WO2012043651A1 - ミエロイド系血液細胞の製造方法 - Google Patents

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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to production of human myeloid blood cells having the ability to proliferate in vitro, and a method for culturing the same. More specifically, the present invention relates to myeloid blood cells collected in vitro from a myeloid blood cell collected from a human body or a pluripotent stem cell such as an induced pluripotent stem cell using a predetermined differentiation induction method. The present invention relates to a method for allowing a cell to acquire the ability to proliferate in vitro while retaining its function. Furthermore, the present invention relates to a method for differentiating myeloid blood cells having the proliferation ability into dendritic cell-like cells having a stronger T cell stimulation ability.
  • the myeloid blood cells produced by the method of the present invention and capable of proliferating in vitro have the activity of phagocytosing microorganisms and the like.
  • the proliferative ability myeloid blood cells or dendritic cell-like cells derived therefrom are useful in the treatment of Alzheimer's disease, cancer, infectious diseases, prion diseases, amyloidosis, autoimmune diseases, etc. It is expected.
  • the proliferative ability myeloid blood cells and dendritic cell-like cells derived therefrom produced by the present invention are also expected to be useful in the treatment of rejection in organ transplantation and graft-versus-host disease (GVHD). Is done.
  • GVHD graft-versus-host disease
  • myeloid blood cells have the proliferative ability produced by the present invention because they have an important role in vivo in pathophysiology such as cancer, immune-related diseases, metabolic diseases, and vascular diseases.
  • Myeloid blood cells are expected to be useful as evaluation cells for examining drug efficacy and toxicity of drugs and the like.
  • Myeloid blood cells are a group of cells classified into leukocytes, and include macrophages, dendritic cells, granulocytes, and the like. Macrophages are main foreign body processing cells in the living body, and have a role of protecting the living body from infectious diseases by phagocytosing infectious microorganisms and the like that have entered the living body and decomposing them. In vivo, a large amount of cells die every day, and macrophages phagocytose and decompose the debris present in the tissues in the living body. In addition, macrophages play an essential role in maintaining homeostasis by phagocytosing and decomposing various metabolites generated in the living body.
  • Macrophages are often infiltrated locally in malignant tumors. It is believed that macrophages present in the tumor are both attacking tumor cells and promoting tumor cell growth. Until now, attempts have been made to treat malignant tumors by utilizing the ability of macrophages to attack tumor cells.
  • Dendritic cells are cells that strongly stimulate and activate T lymphocytes, and are cells that control the immune response in vivo. Upon invasion of infectious microorganisms, dendritic cells engulf the microorganisms and present antigenic substances derived from them to T lymphocytes, stimulating and activating antigen-specific T lymphocytes, thereby enhancing the immune response. Induce. Attempts have been made to use dendritic cells as cellular vaccines in immunotherapy for cancer and infections by taking advantage of the ability of dendritic cells to strongly stimulate T lymphocytes.
  • Macrophages and dendritic cells are cells having an important role in pathophysiology such as cancer, immune-related diseases, metabolic diseases, and vascular diseases. In developing various pharmaceuticals for treating these diseases, it is necessary to evaluate the effects of the drugs on macrophages and dendritic cells. In order to compare the effects of various kinds of chemical substances as drug candidates under the same conditions, a method of supplying large amounts of macrophages and dendritic cells having uniform properties is required.
  • Pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (induced pluripotent stem cells; iPS cells) are cells that have the ability to differentiate into various cells, And it has the ability to grow almost infinitely.
  • ES cells embryonic stem cells
  • induced pluripotent stem cells induced pluripotent stem cells
  • group blood cell which has a certain fixed similarity with the macrophage or dendritic cell which exists in the living body from a pluripotent stem cell is reported (for example, patent document 1 and a nonpatent literature) 1-9).
  • Patent Document 1 includes (A) a step of co-culturing human embryonic stem cells and cells having the property of inducing differentiation and proliferation of blood cells to obtain cell group A, (B) the above step Cell group A obtained in (A) and cells having the property of inducing differentiation and proliferation of blood cells are classified into granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and macrophage colony stimulating factor (M-CSF). And (C) the cell group B obtained in the step (B) in the presence of GM-CSF and interleukin-4 (IL-4).
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • M-CSF macrophage colony stimulating factor
  • IL-4 interleukin-4
  • a method for differentiating human embryonic stem cells into dendritic cells comprising
  • the differentiation-inducing culture methods reported so far including the differentiation method described in Patent Document 1, require considerable labor and time (one month or more) and are therefore intended for use in cell therapy.
  • the cost and time are excessive.
  • myeloid blood cells prepared by inducing differentiation from pluripotent stem cells have been proliferated over a long period (over one month or more), and a large amount (for example, 10 5 of pluripotent stem cells used as materials). No method has been reported that can produce myeloid blood cells (more than double).
  • monocytes monocytes
  • monocytes monocytes
  • monocytes are isolated from human peripheral blood using the expression of CD14 molecule as an index, and are used for dendritic cells and Macrophages can be made.
  • 10 10 monocytes are required to produce 10 10 dendritic cells or macrophages. To do so, it is necessary to separate monocytes from around 20 liters of peripheral blood.
  • Senju S Suemori H, Zembutsu H, Uemura Y, Hirata S, Fukuma D, Matsuyoshi H, Shimomura M, Haruta M, Fukushima S, Matsunaga Y, Katagiri T, Nakamura Y, Furuya N manipulated human embryonic stem cell-derived dendritic cells with immune regulatory function.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing myeloid blood cells having proliferation ability, a method for growing the myeloid blood cells, a myeloid blood cell obtained by the method, and a cell medicine containing the myeloid blood cell. There is to do. More specifically, an object of the present invention is to provide a method for producing a large amount of human myeloid blood cells useful for use as cell therapy. In addition, it stably maintains myeloid blood cells that are useful as evaluation cells in tests to examine the effects of various drugs on myeloid blood cells, which retain the same functions as myeloid blood cells present in the human body. It is to provide a method of manufacturing.
  • the present inventor has tried various methods to produce a large amount of myeloid blood cells from pluripotent stem cells at the lowest possible cost.
  • a myeloid blood cell derived from a pluripotent stem cell was introduced with a BMY1, EZH2, MDM2, MDM4, or HIF1A gene in addition to the cMYC gene and forced to express it, and a culture solution supplemented with M-CSF was used.
  • peripheral blood monocytes which are myeloid blood cells present in the human body, can be proliferated by introducing and forcibly expressing these genes.
  • the present invention has been completed based on such findings.
  • the aspect of the present invention relates to the following.
  • (A) has a proliferation ability, including forcibly expressing at least one gene selected from the group consisting of cMYC gene and (B) BMI1 gene, EZH2 gene, MDM2 gene, MDM4 gene, and HIF1A gene
  • a method for producing myeloid blood cells (2) The method according to (1), wherein the gene is forcibly expressed in the myeloid blood cell by introducing the gene into the myeloid blood cell.
  • the method according to (1) or (2), wherein the myeloid blood cells are derived from pluripotent stem cells.
  • the pluripotent stem cell is an induced pluripotent stem cell.
  • the method according to (4), wherein the induced pluripotent stem cell is a human induced pluripotent stem cell.
  • the method according to (6), wherein the peripheral blood monocytes are human peripheral blood monocytes.
  • the cMYC gene, BMI1 gene, EZH2 gene, MDM2 gene, MDM4 gene, and HIF1A gene are the human cMYC gene, human BMI1 gene, human EZH2 gene, human MDM2 gene, human MDM4 gene, and human HIF1A gene, respectively.
  • a myeloid blood cell comprising culturing a myeloid blood cell produced by the method according to any one of (1) to (8) in the presence of a macrophage colony stimulating factor (M-CSF). How to grow.
  • M-CSF macrophage colony stimulating factor
  • myeloid blood cells produced according to the present invention have the activity of phagocytosing microorganisms as well as macrophages present in the living body, and provide cell medicines for performing cell therapy for infectious diseases and malignant tumors. It is possible to do.
  • myeloid blood cells produced according to the present invention it is possible to provide a cell medicine for diseases caused by accumulation of a large amount of a specific substance in the body, such as Alzheimer's disease, amyloidosis, or certain metabolic diseases.
  • dendritic cell-like cells that can be used as cell vaccines against malignant tumors, infections, and the like. Further, according to the present invention, it becomes possible to produce dendritic cell-like cells or macrophages as cellular medicines for controlling immune responses for the purpose of treating autoimmune diseases or rejection associated with organ transplantation. . Furthermore, according to the present invention, it becomes possible to stably produce myeloid blood cells useful as evaluation cells in tests and studies for examining the effects of various pharmaceuticals on myeloid blood cells.
  • FIG. 1 is a diagram outlining the production method of the present invention.
  • FIG. 2 is a micrograph (photograph of phase contrast lens) of myeloid blood cells (iPS-MC) derived from human iPS cells.
  • FIG. 3 shows the results of analyzing the expression of CD45, CD11b, and CD33 molecules of human iPS cell-derived myeloid blood cells (iPS-MC) using a flow cytometer.
  • FIG. 4 is a micrograph (photograph of phase contrast lens) of a human iPS cell-derived myeloid blood cell line (iPS-ML) produced by forced expression of cMYC and BMI1.
  • FIG. 1 is a diagram outlining the production method of the present invention.
  • FIG. 2 is a micrograph (photograph of phase contrast lens) of myeloid blood cells (iPS-MC) derived from human iPS cells.
  • FIG. 3 shows the results of analyzing the expression of CD45, CD11b, and CD33 molecules of human iPS cell-derived my
  • FIG. 5 shows the results of analyzing the expression of CD45, CD11b, and CD33 molecules in a myeloid blood cell line (iPS-ML) prepared by forced expression of cMYC and BMI1, using a flow cytometer.
  • FIG. 6 shows the results of investigating the dependency on M-CSF and GM-CSF regarding the growth of myeloid blood cell line (iPS-ML).
  • FIG. 7 shows the results of analyzing the phagocytosis of fluorescent dye-labeled zymosan particles by a myeloid blood cell line (iPS-ML).
  • FIG. 8 shows a change with time regarding phagocytosis of fluorescent dye-labeled zymosan particles by a myeloid blood cell line (iPS-ML).
  • FIG. 9 is a photomicrograph of dendritic cell-like cells (ML-DC) derived from a myeloid blood cell line (iPS-ML).
  • FIG. 10 shows the expression of HLA class II, CD80, and CD86 on the cell surface using flow cytometry for dendritic cell-like cells (ML-DC) derived from the myeloid blood cell line (iPS-ML). The analysis result is shown.
  • FIG. 11 shows the results of investigating the activity of inducing the proliferation response of allo-T cells with respect to the myeloid blood cell line (iPS-ML) and dendritic cell-like cells (ML-DC) derived therefrom.
  • FIG. 12 is a photomicrograph (phase contrast lens image) of a human iPS cell-derived myeloid blood cell line (iPS-ML) sputum produced by forced expression of cMYC and EZH2.
  • FIG. 13 shows the results of analyzing the expression of CD45, CD11b, CD33 and CD14 molecules in a myeloid blood cell line (iPS-ML) prepared by forced expression of cMYC and EZH2, using a flow cytometer.
  • FIG. 14 is a micrograph (photograph of phase contrast lens) of a human iPS cell-derived myeloid blood cell line (iPS-ML) produced by forced expression of cMYC and MDM2.
  • FIG. 15 shows the results of analyzing the expression of CD45, CD11b, and CD33 molecules in a myeloid blood cell line (iPS-ML) prepared by forced expression of cMYC and MDM2 using a flow cytometer.
  • FIG. 16 is a photomicrograph (phase contrast lens image) of a myeloid blood cell line derived from human iPS cells (iPS-ML) produced by forced expression of cMYC and MDM4.
  • FIG. 17 shows the results of analyzing the expression of CD45, CD11b, and CD33 molecules in a myeloid blood cell line (iPS-ML) prepared by forced expression of cMYC and MDM4 using a flow cytometer.
  • FIG. 18 is a photomicrograph (phase contrast lens image) of a human iPS cell-derived myeloid blood cell line (iPS-ML) sputum produced by forced expression of cMYC and HIF1A.
  • FIG. 19 shows the results of analyzing the expression of CD45, CD11b, and CD33 molecules in a myeloid blood cell line (iPS-ML) prepared by forced expression of cMYC and HIF1A using a flow cytometer.
  • FIG. 20 is a photomicrograph (photograph of phase contrast lens) of myeloid blood cells (iPS-MC) derived from human iPS cells prepared by a differentiation induction method that does not use feeder cells.
  • FIG. 21 shows the results of analyzing the expression of CD45, CD11b, and CD33 molecules of myeloid blood cells derived from human iPS cells (iPS-MC) produced by a differentiation induction method without using feeder cells, using a flow cytometer.
  • FIG. 22 is a photomicrograph of iPS-ML prepared by forcibly expressing cMYC and BMI1 in iPS-MC derived from human iPS cells prepared by a differentiation induction method that does not use feeder cells (taken by phase contrast lens). ).
  • FIG. 23 shows CD45, CD11b, and CD33 molecules of iPS-ML prepared by forcibly expressing cMYC and BMI1 in iPS-MC derived from human iPS cells prepared by a differentiation induction method that does not use feeder cells. The result of having analyzed the expression of this with the flow cytometer is shown.
  • FIG. 24 is a micrograph (photograph of phase contrast lens) of a myeloid blood cell line (Mo-ML) derived from human peripheral blood monocytes prepared by forced expression of cMYC and BMI1.
  • FIG. 25 shows the results of analysis of the expression of CD45, CD11b, CD33 and CD14 molecules in a myeloid blood cell line (Mo-ML) derived from human peripheral blood monocytes prepared by forced expression of cMYC and BMI1 using a flow cytometer.
  • FIG. 26 shows the expression of HLA class II, CD80, and CD86 on the cell surface for dendritic cell-like cells (ML-DC) derived from myeloid blood cell line (Mo-ML) derived from human peripheral blood monocytes. The result of having been analyzed using flow cytometry is shown.
  • FIG. 27 shows the results of examining the activity of inducing the proliferation response of allo-T cells in relation to the myeloid blood cell line (Mo-ML) and dendritic cell-like cells (ML-DC) derived therefrom.
  • FIG. 28 is a micrograph (photograph of phase contrast lens) of a myeloid blood cell line (Mo-ML) derived from human peripheral blood monocytes prepared by forced expression of cMYC and MDM2.
  • FIG. 29 shows the results of analyzing the expression of CD45 and CD11b molecules of a myeloid blood cell line (Mo-ML) derived from human peripheral blood monocytes prepared by forced expression of cMYC and MDM2 using a flow cytometer.
  • FIG. 30 is a micrograph (photograph of phase contrast lens) of a myeloid blood cell line (Mo-ML) derived from human peripheral blood monocytes prepared by forced expression of cMYC, EZH2, and MDM2.
  • FIG. 31 shows the results of analyzing the expression of CD45 and CD11b molecules in a myeloid blood cell line (Mo-ML) derived from human peripheral blood monocytes prepared by forced expression of cMYC, EZH2, and MDM2, using a flow cytometer. .
  • the present invention is defined as a cell that expresses a CD11b molecule or a CD33 molecule with respect to a myeloid blood cell derived from a pluripotent stem cell or a myeloid blood cell collected directly from a living body.
  • the myeloid blood cells have the ability to proliferate in vitro.
  • the present invention comprises (A) cMYC gene and (B) BMI1 gene, EZH2 gene, MDM2 gene, MDM4 gene, and HIF1A gene in the myeloid blood cells in order to acquire the ability of the cells to proliferate. Forcibly expressing at least one gene selected from the group.
  • a “myeloid blood cell” as a starting material is defined as a cell that expresses a CD11b molecule or a CD33 molecule, and its origin is not particularly limited, but is derived from, for example, a pluripotent stem cell. Examples include myeloid blood cells or myeloid blood cells (eg, peripheral blood monocytes) collected from a living body (eg, human body).
  • the term “pluripotent stem cell” refers to a cell that has the ability to grow under artificially constructed conditions (in vitro) such as in vitro and can differentiate into all the cells constituting the living body. .
  • an embryonic stem cell or an induced pluripotent stem cell induced pluripotent stem cell (induced pluripotent stem cell iPS cell) is preferably used as the pluripotent stem cell, and an induced pluripotent stem cell is more preferably used.
  • induced pluripotent stem cell iPS cell induced pluripotent stem cell
  • the embryonic (ES) cell used in the present invention is not particularly limited as long as it is an ES cell derived from a mammal.
  • an ES cell derived from mouse, monkey or human can be used.
  • human embryonic (ES) cells are stem cells established from early human embryos and maintain the ability to differentiate into all cells existing in the living body (differentiation pluripotency). Cells that can grow in vitro.
  • the iPS cells used in the present invention are cells that have acquired differentiation pluripotency similar to embryonic stem cells by artificially manipulating somatic cells.
  • the type of somatic cell used here is not particularly limited, and includes all cells constituting the living body.
  • the iPS cells referred to in the present invention have a self-replicating ability over a long period of time under predetermined culture conditions (for example, conditions under which ES cells are cultured). This refers to stem cells that have pluripotency.
