UA125246C2 - Спосіб здійснення сайт-спрямованої модифікації рослинних геномів із застосуванням неуспадковуваних матеріалів - Google Patents
Спосіб здійснення сайт-спрямованої модифікації рослинних геномів із застосуванням неуспадковуваних матеріалів Download PDFInfo
- Publication number
- UA125246C2 UA125246C2 UAA201709693A UAA201709693A UA125246C2 UA 125246 C2 UA125246 C2 UA 125246C2 UA A201709693 A UAA201709693 A UA A201709693A UA A201709693 A UAA201709693 A UA A201709693A UA 125246 C2 UA125246 C2 UA 125246C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- plant
- gene
- target
- site
- nuclease
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 title abstract description 5
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 claims abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 154
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 76
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 51
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 46
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 38
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 18
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 17
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 17
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 15
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 15
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 15
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 15
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 7
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims description 7
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 4
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 2
- UPALIKSFLSVKIS-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2-[2-(dimethylamino)ethyl]benzo[de]isoquinoline-1,3-dione Chemical compound NC1=CC(C(N(CCN(C)C)C2=O)=O)=C3C2=CC=CC3=C1 UPALIKSFLSVKIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101500020117 Aedes aegypti Sialokinin Proteins 0.000 claims 1
- 241001211977 Bida Species 0.000 claims 1
- 241001214257 Mene Species 0.000 claims 1
- 241001206439 Motya Species 0.000 claims 1
- 101100440233 Mus musculus Cmpk2 gene Proteins 0.000 claims 1
- 240000005546 Piper methysticum Species 0.000 claims 1
- 235000016787 Piper methysticum Nutrition 0.000 claims 1
- 235000012377 Salvia columbariae var. columbariae Nutrition 0.000 claims 1
- 240000005481 Salvia hispanica Species 0.000 claims 1
- 235000001498 Salvia hispanica Nutrition 0.000 claims 1
- 244000240602 cacao Species 0.000 claims 1
- 235000014167 chia Nutrition 0.000 claims 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 claims 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 abstract description 32
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 abstract description 8
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 abstract description 5
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 abstract 2
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 abstract 1
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 abstract 1
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 74
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 64
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 61
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 59
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 32
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 28
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 24
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 23
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 22
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 13
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 13
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 13
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 9
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 9
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 9
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 8
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101710129611 Em protein Proteins 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 7
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 101150057704 tam gene Proteins 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 6
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 6
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 4
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 101150045515 O gene Proteins 0.000 description 3
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 239000011928 denatured alcohol Substances 0.000 description 2
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 2
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 2
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102100040410 Alpha-methylacyl-CoA racemase Human genes 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 description 1
- 206010007134 Candida infections Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 101000915769 Escherichia coli (strain K12) DNA-3-methyladenine glycosylase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 101000891254 Homo sapiens Alpha-methylacyl-CoA racemase Proteins 0.000 description 1
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007228 Mangifera indica Species 0.000 description 1
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010067445 RA V Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- VXVGFMUNENQGFW-UHFFFAOYSA-N Rubia akane RA-V Natural products C1=CC(OC)=CC=C1CC(N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(N(C1=O)C)C2)C(=O)NC(C)C(=O)N(C)C1CC(C=C1)=CC=C1OC1=CC2=CC=C1O VXVGFMUNENQGFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001099106 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CAAX prenyl protease 2 Proteins 0.000 description 1
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 description 1
- 101000745889 Xenopus laevis Cytochrome P450 26A1 Proteins 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000001061 forehead Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 1
- 229940048662 kwai Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 1
- 210000000745 plant chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000008263 repair mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- SETMGIIITGNLAS-UHFFFAOYSA-N spizofurone Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)C)=CC=C2OC21CC2 SETMGIIITGNLAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950001870 spizofurone Drugs 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- TUBWTFZPLDUNIL-HJJYVODLSA-N tpc-a Chemical compound O.O.O.O.O.C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N(C)C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](N(C1=O)C)C2)C(=O)N[C@H](C)C(=O)N(C)[C@@H]1CC(C=C1)=CC=C1OC1=CC2=CC=C1O.C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N(C)C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](N(C1=O)C)C2)C(=O)N[C@H](C)C(=O)N(C)[C@@H]1CC(C=C1)=CC=C1OC1=CC2=CC=C1O.C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N(C)C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](N(C1=O)C)C2)C(=O)N[C@H](C)C(=O)N(C)[C@@H]1CC(C=C1)=CC=C1OC1=CC2=CC=C1O.C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N(C)C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](N(C1=O)C)C2)C(=O)N[C@H](C)C(=O)N(C)[C@@H]1CC(C=C1)=CC=C1OC1=CC2=CC=C1O TUBWTFZPLDUNIL-HJJYVODLSA-N 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
- C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Винахід належить до способу використання негенетичної речовини для здійснення сайт-спрямованої модифікації рослинного генома шляхом здійснення таких етапів: введення негенетичної речовини в клітину, тканину або частину рослини-мішені, при цьому згадана негенетична речовина являє собою нуклеазу, специфічну для цільового фрагмента, або мРНК, що експресує згадану нуклеазу, при цьому згадана нуклеаза являє собою нуклеазу системи коротких паліндромних повторів, регулярно розміщених групам (CRISPR/Cas9), при цьому вказана нуклеаза розрізає цільовий сегмент, після чого сайт-спрямована модифікація цільового фрагмента завершується шляхом репарації ДНК рослини.
Description
Галузь техніки
Цей винахід належить до галузі генної інженерії рослин і стосується способу здійснення сайт-спрямованої модифікації рослинних геномів із застосуванням неуспадковуваних матеріалів, зокрема, нетрансгенного способу здійснення сайт-спрямованої модифікації рослинного генома із застосуванням білка або мРНК.
Передумови створення винаходу
Технологія редагування генома є найбільш перспективним засобом дослідження функції генів та генетичного поліпшення сільськогосподарських культур. Доступні на цей час технології редагування генома включають цинковопальцеві нуклеази (2ЕМ), транскрипційні активатор- подібні ефекторні нуклеази (ТАГЕМ) і системи коротких паліндромних повторів, регулярно розміщених групами/СКІЗРЕ-асоційованих білків (СРІЗРЕ/Сав5з9), які називають сіквенс- специфічними нуклеазами (З5М). Їх спільною особливістю є те, що вони можуть діяти як ендонуклеази для розщеплення специфічних послідовностей ДНК, продукуючи дволанцюговий розрив (058) ДНК. Згаданий дволанцюговий розрив може активувати внутрішній репараційний механізм клітини, сполучення негомологічних кінців (МНЕ.)) ії гомологічну рекомбінацію (НЕ), щоб здійснити репарацію пошкоджень ДНК. Таким чином, може бути сформований сайт- спрямований субституційний або інсерційний мутант. Наразі технології редагування генома, які демонструють значний потенціал щодо поліпшення агрономічних властивостей важливих сільськогосподарських культур, ефективно використовують на деяких рослинах (таких як рис,
Агарідорзі5, кукурудза, пшениця) для модифікування генома рослини.
Однак, незважаючи на те, що редагування генома надає шанс на поліпшення в майбутньому сільськогосподарських культур, все ще залишається велика проблема. Для проведення редагування генома сіквенсо-специфічна нуклеаза має бути експресована в клітині.
Наразі способом експресії сіквенсо-специфічної нуклеази в рослинних клітинах є доставка експресійного вектора або фрагмента ДНК, що експресує нуклеазу, в згадані клітини із застосуванням традиційних трансформаційних методів (Адгобасіегіит-опосередкованої трансформації, бомбардування частинками, ін'єкції тощо). Ці успадковувані матеріали довільно інтегрують в рослинну хромосому і транскрибують для здійснення редагування. Згадані традиційні трансформаційні методи передбачають інтеграцію екзогенних генів в рослинний
Зо геном і потребують селекційних маркерів (селекційний тиск) в процесі трансформації, що може призвести до утворення небажаних фенотипів. Застосування одержаних рослин підлягає регулюванню згідно з нормативними документами щодо ГМО. Таким чином, необхідно створити спосіб проведення редагування генома в рослинах без необхідності введення успадковуваного матеріалу ДНК.
Суть винаходу
Метою цього винаходу є надання способу здійснення сайт-спрямованої модифікації цільового фрагмента гена-мішені в рослині.
Спосіб, запропонований цим винаходом для проведення сайт-спрямованої модифікації цільового фрагмента гена-мішені в рослині, зокрема, включає такі етапи: введення неуспадковуваного матеріалу в клітину, тканину або частину рослини, що становить інтерес; при цьому згаданий неуспадковуваний матеріал являє собою нуклеазу, специфічну для згаданого цільового фрагмента, або мРНК, що експресує згадану нуклеазу, в результаті чого цільовий фрагмент розщеплюється згаданою нуклеазою, і сайт-спрямована модифікація цільового фрагмента досягається через репарацію ДНК в рослині.
За запропонованим способом неуспадковуваний матеріал вводять в клітину, тканину або частину рослини, що становить інтерес. Згаданий неуспадковуваний матеріал може експресувати нуклеазу для проведення сайт-спрямованої модифікації цільового фрагмента, або згаданий неуспадковуваний матеріал може безпосередньо впливати на цільовий фрагмент із досягненням сайт-спрямованої модифікації. Під час або після сайт-спрямованої модифікації, згаданий неуспадковуваний матеріал може бути зруйнований метаболічним механізмом клітини. Модифікована клітина або тканина може бути регенерована в інтактну рослину із застосуванням звичайної культури тканини. Таким чином, одержують рослину-мутант, що не містить трансгену, в якій модифікованим є тільки цільовий фрагмент і в яку не введений екзогенний успадковуваний матеріал.
За запропонованим способом згадана о нуклеаза являє собою нуклеазу ТАГЕМ, пальцевоцинкову нуклеазу, нуклеазу СКІЗРК/Са5з9 або будь-яку іншу нуклеазу, яка може забезпечити редагування генома.
Відповідно, неуспадковуваний матеріал може бути вибраний з-посеред будь-якого з нижченаведених матеріалів (а)-(с). бо (а) Неуспадковуваний матеріал являє собою нуклеазу ТА ЕМ або мРНК, здатну експресувати спаровані білки ТАГ ЕМ; при цьому білок ТА ЕМ складається з домену зв'язування
ДНК, здатного розпізнавати цільовий фрагмент та зв'язуватись із цим цільовим фрагментом, та домену ЕокК І.
За одним із варіантів здійснення цього винаходу (Приклад 1) згаданий неуспадковуваний матеріал складається з мРНК послідовностей ЗЕО ІЮ МО: З ії БЕО ІЮО МО: 4. За іншим варіантом здійснення цього винаходу (Приклад 2), згаданий неуспадковуваний матеріал складається з білків послідовностей 5ЗЕО ІЮО МО: 7 і 5ЕО ІЮО МО: 8. (Б) Неуспадковуваний матеріал являє собою цинковопальцеву нуклеазу або мРНК, здатну експресувати спаровані білки ЕМ; при цьому білок 2ЕМ складається з домену зв'язування ДНК, здатного розпізнавати та зв'язуватись із цільовим фрагментом, та домену Рок І. (с) Неуспадковуваний матеріал складається з білка Са59 або мРНК, здатної експресувати білок Са59, і РНК-гіда; при цьому згадана РНК-гід являє собою РНК з паліндромною структурою, яка утворюється частковим паруванням основ між сгкМА та ігастеМА; згадана стеМА містить фрагмент РНК, здатний до комплементарного зв'язування з цільовим фрагментом.
За одним з варіантів здійснення цього винаходу (Приклад 3) згаданий неуспадковуваний матеріал складається з білка, який має послідовність ЗЕО ІЮ МО: 10, ї 5б9ЕМА, яка має послідовність ЗЕ ОО МО: 11. За іншим варіантом здійснення цього винаходу (Приклад 4) згаданий неуспадковуваний матеріал складається з білка, який має послідовність БЕО ІЮ МО: 10, і ДМА, яка має послідовність 5ЕО ІЮ МО: 12.
Відповідно до запропонованого способу згадана клітина може бути будь-якою клітиною, в яку може бути введений неуспадковуваний матеріал і яка може регенерувати в інтактну рослину через культуру тканини. Згадана тканина може бути будь-якою тканиною, в яку може бути введений неуспадковуваний матеріал і яка може регенерувати в інтактну рослину через культуру тканини. Згадана частина рослини являє собою частину інтактної рослини (не ех мімо частину), в яку може бути введений неуспадковуваний матеріал.
