CN114891793A - 一种梨CRISPRa基因转录激活***及其应用 - Google Patents
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- C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis
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Abstract
本发明公开了一种梨CRISPRa基因转录激活***及其应用，属于植物基因工程技术领域。包括靶基因的选择；sgRNA的设计；CRISPRa基因转录激活载体的构建；梨愈伤组织的遗传转化；愈伤组织中梨CRISPRa基因转录激活倍数的统计与分析；靶基因转录激活的愈伤组织表型鉴定与分析。本发明构建了一种高效的梨CRISPRa基因转录激活***，并实现了梨花青苷代谢通路靶基因PybZIPa的单基因激活以及PyMYB114和PybHLH3双基因激活，PyDFR、PyANS和PyUFGT的多基因同时激活，得到了与预期相符的基因功能获得型的表型和花青苷合成结构基因的表达模式，对梨花青苷代谢通路相关靶基因进行了功能鉴定，为梨中基因功能研究和分子遗传育种提供了更高效简便的途径。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种梨CRISPRa基因转录激活***及其应用。
背景技术
CRISPR/Cas9基因编辑***(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats/CRISPR associated protein 9)可简便地在靶向位点引起DNA双键断裂(double strains break,DSB)，然后生物体通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)在对DSB进行修复时可能在修复位点产生碱基的***、缺失或替换，即基因敲除(Jineket al.,2012；Hsu et al.,2014)。CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术已经成功应用于很多植物的基因功能缺失研究和性状改良(Chen et al.,2019；Zhu et al.,2020)。但是在很多的基因功能研究和分子遗传育种过程中，不仅需要对某些基因进行敲除以进行功能缺失型表型研究，对某些基因的表达量进行促进的功能获得型研究也同样十分重要。传统的基因过表达方法是通过一个组成型强启动子来表达目的基因。这种方法在过表达单个基因的时候会有比较好的效果，但在同时过表达多个目的基因时需要先将一个基因进行稳定转化，得到稳定的转基因植株后再进行下一个基因的过表达遗传转化，非常的费力、费时且具有挑战性。而基于失活的Cas蛋白(dCas)与转录激活因子融合的CRISPRa***，已经在多种模式植物中显示出了高效的多基因激活活性(Lowder et al.,2015；Li et al.,2017；Lowderet al.,2018；McCarty et al.,2020；Pan et al.,2021)。CRISPRa***可以通过简单的在同一个CRISPR/dCas9载体连接多个sgRNAs来同时靶向多个目的基因的启动子区域，从而只需要一次的稳定转化过程就可以同时对多个目的基因的表达进行激活或促进。
梨是蔷薇科(Rosaceae)梨属(Pyrus L.)的多年生果树，是我国第三大果树树种，栽培历史很悠久，种植面积非常广泛，具有重要的食用价值和经济价值(滕元文2017)。我国作为梨果实出口大国，近年来梨树的栽培面积与产量居世界第一。CRISPRa基因转录激活技术可以对梨中的基因功能研究及性状改良和分子遗传育种起到极大的推进作用，使梨的经济价值和食用价值得到进一步的提高和改良。但是目前梨中还没有CRISPRa基因转录激活技术成功运用的报道。
因此，在梨中建立一种可应用于基因功能研究及性状改良和分子遗传育种的高效的多基因转录激活的CRISPRa***，就成为该技术领域亟待解决和突破的技术难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种梨CRISPRa基因转录激活***及其应用。
本发明的另一目的是提供一构建梨CRISPRa基因转录激活载体的方法。
本发明的又一目的是提供一种梨单基因或多基因的转录激活方法。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种梨CRISPRa基因转录激活***，所述的梨CRISPRa基因转录激活***包含以下载体：
(1)sgRNA-表达骨架载体：包含MS2环的由拟南芥AtU3启动子来驱动sgRNA表达的骨架载体1；
(2)分别将多个sgRNA-表达载体聚合到一起同时表达的骨架载体2；
(3)CRISPRa***骨架载体，所述的CRISPRa***骨架载体融合了dzCas9蛋白编码基因和转录激活因子，所述的CRISPRa***骨架载体的序列如SEQ ID NO.1所示；
(4)用于将所述的多个sgRNA和所述的CRISPRa***骨架载体融合的最终表达骨架载体，所述的最终表达骨架载体包含Pol II启动子拟南芥AtUBQ10启动子来驱动dCas9蛋白的表达。
优选的，所述Pol III启动子AtU3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述Pol II启动子AtUBQ10的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
作为本发明的一种优选，所述的梨CRISPRa基因转录激活***，由以下载体组成：
(1)pYPQ131B2.0、pYPQ132B2.0、pYPQ133B2.0、pYPQ134B2.0、pYPQ135B2.0或pYPQ136B2.0中的任意一种或多种；
(2)pYPQ142、pYPQ144或pYPQ146中的任意一种；
(3)pYPQ-dzCas9-Act3.0骨架载体；
(4)pYPQ202。
本发明所述所有骨架载体的质粒结构如Addgene网站所示，编号为pYPQ131B2.0(no.99885),pYPQ132B2.0(no.99888),pYPQ133B2.0(no.99892),pYPQ134B2.0(no.167158),pYPQ135B2.0(no.167159),pYPQ136B2.0(no.167160),pYPQ142(no.69294),pYPQ144(no.69296),pYPQ146(no.69298),pYPQ-dzCas9-Act3.0(no.158414),pYPQ202(no.86198)。
一种构建梨CRISPRa基因转录激活载体的方法，包含以下步骤：
(1)针对靶基因设计并制备sgRNA，每个靶基因至少设计两个sgRNA；
(2)将制备的sgRNA与骨架载体1连接得到sgRNA-表达载体；
(3)利用骨架载体2将上一步制备的多个sgRNA-表达载体聚合为一个包含多个sgRNA的表达载体；
(4)将上一步制备的包含多个sgRNA的骨架载体、CRISPRa***骨架载体与最终表达骨架载体聚合得到所述的梨CRISPRa基因转录激活载体；
其中，所述的骨架载体1、骨架载体2、CRISPRa***骨架载体与最终表达骨架载体如上所述。
作为本发明的一种优选，所述的骨架载体1选自pYPQ131B2.0、pYPQ132B2.0、pYPQ133B2.0、pYPQ134B2.0、pYPQ135B2.0或pYPQ136B2.0中的任意一种或多种；所述的骨架载体2选自pYPQ142、pYPQ144或pYPQ146中的任意一种；所述的CRISPRa***骨架载体选自pYPQ-dzCas9-Act3.0骨架载体；所述的最终表达骨架载体选自pYPQ202。
作为本发明的进一步优选，所述的方法包含以下步骤：
(1)针对靶基因设计并制备sgRNA，每个靶基因至少设计两个sgRNA；
(2)将制备的sgRNA与骨架载体1连接：通过T4 DNA连接酶将sgRNA与骨架载体pYPQ131B2.0或pYPQ132B2.0或pYPQ133B2.0或pYPQ134B2.0或pYPQ135B2.0或pYPQ136B2.0连接得到sgRNA-表达载体；
(3)将上一步制备得到的多个sgRNA-表达载体串连：基于Golden Gate连接方法，将两个sgRNA-表达载体聚合到pYPQ142同时表达组成sgRNA1-sgRNA2-pYPQ142表达载体以靶向同一个基因；或者将四个sgRNA-表达载体聚合到pYPQ144同时表达组成sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-sgRNA4-pYPQ144表达载体以同时靶向两个基因；或者将六个sgRNA-表达载体聚合到pYPQ146同时表达组成sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-sgRNA4-sgRNA5-sgRNA6-pYPQ146表达载体以同时靶向三个基因。
(4)sgRNA1-sgRNA2-pYPQ142或sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-sgRNA4-pYPQ144或sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-sgRNA4-sgRNA5-sgRNA6-pYPQ146和CRISPRa***骨架载体与最终表达骨架载体pYPQ202的聚合：基于Three-way LR Reaction方法，将三个质粒连接组成最终的梨CRISPRa基因转录激活载体。
按照本发明所述的方法构建的梨CRISPRa基因转录激活载体。
本发明所述的梨CRISPRa基因转录激活***在梨单基因或多基因的转录激活和基因功能研究中的应用。
梨CRISPRa基因转录激活***在梨基因功能研究中的应用，具体包括如下步骤：
(1)靶基因的选择和CRISPRa基因转录激活载体的构建。
首先选择表型易于观察的花青苷代谢通路中的相关基因PybZIPa、PyMYB114、PybHLH3、PyDFR、PyANS和PyUFGT作为梨CRISPRa基因转录激活***的靶基因，然后通过以下步骤进行CRISPRa基因转录激活载体的构建：
