CN113122570A - 一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体在棉花中的使用方法 - Google Patents

一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体在棉花中的使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，且公开了一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体在棉花中的使用方法，包括以下步骤：获得含有目的序列35S启动子的载体pK2GW7.0，以pK2GW7.0载体为模板，利用Primer5软件设计引物。该新型CRISPR/Cas9基因编辑载体在棉花中的使用方法，对含有棉花内源启动子pGhU6‑7的pRGEB32‑GhU6.7‑NPTⅡ载体进行改造，以35S启动子取代原有***中驱动Cas9蛋白表达的Ubiquitin启动子，分别选取棉花内源Gh_A06G0606和GhCLA为目标基因验证改造后的新***在棉花中的应用，利用农杆菌介导的遗传转化将CRISPR/Cas9基因编辑***导入棉花基因组，然后对新载体的愈伤组织进行Sanger测序和Hi‑TOM测序，检测新***在异源四倍体棉花基因组中的突变位点及编辑效率，具有良好的探究性、创新性和研究价值。

Description

一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体在棉花中的使用方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体在棉花中的使用方法。
背景技术
CRISPR/Cas9技术是一种RNA引导的基因组编辑技术，能对基因进行精确性敲除、敲入和替换等，从而实现探究基因功能和修复致病基因等目的，该技术凭借操作简便、价格低廉、可对基因位点进行编辑和可拓展性强等优势，在近几年迅速发展完善，已成为继锌指核酸酶(ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)之后的第三大基因组编辑技术。用于基因编辑的CRISPR/Cas9***的主要组成部分包括DNA切割酶Cas9以及由反式激活的crRNA(tracrRNA)和CRISPR RNA(crRNA)合成的向导RNA(sgRNA)，Cas9扫描目标基因组，首先寻找3-8-nt长的间隔邻近基序(PAM)序列，然后使用gRNA向导序列(20-nt)进行目标识别，并在PAM上游的目标序列三个核苷酸处生成位点特异性双链断裂(DSB)，这些双链断裂导致宿主细胞中DNA修复***的激活，通常通过非同源末端连接途径(NHEJ)，由于修复路径容易出错，因此在修复过程中将引入小的缺失或***，从而产生突变。CRISPR/Cas9技术已被广泛用于水稻、玉米、小麦等禾本植物和许多其他重要草类植物的位点特异性诱变。
尽管CRISPR/Cas9基因编辑技术应用非常广泛且基因编辑效率相对较高，但在陆地棉的应用中仍存在嵌合体的现象而影响基因编辑效率，根据其工作原理可知，影响CRISPR/Cas9***编辑效率的关键因素有Cas9蛋白、sgRNA和PAM序列，这里我们想通过使用调控Cas9蛋白高效表达的启动子来提高Cas9蛋白的含量以提高该***在陆地棉应用中的基因编辑效率。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体在棉花中的使用方法，提高了在棉花中的基因编辑效率。
(二)技术方案
为实现上述提高棉花基因编辑效率的目的，本发明提供如下技术方案：
一种新型CRISPR/Cas9编辑载体在棉花中的使用方法，包括以下步骤：
1)先获得含有目的序列35S启动子的载体pK2GW7.0；
2)以pK2GW7.0载体为模板，利用Primer5软件设计引物，通过PCR扩增获得35S启动子的目的序列；
3)利用SbfⅠ、BstBⅠ两种酶对pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体进行双酶切去除Ubiquitin启动子得到线性载体，与步骤2)中获得的35S启动子目的序列进行In-fusion连接，通过测序验证，得到适用于棉花的新型基因编辑载体。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体在棉花中的使用方法，具备以下有益效果：
本发明构建了新型的CRISPR/Cas9基因编辑载体并首次在棉花中成功应用，该新***比原载体小且相比原载体具有更高的基因编辑效率，这是一种为提高CRISPR/Cas9***基因编辑效率的新尝试，具有重要的研究意义。
附图说明
图1为本发明对载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ改造的过程图；
图2为本发明的新型CRISPR/Cas9基因编辑载体p7N-35S的载体图；
图3为本发明的扩增后35S(345bp)启动子片段的电泳图及载体p7N-35S构建成功的序列比对图。左图泳道1是35S启动子片段，M是5K的marker；
图4为本发明的重叠PCR电泳图。左图为第一次PCR扩增，两个片段的电泳图，泳道M是5K的marker，泳道1-1、1-2和1-3是第一个片段，泳道2-1、2-2和2-3是第二个片段；右图是将第一次PCR的两个片段拼接后的第二次PCR电泳图，如泳道1～3，泳道M是5K的marker；
