多肽残基。
如本文所用, 术语 "嵌合 RNA (chiRNA) " 、 "单链引导 RNA ( sgRNA ) "可互换使用, 均指由具有式 I所示结构编码序列的并能够转录形成一个完整的 RNA分子的 RNA序列。 核酸构建物
本发明提供了一种核酸构建物, 所述核酸构建物包括第一亚核酸构建物和第二亚核酸构 建物, 其中第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物是相互独立的, 或一体的;
其中, 第一亚核酸构建物包括从 5'至 3'的以下元件:
第一植物启动子;
与所述第一植物启动子操作性相连的嵌合 RNA的编码序列, 所述嵌合 RNA的编码序列的 结构如式 I所示:
A-B (I)
式中,
A为编码 CRI SPR RNA (crRNAs)的 DNA序列;
B为编码反式作用型 crRNA (trans-act ivat ing crRNA, tracrRNA)的 DNA序列; " -" 表示 A和 B之间的连接键或连接序列; 其中, 由所述嵌合 RNA的编码序列转录 形成一个完整的 RNA分子, 即嵌合 RNA (chiRNA) ; 和
RNA转录终止子 (包括但并不限于: U6转录终止子,为至少连续的 7个 T) ; 第二亚核酸构建物包括 5'至 3'的以下元件:
第二植物启动子;
与所述第二植物启动子操作性相连的 Cas蛋白的编码序列, 并且所述 Cas蛋白的是 N 端、 C端或两侧与核定位序列(NLS序列)融合的融合蛋白;
植物转录终止子(包括但并不限于 Nos等终止子)。
在本发明中, 第一植物启动子和第二植物启动子的强度分别能够启动产生有效量的 chiRNA和 Cas蛋白, 以实现对植物基因组的定点修饰。
应理解, 在本发明中, 第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物可以位于同一或不同 的多核苷酸上, 也可以位于同一或不同的载体上。
将本发明构建好的上述核酸构建物, 通过常规的植物重组技术(例如农杆菌转让技 术),可以导入植物细胞,从而获得携带所述核酸构建物(或带有所述核酸构建物的载体) 的植物细胞, 或获得基因组中整合有所述核酸构建物的植物细胞。
在所述植物细胞中, 本发明核酸构建物所转录形成的 chi RNA以及所表达形成 Cas蛋
白, 可以配合对基因组进行定点切割, 进而引入各种不同的突变。
此外, 为了获得更多含有突变基因的种子, 并进一步提高 CRISPR/Cas9***在生殖 细胞中的活性, 减小基因打靶技术对植物发育过程可能产生的不良影响, 本发明采用了 拟南芥 SP0R0CYTELESS ( SPL) 基因的表达框架来驱动 Cas9基因的表达。
SPL基因在拟南芥的生殖细胞系,包括大孢子母细胞和小孢子母细胞中都有特异的表 达。原位杂交实验的结果表明, SPL基因的表达框架能有效地启动 Cas9在生殖细胞系中 的转录。 同时, 突变体检测的结果也证明, 由 SPL启动子驱动的 Cas9表达***, 并不 影响 T 1代转基因植物的基因功能和生长发育, 但在 T2代的转基因群体中却可以获得大 量靶向基因发生突变的杂合子, 这说明目的基因的突变是在生殖细胞中发生的。
为了进一步提高 sgRNA在植物中的稳定性, 以及 CRISPR/Cas9***的基因打靶效率, 构建了 TBSV-p l9蛋白与 Cas9蛋白共表达的基因打靶载体 pSgR-Cas9-p l9。 通过在拟南 芥的瞬时表达***中检测重组正确的 YFFP基因的蛋白活性, 实验证明, p l9蛋白可以显 著提高 CRI SPR/Cas9***的基因打靶效率。
此外, 同时构建了以拟南芥内源基因为靶点的 P 19共表达载体, 在得到的 T1代植物 中, 约 1/3出现了明显的叶发育表型, 提示 p l9对受 miRNA调控的植物发育过程有抑制 作用。 Northern检测及基因表达定量分析的结果表明, p l9蛋白的表达水平与 miR168 和 sgRNA的累积量呈正相关性。 同时, 对靶向位点的表型和基因型分析也说明, p l9 表达量高的转基因植物, 靶基因发生突变的概率也更高, 这为进一步改进基于
CRISPR/Cas9的植物基因打靶***提供了重要的依据和手段。 定点切割的方法
本发明还提供了一种对植物的基因组进行定点切割或定点修饰的方法。
(a)将表达嵌合 RNA和表达 Cas蛋白的核酸构建物导入植物细胞, 获得转化的植物细胞; 禾口
(b)在合适的条件下,使转化的植物细胞中的所述核酸构建物转录形成嵌合 RNA (chiRNA) , 并且使所述转化的植物细胞表达所述的 Cas蛋白, 从而使得在所述嵌合 RNA的引导下, 在 所述转化的植物细胞中通过所述 Cas蛋白进行基因组定点切割, 从而进行基因组定点修饰。
在本发明方法中,步骤 (a)中的表达嵌合 RNA和表达 Cas蛋白的核酸构建物可以是同一核 酸构建物, 也可以是不同的核酸构建物。
另外, 如果待处理的植物或植物细胞中已经含有了 Cas蛋白表达盒, 那么可以仅导入表 达嵌合 RNA的核酸构建物。
此外, 如果需要同时在多个特定位点进行定点切割或定点修饰, 那么可以将表达多个不 同 chiRNA的核酸构建物(可以是同一或不同的核酸构建物)导入植物细胞。
在定点切割后, 植物细胞会通过多种机制进行修复, 并常常会在修复过程中引入各 种不同的突变。 基于此, 人们可以筛选出具有所需突变或所需表现的植物或植物细胞, 以便用于后续研究或生产。 定点精确修饰的方法
如果需要在植物基因组中进行定点精确***、 缺失或者替换 DNA序列, 那么可以在
嵌合 RNA和 Cas蛋白对基因组进行定点切割之前, 导入供体 DNA, 所述供体 DNA可以为 单链或双链 DNA, 并包含待***或待替换的 DNA序列, 所述 DNA序列可以为单个核苷酸、 或多个核苷酸 (包括 DNA片段或者编码基因) 。 在定点切割后, 植物细胞可以通过同源重 组介导的 DNA修复***, 以供体 DNA为模板, 对植物基因组进行定点精确***、 缺失或 者替换修饰。 所述供体 DNA可以用于在植物基因组特定位置***或置换特定 DNA序列; 也可以用于替换启动子, ***增强子等 DNA顺式调控元件, 以调控植物内源基因的表达 水平; 还可以用于***编码完整蛋白的多核苷酸序列。 导入供体 DNA的方法包括但不限 于: 显微注射, 农杆菌介导转染, 基因枪法, 电击法, 超声波法, 脂质体介导法, 聚乙 二醇 (PEG) 介导法, 激光微束穿剌孔法, 供体 DNA经化学修饰 (添加亲脂性基团) 后直接导入等。 应用