1)sgRNA的设计：使用在线设计分析平台CRISPRdirect(https://crispr.dbcls.jp)和CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/CRISPR2/)对靶基因启动子序列进行sgRNA的设计。CRISPRa基因转录激活***中dCas9蛋白识别的PAM序列为NGG，sgRNA一般设计在转录起始位点(TSS)上游启动子区100-500bp范围之内。
2)sgRNA的磷酸化和退火。
3)sgRNA连接表达所需的骨架载体：通过T4 DNA连接酶将sgRNA与骨架载体pYPQ131B2.0或pYPQ132B2.0或pYPQ133B2.0或pYPQ134B2.0或pYPQ135B2.0或pYPQ136B2.0连接。
4)多个sgRNA-表达载体的串连：基于Golden Gate连接方法，将两个sgRNA-表达载体聚合到pYPQ142同时表达组成sgRNA1-sgRNA2-pYPQ142表达载体以靶向同一个基因；或者将四个sgRNA-表达载体聚合到pYPQ144同时表达组成sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-sgRNA4-pYPQ144表达载体以同时靶向两个基因；或者将六个sgRNA-表达载体聚合到pYPQ146同时表达组成sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-sgRNA4-sgRNA5-sgRNA6-pYPQ146表达载体以同时靶向三个基因。
5)sgRNA1-sgRNA2-pYPQ142或sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-sgRNA4-pYPQ144或sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-sgRNA4-sgRNA5-sgRNA6-pYPQ146和CRISPRa***骨架载体(pYPQ-dzCas9-Act3.0)与最终表达骨架载体pYPQ202的聚合：基于Three-way LR Reaction方法，将三个质粒连接组成最终的CRISPRa基因转录激活载体。
(2)梨愈伤组织的稳定遗传转化。
首先将上述构建好的CRISPRa基因转录激活载体分别转化到根癌农杆菌感受态细胞中，然后进行‘茄梨’脱分化愈伤组织的稳定遗传转化。
(3)稳定的梨愈伤组织的获得。
提取DNA，对再生出来的梨愈伤组织进行PCR阳性鉴定，得到稳定的梨愈伤组织。PCR阳性鉴定所用的引物序列为：
M13-F1：5’-TTCCCAGTCACGACGTTGTAAAAC-3’
dCas9-R1：5’-TTATCAGCAGCTGGAACTCCG-3’
鉴定结果如图3所示，6个CRISPRa基因转录激活载体都得到了阳性的梨愈伤组织。
(4)CRISPRa基因转录激活***对梨花青苷代谢通路相关靶基因的激活情况分析与统计。
提取RNA，通过反转录试剂盒反转录成cDNA，然后进行实时荧光定量PCR反应分析梨花青苷代谢通路相关靶基因PybZIPa、PyMYB114、PybHLH3、PyDFR、PyANS和PyUFGT的表达量，统计与野生型愈伤(WT)相比，CRISPRa基因转录激活梨愈伤组织中各个靶基因的表达量激活倍数。如图4所示，在含有特定sgRNAs的某些阳性的梨愈伤组织系中，6个靶基因中有4个的表达量被激活了10倍以上。PybZIPa在某些阳性的梨愈伤组织系中被激活了40倍以上(图4a)。PyMYB114和PybHLH3在转化CRISPRa基因转录激活载体pLR50的愈伤组织的多个阳性系中同时被激活10倍到20倍(图4b)。在PyDFR、PyANS和PyUFGT同时激活载体转化的梨愈伤组织中，大多数的阳性系中PyUFGT被激活10-40倍(图4c)。
(5)对稳定的CRISPRa基因转录激活倍数高的梨愈伤组织系进行花青苷表型鉴定和含量测定以及相关结构基因的表达量分析。
取CRISPRa基因转录激活倍数高的梨愈伤组织系置于MS处理培养基上于17℃进行光照处理，12天后观察花青苷的积累情况进行表型鉴定。然后进一步进行花青苷的提取和含量测定以及花青苷合成相关结构基因的表达模式分析来验证靶基因的功能。花青苷表型鉴定和含量测定以及相关结构基因的表达量分析如图5所示，野生型和转化空载对照梨愈伤组织(CTRL)没有或者只有极少量的花青苷积累，而对花青苷代谢通路基因PybZIPa、PyMYB114、PybHLH3、PyDFR、PyANS和PyUFGT进行CRISPRa转录激活的梨愈伤组织则有大量的花青苷积累。与CTRL愈伤相比，对花青苷代谢通路基因PybZIPa、PyMYB114、PybHLH3、PyDFR、PyANS和PyUFGT进行CRISPRa转录激活的梨愈伤组织中的花青苷下游结构基因的表达量显著上升。这与靶基因预期基因功能获得型的表型和花青苷合成结构基因的表达模式相符。
优选的，上述步骤(1)中构建的梨CRISPRa基因转录激活***结构示意图如图1所示，由AtU3启动子来驱动sgRNAs的表达，AtUBQ10启动子来驱动dCas9蛋白的表达。靶基因包括PybZIPa、PyMYB114、PybHLH3、PyDFR、PyANS和PyUFGT，每个靶基因分别设计了4个或2个sgRNAs，一共构建了6个CRISPRa基因转录激活载体来激活靶基因的表达(图2)。其中，pLR47和pLR48为单独激活PybZIPa基因的载体，pLR49和pLR50为同时激活PyMYB114和PybHLH3基因的载体，pLR53和pLR54为同时激活PyDFR、PyANS和PyUFGT基因的载体(图2)。
优选的，上述步骤(5)中MS处理培养基配方(1L)：MS粉末4.74g+蔗糖30g+2,4-D1.5mg/L+6-BA 0.5mg/L+琼脂粉7.5g+MeJA 50uM/L，pH 5.8。
一种梨单基因或多基因的转录激活方法，包括针对需要转录激活的靶基因按照本发明所述的方法构建的梨CRISPRa基因转录激活载体，并将所述的梨CRISPRa基因转录激活载体转化梨愈伤组织，提取DNA，对再生出来的梨愈伤组织进行PCR阳性鉴定，然后提取RNA进行靶基因激活倍数分析，得到稳定的靶基因转录激活的梨愈伤组织。
作为本发明的一种优选，PCR阳性鉴定所用的引物序列为：
M13-F1：5’-TTCCCAGTCACGACGTTGTAAAAC-3’
dCas9-R1：5’-TTATCAGCAGCTGGAACTCCG-3’。
有益效果
本发明提供了一种高效的梨CRISPRa基因转录激活载体、基因转录激活***，并且成功应用于梨花青苷代谢通路相关基因功能研究中。本发明利用上述高效的梨CRISPRa基因转录激活***实现了梨花青苷代谢通路靶基因PybZIPa的单基因激活，PyMYB114和PybHLH3双基因激活，PyDFR、PyANS和PyUFGT的多基因同时激活，并且得到了与预期相符的基因功能获得型的表型和花青苷合成结构基因的表达模式，对梨花青苷代谢通路相关靶基因进行了功能鉴定，为梨的基因功能研究提供更高效简便的途径，为梨性状改良和分子遗传育种奠定良好的基础，同时说明本发明梨CRISPRa基因转录激活***在梨的基因转录激活中具有普适性，并不局限于实施例中的几个靶基因。
附图说明
图1为本发明构建的梨CRISPRa基因转录激活***结构示意图。
图2为目的基因靶位点sgRNA设计和载体构建示意图。其中：a，目的基因靶位点sgRNA设计示意图。b，载体构建示意图。
图3为对再生出来的梨愈伤组织进行PCR阳性鉴定图。其中，M:DL 2000bp DNAmarker；Plasmid:质粒阳性对照；WT:野生型愈伤；H2O:阴性对照。
图4为梨花青苷代谢通路相关靶基因的表达量激活倍数。其中：a，PybZIPa。b，PyMYB114和PybHLH3。c，PyDFR、PyANS和PyUFGT。
图5为花青苷表型鉴定和含量测定以及相关结构基因的表达量。其中：a，花青苷表型图。b，花青苷含量。c，花青苷合成相关结构基因的表达量。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做出进一步详细的描述。根据以下的描述和具体实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征和特点，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案的一些形式和细节做出各种改变和修改，以使其适用各种不同的用途和条件，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例中未注明具体技术、方法或条件者，按照本领域内的常规技术方法或者按照产品说明书进行。所用未标明的试剂均为可以购买得到的常规试剂产品。
实施例1梨CRISPRa基因转录激活***在梨基因功能研究中的应用，具体包括如下步骤：
(1)靶基因的选择和CRISPRa基因转录激活载体的构建。
首先选择表型易于观察的花青苷代谢通路中的相关基因PybZIPa、PyMYB114、PybHLH3、PyDFR、PyANS和PyUFGT作为梨CRISPRa基因转录激活***的靶基因，然后通过以下步骤进行CRISPRa基因转录激活载体的构建：
1)sgRNA的设计：使用在线设计分析平台CRISPRdirect(https:// crispr.dbcls.jp)和CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/CRISPR2/)对靶基因启动子序列进行sgRNA的设计。CRISPRa基因转录激活***中dCas9蛋白识别的PAM序列为NGG，sgRNA一般设计在转录起始位点(TSS)上游启动子区100-500bp范围之内。依据一般sgRNA设计原则挑选出GC含量、特异性、二级结构等较好的sgRNA位点，且最好在TSS上游启动子区100-250bp范围之内。多个在线设计工具的结合使用有助于挑选出打分较高的理论上基因转录激活效率较高的sgRNA。
2)sgRNA的磷酸化和退火。
