JP6091893B2

JP6091893B2 - 機能的に分化した体細胞の増強された自己再生を誘導するための方法

Info

Publication number: JP6091893B2
Application number: JP2012519002A
Authority: JP
Inventors: ジーヴェーケ，ミヒャエル
Original assignee: Aix Marseille Universite; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Aix Marseille Universite; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2009-07-08
Filing date: 2010-07-08
Publication date: 2017-03-08
Anticipated expiration: 2030-07-08
Also published as: WO2011003988A1; EP2451836A1; SG177552A1; CA2765504A1; US20120156179A1; JP2012532592A; KR20120060201A; JP2016028592A; US9175265B2

Description

発明の分野：
本発明は、細胞におけるＭｙｃファミリー遺伝子およびＫｌｆファミリー遺伝子の発現を活性化する工程、または細胞をＭｙｃファミリータンパク質およびＫｌｆファミリータンパク質と接触させる工程を含む、機能的に分化した体細胞の増強された自己再生を誘導するための方法に関する。

発明の背景：
数年間におよび、再生医療の分野の技術は、幹細胞、特に多能性幹細胞（例えば胚幹細胞およびより最近では人工多能性幹細胞）に焦点が当てられている。なぜならこれらの細胞は、自己再生し、そして複数の特化した細胞型へと分化する能力を有するからである。再生医療の概念は、それ自体では再生できないターゲット組織および／またはターゲット臓器を修復および再生することを目標にして対象の細胞を移植することを含む。なぜなら、心臓組織および神経組織などの大半の組織または臓器は、機能的に分化した体細胞から実質的になり、そして単独では再生できないか、または少なくとも、その自己再生能が非常に低いために効率的に再生できないからである。

実際に、後生動物の生物においての最終分化は一般的に、細胞周期離脱と密接に連関し、一方、多能性幹細胞の未分化状態は、無制限の自己再生に関連している。最終分化した細胞の非増殖状態は、特に、強くてしばしば冗長な機序によって保証され、そして完全に成熟した細胞が周期に再度入ることができる稀な例外を除いて、増殖は依然として一過性であり、そして通常は脱分化を含む。その直接的な前駆体の増殖を刺激する正にそのマイトジェンシグナルに対して、分化した細胞を不応性とするものが何かは依然として不明である。例えば、Ｍ−ＣＳＦに対する骨髄単球性前駆体の増殖応答は、マクロファージへの分化時に消失するが、これらの成熟細胞がサイトカインを感作する能力は続く。結果として、骨髄前駆細胞は、半固体のＭ−ＣＳＦ含有培地中でコロニーを形成するが、血中単球および組織マクロファージは形成しない。

しかしながら、国際特許出願ＷＯ２００８／０８４０６９は、近年、細胞におけるＭａｆＢおよびｃ−Ｍａｆの発現または活性を阻害し；そしてＭ−ＣＳＦなどの少なくとも１つのサイトカインの存在下において細胞を増殖することによって、長期培養中の単球およびマクロファージを生成、維持および増殖するための方法を開示している。

今回、本発明者らは、このような方法が、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４の調節された活性化に依存する機序に基づくことを強調し、そして、驚くべきことにｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４はRowland et al. 2006およびAdhikary et al. 2005に記載のように両方共に発癌遺伝子であるという事実にも関わらず、このようにして得られた長期増殖細胞が腫瘍原性ではないことを実証した。

発明の要約：
それ故、本発明の第１の局面は、細胞におけるＭｙｃファミリー遺伝子およびＫｌｆファミリー遺伝子の発現を活性化する工程を含む、機能的に分化した体細胞の増強された自己再生を誘導するための方法に関する。

本発明の第２の局面は、細胞を、Ｍｙｃファミリータンパク質およびＫｌｆファミリータンパク質と接触させる工程を含む、機能的に分化した体細胞の増強された自己再生を誘導するための方法に関する。

本発明の第３の局面は、機能的に分化した体細胞の増強された自己再生を誘導するための方法において使用するための、Ｍｙｃファミリーメンバー（遺伝子またはタンパク質）およびＫｌｆファミリーメンバー（遺伝子またはタンパク質）の組合せに関する。

本発明はまた、機能的に分化した体細胞の増強された自己再生を誘導するための方法において使用するためのＭｙｃファミリーメンバー（遺伝子またはタンパク質）およびＫｌｆファミリーメンバー（遺伝子またはタンパク質）を含むキットに関する。

本発明はまた、機能的に分化した体細胞の増強された自己再生を誘導するためのＭｙｃファミリー遺伝子またはタンパク質およびＫｌｆファミリー遺伝子またはタンパク質の使用に関する。

本発明はさらに、本発明の方法によって得ることのできる機能的に分化した体細胞の個体群、並びに、このような個体群および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物に関する。

発明の詳細な説明：
従って、本発明者らは、多能性（pluri-potent）または多能性（multi-potent）幹細胞中間体を通ることなく、そして悪性形質転換を伴うことなく、該細胞におけるｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４の発現を活性化することによって機能的に分化した体細胞の増強された自己再生を誘導することによって、大量に前記の機能的に分化した体細胞を得ることが可能であることを実証した。本発明者らは、実際に、前記の機能的に分化した体細胞が、長期培養液中で増殖し得るが、特にマウスへの移植後にもまた非腫瘍原性であることを示した。

それ故、本発明の第１の局面は、細胞におけるＭｙｃファミリー遺伝子およびＫｌｆファミリー遺伝子の発現を活性化する工程を含む、機能的に分化した体細胞の増強された自己再生を誘導するための方法に関する。

特定の態様において、本発明による方法は、細胞におけるＭｙｃファミリー遺伝子およびＫｌｆファミリー遺伝子の発現を活性化する工程を含む、機能的に分化した体細胞の増強された自己再生を誘導するためのin vitroにおける方法である。

本明細書において使用する「Ｍｙｃファミリー遺伝子」という用語は、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−ＭｙｃおよびＳ−Ｍｙｃからなる群より選択される任意の遺伝子を指す。このような遺伝子は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、そして参考文献（Adhikary et al. 2005）に記載された。Ｍｙｃファミリー遺伝子は任意の起源に由来し得るが、典型的には哺乳動物（例えばヒトおよび非ヒト霊長類、またはげっ歯類）のＭｙｃファミリー遺伝子である。特定の態様において、Ｍｙｃファミリー遺伝子は、骨髄球腫症発癌遺伝子とも呼ばれるｃ−Ｍｙｃである。Ｍｙｃファミリー遺伝子のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は当業者にはそれ自体公知であり、そしてＮＣＢＩＧｅｎｂａｎｋで公共的に利用可能である。例えば、天然に存在するヒトｃ−Ｍｙｃ遺伝子は、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿００２４６７に示されるヌクレオチド配列を有し、そして天然に存在するヒトタンパク質は、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＰ＿００２４５８に示されるアミノ酸配列を有する。