图5为本发明sgRNA连接到p7N-35S的电泳图。泳道1～8是目的片段连接到p7N-35S载体后的阳性检测条带，泳道M是5K的marker；
图6为本发明Gh_A06G0606基因在棉花中的遗传转化及组织培养图。图6中的罗马编号分别代表：Ⅰ.共培养阶段；Ⅱ.选择培养阶段；Ⅲ.愈伤阶段；Ⅳ.分化培养阶段；Ⅴ.生根培养阶段；Ⅵ.水培炼苗阶段；Ⅶ-Ⅷ.转基因植株在温室生长阶段；
图7为本发明的p7N-35S载体对Gh_A06G0606基因sgRNA1和sgRNA2的基因编辑检测图，其中a图是p7N-35S对Gh_A06G0606基因sgRNA1的编辑序列图，b图是p7N-35S对Gh_A06G0606基因sgRNA2的编辑序列图，D表示碱基缺失，I表示碱基***，D和I前面的数字分别表示碱基缺失和***的个数；
图8为本发明的p7N-35S载体对棉花中Gh_A06G0606和GhCLA基因每个靶点的基因编辑效率分析比较的箱式图。其中，a图是p7N-35S载体对Gh_A06G0606基因每个靶点的编辑效率情况箱式图，b图是p7N-35S载体对GhCLA基因每个靶点的编辑效率情况箱式图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：35S启动子目的序列的获得
以pK2GW7.0载体为模板进行PCR扩增得到目的序列35S启动子。PCR扩增的引物分别为：
35S-F:5'CGCGTGCATGCCTGCA TGAGACTTTTCAACAAAGGGTAA 3'
35S-R:5'GGTTCTATCTCCTTCG GTCCTCTCCAAATGAAATGAACT 3'
PCR反应体系见表1：
表1扩增35S启动子序列的PCR反应体系
Figure BDA0003087318630000041
实施例二：转化载体p7N-35S的构建
将pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ进行双酶切，先加2μL的SbfI酶37℃酶切30min，再加2μL的BstBI，65℃酶切30min，以未切载体为对照凝胶电泳观察酶切条带是否正确，然后用酶切产物纯化试剂盒对剩余酶切产物进行纯化，酶切体系见表2。
表2 pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体酶切体系
Figure BDA0003087318630000042
Figure BDA0003087318630000051
将酶切纯化的pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体与35S启动子片段In-fusion连接，转化大肠杆菌感受态Top10，挑取阳性克隆进行测序，将序列正确的载体命名为p7N-35S，In-fusion反应体系见表3。
表3 In-fusion连接反应体系
Figure BDA0003087318630000052
实施例三：p7N-35S-sgRNA载体的构建
1.Gh_A06G0606和GhCLA基因的sgRNA设计
利用CRISPR-P2.0根据基因Gh_A06G0606及其同源基因Gh_D06G0687，在AD亚组共同区域上找两个靶点：sgRNA1和sgRNA2，并根据白化基因Gh_A10G2292及其同源基因Gh_D10G1640，在AD亚组共同区域上找两个靶点：sgRNA3和sgRNA4，sgRNA的序列见表4。
表4 sgRNA的序列
Figure BDA0003087318630000053
2.sgRNA与p7N-35S载体的连接
(1)用BsaI酶对p7N-35S载体进行单酶切，37℃，5.5h，得到酶切纯化产物(线性p7N-35S载体)，以连接sgRNA。
(2)靶标***p7N-35S载体的序列分别为tRNA+sgRNA1+gRNA+tRNA+sgR NA2+gRNA和tRNA+sgRNA3+gRNA+tRNA+sgRNA4+gRNA，利用重叠PCR获得。用一步克隆试剂盒(Vazyme，C112-01/02)将这两个片段分别连接到p7N-35S线性载体的BsaI酶切位点处。
表5第一次PCR条件
Figure BDA0003087318630000061
表6-1第二次PCR体系
Figure BDA0003087318630000062
Figure BDA0003087318630000071
表6-2第二次PCR条件
Figure BDA0003087318630000072
实施例四：农杆菌介导的遗传转化
具体步骤如下：
A.将剥好的棉花种子用0.1％升汞杀菌，无菌水清洗数次后放入无菌苗培养基中，28℃暗培养1d，挑去种皮，将苗扶正，28℃恒温培养箱暗培养4～5d；
B.将下胚轴切成小茎段，用活化的农杆菌侵染，弃菌液，吹干表面残液；
C.将下胚轴平铺在放有滤纸的共培养培养基中，于20℃恒温培养箱，暗培养36～48h；
D.将下胚轴转入到附加2，4-D的愈伤组织诱导培养基中，放入光照培养室，20～30d后用新鲜愈伤组织诱导培养基继代培养一次；
E.当愈伤组织长成米粒状颗粒，转入分化培养基，进一步分化成胚状体；
F.将分化出的小苗继代到生根培养基中，直至长成根部良好健康的小苗；
G.将小苗转到自来水中，进行炼苗，一周左右后，转移到温室。
转化所用的培养基组分及配比：