根据后续所需连接的骨架载体的酶切位点序列，设计带特定酶切位点序列的sgRNA正向引物F和反向引物R，合成后的寡核苷酸引物，用ddH20水稀释至终浓度为100μM。磷酸化反应体系为：F 1μL，R 1μL，10×T4 DNA ligase buffer1μL，T4 PNK(polynucleotide kinase)0.5μL，加ddH20补足到10μL。混匀，短暂离心，然后使用PCR仪，37℃，30min进行磷酸化反应。将磷酸化后的所有反应产物进行退火反应：装一锅水烧开沸腾后关火，将装有磷酸化产物的小PCR管快速扔进沸水中，待沸水自然冷却至室温后取出即可。取出后用ddH20稀释100倍以备下一步连接反应所用。
3)sgRNA连接表达所需的骨架载体：通过T4 DNA连接酶将sgRNA与骨架载体pYPQ131B2.0或pYPQ132B2.0或pYPQ133B2.0或pYPQ134B2.0或pYPQ135B2.0或pYPQ136B2.0连接。若涉及两个sgRNA，则将第一个sgRNA连接pYPQ131B2.0，第二个sgRNA连接pYPQ132B2.0；若涉及四个sgRNA，则将第一个sgRNA连接pYPQ131B2.0，第二个sgRNA连接pYPQ132B2.0，第三个sgRNA连接pYPQ133B2.0，第四个sgRNA连接pYPQ134B2.0；若涉及六个sgRNA，则将第一个sgRNA连接pYPQ131B2.0，第二个sgRNA连接pYPQ132B2.0，第三个sgRNA连接pYPQ133B2.0，第四个sgRNA连接pYPQ134B2.0，第五个sgRNA连接pYPQ135B2.0，第六个sgRNA连接pYPQ136B2.0。
将sgRNA***骨架载体pYPQ131B2.0或pYPQ132B2.0或pYPQ133B2.0或pYPQ134B2.0或pYPQ135B2.0或pYPQ136B2.0中：首先将骨架载体进行BsmBI酶切，酶切反应体系为：载体质粒2ug，10×Tango buffer 5ul，10mM DTT 5ul，BsmBI 2ul，然后用ddH20补足到50ul。37℃过夜酶切后利用小量胶回收试剂盒(购自诺唯赞生物公司，按照试剂盒操作说明书操作)回收到带有粘性末端的骨架载体，然后将骨架载体和上述步骤2)中磷酸化和退火过的sgRNA进行连接。连接反应体系和步骤为：载体DNA 50ng，sgRNA 2ul，10×T4 DNA ligasebuffer2μL，T4 DNA ligase 1ul，加ddH20补足到20μL，混匀，短暂离心，25℃连接2h。连接产物取10ul转化DH5α大肠杆菌感受态，在含有10mg/L四环素的LB固体平板上生长14小时筛选出阳性克隆，进一步通过菌落PCR鉴定后，包含重组质粒的菌液样品送生物公司测序，验证是否连接成功以及序列是否正确。
4)多个sgRNA-表达载体的串连：基于Golden Gate连接方法，将两个sgRNA-表达载体聚合到pYPQ142同时表达组成sgRNA1-sgRNA2-pYPQ142表达载体以靶向同一个基因；或者将四个sgRNA-表达载体聚合到pYPQ144同时表达组成sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-sgRNA4-pYPQ144表达载体以同时靶向两个基因；或者将六个sgRNA-表达载体聚合到pYPQ146同时表达组成sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-sgRNA4-sgRNA5-sgRNA6-pYPQ146表达载体以同时靶向三个基因。
利用BsaI酶进行多个sgRNA表达载体的串连，反应体系为：10×T4 DNA ligasebuffer 1.5μL，T4 DNA ligase 1ul，BsaI 1ul，sgRNA表达载体1 100ng，sgRNA表达载体2100ng，骨架载体pYPQ142 100ng，加ddH20补足到15μL。或者10×T4 DNA ligase buffer1.5μL，T4 DNA ligase 1ul，BsaI 1ul，sgRNA表达载体1 100ng，sgRNA表达载体2 100ng，sgRNA表达载体3 100ng，sgRNA表达载体4 100ng，骨架载体pYPQ144 100ng，加ddH20补足到15μL。或者10×T4 DNA ligase buffer 1.5μL，T4 DNA ligase 1ul，BsaI 1ul，sgRNA表达载体1 100ng，sgRNA表达载体2 100ng，sgRNA表达载体3 100ng，sgRNA表达载体4 100ng，sgRNA表达载体5 100ng，sgRNA表达载体6 100ng，骨架载体pYPQ146 100ng，加ddH20补足到15μL。然后混匀，短暂离心，进行PCR反应：37℃，5min，16℃，10min，10个循环，50℃，5min，80℃，5min，20℃保温。连接产物取10ul转化DH5α大肠杆菌感受态，在含有50mg/L壮观霉素以及适量X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG的LB固体平板上生长14小时通过蓝白斑筛选出阳性克隆，进一步通过菌落PCR鉴定后，提取质粒进行酶切鉴定，然后将酶切正确的质粒送生物公司测序，验证是否连接成功以及序列是否正确。
5)sgRNA1-sgRNA2-pYPQ142或sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-sgRNA4-pYPQ144或sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-sgRNA4-sgRNA5-sgRNA6-pYPQ146和CRISPRa***骨架载体(pYPQ-dzCas9-Act3.0)与最终表达骨架载体pYPQ202的聚合：基于Three-way LR Reaction方法，将三个质粒连接组成最终的CRISPRa基因转录激活载体。
利用LR克隆酶(Invitrogen,USA)将连有两个sgRNA的质粒sgRNA1-sgRNA2-pYPQ142或者连有四个sgRNA的质粒sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-sgRNA4-pYPQ144或者连有六个sgRNA的质粒sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-sgRNA4-sgRNA5-sgRNA6-pYPQ146、含有CRISPRa***骨架载体(pYPQ-dzCas9-Act3.0)以及最终表达骨架载体pYPQ202聚合成最终CRISPRa基因转录激活载体。连接反应体系为：pYPQ-dzCas9-Act3.0质粒150ng，sgRNA1-sgRNA2-pYPQ142或sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-sgRNA4-pYPQ144或sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-sgRNA4-sgRNA5-sgRNA6-pYPQ146质粒150ng，pYPQ202质粒200ng，LR clonase II mix 1ul。25℃连接4h以上或者过夜连接。所有连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态，在含有50mg/L卡纳霉素的LB固体平板上生长14小时筛选出阳性克隆，进一步通过菌落PCR鉴定后，提取质粒用EcoRI进行酶切鉴定是否连接成功。
上述步骤(1)中构建的梨CRISPRa基因转录激活***结构示意图如图1所示，由AtU3启动子来驱动sgRNAs的表达，AtUBQ10启动子来驱动dCas9蛋白的表达。PybZIPa、PyMYB114、PybHLH3、PyDFR、PyANS和PyUFGT是调控花青苷生物合成的关键转录因子和结构基因(Yao et al.,2017；Liu et al.,2019)，所以花青苷代谢通路中选择PybZIPa、PyMYB114、PybHLH3、PyDFR、PyANS和PyUFGT作为转录激活靶基因，针对每个靶基因的启动子区域分别设计了4个或2个sgRNAs，一共构建了6个CRISPRa基因转录激活载体来激活靶基因的表达(图2)。其中，pLR47和pLR48为单独激活PybZIPa基因的载体，分别包含不同的sgRNAs；pLR49和pLR50为同时激活PyMYB114和PybHLH3基因的载体，分别包含不同的sgRNAs；pLR53和pLR54为同时激活PyDFR、PyANS和PyUFGT基因的载体，分别包含不同的sgRNAs(图2)。靶基因PybZIPa、PyMYB114、PybHLH3、PyDFR、PyANS和PyUFGT启动子序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。所有sgRNAs的序列信息如表1所示。
(2)梨愈伤组织的稳定遗传转化。
首先将上述构建好的CRISPRa基因转录激活载体分别转化到根癌农杆菌感受态细胞中，然后进行‘茄梨’脱分化愈伤组织的稳定遗传转化。具体步骤如下：将酶切鉴定正确的CRISPRa基因转录激活载体质粒取5ul通过冻融法转化农杆菌感受态细胞GV3101(Weidi,China)，方法参照说明书。在含有卡纳霉素(Kan,50mg/L)和利福平(Rif,50mg/L)的LB固体培养基上28℃培养45小时，挑取单菌落进行PCR阳性鉴定。鉴定正确的菌落先于LB(50mg/LKan+50mg/L Rif)液体培养基中小摇(2.0ml离心管)再大摇(100ml锥形瓶)至菌液呈现橙黄色。随后于超净工作台中收集菌体：将菌液倒入50ml灭菌离心管中5000rpm离心10min。弃上清后，用MS液体培养基(含有100mM/L AS)重悬沉淀，调重悬液OD600至0.6。28℃低速(120rpm)诱导1h后加入梨愈伤组织再继续诱导15min。然后迅速将梨愈伤组织用纱布过滤出来，并在灭菌干燥的滤纸上吸干多余的液体，置于MS共生培养基上25℃避光暗培养2天。两天后将愈伤组织捏碎均匀的铺在MS筛选培养基上，一个月后若能再生出新的愈伤组织，即为可能的阳性愈伤组织，但仍需进行下一步的鉴定。
MS液体培养基配方(1L)：MS粉末4.74g+蔗糖30g+2,4-D 1.5mg/L+6-BA 0.5mg/L+AS 100mM/L，pH 5.8。
MS共生培养基配方(1L)：MS粉末4.74g+蔗糖30g+2,4-D 1.5mg/L+6-BA 0.5mg/L+琼脂粉7.5g+AS 100mM/L，pH 5.8。