Зокрема, згаданою клітиною може бути протопласт або клітина суспензійної культури.
Згаданою тканиною може бути калюс, незрілий зародок або зрілий зародок. Згаданою частиною рослини може бути лист, верхівка пагону, гіпокотиль, молодий колос або пилкова трубка.
Відповідно до згаданого способу методом введення неуспадковуваного матеріалу в клітину, тканину або частину рослини, що становить інтерес, може бути бомбардування частинками,
ПЕГ-опосередкована трансформація протопластів, метод з використанням пилкових трубок або будь-який інший метод, який може бути використаний для доставки неуспадковуваного матеріалу.
Відповідно до згаданого способу сайт-специфічна модифікація являє собою інсерцію, делецію та/або заміну нуклеотиду в цільовому фрагменті.
Ще одною метою цього винаходу є надання способу одержання рослини-мутанта, що не містить трансгену.
Запропонований цим винаходом спосіб одержання рослини-мутанта, що не містить трансгену, може включати такі етапи: проведення сайт-спрямованого модифікування цільового фрагмента гена-мішені в рослині, яка становить інтерес, з одержанням таким чином рослини, в якій функції гена-мішені є втраченими або зміненими, і її геном не містить інтегрованого екзогенного гена.
За цим винаходом згадана рослина може бути однодольною або дводольною. За деякими варіантами здійснення цього винаходу згаданою рослиною є рис, кукурудза, пшениця або тютюн.
У порівнянні з успадковуваним матеріалом ДНК, білок і мРНК являють собою два типи неуспадковуваного матеріалу, які можуть бути легко розкладені в клітині із використанням механізму захисту. Завдяки транзієнтному введенню мРНК або білка сіквенсо-специфічної нуклеази, мутанти з сайт-спрямованими нокаутованими генами можуть бути одержані без інтеграції гена сіквенс-специфічної нуклеази або векторного фрагмента в рослинний геном, а саме без трансгенів. Спосіб за цим винаходом забезпечує більшу біологічну безпеку, а різновиди сільськогосподарських культур, одержані за згаданим способом, не будуть підлягати регулюванню згідно з нормативними документами щодо ГМО. Цей винахід має значну цінність для фундаментальних досліджень і селекції сільськогосподарських культур.
Короткий опис фігур
На Фіг. 1 показано, що мутації гена Тасуу2 спричинені трансформуванням незрілого зародка пшениці мРНК Са59 та зоКкМА. А: гель-електрофоретограма мРНК сСавз9, транскрибованої іп міїго із застосуванням транскрипційного набору мРНК (АМ1344, Атрбіоп). В:
Результати РСЕУКЕ, які показують мутації у цільовому сайті Тасум2 рослин ТО, спричинені бо МРНК Саз9 та здеЕМА-саУуУ2-С14. С: результати секвенування показують мутації, індуковані на цільовому сайті іп мійго транскрибованою мРНК Саб59 та 5дЕМА-СМУ2-С14. УТ означає послідовність гена дикого типу, "-" означає послідовність з делецією, "-" означає послідовність з інсерцією, число після "-/4" означає кількість видалених або вставлених нуклеотидів.
На Фіг. 2 показано, що мутації гена О5ВАОН2 були спричинені транзієнтним трансформуванням протопластів рису мРНК-ТАГЕМ. А: гель-електрофоретограма, що показує іп мійго транскрипцію Т-ВАОН2Б-Ї ії Т-ВАОН2Ь-К транскрипційним набором мРНК (АМ1344,
Атріоп); полі(А)-хвіст доданий до 3'-кінця МРНК. В: Результати РСЕ/КЕ, що показують мутації у цільовому сайті, спричинені іп міго транскрибованою мРНК в протопластах. С: результати секвенування показують мутації, індуковані на цільовому сайті іп міго транскрибованою мРНК.
МЛ означає послідовність гена дикого типу, "-" означає послідовність з делецією, "-" означає послідовність з інсерцією, число після "-/я" означає кількість видалених або вставлених нуклеотидів.
На Фіг. З показано мутагенез гена МІ О пшениці в результаті трансформації протопластів пшениці білками МІ О-ТАГЕМ. А: Результати 50О5-РАСЕ, які показують прокаріотичну експресію та очищення Т-МІО-Ї та Т-МІГО-К для цільового сайту МО. В: Результати РСЕ/КЕ, що показують мутації у цільовому сайті, спричинені білками ТАГЕМ в протопластах. С: результати секвенування показують мутації, індуковані на цільовому сайті іп міго одержаними білками
ТАГЕМ. УМТ означає послідовність гена дикого типу, "-" означає послідовність з делецією, "ж" означає послідовність з інсерцією, число після "-/«" означає кількість видалених або вставлених нуклеотидів.
На Фіг. 4 показано мутагенез гена пшениці ТасА5Кк7 в результаті трансформації протопластів пшениці білююом Са59 та іп міго транскрибованою 5дкМА. А: Результати 505-
РАСЕ, які показують прокаріотичну експресію та очищення білка Са59. В: Результати РСЕ/КЕ, що показують мутації у цільовому сайті, спричинені білком Са59 та іп міго транскрибованою 5ОКМА. С: результати секвенування показують мутації, спричинені на цільовому сайті іп міго одержаним білком Са59 та іп міго транскрибованою 5д9ЕМА. УМ/Т означає послідовність гена дикого типу, "-" означає послідовність з делецією, "я" означає послідовність з інсерцією, число після "-/«" означає кількість видалених або вставлених нуклеотидів.
На Фіг. 5 показано, що мутації гена МІРУМ були спричинені котрансформацією білка Са59 та
Зо іп мйго транскрибованої 5З9ЕМА у протопласти тютюну, і рослини-мутанти були одержані регенерацією. А: результати РСК/КЕ, що показують мутації в цільовому сайті, спричинені білком Саз59 та іп міго транскрибованою 5здКМА в протопластах. В: результати секвенування показують мутації цільового сайту, індуковані котрансформацією іп міго одержаного білка Са59 та іп міго транскрибованої 5хФЕМА у протопласти тютюну. С: Виявлення рослин-мутантів, регенерованих з протопластів, та результати секвенування цільових сайтів. УТ означає послідовність гена дикого типу, "-" означає послідовність з делецією, "«" означає послідовність з інсерцією, число після "-/4" означає кількість видалених або вставлених нуклеотидів.
Докладний опис прикладів здійснення
Всі експериментальні методи, використані в нижченаведених Прикладах, є звичайними методами, якщо не зазначено інше.
Всі матеріали, реагенти, використані в нижченаведених Прикладах, є наявними у продажу, якщо не зазначено інше.
Пшениця сорту ВоБбу/піе описана у "УуУеек5, 9.Т. еї аїЇ., Карій ргодисіоп ої тийіріе іпдерепаепі Іпе5 ої ТепіШе іапздепіс мпеаї. Ріапі Рнувіої. 102: 1077-1084, (1993)", і її можна одержати з Інституту генетики і еволюційної біології Китайської Академії наук.
Вектор Т-МГІО на основі нуклеази ТАГЕМ, геном-мішенню для якого є ген Там о пшениці, описаний у "Уапод, У., Спепд, Х., 5пап, О., 2Напа, М., ім, уУ., бас, С., апа Ом, У... (2014).
Зітийапеоиз еєайіпу ої їпгее потоеоаїІє!ез іп Нехаріоїд бгеай упеаї сопіег5 Пепабіє гезівїапсе юЮ ромаеєгу тіідем/. Маїшге Віоїесппоіоду. 32, 947-951", і його можна одержати з Інституту генетики і еволюційної біології Китайської Академії наук.
Експресійний вектор рОЕХ-4Т на основі прокаріотичних генів одержували від Зпаподпаї
ВеїМмио Віотесппоіоду Со. Ца., номер за каталогом 1110024.
Іп міго транскрипційний вектор рХТ7-Са59 на основі Са5з9-птЕМА розкритий в "Спапод М., Зип
С., сао Г.., 2пи 0., Хи Х., єї а)., 2013. Сепоте еайіпд м/п АМА-диїдей Саз9 писієавзе іп 2ебгаїїви етрбгуоз. Сеї! гезвагсп 23:465-72", і його можна одержати від авторів цього винаходу.
Вектор рГ7/-чкМА розкритий в "А ргодгаттабіє ачаІ-АМА-днідеа ОМА епдописієавзе іп адаріїме Басієтіа! іттипйу. Зсієпсе 337(6096): 816-821", і його можна одержати з Інституту генетики і еволюційної біології Китайської Академії наук.
Кукурудза сорту НІЇЇ розкрита в "Аптвігопоу, С.Ї., Стееп, С.Е. 6. РНйірв, В.І. Юемеіортепі апа 60 амайаріїйу ої дептріазт ул Нідн їтуре ІІ сийиге Топтаїйоп гезроп5е. Маїге Сепеї. Соор. Мемуз І ей.
65,92-93 (19913", ії її можна одержати з Інституту генетики і еволюційної біології Китайської
Академії наук.
Розчини, використані при одержанні та перетворенні протопластів рису, наведені в
Таблицях 1-5.
Таблиця 1 50 мл ензимолітичного розчину 11111111 | о Доданакількість | Кінцева концентрація
Целюлаза ВТО
Мацерозим К10 0,375 г 0,75 90 5,51 г .7иЙ7Л/щ06М ГщЮ 2-(М-морфоліно)етансульфонова кислота 0,1066 г
Доливають до 50 мл двічі дистильованою водою, рН доводять до 5,7 додаванням КОН, інкубують на водяній бані (552С) протягом 10 хв, і охолоджують до кімнатної температури перед доданням 0,0735 г
Фільтрують із застосуванням 0,45 мкм фільтра
Таблиця 2 500 мл МУ5 11111111 | о Доданакількість | Кінцева концентрація 154 ММ 9,189 г 125 ММ 0,1864 г 2-(М-морфоліно)етансульфонова кислота 0,2132 г
Доливають до 500 мл двічі дистильованою водою, рН доводять до 5,7 додаванням маон
Таблиця З мл розчину ММО 11111111 | Доданакількість | Кінцева концентрація
Маніт (0,8 М)
Мосіг (1 М 2-(М-морфоліно)етансульфонова кислота (200 мМ) 0,2 мл 4 ММ (Двічидистильованавода.д//-:/ | доїбмл/// | : Ф (
Таблиця 4 4 мл розчину ПЕГ 11111111. | Доданакількість | Кінцева концентрація
РЕС40О00
Маніт (0,8 М)
Сась (і м (Двічидистильованавода.д//-:/ | доїмл/// | //::/С/
Таблиця 5 250 мл розчину УМІ 11111111 | Доданакількість | Кінцева концентрація 27,324 г 7иЙЛищ06М' ГщЮЖ 0,07456 г 2-(М-морфоліно)етансульфонова кислота 0,2135 г 4 ММ 200 мМ
Доливають до 250 мл двічі дистильованою водою, рН доводять до 5,7 додаванням КОН 10
У вищенаведених Таблицях 1-4 95 означає відсоткове відношення маса/об'єм, г/100 мл.
Середовища, використані для культури клітин тканини пшениці, включають:
Гіпертонічне середовище: мінімальне середовище М5, маніт (90 г/л), 2,4-О (5 мг/л), сахароза (30 г/л) і фітогель (З г/л), рН 5,8.
Індукційне середовище: мінімальне середовище М5, 2,4-О (2 мг/л), сульфат міді (0,6 мг/л), казеїнові гідролізати (0,5 мг/л), сахароза (30 г/л) і фітогель (З г/л), рН 5,8.
Диференціювальне середовище: мінімальне середовище М5, кінетин (0,2 мг/л), сахароза (30 г/л) і фітогель (З г/л), рН 5,8.
Укорінювальне середовище: мінімальне середовище М5 (1/2), етансульфонова кислота (0,5 мг/л), а-нафтилоцтова кислота (0,5 мг/л), сахароза (30 г/л) і фітогель (З г/л), рН 5,8.