  • the induced pluripotent stem cell in the present invention may be a stem cell capable of forming a teratoma when transplanted to a test animal such as a mouse.
  • the reprogramming gene is a gene encoding a reprogramming factor that has the action of reprogramming somatic cells into iPS cells.
  • Specific examples of the combination of reprogramming genes include the following combinations, but are not limited thereto.
  • (I) Oct gene, Klf gene, Sox gene, Myc gene ii) Oct gene, Sox gene, NANOG gene, LIN28 gene (iii) Oct gene, Klf gene, Sox gene, Myc gene, hTERT gene, SV40 large T gene
  • Iv Oct gene, Klf gene, Sox gene
  • Each of the Oct gene, Klf gene, Sox gene and Myc gene includes a plurality of family genes.
  • family gene those described in pages 11 to 13 of the specification of International Publication No. WO2007 / 069666 can be used. Specifically, it is as follows.
  • Oct3 / 4 is preferable.
  • Oct3 / 4 is a transcription factor belonging to the POU family, is known as an undifferentiated marker, and has been reported to be involved in maintaining pluripotency.
  • genes belonging to the Klf gene include Klf1 (NM_006563), Klf2 (NM_016270), Klf4 (NM_004235), Klf5 (NM_001730), etc. (in parentheses indicate NCBI accession numbers of human genes) ).
  • Klf4 is preferred.
  • Klf4 (Kruppel like factor-4) has been reported as a tumor suppressor.
  • genes belonging to the Sox gene include, for example, Sox1 (NM_005986), Sox2 (NM_003106), Sox3 (NM_005634), Sox7 (NM_031439), Sox15 (NM_006942), Sox17 (NM_0022454), and Sox18 (NM_018419).
  • Sox1 NM_005986
  • Sox2 NM_003106
  • Sox3 NM_005634
  • Sox7 NM_031439
  • Sox15 NM_006942
  • Sox17 NM_0022454
  • Sox18 NM_018419.
  • Sox2 is a gene that is expressed during early development and encodes a transcription factor.
  • genes belonging to the Myc gene include c-Myc (NM_002467), N-Myc (NM_005378), and L-Myc (NM_005376) (in parentheses the NCBI accession number of the human gene). Show).
  • c-MycMy a transcriptional regulator involved in cell differentiation and proliferation, and has been reported to be involved in maintaining pluripotency.
  • genes described above are genes that exist in common in mammals including humans, and genes derived from any mammal (eg, derived from mammals such as humans, mice, rats, monkeys) can be used in the present invention. .
  • genes derived from any mammal eg, derived from mammals such as humans, mice, rats, monkeys
  • the method for introducing the reprogramming gene into the somatic cell is not particularly limited as long as the introduced reprogramming gene is expressed and the reprogramming of the somatic cell can be achieved.
  • the reprogramming gene can be introduced into a somatic cell using an expression vector containing at least one or more reprogramming genes.
  • the expression vector may be introduced into a somatic cell by incorporating two or more reprogramming genes into one expression vector.
  • Two or more types of expression vectors incorporating one type of reprogramming gene may be prepared and introduced into somatic cells.
  • the type of expression vector is not particularly limited, and may be a viral vector or a plasmid vector.
  • a viral vector that can be used to produce induced pluripotent stem cells include retroviral vectors (including lentiviral vectors), adenoviral vectors, and adenovirus vectors.
  • retroviral vectors including lentiviral vectors
  • adenoviral vectors include associated virus vectors, Sendai virus vectors, and the like.
  • a recombinant viral vector can be produced by introducing a recombinant viral vector plasmid into a packaging cell.
  • the method for introducing the viral vector plasmid into the packaging cell is not particularly limited, and can be performed by a known gene introduction method such as a calcium phosphate method, a lipofection method, or an electroporation method.
  • a medium capable of maintaining the undifferentiation and pluripotency of ES cells is known in the art, and the artificial pluripotent stem cell of the present invention can be isolated and cultured by using a suitable medium in combination. That is, as a medium for culturing the induced pluripotent stem cells of the present invention, an ES medium, a supernatant obtained by culturing mouse embryonic fibroblasts for 24 hours after adding FGF-2 at a concentration of 10 ng / ml to the ES medium And MEF-conditioned ES medium (hereinafter referred to as MEF-conditioned ES medium).
  • MEF-conditioned ES medium MEF-conditioned ES medium
  • the medium for culturing the induced pluripotent stem cells of the present invention includes various growth factors, cytokines, hormones (eg, FGF-2, TGFb-1, activin A, Nanoggin, BDNF, NGF, NT -1, NT-2, NT-3, and other components involved in the growth and maintenance of human ES cells may be added.
  • hormones eg, FGF-2, TGFb-1, activin A, Nanoggin, BDNF, NGF, NT -1, NT-2, NT-3, and other components involved in the growth and maintenance of human ES cells may be added.
  • the differentiation ability and proliferation ability of the isolated induced pluripotent stem cells can be confirmed by using confirmation means known for ES cells.
  • myeloid blood cells derived from pluripotent stem cells are cells produced by inducing differentiation while culturing pluripotent stem cells in vitro, and myeloid blood on the cell surface.
  • Methods for differentiating human pluripotent stem cells into myeloid blood cells are known in the art. For example, Non-Patent Documents 6, 7, 8, and 9 describe methods for producing dendritic cells and macrophages that are myeloid blood cells from human pluripotent stem cells.
  • the present invention relates to pluripotent stem cell-derived myeloid blood cells produced by induction of differentiation by the following method. It is not limited.
  • a group of cells containing mesodermal cells by co-culturing pluripotent stem cells and the feeder cells with cells having the property of inducing differentiation and proliferation of blood cells as feeder cells Can be differentiated into.
  • OP9 cells RIKEN BioResource Center deposit number: RCB1124
  • RCB1124 OP9 cells
  • Cells having the property of inducing the differentiation and proliferation of blood cells are cultured in a culture container containing an appropriate medium under culture conditions according to the feeder cells, and almost cover the bottom surface of the culture container. The cell growth is lost by treatment with a mitomycin C solution or irradiation, and then transplanted to a separately prepared cell culture container to form a feeder cell layer. The pluripotent stem cells can be seeded on the feeder cells thus prepared, and co-culture can be performed.
  • a medium used for the production and co-culture of the feeder cells a medium suitable for culturing adherent mammalian cells is used, and is appropriately selected according to the type of feeder cells. Examples include ⁇ MEM, DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium), IMDM (Iscob's modified Dulbecco medium), and the like.
  • the culture conditions for the feeder cells can be appropriately set according to the type of cells used as the feeder cells. For example, in the case of OP9 cells and the like, conditions for culturing on a culture vessel coated with a 0.1 wt% gelatin solution or the like can be mentioned.
  • Gas phase conditions for the co-culture the type of pluripotent stem cells used, depending on the composition of the culture medium, but may be set appropriately, for example, 37 ° C. before and after (in particular, 37 ° C.), 5 vol% CO 2 And the like.
  • the cell group obtained by the above co-culture exhibits the properties of mesodermal cells and can be obtained as a cell group containing a mass of cells exhibiting a nearly spherical shape.
  • mesodermal cells that are weakly adherent cells are removed by leaving the cells collected after co-culture in a culture vessel and removing the highly adherent cells.
  • the method of recovering can be mentioned.
  • the co-culture is treated with an enzyme such as trypsin or collagenase, and all cells are collected and diluted with an appropriate amount of an appropriate medium such as DMEM, and then the cell solution is seeded in a newly prepared culture vessel.
  • the cells attached to the culture vessel can be discarded, and the non-attached cells in the medium can be collected as a cell population containing a lot of mesodermal cells.
  • the cell group containing mesodermal cells obtained as described above is cultured in the presence of granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and / or macrophage colony stimulating factor (M-CSF).
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • M-CSF macrophage colony stimulating factor
  • the mesodermal cells can be differentiated into myeloid blood cells.
  • Medium that can be used for differentiating a cell group containing mesoderm cells into myeloid blood cells, culture conditions and the like are not particularly limited, but the same medium as the culture and co-culture of the feeder cells described above, Culture conditions and the like can be employed.
  • the content of granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) in the medium is 50 to 200 ng / ml, preferably 75 to 150 ng / ml, from the viewpoint of promoting differentiation of mesodermal cells into myeloid blood cells. Range.
  • the content of macrophage colony stimulating factor (M-CSF) in the medium is 10 to 100 ng / ml, preferably 25 to 75 ng / ml, from the viewpoint of promoting the differentiation of mesodermal cells into myeloid blood cells. Range.
  • the culture period required for the differentiation of mesoderm cells into myeloid blood cells is not limited by the culture conditions and the like, but is, for example, about 1 to 20 days, preferably about 2 to 15 days.
  • Non-Patent Document 6 or 7 As a culture method for inducing differentiation from pluripotent stem cells into myeloid blood cells, as described in Non-Patent Document 6 or 7, a method that does not use feeder cells, or does not contain animal-derived serum It is also possible to use a method using a culture solution. Hereinafter, an example of a method for differentiating pluripotent stem cells into myeloid blood cells using a culture solution that does not use feeder cells and does not contain animal-derived serum will be specifically described. In addition, as described in Non-Patent Document 6 or 7, as a culture method for inducing differentiation from pluripotent stem cells to myeloid blood cells without using feeder cells, other than the method described here, Are known.
  • the myeloid blood cells used in the present invention are not limited to myeloid blood cells derived from pluripotent stem cells produced by differentiation induction by any method.
  • a culture vessel coated with fibronectin or the like can be used to help adhere the cells to the culture vessel.
  • Fibronectin used for coating the culture vessel can be purified from human plasma, or can be a human fibronectin fragment prepared as a recombinant protein.
  • KSR Life Technology
  • Peprogrow III Peprogrow III
  • D-MEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • ⁇ -MEM® Alpha-Minimum Essential Medium
  • AIM-V OpTmizer: Life Technologies, Inc. Stemline: Sigma
  • human pluripotent stem cells are cultured for 15-20 days using a culture solution not containing animal-derived serum.
  • human BMP-4® (Bone® Morphogenic® Protein® 4) is added to a culture solution not containing serum of non-human animals for the purpose of promoting differentiation of pluripotent stem cells.
  • Differentiated cells of various cell lineages appear when differentiation induction culture is performed. From these cells, cells that have differentiated into mesodermal cells are separated, and the separated cells are later used as cell groups containing mesodermal cells. It is preferable to use in the process.
  • As a method of separating differentiated mesoderm cells as in the case of the differentiation induction method using feeder cells, by removing the adherent cells by leaving the cells collected after co-culture in a culture vessel, A method for recovering a cell population containing a lot of mesodermal cells that are floating cells can be mentioned.
  • the cell group containing a lot of mesodermal cells obtained as described above is cultured in the presence of granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and / or macrophage colony stimulating factor (M-CSF).
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • M-CSF macrophage colony stimulating factor
  • the mesodermal cells can be differentiated into myeloid blood cells.
  • the medium, culture conditions, and the like that can be used when differentiating a cell group containing mesoderm cells into myeloid blood cells are not particularly limited, and various serum-free culture solutions can be used.
  • myeloid blood cells present in the living body for example, the human body.
  • myeloid blood cells present in the living body for example, monocytes in the peripheral blood (monosite) can be used, and it is preferable to use human peripheral blood monocytes.
  • a method for separating monocytes from human peripheral blood will be described as an example of a method for obtaining myeloid blood cells present in the living body.
  • the method for obtaining myeloid blood cells used in the present invention is described below. The method is not limited.
  • Human peripheral blood is collected.
  • As the anticoagulant heparin or citric acid is used.
  • the collected blood is diluted with an equal amount of physiological saline, phosphate buffered saline, Hanks buffer solution, or the like.
  • the diluted blood is layered on Ficoll solution (GE Healthcare) previously dispensed in a centrifuge tube (BD-Falcon 352070 etc.). Then, after centrifugation for 20 minutes at a centrifugal force of 500 g using a centrifugal separator, a mononuclear cell fraction (including lymphocytes and monocytes) existing in the vicinity of the interface is collected.
  • Monocytes can be separated from mononuclear cells by the magnetic bead method using the expression of CD14 molecule as an index. For example, it can be separated by using CD14 microbeads (Milte 2 Co., Ltd. 130-050-201).
  • monocytes or macrophages derived therefrom are obtained by culturing the mononuclear cell fraction for about 6-16 hours using a cell culture vessel that has been surface-treated for cell culture, and collecting the cells attached to the vessel. It is also possible to obtain Usually, 200,000-500,000 monocytes can be collected from 10 ml of healthy adult peripheral blood.
  • the present invention relates to a myeloid blood cell derived from a pluripotent stem cell or a myeloid blood cell collected from a living body, and at least selected from the group consisting of a cMYC gene and BMI1, EZH2, MDM2, MDM4, and HIF1A genes.
  • a cMYC gene derived from a pluripotent stem cell or a myeloid blood cell collected from a living body
  • BMI1, EZH2, MDM2, MDM4, and HIF1A genes By forcibly expressing one gene, these cells are given long-term proliferative ability.
  • an endogenous gene present on the genome of the myeloid blood cell may be forcibly expressed, or a foreign gene may be introduced into the myeloid blood cell. By doing so, these genes may be forcibly expressed.
  • the “myeloid blood cell having proliferation ability” means a myeloid blood cell to which long-term proliferation ability is imparted by forcibly expressing the gene in the myeloid blood cell as described above.
  • the “myeloid blood cell having proliferation ability” of the present invention is longer than the control myeloid blood cell into which the above gene is not introduced (that is, the myeloid blood cell used as a starting material). For example, it is possible to proliferate for 2 weeks or more from the time when the gene is forcibly expressed (the time when the gene is introduced into the cell).
  • cMYC gene examples include a human cMYC gene (NM_002467) used for the preparation of the above-mentioned induced pluripotent stem cells (the NCBI accession number is shown in parentheses).
  • BMI1 gene, EZH2 gene, MDM2 gene, MDM4 gene, and HIF1A gene include human BMI1 gene (NM_005180), human EZH2 gene (NM_004456), human MDM2 gene (NM_002392), and human MDM4 gene, respectively.
  • NM — 002393 human HIF1A gene (NM — 001530) can be mentioned (in parentheses indicate NCBI accession numbers).
  • the cMYC gene, the BMI1 gene, the EZH2 gene, the MDM2 gene, the MDM4 gene, and the HIF1A gene are genes that are commonly present in mammals including humans.
  • any gene derived from any mammal eg, human, mouse, rat
  • Genes derived from mammals such as monkeys can be used.
  • a mutated gene having a base substitution, insertion and / or deletion and having a function similar to that of a wild-type gene.
  • the gene may be artificially modified so that the product of the gene is expressed as a fusion protein with another protein or peptide as long as it has a function equivalent to or higher than that of the wild-type gene.
  • the method for introducing the cMYC, BMI1, EZH2, MDM2, MDM4, or HIF1A gene into the above myeloid blood cells is particularly limited as long as the introduced gene can be expressed to give the myeloid blood cells long-term proliferation ability. It is not something.
  • the gene can be introduced into myeloid blood cells using an expression vector containing the transgene.
  • a plurality of genes may be incorporated into one expression vector, and the expression vector may be introduced into myeloid blood cells, or an expression vector into which each gene is separately incorporated is prepared, and these are expressed as myeloid blood cells. May be introduced.
  • the type of expression vector is not particularly limited, and may be a viral vector or a plasmid vector, but is preferably a viral vector, and particularly preferably a viral vector in which the introduced gene is integrated into the chromosome of a myeloid blood cell.
  • virus vectors that can be used in the present invention include retrovirus vectors, lentivirus vectors, and adeno-associated virus vectors.
  • a packaging cell used for producing a recombinant viral vector a cell capable of supplying the defective protein of a recombinant viral vector plasmid lacking at least one gene encoding a protein required for viral packaging Any cell can be used.
  • packaging cells based on human kidney-derived HEK293 cells and mouse fibroblasts NIH3T3 can be used.
  • a recombinant viral vector can be produced by introducing a recombinant viral vector plasmid into a packaging cell.
  • the method for introducing the viral vector plasmid into the packaging cell is not particularly limited, and can be performed by a known gene introduction method such as a calcium phosphate method, a lipofection method, or an electroporation method.
  • a solution enriched with the recombinant virus can be recovered by centrifugation or a method of concentrating using a commercially available column for virus purification. .
  • a solution containing the recombinant virus prepared as described above is added in a culture container. Infect the virus and introduce the target gene.
  • the myeloid blood cells produced as described above and capable of proliferating in vitro can be cultured using a cell culture medium containing M-CSF.
  • the content of macrophage colony stimulating factor (M-CSF) in the culture can be in the range of 25-100 ng / ml.
  • M-CSF can be produced in the myeloid blood cells themselves by introducing the M-CSF gene into the myeloid blood cells themselves using a lentiviral vector or the like. In this case, it is possible to grow and grow using a cell culture medium to which M-CSF is not added.
  • Dendritic cell-like cells can be produced from the myeloid blood cells having the ability to proliferate in vitro according to the present invention.
  • dendritic cell-like cells can be produced by culturing the myeloid blood cells having long-term proliferation ability of the present invention in the presence of GM-CSF and interleukin 4 (IL-4).