MS筛选培养基配方(1L)：MS粉末4.74g+蔗糖30g+2,4-D 1.5mg/L+6-BA 0.5mg/L+琼脂粉7.5g+潮霉素15mg/L+头孢150mg/L，pH 5.8。
(3)稳定的梨愈伤组织的获得。
提取DNA，对再生出来的梨愈伤组织进行PCR阳性鉴定，得到稳定的梨愈伤组织。DNA的提取采用CTAB法，取少量再生出来的梨愈伤组织进行液氮研磨后，依照一般CTAB方法进行DNA的提取。PCR阳性鉴定所用的引物序列为：
M13-F1：5’-TTCCCAGTCACGACGTTGTAAAAC-3’
dCas9-R1：5’-TTATCAGCAGCTGGAACTCCG-3’
PCR阳性鉴定使用的酶购自诺唯赞生物公司(诺唯赞，中国)，反应体系为：2×Rapid Taq Master Mix 5ul，100ng DNA，10uM正向引物M13-F1 0.4ul，10uM反向引物dCas9-R1 0.4ul，加ddH20补足到10μL。PCR反应程序为：95℃，预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸15秒，30个热循环，72℃延伸5分钟，20℃保温。鉴定结果如图3所示，在1000bp处可以扩增出目的条带代表阳性，6个CRISPRa基因转录激活载体都得到了阳性的梨愈伤组织。
(4)CRISPRa基因转录激活***对梨花青苷代谢通路相关靶基因的激活情况分析与统计。
提取RNA，通过反转录试剂盒反转录成cDNA，然后进行实时荧光定量PCR反应分析梨花青苷代谢通路相关靶基因PybZIPa、PyMYB114、PybHLH3、PyDFR、PyANS和PyUFGT的表达量。统计与野生型愈伤(WT)相比，CRISPRa基因转录激活梨愈伤组织中各个靶基因的表达量激活倍数。取少量阳性的梨愈伤组织进行液氮研磨后，按照试剂盒操作说明书中的方法进行总RNA的提取(成都福际，中国)。取2μg提取的总RNA，使用one-step gDNA removal andcDNA synthesis kit(Transgen,China)进行反转录，方法参照说明书。荧光定量PCR所用引物依据一般荧光定量引物设计原则进行设计，以PyGAPDH为内参基因(表2)。荧光定量PCR反应体系按试剂盒操作说明书进行配制(Transgen,China)：2×TransStart Green qPCRSuperMix 5μL，10μM上下游引物稀释后混匀一共加2.5μL，2μLcDNA，加ddH20补足到10μL。上下游引物稀释：10μM上游引物16μL，10μM下游引物16μL，ddH20 168μL，混匀。Real-time荧光定量PCR所用仪器为Roche 480定量PCR仪，反应条件为95℃预变性5min，95℃变性3s，60℃退火10s，72℃延伸30s，45个热循环，72℃延伸5min，20℃保温。如图4所示，在含有特定sgRNAs的某些阳性的梨愈伤组织系中，6个靶基因中有4个的表达量被激活了10倍以上。PybZIPa在某些阳性的梨愈伤组织系中被激活了40倍以上(图4a)。PyMYB114和PybHLH3在转化pLR50载体的愈伤组织的多个阳性系中同时被激活10倍到20倍(图4b)。在PyDFR、PyANS和PyUFGT同时激活载体转化的梨愈伤组织中，大多数的阳性系中PyUFGT被激活10-40倍(图4c)。
(5)对稳定的CRISPRa基因转录激活倍数高的梨愈伤组织系进行花青苷表型鉴定和含量测定以及相关结构基因的表达量分析。
取CRISPRa基因转录激活倍数高的梨愈伤组织系置于MS处理培养基上于17℃进行光照处理，12天后观察花青苷的积累情况进行表型鉴定。然后进一步进行花青苷的提取和含量测定以及花青苷合成相关结构基因的表达模式分析来验证靶基因的功能。花青苷的提取方法为：取处理后的梨愈伤组织进行液氮研磨，磨成细粉后迅速称量0.1g于2.0ml液氮预冷离心管中，加入提前预冷的0.1％盐酸甲醇溶液(V：V)1ml，涡旋振荡混匀后于4℃黑暗中浸提24小时，每个样品进行3次生物学重复。浸提结束后4℃，12000rpm高速离心10分钟，然后取上清液，用提前预冷的0.1％盐酸甲醇溶液定容到10ml。花青苷含量测定方法为：每个样品取花青苷提取液200ul加入到透明的酶标板中，使用酶标仪测定波长为530、620和650nm条件下的吸光值A。花青苷的密度D＝(A530-A620)-0.1*(A650-A620)。花青苷含量＝D/(4.62*104)*V/M*106。其中：4.62*104为花青苷分子530nm波长消光系数，V为提取液体积10ml，M为样品质量0.1g。总RNA的提取、cDNA的合成、实时荧光定量PCR反应的体系及程序参照上述步骤(4)中所述。荧光定量PCR所用引物依据一般荧光定量引物设计原则进行设计，以PyGAPDH为内参基因(表2)。花青苷表型鉴定和含量测定以及相关结构基因的表达量分析如图5所示，野生型和转化空载对照梨愈伤组织(CTRL)没有或者只有极少量的花青苷积累，而对花青苷代谢通路基因PybZIPa、PyMYB114、PybHLH3、PyDFR、PyANS和PyUFGT进行CRISPRa转录激活的梨愈伤组织则有大量的花青苷积累。与CTRL愈伤相比，对花青苷代谢通路基因PybZIPa、PyMYB114、PybHLH3、PyDFR、PyANS和PyUFGT进行CRISPRa转录激活的梨愈伤组织中的花青苷下游结构基因的表达量显著上升。这也与靶基因预期基因功能获得型的表型和花青苷合成结构基因的表达模式相符，说明高效的CRISPRa基因转录激活***是梨花青苷代谢通路相关基因进行功能鉴定的一个有力工具。
上述步骤(5)中MS处理培养基配方(1L)：MS粉末4.74g+蔗糖30g+2,4-D1.5mg/L+6-BA 0.5mg/L+琼脂粉7.5g+MeJA 50uM/L，pH 5.8。
表1文中所有靶基因sgRNAs的信息表
表2梨实时荧光定量PCR引物
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序列表
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<120> 一种梨CRISPRa 基因转录激活***及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10752
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggattaca aggaccacga cggggattac aaggaccacg acattgatta caaggatgat 60
gatgacaaga tggctccgaa gaagaagagg aaggttggca tccacggggt gccagctgct 120
gacaagaagt actcgatcgg cctcgccatt gggactaact ctgttggctg ggccgtgatc 180
accgacgagt acaaggtgcc ctcaaagaag ttcaaggtcc tgggcaacac cgatcggcat 240
tccatcaaga agaatctcat tggcgctctc ctgttcgaca gcggcgagac ggctgaggct 300
acgcggctca agcgcaccgc ccgcaggcgg tacacgcgca ggaagaatcg catctgctac 360
ctgcaggaga ttttctccaa cgagatggcg aaggttgacg attctttctt ccacaggctg 420
gaggagtcat tcctcgtgga ggaggataag aagcacgagc ggcatccaat cttcggcaac 480
attgtcgacg aggttgccta ccacgagaag taccctacga tctaccatct gcggaagaag 540
ctcgtggact ccacagataa ggcggacctc cgcctgatct acctcgctct ggcccacatg 600
attaagttca ggggccattt cctgatcgag ggggatctca acccggacaa tagcgatgtt 660
gacaagctgt tcatccagct cgtgcagacg tacaaccagc tcttcgagga gaaccccatt 720
aatgcgtcag gcgtcgacgc gaaggctatc ctgtccgcta ggctctcgaa gtctcggcgc 780
ctcgagaacc tgatcgccca gctgccgggc gagaagaaga acggcctgtt cgggaatctc 840
attgcgctca gcctggggct cacgcccaac ttcaagtcga atttcgatct cgctgaggac 900
gccaagctgc agctctccaa ggacacatac gacgatgacc tggataacct cctggcccag 960
atcggcgatc agtacgcgga cctgttcctc gctgccaaga atctgtcgga cgccatcctc 1020
ctgtctgata ttctcagggt gaacaccgag attacgaagg ctccgctctc agcctccatg 1080
atcaagcgct acgacgagca ccatcaggat ctgaccctcc tgaaggcgct ggtcaggcag 1140
cagctccccg agaagtacaa ggagatcttc ttcgatcagt cgaagaacgg ctacgctggg 1200
tacattgacg gcggggcctc tcaggaggag ttctacaagt tcatcaagcc gattctggag 1260
aagatggacg gcacggagga gctgctggtg aagctcaatc gcgaggacct cctgaggaag 1320
cagcggacat tcgataacgg cagcatccca caccagattc atctcgggga gctgcacgct 1380
atcctgagga ggcaggagga cttctaccct ttcctcaagg ataaccgcga gaagatcgag 1440
aagattctga ctttcaggat cccgtactac gtcggcccac tcgctagggg caactcccgc 1500