本明細書において使用する「Ｋｌｆファミリー遺伝子」という用語は、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ３、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、Ｋｌｆ６、Ｋｌｆ８、Ｋｌｆ９、Ｋｌｆ１０、Ｋｌｆ１１、Ｋｌｆ１２、Ｋｌｆ１３、Ｋｌｆ１４、Ｋｌｆ１５、Ｋｌｆ１６およびＫｌｆ１７からなる群より選択される任意の遺伝子を指す。このような遺伝子は当技術分野におけるその一般的な意味を有する。Ｋｌｆファミリー遺伝子は任意の起源に由来し得るが、典型的には哺乳動物（例えばヒトおよび非ヒト霊長類、またはげっ歯類）のＫｆｌファミリー遺伝子である。特定の態様において、Ｋｌｆファミリー遺伝子は、Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子４とも呼ばれるＫｌｆ４である。Ｋｌｆファミリー遺伝子のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は当業者にはそれ自体公知であり、そしてＮＣＢＩＧｅｎｂａｎｋで公共的に利用可能である。例えば、天然に存在するヒトＫｌｆ４遺伝子は、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿００４２３５に示されるヌクレオチド配列を有し、そして天然に存在するヒトタンパク質はＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＰ＿００４２２６に示されるアミノ酸配列を有する。

本明細書において使用するような、特定の遺伝子（例えばｃ−ＭｙｃまたはＫｌｆ４遺伝子）への言及は、天然（内因性）ポリヌクレオチド配列、特にヒト遺伝子、またはその任意の対立遺伝子または多形変異体、並びに、他の種に見られるオルソロガス配列を有する核酸を含み得る。ポリヌクレオチド変異体は、１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み得る。例えば、遺伝子コードの固有な縮重に因り、実質的に同じまたは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が産生され得、そしてこれらの配列を使用して所与のポリペプチドをクローニングおよび発現させ得る。

当業者によって認識されているように、ポリヌクレオチドは一本鎖（コード鎖またはアンチセンス鎖）または二本鎖であり得、そしてＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。追加のコード配列または非コード配列が、本発明のポリヌクレオチド内に存在していてもよいがその必要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に連結していてもよいがその必要はない。

本明細書において使用する「ＤＮＡ」および「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、特定の種の全ゲノムＤＮＡを含まないように単離されたＤＮＡ分子を指す。それ故、ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、ＤＮＡセグメントが得られた種の全ゲノムＤＮＡから実質的に単離された、またはそれから精製された１つ以上のコード配列を含むＤＮＡセグメントを指す。「ＤＮＡセグメント」および「ポリヌクレオチド」という用語には、ＤＮＡセグメントおよびこのようなセグメントのより小さなフラグメント、並びにまた組換えベクター（例えばプラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、ウイルスなどを含む）が含まれる。

本明細書において使用するような、特定のタンパク質（例えばｃ−ＭｙｃまたはＫｌｆ４タンパク質）への言及は、天然アミノ酸配列、並びに変異体および改変形（その起源または調製様式に関係なく）を有する、ポリペプチドを含み得る。天然アミノ酸配列を有するタンパク質は、天然から得られたのと同じアミノ酸配列を有するタンパク質である（例えば天然に存在するｃ−ＭｙｃまたはＫｌｆ４）。このような天然配列のタンパク質を、天然から単離しても、あるいは標準的な組換えおよび／または合成法を使用して調製してもよい。天然配列のタンパク質は、特に、天然に存在する切断短縮形または可溶形、天然に存在する変異体形、天然に存在する対立遺伝子変異体および形（翻訳後修飾を含む）を包含する。天然配列のタンパク質は、いくつかのアミノ酸残基のグリコシル化、またはリン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化または他の修飾などの翻訳後修飾後のタンパク質を含む。

変異体は、類似したアミノ酸配列を有し、そしてある程度まで、天然タンパク質の１つ以上の活性を保持する、天然配列のタンパク質に対する機能的な等価体であるタンパク質を指す。変異体はまた、活性を保持するフラグメントも含む。変異体はまた、天然配列と実質的に同一である（例えば８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％の配列同一性を有する）タンパク質を含む。このような変異体は、欠失、挿入および／または置換などのアミノ酸変化を有するタンパク質を含む。「欠失」は、関連タンパク質における１つ以上のアミノ酸残基の不在を指す。「挿入」という用語は、関連タンパク質における１つ以上のアミノ酸の付加を指す。「置換」は、ポリペプチドにおける別のアミノ酸残基による１つ以上のアミノ酸残基の置換を指す。典型的には、このような変化は、性質が保存的であるので、変異タンパク質の活性は、実質的に、天然配列のタンパク質と類似している。置換の場合、別のアミノ酸を置換するアミノ酸は、通常、類似した構造的および／または化学的特性を有する。挿入および欠失は、典型的には、１〜５アミノ酸の範囲であるが、挿入の位置に依存して、より多くのアミノ酸を挿入または除去することができる。

特定の態様において、本発明は、細胞におけるｃ−Ｍｙｃ遺伝子およびＫｌｆ４遺伝子の発現を活性化する工程を含む、機能的に分化した体細胞の増強された自己再生を誘導するための方法に関する。

別の特定の態様において、Ｍｙｃファミリー遺伝子はｃ−Ｍｙｃであり、そしてＫｌｆファミリー遺伝子はＫｌｆ２である。

別の特定の態様において、Ｍｙｃファミリー遺伝子はｃ−Ｍｙｃであり、そしてＫｌｆファミリー遺伝子はＫｌｆ５である。

別の特定の態様において、Ｍｙｃファミリー遺伝子はＮ−Ｍｙｃであり、そしてＫｌｆファミリー遺伝子はＫｌｆ４である。

別の特定の態様において、Ｍｙｃファミリー遺伝子はＮ−Ｍｙｃであり、そしてＫｌｆファミリー遺伝子はＫｌｆ２である。

さらに別の特定の態様において、Ｍｙｃファミリー遺伝子はＮ−Ｍｙｃであり、そしてＫｌｆファミリー遺伝子はＫｌｆ５である。

本明細書において使用する「機能的に分化した体細胞」という用語は、特定の機能に特化された細胞（例えばリンパ球、ニューロンまたは筋肉細胞）を指す。大半の組織または臓器は再生できないか、または少なくとも効率的に再生できないことをさらに注記しなければならない。実際に、このような組織または臓器は、生物の生涯におよび自分自身の同一のコピー（自己再生）を作ることができない分化した細胞からなる。従って、本発明の特定の態様において、対象の機能的に分化した細胞は、それ自体で自己再生できないか、または効率的に自己再生できないか、あるいは成体組織幹細胞または前駆細胞からの置換が非常に稀であるかまたは非効率的である細胞である。本発明の機能的に分化した体細胞は、典型的には、例えばヒト、霊長類、ウマ、ウシ、ラクダ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラットまたはマウスなどの哺乳動物起源に由来する。