本发明可应用于植物基因工程领域, 用于改造各种不同的植物, 尤其是具有经济价 值的农作物和林业植物。 本发明的主要优点包括:
(a)可特异性地在植物基因组的特定位置, 进行定点切割和修饰。
(b)可高效地在特定位置引入各种不同形式的修饰。
(c)可高效地在特定位置引入新的基因。
(d)可高效地敲除植物基因组的特定基因。
(e)可有效地调控植物內源基因的表达水平。 下面结合具体实施例, 进一步阐述本发明。 应理解, 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法, 通常按照常规 条件, 例如 Sambrook等人, 分子克隆: 实验室手册(New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件, 或按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说 明, 否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。 通用材料和方法
拟南芥和水稻植物生长
试验中采用拟南芥野生型 Col-0 (购自美国 ABRC中心)。种子播种到 MS培养基上先在 4 ° C春化 3天, 然后放入 22 ° C长光照生长室(16 h光照 /8 h 黑夜), 5_10天后移苗到 营养土。
实验中采用的水稻为 Kasalath品种(购自中国水稻所), 植株移栽到土中后生长于温 室中(16 h光照, 30度 /8 h 黑夜, 22度)。
目的位点的设计
合适的 chiRNA目的位点为 N^NGG的形式, 其中 。为 chiRNA载体构建物所需要提 供的识别序列, NGG为 CRISPR/Cas9复合体与 DNA目的位点结合所需要的识别序列, 称 为 PAM序列。
因为 U6型小 RNA的转录以 G作为起始信号, 因此, 选用对 GN19NGG这种形式的序列 作为目的位点。 此外, 因为研究表明 CRISPR/Cas***可以容忍目的位点远离 PAM序列 一侧多达 5个碱基的错配, 因此如果 。的第一个核苷酸是 G, 则合成目的位点 o l igo 引物为接头加 。; 如果 2。的第一个核苷酸不是 G, 则本实施例中也将之当做为 G, 合 成目的位点 ol i go引物为接头加 GN2_2。。
载体构建
从载体 PX260中, 用引物 Cas9-F和 Cas9-R, 通过 PCR扩增 SpCas9的编码序列, 亚 克隆到 PA7-GFP载体的 Xhol和 BamHI位点之间替换掉其原来的 GFP基因, 这样就分别 在 N端和 C端获得了 2x 35S 启动子和 Nos终止子。 pX260和 A7-GFP载体的详细构建方 法见文献(Voelker et al., 2006 ; Cong et al ., 2013)。 随后用 Hindl l l/EcoRI酶切 位点将 2x 35S启动子到 Nos终止子这段完整的 Cas9表达盒亚克隆到 pBluescript SK+ 载体(购自 Stratagene Inc. , San Diego, CA ), 命名为 35S_Cas9_SK。
以拟南芥野生型 Col-0基因组 DNA为模板, 用 AtU6-26F和 AtU6_26R引物通过 PCR 扩增获得 AtU6-26启动子,然后亚克隆到 pEasy-Blunt载体(购自全式金生物,北京)中, 挑选 Kpnl在启动子前端的克隆。随后利用 Kpnl/Xhol酶切位点亚克隆到 pBluescript SK+ (购自 Stratagene Inc., San Diego, CA)载体中。 用 AtU6-26_85F和 AtU6-26_85R引物 通过 PCR扩增的方法从载体 pX330中获得 85 bp的 chiRNA诱导序列并与 AtU6_26启动 子融合, 从而获得完整的 chiRNA表达载体 (见图 10 ) , 获得的载体命名为 At6-26SK。 根据设计的目标位点合成上下游寡聚核苷酸链(见表 1), 退火形成的带有接头的双链小 片段通过连接反应克隆到 Bbs l酶切后的 At6-26SK的两个 Bbsl位点之间。
随后用 Kpnl/EcoRI酶切将 chiRNA表达盒亚克隆到 35S-Cas9_SK中用于瞬时表达分 析, 或者用 Kpnl/Sal l酶切后与带有完整 Cas9表达框的 Sal l/EcoRI片段一起亚克隆到 pCamb ial300载体的 Kpnl/EcoRI 区域(Cambia, Canberra, Austral ia)以用于拟南芥转 基因。
以水稻野生型 Nipponbare基因组 DNA为模板用 0sU6_2F和 0sU6_2R引物通过 PCR扩 增获得 0sU6-2启动子, 然后亚克隆到 pEasy-Blunt载体(全式金生物, 北京)中。
随后用 TPCR-0sU6F禾口 TPCR_0sU6R弓 |物通过 Transfer PCR的方法 4 0sU6-2转移至 lj At6-26SK载体中替换 AtU6-26启动子, 获得载体 0sU6_2SK (见图 12 ) 。 根据设计的目 标位点合成上下游寡聚核苷酸链, 退火形成的带有接头的双链小片段通过连接反应克隆 到 Bbs l酶切后的 0sU6-2SK的两个 Bbsl位点之间。 随后用 Kpnl/EcoRI酶切将 chiRNA 表达盒亚克隆到 35S-Cas9-SK中用于瞬时表达分析, 或者用 ΚρηΙ/HindI I I酶切后与带 有完整 Cas9表达框的 Hindl l l/EcoRI片段一起亚克隆到 pCambial300 载体的
Kpnl/EcoRI 区域(Camb ia, Canberra, Austral ia)以用于水稻转基因。
以拟南芥野生型 Col-0基因组为模板,用 pAtU6-F-HindI I I和 PAtU6_R引物通过 PCR 扩增得到 AtU6-26启动子片段 pAtU6-26。 以 pX330载体为模板, 用 sgR-F_U6和 sgR-R-Smal引物通过 PCR扩增得到 chiRNA (即 sgRNA)片段。 随后以 chiRNA和 pAtU6的 PCR产物的混合物为模板, 用 pAtU6-F-HindI I I和 sgR-R-Smal引物进行重叠 PCR获得 pAtU6-chiRNA片段(SEQ ID NO. : 40), 经过 Hindi I I和 Xmal酶切后*** pMD18T载体相 应位置得到 psgR-At载体。