ttcgcttgga tgacccgcaa gtcagaggag acgatcacgc cgtggaactt cgaggaggtg 1560
gtcgacaagg gcgctagcgc tcagtcgttc atcgagagga tgacgaattt cgacaagaac 1620
ctgccaaatg agaaggtgct ccctaagcac tcgctcctgt acgagtactt cacagtctac 1680
aacgagctga ctaaggtgaa gtatgtgacc gagggcatga ggaagccggc tttcctgtct 1740
ggggagcaga agaaggccat cgtggacctc ctgttcaaga ccaaccggaa ggtcacggtt 1800
aagcagctca aggaggacta cttcaagaag attgagtgct tcgattcggt cgagatctct 1860
ggcgttgagg accgcttcaa cgcctccctg gggacctacc acgatctcct gaagatcatt 1920
aaggataagg acttcctgga caacgaggag aatgaggata tcctcgagga cattgtgctg 1980
acactcactc tgttcgagga ccgggagatg atcgaggagc gcctgaagac ttacgcccat 2040
ctcttcgatg acaaggtcat gaagcagctc aagaggagga ggtacaccgg ctgggggagg 2100
ctgagcagga agctcatcaa cggcattcgg gacaagcagt ccgggaagac gatcctcgac 2160
ttcctgaaga gcgatggctt cgcgaaccgc aatttcatgc agctgattca cgatgacagc 2220
ctcacattca aggaggatat ccagaaggct caggtgagcg gccaggggga ctcgctgcac 2280
gagcatatcg cgaacctcgc tggctcgcca gctatcaaga aggggattct gcagaccgtg 2340
aaggttgtgg acgagctggt gaaggtcatg ggcaggcaca agcctgagaa catcgtcatt 2400
gagatggccc gggagaatca gaccacgcag aagggccaga agaactcacg cgagaggatg 2460
aagaggatcg aggagggcat taaggagctg gggtcccaga tcctcaagga gcacccggtg 2520
gagaacacgc agctgcagaa tgagaagctc tacctgtact acctccagaa tggccgcgat 2580
atgtatgtgg accaggagct ggatattaac aggctcagcg attacgacgt cgatgctatc 2640
gttccacagt cattcctgaa ggatgactcc attgacaaca aggtcctcac caggtcggac 2700
aagaaccggg gcaagtctga taatgttcct tcagaggagg tcgttaagaa gatgaagaac 2760
tactggcgcc agctcctgaa tgccaagctg atcacgcagc ggaagttcga taacctcaca 2820
aaggctgaga ggggcgggct ctctgagctg gacaaggcgg gcttcatcaa gaggcagctg 2880
gtcgagacac ggcagatcac taagcacgtt gcgcagattc tcgactcacg gatgaacact 2940
aagtacgatg agaatgacaa gctgatccgc gaggtgaagg tcatcaccct gaagtcaaag 3000
ctcgtctccg acttcaggaa ggatttccag ttctacaagg ttcgggagat caacaattac 3060
caccatgccc atgacgcgta cctgaacgcg gtggtcggca cagctctgat caagaagtac 3120
ccaaagctcg agagcgagtt cgtgtacggg gactacaagg tttacgatgt gaggaagatg 3180
atcgccaagt cggagcagga gattggcaag gctaccgcca agtacttctt ctactctaac 3240
attatgaatt tcttcaagac agagatcact ctggccaatg gcgagatccg gaagcgcccc 3300
ctcatcgaga cgaacggcga gacgggggag atcgtgtggg acaagggcag ggatttcgcg 3360
accgtcagga aggttctctc catgccacaa gtgaatatcg tcaagaagac agaggtccag 3420
actggcgggt tctctaagga gtcaattctg cctaagcgga acagcgacaa gctcatcgcc 3480
cgcaagaagg actgggatcc gaagaagtac ggcgggttcg acagccccac tgtggcctac 3540
tcggtcctgg ttgtggcgaa ggttgagaag ggcaagtcca agaagctcaa gagcgtgaag 3600
gagctgctgg ggatcacgat tatggagcgc tccagcttcg agaagaaccc gatcgatttc 3660
ctggaggcga agggctacaa ggaggtgaag aaggacctga tcattaagct ccccaagtac 3720
tcactcttcg agctggagaa cggcaggaag cggatgctgg cttccgctgg cgagctgcag 3780
aaggggaacg agctggctct gccgtccaag tatgtgaact tcctctacct ggcctcccac 3840
tacgagaagc tcaagggcag ccccgaggac aacgagcaga agcagctgtt cgtcgagcag 3900
cacaagcatt acctcgacga gatcattgag cagatttccg agttctccaa gcgcgtgatc 3960
ctggccgacg cgaatctgga taaggtcctc tccgcgtaca acaagcaccg cgacaagcca 4020
atcagggagc aggctgagaa tatcattcat ctcttcaccc tgacgaacct cggcgcccct 4080
gctgctttca agtacttcga cacaactatc gatcgcaaga ggtacacaag cactaaggag 4140
gtcctggacg cgaccctcat ccaccagtcg attaccggcc tctacgagac gcgcatcgac 4200
ctgtctcagc tcgggggcga caagcggcca gcggcgacga agaaggcggg gcaggcgaag 4260
aagaagaaga agggagacgg ctctggatcg gggtcgggtt ctggctcagt cgacgatgct 4320
cttgacgatt ttgacctcga tatgctcgac gctcttgatg attttgatct cgacatgctc 4380
gatgcacttg atgactttga ccttgacatg ctcgacgcac tcgatgactt cgacctcgac 4440
atgcttgagg gcagaggaag tcttctaaca tgcggtgacg tggaggagaa tcccggccct 4500
atggcgtcaa atttcacgca gtttgttttg gttgataacg gcgggactgg cgacgttaca 4560
gtagctccat caaattttgc gaacggagtc gctgagtgga ttagctcaaa ttcaaggtcc 4620
caggcctaca aggttacctg ttctgttagg cagagttctg cgcaaaaaag aaaatatacc 4680
atcaaggttg aagtccctaa agttgcaaca caaacagtcg gtggtgttga gctccctgtg 4740
gcagcctgga gatcttactt aaacatggag ctaacaattc caatattcgc tacaaactct 4800
gattgtgaac tgattgttaa ggcgatgcaa ggtctcttga aagatggaaa ccctataccg 4860
tccgctatcg cagctaacag cggtatctat cctaagaaga agaggaaggt tggctctgga 4920
tcggggtcgg gttctggctc aggatccggt acctatccct atgacgtgcc cgattatgcc 4980
agcctgggca gcggctcccc caagaaaaaa cgcaaggtgg aagatcctaa gaaaaagcgg 5040
aaagtggacg gcattggtag tgggagcaac ggcagcagcg gatccaacgg tccgactgac 5100
gccgcggaag aagaactttt gagcaagaat tatcatcttg agaacgaagt ggctcgtctt 5160
aagaaaggtt ctggcagtgg agaagaactg ctttcaaaga attaccacct ggaaaatgag 5220
gtagctagac tgaaaaaggg gagcggaagt ggggaggagt tgctgagcaa aaattatcat 5280