Приклад 1. Сайт-спрямоване редагування Тасму?2 шляхом трансформування незрілого зародка пшениці іп міго транскрибованою мРНК Савз9 та здаеЕМА
І. Конструювання цільового фрагмента: мішень-С14
Мішень-С14: 5-ССбАсСсаАТавасТАТТТСТАСАСО-3 (на консервативній ділянці екзону 8 пшениці Тасум2, Групи А, В і 0).
І. Тп міго транскрипція і очищення Са59-ме НК 1. Вектор рХтТ7-Саз59 гідролізували за допомогою Хваї. Гідролізований продукт очищали із застосуванням набору для очищення (Ахудеп) до концентрації вище ніж 100 нг/мкл, і позначали як рХТ7-Са59-Хваї. 2. Очищений продукт рХТ7-Сав5з9-Хба! транскрибували із застосуванням транскрипційного набору іп міго (АМ1344, Атбіоп). Продукт очищали із застосуванням набору для очищення
МРНК (АМ1908, Атбіоп) до концентрації вище ніж 500 нг/мкл. На Фіг. ТА показана агарозна гель-електрофоретограма іп міго транскрибованої Са59-мРНК.
ШІ. Тп міго транскрипція З9ДКМА проти цільового сайту 1. Цільовий сайт Тасуу2 вбудовували у вектор рТаб-двВМА
Синтезували такі одноланцюгові олігонуклеотиди з липкими кінцями (підкреслені):
С14г: 5-СстТаСАасаАтТасаатТАТТТСТАа-3";
С148: У-АААССТАСАААТАССССАТОСТОИ-3".
Дволанцюгову ДНК з липкими кінцями одержували із застосуванням процесу відпалу між
Зо С14Р/С14К, і вставляли між двома сайтами рестрикції Вр5І в плазміду рТтайб-деМА з одержанням плазміди рГайб-дкМА, яка містить сайт С14. Позитивну плазміду підтверджували секвенуванням. Рекомбінантна плазміда, яку одержали інсерцією фрагмента ДНК, як показано в 5-сттасяласАтТасаастТАТТТСТАС-3, у прямому напрямку на сайті рестрикції Вр5іІ плазміди ртТайб-9еМА, була позитивною, і її позначили як рТайб-аАМА-С5. 2. Іп міго ампліфікація та очищення фрагмента ДНК Т7-Тасху2-двМА
Конструкція праймера
Т7-Тайму2-г: ТААТАСИАСТСАСТАТАСССАсСалтасвсаТАТТТСТАС; 9АМА-РСВ-В: АСАСССАСТОСИОИТасСсСАСТТ.
ПЛР-ампліфікацію виконували з рташб-днМА-С14 у ролі матриці. Продукт ПЛР очищали із застосуванням набору для очищення ПЛР (АР-Х-25005, Ахудеп) до концентрації вище ніж 100 нг/мкл. Одержаний продукт ПЛР являє собою 5дЕМА, що містить промотор 17 та цільовий сайт
Тасуу2, і його позначили як Т7-Тасх/2-дАМА. 3. Іп міго транскрипція З9КМА, що містить цільовий сайт Тасуу2 59АМА-сУУ2-С14 (як показано в послідовності ЗЕО ІЮ МО: 17) транскрибували іп міїго із застосуванням іп міго транскрипційного набору Т7 (Е20405, МЕВ).
ІМ. Сайт-спрямоване редагування гена Тасуум2 пшениці шляхом трансформації із застосуванням бомбардування частинками іп міго транскрибованої Сабз9-птЕМА та іп міго транскрибованої ЗхдаеЕМА 1. Завантаження іп міго транскрибованої Са59-тЕМА та іп міго транскрибованої 5Зд9ЕМА у 0,6 нм золотий порошок 5 мкл 0,6 нм золотого порошку, З мкл Саб59-птЕМА, 1 мкл зда МА-СУУ2-С14, 1 мкл 5 М розчину ацетату амонію, 20 мкл ізопропанолу змішували, і осаджували при -202С протягом 1 год. для того, щоб уможливити прикріплення Са59-пЕМА і здаЕМА-сМуУ2-С14 до золотого порошку. Суміш центрифугували при 1000 об/хв протягом 5 с, і промивали в 100 мкл зневодненого спирту після видалення супернатанту, а потім знову центрифугували при 1000 об/хв протягом 5 с, і ресуспендували в 20 мкл зневодненого спирту після видалення супернатанту. 2. Трансформація матеріалів-реципієнтів пшениці із застосуванням бомбардування частинками бо 1) Брали незрілий зародок пшениці сорту КМ199 і обробляли протягом 4 год. у гіпертонічному середовищі. 2) Для бомбардування незрілого зародка пшениці, культивованого на етапі 1) у гіпертонічному середовищі, застосовували пристрій для бомбардування частинками. 20 мкл суміші ЗФДЕМА-Са59-пЕМА наносили на мембрану, і здійснювали бомбардування; відстань для кожного бомбардування дорівнювала 6 см, тиск бомбардування становив 1100 фунтів/дюйм? (7,584 МПа), діаметр бомбардування дорівнював 2 см. 3) Незрілий зародок пшениці, бомбардований на етапі 2), культивували протягом 16 год. у гіпертонічному середовищі. 4) Незрілий зародок пшениці, культивований на етапі 3) у гіпертонічному середовищі, у подальшому послідовно піддавали культивуванню протягом 14 днів для індукування утворення калюсної тканини, культивуванню протягом 28 днів для диференціювання і культивуванню для вкорінення для того, щоб одержати рослини пшениці. 5) З розсади пшениці, одержаної на етапі 4), екстрагували ДНК, і мутанти з нокаутованим геном (у сайт-спрямований спосіб) виявляли із застосуванням методів РСЕ/КЕ (полімеразна ланцюгова реакція/рестрикційний гідроліз) (конкретний метод випробування, дивись етап ІМ). Як контроль використовували пшеницю сорту Кп199 дикого типу.
Оскільки існує послідовність, розпізнавана рестрикційною ендонуклеазою Хваї у цільовому фрагменті ендогенного гена Тасуу2 пшениці, для проведення тестів РСЕ/КЕ використовували храї. Праймери, використані для ПЛР-ампліфікації, являють собою праймери, специфічні для
Груп А, В та 0, і мають такі послідовності:
Тасхмуг-АЕ: 5-стТассСАТТАСТТТаТтТАТТТТОасСТААТА-З";
Тасхму2г-ВвВЕ: 5-аТСсАпАТааСААТСТАДААСТТ-3";
Тасхжуг-ОЕ: У-аСАТатТАСТІ ТОАТтТаттасСатаА-3";
Тасхуг-н: 5-ТОСТОСТОТСТТАССАСТТОСО-3".
Результати деяких тестів на виявлення вказують на те, що на цільовому сайті гена Тасшу2 пшениці відбулись мутації. Смуги були відновлені для секвенування. Результати секвенування вказують на те, що на цільовому сайті гена Тасуу2 пшениці відбулась інсерція/делеція (індел) (Фіг. 18 і фіг. С).
Приклад 2. Сайт-спрямоване редагування гена О5ВАОН2 шляхом трансформування
Зо протопластів рису іп міго транскрибованою мРНК ТАГЕМ
І. Цільовий фрагмент ТАГЕМ
Послідовність гена ВАСНЕІ рису показана послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 1.
Цільовий фрагмент ТАГЕМ розташований у четвертому екзоні гена ВАОНІ рису і має таку послідовність: 5-астапАТтасттталдатТАстосадаїснасадад ТССТТасАСАДАДАСс(аС-3 (позиції 1589-1640 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1); малі літери посередині означають послідовність спейсера; і розташовані з обох сторін великі літери означають послідовності, що розпізнаються модулями
ТАГЕМ (позначеними як І -р та К-Б). Підкресленою є послідовність, що розпізнається ВО.
ІЇ. Конструювання та синтез генів кодування ТАГЕМ
Білок ТАГ ЕМ, який розпізнає І -5 у цільовій послідовності, позначений як Т-ВАОНЕАаБ-Ї, тоді як кодувальна послідовність показана позиціями 7-2952 послідовності ХЕО ІЮ МО: 2. Позиції 7-27 послідовності 5ЕО ІЮ МО: 2 кодують сигнал ядерної локалізації (МІ 5); позиції 463-2154 кодують білок, що розпізнає модуль послідовності І -б; позиції 2350-2953 (603 п.н.) кодують ендонуклеазу
ЕоК І.
Білок ТАГЕМ, який розпізнає К-Бр у цільовій послідовності, позначений як Т-ВАЮОНО2Б-К, тоді як послідовність кодування показана позиціями 3085-6018 послідовності 560 ІЮ МО: 2. Позиції 3085-3105 послідовності зХЕО ІЮ МО: 2 кодують сигнал ядерної локалізації (МІ 5); позиції 3541- 5232 кодують білок, що розпізнає модуль послідовності І -Б; позиції 5428-6018 (591 п.н.) кодують ендонуклеазу РОК І.
БО Позиції 2953-3006 послідовності 5ЕО ІО МО: 2 кодують Т2А, який складається з 18 амінокислот і який дозволяє білкам Т-ВАОНаБ-Ї ії Т-ВАОН2р-К, експресованим в одному і тому самому полігенному експресійному кластері, розділятись на два окремі білки.
І. Тп міго синтез мРНК гена ТАГЕМ
Два компоненти ТАГЕМ гена ВАЮН2 рису, Т-ВАОН2Б-Ї і Т-ВАОН2бБ-К, транскрибували іп міго із застосуванням транскрипційного набору мРНК (Атрбіоп), використовуючи промотор Т7 для ініціювання транскрипції. Одержали меРНК-Ї -Т-оО5ВАОНІ2Ь ії мРНК-А-Т-О5ВАОНЕа, а полі(А)- хвости додавали до їхнього 3'-кінця, для підвищення стабільності мРНК.
Послідовність мРНК-Ї -Т-О5ВАОН2Ь показана послідовністю 5ЕО ІЮО МО: 3, а послідовність
МРНК-А-Т-О5ВА0Н2Ь показана послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 4. бо ІМ. Введення суміші двох мРНК ТАГЕМ, одержаних транскрипцією іп міго, в протопласти рису 1. Одержання матеріалів
Використовують рис сорту Мірропбаге. Зерна промивають 75 95 етанолом, потім обробляють 2,5 95 розчином натрію гіпохлориту протягом 20 хв, промивають стерильною водою більше 5 разів, і культивують на середовищі 1/2 М5 протягом 7-10 днів при температурі 262С та 12- годинному освітленні (150 мкмоль-м--с7"). 15 зерен можна культивувати у великому скляному культуральному флаконі. Для одного експерименту потрібно 40-60 проростків, а кількість ізольованих протопластів є достатньою для трансформації 6 плазмід. 2. Виділення протопластів 1) Для виділення протопластів використовували паростки та листкові піхви. Їх нарізали на 0,5 мм смужки. 2) Згадані смужки негайно переносили до 0,6 М розчину маніту, і витримували в темряві протягом 10 хв. 3) Розчин маніту видаляли фільтруванням, смужки переносили в ензимолітичний розчин, і обробляли протягом 30 хв при створюваному вакуумним насосом тиску від -15 мм рт. ст. (-2,0 кПа) до -20 мм рт. ст. (-2,7 кПа) у темряві. 4) Зразки додатково гідролізували протягом 4-5 год. з обережним струшуванням (на шейкері із частотою 10 об/хв). 5) Після гідролізу додавали рівний об'єм розчину М/5, і розчин струшували протягом 10 с для вивільнення протопластів. б) Протопласти відфільтровували в 50 мл круглодонну центрифугальну пробірку, використовуючи 40 мкм нейлонову фільтрувальну мембрану, і для промивання додавали розчин УМ5. 7) Центрифугували при 2509 протягом З хв для осадження протопластів, і супернатант видаляли. 8) Протопласти ресуспендували в 10 мл М/5, центрифугували при 2509 протягом 5 хв, і супернатант видаляли. 9) Протопласти ресуспендували додаванням відповідної кількості розчину ММО.
Концентрація протопластів становила 2х106/мл, як визначили шляхом підрахунку із застосуванням гемоцитометра.