以拟南芥野生型 Col-0基因组为模板, 分别用 pAtUBQl-F-Smal和 pAtUBQl-R-Cas与 tUBQl-F-BamHI和 tUBQ-R-Kpnl为引物通过 PCR扩增获得 AtUBQl的启动子 pAtUBQl和终 止子。 以 pX330载体为模板, 以 Cas9-F-pUBQ 和 Cas9-R_BamHI为引物通过 PCR扩增获 得 Cas9基因片段。 将上述 pAtUBQl , Cas9基因和 AtUBQl的终止子片段分别用 Xmal禾口 NcoI,NcoI禾口 BamHI以及 BamHI禾口 Kpnl酉每切后共同连人用 Xmal禾口 Kpnl双切的 psgR-At 载体, 最终得到***片段为 pAtUBQ-Cas9-tUBQ (SEQ ID NO.: 41)的 psgR-Cas9_At骨架 载体。
选择符合 5 ' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG-3 ' 的序列作为靶标。 对于 psgR-CaS9-At 载体, 分别合成正义链 5 ' -GATTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3 ' 和反义链
5 ' -AAAC丽顺丽顺丽顺丽顺丽 NC-3 ' 。 随后将两条合成的人工序列链变性退火形成带接 头的双链 DNA小片段, *** psgR-Cas9-At的两个 Bbsl酶切位点之间, 获得针对特定目 标位点的 psgR-Cas9-At载体。 从已***有靶标基因片段的 psgR-At载体上, 用 pAtU6-F-KpnI禾口 sgR— EcoRI弓 |物, 扩增得至 lj完整的 pAtU6— chiRNA元件, 并用 Kpnl禾口 EcoRI酶切后***已经带有针对另一个靶标基因的 PAtU6-chiRNA元件的 psgR-Cas9_At 载体, 得到 p2 X sgR-Cas9-At载体。 随后用 Hindl l l和 EcoRI酶切, 将完整的 2 X sgR-Cas9-At亚克隆到 pCambial300 (Cambia, Canberra, Austral ia)载体得到双元载体 p2 X 1300-sgR-Cas9用于拟南芥转基因。
pUBQ-Cas9-sgR系列载体的构建
合成引物 sgR-Bsa I -F/R, 用 PNK激酶将引物加磷, 缓慢退火, 连入 psgR-Cas9_At 的 Bbs I位点。 将所得到的 psgR-Cas9-Bsa载体用 EcoR I和 Hindlll酶切连入 pBinl9载 体。 SP得 pUBQ-Cas9-sgR载体。 将合成的引物 sgR_APl_S27/A27和 sgR_APl_S194/A194 也按照上述方法连入 pUBQ-Cas9-sgR载体的 Bsa I位点,即得 pUBQ-Cas9-sgR-APl_27和 pUBQ-Cas9-sgR-APl-194 o
pSPL-Cas9-sgR系列载体的构建
合成引物 SPL5 ' -F-Xma I和 SPL5 ' -R-Bsa I, 从拟南芥基因组上扩增 SPL基因的 5 ' 端启动子序列。 该片段用 Xma I和 Bsa I酶切后, 连入 psgR-Cas9_Bsa的 Xma I和 Nco I 位点, 得至 lj pSPL_Cas9_5 ' 。 合成弓 |物 SPL3 ' _F_BamH I禾口 SPL3 ' -R-Kpn I , 从拟南芥 基因组上扩增 SPL基因的 3 '端序列,该序列包括 SPL基因的后个外显子(SEQ ID NO.: 104、 106)和两个内含子(SEQ ID NO.: 103、 105)以及终止子(SEQ ID NO.: 108), 用 BamH I 禾 P Kpn I酶切后连入 pSPL-Cas9-5, ,得到 pSPL-Cas9_53, 。 所得质粒用 Xma I和 Kpn I 酶切后,连入 pUBQ-Cas9-sgR,即得 pSPL-Cas9_sgR载体。将合成的引物 sgR_APl_S27/A27 和 sgR-APl-S194/A194也按照上述方法连入 pSPL-Cas9_sgR载体的 Bsa I位点, 即得 pSPL-Cas9-sgR-APl-27禾口 pSPL - Cas9 - sgR - API - 194。
psgR-Cas9-pl9载体的构建
含有 Nco I位点的 TBSV-pl9-2A基因由金唯智公司合成。 将该基因片段用 Ncol酶切 后*** psgR-Cas9载体的 Ncol位点, 用 pl9_F和 Cas9_378R引物鉴定片段的***方向, 即得 psgR-Cas9-pl9载体。
psgR-Cas9-MRSl/2载体的构建
分别合成引物 sgR_MRSl_S/A禾 P sgR_MRS2_S/A。 连入 psgR_Cas9_At的 Bbs I位点,
即得 psgR-Cas9-MRSl禾口 psgR_Cas9_MRS2载体
psgR-Cas9-MRSl/2-pl9载体的构建
分别合成引物 sgR_MRSl_S/A禾 P sgR_MRS2_S/A。 连入 psgR_Cas9_pl9的 Bbs I位点, 即得 psgR- Cas9- MRS1- pl9和 psgR- Cas9- MRS2- pl9载体
1300-psgR-Cas9-pl9-APl/TT4载体的构建
分别合成引物 sgR-APl-S27/A27, sgR-APl_S194/A194, sgR_TT4_S65/A65禾口 sgR-TT4-S296/A2960用 PNK激酶将引物加磷,退火,连入 psgR-Cas9-pl9的 Bbs I位点, 即得 psgR-Cas9-pl9-APl-27, psgR-Cas9-pl9-APl-194, psgR-Cas9-pl9-TT4-65禾口 psgR_Cas9_pl9_TT4_296。 用 AtU6_F_KpnI禾口 sgR_R_EcoRI弓 |物分另 ij扩增
psgR- Cas9- API- 194- pl9和 psgR- Cas9-pl9-TT4- 296, 所得片段用 Kpn I和 EcoR I酶切 连入 psgR_Cas9_pl9_APl-27和 psgR_Cas9_pl9_TT4_65, 即得 psgR_Cas9_pl9_APl禾口 psgR-Cas9-pl9-TT4o 将这两个质粒用 Hindlll和 EcoR I酶切, 回收, 连入 pCAMBIA1300 载体, 即得 1300-psgR-Cas9-pl9-APl禾 P 1300-psgR-Cas9-pl9-TT4载体。
基于同源重组的瞬时 YF-FP报告***分析