例えば、機能的に分化した体細胞は、表皮細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、ニューロン（運動ニューロン、特定の神経伝達物質産生ニューロン、例えばドーパミン作動性ニューロンを含む）、グリア細胞、網膜細胞、角膜の水晶体細胞、内耳の有毛細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、内分泌膵細胞（膵β細胞を含む）、肝細胞、内皮細胞、造血細胞（赤血球、リンパ球（Ｂ、ＴおよびＮＫリンパ球を含む）、単球、マクロファージおよび樹状細胞を含む）、筋肉細胞、例えば心筋細胞、骨格筋細胞および他の筋肉細胞、骨芽細胞および破骨細胞からなる群より選択される。これらの例は、制限ではなくむしろ例示的なものである。

１つの態様において、機能的に分化した体細胞は造血細胞である。

特定の態様において、機能的に分化した体細胞は、単球、マクロファージまたは樹状細胞である。

別の特定の態様において、機能的に分化した体細胞はＢおよびＴリンパ球である。

別の特定の態様において、機能的に分化した体細胞は血小板である。

さらに別の特定の態様において、機能的に分化した体細胞は赤血球である。

別の態様において、機能的に分化した体細胞は、心筋細胞、肝細胞および脂肪細胞からなる群より選択される。

発現を活性化するためのＫｌｆファミリー遺伝子を、関連する機能的に分化した体細胞に依存して選択され得ることを注記すべきである。実際に所与の機能的に分化した体細胞は、Pearson et al. 2008に記載のようにＫｆｌ遺伝子に関する特異的な発現を示す。

典型的には、機能的に分化した体細胞が心筋細胞である場合、発現を活性化するためのＫｌｆファミリー遺伝子は、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ５、Ｋｌｆ６、Ｋｌｆ１０、Ｋｌｆ１３およびＫｌｆ１５からなる群より選択され得る。

特定の態様において、機能的に分化した体細胞が心筋細胞である場合、Ｋｌｆファミリー遺伝子は、Haldar et al. 2007に記載のように、Ｋｌｆ５、Ｋｌｆ１０、Ｋｌｆ１３およびＫｌｆ１５からなる群より選択され得る。

典型的には、体細胞が骨格筋細胞である場合、発現を活性化するためのＫｌｆファミリー遺伝子は、Ｋｌｆ６、Ｋｌｆ１３およびＫｌｆ１５からなる群より選択され得る。

典型的には、体細胞が脂肪細胞である場合、発現を活性化するためのＫｌｆファミリー遺伝子は、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ５およびＫｌｆ１５からなる群より選択され得る。

典型的には、体細胞がニューロンである場合、発現を活性化するためのＫｌｆファミリー遺伝子は、Ｋｌｆ６、Ｋｌｆ７およびＫｌｆ９からなる群より選択され得る。

典型的には、体細胞が骨芽細胞である場合、Ｋｌｆファミリー遺伝子はＫｌｆ１０であり得る。

典型的には、体細胞が赤血球細胞である場合、発現を活性化するためのＫｌｆファミリー遺伝子は、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ６およびＫｌｆ１１からなる群より選択され得る。

典型的には、体細胞がＴリンパ球である場合、発現を活性化するためのＫｌｆファミリー遺伝子は、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４およびＫｌｆ１３からなる群より選択され得る。

典型的には、体細胞が肝細胞である場合、Ｋｌｆファミリー遺伝子はＫｌｆ６であり得る。

典型的には、体細胞が内皮細胞である場合、Ｋｌｆファミリー遺伝子はＫｌｆ５であり得る。

典型的には、体細胞がケラチノサイトである場合、Ｋｌｆファミリー遺伝子はＫｌｆ４であり得る。

ＫＬＦメンバーのこの選択は、現在発行されている文献に基づき、そして制限ではなくむしろ例示的なものとして捉えるべきであることをさらに注記すべきである。

１つの態様によると、Ｍｙｃファミリー遺伝子およびＫｌｆファミリー遺伝子をコードする遺伝子材料を、組み込み型または非組み込み型ベクターなどのベクターを使用して、トランスフェクションまたは形質導入によって体細胞に導入することができる。導入後、Ｍｙｃファミリー遺伝子およびＫｌｆファミリー遺伝子をコードするＤＮＡセグメント（群）を、染色体外に（例えばエピソームプラスミド上に）配置し得るか、または細胞染色体（群）中に安定に組み込み得る。本明細書において使用する「ベクター」という用語は、in vitro、in vivoまたはex vivoにおいて、それが連結された別の核酸を宿主細胞中に輸送することのできる核酸分子を指す。このようなベクターは、被験体への投与時に前記ポリペプチドの発現を引き起こすまたは指令するような、プロモーター、エンハンサー、終結因子などの調節エレメントを含み得る。プロモーター領域は、コード配列に対して同種であっても異種であってもよく、そして、in vivoでの使用を含む、任意の適切な宿主細胞における、遍在的、構成的、調節的および／または組織特異的な発現を与える。プロモーターの例としては、細菌プロモーター（Ｔ７、ｐＴＡＣ、Ｔｒｐプロモーターなど）、ウイルスプロモーター（ＬＴＲ、ＴＫ、ＣＭＶ−ＩＥなど）、哺乳動物遺伝子プロモーター（アルブミン、ＰＧＫなど）などが挙げられる。ベクターは、Ｍｙｃファミリー遺伝子またはＫｌｆファミリー遺伝子またはその両方をコードする単一のＤＮＡセグメントを含み得る。ベクターはさらに、１つまたは数個の複製起点を含み得る。ベクターは場合により、ベクターを取り込みそして発現する細胞を同定するための選択マーカーをコードし得る。一例として、ベクターが細胞に抗生物質耐性を付与する場合、抗生物質を培養培地に添加することにより、細胞へのベクターの成功裏の導入を同定することができる。本明細書において使用する「ウイルスベクター」という用語は、核酸分子および／またはペプチドまたは他の分子をターゲット細胞に導入するために使用することのできる改変されたウイルス粒子を指す。

ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えばアデノ随伴ウイルスまたはＡＡＶベクター）、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えばオルソミクソウイルス（例えばインフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば狂犬病および水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば麻疹およびセンダイ）、プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばピコルナウイルスおよびアルファウイルス、並びに二本鎖ＤＮＡウイルス（アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えばヘルペス単純ウイルス１型および２型、エプシュタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えばワクシニア、鶏痘およびカナリアポックス）を含む）が挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血病肉腫ウイルス、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、スプーマウイルスが挙げられる。

このような組換えウイルスは、パッケージング細胞をトランスフェクションすることによって、またはヘルパープラスミドもしくはウイルスを用いての一過性トランスフェクションによってなどの、当技術分野において公知の技術によって産生され得る。本明細書において記載したベクターを、当技術分野において認められた技術を使用して構築および工学操作することにより、療法において使用するためのその安全性を高め、そして適切な発現エレメントおよび対象の遺伝子を含ませることができる。本発明において使用するために適した発現ベクターの構築のための標準的な技術は当業者には周知であり、そしてSambrook J, et al, "Molecular cloning: a laboratory manual," (3rd ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001)などのこのような刊行物に見出すことができ、この刊行物はその全体が示されているかのように参照により本明細書に組み入れられる。

従って、１つの特定の態様において、Ｍｙｃファミリー遺伝子および／またはＭｙｃファミリー遺伝子をコードするベクターを使用する。

１つの特定の態様において、ベクターはウイルスベクターである。

１つの特定の態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。レトロウイルスベクターは、細胞と接触させる前にベクターをビリオン中にパッケージングすることによって形質導入される。

この態様によると、ウイルスベクターは、好ましくは、レンチウイルスベクターである。

別の態様において、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。

別の特定の態様において、ベクターは非ウイルスベクターである。

別の特定の態様において、非ウイルスベクターはエピソームベクターである。

さらに特定の態様において、エピソームベクターはプラスミドである。

「非ウイルス」ベクターへの本明細書における言及は、ベクターが感染性ウイルスをコードすることができないことを示す。従って、このような非ウイルスベクターは、感染性のまたは複製能のあるウイルスを生じるに十分なウイルスゲノムの全てまたは一部をコードしないベクターを指すが、このようなベクターは、１つ以上のウイルスから得られた構造エレメントを含み得る。

両方の導入遺伝子（すなわちＭｙｃファミリー遺伝子およびＫｌｆファミリー遺伝子）を単一ベクター（ウイルス性または非ウイルス性）上に提供し得ることをさらに注記すべきである。

例えば、１つの強力で構成的な転写プロモーターが、両方の導入遺伝子のための転写制御を行ない得、該導入遺伝子は発現カセットとして提供され得る。ベクター上の別々の発現カセットは、別々の強力で構成的なプロモーターの転写制御下にあってもよく、該プロモーターは同じプロモーターのコピーであっても、または別個のプロモーターであってもよい。当技術分野において種々の異種プロモーターが知られており、そしてこれを、導入遺伝子の所望の発現レベルなどの導入遺伝子に依存して使用し得る。

本発明はまた、核酸分子および非ウイルス遺伝子送達ビヒクルを含む、遺伝子送達システムの使用も包含する。非ウイルス遺伝子送達ビヒクルの例としては、リポソームおよびポリマー、例えばポリエチレンイミン、シクロデキストリン、ヒスチジン／リジン（ＨＫ）ポリマーなどが挙げられる。

１つの態様において、Ｍｙｃファミリータンパク質およびＫｌｆファミリータンパク質またはその変異体を、細胞へのタンパク質の送達について知られている任意の手順を用いて、ターゲット細胞に、ex vivoにおいて、培養液中の細胞上もしくは被験体から取り出した細胞上で、またはin vivoにおいて導入し得る。

特定の態様において、本発明による方法は、細胞を、Ｍｙｃファミリータンパク質およびＫｌｆファミリータンパク質と接触させる工程を含む、機能的に分化した体細胞の増強された自己再生を誘導するためのin vitroにおける方法である。

特定の態様において、Ｍｙｃファミリータンパク質はｃ−Ｍｙｃであり、そしてＫｌｆファミリータンパク質はＫｌｆ４である。

以前に記載したように、発現を活性化するためのＫｌｆファミリー遺伝子は、関連する機能的に分化した体細胞に依存して選択され得る。

タンパク質の送達は、タンパク質が細胞形質膜を透過する過程である。伝統的には、細胞中にタンパク質を導入するための方法としては、マイクロインジェクション、電気穿孔法、およびタンパク質薬物送達のためのナノ粒子が挙げられる。

また、細胞中へのタンパク質の送達を媒介する多くのタンパク質透過ドメイン（ＰＴＤ）が開発されている。これらのＰＴＤまたはシグナルペプチド配列は、１５〜３０アミノ酸の天然に存在するポリペプチドであり、これは通常、細胞におけるタンパク質の分泌を媒介する。それらは、正に荷電したアミノ末端、中心の疎水性コア、およびシグナルぺプチダーゼによって認識されるカルボキシ末端開裂部位からなる。このような膜透過ペプチドの例としては、Ｔｒｏｊａｎペプチド、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１転写アクチベーター（ＴＡＴ）タンパク質またはその機能的ドメインペプチド、並びに、ショウジョウバエホメオティック転写因子アンテナペディア（Ａｎｔｐ）および単純ヘルペスウイルスＤＮＡ結合タンパク質、ＶＰ２２などの転移タンパク質に由来するタンパク質透過ドメイン（ＰＴＤ）を含む他のペプチドが挙げられる。いくつかの市販されているペプチド、例えばペネトラチン１、Ｐｅｐ−１（Chariot reagent, Active Motif Inc., CA）およびＨＩＶＧＰ４１フラグメント（５１９〜５４１）をタンパク質の送達のために使用することができる。

近年、対象のタンパク質と複合体を形成し、そして細胞中へのタンパク質の送達を促進することのできる脂質リポソームまたは類似物の使用も実証されている。市販されている製品、例えばBioPORTER (Gene Therapy Systems)またはProVectin (Imgenex, San Diego, Calif.)などを使用することができる。