Примітка: всі описані вище етапи виконували при кімнатній температурі. 3. Трансформація протопластів 1) У 2 мл центрифугальну пробірку вміщували 10 мкг мРНК-І -Т-О5ВАОНАІ2Ь та 10 мкг мРеНК-
В8-Т-О5ВАОНЗ2Ь. Додавали 200 мкл протопластів (приблизно 4х105 клітин). Потім додавали 220 мкл свіжого розчину ПЕГ, і змішували. Трансформацію проводили в темряві протягом 10-20 хв при кімнатній температурі. 2) Після завершення трансформації повільно додавали 880 мкл МУ5, перемішували перевертанням, центрифугували при 2509 протягом З хв, і супернатант видаляли. 3) Протопласти ресуспендували додаванням 1 мл МІ, і переносили на б-лунковий планшет (із заздалегідь доданим 1 мл МІ), після чого культивували при кімнатній температурі або при 282С в темряві протягом 6-16 год. (протягом 48 год., якщо протопласти використовували для екстракції геномної ДНК). 4. Використання РСК/КЕ (полімеразна ланцюгова реакція/рестрикційний гідроліз) експериментів для аналізу мутагенезу ендогенного гена ВАЮН2 рису, що є результатом використання іп міго транскрибованої ТАГ ЕМ
Через 48 год. після трансформації протопластів екстрагували геномну ДНК, яку використовували як матрицю для аналізу з РСЕК/КЕ (полімеразна ланцюгова реакція/рестрикційний гідроліз) експериментами. Протопласти рису сорту Мірропраге дикого типу одночасно використовували як контроль. Метод аналізу з РСЕ/КЕ базується на 5Впап, о. еї аї., Варій апа ейісіепі депе тодаіййсайоп іп се апа Вгаспуродішт ивіпа ТАГЕМ5. Моїесшіаг Ріапі (2013). Оскільки цільовий сайт ендогенного гена ВАОН2 рису містить послідовність розпізнавання рестрикційної ендонуклеази ВО, згадану рестрикційну ендонуклеазу ВОЇЇЇ використовували в експерименті для проведення тесту РСЕ/КЕ. Праймерами, використаними в
РСВ-ампліфікації, були:
О5ВАОН-Е: У-САТосСсаса,аСсассластоттсатоа-9";
О5БВАОН2-В: 5-САСИаААТААДААТСТСАААТатсСТТСААСТТ-3".
Результати РСЕ/КЕ експериментів зображені на Фіг. 2В, і ці результати показали, що на цільовому сайті гена ВАСНАа відбулись мутації, і ефективність мутагенезу становить приблизно 5 95. Смуги на цій фігурі були відновлені і секвеновані. Результати секвенування показали, що бо на цільовому сайті гена ВАОСНЗ відбулась інсерція/делеція (індел) (Фіг. 25).
Приклад 3. Експресія і очищення білків ТАГЕМ в прокаріотичній експресійній системі та трансформація цих білків на протопласти або незрілі зародки пшениці для сайт-спрямованої модифікації гена МО
І. Вибір цільових послідовностей і конструювання білків ТА ЕМ
Консервативну ділянку в екзоні 2 гена МГО пшениці використовували як цільову послідовність для конструювання пари білків ТАГ ЕМ (що складається з білка ТАЇ -МІ 0-1 і білка
ТАІ-МІО-К; білок ТАЇ-МІО-Ї складається з двох функціональних фрагментів, а саме фрагмента, який специфічно зв'язується з висхідними нуклеотидами цільової послідовності, та ендонуклеази ЕБокК | з ЕЇ -мутацією; білок ТАГ-МІГО-К складається з двох функціональних фрагментів, а саме фрагмента, який специфічно зв'язується з низхідними нуклеотидами цільової послідовності, та ендонуклеази ЕоК І з КК-мутацією). Цільові послідовності згаданих білків ТАГЕМ в генах Там о-А, Там! Оо-В та Там! о-о0 виглядають так:
Ген Там о-А: 5е-тоастастастоасСсСстТсасоасаддасссааіссісс!;сО)СсАТАТаСАТСТОССА-3";
Ген Там о-вВ: 5е-тсастастастоассСстТдасосаддассссаїсіссСЇСс:сАТАТаСАТСТОСОДА-3;
Ген Там 0-0: 5е-тсастастастоасСсСстТдасасаддасссааїссСасАТАТаСАТСТОСОЇДА-3.
У клітині пшениці, коли фрагмент ТАГ--Ї та фрагмент ТАГ-К зв'язані з відповідною ділянкою зв'язування, дві різні мономерні ендонуклеази бок І (ендонуклеаза БоК І з ЕЇ -мутацією та ендонуклеаза Рок І з КК-мутацією) можуть утворити активну димерну ендонуклеазу Рок І, яка розщеплює ділянку цільової послідовності (включаючи цільову послідовність і фланкуючі послідовності) з утворенням дволанцюгового розриву. Протягом репарації згаданого розриву згаданою клітиною може бути введена будь-яка кількість мутацій. У цьому описі термін "мутація" має широке значення, включаючи інсерцію, делецію, заміну тощо, більшість з яких призводить до втрати функції генів.
У вищенаведених цільових послідовностях підкреслена частина являє собою послідовність розпізнавання рестрикційної нуклеази АмаїІ, яка може бути розрізана із застосуванням АмаїЇ.
Після утворення розриву, якщо відбувається мутація, яка руйнує послідовність розпізнавання
Зо АмаїІ, цільова послідовність не може бути розрізана із застосуванням Амаї!; якщо мутація не відбувається, цільова послідовність може бути розрізана із застосуванням Амаї!.
ІІ. Експресія і очищення білків ТАГЕМ для гена-мішені МО в прокаріотичній експресійній системі 1. Конструювання прокаріотичних експресійних векторів для експресії білків ТА ЕМ 1) Кодувальні ділянки ТАГ-І/. (послідовність 5ЕО ІЮ МО: 5) і ТАГ-К (послідовність 5ЕО ІО МО: б) гена ТАГЕМ вбудовували в прокаріотичний експресійний вектор рОЕХ-4Т, так що одержали рекомбінатний вектор з кодувальною ділянкою ТАЇ-І. (послідовність ЖЕО ІЮО МО: 5), вставленою між сайтами Ватні та Храї роЕХ-4Т у прямому напрямку, тоді як кодувальна ділянка ТА! -А (послідовність ЗЕО ІЮ МО: 6) була вставлена між сайтами Хваї та Ватні роЕХ-4Т у прямому напрямку. Рекомбінантний вектор перетворювали на ВІі/21 Е.соїї Позитивну колонію інокулювали в середовище І В, доповнене ампіциліном та хлорамфеніколом, і культивували при 372С протягом ночі. Після цього згадану культуру інокулювали в 5 мл свіжого середовища ГІ В у співвідношенні 1:100, культивували при 372С при 225 об/хв до О0060020,5. Як негативний контроль (без індукції) відібрали 1 мл згаданої культури. Також одержували контролі порожнього вектора рОЕХ-4Т з індукцією або без неї. До решти культури додавали ІРТО (кінцева концентрація 1 мМ) для індукування експресії при 372С при 225 об/хв протягом 8 год. 2) Відбирали по 1 мл кожної з контрольної або індукованої культур, і центрифугували при 12000 об/хв протягом 10 хв для збору бактеріальних клітин, видаляючи супернатант. Зібрані клітини ресуспендували додаванням 50 мкл буфера, призначеного для завантаження білка, і кип'ятили протягом 7 хв. Супернатант аналізували із застосуванням електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності 1095 додецилсульфату натрію (1095 505-РАСЕ).
Молекулярна маса кожного білка ТАГЕМ становила приблизно 100 кДа. Амінокислотна послідовність білка ТАЇГ-МІО-Ї показана послідовністю 5ЕБЕО І МО: 7. Амінокислотна послідовність білка ТА! -МІ О-Е показана послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 8. 2. Очищення білків ТАГЕМ
Бактеріальну культуру центрифугували при 42С протягом 10 хв для збору бактеріальних клітин. В утворений осад додавали 10 мл лізисного буфера (50 мМ Трис-НСІ, 2 мМ ЕОТА, 100
ММ Масі, 1 мг/мл лізоциму, рН8,5), і перемішували на льоду протягом 45 хв. Після обробки ультразвуком, збирали осад центрифугуванням, промивали 4М розчином імідазолу. Осад, бо одержаний після подальшого центрифугування, розчиняли у 50 мМ фосфатному буфері (що містив 8М сечовини) при рН 7,4. (Фіг. ЗА).
І. Введення очищених білків ТАГЕМ у протопласти пшениці для сайт-спрямованого редагування гена МО
Очищені білюи ТАГЕМ проти цільового сайту гена МГО вводили в протопласти пшениці сорту Ворул/піїе із застосуванням РЕС-опосередкованого методу, описаного нижче. 1. Вирощування паростків пшениці
Зерна пшениці пророщували в культуральній кімнаті при 25:522С, освітленості 1000 люкс, при 14-16-годинному освітленні на добу, протягом приблизно 1-2 тижнів. 2. Виділення протопластів 1) Брали тонке листя пшениці, і його середню частину розрізали різальним інструментом на 0,5-1 мм смужки, уміщували в 0,6М розчин маніту (як розчинник використовували воду) на 10 хв в темряві. Потім суміш фільтрували через фільтр, після чого уміщували в 50 мл ензимолітичного розчину для гідролізу протягом 5 год. (0,5 год. - ензимолізис у вакуумі, потім 4,5 год. - повільне струшування при 10 об/хв).
Примітка: Температуру під час ензимолізису слід підтримувати на рівні 20-252С, реакцію слід проводити в темряві; і розчин слід обережно струшувати після реакції для вивільнення протопластів. 2) Продукт ензимолізису розбавляли додаванням 10 мл М/5, і відфільтровували в 50 мл центрифугальну пробірку з круглим дном із застосуванням 75 мкм нейлонової фільтрувальної мембрани.
Примітка: Нейлонову фільтрувальну мембрану слід занурити в 75 95 (у відсотках за об'ємом) етанол, промити водою, після чого просочити М/5 протягом 2 хв перед використанням. 3) Центрифугували при 232С протягом З хв при 1009, і супернатант видаляли. 4) Осад суспендували в 10 мл УУ5, витримували на льоду протягом 30 хв; протопласти в кінцевому підсумку утворювали осад, і супернатант видаляли. 5) Протопласти суспендували додаванням відповідної кількості розчину ММО, витримували на льоду до трансформації.
Примітка: Концентрацію протопластів слід визначити методом мікроскопії (х100). Кількість протопластів має становити від 2х10»/мл до 1х106/мл.
Зо 3. Трансформація протопластів пшениці 1) 15 мкг білків ТАГ ЕМ (білок ТАЇ -МІ 0-1. і білок ТАГ-МІ О-Е, змішані в рівних кількостях) або 20 мкг вектора Т-МІ О (контроль) вміщували в 2 мл центрифугальну пробірку. Із застосуванням піпетки додавали 200 мкл виділених протопластів, після чого перемішували легким постукуванням, і відстоювали протягом 3-5 хв. Потім додавали 250 мкл РЕС4000, і перемішували легким постукуванням. Трансформацію здійснювали в темряві протягом 30 хв. 2) Додавали 900 мкл МУУ5 (кімнатна температура), і перемішували перекиданням, центрифугували протягом З хв при 1009, і супернатант видаляли. 3) Додавали 1 мл МУУ5, і перемішували перекиданням, вміст обережно переносили на 6- лунковий планшет (із заздалегідь доданим 1 мл Му5), після чого культивували протягом ночі при температурі 2320. 4. Використання РСЕ/КЕ експериментів для аналізу мутагенезу ендогенного гена МІ о, що є результатом використання очищених білків ТА ЕМ
Через 48 год. після трансформації протопластів пшениці екстрагували геномну ДНК, яку використовували як матрицю для аналізу РСК/КЕ (полімеразна ланцюгова реакція/рестрикційний гідроліз) експериментами. Одночасно протопласти, трансформовані плазмідою Т-МІ О, або протопласти пшениці сорту Вобм/піе дикого типу використовували як контроль. Метод аналізу з РСБ/КЕ базується на Зпап, 0. еї аї.,, Карій ап ейсієепі депе тоаїйїсайоп іп гісе апа Вгаспуродішт ибзіпд ТАГЕМ»5. Моїесшціаг Ріапі (2013). Оскільки цільовий фрагмент ендогенного гена МГО пшениці містив послідовність розпізнавання рестрикційної ендонуклеази Амаї!, згадану рестрикційну ендонуклеазу Амаї! використовували в експерименті для проведення тесту РСК/НЕ. Праймерами, використаними в РСК-ампліфікації, були:
ТамгГо-г: 5-ТСАТССсТСТОССЯТОоСТОСТОаАаТсСА-З;
Тамі о-в: 5-таапТАТТССААлСОАСсаСсватотстатст-3.