  • the content of GM-CSF in the culture solution can be in the range of 50 to 200 ng / ml, and the content of IL-4 can be in the range of 5 to 20 ng / ml.
  • a “dendritic cell-like cell” is a cell having properties similar to those of monocyte-derived dendritic cells in terms of morphology, cell surface molecules, and T cell stimulating ability.
  • the myeloid blood cell of the present invention has an activity of phagocytosing microorganisms as well as macrophages and the like present in the living body, and provides a cell medicine for performing immune cell therapy for infectious diseases and malignant tumors. Can do.
  • the myeloid blood cells of the present invention may be used for diseases such as Alzheimer's disease, prion disease, amyloidosis, cancer, leukemia, or certain metabolic diseases caused by the accumulation of a large amount of a specific substance in the body.
  • Cellular medicine for use in therapy can also be provided.
  • the dendritic cell-like cells derived from myeloid blood cells having long-term proliferative ability of the present invention can be used as a cell vaccine for use in the treatment of malignant tumors and infectious diseases. Furthermore, dendritic cell-like cells derived from the myeloid blood cells of the present invention provide a cell medicine for use in controlling immune responses for the purpose of treating rejection reactions associated with autoimmune diseases and organ transplantation. Can do.
  • an aid other than those described above is used.
  • An agent such as a medium may be used as appropriate.
  • Example 1 Preparation of lentiviral vector CDNAs of reprogramming factors, human OCT3 / 4, SOX2, KLF4, and c-MYC, were synthesized by PCR, inserted into a plasmid vector (pENTR-D-TOPO, Gibco-Invitrogen), and cloned. Thereafter, the base sequence of the cloned plasmid DNA was confirmed by sequence analysis. Human BMI1, EZH2, MDM2, MDM4, and HIF1A cDNA clones were obtained from RIKEN BRC Genetic Material Development Office or Product Evaluation Technology Infrastructure.
  • the above-mentioned cDNA fragment was inserted into a lentiviral vector (CSII-EF-RfAl, distributed by Dr. Hiroyuki Miyoshi, RIRI) using LR clonase (Gibco-Invitrogen).
  • the cell culture solution was collected, passed through a 0.45 ⁇ m filter, and then virus particles were precipitated and collected by centrifugation (50,000 G, 2 hours).
  • the recovered recombinant virus particles were suspended in a DMEM solution, dispensed into a freezing tube, and stored in a freezer ( ⁇ 80 ° C.) until use.
  • Example 2 Production of Human Artificial Pluripotent Stem (iPS) Cells Human abdominal skin pieces were collected and cultured in a cell culture plate using a culture solution (DMEM / 10% bovine serum). Since the first week after the start of culture, fibroblasts migrated and proliferated from the skin pieces. Trypsin / EDTA-containing phosphate-interfering saline (trypsin-EDTA) was used as appropriate for fibroblasts. Collected and stored frozen.
  • DMEM fetal bovine serum
  • a colony showing an ES cell-like morphology using a microchip under microscopic observation as an induced pluripotent stem (iPS) cell clone Co-culture with mouse embryo-derived feeder cells that had been isolated and prepared separately was performed. Thereafter, the culture was continued while expanding the culture container according to the proliferation of the cells.
  • iPS induced pluripotent stem
  • Human iPS cells are maintained in culture for human embryonic stem cells (DMEM-F12 (WakoWChemicals) / 20% 20KSR (Gibco-Invitrogen) / bFGF (basic fibroblast growth factor: 10 ng / ml) / 2-ME 2-mercaptoethanol, 50 ⁇ M)), and mitomycin C-treated mouse fetal fibroblasts were used as feeder cells in a polystyrene culture dish.
  • DMEM-F12 WiwakoWChemicals
  • 20KSR Gibco-Invitrogen
  • bFGF basic fibroblast growth factor: 10 ng / ml
  • 2-ME 2-mercaptoethanol 50 ⁇ M
  • CTK solution collagenase-trypsin-KSR solution, Biochemical and Biophysical Research Communications 345: 926-932, 2006
  • the cells were collected and inoculated into an appropriately sized culture vessel, and the culture was continued.
  • Example 3 Induction of differentiation of human induced pluripotent stem cells into myeloid blood cells (iPS-MC) (1) Preparation of OP9 feeder cells Mice-derived cultured cell line OP9 was treated with mitomycin C (0.01 mg / ml 60 minutes) was sown on a gelatin-coated dish and used after the next day.
  • iPS-MC myeloid blood cells
  • cells were treated with trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) -collagenase solution (37 ° C. for 60 minutes), dissociated and collected, and a cell suspension was prepared by pipetting. Then, cells derived from one 10 cm diameter dish were suspended in 10 ⁇ m DMEM / 10% FCS, and seeded on two 10 cm diameter dishes without feeder cells and without gelatin coating. After 2-5 hours, the cells that did not adhere to the dish were collected and passed through a 100 micron mesh (BD-Falcon Co. cell strainer) to obtain a cell suspension from which aggregated cell mass had been removed.
  • trypsin-EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • FIG. 2 shows a photomicrograph of differentiated cells derived from this iPS cell.
  • CD45 which is a leukocyte marker molecule
  • CD11b and CD33 which are myeloid cell markers.
  • Fc receptor blocking reagent (Miltenyi Biotec) was used for 10 minutes.
  • staining was carried out for 40 minutes at room temperature using fluorescein isothiocyanate (FITC) -labeled anti-human CD45 monoclonal antibody, phycoerythrosin (PE) -labeled anti-human / mouse CD11b antibody, or PE-labeled anti-human CD33 antibody.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • PE phycoerythrosin
  • PE PE-labeled anti-human / mouse CD11b antibody
  • PE-labeled anti-human CD33 antibody As a negative control, staining was performed using an isotype-matched control antibody labeled with the same fluorescent dye.
  • the cells were washed twice with PBS / 2% FCS, and the washed cells were analyzed using a flow cytometer analyzer (trade name: FACScan, manufactured by Becton Dickinson) equipped with CellQuest software.
  • a flow cytometer analyzer (trade name: FACScan, manufactured by Becton Dickinson) equipped with CellQuest software.
  • FIG. 3 shows the results of examining molecules expressed on the cell surface of the cells by flow cytometer analysis.
  • a histogram is shown in which the pattern of specific staining and the staining pattern using the isotype-matched control antibody are overlaid.
  • CD45 which is a pan-leukocyte marker molecule.
  • CD11b or CD33 which are marker molecules of myeloid blood cells.
  • This cell derived from iPS cells and expressing a marker molecule of myeloid blood cells was named iPS-MC (iPS-cell-derived myeloid cells: eloid blood cells derived from iPS cells).
  • Example 4 Giving long-term proliferation ability by introducing cMYC and BMI1 into iPS-MC (production of iPS-ML)
  • the iPS-MC prepared in the previous section was cultured in a 24-well culture plate and infected by adding a lentivirus suspension expressing cMYC or BMI1 alone or simultaneously. From the day after the gene transfer, the culture scale was expanded while adding a culture solution according to the cell growth. As a culture solution, ⁇ -MEM / 20% FCS / human GM-CSF (100 ng / ml) / human M-CSF (50 ng / ml) was continuously used.
  • iPS-MC When infected only with lentivirus expressing cMYC, iPS-MC grew at a rate of about 2 days doubling time. However, growth stopped after approximately 2 weeks after lentivirus infection. As a result, the forced expression of cMYC by lentivirus stopped iPS-MC from growing 30 to 100 times and then stopped growing.
  • iPS-MC After infection with cMYC lentivirus alone, iPS-MC, which had stopped growing for more than 2 weeks, was further infected with cMYC lentivirus, and subsequent cell growth was not observed.
  • iPS-MC proliferated slowly and reached about 2-3 times the number of cells, and then stopped proliferating.
  • iPS-MC When simultaneously infected with lentivirus expressing cMYC and BMI1, iPS-MC grew at a faster rate than when infected with cMYC lentivirus alone. Moreover, unlike the case where only cMYC lentivirus was infected, the cells continued to proliferate after the second week after the infection.
  • IPS-MC iPS-MC line, iPS cell-derived myeloid cell line, a myeloid blood cell line derived from iPS cells with long-term proliferative potential
  • iPS-MC that has acquired the ability to proliferate over a long period of time in this way Named.
  • FIG. 4 shows a micrograph of iPS-ML.
  • FIG. 5 shows the results of flow cytometer analysis in which the expression of CD45, CD11b, and CD33 in iPS-ML was examined. From this result, it was confirmed that iPS-ML expresses CD45, which is a leukocyte marker molecule, and CD11b and CD33, which are marker molecules of myeloid cells, on the cell surface.
  • Example 5 Examination of the necessity of M-CSF and GM-CSF in the proliferation of iPS-ML After infecting with lentivirus expressing cMYC and BMI1, iPS-ML was collected after 2 months of culture and seeded in 96-well culture plate (FALSCON 353072) (5 x 10 3 cells / well) Went. The growth rate was compared between the case where GM-CSF and M-CSF were contained in the culture solution (50 ng / ml or 100 ng / ml) and the case where GM-CSF and M-CSF were not contained.
  • 3 H-methylthymidine was added (37 Kbq / well), and 18 hours later, high molecular weight DNA in the cells was filtered with a cell filter using a cell harvester (Wallac). Captured. Then, 3 H-thymidine incorporation into high molecular weight DNA was measured by scintillation counting (using a Wallac microbeta system). The incorporation of 3 H-thymidine into high molecular weight DNA is proportional to the rate of DNA synthesis, ie the rate of cell growth.
  • FIG. 6 shows the results of scintillation measurement. From this result, it can be seen that the growth of iPS-ML requires that the culture medium contains about 50 ng / ml of M-CSF. On the other hand, GM-CSF is not necessarily required, but it can be seen that it has an effect of promoting proliferation.
  • Example 6 Analysis of Fungal Cell Particle (Zymosan) Phagocytosis by iPS-ML
  • myeloid blood cells have a strong activity of phagocytosing microorganisms such as bacteria and fungi. Therefore, the discoloration activity of fungal cell particles (zymosan) by iPS-ML was examined.
  • the iPS-ML during maintenance culture was recovered from the culture flask by pipetting, and seeded (2 ⁇ 10 5 / well) in a 24-well culture plate (FALCON 353047) coated with cell culture. After standing for 3 hours and confirming that most of iPS-ML was attached to the bottom of the culture plate, FITC-labeled zymosan (Molecular Probe Z2841) was added. After further 3 hours, observation with a fluorescence microscope was performed.
  • FIG. 7 shows a photomicrograph.
  • the left-side bright-field image (taken with a phase contrast lens) shows iPS-ML adhering to the culture plate.
  • the image on the right is taken from the same field of view as the image on the left, under the conditions for detecting the fluorescence emitted by FITC.
  • FITC fluorescence emitted by FITC.
  • signals indicating the localization of FITC-labeled zymosan particles are accumulated in accordance with iPS-ML. From this result, it was shown that iPS-ML phagocytoses FITC-labeled zymosan particles.
  • FIG. 8 shows the results of analysis using a flow cytometer. From this result, it was shown that the frequency of iPS-ML that phagocytosed zymosan particles increased with time. In this experiment, about half of iPS-MLs phagocytosed zymosan particles within 30 minutes after adding zymosan particles.
  • Example 7 Differentiation induction of iPS-ML into dendritic cell-like cells (ML-DC) iPS- after 40 days have elapsed after simultaneously infecting a lentivirus expressing cMYC and a lentivirus expressing BMI1 ML was cultured for 4 days in the presence of GM-CSF (100 ng / ml) and IL-4 (10 ng / ml) to induce differentiation into dendritic cell-like cells (ML-DC).
  • FIG. 9 shows cell morphology (phase contrast micrograph) when TNF (tumor necrosis factor) - ⁇ (10 ng / ml) was added and cultured for 2 days. It can be seen that irregularly shaped cells having protrusions form clusters.
  • ML-DC produced as described above was collected by pipetting, and stained with anti-HLA class II antibody, anti-human 80 antibody, or anti-human 86 antibody. Alternatively, staining was performed with an isotype matched control antibody. Thereafter, the cells were washed twice with PBS / 2% FCS. The washed cells were analyzed using a flow cytometer analyzer (trade name: FACScan, manufactured by Becton Dickinson) equipped with CellQuest software.
  • FIG. 10 shows the results of flow cytometer analysis after antibody staining.
  • the pattern of specific staining (solid line) and the staining pattern using the isotype-matched control antibody (dashed line) are shown superimposed.
  • the results of this analysis indicate that ML-DC expresses CD80, CD86, and HLA class II, which are related to T lymphocyte activation, on the cell surface as well as physiologically present dendritic cells. found.
  • Example 8 Examination of T-cell stimulating ability of ML-DC iPS-ML was cultured in the presence of GM-CSF (100 ng / ml) and IL-4 (10 ng / ml) for 4 days to obtain ML-DC. Then, TNF (tumor necrosis factor) - ⁇ (10 ng / ml) was added and cultured for 2 days, and then the cells were collected. These cells were irradiated with 45 Gy X-rays to stop cell growth, and then seeded in a 96-well round bottom culture plate (FALCON 353077) (1 x 10 2 cells-1 x 10 4 cells / well) for stimulation Cells were used.
  • GM-CSF 100 ng / ml
  • IL-4 10 ng / ml
  • ML-DC without TNF- ⁇ addition or iPS-ML without GM-CSF and IL-4 were also irradiated with 45 Gy X-rays to stop cell growth and cultured.
  • the cells were seeded and used as stimulator cells.
  • peripheral blood T cells derived from allo donors were added as reaction cells (5 ⁇ 10 4 cells / well) and cultured.
  • Peripheral blood T cells were isolated using a human T cell separation kit (Milte-Biotech 130-091-156).
  • 3 H-methylthymidine was added (37 Kbq / well). After 18 hours, high molecular weight DNA in the cells was captured on a glass filter using a cell harvester (Wallac). By measuring the radioactivity of 3 H-thymidine trapped on the glass filter by scintillation counting (using a Wallac microbeta system), the rate of macromolecular DNA synthesis, ie, the proliferation rate of T cells, was quantified.
  • FIG. 11 shows the results of T cell proliferation response analysis. All of the three types of stimulating cells (MLPS with or without iPS-ML or TNF- ⁇ treatment) have the activity of stimulating allo-T cells and inducing proliferative responses found. And it turns out that ML-DC which performed TNF- (alpha) treatment has the strongest T cell stimulation capability among three types of stimulation cells. From the above results, it was shown that ML-DC derived from iPS-ML has a strong ability to stimulate T cells.
  • Example 9 Preparation of iPS-ML by introduction of cMYC and EZH2 into iPS-MC
  • the iPS-MC prepared in the previous section was cultured in a 24-well culture plate, and lentivirus suspension expressing cMYC and EZH2 therein IPS-ML was produced by simultaneously infecting.
  • FIG. 12 shows a photomicrograph of this cell.
  • FIG. 13 shows the results of examining the expression of CD45, CD11b, CD33 and CD14 using a flow cytometer.
  • IPS-ML obtained in this example proliferated at a faster rate than cells into which cMYC alone was introduced.
  • the obtained iPS-ML proliferated over a longer period of time than cells into which only cMYC had been introduced, and continued to proliferate after the second week after infection with lentivirus.
  • Example 10 Production of iPS-ML by introducing cMYC and MDM2 into iPS-MC
  • the iPS-MC produced in the previous section was cultured in a 24-well culture plate, and a lentiviral suspension expressing cMYC and MDM2 therein.
  • IPS-ML was produced by simultaneously infecting.
  • FIG. 14 shows a micrograph of this cell.
  • FIG. 15 shows the results of examining the expression of CD45, CD11b, and CD33 using a flow cytometer.
  • IPS-ML obtained in this example proliferated at a faster rate than cells into which cMYC alone was introduced.
  • the obtained iPS-ML proliferated over a longer period of time than cells into which only cMYC had been introduced, and continued to proliferate after the second week after infection with lentivirus.
  • Example 11 Preparation of iPS-ML by introducing cMYC and MDM4 into iPS-MC
  • the iPS-MC prepared in the previous section was cultured in a 24-well culture plate, and a lentiviral suspension expressing cMYC and MDM4 therein.
  • IPS-ML was produced by simultaneously infecting.
  • FIG. 16 shows a micrograph of this cell.
  • FIG. 17 shows the results of examining the expression of CD45, CD11b, and CD33 using a flow cytometer.
  • IPS-ML obtained in this example proliferated at a faster rate than cells into which cMYC alone was introduced.
  • the obtained iPS-ML proliferated over a longer period of time than cells into which only cMYC had been introduced, and continued to proliferate after the second week after infection with lentivirus.
  • Example 12 Preparation of iPS-ML by introducing cMYC and HIF1a into iPS-MC
  • the iPS-MC prepared in the previous section was cultured in a 24-well culture plate, and lentivirus suspension expressing cMYC and HIF1a therein IPS-ML was produced by simultaneously infecting.
  • FIG. 18 shows a micrograph of this cell.
  • FIG. 19 shows the results of examining the expression of CD45, CD11b, and CD33 using a flow cytometer.