前記の方法は本発明の範囲を制限せず、そして当業者は、in vivoまたはin vitroにおいて細胞にタンパク質を送達するための任意の他の公知の適切な方法を容易に使用し得ることが理解されるだろう。

あるいは、Ｍｙｃファミリータンパク質およびＫｌｆファミリータンパク質の活性を模倣する生物学的または化学的な化合物を、機能的に分化した体細胞の増強された自己再生を誘導するために使用し得る。特定の態様において、このような生物学的または化学的な化合物は、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４のタンパク質活性を模倣する。

それ故、本発明はまた、細胞を、Ｍｙｃファミリータンパク質を模倣する生物学的または化学的な化合物、およびＫｌｆファミリータンパク質を模倣する生物学的または化学的な化合物と接触させる工程を含む、機能的に分化した体細胞の増強された自己再生を誘導するための方法に関する。

特定の態様において、前記方法は、細胞を、Ｍｙｃファミリータンパク質を模倣する生物学的または化学的な化合物、およびＫｌｆファミリータンパク質を模倣する生物学的または化学的な化合物と接触させる工程を含む、機能的に分化した体細胞の増強された自己再生を誘導するためのin vitroにおける方法である。

従って、ポーロン構造クラスに属する化学的化合物を、Lyssiotis et al. 2010に記載のようにＫｌｆ４の代わりに使用し得る。

１つの態様において、ポーロン構造クラスに属するこのような化学的化合物は、国際特許出願ＷＯ９９／６５９１０に記載され、そして以下の式：

（式中、
Ａは、単結合または二重結合によって右に結合した酸素または硫黄であり；Ｒ２は、水素、アリール、低級脂肪族置換基、特にアルキルおよび低級アルキルエステルからなる群より選択され；Ｒ４〜Ｒ７は、独立して、アルコキシ、アミノ、アシル、脂肪族置換基、特にアルキル、アルケニルおよびアルキニル置換基、脂肪族アルコール、特にアルキルアルコール、脂肪族ニトリル、特にアルキルニトリル、シアノ、ニトロ、カルボキシル、ハロゲン、水素、ヒドロキシル、イミノ、およびα，β不飽和ケトンからなる群より選択され；Ｒ８〜Ｒ１１は、独立して、脂肪族置換基、特にアルキル、アルケニルおよびアルキニル置換基、特に低級脂肪族置換基、脂肪族アルコール、特にアルキルアルコール、アルコキシ、アシル、シアノ、ニトロ、エポキシ、ハロアルキル基、ハロゲン、水素およびヒドロキシルからなる群より選択され；Ｒ１２は、脂肪族基、特に低級アルキル基、脂肪族アルコール、特にアルキルアルコール、カルボン酸および水素からなる群より選択される）
を有する。

特定の態様において、ポーロン構造クラスに属する化学的化合物は、以下の式：

を有する、ケンパウロンすなわち９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［３，２−ｄ］［１］ベンザゼピン−６（５Ｈ）−オンである。

あるいは、フラボンおよびリゼルグアミドなどの他の化学構造の化合物を、Lyssiotis et al. 2010にも記載のように、Ｋｌｆ４の代わりに使用し得る。

従って、別の態様において、フラボン構造クラスに属する化学的化合物をＫｌｆ４の代わりに使用し得る。

特定の態様において、フラボン構造クラスに属する化学的化合物は、以下の式：

を有する７−ヒドロキシフラボンである。

別の態様において、リゼルグアミド構造クラスに属する化学的化合物をＫｌｆ４の代わりに使用し得る。

特定の態様において、リゼルグアミド構造クラスに属する化学的化合物は、以下の式：

を有するリゼルギン酸エチルアミドである。

さらに別の態様において、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化する生物学的または化学的化合物をｃ−Ｍｙｃの代わりに使用し得る。

従って、１つの態様において、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化する化学的化合物はＷｎｔアゴニストであり得る。

特定の態様において、Ｗｎｔアゴニストは、Marson et al. 2009および国際公開公報ＷＯ２００９／０３２１９４に記載のようなタンパク質Ｗｎｔ３ａである。

さらに特定の態様において、Ｗｎｔアゴニストは、以下の式：

（式中、
Ｒ１は水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；Ｒ２はＣ１〜６アルキルおよびＸ１ＮＲ４Ｒ５から選択され；Ｘ１はＣ１〜４アルキレンであり；Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素およびＣ１〜４アルキルから選択されるか；または、Ｒ４およびＲ５はそれら両方が結合している窒素と一緒に、そして場合によりＯ、ＳおよびＮ基から選択された別のヘテロ原子と一緒に、１〜２つのヘテロ原子を含む６員環のヘテロ環を形成するか；あるいは、Ｒ１およびＲ２は、それら両方が結合している窒素と一緒に、そして場合によりＯ、ＳおよびＮ基から選択された別のヘテロ原子と一緒に、１〜２つのヘテロ原子を含む６員環のヘテロ環を形成し；Ｒ１およびＲ２またはＲ４およびＲ５から形成された前記ヘテロ環は、場合により、Ｃ１〜４アルキルで置換されていてもよく；そしてＲ３は、水素、ハロ、Ｃ１〜４アルキル、ハロ置換Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、およびハロ置換Ｃ１〜４アルコキシから選択される）
を有する、Wang et al. 2009および国際特許出願ＷＯ２０１０／０５６９０７に記載のような５−チオフェンピリミジンクラスに属する化学的化合物である。

特定の態様において、５−チオフェンピリミジンクラスに属する化学的化合物は、以下の式：

を有する、２−クロロ−Ｎ−（２−モルホリノエチル）−４−（４−（チオフェン−２−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）ベンズアミドである。

別の特定の態様において、Ｗｎｔアゴニストは、Wang et al. 2009に記載のようなアミノピリジンクラスに属する化学的化合物である。

さらに別の特定の態様において、Ｗｎｔアゴニストは、Wang et al. 2009に記載のようなインディルビン構造クラスに属する化学的化合物である。

従って、インディルビンクラスに属するこのような化学的化合物は、国際特許出願ＷＯ２００５／０４１９５４に記載されている。このような化合物は、インディルビン分子のＣ６位がハロゲンで置換されたインディルビン分子を含む。

特定の態様において、インディルビン構造クラスに属する前記化合物は、以下の式：

を有する６−ブロモインディルビン−３’−オキシム（「ＢＩＯ」）である。

使用し得る他の置換インディルビンは、国際特許出願ＷＯ２００７／０９９４０２に記載のような３’−，７−置換インディルビン、または国際特許出願ＷＯ２０１０／０１３１６８に記載のような３’−，６−置換インディルビンである。