Результати РСК/КЕ експериментів показали, що на цільовому сайті гена МО відбулись мутації. Смуги були відновлені і секвеновані. Результати секвенування показали, що на цільовому сайті гена МГ О відбулась інсерція/делеція (індел) (Фіг. ЗВ і фіг. 3).
ІМ. Сайт-спрямоване редагування гена МО введенням білків ТА ЕМ із застосуванням бомбардування частинками
Як правило, при трансформації експресійної плазміди в клітинах бомбардуванням бо частинками золотий порошок використовують як носій, який переносить ДНК-плазміду у клітини.
Проте для білків золотий порошок як носій є непридатним, оскільки білок важко зв'язати із золотим порошком. За цим винаходом для трансформації білків із бомбардуванням частинками як носій використовують кремнезем. 1. Завантаження білків у кремнезем
Як носій використовували кремнезем-Аи-М5М (розмір чарунок сита 10 нм). До 5 мл фосфатного буфера (РВ5), рн7,4, додавали 20 мг А!и-М5М для обробки ультразвуком, потім додавали 7 мг очищеного білка ТАЇ -МІ О-І. та білка ТАІ -МІ О-К. Суміш перемішували при 2226 протягом 24 год., центрифугували при 12000 об/хв. Супернатант видаляли. Осад суспендували фосфатним буфером. 2. Трансформація матеріалів-реципієнтів пшениці із застосуванням бомбардування частинками 1) Брали незрілий зародок пшениці сорту Вобм/пйе, і обробляли його протягом 4 год. у гіпертонічному середовищі. 2) Для бомбардування незрілого зародка пшениці, культивованого на етапі 1) у гіпертонічному середовищі, застосовували пристрій для бомбардування частинками. А!и-М5М, навантажений білками ТАГЕМ (5 мкл, 20 мкг/мл), завантажували на мембрану, і піддавали бомбардуванню; відстань для кожного бомбардування становила 6 см, тиск бомбардування становив 1100 фунтів/дюйм: (7,584 МПа), діаметр бомбардування становив 2 см. 3) Незрілий зародок пшениці, бомбардований на етапі 2), культивували протягом 16 год. у гіпертонічному середовищі. 4) Незрілий зародок пшениці, культивований на етапі 3) у гіпертонічному середовищі, у подальшому послідовно піддавали культивуванню протягом 14 днів для індукування утворення калюсної тканини, культивуванню протягом 28 днів для диференціювання і культивуванню протягом 14-28 днів для вкорінення для того, щоб одержати рослини пшениці. 5) З паростків пшениці, одержаних на етапі 4), екстрагували ДНК, і із застосуванням РСК/КЕ виявляли мутантів з нокаутованим (сайт-спрямованим шляхом) геном (стосовно конкретного методу випробувань, будь ласка, зверніться до етапу І). Як контроль використовували пшеницю сорту Вобж/пце дикого типу.
Результати виявлення декількох мутантів вказують на те, що на цільовому сайті гена МО
Зо пшениці відбулись мутації. Смуги були відновлені для секвенування. Результати секвенування показують, що на цільовому сайті гена МІ О відбулась інсерція/делеція (індел).
Вищенаведені результати показують, що сайт-спрямоване редагування цільового сайту може бути досягнуте введенням в пшеницю нуклеазного білка. Мутанти, одержані цим способом, не містять екзогенної ДНК, а введений білок буде зруйнований клітиною рослини.
Тому мутанти, одержані за цим способом, являють собою рослини, що не містять трансгену, які мають високу біобезпечність.
Приклад 4. Сайт-спрямоване редагування гена ТазА5К7 котрансформацією білка Саз59, експресованого і очищеного в прокаріотичній експресійній системі, та іп міго транскрибованої 5авВМА
І. Конструювання цільового фрагмента: мішень-С5
Мішень-С5: 5-СсССсОаССбасаСАССТАСОасСААС-3 (у гена ТасАЗК?7, як показано в номері депонування сСепрапк ЕОО95332, позиції 248-268).
ІІ. Експресія в прокаріотичній системи і очищення білка Са59 1. Ген Са59 (оптимізований для використання в кодоні рослинної клітини і доданий з Мі 5 на обох кінцях) вбудовували в прокаріотичний експресійний вектор рОЕХ-4Т, так що одержували рекомбінатний вектор з геном Са59 послідовності 5ЕО І МО: 9 (оптимізований для використання в кодоні рослинної клітини і доданий з МІ 5 на обох кінцях), вставлений між сайтами Ватні та 5реї! вектора роєЕХ-4Т. Рекомбінантний вектор перетворювали на Ес.соїї ВІ 21.
Позитивну колонію інокулювали в середовище І В, доповнене ампіциліном та хлорамфеніколом, і культивували при 372С протягом ночі. Після цього згадану культуру інокулювали в 5 мл свіжого середовища І В у співвідношенні 1: 100, культивували при 372С при 225 об/хв до 00600 20,5. 1 мл згаданої культури відбирали як негативний контроль (без індукції). Також одержували контролі порожнього вектора реЕХ-41 з індукцією або без індукції. До решти культури додавали
ІРТО (кінцева концентрація 1 мМ) для індукування експресії при 372С при 225 об/хв протягом 8 год. 2. Відбирали по 1 мл кожної з контрольної або індукованої культур, і центрифугували при 12000 об/хв протягом 10 хв для збору бактеріальних клітин, видаляючи супернатант. Клітини ресуспендували, додаванням 50 мкл буфера, призначеного для завантаження білка, і кип'ятили протягом 7 хв. Супернатант аналізували із застосуванням електрофорезу у поліаакриламідному 60 гелі у присутності 10 95 додецилсульфату натрію (10 95 505-РАСЕ). Молекулярна маса білка
Са59 становила приблизно 200 кДа. Амінокислотна послідовність білка Са59 показана послідовністю 5ЕО ІО МО: 10. 2. Очищення білка Са59
Бактеріальну культуру центрифугували при 42С протягом 10 хв для збору бактеріальних клітин. В утворений осад додавали 10 мл лізисного буфера (50 мМ Трис-НСЇІ, 2 мМ ЕОТА, 100
ММ Масі, 1 мг/мл лізоциму, рНеВ,5), і перемішували на льоду протягом 45 хв. Після обробки ультразвуком осад збирали центрифугуванням, промивали 4М розчином імідазолу. Осад, одержаний після подальшого центрифугування, розчиняли у 50 мМ фосфатному буфері (що містить 8М сечовини) при рн 7,4. (Фіг. 4А).
І. Тп міго транскрипція З9ДКМА цільового сайту 1. Цільовий сайт ТасА5кК7 вбудовували у вектор рТ7-д8МА.
С5 являє собою послідовність ДНК, що кодує РНК, яка може комплементарно зв'язуватись з мішенню-С5.
Синтезували такі одноланцюгові олігонуклеотиди з липкими кінцями (підкреслені):
Сг: 5-СТТатта,асСсатаааЙтасссоа(а-9";
С5А: 5-АААсСсСааваСАССТАСИасАА-З".
Дволанцюгову ДНК з липкими кінцями одержували із застосуванням процесу відпалу олігонуклеотидів, і вставляли між двома сайтами рестрикції ВБбБ5І в плазміду рГ7/-9сКМА з одержанням плазміди рГ7-деЕМА, яка містить сайт С5. Позитивну плазміду підтверджували секвенуванням. Рекомбінантна плазміда, яку одержали інсерцією фрагмента ДНК, як показано в 5Б-статасСатаа,аатасссбас-3, у прямому напрямку на сайті рестрикції ВБр5іІ плазміди рТ7- 9ЕМА, була позитивною, і її позначили як рТ7-дАМА-С5. 2. Іп міго транскрипція З9ДКМА, що містить цільовий сайт ТасАЗК7
З використанням промотора Т7 для ініціації транскрипції, 59ЕМА для гена Тасдо5кК7 транскрибували іп міго із застосуванням транскрипційного набору мРНК (Атріоп) в здЕеЕМА-
СА5БІА7-С5 (послідовність зЗЕО ІЮО МО: 11), і полі(А)-хвіст додавали до 3'-кінця для підвищення стабільності МРНК.
ЇМ. Редагування гена Тасд5К7 котрансформацією білка Са59 та іп міго транскрибованої 59АМА у протопласти пшениці
Зо 1. Процес одержання протопластів є ідентичним процесу Прикладу 3. 2. Трансформація протопластів 1) У 2 мл центрифугальну пробірку вміщували 15 мкг очищеного білка Са59 і 20 мкг ЗдЕМА-
САБНА7-С5. Додавали 200 мкл протопластів (приблизно 4х10» клітин), потім додавали 250 мкл свіжого розчину ПЕГ, і перемішували. Трансформацію проводили в темряві протягом 30 хв. 2) Додавали 900 мкл М/5 (кімнатна температура), і перемішували перевертанням, центрифугували при 1009 протягом З хв, і супернатант видаляли. 3) Додавали 1 мл МУ/5, і перемішували перевертанням, вміст обережно переносили на 6- лунковий планшет (із заздалегідь доданим 1 мл МУУ5), після чого культивували при 232С протягом ночі.
З. Використання РСК/КЕ (полімеразна ланцюгова реакція/рестрикційний гідроліз) експериментів для аналізу мутагенезу ендогенного гена ТасзА5К7 пшениці, що є результатом використання очищеного білка Са59 та іп міго транскрибованої гдаеЕМА
Через 48 год. після трансформації протопластів пшениці екстрагували геномну ДНК, яку використовували як матрицю для аналізу з РСЕК/КЕ (полімеразна ланцюгова реакція/рестрикційний гідроліз) експериментами. Протопласти пшениці сорту Ворм/пйе дикого типу одночасно використовували як контроль. Метод аналізу з РСЕ/КЕ базується на 5Впап, о. еї а!., Наріа апа ейісієпі депе тодіїсайоп іп гісе апа Вгаспуродіит ивіпд ТАГЕМ5. Моїесшаг Ріапі (2013). Оскільки цільовий сайт (позиції 248-268, номер депонування Сепрапк ЕШО95332) ендогенного гена ТасздА5БкК7/ пшениці (номер депонування Сепрапк ЕШО95332) містив послідовність розпізнавання (5'-605(303-3) рестрикційної ендонуклеази Месії, згадану рестрикційну ендонуклеазу Месії використовували в експерименті для проведення тесту РСЕ/КЕ.
Праймерами, використаними в РСК-ампліфікації, були:
Тапд5НА?-Е: 5-СссАсатадтааадаатаскса(в(а-9";
Тасад5н7-В: 5-стасаАа,асасСААТТСАСАТасСсСА-3".
Результати з РСК/КЕ експериментів показали, що на цільовому сайті гена Тасд5кК7 відбулись мутації. Смуги на фігурі були відновлені і секвеновані. Результати секвенування показали, що на цільовому сайті гена ТасАд5К7 відбулась інсерція/делеція (індел) (Фіг. 4В і Фіг. 4С).