ttggagaacg aagtagcacg actaaagaaa gggtccggat cgggtgagga gttactctcg 5340
aaaaattatc atctcgaaaa cgaagtggct cggctaaaaa agggcagtgg ttctggagaa 5400
gagctattat ctaaaaacta ccacctcgaa aatgaggtgg cacgcttaaa aaagggaagt 5460
ggcagtggtg aagagctact atccaagaat tatcatcttg agaacgaggt agcgcgtttg 5520
aagaagggtt ccggctcagg agaggaactg ctctcgaaga actatcatct tgaaaatgag 5580
gtcgctcgat taaaaaaggg atcgggcagt ggtgaggaac tactttcaaa gaattaccac 5640
ctcgaaaacg aagtagctcg attaaagaaa ggttcagggt cgggtgaaga attactgagt 5700
aaaaattatc atctggaaaa tgaggtagcg agactaaaaa aggggagtgg ttctggcgag 5760
gaattgctat cgaaaaatta tcatcttgag aacgaagttg ctaggctcaa aaagggctca 5820
ggctcaggca ccgcggtaaa cataggtggt ggaaccggtc cgatggatct acagcggccg 5880
caaggtggag gtggacccaa gaagaagcgc aaggtgtgaa ctagttaaag agctttcgtt 5940
cgtatcatcg gtttcgacaa cgttcgtcaa gttcaatgca tcagtttcat tgcgcacaca 6000
ccagaatcct actgagtttg agtattatgg cattgggaaa actgtttttc ttgtaccatt 6060
tgttgtgctt gtaatttact gtgtttttta ttcggttttc gctatcgaac tgtgaaatgg 6120
aaatggatgg agaagagtta atgaatgata tggtcctttt gttcattctc aaattaatat 6180
tatttgtttt ttctcttatt tgttgtgtgt tgaatttgaa attataagag atatgcaaac 6240
attttgtttt gagtaaaaat gtgtcaaatc gtggcctcta atgaccgaag ttaatatgag 6300
gagtaaaaca cttgtagttg taccattatg cttattcact aggcaacaaa tatattttca 6360
gacctagaaa agctgcaaat gttactgaat acaagtatgt cctcttgtgt tttagacatt 6420
tatgaacttt cctttatgta attttccaga atccttgtca gattctaatc attgctttat 6480
aattatagtt atactcatgg atttgtagtt gagtatgaaa atatttttta atgcatttta 6540
tgacttgccc gtacgctgca gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct agagataatg 6600
agcattgcat gtctaagtta taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac acttgtttga 6660
agtgcagttt atctatcttt atacatatat ttaaacttta ctctacgaat aatataatct 6720
atagtactac aataatatca gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt tagacatggt 6780
ctaaaggaca attgagtatt ttgacaacag gactctacag ttttatcttt ttagtgtgca 6840
tgtgttctcc tttttttttg caaatagctt cacctatata atacttcatc cattttatta 6900
gtacatccat ttagggttta gggttaatgg tttttataga ctaatttttt tagtacatct 6960
attttattct attttagcct ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta gtttttttat 7020
ttaataattt agatataaaa tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa caaataccct 7080
ttaagaaatt aaaaaaacta aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata atgccagcct 7140
gttaaacgcc gtcgacgagt ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc gtcgcgtcgg 7200
gccaagcgaa gcagacggca cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct ctcgagagtt 7260
ccgctccacc gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg cggagcggca 7320
gacgtgagcc ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca cggcaccggc agctacgggg 7380
gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc 7440
ccctccacac cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga 7500
tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc 7560
cccccccctc tctaccttct ctagatcggc gttccggtcc atggttaggg cccggtagtt 7620
ctacttctgt tcatgtttgt gttagatccg tgtttgtgtt agatccgtgc tgctagcgtt 7680
cgtacacgga tgcgacctgt acgtcagaca cgttctgatt gctaacttgc cagtgtttct 7740
ctttggggaa tcctgggatg gctctagccg ttccgcagac gggatcgatt tcatgatttt 7800
ttttgtttcg ttgcataggg tttggtttgc ccttttcctt tatttcaata tatgccgtgc 7860
acttgtttgt cgggtcatct tttcatgctt ttttttgtct tggttgtgat gatgtggtct 7920
ggttgggcgg tcgttctaga tcggagtaga attaattctg tttcaaacta cctggtggat 7980
ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg 8040
atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat 8100
atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc 8160
attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg 8220
gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc 8280
gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata 8340
tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg 8400
ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg 8460
gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga 8520
tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg cagggcgcca tggggccgga catagtcatg 8580
acacaaagtc cgagttcgct ttctgcgagt gttggggata gagttacgat aacctgcaga 8640
tctagtacgg gggccgtcac cacgtcgaat tacgcgtcat gggtccaaga aaagccaggc 8700
aaactgttta agggtcttat aggtggcacg aacaaccggg ctcccggagt cccttccagg 8760
tttagtggat cacttattgg tgacaaggca acgctgacga tatcttccct ccagccagaa 8820
gatttcgcga cctacttttg tgcactttgg tattctaacc actgggtctt tggccaaggg 8880
acgaaggtcg agctcaaacg gggtggcggt gggagcggcg ggggaggatc agggggcgga 8940