  • IPS-ML obtained in this example proliferated at a faster rate than cells into which cMYC alone was introduced.
  • the obtained iPS-ML proliferated over a longer period of time than cells into which only cMYC had been introduced, and continued to proliferate after the second week after infection with lentivirus.
  • Example 13 Differentiation of human induced pluripotent stem cells without feeder cells into myeloid blood cells (iPS-MC) and production of iPS-ML Undifferentiated human iPS cells were collected using CTK solution. The cells were cultured in a culture vessel coated with human fibronectin. As the culture solution, a mixture of OpTmizer TM T-Cell Expansion SFM (Life Technoilogies) and Stemline II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium (SIGMA) at 1: 1 and Peprogrow III (Peprotech) were sequentially used. Furthermore, human BMP-4 (Bone Morphogenic Protein 4) was added to the culture solution at a concentration of 5 ng / ml with the intention of promoting differentiation into mesodermal cells.
  • iPS-MC myeloid blood cells
  • cells 25 days after the start of the culture, cells were treated with a trypsin-EDTA-collagenase solution (37 ° C. for 60 minutes), dissociated and collected, and a cell suspension was prepared by pipetting. Then, cells derived from one 10 cm diameter dish were suspended in 10 ⁇ m DMEM / 10% FCS, and seeded on two 10 cm diameter dishes without feeder cells and without gelatin coating. After 2-5 hours, the cells that did not adhere to the dish were collected and passed through a 100 micron mesh (BD-Falcon Co. cell strainer) to obtain a cell suspension from which aggregated cell mass had been removed. Thereafter, the cells were stored frozen using a cell preservation solution (Cell Banker Toji Field).
  • a trypsin-EDTA-collagenase solution 37 ° C. for 60 minutes
  • FCS 10 ⁇ m DMEM / 10% FCS
  • FIG. 20 shows a micrograph of this cell.
  • FIG. 21 shows the results of examining the expression of CD45, CD11b, and CD33 using a flow cytometer. From these results, it was confirmed that CD45, which is a leukocyte marker molecule, and CD11b and CD33, which are marker molecules for myeloid blood cells, were expressed on the cell surface. Therefore, this differentiated cell derived from iPS cells was also determined to be iPS-MC.
  • this iPS-MC was collected and cultured in a 24-well culture plate. Infections were made by simultaneously adding a lentivirus suspension expressing cMYC and BMI1 to prepare iPS-ML.
  • FIG. 22 shows a micrograph of this cell.
  • FIG. 23 shows the results of examining the expression of CD45, CD11b, and CD33 using a flow cytometer.
  • IPS-ML obtained in this example proliferated at a faster rate than cells into which cMYC alone was introduced.
  • the obtained iPS-ML proliferated over a longer period of time than cells into which only cMYC had been introduced, and continued to proliferate after the second week after infection with lentivirus.
  • Example 14 Providing long-term proliferative ability by introducing cMYC and BMI1 into human peripheral blood monocytes (production of Mo-ML) Using a 50 ml injection syringe aspirated with a small amount (about 0.5 ml) of heparin, 50 ml of peripheral blood was collected from a healthy donor. The blood was dispensed in 25 ml aliquots into two 50 ml centrifuge tubes and diluted with an equal volume of phosphate buffered saline (PBS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • the collected mononuclear cell fraction was washed with a RPMI-1640 culture solution and then suspended in a magnetic bead separation buffer (PBS containing 2 mM EDTA and 2% FCS). Then, magnetic microbeads bound with anti-human CD14 antibody (Milte-Biotech 130-050-201) were added and allowed to stand at 6 ° C. for 15 minutes. Then, after washing with a magnetic bead separation buffer, cells expressing CD14 on the cell surface, that is, monocytes, were separated using a cell separation column (MS column 130-042-201 manufactured by Milte 2-Biotech). separated. In addition, human peripheral blood monocytes (Lonza 2W-400C) that were separated by the same method and were commercially available for research were also used.
  • a cell separation column MS column 130-042-201 manufactured by Milte 2-Biotech
  • a lentivirus suspension expressing cMYC and a lentivirus suspension expressing BMI1 are simultaneously added thereto. Infected.
  • ⁇ -MEM / 20% FCS / human GM-CSF (100 ng / ml) / human M-CSF (50 ng / ml) was used.
  • FIG. 24 shows a photomicrograph of the cells about 40 days after the infection with the lentivirus. Moreover, the cells in the same period were collected, and the results of examining the expression of CD45, CD11b, CD33, and CD14 with a flow cytometer are shown in FIG. From these results, it was confirmed that monocyte-derived cells that acquired long-term proliferative ability by introduction of cMYC and BMI1 expressed myeloid blood cell markers. Therefore, this cell was named Mo-ML (Monocyte-derived myeloid cell line, a myeloid blood cell line derived from monocytes).
  • Mo-ML Monocyte-derived myeloid cell line, a myeloid blood cell line derived from monocytes.
  • Example 15 Induction of differentiation of Mo-ML into dendritic cell-like cells (ML-DC) After 40 days of simultaneous infection with lentivirus expressing cMYC and BMI1, Mo-ML was treated with GM-CSF (100 ng / ml) and IL-4 (10 ng / ml) for 4 days. The cells were cultured and induced to differentiate into dendritic cell-like cells (ML-DC). Further, TNF- ⁇ (10 ng / ml) was added and cultured for 2 days.
  • GM-CSF 100 ng / ml
  • IL-4 10 ng / ml
  • ML-DC The expression of marker molecules on the cell surface of ML-DC was examined by flow cytometry. First, it processed for 10 minutes using Fc receptor block reagent (made by Miltenyi Biotec). Next, it was stained for 40 minutes at room temperature with FITC-anti-human 80 antibody, anti-human 86 antibody, or anti-HLA class II antibody. In addition, staining was performed using an isotype-matched control antibody labeled with FITC or PE. Stained cells were analyzed using FACScan (BD).
  • FIG. 26 shows the results of flow cytometer analysis after antibody staining.
  • the pattern of specific staining (solid line) and the staining pattern using the isotype-matched control antibody (broken line) are shown superimposed.
  • the results of this analysis indicate that ML-DC expresses CD80, CD86, and HLA class II, which are related to T lymphocyte activation, on the cell surface as well as physiologically present dendritic cells. found.
  • Example 16 Examination of T-cell stimulation ability of Mo-ML-derived ML-DC Mo-ML was cultured for 4 days in the presence of GM-CSF (100 ng / ml) and IL-4 (10 ng / ml). ML-DC was prepared, and TNF- ⁇ (10 ng / ml) was further added and cultured for 2 days, and then the cells were collected. These cells were irradiated with 45 Gy X-rays to stop cell growth, and then seeded in a 96-well round bottom culture plate (FALCON 353077) (1 x 10 2 cells-1 x 10 4 cells / well) for stimulation Cells were used.
  • FALCON 353077 96-well round bottom culture plate
  • ML-DC without TNF- ⁇ addition, or Mo-ML without GM-CSF and IL-4 were similarly cultured after 45 Gy X-rays were irradiated to stop cell growth.
  • the cells were seeded and used as stimulator cells.
  • peripheral blood T cells derived from allo donors were added as reaction cells (5 ⁇ 10 4 cells / well) and cultured.
  • 3 H-methylthymidine was added (37 Kbq / well). After 18 hours, high molecular weight DNA in the cells was captured on a glass filter using a cell harvester (Wallac). The proliferation rate of T cells was quantified by measuring the radioactivity of 3 H-thymidine trapped on the glass filter by scintillation counting.
  • FIG. 27 shows the results of T cell proliferation response analysis. All of the three types of stimulating cells (MLPS with or without iPS-ML or TNF- ⁇ treatment) have the activity of stimulating allo-T cells and inducing proliferative responses found. And it turns out that ML-DC which performed TNF- (alpha) treatment has the strongest T cell stimulation capability among three types of stimulation cells. From the above results, it was shown that ML-DC derived from Mo-ML has a strong ability to stimulate T cells.
  • Example 17 Production of Mo-ML by introduction of cMYC and MDM2 into peripheral blood monocytes
  • Human peripheral blood monocytes (CD14 positive cells) were cultured in 24-well culture plates, and wrench expressing cMYC and MDM2 there. Infections were made by simultaneously adding the virus suspension.
  • As the culture solution ⁇ -MEM / 20% FCS / human GM-CSF (100 ng / ml) / human M-CSF (50 ng / ml) was used.
  • the cells showed a clear tendency to proliferate after about 3 weeks after infection with lentivirus.
  • FIG. 28 shows a photomicrograph of cells about 1 month after infection with lentivirus.
  • FIG. 29 shows the results of examining the expression of CD45, CD11b, CD33 and CD14 using a flow cytometer at the same time.
  • Example 18 Production of Mo-ML by introduction of cMYC, EZH2 and MDM2 into peripheral blood monocytes
  • Human peripheral blood monocytes were cultured in 24-well culture plates, and lentivirus expressing cMYC, EZH2 and MDM2 there. Infections were made by adding the suspension simultaneously. The cells showed a clear tendency to proliferate after about 3 weeks after infection with lentivirus.