在 pA7-YFP的基础上构建了一个基于同源重组的瞬时 YF-FP报告***。 pA7_YFP载体 图谱见图 9, 它以 pUC18载体为骨架, 在多克隆位点处***了一个 2X35S启动子 -EYFP-N0S终止子的完整表达盒。 以 pA7-YFP载体为模板, 分别用表 1中的两对引物 YF-FP 1F禾 P YF-FP 1R与 YF-FP 2F禾 P YF-FP 2R通过 PCR扩增的方法分别获得 YFP基因 的 1-510 bp和 229-720 bp这两段编码序列, 然后通过一个 18bp的酶切接头(GGATCC ACTAGT GTCGAC) (SEQ ID NO.: 103)或一个 55bp的多重识别序列 (MRS:
ACTAGTTCCCTTTATCTCTTAGGGATAACAGGGTAATAG AGATAAAGGGAGGCCT ) (SEQ ID NO.: 104) 连接起来, 并利用 Xhol/Sacl放回到 pA-YFP载体上以替换原来的 YFP编码区。 该载体 的 YFP编码区域在酶切接头两侧有 282 bp的重叠区域。 根据已经报道的方法制备拟南 芥叶肉细胞原生质体和 PEG转化转化(Yoo et al., 2007)。 转化后室温暗培养 16-24 小 时的样品用流式细胞仪进行荧光检测。 创建拟南芥和水稻稳定转基因植株
将带有 SpCas9完整表达盒和 chiRNA完整表达盒的 pCambial300载体转化到农杆菌 GV3101中。 选取正在盛花期的健壮野生型 Col-0植株用浸花法进行转基因(Clough and Bent, 1998)。 正常护理转基因植株至收获种子, 收到的 T1代种子, 用 5%次氯酸钠消毒 后 10分钟后, 无菌水漂洗 4次, 播撒在含 20 μ /L 潮霉素或 50 μ Μ卡那霉素的 MS0培 养基上筛选。 4°C放置 2天后, 移入 12小时光照的培养箱中培养 10天后, 移栽到 16小 时光照的温室中, 继续培养。 。通过农杆菌介导转化水稻愈伤组织获得转基因植株 (Hiei et al., 1994)。
基因组修饰的酶切和测序分析
提取潮霉素筛选获得阳性转化子的基因组 DNA。用目标位点对应的引物进行 PCR扩增 并回收。 每个样品取大约 400ng PCR回收产物用相应的限制性内切酶酶切过夜。 酶切反 应用琼脂糖凝胶电泳(1.2-2%)进行分析。 对酶切后残留的未被切割的条带进行割胶回 收,连接到 pZeroBack/blunt载体(天根生物,北京)中,对单克隆摇菌制备质粒后用 M13F
引物进行桑格法测序分析。
生殖细胞打靶的突变体鉴定
对四种不同的转基因 T1代群体, 随机选取 32个株系, 分别在生长 2周后和开花后 各选取 1枚叶片和一个花序, 用 CTAB法提取 DNA基因组。 以 AP1-F133/271R为引物, PCR扩增目的基因片段并测序, 突变体会从剪切位点起出生套峰。对于 T2代的转基因群 体, 随机选取 8个发生突变的株系, 各检测 12个单株。 将测序结果为套峰的 PCR产物, 进行 TA克隆, 并挑取 10个单克隆测序以确定突变基因的类型。
含 P19蛋白的突变体鉴定
对 T1代的 1300-pSgR-Cas9-pl9-APl/TT4转基因植物群体, 各随机选取 60个株系, 在生长 2周后取 1枚叶片, 用 CTAB法提取 DNA基因组。 分别以 AP1-F133/271R和
TT4-F159/407R为引物, PCR扩增目的基因片段, 电泳检测 PCR的条带, 统计发生片段 确实植物株系和相关的发育表型。
原位杂交
1.材料包埋:选用抽薹后的转基因植物的花序为材料,用 4%的多聚甲醛固定 12小时, 梯度酒精脱水, 二甲苯透明后石蜡包埋。
2.探针制备: Cas9基因以引物 dCas9-F3-F/R扩增后, 所得片段用 Pstl和 BamHI酶 切连入 pTA2载体。 所得载体用 Sal I线性化后, 作为 DNA模板, 分别用 T7和 SP6RNA聚 合酶在体外转录出反义和正义的 Biotin标记 RNA探针 (Roche, 11175025910 ) 。 产物 经过 DNase I消化, 碱裂和纯化后溶解于甲酰胺中保存。
3.原位杂交按照文献报道的方法操作。 (Brewer PB, Heisler MG, Hejatko J, Friml
J, Benkova E (2006) In situ hybridization for mRNA detection in Arabidopsis tissue sections. Nat Protoc 1 : 1462-1467. )
Northern杂交
取开花期植物的花序, 用 Trizol法提取总 RNA (Invitrogen)。每个样品上样 50 μ g, 用 15%的 PAGE胶分离目的 RNA条带并用湿转法转移到硝酸纤维素膜上(Hybond,
Amersham)。 紫外交联 2分钟后, 在杂交液 (DIG EASY Hyb, Roche ) 中预杂交 1小时, 加入 20 μ Μ地高辛标记的人工序列探针 (Invitrogen) , 42°C杂交过夜。 2 X SSC, 0. 1% 的 SDS洗膜两次, 每次 10分钟, 0. 1 X SSC, 0. 1%的 SDS洗膜两次, 每次 10分钟。 用地 高辛检测试剂盒 (Thermo Fi sher ) 检测目的条带, 压片 15分钟后, 用 X光片显影。
Realtime PCR
将提取的植物总 RNA用 DNase I ( Takara) 处理 30分钟,酚氯仿纯化后, 取 5 μ g做 反转录 (Takara) 。 产物稀释 1倍后, 取 Ι μ ΐ做模板, 配置 Realtime-PCR反应体系 ( Biorad) 。 每个样品做三个重复, 以 ACTIN基因为内参, Col野生型为对照, 用 2- Δ Δ Ct法计算基因表达的相对变化。
序列信息
表 1 序列信息
SEQ
用途 引物名称 引物序列 (5'-->3') ID
NO.: 克隆 YF-FP 1 F ACACGCTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGG 5
YF-FP 1 R ACACGGTCGACACTAGTGGATCCGTGGCGGATCTTGAAGTTCAC 6
YF-FP 2F ACACGGGATCCACTAGTGTCGACGACCACATGAAGCAGCACGAC 7
YF-FP 2R ACACGGAGCTCTTACTTGTACAGCTCGTC 8
Cas9-F TTACTCGAGATGGACTATAAGGACCACGACG 9
Cas9-R ATTGGATCCTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGGC 10
AtU6-26F AAGCTTCGTTGAACAACGGA 1 1
AtU6-26R CGAAGGGACAATCACTACTTCG 12
TTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACAGGTCTTCTC
AtU6-26-85F 13
GAAGACCCAATCACTACTTCGACTCTAGCTGTA
GTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGC
AtU6-26-85R 14
ACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGTCCCTTCGAAGGGCCTTT
OSU6-2F GGATCATGAACCAACGGCCT 15
OSU6-2R AACACAAGCGACAGCGCG 16
TPCR-OSU6F GCCAGTGTGCTGGAATTGCCCTTGGATCATGAACCAACGGCC 17
TPCR-OSU6R GCTCTAAAACAGGTCTTCTCGAAGACCCACACAAGCGACAGCGCG 18
YF-FP chiRNAI F GATTGTGAACTTCAAGATCCGCCA 19
YF-FP chiRNAI R AAACTGGCGGATCTTGAAGTTCAC 20
BRI 1 chiRNAI F GATTGTGGGTCATAACGATATCTC 21
BRI 1 chiRNAI R AAACGAGATATCGTTATGACCCAC 22
BRI 1 chiRNA2 F GATTGGACATACATGAGCTCCTGA 23 目的位
BRI 1 chiRNA2 R AAACTCAGGAGCTCATGTATGTCC 24
BRI 1 chiRNA3 F GATTGTAAGAGCTGACATAGCCTG 25 oligos
BRI 1 chiRNA3 R AAACCAGGCTATGTCAGCTCTTAC 26
GAI chiRNAI F GATTGATGAGCTTCTAGCTGTTCT 27
GAI chiRNAI R AAACAGAACAGCTAGAAGCTCATC 28
ROC5 chiRNAI F GTGTGCGGAGAACGACAGCCGGTC 29
ROC5 chiRNAI R AAACGACCGGCTGTCGTTCTCCG C 30
BRI 1 1 F GAATCTCTGACGAATCTATCC 31
BRI 1 1 R CACTCTTTCTTCATCCCATC 32
BRI 1 2F GATGGGATGAAGAAAGAGTG 33
RFLP BRI 1 2R CTCATCTCTCTACCAACAAG 34 检测 GAI F TGTTATTAGAAGTGGTAGTGGAGTG 35
GAI R AGCCGTCGCTGTAGTGGTT 36
ROC5 F CTTTGGGGGCCTCTTTGAC 37
ROC5 R ATCTGCGTGCGGCGATTC 38 实施例 1
使用酿脓链球菌 SF370的 CRISPR/Cas9在拟南芥原生质体中造成定点 DNA双链断裂。 结果如图 1所示。构建 YFP1 目标位点 chiRNA的 ol igo为表 1中的 YF-FP F和 YF-FP R。 结果表明, 当将 YF-FP报告基因和 CRISPR/Cas载体共转拟南芥原生质体后, 可以获 得很强的 YFP信号,基于同源重组的基因修复效率高达 18. 8% [ (4. 76%-0. 78%) /21. 23%]。 这说明构建的 CRISPR/Cas***发挥功能, 能够实现在植物细胞中高效地对 DNA序列进 行双链切割产生双链断裂。
实施例 2
构建用于农杆菌介导的拟南芥和水稻的转化的单一二元载体中表达 chiRNA和 hSpCas9 , 并选取 2个拟南芥基因 BRI 1和 GAI与 1个水稻基因 R0C5设计目标位点。
结果如图 2所示。 载体的 Cas9表达盒完全相同。 对于 chiRNA表达盒, 用于拟南芥 转化的采用 AtU6-26启动子, 用水稻转化的采用 0sU6-2启动子。 BRI 1位点 1, 2, 3的 chiRNA构建所对应 o l igos分别为表 1中的 BRI l chiRNAl F禾 P BRI 1 chiRNAl R, BRI l chiRNA2 F禾口 BRI l chiRNA2 R, BRI l chiRNA3 F禾口 BRI l chiRNA3 R。 GAI位点 1的 chiRNA 构建所对应的 ol igos为表 1中的 GAI chiRNAl F禾 P GAI chiRNAl R。R0C5位点 1的 chiRNA 构建所对应的 o l igos为表 1中的 R0C5 chiRNAl F和 R0C5 chiRNAl R。 实施例 3
通过目标位点在拟南芥和水稻中产生稳定转基因植物。
结果如图 3所示。 RFLP鉴定 BRI 1位点 1和 3的转基因植株的 PCR引物为表 1中的 BRI l 1F和 BRI l 1R, RFLP鉴定 BRI l位点 2的转基因植株的 PCR引物为表 1中的 BRI l 2F 禾口 BRI l 2R。 RFLP鉴定 GAI位点 1的转基因植株的 PCR引物为表 1中的 GAI F和 GAI R。 RFLP鉴定 R0C5位点 1的转基因植株的 PCR引物为表 1中的 R0C5 F和 R0C5 R。
结果表明, 很大比例的拟南芥转基因 T 1代植株在生长早期显现出与目的基因位点纯 合突变相似的表型。 RFLP酶切分析显示有些转基因植株的目的位点位置的 PCR产物有明 显的不能被酶切的片段残留, 说明这些植株中部分细胞的目的位点位置的天然酶切位点 已经丢失。 进一步测序结果显示, 所有选定的拟南芥和水稻目的基因的 T1代转基因植 株在目的基因位点都有多种类型的 DNA突变, 包括短的删除, ***或替换。 这说明 CRISPR/Cas***可以高效地在拟南芥和水稻的转基因植株中高效地对基因组的多个位 点进行定点的切割, 从而获得对特定基因的修饰。 实施例 4
使用工程化的 chiRNA: Cas9在多个拟南芥植株中 ?/7基因位点 1上诱导产生靶向 位点***和缺失突变 (图 11、 图 13 ) 。
结果如图 4所示。 对 12株 T1代独立转基因植株进行测序鉴定, 从 98个克隆中检测 到了 75个突变, 总共获得 37种不同类型的突变类型。 值得注意的是有的序列既有*** 又有缺失。 结果表明 CRI SPR/Cas***可以高效地在拟南芥目的基因位点进行定点的切 害 从而获得对特定基因的修饰。 实施例 5
使用工程化的 chiRNA: Cas9在多个拟南芥植株中 ?/7基因位点 2上诱导产生靶向 位点***和缺失突变。