无菌苗萌发培养基：1/2MS大量元素，15g/L葡萄糖，2.6g/L的Phytag el；pH:6.1～6.2。
农杆菌活化培养基：胰化蛋白胨5g/L+NaCl 5g/L+MgSO4.7H2O 0.1g/L+KH2PO40.25g/L+甘露醇5g/L+甘氨酸1.0g/L。
愈伤组织诱导培养基：MSB+24-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+3％Glucose+0.3％Phytagel；pH:5.85～5.95。
共培养培养基：MSB+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+50mg/L AS+3％Gl ucose+0.25％Phytagel，pH:5.85～5.95。
选择培养基：MSB+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+3％Glucose+0.3％Ph ytagel，卡那霉素50mg/L和头孢霉素400mg/L；pH:5.85～5.95。
分化培养基：分化培养基：MSB培养基中去掉NH4NO3，将KNO3用量加倍+Glu 1.0g/L+Asp 0.5g/L+IBA 0.5mg/L+KT 0.15mg/L+3％Glucose+0.26％Phytagel，pH:6.1～6.2。
生根培养基：1/2MS无机盐+B5有机物，15g/L葡萄糖，2.5g/L的Phyt agel；pH:6.1～6.2。
MSB的成分：MS培养基+B5维生素。
实施例五：新型基因编辑载体p7N-35S对棉花基因组的编辑效率检测
1.利用CTAB法提取p7N-35S:Gh_A06G0606及p7N-35S:GhCLA两个载体的愈伤组织DNA
具体步骤如下：
A.取新鲜幼嫩叶片0.1g于2mL离心管置于冰或液氮中，逐个加入钢珠和200μL抽提缓冲液，磨样机磨样60s，频率为60Hz；
B.加入预热的DNA抽提裂解液800μL后摇匀；
C.65℃水浴40min，每隔10min轻轻上下颠倒几次，此时及后续步骤避免剧烈震荡；
D.加800μL氯仿，轻柔摇匀抽提20min，室温11000rpm离心10min；
E.吸取上清至1.5mL新离心管，加入等体积异丙醇后混匀，此时产生白色絮状沉淀即为DNA粗提物；
F.倒掉上清，絮状沉淀用75％酒精洗两次后吹干，用适量ddH2O溶解。
相关试剂：
抽提缓冲液(PH＝7.5)：0.35M葡萄糖69.36g/L+0.1M Tris-HCl 12.44g/L+0.005MNa2EDTA 1.86g/L+2％(W/V)PVP K-30 20g/L+0.1％DIECA 1～2g/L，使用前加β-巯基乙醇至0.2％，PH调至7.5。
抽提裂解液(PH＝8.0)：0.1M Tris-HCl 12.44g/L+1.4M NaCl 81.816g/L+0.02MNa2EDTA 7.45g/L+2％CTAB 20g/L+0.1％DIECA 1g/L+2％PVP K-3020g/L，加0.2％β-巯基乙醇后调PH值至8.0。
2.对提取的愈伤组织DNA进行载体的阳性检测
设计载体的阳性检测引物：
正向引物：5’TGACCAGAAGCGACAAGAACC 3’
反向引物：5’CCACCACCAGCACAGAATAGG 3’
通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳进行检测。
3.对阳性愈伤组织DNA进行Hi-TOM测序检测基因编辑效率
分别设计Gh_A06G0606和GhCLA这两个基因的靶点检测引物(如表7所示)，以阳性愈伤组织DNA为模板，体系为40μL，取少量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测条带无误后，将剩余PCR产物进行Hi-TOM测序。
表7 Hi-TOM测序基因靶点检测引物
Figure BDA0003087318630000091
Figure BDA0003087318630000101
本发明构建了新型的CRISPR/Cas9基因编辑载体并首次在棉花中成功应用，该新***具有比原载体小的特点且比原载体具有更高的基因编辑效率，这是一种为提高CRISPR/Cas9***基因编辑效率的新尝试，具有重要的研究意义。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (1)

1.一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体在棉花中的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)先获得含有目的序列35S启动子的载体pK2GW7.0；
2)以pK2GW7.0载体为模板，利用Primer5软件设计引物，通过PCR扩增获得35S启动子的目的序列；
3)利用SbfⅠ、BstBⅠ两种酶对pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体进行双酶切去除Ubiquitin启动子得到线性载体，然后与步骤2)中获得的35S启动子目的序列进行In-fusion连接，通过测序验证，得到适用于棉花的新型基因编辑载体。
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