  • FIG. 30 shows a photomicrograph of cells about 1 month after infection with lentivirus.
  • FIG. 31 shows the results of examining the expression of CD45, CD11b, CD33 and CD14 using a flow cytometer at the same time.

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Abstract

本発明の目的は、増殖能力を有するミエロイド系血液細胞の製造方法を提供することにある。本発明によれば、ミエロイド系血液細胞において、（Ａ）ｃＭＹＣ遺伝子、並びに（Ｂ）ＢＭＩ１遺伝子、ＥＺＨ２遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＭＤＭ４遺伝子、及びＨＩＦ１Ａ遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子を強制的に発現させることを含む、増殖能力を有するミエロイド系血液細胞を製造する方法が提供される。

Description

ミエロイド系血液細胞の製造方法
本発明は、生体外で増殖する能力を有するヒトミエロイド系血液細胞の製造、およびその培養の方法に関する。より詳細には、本発明は、人体から採取されたミエロイド系血液細胞、あるいは、人工多能性幹細胞などの多能性幹細胞から所定の分化誘導法を用いて生体外において作製されたミエロイド系血液細胞に、その機能を保持しつつ生体外で増殖する能力を獲得させる方法に関する。さらに、該増殖能力を有するミエロイド系血液細胞を、より強力なT細胞刺激能力を有する樹状細胞様細胞へと分化させる方法に関する。本発明の方法により製造される生体外で増殖する能力を有するミエロイド系血液細胞は、微生物等を貪食する活性を有している。本発明により作製される増殖能力を有するミエロイド系血液細胞、あるいはそれに由来する樹状細胞様細胞は、アルツハイマー病、がん、感染症、プリオン病、アミロイドーシス、自己免疫疾患等の治療において有用であると期待される。本発明により作製される増殖能力を有するミエロイド系血液細胞およびそれに由来する樹状細胞様細胞は、また、臓器移植における拒絶反応や移植片対宿主病（GVHD）の治療においても有用であると期待される。さらに、ミエロイド系血液細胞は、がん、免疫関連疾患、代謝性疾患、血管病などの病態生理において生体内で重要な役割を有していることから、本発明により製造される増殖能を有するミエロイド系血液細胞は、医薬品等の薬効および毒性を検査するための評価細胞としても有用であると期待される。
　ミエロイド系血液細胞は、白血球中に分類される細胞群であり、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球などを含む。マクロファージは、生体内における主要な異物処理細胞であり、生体内に侵入した感染性微生物等を貪食してこれを分解することにより、生体を感染症から防御する役割を有している。また、生体内では、日々、大量の細胞が死滅しており、マクロファージは、生体内組織中に存在するその残骸物を貪食し分解する。それ以外にも、マクロファージは、生体内で生じる様々な代謝産物を貪食・分解処理することにより、生体の恒常性維持において必須の役割を担っている。また、マクロファージは、悪性腫瘍の局所においてしばしば浸潤が認められる。腫瘍の局所に存在するマクロファージは、腫瘍細胞を攻撃している場合と腫瘍細胞の増殖を促進している場合の両方があると考えられている。これまでに、マクロファージの腫瘍細胞に対する攻撃能力を活用して悪性腫瘍を治療しようとする試みもなされている。
樹状細胞は、Tリンパ球を強力に刺激し活性化する細胞であり、生体内において免疫応答の制御を司っている細胞である。感染性微生物の生体内侵入に際して、樹状細胞は、微生物を貪食しそれに由来する抗原物質をTリンパ球に提示し、抗原特異的なTリンパ球を刺激し活性化することにより、免疫応答を誘導する。樹状細胞が有するTリンパ球を強力に刺激する能力を生かし、樹状細胞を、がんや感染症に対する免疫療法において細胞ワクチンとして用いる試みがなされている。
細胞医薬としてマクロファージや樹状細胞を使用し、臨床的な効果を得るためには、大量の細胞を必要とする。マクロファージの場合、1010から1012程度、樹状細胞の場合でも108から109の細胞を必要とする。生体内組織に存在するこれらの細胞の数は、有限であり、また、生体内組織からこれらの細胞を大量に採取することは困難である。そこで、マクロファージや樹状細胞による細胞医療を実現するためには、これらのミエロイド系血液細胞を大量に、かつ、より少ない費用で安定して供給できる方法を確立する必要がある。
マクロファージや樹状細胞は、がん、免疫関連疾患、代謝性疾患、血管病などの病態生理において重要な役割を有する細胞である。これらの疾患を治療するための各種医薬品を開発するにあたっては、マクロファージや樹状細胞に対する薬品の効果を評価することが必要である。医薬品の候補として多種類の化学物質について、同一の条件でその効果を比較するためには、均一な性質を有するマクロファージや樹状細胞を大量に供給する方法が必要である。
胚性幹細胞(ES細胞)や人工多能性幹細胞（誘導多能性幹細胞）（induced pluripotent stem cell；iPS細胞）などの多能性幹細胞は、様々な細胞へ分化する能力を有する細胞であり、かつ、ほぼ無限に増殖する能力を有する。そして、生体内に存在するマクロファージあるいは樹状細胞と機能的に一定の類似性を有するミエロイド系血液細胞を多能性幹細胞から作製する方法が報告されている（例えば、特許文献１及び非特許文献１～９参照）。そこで、多能性幹細胞を大量に増殖させた後に、これらの分化誘導法を用いて分化させることにより、大量のミエロイド系血液細胞を作製することは、理論的には可能である。例えば、特許文献１には、（Ａ）ヒト胚性幹細胞と、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞とを共培養して、細胞群Ａを得るステップ、（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞群Ａと、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞とを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)とマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)の存在下に共培養して、細胞群Ｂを得るステップ、及び（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞群Ｂを、GM-CSFとインターロイキン－４(IL-4)の存在下に培養するステップ、を含む、ヒト胚性幹細胞から樹状細胞への分化方法が開示されている。しかしながら、特許文献１に記載の分化方法を含め、これまでに報告されている分化誘導培養法は、相当な労力と時間（1か月以上）を必要とするため、細胞治療に用いることを目的としてミエロイド系血液細胞を作製する方法としてはコストと時間が過大である。また、これまでに、多能性幹細胞からの分化誘導により作製したミエロイド系血液細胞を長期間（１か月以上にわたり）増殖させ、大量の（例えば、材料として用いた多能性幹細胞の105倍以上の）ミエロイド系血液細胞を作製できる方法は報告されていない。
他方、ヒトの末梢血中の単球（モノサイト、末梢血中のCD14分子を発現する細胞）から、樹状細胞およびマクロファージを作製する方法はよく知られている。健康なヒトの末梢血には、1mlあたり20,000-50,000個前後の単球が存在するので、CD14分子の発現を指標としてヒトの末梢血から単球を分離し、これを用いて樹状細胞およびマクロファージを作製することが可能である。ただし、従来技術ではヒトの末梢血単球を生体外での培養により増殖させることは困難であるため、1010の樹状細胞あるいはマクロファージを作製するためには、1010の単球を必要とし、そのためには20リットル前後の末梢血から単球を分離することを必要とする。そこで、今日、がんに対する細胞ワクチン療法を行うために樹状細胞を作製する場合は、成分採血装置（アフェレーシス）を用いた細胞分離による白血球分離装置を用いた白血球の分離、さらに白血球中の単球の分離が行われている。また、末梢血中の単球の数および生体外での分化能力にはドナーによる違いが大きいため樹状細胞を安定して作製することが困難であるという問題もある。
国際公開ＷＯ２００８／０５６７３４
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　本発明の課題は、増殖能力を有するミエロイド系血液細胞の製造方法、該ミエロイド系血液細胞を増殖させる方法、該方法により得られるミエロイド系血液細胞、及び該ミエロイド系血液細胞を含む細胞医薬を提供することにある。より具体的には、本発明の課題は、細胞治療としての用途に有用なヒトのミエロイド系血液細胞を大量に製造する方法を提供することにある。また、ヒトの体内に存在するミエロイド系血液細胞と同等の機能を保持し、各種医薬品などのミエロイド系血液細胞に与える影響を調べるための検査において評価細胞として有用なミエロイド系血液細胞を安定的に製造する方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するため、多能性幹細胞から大量のミエロイド系血液細胞をできるだけ少ない費用で製造するべく、様々な方法を試みた。また、多能性幹細胞に由来するミエロイド系血液細胞に様々な遺伝子を強制的に発現させることにより、長期増殖能力を付与することを試みた。その結果、多能性幹細胞由来のミエロイド系血液細胞にcMYC遺伝子に加えてBMI1、EZH2、MDM2、MDM4、あるいはHIF1Aの遺伝子を導入し強制的に発現させ、M-CSFを添加した培養液を用いて継続的に培養することにより、長期間に渡ってミエロイド系血液細胞としての性質を保持しながら増殖させることが可能であることを見いだした。さらに、ヒトの体内に存在するミエロイド系血液細胞である末梢血中単球の場合も、これらの遺伝子を導入し強制的に発現させることにより、増殖させることが可能であることを見いだした。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
　すなわち、本発明の態様は以下に関する。
（１）　ミエロイド系血液細胞において、
（Ａ）ｃＭＹＣ遺伝子、並びに
（Ｂ）ＢＭＩ１遺伝子、ＥＺＨ２遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＭＤＭ４遺伝子、及びＨＩＦ１Ａ遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子
を強制的に発現させることを含む、増殖能力を有するミエロイド系血液細胞を製造する方法。
（２）　前記ミエロイド系血液細胞に前記遺伝子を導入することにより、該ミエロイド系血液細胞において該遺伝子を強制的に発現させる、（１）に記載の方法。
（３）　前記ミエロイド系血液細胞が、多能性幹細胞に由来する、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）　前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞である、（３）に記載の方法。
（５）　前記人工多能性幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞である、（４）に記載の方法。
（６）　前記ミエロイド系血液細胞が、末梢血単球である、（１）又は（２）に記載の方法。
（７）　前記末梢血単球が、ヒト末梢血単球である、（６）に記載の方法。
（８）　前記ｃＭＹＣ遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＥＺＨ２遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＭＤＭ４遺伝子、及びＨＩＦ１Ａ遺伝子が、それぞれ、ヒトｃＭＹＣ遺伝子、ヒトＢＭＩ１遺伝子、ヒトＥＺＨ２遺伝子、ヒトＭＤＭ２遺伝子、ヒトＭＤＭ４遺伝子、及びヒトＨＩＦ１Ａ遺伝子である、（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）　マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）の存在下で、（１）～（８）のいずれかに記載の方法で製造したミエロイド系血液細胞を培養することを含む、ミエロイド系血液細胞を増殖させる方法。
（１０）　（１）～（９）のいずれかに記載の方法により製造される細胞。
（１１）　（１０）に記載の細胞を樹状細胞様細胞に分化誘導することを含む、樹状細胞様細胞を製造する方法。
（１２）　顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）およびインターロイキン-4（IL-4）を含む培養液を用いて、前記ミエロイド系血液細胞を培養することにより、該ミエロイド系血液細胞を樹状細胞様細胞に分化誘導する、（１１）に記載の方法。
（１３）　（１１）又は（１２）に記載の方法により製造される細胞。
（１４）　（１０）又は（１３）に記載の細胞を含む、細胞医薬。
（１５）　前記細胞医薬は、感染症、腫瘍、アルツハイマー病、プリオン病、アミロイドーシス、白血病、及び／又は自己免疫疾患の治療又は予防に用いるための細胞医薬である、（１４）に記載の細胞医薬。
（１６）　（１０）若しくは（１３）に記載の細胞、又は（１４）に記載の細胞医薬を製造するための、
（Ａ）ｃＭＹＣ遺伝子、並びに
（Ｂ）ＢＭＩ１遺伝子、ＥＺＨ２遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＭＤＭ４遺伝子、及びＨＩＦ１Ａ遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子
の使用。
（１７）　（１４）に記載の細胞医薬を用いて、感染症、腫瘍、アルツハイマー病、プリオン病、アミロイドーシス、白血病、及び／又は自己免疫疾患を治療する方法。
　本発明によれば、細胞ドナーの身体的負荷を伴うことなく、ミエロイド系血液細胞を大量に、かつ、安定して供給することが可能になる。また、本発明により製造したミエロイド系血液細胞は、生体内に存在するマクロファージと同様に微生物などを貪食する活性を有しており、感染症や悪性腫瘍に対する細胞療法を行うための細胞医薬を提供することを可能とする。また、本発明によれば、アルツハイマー病、アミロイドーシス、あるいは、ある種の代謝性疾患など、体内に特定の物質が大量に蓄積することに起因する疾患に対する細胞医薬を提供することも可能となる。さらに、本発明によれば、悪性腫瘍、感染症などに対する細胞ワクチンとして使用可能な樹状細胞様細胞を製造することが可能である。また、本発明によれば、自己免疫疾患や臓器移植に伴う拒絶反応などを治療する目的で免疫応答を制御するための細胞医薬品としての樹状細胞様細胞あるいはマクロファージを製造することが可能になる。さらに、本発明によれば、各種医薬品のミエロイド系血液細胞へ与える影響を検査するための試験・研究において評価細胞として有用なミエロイド系血液細胞を安定的に製造することが可能になる。
図１は、本発明の製造方法を概説する図である。 図２は、ヒトiPS細胞由来のミエロイド系血液細胞(iPS-MC)の顕微鏡写真（位相差レンズ撮影像）である。 図３は、ヒトiPS細胞由来のミエロイド系血液細胞(iPS-MC)のCD４５、CD11b、およびCD33分子の発現をフローサイトメーターにより解析した結果を示す。 図４は、cMYCとBMI1の強制発現により作製したヒトiPS細胞由来のミエロイド系血液細胞ライン(iPS-ML)の顕微鏡写真（位相差レンズ撮影像）である。 図５は、cMYCとBMI1の強制発現により作製したミエロイド系血液細胞ライン(iPS-ML)のCD４５、CD11b、およびCD33分子の発現をフローサイトメーターにより解析した結果を示す。 図６は、ミエロイド系血液細胞ライン（iPS-ML）の増殖に関し、Ｍ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦに対する依存性を調べた結果を示す。 図７は、ミエロイド系血液細胞ライン（iPS-ML）による蛍光色素標識されたザイモザン粒子の貪食を解析した結果を示す。 図８は、ミエロイド系血液細胞ライン（iPS-ML）による蛍光色素標識されたザイモザン粒子の貪食に関し、経時的変化を示す。 図９は、ミエロイド系血液細胞ライン（iPS-ML）に由来する樹状細胞様細胞（ＭＬ－ＤC）の顕微鏡写真である。 図１０は、ミエロイド系血液細胞ライン（iPS-ML）に由来する樹状細胞様細胞（ＭＬ－ＤC）に関し、細胞表面上のHLAクラスII、CD８０、およびCD８６の発現をフローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す。 図１１は、ミエロイド系血液細胞ライン（iPS-ML）、およびそれに由来する樹状細胞様細胞（ＭＬ－ＤC）に関し、アロＴ細胞の増殖応答の誘導活性を調べた結果を示す。 図１２は、cMYCとEZH2の強制発現により作製したヒトiPS細胞由来のミエロイド系血液細胞ライン(iPS-ML) の顕微鏡写真（位相差レンズ撮影像）である。 図１３は、cMYC と EZH2の強制発現により作製したミエロイド系血液細胞ライン（iPS-ML）のCD４５、CD11b、CD33およびCD14分子の発現をフローサイトメーターにより解析した結果を示す。 図１４は、cMYCとMDM2の強制発現により作製したヒトiPS細胞由来のミエロイド系血液細胞ライン(iPS-ML) の顕微鏡写真（位相差レンズ撮影像）である。 図１５は、cMYC と MDM2の強制発現により作製したミエロイド系血液細胞ライン（iPS-ML）のCD４５、CD11b、およびCD33分子の発現をフローサイトメーターにより解析した結果を示す。 図１６は、cMYCとMDM４の強制発現により作製したヒトiPS細胞由来のミエロイド系血液細胞ライン(iPS-ML) の顕微鏡写真（位相差レンズ撮影像）である。 図１７は、cMYC と MDM４の強制発現により作製したミエロイド系血液細胞ライン（iPS-ML）のCD４５、CD11b、およびCD33分子の発現をフローサイトメーターにより解析した結果を示す。 図１８は、cMYCとHIF1Aの強制発現により作製したヒトiPS細胞由来のミエロイド系血液細胞ライン(iPS-ML) の顕微鏡写真（位相差レンズ撮影像）である。 図１９は、cMYCとHIF1Aの強制発現により作製したミエロイド系血液細胞ライン（iPS-ML）のCD４５、CD11b、およびCD33分子の発現をフローサイトメーターにより解析した結果を示す。 図２０は、フィーダー細胞を使用しない分化誘導法により作製した、ヒトiPS細胞に由来するミエロイド系血液細胞(iPS-MC)の顕微鏡写真（位相差レンズ撮影像）である。 図２１は、フィーダー細胞を使用しない分化誘導法により作製した、ヒトiPS細胞に由来するミエロイド系血液細胞(iPS-MC)のCD４５、CD11b、およびCD33分子の発現をフローサイトメーターにより解析した結果を示す。 図２２は、フィーダー細胞を使用しない分化誘導法により作製した、ヒトiPS細胞に由来するiPS-MCに、cMYCとBMI1を強制発現することにより作製したiPS-MLの顕微鏡写真（位相差レンズ撮影像）である。 図２３は、フフィーダー細胞を使用しない分化誘導法により作製した、ヒトiPS細胞に由来するiPS-MCに、cMYCとBMI1を強制発現することにより作製したiPS-MLのCD４５、CD11b、およびCD33分子の発現をフローサイトメーターにより解析した結果を示す。 図２４は、cMYCとBMI1の強制発現により作製したヒト末梢血単球由来のミエロイド系血液細胞ライン(Mo-ML)の顕微鏡写真（位相差レンズ撮影像）である。 図２５は、cMYCとBMI1の強制発現により作製したヒト末梢血単球由来のミエロイド系血液細胞ライン(Mo-ML)のCD４５、CD11b、CD33およびCD14分子の発現をフローサイトメーターにより解析した結果を示す。 図２６は、ヒト末梢血単球由来のミエロイド系血液細胞ライン（Mo-ML）に由来する樹状細胞様細胞（ＭＬ－ＤC）に関し、細胞表面上のHLAクラスII、CD８０、およびCD８６の発現をフローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す。 図２７は、ミエロイド系血液細胞ライン（Mo-ML）、およびそれに由来する樹状細胞様細胞（ＭＬ－ＤC）に関し、アロＴ細胞の増殖応答の誘導活性を調べた結果を示す。 図２８は、cMYCおよびMDM2の強制発現により作製したヒト末梢血単球由来のミエロイド系血液細胞ライン(Mo-ML)の顕微鏡写真（位相差レンズ撮影像）である。 図２９は、cMYCおよびMDM2の強制発現により作製したヒト末梢血単球由来のミエロイド系血液細胞ライン(Mo-ML)のCD４５およびCD11b分子の発現をフローサイトメーターにより解析した結果を示す。 図３０は、cMYC、EZH2、およびMDM2の強制発現により作製したヒト末梢血単球由来のミエロイド系血液細胞ライン(Mo-ML)の顕微鏡写真（位相差レンズ撮影像）である。 図３１は、cMYC、EZH2、およびMDM2の強制発現により作製したヒト末梢血単球由来のミエロイド系血液細胞ライン(Mo-ML)のCD４５およびCD１１b分子の発現をフローサイトメーターにより解析した結果を示す。