М. Сайт-спрямоване редагування гена ТасАд5К7 пшениці трансформацією бомбардуванням 60 частинками очищеного білка Са59 та іп міго транскрибованої ЗдЕМА
1. Завантаження очищеного білка Савз9 та іп міго транскрибованої З5дФеЕМА у кремнезем
Як носій використовували кремнезем-Аи-М5М (розмір чарунок сита 10 нм). До 5 мл фосфатного буфера (РВ5), рН7,4, додавали 20 мг Аи-М5М для обробки ультразвуком. Потім додавали 7 мг очищеного білка Са59. Суміш перемішували при 222С протягом 24 год., центрифугували при 12000 об/хв. Супернатант видаляли. Осад суспендували фосфатним буфером. До 10 мкл білка Савз-носія А!ц-МеМ (10 мкг/мкл)у додавали 4 мкл іп мійго транскрибованої З9дЕМА (250 нг/мкл). Потім додавали 12,5 мкл 2,5 М розчину СасСігі 5 мклО1 М розчину спермідину, центрифугували при 5000 об/хв протягом 15 с, і супернатант видаляли. А!й-
М5М, що несе білок Саб59 і є покритим мРНК, двічі промивали 10095 етанолом, і ресуспендували у 5 мкл 100 95 етанолу, утворену суспензію позначали як Зх9ФІКМА-Саз9-Аи-М5М. 2. Трансформація матеріалів-реципієнтів пшениці із застосуванням бомбардування частинками 1) Брали незрілий зародок пшениці сорту Вобм/пйе, і обробляли його протягом 4 год. у гіпертонічному середовищі. 2) Для бомбардування незрілого зародка пшениці, культивованого на етапі 1) у гіпертонічному середовищі, застосовували пристрій для бомбардування частинками. 5 мкл 59АМА-Са59-Ац-М5М завантажували на мембрану, і піддавали бомбардуванню; відстань для кожного бомбардування становила б см, тиск бомбардування становив 1100 фунтів/"дюйм? (7,584 МПа), діаметр бомбардування становив 2 см. 3) Незрілий зародок пшениці, бомбардований на етапі 2), культивували протягом 16 год. з у гіпертонічному середовищі. 4) Незрілий зародок пшениці, культивований на етапі 3) у гіпертонічному середовищі, у подальшому послідовно піддавали культивуванню протягом 14 днів для індукування утворення калюсної тканини, культивуванню протягом 28 днів для диференціювання і культивуванню протягом 14-28 днів для вкорінення для того, щоб одержати рослини пшениці. 5) З паростків пшениці, одержаних на етапі 4), екстрагували ДНК, і із застосуванням РСЕ/КЕ виявляли мутантів з нокаутованим (сайт-спрямованим шляхом) геном (стосовно конкретного методу випробувань, будь ласка, зверніться до етапу ІМ). Як контроль використовували пшеницю сорту Вобж/пце дикого типу.
Зо Результати виявлення деяких мутантів вказують на те, що на цільовому сайті гена ТасА5К7 пшениці відбулись мутації. Смуги були відновлені для секвенування. Результати секвенування показують, що на цільовому сайті гена ТасА5К7 пшениці відбулась інсерція/делеція (індел).
Приклад 5. Сайт-спрямоване редагування ендогенного гена 7тіРК кукурудзи введенням очищеного білка Са59 та З59ЕМА в рослину за методом з використанням пилкових трубок
І. Конструювання цільового фрагмента: мішень-С2
Мішень-С2: 5-СсССбСсАаСТопАССАСасССасСсСОоАС-3 (позиції 393-415 гена 7тіІРК, як показано у номері депонування сепрапк АХ172635).
ІЇ. Прокаріотична експресія та очищення білка Са59
Аналогічно Прикладу 3, етап ІІ.
І. Тп міго транскрипція З9ДКМА цільового сайту 1. Цільовий сайт 27тіРК вбудовували у вектор рТ7-дВМА
С2 являє собою послідовність ДНК, яка кодує РНК, яка може комплементарно зв'язуватись із мішенню-С2.
Синтезували такі одноланцюгові олігонуклеотиди з липкими кінцями (підкреслені): бг-1г: 5-дасаатсавсасвсасатаатоаАОст-8"; б2-18: У-АААсАаастоаАССАСаССа,аССаАо-3.
Дволанцюгову ДНК з липкими кінцями одержували із застосуванням процесу відпалу олігонуклеотидів, і вставляли між двома сайтами рестрикції ВБбБ5І в плазміду рГ7/-9сКМА з одержанням плазміди рГ7-деЕМА, яка містить сайт С2. Позитивну плазміду підтверджували секвенуванням. Рекомбінантна плазміда, яку одержали інсерцією фрагмента ДНК, як показано в в-дасадатосаса,васстаатсцАсСсСтТ-3, у прямому напрямку на сайті рестрикції Врб5і плазміди рТ7-деМА, була позитивною, і її позначили як рТ7-дАМА-С2. 2. Іп міго транскрипція 5З9КМА, яка містить цільовий сайт 2тіРК
З використанням промотора Т7 для ініціації транскрипції, 59КМА для гена 2тіРк транскрибували іп міїго із застосуванням транскрипційного набору мРНК (Атрбіоп) в ЗдПЕМА-ІРО-
С2 (послідовність ЗЕО ІО МО: 12), ії полі(А)-хвіст додавали до 3'-кінця для підвищення стабільності МРНК.
ІМ. Сайт-спрямоване редагування ендогенного гена 27тіРК кукурудзи введенням очищеного білка Са59 та іп міго транскрибованої зхд9ЕМА за методом з використанням пилкових трубок бо Як матеріали-реципієнти в польових умовах вибирали сильні рослини кукурудзи інбредної лінії НІЇЇ. Рослини піддавали самозапиленню о 14:00-16:00 сонячного дня. Через 16-20 год. після запилення, а саме о 10:00-12:00 наступного дня, маточки реципієнтів вирізали. На розрізи наносили краплями суміш білка Са59 (10 мкг/мкл) та 5ФдКМА (250 нг/мкл). Приймочки вкривали мішечками до плодоношення. Одержані зерна кукурудзи вирощували, і геномну ДНК екстрагували, і використовували в РСК/КЕ експерименті як матрицю. Кукурудзу сорту НІЇ дикого типу використовували як контроль. Метод аналізу з РСЕ/КЕ базується на 5пап, о). еї аї.,
Варіа апа ейісіеєпі депе тодаіїісайоп іп гісе апа Вгаспуродіит ивіпуд ТАГЕМ5. Моїесшаг Ріапі (2013). Оскільки цільовий фрагмент (позиції 393-415, номер депонування сСепрапк АХ172635) ендогенного гена 2тіІРК кукурудзи (номер депонування Сепрапк АМм172635) містив послідовність розпізнавання (5-С4АССТО-3) рестрикційної ендонуклеази Засі, згадану рестрикційну ендонуклеазу Засі використовували в експерименті для проведення тесту
РСЕ/КЕ. Праймерами, використаними в РСЕК-ампліфікації, були: 2тіІРК-ТЕ: 2-ТсСаСАасасооСта,аСА,сАасСАд-З"; 2тіІРК-1А: 5-СсАСАССТасаАаАда,ааАспСАСаавАТОС-З".
Результати РСЕ/КЕ експериментів показали, що на цільовому сайті гена 2тіРК відбулись мутації. Нерозрізані смуги були відновлені і секвеновані. Результати секвенування показали, що на цільовому сайті гена 2тіРК відбулась інсерція/делеція (індел).
Приклад 6. Сайт-спрямоване редагування гена МІРМУ котрансформацією білка Сав59, експресованого і очищеного в прокаріотичній експресійній системі, та іп міго транскрибованої 5О9КМА у протопласти тютюну і регенерація в рослини
І. Конструювання цільового фрагмента: мішень-Р4А
Мішень-Р4: 5-ТаАТАССАССТА,СТАТАСАСОЇа-з"
ІІ. Процес прокаріотичної експресії та очищення білка Са59 є аналогічним описаному у
Прикладі 3.
І. Тп міго транскрипція З9ДКМА цільового сайту 1. Цільовий сайт МІРУМ вбудовували у вектор РНОМ401
Р4 являє собою послідовність ДНК, яка кодує РНК, яка може комплементарно зв'язуватись із мішенню-Ра.
Синтезували такі одноланцюгові олігонуклеотиди з липкими кінцями (підкреслені):
Зо РА-Е: У-АТТатТаАТАССАССТасасСТАТАСА-3";
РА-В: У-АААСТИТАТАСССАаСтТаатТАТСА-3.
Дволанцюгову ДНК з липкими кінцями одержували із застосуванням процесу відпалу олігонуклеотидів, і вставляли між двома сайтами рестрикції В5аі в плазміду рРНЗМ401 з одержанням плазміди рНеМ401, яка містить Рі. Позитивну плазміду підтверджували секвенуванням. Рекомбінантна плазміда, яку одержали інсерцією фрагмента ДНК, як показано в 5-АТТаТОАТАССАСаСТОассТАТАСА-3, у прямому напрямку на сайті рестрикції Вза! плазміди рноімМао1, була позитивною, і її позначили як рНнОМ401-РА. 2. Іп міго транскрипція 5З9КМА, яка містить цільовий сайт МТРУУ
З використанням промотора Т7 для ініціації транскрипції, 59КЕМА для гена МТРУУ (послідовності ЗЕО ІЮ МО: 13, 14, 15) транскрибували іп міїго із застосуванням транскрипційного набору мРНК (Атбіоп) в здеЕМА-РУХ-РА (послідовність ЗЕО ІЮ МО: 16).
ЇМ. Редагування гена МІРУМ котрансформацією білка Са59 та іп міго транскрибованої здаеЕМА у протопласти тютюну 1. Одержання матеріалів
Використовували тютюн сорту Нопдпша Ваїіпучап. Насіння обробляли 20 95 розчином натрію гіпохлориту протягом 20 хв, і 5 разів промивали стерильною водою. Після цього насіння культивували на середовищі 1/2 М5 при 252С з освітленням протягом 16 год. 2. Виділення протопластів 1) Відбирали б листків ЗО-денних рослин тютюну, і за стерильних умов розрізали їх на сегменти величиною приблизно 1 см. Ці сегменти вміщували в культуральний планшет, який містить 15 мл ензимолітичного розчину. Планшет герметизували, і витримували в темряві при 252С протягом ночі (найбільша перевага віддається проміжку часу, який становить 12 год.). 2) Після реакції ензимолізу додавали відповідну кількість розчину М/5. Планшет обережно струшували для того, щоб вивільнити протопласти. Потім суспензію протопластів фільтрували через 100 мкм і 40 мкм стерильні фільтри, центрифугували при 709 протягом 5 хв, і супернатант видаляли. 3) Протопласти ресуспендували додаванням 5 мл 22 95 розчину сахарози. Потім додавали 2 мл розчину М/5, і центрифугували при 709 протягом 5 хв. Суспендовані протопласти знаходилися на поверхні розділу. бо 4) Протопласти знімали з поверхні розділу. Додавали 5 мл розчину МУ5, і перемішували з подальшим центрифугуванням при 709 протягом 5 хв. 5) Супернатант видаляли. Для ресуспендування протопластів додавали 1 мл трансформаційного розчину ММО. Вихід протопластів визначали із застосуванням мікроскопа. 3. Трансформація та регенерація протопластів 1) У 14 мл центрифугальну пробірку вміщували 20 мкг очищеного білка Са59 і 20 мкг теМА-
РМУ-Р4. Додавали 300 мкл протопластів (приблизно 5х105 клітин). Потім додавали 300 мкл свіжого розчину ПЕГ, перемішували, і витримували в темряві протягом 20 хв. 2) Додавали 10 мл УУ5, перемішували, центрифугували при 709 протягом З хв, і супернатант видаляли; цей етап повторювали. 3) Додавали 1 мл середовища КЗ:Н, яке містило 0,6 95 агарози 5еа Ріадце " (інкубованого на водяній бані (40-45 "С) перед використанням), та перемішували. Суміш переносили на стерильний 30 мм культуральний планшет. 4) Після затвердіння середовища планшет витримували в темряві при 242С протягом 24 год., і знову культивували у темряві протягом 6 діб до першого поділу клітин. 5) Агарозний гель переносили на 90 мм культуральний планшет, і додавали відповідну кількість рідкого середовища А. Культивування продовжували в темряві при температурі 24260. 6) Через 3-4 тижні в чашці з'являвся видимий калюс. Після 5-6б-тижневого культивування діаметр калюса досягав 8-10 мм. 7) Калюси переносили на диференціювальне середовище, і культивували протягом 1-2 тижнів до утворення на поверхні адвентивних бруньок. 8) 3-4 см адвентивні бруньки зрізали, і переносили на укорінювальне середовище для індукування утворення коренів до одержання інтактних рослин. 9) Проростки пересаджували в грунт після досягнення корінням певної довжини.
ДНК трансгенного тютюну екстрагували, і використовували як матрицю для аналізу з
РСРЕУКЕ (полімеразна ланцюгова реакція/рестрикційний гідроліз) експериментами. Одночасно використовували ДНК тютюну дикого типу як контроль. Метод аналізу з РСЕ/КЕ базується на зпап, О. єї аї., Варіа апа ейісіеєпі депе тоаійісайоп іп гісе апа Вгаспуродіит ивіпа ТАГЕМВ5.