结果如图 5所示。 对 3株 T 1代独立转基因植株进行测序鉴定, 从 71个克隆中检测 到了 28个突变, 每个植株都有 2种或两种以上的突变类型。 结果表明 CRISPR/Cas*** 可以高效地在拟南芥目的基因位点进行定点的切割, 从而获得对特定基因的修饰。
实施例 6
使用工程化的 chiRNA: Cas9在多个拟南芥植株中 ?/7基因位点 3上诱导产生靶向 位点***和缺失突变。
结果如图 6所示。 对 4株 T1代独立转基因植株进行测序鉴定, 从 34个克隆中检测 到了 22个突变, 每个植株都有 2种或两种以上的突变类型。 结果表明 CRISPR/Cas*** 可以高效地在拟南芥目的基因位点进行定点的切割, 从而获得对特定基因的修饰。 实施例 7
使用工程化的 chiRNA: Cas9在拟南芥中 GAI基因位点 1上诱导产生靶向位点***和 缺失突变。
结果如图 7所示。 对 3株 T1代独立转基因植株进行测序鉴定, 从 53个克隆中检测 到了 17个突变, 每个植株都有 1种或以上的突变类型。 结果表明 CRISPR/Cas***可以 高效地在拟南芥目的基因位点进行定点的切割, 从而获得对特定基因的修饰。 实施例 8
使用工程化的 chiRNA: Cas9在水稻中 R0C5基因位点 1上诱导产生靶向位点***和 缺失突变。
结果如图 8所示。 对 15株 T1代独立水稻转基因植株进行测序鉴定, 从 165个克隆 中检测到了 136个突变,每个植株都有 1种或多达 5种的突变类型。结果表明 CRISPR/Cas ***可以高效地在水稻目的基因位点进行定点的切割, 从而获得对特定基因的修饰。
上述实施例的部分试验的汇总结果如表 2所示:
表 2. 拟南芥和水稻 T1代转基因植株中检测到的目的位点突变统计表
、 , ^ 目标位点突变 目标位点不同类 植株编号 测序克隆数目
的克隆数目 型突变的数目
1 9 7 4
2 8 8 8
3 8 3 3
4 10 8 7
5 7 7 4
6 8 5 4
BRI1 位点 1 7 7 6 5
8 7 4 4
9 10 8 5
10 10 9 6
1 1 6 4 4
12 8 6 6
总计 98 75 60
1 23 13 3
BRI1 位点 2 2 24 1 1
3 24 4 2
总计 71 28 9
1 10 6 4
2 9 7 2
BRI1 位点 3 3 6 4 3
4 9 5 2
b计 34 22 1 1
1 15 8 1
GAI位点 1 2 19 4 2
3 19 5 1 总计 53 17 4
1 33 27 1
2 27 19 5
ROC5位点 1 3 31 29 1
4 41 28 2
5 33 33 2
b计 165 136 1 1 实施例 9
重复实施例 4,不同点在于,用启动子 AtU6- 1替换 AtU6-26。同样使用工程化的 ch i RNA: Cas9在多个拟南芥植株中 ?/7基因位点 1上诱导产生靶向位点***和缺失突变。
对 10株 T1代独立转基因植株进行测序鉴定, 结果表明, 采用 AtU6-l同样可以在基 因组特定位点引入突变,但引入突变的频率较低,不足 AtU6-26的约 10%。这提示, AtU6-26 是特别优选的第一植物启动子。 实施例 10
通过目标位点对拟南芥中 2个不同基因同时进行突变。
使用 P2 X 1300-sgR-Cas9载体在多个拟南芥植株中同时对 CHLi 基因位点 诱导产生靶向位点***和缺失突变, 结果如图 15、 表 4和表 5所示。 对 3株 T1代独立 转基因植株进行测序鉴定, 各植株在 /7和 基因位点都有多种突变类型。 结果 表明 CRISPR/Cas***可以高效地实现在拟南芥多个目的基因位点同时进行定点的切割, 从而同时获得对多个特定基因的修饰。
构建载体所使用的 chiRNA ol igos为表 3中的 sgCHLI l_S101和 sgCHLI l_A101与 sgCHLI2-S280禾 P sgCHLI2_A280。 SURVEYOR分析检测转基因植株的 PCR引物为表 3中的 CHLI 1-3-F禾口 CHLI 1— 262— R与 CHLI2-3-F禾口 CHLI2— 463_R。 实施例 11
通过目标位点在拟南芥中同一个基因的 2个位点同时进行突变及实现大片段删除 使用 p2 X 1300-sgR-Cas9载体在多个拟南芥植株中同时对 7 基因中的 2个位点诱 导产生靶向位点***和缺失突变,以及造成 2个位点间序列的大片段缺失,结果如图 16、
表 4和表 5所示。 对 11株 T1代独立转基因植株进行测序鉴定, 每个植株在 77 基因的 2个位点都有多种突变类型, 而且在多个植株中检测到目的位点之间序列的整体缺失。 结果表明 CRISPR/Cas ***可以高效地实现在拟南芥同时对同一基因内多位点进行定点 切割修饰, 并能够实现大片段序列整体删除。
构建载体所使用的 chiRNA ol igos为表 3中的 sgTT4_S65和 sgTT4_A65与 sgTT4_S296 和 sgTT4-A296。 SURVEYOR分析检测转基因植株的 PCR引物为表 3中的 TT4-1-F和 TT4-362-R与 TT4-F-159禾口 TT4- 407- R。
表 3 引物列表
SEQ ID
用途 引物名称 引物序列 (5'-->3')
NO.: 克隆 pAtU6-F-Hindl l l GCCAAGCTTCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTC 42 pAtU6-R AATCACTACTTCGACTCTAGCTGTATATAAACTCAGCTTCG 43 sgR-F-U6 CGAAGTAGTGATTGGGTCTTCGAGAAGACCTGTTTTAG 44 sgR-R-Smal 5TATCCCGGGGCCATTTGTCTGCAGAATTGGC 45 pAtUBQ1 -F-Smal TGGCCCCGGGATATTTCACAAATTGAACATAGACTAC 46 pAtUBQ1 -R-Cas CCTTATAGTCCATGGTTTGTGTTTCGTCTCTCTCACGTAG 47
Cas9-F-pUBQ CACAAACCATGGACTATAAGGACCACGACGGAG 48