　図１に示すように、本発明は、多能性幹細胞に由来するミエロイド系血液細胞、あるいは、生体から直接採取されたミエロイド系血液細胞に対し、CD１１b分子あるいはCD３３分子を発現する細胞として定義されるミエロイド系血液細胞に、生体外において増殖する能力を獲得させることを特徴とする。本発明は、前記細胞に増殖する能力を獲得させるために、該ミエロイド系血液細胞において、（Ａ）ｃＭＹＣ遺伝子、並びに
（Ｂ）ＢＭＩ１遺伝子、ＥＺＨ２遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＭＤＭ４遺伝子、及びＨＩＦ１Ａ遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子を強制的に発現させることを含むことを特徴とする。
本発明において、出発材料となる「ミエロイド系血液細胞」は、CD１１b分子あるいはCD３３分子を発現する細胞として定義され、その由来は特に限定されるものではないが、例えば、多能性幹細胞に由来するミエロイド系血液細胞、あるいは生体（例えば、人体）から採取されたミエロイド系血液細胞（例えば、末梢血単球）が例として挙げられる。
　本発明において、「多能性幹細胞」とは、試験管内などの人工的に構成された条件下（in vitro）で増殖能を持ち、生体を構成する全ての細胞に分化が可能な細胞を言う。本発明では、多能性幹細胞として、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞（誘導多能性幹細胞　iPS細胞）を用いることが好ましく、人工多能性幹細胞を用いることがより好ましい。以下、本発明において用いられる胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞について説明する。
（胚性幹細胞）
　本発明で用いる胚性（ＥＳ）細胞は、哺乳動物由来のＥＳ細胞であればよく、その種類などは特に限定されず、例えば、マウス、サル又はヒト由来のＥＳ細胞などを使用することができる。例えば、ヒトの胚性（ES） 細胞は、ヒトの初期胚から樹立された幹細胞であり、生体内に存在する全ての細胞へ分化できる能力（分化多能性）を維持したまま、長期に渡って生体外で増殖できる細胞である。
（人工多能性幹細胞）
　本発明で用いるiPS細胞とは、体細胞に人為的な操作を加えることにより、胚性幹細胞に類似した分化多能性を獲得させた細胞である。ここで用いる体細胞の種類は特に限定されず、生体を構成する全ての細胞を包含する。
　本発明で言うiPS細胞は、所定の培養条件下（例えば、ＥＳ細胞を培養する条件下）において長期にわたって自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において外胚葉、中胚葉及び内胚葉への多分化能を有する幹細胞のことを言う。また、本発明における人工多能性幹細胞はマウスなどの試験動物に移植した場合にテラトーマを形成する能力を有する幹細胞でもよい。
　体細胞からiPS細胞を製造するためには、まず、少なくとも１種類以上の初期化遺伝子を体細胞に導入する。初期化遺伝子とは、体細胞を初期化してiPS細胞とする作用を有する初期化因子をコードする遺伝子である。初期化遺伝子の組み合わせの具体例としては、以下の組み合わせをあげることができるが、これらに限定されるものではない。
（ｉ）Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子
（ii）Oct遺伝子、Sox遺伝子、NANOG遺伝子、LIN28遺伝子
（iii）Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子、hTERT遺伝子、SV40 large T遺伝子
（iv）Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子
Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子及びMyc遺伝子にはそれぞれ、複数のファミリー遺伝子が含まれている。それぞれのファミリー遺伝子の具体例としては、国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号公報の明細書の第１１頁から第１３頁に記載されているものを用いることができる。具体的には、以下の通りである。
　Oct遺伝子に属する遺伝子の具体例としては、Oct3/4（NM_002701）、Oct1A(NM_002697)、及びOct6(NM_002699)などを挙げることができる（括弧内は、ヒト遺伝子のNCBI accession 番号を示す）。好ましくはOct3/4である。Oct3/4はPOUファミリーに属する転写因子であり、未分化マーカーとして知られており、また多能性維持に関与しているとの報告もある。
　Klf遺伝子に属する遺伝子の具体例としては、Klf1(NM_006563)、Klf2(NM_016270)、Klf4(NM_004235)、及びKlf5(NM_001730)などを挙げることができる（括弧内は、ヒト遺伝子のNCBI accession 番号を示す）。好ましくはKlf4である。Klf4（Kruppel like factor-4）は腫瘍抑制因子として報告されている。
 Sox遺伝子に属する遺伝子の具体例としては、例えば、Sox1(NM_005986)、Sox2(NM_003106)、Sox3(NM_005634)、Sox7(NM_031439)、Sox15(NM_006942)、Sox17(NM_0022454)、及びSox18(NM_018419)を挙げることができる（括弧内は、ヒト遺伝子のNCBI accession 番号を示す）。好ましくはSox2である。Sox2は初期発生過程で発現し、転写因子をコードする遺伝子である。
　Myc遺伝子に属する遺伝子の具体例としては、c-Myc(NM_002467)、N-Myc(NM_005378)、及びL-Myc(NM_005376)などを挙げることができる（括弧内は、ヒト遺伝子のNCBI accession 番号を示す）。好ましくは、c-Myc である。c-Mycは細胞の分化及び増殖に関与する転写制御因子であり、多能性維持に関与しているとの報告がある。
　上記した遺伝子は、ヒトを含む哺乳類動物において共通して存在する遺伝子であり、本発明において任意の哺乳類動物由来（例えばヒト、マウス、ラット、サルなどの哺乳類動物由来）の遺伝子を用いることができる。また、野生型の遺伝子に対して、数個（例えば１～３０個、好ましくは１～２０、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１から３個）の塩基が置換、挿入及び／又は欠失した変異遺伝子であって、野生型の遺伝子と同様の機能を有する遺伝子を使用することもできる。
　本発明では特に好ましくは、初期化遺伝子として、Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、Sox2遺伝子、及びc-Myc遺伝子の組み合わせを用いることができる。
　初期化遺伝子を体細胞に導入する方法は、導入された初期化遺伝子が発現して体細胞の初期化を達成できる限り特に限定されない。例えば、少なくとも１種類以上の初期化遺伝子を含む発現ベクターを用いて該初期化遺伝子を体細胞に導入することができる。ベクターを用いて２種類以上の初期化遺伝子を体細胞に導入する場合には、一つの発現ベクターに２種類以上の初期化遺伝子を組み込んで、該発現ベクターを体細胞に導入してもよいし、１種類の初期化遺伝子を組み込んだ発現ベクターを２種類以上用意して、それらを体細胞に導入してもよい。
　発現ベクターの種類は特に限定されず、ウイルスベクターでもプラスミドベクターでもよいが、誘導多能性幹細胞の作製に使用できるウイルスベクターとしては、レトロウィルスベクター（レンチウィルスベクターを含む）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどを挙げることができる。
　組換えウイルスベクタープラスミドをパッケージング細胞に導入することで組換えウイルスベクターを生産することができる。上記パッケージング細胞への上記ウイルスベクタープラスミドの導入法は、特に限定されず、リン酸カルシウム法、リポフェクション法又はエレクトロポレーション法などの公知の遺伝子導入法で行うことができる。
　ＥＳ細胞の未分化性及び多能性を維持可能な培地は当業界で公知であり、適当な培地を組み合わせて用いることにより、本発明の人工多能性幹細胞を分離及び培養することができる。即ち、本発明の人工多能性幹細胞を培養するための培地としては、ES培地、ES培地に10ng/ml の濃度のFGF-2を添加後にマウス胚性線維芽細胞を24時間培養した上清であるMEF馴化ES培地（以下MEF馴化ES培地）などをあげることができる。本発明の人工多能性幹細胞を培養するための培地には、各種の成長因子、サイトカイン、ホルモンなど（例えば、FGF-2、TGFb-1、アクチビンA、ノギン（Nanoggin）、BDNF、NGF、NT-1、NT-2、NT-3等のヒトES細胞の増殖・維持に関与する成分）を添加してもよい。また、分離された人工多能性幹細胞の分化能及び増殖能は、ES細胞について知られている確認手段を利用することにより確認することができる。
（多能性幹細胞からのミエロイド系血液細胞への分化）
　本発明において、「多能性幹細胞に由来するミエロイド系血液細胞」とは、多能性幹細胞を生体外で培養しつつ分化誘導することにより作製された細胞であり、細胞表面上にミエロイド系血液細胞のマーカー分子であるＣＤ１１ｂあるいはCD３３分子を発現する細胞を言う。ヒト多能性幹細胞をミエロイド系血液細胞へ分化させる方法は、当業界では公知である。例えば、非特許文献６、７、８、９には、ヒトの多能性幹細胞から、ミエロイド系血液細胞である樹状細胞やマクロファージを作製する方法が記載されている。以下、多能性幹細胞をミエロイド系血液細胞へ分化させる方法の例について具体的に説明するが、本発明は、以下の方法による分化誘導により製造された多能性幹細胞由来のミエロイド系血液細胞に限定されるものではない。
(多能性幹細胞からのミエロイド系血液細胞分化誘導法)
　血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞をフィーダー細胞として、多能性幹細胞と、該フィーダー細胞とを共培養することにより、多能性幹細胞を、中胚葉系細胞を含む細胞群に分化させることができる。
「血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞」としては、例えば、ＯＰ９細胞（理研バイオリソースセンター寄託番号：ＲＣＢ１１２４）を用いることができる。
「血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞」は、適切な培地の入った培養容器において、当該フィーダー細胞に応じた培養条件下に培養し、該培養容器の底面をほぼ覆う程度まで増殖させ、マイトマイシンＣ溶液による処理又は放射線照射により細胞増殖を失わせた後に、再度、別途用意した細胞培養容器に移植してフィーダー細胞層を形成させて用いられ得る。このようにして作製したフィーダー細胞上に、上記多能性幹細胞を播種し、共培養を行うことができる。
前記フィーダー細胞の作製、及び共培養に用いられる培地としては、付着性の哺乳動物細胞の培養に適した培地が用いられ、フィーダー細胞の種類などに応じて適宜選択される。例えば、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＩＭＤＭ（イスコブ改変ダルベッコ培地）等が挙げられる。
　前記フィーダー細胞の培養条件としては、フィーダー細胞として用いる細胞の種類などに応じて適宜設定され得る。例えば、ＯＰ９細胞等の場合、０．１重量％ゼラチン溶液等でコーティングされた培養容器上で培養する条件等が挙げられる。
上記共培養の気相条件は、用いられる多能性幹細胞の種類、培養液の組成等に応じて、適宜設定されうるが、例えば、３７℃前後（特に、３７℃）、５体積％ＣＯ2等の条件が挙げられる。
上記共培養により得られる細胞群は、中胚葉系細胞の性質を示すものであり、球状に近い形態を示す細胞の塊を含有する細胞群として得られうる。
多能性幹細胞と、フィーダー細胞との共培養物から、特に、多能性幹細胞に由来し、中胚葉系細胞に分化した細胞を多く含む細胞集団を分離して、後の工程に用いることが好ましい。分化した中胚葉系細胞を分離する方法としては、共培養後に回収した細胞を培養容器中に静置して付着性の強い細胞を除去することにより、付着性の弱い細胞である中胚葉系細胞を回収する方法を挙げることができる。例えば、上記共培養物をトリプシン、コラゲナーゼ等の酵素で処理し、全細胞を回収し、ＤＭＥＭ等の適切な培地適当量で希釈した後、該細胞溶液を新たに用意した培養容器に播種する。播種から２～５時間経過した後、培養容器に付着した細胞を廃棄し、培地中の付着しなかった細胞を中胚葉系細胞を多く含む細胞集団として回収することができる。また、回収した細胞浮遊液に含まれる１００μｍ以上の大きさの細胞塊は、ナイロン製のメッシュ(例えば、ＢＤ．Ｆalcon社、セルストレイナー、１００μｍナイロン)等を用いて除去することが好ましい。
続いて、上記の通り得られた中胚葉系細胞を含む細胞群を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）及び／又はマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）の存在下で培養することにより、該中胚葉系細胞をミエロイド系血液細胞に分化させることができる。中胚葉系細胞を含む細胞群をミエロイド系血液細胞に分化させる際に用いることができる培地、培養条件等は特に限定させるものではないが、上述のフィーダー細胞の培養及び共培養と同様の培地、培養条件等を採用することができる。
培地中の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）の含有量は、中胚葉系細胞のミエロイド系血液細胞への分化を促進させる観点から、５０～２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは７５～１５０ｎｇ／ｍｌの範囲とすることができる。また、培地中のマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）の含有量は、中胚葉系細胞のミエロイド系血液細胞への分化を促進させる観点から、１０～１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２５～７５ｎｇ／ｍｌの範囲とすることができる。
中胚葉系細胞のミエロイド系血液細胞への分化に要する培養期間としては、培養条件等により限定されるものではないが、例えば、１日～２０日、好ましくは２日～１５日程度である。
多能性幹細胞からミエロイド系血液細胞への分化を誘導する培養法としては、非特許文献６あるいは７に記載されているように、フィーダー細胞を用いない方法、あるいは、動物由来の血清を含有しない培養液を用いる方法を使用することも可能である。以下、フィーダー細胞を使用せず、かつ、動物由来の血清を含有しない培養液を使用して、多能性幹細胞をミエロイド系血液細胞へ分化させる方法の一例について、具体的に説明する。なお、フィーダー細胞を用いることなく多能性幹細胞からミエロイド系血液細胞への分化を誘導する培養法としては、非特許文献６あるいは７に記載されているように、ここで説明する方法以外にも知られている。本発明で用いるミエロイド系血液細胞は、いずれかの方法による分化誘導により製造された多能性幹細胞由来のミエロイド系血液細胞に限定されるものではない。
（フィーダー細胞を用いない多能性幹細胞からのミエロイド系血液細胞分化誘導法の例）
フィーダー細胞と非ヒト動物の血清のいずれをも用いずに分化誘導を行う場合、細胞の培養容器への付着を助けるために、フィブロネクチンなどによるコーティングを施した培養容器を用いることができる。培養容器のコーティングに用いるフィブロネクチンは、ヒト血漿から精製したもの、あるいは、遺伝子組換えタンパク質として作製されたヒトフィブロネクチン断片等を用いることが可能である。
非ヒト動物の血清を含まない培養液を用いる場合は、D-MEM（ダルベッコ改変イーグル培地）あるいはα-MEM (アルファ-ミニマムエッセンシャル培地)等にKSR(ライフテクノロジー社製)あるいはPeprogrow III (ぺプロテック社製)等の血清代替添加物を加えたもの、あるいは、市販の無血清培養液（AIM-V、OpTmizer: ライフテクノロジー社 Stemline: シグマ社）を用いることができる。
ヒトのフィブロネクチンをコートした培養容器中で、ヒトの多能性幹細胞を動物由来の血清を含有しない培養液を用いて、15-20日間培養する。また、非ヒト動物の血清を含まない培養液には、多能性幹細胞の分化を促進する目的で、ヒトBMP-4 (Bone Morphogenic Protein 4)を添加する。
分化誘導培養を行うと様々な細胞系譜の分化細胞が出現するが、この中から中胚葉系細胞に分化した細胞を分離して、分離した細胞を、中胚葉系細胞を含む細胞群として後の工程に用いることが好ましい。分化した中胚葉系細胞を分離する方法としては、フィーダー細胞を用いた分化誘導法の場合と同様に、共培養後に回収した細胞を培養容器中に静置して付着細胞を除去することにより、浮遊細胞である中胚葉系細胞を多く含む細胞集団を回収する方法を挙げることができる。
続いて、上記の通り得られた中胚葉系細胞を多く含む細胞群を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）及び／又はマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）の存在下で培養することにより、該中胚葉系細胞をミエロイド系血液細胞に分化させることができる。中胚葉系細胞を含む細胞群をミエロイド系血液細胞に分化させる際に用いることができる培地、培養条件等は特に限定されるものではなく、各種の無血清培養液を使用することができる。
本発明においては、生体内（例えば、ヒトの体内）に存在するミエロイド系血液細胞を用いることも可能である。生体内に存在するミエロイド系血液細胞として、例えば、末梢血中の単球（モノサイト）を用いることも可能であり、ヒトの末梢血単球を用いることが好ましい。以下に、生体内に存在するミエロイド系血液細胞を得る方法の一例としてヒトの末梢血中からの単球の分離方法を説明するが、本発明において用いられるミエロイド系血液細胞を得る方法は、この方法に限定されるものではない。
（ヒト末梢血からの単球の分離）
ヒトの末梢血を採血する。抗凝固剤としては、ヘパリンあるいはクエン酸などを用いる。採血した血液を等量の生理的食塩水、リン酸緩衝生理的食塩水、あるいは、ハンクス緩衝溶液などを用いて希釈する。次に、希釈した血液を、あらかじめ遠心チューブ（BD-Falcon 352070等）中に分注しておいたフィコール液（GE ヘルスケア社）の上に重層する。そして、遠心分離装置を用いて、遠心力５００gで２０分間遠心した後、界面付近に存在する単核細胞分画（リンパ球と単球を含む）を回収する。
単球は、単核細胞中からCD14分子の発現を指標として、磁気ビーズ法などにより分離することができる。例えば、CD１４マイクロビーズ（ミルテ二－社　130-050-201）等を用いることにより分離することが可能である。あるいは、単核細胞分画を、細胞培養用の表面処理がなされた細胞培養容器を用いて6-16時間ほど培養し、容器に付着した細胞を回収することにより、単球あるいはそれに由来するマクロファージを得ることも可能である。通常、健康な成人の末梢血１０mlから、２００,０００-５００,０００個の単球を回収することができる。
（ミエロイド系血液細胞への長期増殖能力の付与）
本発明は、多能性幹細胞由来のミエロイド系血液細胞、あるいは、生体から採取したミエロイド系血液細胞において、ｃＭＹＣ遺伝子、並びにBMI1、EZH2、MDM2、MDM4、及びHIF1A遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子を強制的に発現させることにより、これらの細胞に長期増殖能を付与する。前記遺伝子を強制的に発現させるための方法として、ミエロイド系血液細胞のゲノム上に存在する内在性の遺伝子を強制的に発現させても良いし、あるいは外来の遺伝子を該ミエロイド系血液細胞に導入することにより、これら遺伝子の強制的な発現を行っても良い。遺伝子の効率的かつ高レベルの発現を達成し、ミエロイド系血液細胞に長期増殖能を確実に付与する観点から、遺伝子工学技術を用いて外来遺伝子を該ミエロイド系血液細胞に導入する方法が好ましい。