ggttcgagtg gcggggggag cgaagtcaaa ctcctcgagt ccggtggagg attggtgcaa 9000
ccaggtggtt cattgaagct ctcgtgtgca gtttctggtt tctctttgac agactacggt 9060
gtcaattggg tccggcaggc accggggcgc ggtcttgagt ggatcggcgt tatctggggc 9120
gacggaataa cagattataa ctctgctttg aaggacagat tcatcattag caaggacaac 9180
gggaagaaca cggtgtacct ccagatgagc aaagtgcgca gtgatgatac tgccctgtat 9240
tactgcgtca caggtttgtt tgattactgg ggtcaaggca ctcttgtgac agtctcttcg 9300
tatccttatg acgtgcccga ctacgctggc ggagggggcg gcagcggcgg gggtggatcc 9360
ggaggcggtg gctcaggggg cggcgggtcg cttgatcctg gtggcggagg ttctgggagc 9420
aaaggagagg agctctttac aggtgtcgtc cctattttgg tggagcttga tggagatgtc 9480
aatggccata aattttccgt caggggcgaa ggggaggggg acgcgactaa tggaaaattg 9540
accctcaagt ttatctgcac gacaggaaag ttgccggtcc cctggcccac tctggttacc 9600
accctcactt atggggtcca gtgctttagc agataccctg atcatatgaa acgccatgac 9660
ttcttcaaat cagccatgcc agagggttat gtgcaggaaa gaactataag ctttaaggac 9720
gatgggacgt acaaaacgcg ggcagaggtt aagtttgagg gggatactct tgtgaatagg 9780
atcgaactta agggcatcga ttttaaagaa gacggtaata ttcttggcca caagttggag 9840
tataatttca attctcacaa cgtgtacata acagcagata aacagaaaaa tgggatcaag 9900
gccaatttta aaattaggca taatgttgaa gatgggtctg tgcaactggc agatcattat 9960
cagcagaata ctccaattgg cgatggccct gtcttgttgc ctgacaatca ttacctttcc 10020
acgcagtcag tcctgtccaa agatccgaat gagaagcggg accacatggt cttgctcgaa 10080
ttcgttactg ccgccggaat cactcatggc atggacgagc tttacaaggg aggtggaagg 10140
actggaggtg gcggaggggg gctgcttgac cccggaaccc ctatggatgc cgacttggtg 10200
gcctcctcca cggttgtttg ggaacaggat gccgaccctt ttgcgggcac tgctgacgat 10260
tttcccgctt tcaatgagga ggagttggct tggctgatgg aacttctccc acagggtggt 10320
agtggtggcc tcctggatcc ggggacaccg atggacgcag acctggtggc gtcgtcaacg 10380
gttgtgtggg aacaggatgc tgatccgttc gcaggaactg ccgacgattt tcctgcattc 10440
aacgaagagg aactcgcatg gctcatggag cttctgcctc agggatcggg tggcgggtct 10500
cgaacggaag aatacaagct tatattgaac ggtaagacac tgaaaggtga aactacgaca 10560
gaagccgttg acgcggcaac tgcggagaaa gtctttaagc agtatgctaa cgataatggc 10620
gtggacgggg agtggacgta tgacgacgca accaaaacat tcacggtcac cgaggggggc 10680
ggcagcggag gcggtacctc gcccaaaacc cggagacgcc ctaggcgctc gcagcgcaaa 10740
agacctccca cg 10752
<210> 2
<211> 326
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttactttaa atttttctta tggctcagcc tgtgatggat aactgaatca aacaaatggc 60
gtctgggttt aagaacatct gttttggcta tgttggacga aacaagtgaa cttttaggat 120
caacttcagt ttatatacgg agcttatatc gagcaataag ataagtgggc tttttatgta 180
atttaatggg ctatcgtcca tatattcact aatacccatg cccagtaccc atgtatgcgt 240
ttcatataag ctcctaattt ctcccacatc gctcaaatct aaacaaatct tgttgtatat 300
ataacactga gggagcacca ttggtc 326
<210> 3
<211> 633
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgacgagtca gtaataaacg gcgtcaaagt ggttgcagcc ggcacacacg agtcgtgttt 60
atcaactcaa agcacaaata cttttcctca acctaaaaat aaggcaatta gccaaaaaca 120
actttgcgtg taaacaacgc tcaatacacg tgtcatttta ttattagcta ttgcttcacc 180
gccttagctt tctcgtgacc tagtcgtcct cgtcttttct tcttcttctt ctataaaaca 240
atacccaaag agctcttctt cttcacaatt cagatttcaa tttctcaaaa tcttaaaaac 300
tttctctcaa ttctctctac cgtgatcaag gtaaatttct gtgttcctta ttctctcaaa 360
atcttcgatt ttgttttcgt tcgatcccaa tttcgtatat gttctttggt ttagattctg 420
ttaatcttag atcgaagacg attttctggg tttgatcgtt agatatcatc ttaattctcg 480
attagggttt catagatatc atccgatttg ttcaaataat ttgagttttg tcgaataatt 540
actcttcgat ttgtgatttc tatctagatc tggtgttagt ttctagtttg tgcgatcgaa 600
tttgtagatt aatctgagtt tttctgatta aca 633
<210> 4
<211> 265
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgtttgctt ttagggttta cggacgtttc agcgagggag gtgtaggaca aatgaaaatg 60
ggcctaggaa gaagagtgtc gtgcggctat ctttacatca acgtgttcgc tcttcaacca 120
aaccccttcc ttttactcac aaccctggca actaatctaa acgcgcatat ataatcaata 180
tatattcctt aatattgtgt atcatttcat atataagctc atcgtccaga gagagagaga 240
gctcataagc cagccatgtc agtcc 265
<210> 5
<211> 293
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caattgctta atatgtcttt actaaattac taattcactt tagaccaatt ttggtcactg 60
gagtattacc caattgacac ctattcgttt tatatattta atttgttttg taagaatcag 120
tgaaatacaa cctatcgtct ctggtaaaaa aaaaaaacct ctatcaaatt gtttcagtcg 180
tactgtggtc cttttcattc atttatgtgg agagcagtca tgcacgtcgg tggccttatg 240
atctataatc tggtatatat ttacatatgg aggatagtaa tttgctggga ata 293
<210> 6
<211> 304
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcccctttct gtatgtactc atcatatgtt agtttcaaac atcaaagctg tttgatcatt 60
agctagctct gcaaatccac ctcctccttt ctgctgcctt ctcacttacc aatcaaaccc 120
aaatccccaa aagtacaact cctttattct tcttctctct taatccttaa tttttactta 180