Моїесшіаг Ріапі (2013). Оскільки цільовий фрагмент ендогенного гена МІРМУ тютюну містив послідовність розпізнавання (5-САССТ(О-3) рестрикційної ендонуклеази РуціІ, згадану
Зо рестрикційну ендонуклеазу Рмші! використовували в тесті з РСК/КЕ. Праймерами, використаними в РСВ-ампліфікації, були:
МЕРММУ-Е: 5-ТаОСАТТАСАТОИ ТТ ТТ САААТОаС-3";
МЕРМУ-В: 5-САТ ТО ТІ ТаОСсСОасАСО,сАСАДА-З.
Результати з РСЕ/КЕ експериментів показали, що в результаті котрансформації білка Са59 та іп міго транскрибованої З9ОЕМА у протопласти тютюну на цільовому сайті гена МРУУ відбулися мутації. Нерозрізані смуги були відновлені і секвеновані. Результати секвенування показали, що на цільовому сайті гена МІЕРУМУ відбулась інсерція/делеція (індел) (Фіг. 5А і фіг. 5В).
Крім того, регенеровані трансгенні рослини тютюну також демонстрували мутацію на цільовому сайті гена МІРМУ. Результати секвенування показали, що на цільовому сайті гена МШМРУУ відбулась інсерція/делеція (індел) (Фіг. 5С).
Розчини для виділення та культивування протопластів тютюну наведені в Таблицях 6-10.
Таблиця 6 11111111 | 1 Доданакількість | Кінцеваконцентрація. З:
Целюлазав!0 //-/-://///Ї7777777777171С170611111111111Ї111111стеовсСсСС при 70004 протягом 10 хв; фільтрують через 0,22 мкм фільтр.
Таблиця 7 11111111 | Доданакільксть | Кінцеваконцентрація. З:
Доливають до 500 мл двічі дистильованою водою, рН доводять до 5,8 додаванням КОН,
Таблиця 8 11111111 | Доданакільксть | Кінцеваконцентрація. З: автоклавують.
Таблиця 9 11111111. | Доданакільксть | Кінцеваконцентрація. З:
Сагїмов)аїд/////С1СЇ111111111111111Г111111омсИЙИЙ2 автоклавують.
Таблиця 10
Концентрований розчин для виділення та культивування протопластів тютюну мМнаМоз 7 Ї777717717171717171717Ї171117401 17111301 7125 | 825 (мнааяОї 7 ЇЇ 70 ЇЇ 0 1 25 | 0 ЇЇ 0
КНРО 7777777 71171011 136 | 17 | 0 | 17 манггої 7 Ї7770117 11110 1 15 | 0 1 щж0 (мнЯесукцинат-/:/ | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 банРох// ЇЇ 70 Її 0 1 0 1 5 ЇЇ 0 111110 |лоо |7лоо | лоб | лоо | ло
Ю-сорбії 7 Ї777170117 17111011 1455 | 20 | 0
Ю-мант// Ї7711701 11110 | 455 | 20 | 0
Гормони (мг/л) (кінцева концентрація) 71240 110 | 15 | 5 | 15 | 0
Кнетин///////// ЇЇ 7770 Її 0 ЇЇ 0 ЇЇ 0 11 02
Продовження таблиці 10 (Нікотиновакислота | 0 2 | 05 | 05 | 05 | 05
Інші органічні речовини (мг/л) (кінцева концентрація) -сглутамно 777010 ЇЇ 0 1 877 | 0 саспарагніо///////Ї77717077 17711010 | 266 | 0 (Казеїнутідролзат | 400 | 400 | 40 | 0 | 0
Claims (6)
1. Спосіб здійснення сайт-спрямованої модифікації цільового фрагмента гена-мішені в рослині, який включає такі етапи: введення неуспадковуваного матеріалу в тканину або частину відповідної рослини методом бомбардування частинками, при цьому згаданий неуспадковуваний матеріал являє собою нуклеазу системи коротких паліндромних повторів, регулярно розміщених групами/СкКІЗРЕ асоційованих білків, специфічну для згаданого цільового фрагмента, в результаті чого цей цільовий фрагмент розщеплюється згаданою нуклеазою і сайт-спрямована модифікація цільового фрагмента досягається через репарацію ДНК в рослині; при цьому згадана тканина являє собою калюс, незрілий зародок або зрілий зародок; або згадана частина рослини являє собою лист, верхівку пагона, суцвіття або пилкову трубку.
2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що згадана нуклеаза являє собою нуклеазу СВІБРА/Саз9.
3. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що неуспадковуваний матеріал складається з білка Саз9 і РНК-гіду; при цьому згадана РНК-гід являє собою РНК з паліндромною структурою, яка утворюється частковим паруванням основ між сгеЕМА та їгастеМА, при цьому згадана сгеЕМА містить фрагмент РНК, здатний до комплементарного зв'язування з цільовим фрагментом.
4. Спосіб за будь-яким із пп. 1-3, який відрізняється тим, що згадана тканина являє собою будь-яку тканину для введення неуспадковуваного матеріалу і регенерування в інтактну рослину через культуру тканини; або згадана частина рослини являє собою будь-яку частину інтактної рослини для введення неуспадковуваного матеріалу.
5. Спосіб за будь-яким із пп. 1-4, який відрізняється тим, що сайт-спрямована модифікація являє собою інсерцію, делецію та/або заміну нуклеотиду в цільовому фрагменті.
6. Спосіб одержання мутантної рослини, яка не містить трансгену, який включає такі етапи: проведення сайт-спрямованої модифікації цільового фрагмента гена-мішені у відповідній рослині за способом за будь-яким з пп. 1-5, з одержанням таким чином рослини, в якій функції Зо гена-мішені є втраченими або зміненими, і геном якої не містить інтегрованого екзогенного гена.
ка АЖ В ШИМИ и п шо шко ші Як б к- молоко вк ук нок вместе а ірупа В Що ТОЛЯ ни С їванаеві сАесукВНУ АТЕТОКАВМІВ ТОНИ МАКСА МУК ТОМИ ШАССВУМОКОТА ТКУ ж-ї ДА ЄдопУопесатУР.
ТАОМИВ «Рв, ПАЛИТИ ТММ в.
ВХ СВОСВТСОЗКОТА хо ТВО «дж.
ОДНУ КАТАТИ КІ КАНА.
КР вв, ЩІ ОЄАЧО засн х юки ДОМІ -13 вав.
ПАПСАДЖОЄ НАЕК АЛЛО із.
ТАЗ ВІ МАСЛОВ ЕУ ГУ ЯЗ яв, Її ОКОВЦАКРЦОМОТАТР РОС зі пи.
Т-8 ДІ САСОДТУ, ххх хо ВАВ «ви САМОВИКЕНУТА є ОВО -В Ви.
МА СКАЦОДЖУО о кох хх КАК «ня.
МК ПДАТУ а АН і в, КОП ЖОТАТИЕ ВІ.
МАЄ «В. те Ві СЛОВА СТАТТ СО КАВИ іа; САТ НННУТ АЮ» я я ХВОЯ -З в.
І Сугхллухи тека ках ЙО «І в.
ПОЕВАТИОВОКАТ» «з ВКДАКИ «З, Те ВУ КАВА ОТАТУ КМУ Я в.
МТ САВКА ТАСВИКИ ЕВ, СВО ТИНИ сет етикох -Я ня же ВІ КВООВАЖО лані чужитоти «Чтв.
ПАСА КСВ А ЖІ дах.
ПІ ОСАОУА ВНИХ АКОТ МІ ЖЕ САССВАЛЕЄНУЗОК з котел «Ів.
ФІГ І
А Ж В вд зх К Ф с х ж
Є. КУ амо шк ШК Є ж ; я учик ; Кк КК НИ МК М о шНиМА ск єв як ФУ У Ей ооо ок оос восковою м А Ак Бе у ДО КОН Ох і і й пок вв ИН в Ки Ве ВО
ПИ. ТИЙ и ит КОН и Кук КОЖ я КОЖ пр ва с о Пн пот Я 0 м ша Я ЯК ПО с ши ПВ КВ МОЯ ПЕКИ КК ОК АК І, Кто ен и ПО НН є і і і Ши а я в Кн Кн 5 2 ТВАМАТ-ОБВАЮНЯВ ТОСТОЦАТОСТ ВОДОЮ оуентяк сх оса ця АТО ОА вс ВОСТОПАТССЕ ТИВ ВОК ЦНС АТО КТС сн ТОСТОСАТОСТТТИАВТВЕ ВОВК ЦВК ТТ СААВАСА ек ТЕСТОМ АВТАСК ЗОВ КОК І СаАТКСТАСАЛАВЯ ЦІ ЖИСТНМАТОМ ТТ ТОАЮІТВСВКІОсВц БОКОВА АЛ ОСА ІН ТОСТОКАТУТТОАСІАОКТ пово АСВАЛАВОСА ЗА
ФІГ. 2 У ек МЕ А ех - в м ії з 44 а їй ей В о ВХ в КУ З16 Дудії ШЕ. «В як я УМ Де др, мекв ЕВ. хеелоковеєткикоксв ш- о ю(Д(Д(Ю КА яко й : ЯНВ оон понвкокоюсококненннннй? ЕХ кЛе ТЕ. ще Нім, ки е на У ХМ Ше: нн НН. нь: Мити ит ді п -: МОМ ЧНО СК ВІКОВА ЗЛ зако су он и МИ Ж КІ ес що: КОКСТУЄСХВО КН апа» «жест КНЕСАНККСВ й ЗКЖДВ се и мо склих М: ЖЕН В Кун хх МКК НВ АХ нм Й і НН в і и Й кри нан ни А нс Я: ДЕКО И КООКаМЮ сс сх ПАКОМСА ЯМ свв р зи Мбх ТОБТО В КО ОН о Коко ВІК ВВ
ФІГ. 3
А а мМм' З 4 жк 7 бу А хи и р Не ЗВ СУК Зорвввовв: новні ПЕПИКИЕК о ит ун падків КИ а ни км Повна и ИИИИ ис Коок ох вок осені п шо о ее и мене чен - шк ЗИ ит и КК КЛИН ТИ М ОМ ПИМИИДИИМ ПИННН й ПИ: ми и и ННЯ ід АБН Є МЕ одн в цк МЕ ке в о М В в НИ ин а а в он ин сИПМУНС Ти В ТИКИ ОВТТОКЯ кі ИЙ Ли КП АН ВИХ и ти ИН рожі ев ваии и в И ИКЕ Ежу к ки чя ЖОВ, нити . пики При ТИ С КУМЕ ТУ Оп ЛТИеМИЯ ту МІ ВН ИН я нн нен НН и УКУСІ КИМ БУМ ОВ а и НО НН НН ан НЕК ЕНН УА в ВЕ С с У ОМ СБ на на вве Ме нки зе і ВД оз Не и Оу Ж УА Мотя иЙ т тн ХП КК єму КК ЕЕ ОВ Її ся І
А вМвВУК ре КОрутАссАо т тАтАсАСоВ ЧЕВОЗЕПЛЬНИЙ РОЗШЩЕВНЯ ВВ КУЦЇ ружвне Я. рю то: фе шу БІДА ВАЛРСТСАТВИСДАНСТ ВАЛОВА АХ АТУЖК МУ ВІТА ДЕД лю кт тетттюю м жетжю межючю ем мн ОВТ ВО АТАК ДО АОТАМНУАЛАТСТОА АССВОС У ни СТА МУТАТОСТ В ОВТАКИК ОВ РОЗПИУЦТНИЙ РУКА й ; й о ву яд І че я І г Гоися живе ВВ 7 ЕЕ як - ОУН о вка х МКК КК ВН ЕЕ дикий ТВ: СУКА ВААС ТАТАССТВМ У КАКАО ВТО ТОНАХ МтуйеЯі ФАК осонні у петлю де вок ток ік ВЕУ ТО АТАК І Муфта нй: ТАБАКОВ АВНІСТВАХАЦИД не ВМТ АНОДА ТКУ В Її ТАБУ АААКС ТАКА т хо КУ А КОВО СТАТ ФІГ 5
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510114017 | 2015-03-16 | ||
PCT/CN2016/076244 WO2016155482A1 (zh) | 2015-03-16 | 2016-03-14 | 一种利用非遗传物质对植物基因组进行定点改造的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
UA125246C2 true UA125246C2 (uk) | 2022-02-09 |
Family
ID=57005578
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
UAA201709693A UA125246C2 (uk) | 2015-03-16 | 2016-03-14 | Спосіб здійснення сайт-спрямованої модифікації рослинних геномів із застосуванням неуспадковуваних матеріалів |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20180163232A1 (uk) |
EP (1) | EP3279321A4 (uk) |
JP (2) | JP2018508221A (uk) |
KR (1) | KR102194612B1 (uk) |
CN (1) | CN105985943B (uk) |
AR (1) | AR103926A1 (uk) |
AU (1) | AU2016239037B2 (uk) |
BR (1) | BR112017016431A2 (uk) |
CA (1) | CA2979290A1 (uk) |
EA (1) | EA038896B1 (uk) |
UA (1) | UA125246C2 (uk) |
WO (1) | WO2016155482A1 (uk) |
Families Citing this family (34)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2853829C (en) | 2011-07-22 | 2023-09-26 | President And Fellows Of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
US20150044192A1 (en) | 2013-08-09 | 2015-02-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease |
US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
US9526784B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-12-27 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
US9340800B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | Extended DNA-sensing GRNAS |