　本発明において、「増殖能力を有するミエロイド系血液細胞」とは、上記の通り、ミエロイド系血液細胞において上記遺伝子を強制的に発現させることにより長期増殖能が付与されたミエロイド系血液細胞を意味する。本発明の「増殖能力を有するミエロイド系血液細胞」は、上記遺伝子が導入されていない、対照となるミエロイド系血液細胞（つまり、出発材料として用いたミエロイド系血液細胞）と比較して、より長期に渡り増殖することが可能となり、例えば、上記遺伝子を強制的に発現させた時点（上記遺伝子を細胞に導入した時点）から２週間以上増殖することが可能である。
ｃＭＹＣ遺伝子の具体例としては、上記人工多能性幹細胞の調製に用いられる、ヒトのｃＭＹＣ遺伝子（ＮＭ＿００２４６７）を挙げることができる（括弧内は、NCBI accession番号を示す。）。ＢＭＩ１遺伝子、EZH2遺伝子、MDM２遺伝子、MDM4遺伝子、 HIF1A遺伝子の具体例としては、それぞれ、ヒトのＢＭＩ１遺伝子（ＮＭ＿００５１８０）、ヒトのEZH2遺伝子（ＮＭ＿００４４５６）、ヒトのMDM２遺伝子（ＮＭ＿００２３９２）、ヒトのMDM４遺伝子（ＮＭ＿００２３９３）、ヒトのHIF1A遺伝子（ＮＭ＿００１５３０）を挙げることができる（括弧内は、NCBI accession番号を示す。）。
　ｃＭＹＣ遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、EZH2遺伝子、MDM２遺伝子、MDM４遺伝子、及びHIF1A遺伝子は、ヒトを含む哺乳類動物において共通して存在する遺伝子であり、本発明において任意の哺乳類動物由来（例えばヒト、マウス、ラット、サルなどの哺乳類動物由来）の遺伝子を用いることができる。また、野生型の遺伝子に対して、数個（例えば１～３０個、好ましくは１～２０、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１から３個）の塩基が置換、挿入及び／又は欠失した変異遺伝子であって、野生型の遺伝子と同様の機能を有する遺伝子を使用することもできる。また、野生型の遺伝子と同等あるいはそれ以上の機能を有する限りにおいて、該遺伝子の産物が他のタンパク質あるいはペプチドとの融合タンパク質として発現されるように人為的に修飾を加えた遺伝子でも良い。
cMYC、BMI1、EZH2、MDM2、MDM4、あるいはHIF1A遺伝子を上記ミエロイド系血液細胞に導入する方法は、導入されたこれら遺伝子が発現してミエロイド系血液細胞に長期増殖能を付与できる限り、特に限定されるものではない。例えば、導入遺伝子を含む発現ベクターを用いて該遺伝子をミエロイド系血液細胞に導入することができる。また、一つの発現ベクターに複数の遺伝子を組み込んで、該発現ベクターをミエロイド系血液細胞に導入してもよいし、各遺伝子を別々に組み込んだ発現ベクターを用意して、それらをミエロイド系血液細胞に導入してもよい。
　発現ベクターの種類は特に限定されず、ウイルスベクターでもプラスミドベクターでもよいが、好ましくはウイルスベクターであり、特に好ましくは導入した遺伝子がミエロイド系血液細胞の染色体に組み込まれるようなウイルスベクターである。本発明で使用できるウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどを挙げることができる。
　組み換えウイルスベクターを作製するために用いるパッケージング細胞としては、ウイルスのパッケージングに必要なタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つを欠損している組換えウイルスベクタープラスミドの該欠損するタンパク質を補給できる細胞であれば任意の細胞を用いることができる。例えばヒト腎臓由来のHEK293細胞、マウス線維芽細胞NIH3T3に基づくパッケージング細胞を用いることができる。
　組換えウイルスベクタープラスミドをパッケージング細胞に導入することで組換えウイルスベクターを生産することができる。上記パッケージング細胞への上記ウイルスベクタープラスミドの導入法は、特に限定されず、リン酸カルシウム法、リポフェクション法又はエレクトロポレーション法などの公知の遺伝子導入法で行うことができる。さらに、プラスミドを導入したパッケージング細胞の培養上清から、遠心分離法、あるいはウイルス精製用として市販されているカラムを用いる濃縮する方法などにより遺伝子組換えウイルスを濃縮した溶液を回収することができる。
　多能性幹細胞に由来するミエロイド系血液細胞、あるいは、人体から直接採取したミエロイド系血液細胞に対して、培養容器の中で、前記の様に調整した遺伝子組換えウイルスを含む溶液を添加することにより、ウイルスを感染させ、目的とする遺伝子を導入する。
(増殖能力を有するミエロイド系血液細胞の増殖方法)
　上記の通り製造した生体外で増殖する能力を有するミエロイド系血液細胞は、Ｍ－ＣＳＦを含む細胞培養液を用いて培養することができる。培養液中のマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）の含有量は、２５～１００ｎｇ／ｍｌの範囲とすることができる。あるいは、レンチウイルスベクター等を用いてＭ－ＣＳＦ遺伝子をミエロイド系血液細胞自身に導入することによりミエロイド系血液細胞自身にＭ－ＣＳＦを産生させることも可能である。この場合は、M-CSFを添加していない細胞培養液を用いて培養し、増殖させることが可能である。
（ミエロイド系血液細胞からの樹状細胞様細胞への分化）
　本発明の生体外で増殖する能力を有するミエロイド系血液細胞から、樹状細胞様細胞を製造することが可能である。例えば、本発明の長期増殖能を有するミエロイド系血液細胞を、ＧＭ－ＣＳＦ及びインターロイキン４（ＩＬ－４）の存在下で培養することにより、樹状細胞様細胞を製造することができる。培養液中のＧＭ－ＣＳＦの含有量は、５０～２００ｎｇ／ｍｌの範囲、IL-4の含有量は、5～２０ｎｇ／ｍｌの範囲とすることができる。本発明において、「樹状細胞様細胞」とは、形態、細胞表面分子、Ｔ細胞刺激能力という点で単球由来樹状細胞等と類似した性質を有する細胞である。
（細胞医薬）
　本発明のミエロイド系血液細胞は、生体内に存在するマクロファージ等と同様に微生物などを貪食する活性を有しており、感染症や悪性腫瘍に対する免疫細胞療法を行うための細胞医薬を提供することができる。また、本発明のミエロイド系血液細胞は、アルツハイマー病、プリオン病、アミロイドーシス、がん、白血病、或いはある種の代謝性疾患など、体内に特定の物質が大量に蓄積することに起因する疾患等の治療に用いるための細胞医薬を提供することもできる。また、本発明の長期増殖能を有するミエロイド系血液細胞に由来する樹状細胞様細胞は、悪性腫瘍や感染症の治療に用いるための細胞ワクチンとして使用することができる。さらに、本発明のミエロイド系血液細胞に由来する樹状細胞様細胞は、自己免疫疾患や臓器移植に伴う拒絶反応等を治療する目的で、免疫応答の制御に用いるための細胞医薬を提供することができる。
本発明の細胞医薬の製造の際には、本発明の長期増殖能を有するミエロイド系血液細胞、及びそれに由来するミエロイド系血液細胞を安定に保持しうることを目的として、前記したもの以外の助剤、例えば、培地等を適宜用いてもよい。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
実施例1：レンチウイルスベクターの作製
PCR法により初期化因子であるヒトのOCT3/4, SOX2, KLF4,および c-MYCのcDNAを合成し、プラスミドベクター（pENTR-D-TOPO, Gibco-Invitrogen社）へ挿入しクローニングを行った。その後、クローニングを行ったプラスミドDNAの塩基配列をシークエンス解析により確認した。ヒトＢＭＩ１、EZH2、MDM２、MDM４、及びHIF1AのcDNAクローンは、理化学研究所BRC遺伝子材料開発室あるいは製品評価技術基盤機構より入手した。
LR clonase (Gibco-Invitrogen社)を用いて、前記したcDNA断片をレンチウイルスベクター（CSII-EF-RfAl, 理化学研究所　三好浩之博士より分与）へ挿入した。
リポフェクション法（Lipofectamine 2000, Invitrogen社）を用いて、上記で作製したCSII-EFに導入した遺伝子の各々とパッケージングコンストラクト（pCAG-HIVgp,  三好博士より分与）、およびエンベロープおよびRevのコンストラクト（pCMV-VSV-G-RSV-Rev,  三好博士より分与）をパッケージング細胞（ウイルス産生細胞）である293T細胞へ導入した。
293T細胞への遺伝子導入の３日後に、細胞培養液を回収し、0.45μmのフィルターを通した後、遠心分離法（50,000G、２時間）によりウイルス粒子を沈澱させ回収した。回収した組換えウイルス粒子は、DMEM溶液に懸濁した後、凍結チューブに分注し、使用時まで冷凍庫（-８０℃）にて保存した。
実施例２：ヒト人工多能性幹（iPS）細胞の作製
ヒト腹部の皮膚片を採取し、細胞培養用プレート中で培養液（DMEM / 10 % 牛血清）を用いて培養した。培養開始１週間目以降より、皮膚片からの線維芽細胞の遊走と増殖が認められたので、トリプシン/EDTA含有リン酸干渉生理食塩水（トリプシン-EDTA）を用いて、適宜、線維芽細胞を回収し凍結保存した。
凍結保存しておいたヒト線維芽細胞を解凍し、数日間、再度培養した後、培養プレート中において前述のとおり作製し凍結保存しておいたOCT3/4, SOX2, KLF4, およびc-MYCを発現するレンチウイルスベクターを同時に加え、遺伝子導入を行った。
遺伝子導入の4-6日後、トリプシン-EDTAを用いて感染細胞を回収し、事前に準備しておいたマイトマイシンC処理により増殖を停止させたマウス胎児由来線維芽細胞（フィーダー細胞）との共培養を開始した。その翌日より、培養液をヒトES細胞用の培養液に置換し、培養を継続した。
レンチウイルスベクターによる初期化因子の遺伝子の導入から２０-３０日の後、顕微鏡観察の下で、マイクロチップを用いてES細胞様の形態を示すコロニーを人工多能性幹（iPS）細胞クローンとして単離し、別に準備しておいたマウス胎児由来フィーダー細胞との共培養を行った。その後、細胞の増殖に応じて、培養容器を拡大しつつ培養を継続した。
ヒトiPS細胞の維持培養は、ヒト胚性幹細胞用培養液（DMEM-F12(Wako Chemicals)/20% KSR(Gibco-Invitrogen)/bFGF (basic fibroblast growth factor: 10 ng/ml)/2-ME （2-メルカプトエタノール, 50μM））を用いて、マイトマイシンC処理マウス胎児線維芽細胞をフィーダー細胞としてポリスチレン製培養皿にて行った。細胞の増殖に応じて、4-5日に一度、細胞をCTK液（コラゲナーゼ-トリプシン-KSR液、Biochemical and Biophysical Research Communications 345: 926-932, 2006年）を用いて5-10分間処理して回収し、適当な大きさの培養容器へ播種し培養を継続した。
実施例３：ヒト人工多能性幹細胞のミエロイド系血液細胞(iPS-MC)への分化誘導
（１）OP9フィーダー細胞の調整
　マウス由来の培養細胞株OP9をマイトマイシンCにて処理（0.01 mg/ml、60分）したものを、ゼラチンをコートしたディッシュに播種し、翌日以降に使用した。
（２）分化誘導培養
　未分化なiPS細胞を、CTK液を用いて5-10分間処理し、牛胎児(FCS)血清入りのDMEM培養液で回収した。細胞をα-MEM／20%FCSに懸濁し、OP9フィーダー細胞上へ播種し、分化誘導培養を開始した。以降、3日に1度、培養液（α-MEM／20%FCS）を交換しつつ培養を継続した。
　分化誘導開始から18日後、トリプシン-EDTA（エチレンジアミン四酢酸）-コラゲナーゼ液を用いて細胞を処理（37℃ 60分）して解離させて回収し、ピペッティング操作により細胞浮遊液を作製した。そして、直径１０cmのディッシュ1枚に由来する細胞を10 ml のDMEM/10% FCSに懸濁し、フィーダー細胞なし、ゼラチンコートなしの直径１０cmのディッシュ2枚に播種した。2-5時間後、ディッシュに付着しなかった細胞を回収し、100ミクロンのメッシュ（BD Falcon社製 セルストレイナー）を通過させることにより、凝集細胞塊を除いた細胞浮遊液を得た。
メッシュを通過した細胞を、α-MEM / 20%FCS / ヒト GM-CSF (100 ng/ml、ぺプロテック社製) / ヒト M-CSF (50 ng/ml、ぺプロテック社製)に浮遊させ、OP9フィーダー細胞を用いずに、培養を行った。その後、3～9日程度経過すると、浮遊性あるいは弱付着性の細胞が出現し、日を追って細胞数が増加するのが観察された。図２に、このiPS細胞に由来する分化細胞の顕微鏡写真を示す。
　前記の浮遊細胞を回収し、白血球マーカー分子であるCD４５、および、ミエロイド系細胞マーカーであるCD１１bとCD33の発現を検討した。まず、抗体の非特異的な結合を阻害する目的で、Fcレセプターブロック試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて10分間処理した。その後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識-抗ヒトCD45モノクローナル抗体、フィコエリスロシン（PE）標識-抗ヒト/マウスＣＤ１１b抗体、あるいは、PE標識-抗ヒトCD３３抗体を用いて室温中で40分間染色した。また、陰性対照として、同一の蛍光色素で標識したアイソタイプ適合対照抗体を用いて染色した。
　その後、細胞を、ＰＢＳ／２％　ＦＣＳで2回洗浄し、洗浄後の細胞について、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ　ソフトウェアを備えたフローサイトメーター解析装置（商品名：ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて分析した。
　図３に、フローサイトメーター解析により、この細胞の細胞表面に発現する分子を調べた結果を示す。特異的染色のパターンとアイソタイプ適合対照抗体を用いた染色パターンを重ねあわせたヒストグラムを示している。この図に示す結果から、このヒトiPS細胞を分化誘導することによって得られた浮遊細胞が、汎白血球マーカー分子であるCD45を発現していることが分かる。さらに、その多くがミエロイド系血液細胞のマーカー分子であるCD11bあるいはCD33を発現していることが分かる。この、iPS細胞に由来し、ミエロイド系血液細胞のマーカー分子を発現する細胞をiPS-MC（iPS cell-derived myeloid cells：　iPS細胞に由来するエロイド系血液細胞）と命名した。
実施例４：iPS-MCへのcMYCおよびBMI1の導入による長期増殖能力の付与（iPS-MLの作製）
　前項で作製したiPS-MCを２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYCあるいはBMI1を発現するレンチウイルス懸濁液を単独で、あるいは同時に加えることにより、感染させた。遺伝子導入の翌日より、細胞の増殖に応じて培養液を追加しつつ、培養スケールの拡大を行った。培養液としては、継続的に、α-MEM / 20%FCS / ヒト GM-CSF (100 ng/ml) / ヒト M-CSF (50 ng/ml、)を用いた。
cMYCを発現するレンチウイルスのみを感染させた場合には、iPS-MCは倍加時間約２日の速度で増殖した。しかしながら、レンチウイルスを感染させてから約2週間後、増殖を停止した。結果的に、レンチウイルスによるcMYCの強制的発現により、iPS-MCは30倍から100倍程度に増殖した後に増殖を停止した。
cMYCレンチウイルスのみを感染させた後、2週間以上が経過し増殖を停止しているiPS-MCに、さらにcMYCレンチウイルスを感染させてもその後の細胞増殖は観察されなかった。
BMI1のレンチウイルスのみを感染させた場合には、iPS-MCは、ゆっくりと増殖し、２-3倍程度の細胞数となった後、増殖を停止した。
cMYCとBMI1を発現するレンチウイルスを同時に感染させた場合には、iPS-MCはcMYCレンチウイルスのみを感染させた場合よりも速い速度で増殖した。また、cMYCレンチウイルスのみを感染させた場合とは異なり、レンチウイルスを感染させてから2週間目以降も増殖を続けた。このように長期間にわたり増殖する能力を獲得したiPS-MCをiPS-ML(iPS-MC line、iPS cell-derived myeloid cell line、長期増殖能を有するiPS細胞に由来するミエロイド系血液細胞ライン）と名付けた。
増殖するiPS-MLを一定の細胞密度（1 x 105 - 1 x 106 個／ml）を維持しつつ培養を継続した。iPS-MLは、レンチウイルスを感染させた後、４か月間以上にわたって一定の速度(倍加時間2-３日)で増殖を続けた。図４に、iPS-MLの顕微鏡写真を示す。
　図５に、iPS-MLにおける、CD４５、CD１１b、およびCD３３の発現を検討したフローサイトメーター解析の結果を示す。この結果から、iPS-MLは、細胞表面上に白血球マーカー分子であるCD45、さらにミエロイド細胞のマーカー分子であるCD11bおよびCD33を発現していることが確認された。
実施例５：iPS-MLの増殖におけるM-CSFおよびGM-CSFの必要性の検討
cMYCとBMI1を発現するレンチウイルスを感染させた後、２か月間培養を継続した後のiPS-MLを回収し96穴培養プレート（FALSCON 353072）に播種し（5 x 103細胞 / well）培養を行った。そして、培養液中にGM-CSFとM-CSFが含まれている（５０ng/mlあるいは１００ng/ml）場合と含まれていない場合とで増殖の速度を比較した。
96穴培養プレートでの培養開始から48時間後に、3H-メチルチミジンを添加（37 Kbq/well）し、その18時間後にセルハーベスタ（Wallac社）を用いて細胞中の高分子量DNAをガラスフィルターに捕捉した。そして、高分子量DNAへの3H-チミジンの取込みを、シンチレーション計測（Wallac社のマイクロベータシステムを使用）により測定した。高分子量DNAへの3H-チミジンの取込みは、DNA合成の速度すなわち細胞増殖の速度に比例する。
図６にシンチレーション計測の結果を示す。この結果から、iPS-MLの増殖には、培養液中に50 ng/ml程度のM-CSFが含まれていることが必要であることがわかる。一方、GM-CSFは必ずしも必要ではないが、増殖を促進する効果があることがわかる。
実施例６： iPS-MLによる真菌の菌体粒子（ザイモサン）貪食能の解析
一般に、ミエロイド系血液細胞は、細菌や真菌などの微生物を貪食する強い活性を有している。そこで、iPS-MLによる真菌の菌体粒子（ザイモサン）の貪色活性を検討した。維持培養中のiPS-MLをピペッティング操作により培養フラスコから回収し、細胞培養用のコーティングがなされている24穴培養プレート（FALCON 353047）へ播種した（2 x 105/well）。３時間静置しiPS-MLの多くが培養プレートの底面に付着したのを確認した後、FITC標識ザイモサン(Molecular Probe社　Z２８４１)を加えた。さらに３時間が経過した後、蛍光顕微鏡による観察を行った。
図７に顕微鏡写真を示す。左側の明視野画像（位相差レンズにより撮影）に、培養プレートに付着しているiPS-MLが認められる。右側の画像は、左側の画像と同じ視野をFITCが発する蛍光を検出する条件で撮影したものである。この蛍光観察画像では、FITC標識ザイモサン粒子の局在を示すシグナルが、iPS-MLに一致して集積しているのが認められる。この結果から、iPS-MLが、FITC標識ザイモサン粒子を貪食していることが示された。
次に、iPS-MLによるザイモサン粒子貪食の時間経過を観察した。24穴培養プレートに付着しているiPS-MLにFITC標識ザイモサンを加え、一定時間（5, 10, 20, 40,あるいは 80分）が経過した後、トリプシン／EDTAを用いてiPS-MLを回収した。フローサイトメーター解析装置を用いて特異的な蛍光を有する細胞、すなわち、FITC標識ザイモサンを貪食した細胞の割合を解析した。
図８に、フローサイトメーターによる解析の結果を示す。この結果から、時間の経過に従って、ザイモサン粒子を貪食したiPS-MLの頻度が増加することが示された。今回の実験では、ザイモサン粒子を添加してから30分の間に約半数のiPS-MLがザイモサン粒子を貪食していた。
実施例７： iPS-MLの樹状細胞様細胞(ML-DC)への分化誘導
　cMYCを発現するレンチウイルスとBMI1を発現するレンチウイルスを同時に感染させた後、40日経過した後のiPS-MLをGM-CSF(100 ng/ml)とIL-4 (10 ng/ml)の存在下で4日間培養し、樹状細胞様細胞(ML-DC)への分化誘導を行った。さらにTNF(腫瘍壊死因子)-α(10 ng/ml)を添加して2日間培養した時の細胞の形態（位相差顕微鏡写真）を、図９に示す。突起を有する不規則な形態の細胞がクラスターを形成しているのがわかる。