atctagatgt tatttcagag ggagagttag ggaaaaaaag gtagctaact taggctcaac 240
cctctctctc tctctctctc taattaagat tagtagaggt cgagagaagg tcaggtgacc 300
aaaa 304
<210> 7
<211> 426
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aacagggaga tcattttaaa gttataataa ttgtagtcat tgaataaaaa ttcaacgatt 60
aacgatgatg gatcaggagg atcctctcca ttagatcagg gagaatccaa atccgtgaat 120
ttgtttcaca cgaactacaa agttgagcag ctaacaaaag cagtaaagaa ctaggaaatc 180
aaccaccacg ctcgtgcgtc aaccgttagg aaagcacgtg atgccccgga agctgagata 240
aaacagagaa agcgggcgtg agcgggttag gccgccaatg ttagctgggg ttcgcaacac 300
tccaccagcc ccccactata aatattttat aagcttctcc agtccctcac ccagcaacta 360
ttccaagtac ctattctcca ttgatttttc aagagatata cttcagtaag cacgtacaca 420
caagat 426
<210> 8
<211> 572
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cttgattgta cagaaaaata ttgttactta cttgaattat aaatcattat tattgaatat 60
gtaaatgcaa ttaagtttgt aaaccaataa ttaacttaat tttgatagtc aaacgcctca 120
tataaagtgg aaaaccaaga accggaagca tttactaagg cggttagggg tatccatgca 180
cgctttcaac tttccagtca aacctcggtc gtatgatgaa agtctggtgg gtgagatgtc 240
acatgtacaa cagccacatg cctactcgaa aagaaagaac acattcttca ctctccaaca 300
cgctcactta ctcttgctag tggtagctag cagcagtatt ttcccttcta agttttgtaa 360
acccaagtgg aaccaactac tcatttggtc acgctactat aaaagcaacg ttacattatc 420
attgcccctt aaaccattgc ttcatcaacc caccacaaaa aaaaagagtg cagggcctgc 480
attgttatcg gaaaaaaaaa aaaaaacaaa aaaaaactag taatatacta gctgagatag 540
tatattcttg ttgtcgaaag ccagctccaa aa 572
<210> 9
<211> 459
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttcctgatgc catctaaatt aggttactaa tttgtttcta catttctttg ttgatggctt 60
ctactttcgc caattttcca atcttgccaa gtaggttttt gtgaagactt actatgatca 120
atttcctttt tacaatttct agttttctat tattttctat tatgtaatta aaatgtcatg 180
tcttatcgca gcattgcatg gagatcattg ctagtcttta tcatgttcac gagatacggt 240
tcagttggtg ggcaaatgat cgtccacgca acactcaaat tcattgcaaa tcaagtagtc 300
ttggtggtcc tcctccctac ctagtaaaat tgggagtgcc gtggcctgtt gtcggtcttt 360
tggtgtcacg tattgccacc ccagtcaaat agtaatccgg tgggccctct ggggggttat 420
aaaccgcatt gggttaatgc ctatagcaac cgtcagtca 459
Claims (9)
1.一种梨CRISPRa基因转录激活***，其特征在于所述的梨CRISPRa基因转录激活***包含以下载体：
(1)sgRNA-表达骨架载体：包含MS2环的由拟南芥AtU3启动子来驱动sgRNA表达的骨架载体1；
(2)分别将多个sgRNA-表达载体聚合到一起同时表达的骨架载体2；
(3)CRISPRa***骨架载体，所述的CRISPRa***骨架载体融合了dzCas9蛋白编码基因和转录激活因子，所述的CRISPRa***骨架载体的序列如SEQ ID NO.1所示；
(4)用于将所述的多个sgRNA和所述的CRISPRa***骨架载体融合的最终表达骨架载体，所述的最终表达骨架载体包含Pol II启动子拟南芥AtUBQ10启动子来驱动dCas9蛋白的表达。
2.根据权利要求1所述的梨CRISPRa基因转录激活***，其特征在于由以下载体组成：
(1)pYPQ131B2.0、pYPQ132B2.0、pYPQ133B2.0、pYPQ134B2.0、pYPQ135B2.0或pYPQ136B2.0中的任意一种或多种；
(2)pYPQ142、pYPQ144或pYPQ146中的任意一种；
(3)pYPQ-dzCas9-Act3.0骨架载体；
(4)pYPQ202。
3.一种构建梨CRISPRa基因转录激活载体的方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)针对靶基因设计并制备sgRNA，每个靶基因至少设计两个sgRNA；
(2)将制备的sgRNA与骨架载体1连接得到sgRNA-表达载体；
(3)利用骨架载体2将上一步制备的多个sgRNA-表达载体聚合为一个包含多个sgRNA的表达载体；
(4)将上一步制备的包含多个sgRNA的表达载体、CRISPRa***骨架载体与最终表达骨架载体聚合得到所述的梨CRISPRa基因转录激活载体；
其中，所述的骨架载体1、骨架载体2、CRISPRa***骨架载体与最终表达骨架载体如权利要求1所述。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的骨架载体1选自pYPQ131B2.0、pYPQ132B2.0、pYPQ133B2.0、pYPQ134B2.0、pYPQ135B2.0或pYPQ136B2.0中的任意一种或多种；所述的骨架载体2选自pYPQ142、pYPQ144或pYPQ146中的任意一种；所述的CRISPRa***骨架载体选自pYPQ-dzCas9-Act3.0骨架载体；所述的最终表达骨架载体选自pYPQ202。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)针对靶基因设计并制备sgRNA，每个靶基因至少设计两个sgRNA；
(2)将制备的sgRNA与骨架载体1连接：通过T4 DNA连接酶将sgRNA与骨架载体pYPQ131B2.0或pYPQ132B2.0或pYPQ133B2.0或pYPQ134B2.0或pYPQ135B2.0或pYPQ136B2.0连接得到sgRNA-表达载体；
(3)将上一步制备得到的多个sgRNA-表达载体串连：基于Golden Gate连接方法，将两个sgRNA-表达载体聚合到pYPQ142同时表达组成sgRNA1-sgRNA2-pYPQ142表达载体以靶向同一个基因；或者将四个sgRNA-表达载体聚合到pYPQ144同时表达组成sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-sgRNA4-pYPQ144表达载体以同时靶向两个基因；或者将六个sgRNA-表达载体聚合到pYPQ146同时表达组成sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-sgRNA4-sgRNA5-sgRNA6-pYPQ146表达载体以同时靶向三个基因。
(4)sgRNA1-sgRNA2-pYPQ142或sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-sgRNA4-pYPQ144或sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-sgRNA4-sgRNA5-sgRNA6-pYPQ146和CRISPRa***骨架载体与最终表达骨架载体pYPQ202的聚合：基于Three-way LR Reaction方法，将三个质粒连接组成最终的梨CRISPRa基因转录激活载体。
6.按照权利要求3-5中任一项所述的方法构建的梨CRISPRa基因转录激活载体。
7.权利要求1-2中任一项所述的梨CRISPRa基因转录激活***在梨单基因或多基因的转录激活和基因功能研究中的应用。
8.一种梨单基因或多基因的转录激活方法，其特征在于包括针对需要转录激活的靶基因按照权利要求3-5中任一项所述的方法构建梨CRISPRa基因转录激活载体，并将所述的梨CRISPRa基因转录激活载体转化梨愈伤组织，提取DNA，对再生出来的梨愈伤组织进行PCR阳性鉴定，然后提取RNA进行靶基因激活倍数分析，得到稳定的靶基因转录激活的梨愈伤组织。
9.根据权利要求8所述的梨单基因或多基因的转录激活方法，其特征在于，PCR阳性鉴定所用的引物序列为：
M13-F1：5’-TTCCCAGTCACGACGTTGTAAAAC-3’
dCas9-R1：5’-TTATCAGCAGCTGGAACTCCG-3’。
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