別の態様において、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化する化学的化合物は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤であり得る。

ＧＳＫ３阻害への言及は、１つ以上のＧＳＫ３酵素の阻害を指す。ＧＳＫ３酵素のファミリーは当技術分野において周知である。特定の態様において、ＧＳＫ３−βが阻害される。ＧＳＫ３α阻害剤も適切であり、そして一般的に本発明において使用するための阻害剤は両方を阻害する。多種多様なＧＳＫ３阻害剤が知られており、例えば、阻害剤ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＲ−ＡＯ１４４−１８、ＴＤＺＤ−８、ＳＢ２１６７６３およびＳＢ４１５２８６がある。他の阻害剤も公知であり、そして本発明において有用である。さらに、ＧＳＫ３−βの活性部位の構造が特徴付けられ、そして特異的および非特異的阻害剤と相互作用する重要な残基が同定された（Bertrand et al. 2003）。この構造特徴から、さらなるＧＳＫ阻害剤を容易に同定することができる。

特定の態様において、ＧＳＫ３阻害剤は、以下の式：

を有する６−（２−（４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）エチルアミノ）ニコチノニトリル（ＣＨＩＲ９９０２１）である。

別の特定の態様において、ＧＳＫ３阻害剤は、Zhang et al. 2007に記載のような２，６，９−三置換プリンである。

特定の態様において、２，６，９−三置換プリンは、以下の式：

を有する（Ｓ）−２−（９−（ビフェニル−４−イルメチル）−２−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−イルオキシ）−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）−３−フェニルプロパン−１−オール（ＱＳ１１）である。

別の特定の態様において、ＧＳＫ３阻害剤は、Zhong et al. 2009に記載のようなベンゾ［ｅ］イソインドール−１，３−ジオンである。

特定の態様において、ベンゾ［ｅ］イソインドール−１，３−ジオンは、以下の式：

を有する５−エチル−７，８−ジメトキシ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］−イソキノリン−１，３−（２Ｈ）−ジオン（３Ｆ８）である。

あるいは、Ｍｙｃファミリー遺伝子およびＫｌｆファミリー遺伝子の発現を活性化する生物学的または化学的化合物を、機能的に分化した体細胞の増強された自己再生を誘導するために使用し得る。特定の態様において、このような生物学的または化学的化合物は、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４遺伝子の発現を誘導する。

従って、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）のアクチベーターを使用して、Hall et al. 2009に記載のようにＫｌｆ４の発現を増強し得る。ＳＴＡＴ３のアクチベーターの一例はサイトカイン白血病抑制因子（ＬＩＦ）である。

本発明の別の局面は、機能的に分化した体細胞の増強された自己再生を誘導するためのＭｙｃファミリーメンバー（遺伝子またはタンパク質）およびＫｌｆファミリーメンバー（遺伝子またはタンパク質）の使用に関する。

特定の態様において、Ｍｙｃファミリーメンバーはｃ−Ｍｙｃであり、そしてＫｌｆファミリーメンバーはＫｌｆ４である。

本発明の別の局面は、機能的に分化した体細胞の増強された自己再生を誘導するための方法において使用するための、Ｍｙｃファミリーメンバー（遺伝子またはタンパク質）およびＫｌｆファミリーメンバー（遺伝子またはタンパク質）の組合せに関する。

本発明の別の局面は、機能的に分化した体細胞の増強された自己再生を誘導するための方法において使用するための、Ｍｙｃファミリーメンバー（遺伝子またはタンパク質）およびＫｌｆファミリーメンバー（遺伝子またはタンパク質）を含むキットに関する。

本発明のさらなる目的は、本発明の方法に従って得ることのできる機能的に分化した体細胞の個体群に関する。

本発明のさらなる目的は、本発明の方法に従って得られた機能的に分化した体細胞の個体群に関する。

本発明の方法に従って得られた機能的に分化した体細胞を、in vitroにおいて容易にかつ効果的に生成することができる。in vitroで大量の機能的に分化した体細胞を得る能力は、治療分野のための新たな機会を開拓する。以前に記載したように、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４は両方共に発癌遺伝子であるという事実にも関わらず、前記のin vitroの機能的に分化した体細胞は、移植から６ヶ月後まで分析したところマウスにおいて腫瘍原性ではないことをさらに注記すべきである。

さらに、本発明の機能的に分化した体細胞を、前記細胞が、対象のタンパク質をコードする対象の治療核酸を発現するように、さらに遺伝子工学操作し得る。対象の適切な遺伝子としては成長因子が挙げられる。

例えば、本発明の細胞を遺伝子工学操作して、被験体への遺伝子工学操作された細胞の移植時に有益な遺伝子産物を産生し得る。このような遺伝子産物としては、抗炎症因子、例えば抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−１、抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−２などが挙げられるがそれらに限定されない。

遺伝子病を有する患者からのさらに増幅された機能的に分化した体細胞を、薬学的スクリーニングのために使用して、疾病症状を処置または寛解するのに有用な薬物を同定し得る。

また、本発明の機能的に分化した体細胞をさらに遺伝子工学操作して、これにより前記細胞は再移植前に遺伝子的欠陥を修正し得る。

あるいは、マクロファージなどの本発明の機能的に分化した体細胞を、他の機能的に分化した体細胞へと融合させて、ターゲット細胞における遺伝子的欠陥を修正または治療化合物を送達し得る。

実際に、マクロファージは心筋細胞または肝細胞と融合することが示され、そしてCamargo et al., 2003; Camargo et al., 2004およびWillenbring et al., 2004に記載のようにこれらの細胞における遺伝子的欠陥を修正し得る。例えば、それ故、マクロファージなどの本発明の細胞をまた工学操作して、遺伝子疾患において突然変異している複数のまたは１コピーの正常なまたは過活性の遺伝子の変異体を発現させ得る。例としては、肝臓における酵素欠乏症またはデュシェンヌ型筋ジストロフィーにおけるジストロフィンが挙げられるがそれらに限定されない。

それ故、本発明はまた、移植後にin vivoにおいてターゲット細胞と融合させるための、増幅された機能的に分化した体細胞、特にマクロファージの使用に関する。

特定の態様において、本発明による融合細胞は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患しそして野生型（ＷＴ）ジストロフィンを発現するように遺伝子的に改変された患者から得られたマクロファージと、移植後の同じ患者に由来する骨格筋細胞との融合から生じた細胞である。