US9388430B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-07-12 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
US20150166982A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting pi3k point mutations |
US10077453B2 (en) | 2014-07-30 | 2018-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
BR112018008109A2 (pt) | 2015-10-20 | 2018-11-06 | Pioneer Hi Bred Int | métodos para modificar uma sequência de nucleotídeos no genoma de uma célula vegetal, produzir uma planta, produzir tecido de calo de planta que tem uma sequência de nucleotídeos modificada em seu genoma sem o uso de um marcador selecionável, e planta de progênie da planta |
EP4269577A3 (en) | 2015-10-23 | 2024-01-17 | President and Fellows of Harvard College | Nucleobase editors and uses thereof |
SG11201900907YA (en) | 2016-08-03 | 2019-02-27 | Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
WO2018031683A1 (en) | 2016-08-09 | 2018-02-15 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
CN110214180A (zh) | 2016-10-14 | 2019-09-06 | 哈佛大学的校长及成员们 | 核碱基编辑器的aav递送 |
US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
JP6928416B2 (ja) * | 2016-12-27 | 2021-09-01 | 株式会社豊田中央研究所 | Dna二本鎖切断活性を有するタンパク質を用いた真核生物の育種方法 |
EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
EP3592777A1 (en) | 2017-03-10 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
CN110914426A (zh) | 2017-03-23 | 2020-03-24 | 哈佛大学的校长及成员们 | 包含核酸可编程dna结合蛋白的核碱基编辑器 |
CN117051035A (zh) * | 2017-05-05 | 2023-11-14 | 苏州齐禾生科生物科技有限公司 | 不使用转基因标记序列分离细胞的方法 |
WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
WO2019023680A1 (en) | 2017-07-28 | 2019-01-31 | President And Fellows Of Harvard College | METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE) |
CN107338309A (zh) * | 2017-07-28 | 2017-11-10 | 华智水稻生物技术有限公司 | 一种水稻常用栽培品种香味基因badh2的SNP分子标记及应用 |
US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
JP2021500036A (ja) | 2017-10-16 | 2021-01-07 | ザ ブロード インスティテュート, インコーポレーテッドThe Broad Institute, Inc. | アデノシン塩基編集因子の使用 |
CN112654710A (zh) | 2018-05-16 | 2021-04-13 | 辛瑟高公司 | 用于指导rna设计和使用的方法和*** |
GB201809273D0 (en) | 2018-06-06 | 2018-07-25 | Vib Vzw | Novel mutant plant cinnamoyl-coa reductase proteins |
CN109371056B (zh) * | 2018-09-16 | 2022-04-08 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一种选育对辣椒脉斑驳病毒抗性的烟草植物的方法 |
GB201820109D0 (en) | 2018-12-11 | 2019-01-23 | Vib Vzw | Plants with a lignin trait and udp-glycosyltransferase mutation |
BR112021018607A2 (pt) | 2019-03-19 | 2021-11-23 | Massachusetts Inst Technology | Métodos e composições para editar sequências de nucleotídeos |
JP7334898B2 (ja) * | 2019-04-12 | 2023-08-29 | 国立大学法人東海国立大学機構 | 花粉への物質導入方法 |
CN116096873A (zh) | 2020-05-08 | 2023-05-09 | 布罗德研究所股份有限公司 | 同时编辑靶标双链核苷酸序列的两条链的方法和组合物 |
JP7345760B2 (ja) * | 2020-10-07 | 2023-09-19 | 国立大学法人東海国立大学機構 | 花粉への物質導入方法 |
CN117683763A (zh) * | 2022-09-09 | 2024-03-12 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 基于dna聚合酶的基因组编辑***和方法 |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0716708A1 (de) * | 1993-09-03 | 1996-06-19 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Mittelkettenspezifische thioesterasen |
US6583335B1 (en) * | 1997-04-18 | 2003-06-24 | Texas Tech University | Direct transformation of higher plants through pollen tube pathway |
US6518487B1 (en) * | 1998-09-23 | 2003-02-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Cyclin D polynucleotides, polypeptides and uses thereof |
JP5491039B2 (ja) * | 2009-02-13 | 2014-05-14 | 国立大学法人岩手大学 | リンゴ小球形潜在ウイルスベクターを用いたバラ科果樹の開花促進方法 |
AU2010234539B2 (en) * | 2009-04-07 | 2015-04-09 | Corteva Agriscience Llc | Nanoparticle mediated delivery of sequence specific nucleases |
EP2526112B1 (en) * | 2010-01-22 | 2018-10-17 | Dow AgroSciences LLC | Targeted genomic alteration |
EP3808844A1 (en) * | 2012-07-25 | 2021-04-21 | The Broad Institute, Inc. | Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof |
UA119135C2 (uk) * | 2012-09-07 | 2019-05-10 | ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі | Спосіб отримання трансгенної рослини |
EP3372679A1 (en) * | 2012-10-23 | 2018-09-12 | Toolgen Incorporated | Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof |
CN103898099B (zh) * | 2012-12-25 | 2017-08-25 | 袁晶 | 一种实现基因组定点修饰的蛋白表达载体的方法 |
CN103898155B (zh) * | 2012-12-25 | 2016-06-15 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 利用基因枪获得转基因小麦的方法及其专用培养基 |
DK2938184T3 (en) * | 2012-12-27 | 2018-12-17 | Keygene Nv | Method of removing a genetic linkage in a plant |
CN105121650A (zh) * | 2013-04-02 | 2015-12-02 | 拜尔作物科学公司 | 真核生物中的靶向基因组工程 |
US20150067922A1 (en) * | 2013-05-30 | 2015-03-05 | The Penn State Research Foundation | Gene targeting and genetic modification of plants via rna-guided genome editing |
WO2014199358A1 (en) * | 2013-06-14 | 2014-12-18 | Cellectis | Methods for non-transgenic genome editing in plants |
CN103343120B (zh) * | 2013-07-04 | 2015-03-04 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种小麦基因组定点改造方法 |
CN103382468B (zh) * | 2013-07-04 | 2015-04-29 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种水稻基因组定点改造方法 |
WO2015007194A1 (zh) * | 2013-07-16 | 2015-01-22 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 植物基因组定点修饰方法 |
CN103667338B (zh) * | 2013-11-28 | 2016-01-27 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种玉米基因组定点改造方法 |
CN103952405B (zh) * | 2014-05-13 | 2016-02-10 | 扬州大学 | 一种山羊mstn基因定点修饰***及其应用 |
CN104212778A (zh) * | 2014-06-26 | 2014-12-17 | 绍兴市人民医院 | 基于TALEN和pMD18载体的定点突变***及应用 |
-
2016
- 2016-03-14 UA UAA201709693A patent/UA125246C2/uk unknown
- 2016-03-14 BR BR112017016431A patent/BR112017016431A2/pt active Search and Examination
- 2016-03-14 AR ARP160100672A patent/AR103926A1/es unknown
- 2016-03-14 AU AU2016239037A patent/AU2016239037B2/en active Active
- 2016-03-14 CA CA2979290A patent/CA2979290A1/en active Pending
- 2016-03-14 US US15/558,794 patent/US20180163232A1/en active Pending
- 2016-03-14 KR KR1020177029577A patent/KR102194612B1/ko active IP Right Grant
- 2016-03-14 EP EP16771237.1A patent/EP3279321A4/en active Pending
- 2016-03-14 EA EA201792036A patent/EA038896B1/ru unknown
- 2016-03-14 WO PCT/CN2016/076244 patent/WO2016155482A1/zh active Application Filing
- 2016-03-14 CN CN201610141846.6A patent/CN105985943B/zh active Active
- 2016-03-14 JP JP2017548901A patent/JP2018508221A/ja active Pending
-
2022
- 2022-11-22 JP JP2022186467A patent/JP2023018066A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20180163232A1 (en) | 2018-06-14 |
KR102194612B1 (ko) | 2020-12-23 |
EP3279321A1 (en) | 2018-02-07 |
AR103926A1 (es) | 2017-06-14 |
CN105985943A (zh) | 2016-10-05 |
AU2016239037B2 (en) | 2022-04-21 |
CN105985943B (zh) | 2021-07-06 |
EA201792036A1 (ru) | 2018-06-29 |
BR112017016431A2 (pt) | 2018-04-10 |
AU2016239037A1 (en) | 2017-08-10 |
WO2016155482A1 (zh) | 2016-10-06 |
KR20170126502A (ko) | 2017-11-17 |
JP2018508221A (ja) | 2018-03-29 |
JP2023018066A (ja) | 2023-02-07 |
EA038896B1 (ru) | 2021-11-03 |
CA2979290A1 (en) | 2016-10-06 |
EP3279321A4 (en) | 2018-10-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
UA125246C2 (uk) | Спосіб здійснення сайт-спрямованої модифікації рослинних геномів із застосуванням неуспадковуваних матеріалів | |
US20220411810A1 (en) | Method for conducting site-specific modification on entire plant via gene transient expression | |
CN111465321A (zh) | 用于植物细胞的细胞重编程的***和方法 | |
CN101182523B (zh) | 植物花药特异性启动子及其应用 | |
CN113412333A (zh) | 用于克隆植物生产的方法 | |
CA3047163A1 (en) | Genome editing-based crop engineering and production of brachytic plants | |
CN102724865A (zh) | 修饰的编码植物中生长和/或发育相关蛋白的转基因 | |
ES2750530T3 (es) | Medios y procedimientos para producir rendimiento en plantas | |
US20230081632A1 (en) | Immature inflorescence meristem editing | |
KR20140056294A (ko) | 웅성 감수분열 모세포의 세포내 프로세스에 체계적으로 영향을 가하는 방법 | |
AU2007237251B2 (en) | Method to produce sterile male flowers and partenocarpic fruits by genetic silencing, associated sequences and vectors containing said sequences | |
MXPA01012750A (es) | Transformacion de algodon de alta eficiencia mediada por agrobacterium utilizando explantes de peciolo. | |
KR20200070357A (ko) | 식물에서의 도복 저항성 | |
US20160138032A1 (en) | Poaceae plant whose flowering time is controllable | |
Tehseen et al. | Development of male sterility by silencing Bcp1 gene of Arabidopsis through RNA interference | |
KR102453800B1 (ko) | CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 SlMS10 유전자 녹아웃 토마토 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 웅성 불임 토마토 식물체 | |
US20160281102A1 (en) | DNA Having Anther-Specific Promoter Activity, and Utilization Thereof | |
CN109456981B (zh) | 一种FvAGI基因、表达载体和应用 | |
Elorriaga | Functional Characterization and Classification of Genes Essential to Flower Induction, Flower Development, and Seed Development in Populus and Eucalyptus | |
WO2024065009A1 (en) | Methods of plant manipulation | |
JP2007060979A (ja) | システインプロテアーゼ遺伝子を導入した葯の裂開を抑制する植物 | |
Yang | Somatic Hybridization, Targeted Genome Engineering and Their Application in Crop Improvement |