　上記のように作製したML-DCをピペッティング操作により回収し、抗HLAクラスII抗体、抗ヒト80抗体、あるいは抗ヒト86抗体を用いて染色した。あるいは、アイソタイプ適合対照抗体を用いて染色した。その後、細胞を、ＰＢＳ／２％　ＦＣＳで2回洗浄した。洗浄後の細胞について、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ　ソフトウェアを備えたフローサイトメーター解析装置（商品名：ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて分析した。
　図１０に抗体染色後のフローサイトメーター解析の結果を示す。この図では、特異的染色のパターン（実線）とアイソタイプ適合対照抗体を用いた染色パターン（破線）を重ねあわせて示している。この解析の結果からML-DCは、生理的に存在する樹状細胞と同様に、Tリンパ球の活性化に関連するCD80、CD86、およびHLAクラスIIを細胞表面上に発現していることが判明した。
実施例８：ML-DCのT細胞刺激能力の検討
　iPS-MLをGM-CSF(100 ng/ml)とIL-4 (10 ng/ml)の存在下で4日間培養してML-DCを作製し、さらにTNF(腫瘍壊死因子)-α(10 ng/ml)を添加して2日間培養した後、細胞を回収した。この細胞に45 GyのX線を照射して細胞増殖を停止させた後、96穴丸底培養プレート（FALCON 353077）に播種し（1 x 102細胞-1 x 104細胞/well）、刺激細胞とした。TNF-αの添加を行っていないML-DC、あるいは、GM-CSFとIL-4を加えていないiPS-MLも、同様に45GyのX線を照射して細胞増殖を停止させた後、培養プレートに播種し、刺激細胞とした。そして、反応細胞として、アロのドナー由来の末梢血T細胞を加え（5 x 104細胞/well）、培養を行った。末梢血T細胞は、ヒトT細胞分離キット（ミルテ二－バイオテク社　１３０-０９１-１５６）を用いて分離したものを用いた。
培養開始から４日後に3H-メチルチミジンを添加（37 Kbq/well）した。その18時間後にセルハーベスタ（Wallac社）を用いて細胞中の高分子量DNAをガラスフィルターに捕捉した。ガラスフィルターに捕捉された3H-チミジンの放射活性をシンチレーション計測（Wallac社のマイクロベータシステムを使用）により測定することにより、高分子DNA合成の速度、すなわちT細胞の増殖速度を定量化した。
図１１にT細胞増殖応答解析の結果を示す。３種類の刺激細胞（iPS-MLあるいはTNF-α処理を行った、あるいは、行っていないML-DC）のいずれも、アロT細胞を刺激し増殖応答を誘導する活性を有していることが判明した。そして、３種類の刺激細胞のなかでは、TNF-α処理を行ったML-DCが最も強力なT細胞刺激能力を有していることが分かる。以上の結果から、iPS-MLに由来するML-DCが、強力なT細胞刺激能力を有していることが示された。
実施例９：iPS-MCへのcMYCとEZH2の導入によるiPS-MLの作製
　前項で作製したiPS-MCを２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYCとEZH2を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより感染させ、iPS-MLを作製した。図１２に、この細胞の顕微鏡写真を示す。図１３に、フローサイトメーターによりCD45、CD11b、CD33およびCD14の発現を検討した結果を示す。
　　本実施例により得られたiPS-MLは、cMYCのみを導入した細胞よりも速い速度で増殖した。さらに、得られたiPS-ML は、cMYC のみ導入した細胞よりも長期に渡り増殖し、レンチウイルスを感染させてから2週間目以降も増殖を続けた。
実施例１０：iPS-MCへのcMYCとMDM2の導入によるiPS-MLの作製
　前項で作製したiPS-MCを２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYCとMDM2を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより感染させ、iPS-MLを作製した。図１４に、この細胞の顕微鏡写真を示す。図１５に、フローサイトメーターによりCD45、CD11b、およびCD33の発現を検討した結果を示す。
　本実施例により得られたiPS-MLは、cMYCのみを導入した細胞よりも速い速度で増殖した。さらに、得られたiPS-ML は、cMYC のみ導入した細胞よりも長期に渡り増殖し、レンチウイルスを感染させてから2週間目以降も増殖を続けた。
実施例１１：iPS-MCへのcMYCとMDM４の導入によるiPS-MLの作製
　前項で作製したiPS-MCを２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYCとMDM４を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより感染させ、iPS-MLを作製した。図１６に、この細胞の顕微鏡写真を示す。図１７に、フローサイトメーターによりCD45、CD11b、およびCD33の発現を検討した結果を示す。
　本実施例により得られたiPS-MLは、cMYCのみを導入した細胞よりも速い速度で増殖した。さらに、得られたiPS-ML は、cMYC のみ導入した細胞よりも長期に渡り増殖し、レンチウイルスを感染させてから2週間目以降も増殖を続けた。
実施例１２：iPS-MCへのcMYCとHIF1aの導入によるiPS-MLの作製
前項で作製したiPS-MCを２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYCとHIF1aを発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより感染させ、iPS-MLを作製した。図１８に、この細胞の顕微鏡写真を示す。図１９に、フローサイトメーターによりCD45、CD11b、およびCD33の発現を検討した結果を示す。
　　本実施例により得られたiPS-MLは、cMYCのみを導入した細胞よりも速い速度で増殖した。さらに、得られたiPS-ML は、cMYC のみ導入した細胞よりも長期に渡り増殖し、レンチウイルスを感染させてから2週間目以降も増殖を続けた。
実施例１３：フィーダー細胞を用いないヒト人工多能性幹細胞のミエロイド系血液細胞(iPS-MC)への分化誘導およびiPS-MLの作製
　未分化なヒトiPS細胞を、CTK液を用いて回収し、ヒトフィブロネクチンをコートした培養容器中で培養した。培養液は、OpTmizerTM T-Cell Expansion SFM (Life Technoilogies社)とStemline II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium(SIGMA社)を１：１で混合したもの、および、Peprogrow III(Peprotech社)を順次用いた。さらに、培養液には、中胚葉系細胞への分化を促進することを意図して、ヒトBMP-4 (Bone Morphogenic Protein 4)を５ng/mlの濃度で添加した。
培養開始から２５日後、トリプシン-EDTA-コラゲナーゼ液を用いて細胞を処理（37℃ 60分）して解離させて回収し、ピペッティング操作により細胞浮遊液を作製した。そして、直径１０cmのディッシュ1枚に由来する細胞を10 ml のDMEM/10% FCSに懸濁し、フィーダー細胞なし、ゼラチンコートなしの直径１０cmのディッシュ2枚に播種した。2-5時間後、ディッシュに付着しなかった細胞を回収し、100ミクロンのメッシュ（BD Falcon社製 セルストレイナー）を通過させることにより、凝集細胞塊を除いた細胞浮遊液を得た。その後、細胞保存液（セルバンカー　十慈フィールド）を用いて細胞を凍結保存した。
上記で凍結保存しておいた細胞を解凍し、GM-CSF(50ng/ml)およびM-CSF(50ng/ml)を含むα-MEM/20%FCSを用いて培養し１０日間培養した。その結果、浮遊性あるいは付着性の細胞が出現し増殖するのが観察された。図２０に、この細胞の顕微鏡写真を示す。図２１に、フローサイトメーターによりCD45、CD11b、およびCD33の発現を検討した結果を示す。この結果から、細胞表面上に白血球マーカー分子であるCD45、さらにミエロイド系血液細胞のマーカー分子であるCD11bおよびCD33を発現していることが確認された。そこで、このiPS細胞由来の分化細胞もiPS-MCであると判断された。
次に、このiPS-MCを回収し、２４穴培養プレート中で培養した。そこへcMYCとBMI1を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより感染させ、iPS-MLを作製した。図２２に、この細胞の顕微鏡写真を示す。図２３に、フローサイトメーターによりCD45、CD11b、およびCD33の発現を検討した結果を示す。
　本実施例により得られたiPS-MLは、cMYCのみを導入した細胞よりも速い速度で増殖した。さらに、得られたiPS-ML は、cMYC のみ導入した細胞よりも長期に渡り増殖し、レンチウイルスを感染させてから2週間目以降も増殖を続けた。
実施例１4：ヒト末梢血単球へのcMYCおよびBMI1の導入による長期増殖能力の付与（Mo-MLの作製）
少量（0.5ml程度）のヘパリンを吸引した５０mlの注射シリンジを用いて、健常人ドナーより末梢血を５０ml採血した。血液は、５０mlの遠心チューブ２本に２５mlずつ分注し、等量のリン酸緩衝生理的食塩水（PBS）で希釈した。次に、この希釈した血液２５mlを、あらかじめ遠心チューブ（BD-Falcon 352070等）中に分注しておいたフィコール液（GE ヘルスケア社　１７-１４４０-０３）15 mlの上にゆっくりと重層した。そして、遠心分離装置を用いて、遠心力５００gで２０分間遠心した後、界面付近に存在する単核細胞分画（リンパ球と単球を含む細胞集団）を回収した。
回収した単核細胞分画をRPMI-1640培養液により洗浄した後、磁気ビーズ分離用緩衝液（2mMのEDTAおよび２％のFCSを含有するPBS）に浮遊させた。そして、抗ヒトCD１４抗体を結合した磁気マイクロビーズ（ミルテ二－バイオテク社製　130-050-201）を加え、６℃で１５分間静置した。その後、磁気ビーズ分離用緩衝液で洗浄した後、細胞分離用カラム（ミルテ二－バイオテク社製　MSカラム　130-042-201）を用いて、細胞表面にCD１４を発現する細胞、すなわち、単球を分離した。また、同様の方法により分離され研究用として市販されていたヒト末梢血単球（Lonza社　2W-400C）も使用した。
　前項で分離したヒト末梢血単球（CD14陽性細胞）を２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYCを発現するレンチウイルス懸濁液およびBMI1を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより、感染させた。培養液としては、α-MEM / 20%FCS / ヒト GM-CSF (100 ng/ml) / ヒト M-CSF (50 ng/ml、)を用いた。
レンチウイルスを感染させた後、2週間目までは、明らかな細胞増殖は認めなかった。3週間目以降、増殖が観察されたので、細胞の増殖に応じて培養液を追加しつつ、培養スケールの拡大を行った。レンチウイルスを感染させた後、約４０日後の細胞の顕微鏡写真を図２４に示す。また、同時期の細胞を回収し、フローサイトメーターにより、CD45、CD１１b、CD33、およびCD14の発現を調べた結果を図２５に示す。この結果から、cMYCおよびBMI1の導入により長期増殖能力を獲得した単球由来の細胞が、ミエロイド系血液細胞のマーカーを発現していることが確認された。そこで、この細胞をMo-ML(Monocyte-derived myeloid cell line、単球に由来するミエロイド系血液細胞ライン）と名付けた。
実施例１５： Mo-MLの樹状細胞様細胞(ML-DC)への分化誘導
cMYCとBMI1を発現するレンチウイルスを同時に感染させた後、40日経過した後のMo-MLをGM-CSF(100 ng/ml)とIL-4 (10 ng/ml)の存在下で4日間培養し、樹状細胞様細胞(ML-DC)への分化誘導を行った。さらにTNF-α(10 ng/ml)を添加して2日間培養した。
フローサイトメトリーによるML-DCの細胞表面上のマーカー分子の発現の検討を行った。
まず、Fcレセプターブロック試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて10分間処理した。次に、ＦＩＴＣ-抗ヒト80抗体、抗ヒト86抗体、あるいは抗HLAクラスII抗体を用いて室温中で40分間染色した。また、ＦＩＴＣあるいはPEで標識されたアイソタイプ適合対照抗体を用いて染色した。染色した細胞を、ＦＡＣＳｃａｎ(BD社)を用いて解析した。
　図２６に抗体染色後のフローサイトメーター解析の結果を示す。この図では、特異的染色のパターン（実線）とアイソタイプ適合対照抗体を用いた染色パターン（破線）を重ねあわせて示している。この解析の結果からML-DCは、生理的に存在する樹状細胞と同様に、Tリンパ球の活性化に関連するCD80、CD86、およびHLAクラスIIを細胞表面上に発現していることが判明した。
実施例１６：Mo-ML由来のML-DCのT細胞刺激能力の検討
　Mo-MLをGM-CSF(100 ng/ml)とIL-4 (10 ng/ml)の存在下で4日間培養してML-DCを作製し、さらにTNF-α(10 ng/ml)を添加して2日間培養した後、細胞を回収した。この細胞に45 GyのX線を照射して細胞増殖を停止させた後、96穴丸底培養プレート（FALCON 353077）に播種し（1 x 102細胞-1 x 104細胞/well）、刺激細胞とした。TNF-αの添加を行っていないML-DC、あるいは、GM-CSFとIL-4を加えていないMo-MLも、同様に45GyのX線を照射して細胞増殖を停止させた後、培養プレートに播種し、刺激細胞とした。そして、反応細胞として、アロのドナー由来の末梢血T細胞を加え（5 x 104細胞/well）、培養を行った。
培養開始から４日後に3H-メチルチミジンを添加（37 Kbq/well）した。その18時間後にセルハーベスタ（Wallac社）を用いて細胞中の高分子量DNAをガラスフィルターに捕捉した。ガラスフィルターに捕捉された3H-チミジンの放射活性をシンチレーション計測により測定することにより、T細胞の増殖速度を定量化した。
図２７にT細胞増殖応答解析の結果を示す。３種類の刺激細胞（iPS-MLあるいはTNF-α処理を行った、あるいは、行っていないML-DC）のいずれも、アロT細胞を刺激し増殖応答を誘導する活性を有していることが判明した。そして、３種類の刺激細胞のなかでは、TNF-α処理を行ったML-DCが最も強力なT細胞刺激能力を有していることが分かる。以上の結果から、Mo-ML由来のML-DCが、強力なT細胞刺激能力を有していることが示された。
実施例１７：末梢血単球へのcMYCおよびMDM2の導入によるMo-MLの作製
　ヒト末梢血単球（CD14陽性細胞）を２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYCおよびMDM2を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより、感染させた。培養液としては、α-MEM / 20%FCS / ヒト GM-CSF (100 ng/ml) / ヒト M-CSF (50 ng/ml、)を用いた。細胞は、レンチウイルスを感染させた後、3週間目頃よりはっきりとした増殖傾向を示した。図２８に、レンチウイルスを感染させた約１月後の細胞の顕微鏡写真を示す。図２９に、同時期にフローサイトメーターによりCD45、CD11b、CD33およびCD14の発現を検討した結果を示す。
実施例１8：末梢血単球へのcMYC、EZH2およびMDM2の導入によるMo-MLの作製
　ヒト末梢血単球を２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYC、EZH2およびMDM2を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより、感染させた。細胞は、レンチウイルスを感染させた後、3週間目頃よりはっきりとした増殖傾向を示した。図３０に、レンチウイルスを感染させた約１月後の細胞の顕微鏡写真を示す。図３１に、同時期にフローサイトメーターによりCD45、CD11b、CD33およびCD14の発現を検討した結果を示す。

Claims (17)

  1. 　ミエロイド系血液細胞において、
    （Ａ）ｃＭＹＣ遺伝子、並びに
    （Ｂ）ＢＭＩ１遺伝子、ＥＺＨ２遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＭＤＭ４遺伝子、及びＨＩＦ１Ａ遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子
    を強制的に発現させることを含む、増殖能力を有するミエロイド系血液細胞を製造する方法。
  2. 　前記ミエロイド系血液細胞に前記遺伝子を導入することにより、該ミエロイド系血液細胞において該遺伝子を強制的に発現させる、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ミエロイド系血液細胞が、多能性幹細胞に由来する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記人工多能性幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞である、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記ミエロイド系血液細胞が、末梢血単球である、請求項１又は２に記載の方法。
  7. 　前記末梢血単球が、ヒト末梢血単球である、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記ｃＭＹＣ遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＥＺＨ２遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＭＤＭ４遺伝子、及びＨＩＦ１Ａ遺伝子が、それぞれ、ヒトｃＭＹＣ遺伝子、ヒトＢＭＩ１遺伝子、ヒトＥＺＨ２遺伝子、ヒトＭＤＭ２遺伝子、ヒトＭＤＭ４遺伝子、及びヒトＨＩＦ１Ａ遺伝子である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）の存在下で、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法で製造したミエロイド系血液細胞を培養することを含む、ミエロイド系血液細胞を増殖させる方法。
  10. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の方法により製造される細胞。
  11. 　請求項１０に記載の細胞を樹状細胞様細胞に分化誘導することを含む、樹状細胞様細胞を製造する方法。
  12. 　顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）およびインターロイキン-4（IL-4）を含む培養液を用いて、前記ミエロイド系血液細胞を培養することにより、該ミエロイド系血液細胞を樹状細胞様細胞に分化誘導する、請求項１１に記載の方法。
  13. 　請求項１１又は１２に記載の方法により製造される細胞。
  14. 　請求項１０又は１３に記載の細胞を含む、細胞医薬。
  15. 前記細胞医薬は、感染症、腫瘍、アルツハイマー病、プリオン病、アミロイドーシス、白血病、臓器移植に伴う拒絶反応、及び／又は自己免疫疾患の治療又は予防に用いるための細胞医薬である、請求項１４に記載の細胞医薬。
  16. 請求項１０若しくは１３に記載の細胞、又は請求項１４に記載の細胞医薬を製造するための、
    （Ａ）ｃＭＹＣ遺伝子、並びに
    （Ｂ）ＢＭＩ１遺伝子、ＥＺＨ２遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＭＤＭ４遺伝子、及びＨＩＦ１Ａ遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子
    の使用。
  17. 請求項１４に記載の細胞医薬を用いて、感染症、腫瘍、アルツハイマー病、プリオン病、アミロイドーシス、白血病、及び／又は自己免疫疾患を治療する方法。
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