従って、本発明は、薬学的に許容される担体または賦形剤と組み合わせた、前記に定義したような機能的に分化した体細胞を含む薬学的組成物を提供する。特定の態様において、本発明の方法は、機能的に分化した体細胞の実質的に均一な個体群を提供する。本明細書において使用する「実質的に均一な個体群」という用語は、細胞の全数の大半（例えば少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％）が、対象の完全に分化した体細胞の特異的な特徴を有する、細胞の個体群を指す。本明細書において使用する「薬学的に許容される担体または賦形剤」という用語は、本発明の機能的に分化した体細胞の生物活性の効力に干渉せず、そして投与される濃度において宿主に対して過度に毒性ではない、担体媒体を指す。適切な薬学的に許容される担体または賦形剤の例としては、水、塩溶液（例えばリンガー液）、アルコール、油、ゼラチン、炭水化物（例えばラクトース、アミラーゼまたはデンプン）、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルプロリンが挙げられるがそれらに限定されない。薬学的組成物は、液体、半液体（例えばゲル）または固体（例えばマトリックス、格子、足場など）として製剤化され得る。所望であれば、薬学的組成物を滅菌し得る。

特定の態様において、薬学的組成物はさらに、少なくとも１つの生物学的に活性な物質または生物活性因子を含み得る。本明細書において使用する「生物学的に活性な物質または生物活性因子」という用語は、本発明の薬学的組成物中におけるその存在が、前記組成物を受ける被験体にとって有益である任意の分子または化合物を指す。当業者によって認められているように、本発明の実施に使用するのに適した生物学的に活性な物質または生物活性因子は、多種多様なファミリーの生物活性分子および化合物に見出され得る。例えば、本発明の脈絡において有用な生物学的に活性な物質または生物活性因子は、抗炎症剤、抗アポトーシス剤、免疫抑制剤または免疫調節剤、抗酸化剤、成長因子、および薬物から選択され得る。

さらに、本発明の機能的に分化した体細胞の個体群は、他の用途も有し得る。これらの用途としては、損傷または病態をモデリングするためのおよび化合物をスクリーニングするための使用が挙げられるがそれらに限定されない。例えば、前記の機能的に分化した体細胞の個体群はまた、多種多様なin vitroおよびin vivo試験のために使用され得る。特に制限するものではないが、それらは、薬学的候補化合物などの化合物の毒性の評価においても用途を見出す。

本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。しかしながら、これらの実施例を、いずれにしても本発明の範囲を制限するものとは解釈すべきではない。

実施例１：ＭＡＦ−ＤＫＯマクロファージおよびＷＴマクロファージの自己再生
以下に報告した結果は科学文献（Aziz et al. 2009）に提示され、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

材料および方法：
マウス：ＭａｆＢおよびｃ−Ｍａｆの欠損は誕生時または誕生後すぐに致命的であるので、本発明者らは、Aziz et al. 2006に記載のように年齢および性別の一致するＬｙ５．１レシピエントを、ｗｔまたはＭａｆ−ＤＫＯＥ１４．５Ｌｙ５．２胎児肝細胞を用いて再構成することによって、Ｍａｆ−ＤＫＯ造血系を有するマウスを作製した。

細胞および培地：Ｍａｆ−ＤＫＯマクロファージを、１０〜５０ng/mlのｒＭ−ＣＳＦ（Preprotec）の補充されたＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ（Invitrogen）または２０％Ｍ−ＣＳＦ含有Ｌ−９２９細胞馴化ＩＭＤＭ／０．５％ＦＣＳ培地（ＬＣＭ）中において２日毎に一部の培地を交換しながら４日毎に継代させた。コロニーアッセイを、１００ng/mlのｒＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３またはＧＭ−ＣＳＦ（Preprotec）の補充されたＭｅｔｈｏｃｕｌｔ−３２３４（Stem Cell Technologies）または完全なサイトカイン混液を含むＭｅｔｈｏｃｕｌｔ−３４３４を使用して実施した。白血球を、ヘパリン処理したミクロキャピラリーでの血液回収および赤血球溶解（ＢＤ）後にLympholyte Mammalian（登録商標）(TeBU-Biotech)を使用して密度勾配遠心分離によって濃縮した。クッパー細胞を、肝細胞懸濁液からＦ４／８０autoMACS（登録商標）によって濃縮した。ＦＡＣＳ抗体染色を、Aziz et al. 2006に記載のようにＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ／２mM ＥＤＴＡ中で行なった。Ｍａｆ−ＤＫＯマクロファージ（１０^７個の細胞/ml）を２．５μMのＣＦＳＥで標識し、その後、致死量以下で照射した（４５０Ｇｙ）Ｌｙ５．１レシピエントに注射した。

アッセイ：細胞周期分析を、３７℃で５μM ＢｒｄＵを用いての細胞培養液または全血の１時間かけての標識後にＢｒｄＵ−フローサイトメトリー（登録商標）（ＢＤ）によって実施した。食作用およびＮＯアッセイをAziz et al. 2006に記載のように、またはＧＦＰを発現するサルモネラＮＰＣＣ１２０２３^２３を用いて実施した。核型分析を、KaryoMAX（登録商標）Colcemid（登録商標）溶液（Invitrogen）およびＤＡＰＩによる中期染色体伸展標本の染色により実施した。ＲＮＡを単離し、そして定量ＲＴ−ＰＣＲアッセイをAziz et al. 2006に記載のように実施した。パラホルムアルデヒドで固定した凍結組織を、抗Ｆ４/８０（Serotec;MCA497A647）または抗Ｍｏｍａ−１（ＢＭＡ；Ｔ−２０２１）／ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ５４６（Invitrogen;S11225）抗体を用いて染色し、そしてZeiss LSM510共焦点顕微鏡で分析した。イムノブロットを、Aziz et al. 2006に記載のように、抗ｃ−Ｍｙｃ（Ｎ−２６２；SantaCruz-764）、抗Ｋｌｆ４（Ｈ−１８０；SantaCruz-20691）および抗βチューブリン−Ｉ（Sigma;T-7816）抗体を使用して実施した。ＦＡＣＳ抗体染色を、記載のように（Aziz et al., 2006）ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ／２mM ＥＤＴＡ中で実施した。細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＦＡＣＳＣａｎｔｏまたはＬＳＲＩＩで分析し、そしてＤＩＶＡ（登録商標）（Becton-Dickinson）またはFlowJo（登録商標）ソフトウェアを使用してＦＡＣＳＡｒｉａで選別した。