Cas9-R-BamHI TCTGGATCCTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGGCCGGCC 49 tUBQ1 -F-BamHI TAAGGATCCAGAGACTCTTATCAAGAATCCCATCTCTTGC 50 tUBQ-R-Kpn l ACGGTACCACATAAACGGTCATTATTTCACGATACTTGTATAG 51 pAtU6-F-Kpn l GTGGTACCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTC 52 sgR-EcoRI ACGAATTCGCCATTTGTCTGCAGAATTGGC 53 sgR-Bsal-F GATTGGAGACCGAGGTCTCT 70 sgR-Bsal-R AAACAGAGACCTCGGTCTCC 71
SPL5'-F-Xmal TTACCCGGGAACACGAAGTCACAAAACCC 76
SPL5'-R-Bsal GGTCTCCCATGGTGATGATGATCTTCTTCTCGG 77
SPL3'-F-BamH I AATGGATCCGTTTGTTTGTTTTTTAATCGTTTTCATCAACATG 78
SPL3'-R-Kpnl AATGGTACCACGAGAACGTGCTGAGC 79 突变检测 CHLI 1 -3-F GGCGTCTCTTCTTGGAACATC 54
CHLI 1 -262-R CCGAAACATGGTAACGAGACC 55
CHLI2-3-F GGCGTCTCTTCTCGGAAGAT 56
CHLI2-463-R CGGATAAACAGGTCTTGCAC 57
TT4-1 -F ATGGTGATGGCTGGTGCTTC 58
TT4-362-R CATGTAAGCACACATGTGTGGG 59
TT4-F- 59 CTGCCCGTCCATCTAACCTAC 60
TT4-407-R GACTTCGACCACCACGATGT 61
AP1 -F1 1 3 GGTTCATACCAAAGTCTGAGC 80
AP1 -27 R TCAAGTAGTCAACTTAAGGGGG 81 目的位点 sgCHLI 1 -S1 01 GATTGCCCCCATTTGCTTCAGGCC 62 oligos
sgCHLI 1 -A1 01 AAACGGCCTGAAGCAAATGGGGGC 63 sgCHLI2-S280 GATTGGACATTCATAACAGAGACA 64 sgCHLI2-A280 AAACTGTCTCTGTTATGAATGTCC 65 sgTT4-S65 GATTGAGAGAGCTGATGGACCTGC 66 sgTT4-A65 AAACGCAGGTCCATCAGCTCTCTC 67 sgTT4-S296 GATTGAGGCGACAAGTCGACAATT 68 sgTT4-A296 AAACAATTGTCGACTTGTCGCCTC 69
sgR-AP1-S27 GATTGGGGTAGGGTTCAATTGAAG 72 sgR-AP1-A27 AAACCTTCAATTGAACCCTACCC 73 sgR-AP1-S 94 GATTGTGAAGTTACCAAGAATCAG 74 sgR-AP1-A 94 AAACCTGATTCTTGGTAACTTCA 75 sgR-MRS1-S GATTGACAGGGTAATAGAGATAAA 86 sgR-MRS1-A AAACTTTATCTCTATTACCCTGT 87 sgR-MRS2-S GATTGGGGTAATAGAGATAAAGGG 88 sgR-MRS2-A AAACCCCTTTATCTCTATTACCC 89
Northern
Probe-sgR-1-bio CAAGTTGATAACGGACTAGCC 90 探针
Probe-sgR-3-bio CTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC 91
Probe-miR 68-bio TTCCCGACCTGCACCAAGCGA 92
Realtime-PC
R Cas9-RT-F CACAAACCATGGACTATAAGGACCACGACGGAG 93 引物
Cas9-RT-R GATGGGGTGCCGCTCGTGCTTC 94 p 9-F GAACGAGCTATACAAGGAAACGACGCTAGGG 85
2A-R-Ncol AGTCCATGGCAGGTCCAGGGTTCTCCTC 95
Actin- S TGGCATCAYACTTTCTACAA 96
Actin- A CCACCACTDAGCACAATGTT 97 原位杂交
82 探针 dCas9-F3-F CATGGTCTCACGCCATCGTGCCTCAGAGCTTTC
dCas9-F3-R GATGGTCTCGGATCCTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGGCCGGCC 83
Cas9-378R GCTGAAGATCTCTTGCAGATAGCAGATCCGG 84 p19-F GAACGAGCTATACAAGGAAACGACGCTAGGG 85 表 4 CRISPR-Cas在 Tl代拟南芥转基因植株中诱导基因修饰统计
^,, T1 代转基因 位点发生突变的 2个位点同时发生突变 2个位点同时发生 目的位点
w 植株数目 转基因植株数目 的转基因植株数目 突变的效率
CHLI1-101 28
2xsgR-CHLI1&2 37 68%
CHLI2-280 33
TT4-65 49
2xsgR-TT4 58 74%
TT4-296 45 表 5 拟南芥 Tl代转基因植株中检测到的目的位点突变统计表
植株编 目标位点突变 目标位点不同类型 载体 目的位点 测序克隆数目
号 克隆数目 突变的克隆数目
1 10 4 2
2 11 5 4
CHLI1-101
3 7 6 3
2xsgR-CHLI1 total 28 15 7
& 2 1 11 9 6
2 10 8 7
CHLI2-280
3 10 9 6
total 31 26 15
1 10 10 2
2 8 8 3
2xsgR-TT4 ΑΓΓΤ4-65 3 4 4 1
4 7 5 2
5 13 13 4
6 1 0 7 3
7 8 6 2
8 9 6 2
9 1 0 7 4
1 0 12 7 4
1 1 8 6 3
total 99 79 20
1 1 0 7 1
2 8 4 2
3 4 4 1
4 7 6 2
5 1 3 1 3 3
6 1 0 4 3
7 8 8 4
8 9 7 3
9 1 0 5 2
1 0 12 12 2
1 1 8 8 2
total 99 78 1 1 实施例 12 植物生殖系基因打靶载体的构建
为了实现 Cas9基因在拟南芥生殖细胞系中的特异表达, 克隆了 SPL基因上游 3. 7K 的序列作为启动子以及下游 1. 5K的片段作为终止子。 并用人源化的链霉菌 Cas9基因取 代 SPL基因第一个外显子, 保留 SPL基因所有的内含子以及第二和第三个外显子 (图 17, A) 。 同时, 克隆了组成型表达的 UBQ基因的启动子和终止子, 用于构建组成型表达 的基因打靶载体作为实验对照 (图 17,B ) 。
实施例 13 Cas9基因的表达模式检测
原位杂交的结果表明, SPL基因启动子能驱动 Cas9基因在花粉发育早期的绒毡层细 胞 (图 18, A) 和小孢子母细胞 (图 18, B ) 中特异表达, 而 UBQ启动子驱动的 Cas9基因 在同一时期的花药中几乎不表达 (图 18,D,E ) 。 此外, SPL启动子驱动的 Cas9基因在 胚珠发育早期的***中也能检测到表达信号 (图 18,C ) , 与之相比, UBQ启动子在 胚珠中的表达是泛在的 (图 18,F) 。 这一结果表明, SPL基因的表达框架确实能在生 殖细胞系中特异诱导 Cas9基因的转录。 实施例 14 不同植物基因打靶***的突变效率检测
为了比较 pSPL-Cas9-sgR载体和 pUBQ-Cas9-sgR载体的基因打靶效率, 我们分别构 建了识别拟南芥 APETALA ( AP I ) 编码基因第 27号核苷酸位点和第 194号核苷酸位点的 基因打靶载体, 并转化拟南芥。 通过 PCR扩增目的基因的序列以和测序结果比对发现, pUBQ-Cas9-sgR系列载体可以同时在 T1和 T2代植物中检测到基因突变, 而
pSPL-CaS9-SgR系列载体只能在 T2代的转基因群体中检测到突变 (图 19, A) , 这同时 也说明这该载体的 DNA切割活性具有生殖细胞特异性。
通过统计这两种打靶载体在植物不同发育时期和不同世代的基因打靶活性, 我们发 现, 首先, 不同靶向位点的剪切效率不同。 对于 pUBQ-CaS9-SgR载体而言, 不论是在叶 片中还是在花序中, AP1-27的效率均高于 AP1-194。 其次, 有些在叶片中能检测到突变 的株系, 在花序中却没有产生突变。 再者, AP1-194位点的突变效率在 pSPL-CaS9-SgR 的 T2代转化子中不但高于 AP 1-27 , 而且比同期的 pUBQ-Cas9-sgR转化子提高了近 1倍 (图 19, B ) 。 说明生殖细胞专一性打靶载体很好的 DNA切割活性。 实施例 15 T2代转化子中的基因突变类型的统计
为了由比较不同基因打靶***产生的基因突变类型, 我们从 4个转基因群体中, 各 随机选取了 8个发生基因突变的 T2代转基因株系, 每个株系分别检测了 12个单株。 实 验结果表明, 组成型表达的基因打靶***虽然能产生一定比例的纯合子 (2-4%) 和杂合 子 (1 1-12%) , 但是其中绝大多是基因型不明确的嵌合体或野生型 (73%-84%) 。 而生 殖系专一性的打靶***能较稳定地产生 30%左右的杂合子,却未得到纯合的植株(图 20 )。 推测 SPL启动子虽然在雌雄配子体中都表达,但在其中一方造成目的基因突变频率较低。 当然, 这并不影响杂合的 T2代植株在 T3代中分离出纯合的株系。 实施例 16 高效植物基因打靶载体的构建
在已有的拟南芥基因打靶载体的基础上 (图 21, A ) , 为了实现 CRISPR/Cas9***在 植物中稳定和高效的表达, 克隆了番茄矮壮病毒 (TBSV) 的 p l9蛋白序列并将其与人源 化的链霉菌 Cas9蛋白通过蛋白顺式切割元件 2A肽融合在 UBQ基因的框架下进行基因转 录和翻译 (图 21, B ) 。 由于 2A肽的蛋白自剪切作用, 这个融合的阅读框会表达出两个 独立的蛋白来各自行使功能。 实施例 17 高效植物打靶***的活性检测
在拟南芥的瞬时表达***中,分别将含有 P 19和不含 p l9的 CRISPR/Cas9载体与 YFFP 报道基因共同转化原生质体。 YFFP报道基因是一个有部分序列重复的黄色荧光蛋白
( YFP ) 编码基因, 正常情况下无法正确表达和翻译。 但在 CRISPR/Cas9***地识别和 剪切作用下, 会发生双链 DNA的断裂 (DSB ) 并激活植物内源的 DNA修复机制来去除重 复的基因片段, 从而产生正常的有功能的 YFP蛋白 (图 22, A ) 。 通过统计两组不同的 转染群体中 YFP阳性细胞的比例, 实验证明, p 19能显著提高 CRISPR/Cas9的基因打靶 效率 (图 22, B ) 。 实施例 18高效植物基因打靶***在转基因植物中的表达分析
为了在稳定转化***中验证 P 19蛋白提高植物基因打靶效率的作用, 本实施例选取 了两个拟南芥内源基因 AP 1和 TT4作为靶向位点,分别构建了两组含有 p 19和不含有 p 19 蛋白的 CRI SPR/Cas9基因敲除载体并转化拟南芥。 在得到的四种 T1代转基因群体中, 均出现不同程度的叶发育表型。 根据表型的严重程度, 可以将它们分成 3种类型: 平展 型 (1/-) , 卷曲型 (2/+)和锯齿型(3/++) , 并由此推测 p l9蛋白也可能干扰受 miRNA 调控的植物叶发育过程 (图 23, A ) 。
为了验证, 分别检测了不同表型的植物中 sgRNA和 miR168的表达水平, 结果发现在 有严重叶发育表型的植物中 sgRNA和 miRNA的累积水平均最高 (图 23, B) 。 同时, pl9 基因的表达水平也与叶发育表型的严重程度成正比, 但对 Cas9的表达影响不大(图 23, C,D) 。 由此可见, pl9蛋白确实可以提高植物内源 sgRNA的稳定性。 实施例 19 高效植物基因打靶***在转基因植物中的功能分析
为了解 P19蛋白在稳定 sgRNA的同时是否能提高 CRISPR/Cas9***的打靶活性, 在 两个不同 1300-pSgR-CaS9-pl9转基因群体中, 分别统计了叶发育表型和基因突变的情 况。
结果表明, 在这两个群体中, 均有约 1/3的植株出现严重发育表型, 有约 1/5的植 株有轻微的叶发育表型, 且无论在哪一个群体中, 有叶发育表型的植株出现靶基因突变 的概率都要明显高于没有叶发育表型的植株(图 24) , 说明 pl9也能在稳定转化植株中 提高 CRISPR/Cas9***地基因打靶效率。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考, 就如同每一篇文献被单独引 用作为参考那样。 此外应理解, 在阅读了本发明的上述讲授内容之后, 本领域技术人员 可以对本发明作各种改动或修改, 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
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