ｓｈＲＮＡウイルス：ｓｈＲＮＡ配列を、「ＲＮＡｉ−Ｃｏｄｅｘ」ソフトウェア（http://codex.cshl.edu/scripts/newmain.pl）を使用して決定し、そしてＬＭＰ−ＧＦＰウイルス（Paddison et al., 2004に記載のようなOpen Biosystems）にクローニングした。Ｍａｆ−ＤＫＯマクロファージまたはＮＩＨ３Ｔ３を、ＰｈｏｅｎｉｘＥ細胞（www.stanford.edu/group/nolan）によって産生したウイルスを用いて感染させた。全てのエラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。

結果：
分化した細胞を、４つの転写因子であるＯｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＫＬＦ４およびｃ−Ｍｙｃによって幹細胞へと再プログラム化し、その後者の２つは、ＥＳ細胞自己再生におけるその役割に基づいて、増強された増殖能を付与すると提唱されている。ＫＬＦ４およびｃ−Ｍｙｃはまた、それぞれ単球の分化および増殖を媒介し得るので、本発明者らは、Ｍａｆ−ＤＫＯマクロファージの実証された増強された増殖能におけるその役割を調査した（文書ＷＯ２００８／０８４０６９参照）。本発明者らは、ｗｔ対照と比べて、Ｍａｆ−ＤＫＯマクロファージは、ＫＬＦ４およびｃ−Ｍｙｃの両方の発現の強力なアップレギュレーションを示したが、多能性因子のＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４またはｎａｎｏｇのアップレギュレーションは示さなかったことを観察した。ＫＬＦ４およびｃ−Ｍｙｃは、Ｍ−ＣＳＦ枯渇細胞においてＭ−ＣＳＦによる刺激の２時間以内に高度に発現するようになり、そして、７２時間の観察期間におよび有意により高い発現レベルを維持した。

ｃ−ＭｙｃおよびＫＬＦ４は両方共に、Rowland et al. 2006およびAdhikary et al. 2005に記載のように特定の状況において発癌遺伝子として作用し得る。ｃ−ＭｙｃおよびＫＬＦ−４を過剰発現するＭａｆ−ＤＫＯ単球の増強された増殖能が、腫瘍原性形質転換に関連するかどうかを決定するために、本発明者らは、in vivoにおいてＭａｆＢ／ｃＭａｆ欠損の長期作用を分析した。興味深いことに、Ｍａｆ−ＤＫＯ造血系を有する骨髄キメラは、再構成後の１年間におよび白血病または骨髄増殖疾病の兆候を全く示さなかった。さらに、Ｍａｆ−ＤＫＯマクロファージは、長期のex vivoにおける増殖を通して、正常な数の染色体を保持し、そして注射経路に関係なく、そしてin vivoにおける細胞の***能に関わらず、同系または免疫無防備状態のヌードマウスへの移植時に腫瘍を生じなかった。比較によって、同じ条件下で、マウスマクロファージ細胞株Ｊ７７４．１は、数日間以内に大量の腫瘍を誘導し、そして４週間後までに１００％の死亡率を引き起こした。腫瘍を形成するのではなくむしろ、移植されたＭａｆ−ＤＫＯマクロファージは、複数の組織においてマクロファージの正常な位置へのホーミングを示した。Ｍａｆ−ＤＫＯ細胞は、このように、骨髄、腹膜、脾臓の赤色髄および辺縁帯のマクロファージに、そして肝臓のクッパー細胞へと寄与した。共に、これらの結果は、増殖されたＭａｆ−ＤＫＯ単球は形質転換されないが、in vivoにおける恒常性の制御にかけられ、そして正常な組織構造に組み込まれるマクロファージを生じ得ることを示す。

これらの変化の機能的結果を決定するために、本発明者らは、ＲＮＡおよびタンパク質レベルで内因性およびトランスフェクションされたターゲット遺伝子の両方の発現を特異的に減少させ得る、ＫＬＦ４またはｃ−Ｍｙｃに対して指向されるｓｈＲＮＡレトロウイルスベクターを作製した。全くコードしないかまたは対照ｓｈＲＮＡ配列をコードするＧＦＰ発現レトロウイルスを用いて感染させたＭａｆ−ＤＫＯマクロファージは、ｍｅｔｈｏｃｕｌｔアッセイにおいて、非感染細胞と同じサイズおよび形態のＧＦＰ^＋コロニーを生じた。これに対して、ＫＬＦ４またはｃ−ＭｙｃｓｈＲＮＡのいずれかを発現するＧＦＰ−レトロウイルスを用いて感染させた細胞は、連続的な再播種を通して増殖することのできない、２０個未満の細胞のほんの小さなＧＦＰ^＋細胞クラスターを生じた。同じ播種からの感染していないＧＦＰ⁻コロニーの内部対照は、全ての条件下において同一の形態、発生頻度および再播種挙動を示した。さらに、本発明者らは、ｃ−ＭｙｃおよびＫＬＦ４のレトロウイルス性の過剰発現が、ｗｔマクロファージにおける増強された自己再生能を誘導するのに十分であったが、腫瘍原性形質転換を誘導しなかったことを観察した。ｃ−Ｍｙｃのみの感染マクロファージクローンは、移植されたヌードマウスにおいて多くの腫瘍を誘導し、レシピエントの急速な死亡を引き起こしたが、ｃ−Ｍｙｃ／ＫＬＦ４の感染マクロファージクローンは、ＭａｆＢ／ｃ−Ｍａｆ欠損マクロファージクローンと同じようにそうではなかった。合わせると、これらの結果は、ＫＬＦ−４およびｃ−Ｍｙｃの両方の増加した発現が、マクロファージの増強された増殖能を可能とするのに必要とされかつ十分であることを示した。従って、本発明者らの結果は、完全に分化した細胞の長期増殖が、機能の消失または腫瘍原性形質転換を伴うことなく可能であることを示す。興味深いことに、これは、体細胞を多能性幹細胞（ｉＰＳ）へと再プログラム化し得る一群の転写因子に属する、ｃ−ＭｙｃおよびＫＬＦ４を必要とする。多能性には必要とされないが、ｃ−ＭｙｃおよびＫＬＦ４は、増強された増殖を媒介すると提唱され、そしてＥＳ細胞の自己再生に重要である。Ｍａｆ−ＤＫＯマクロファージの非腫瘍原性は、個々にｃ−ＭｙｃおよびＫＬＦ４の両方がRowland et al. 2006およびAdhikary et al. 2005に記載のように発癌遺伝子として作用し得ることを考えると興味深い。特に、ｃ−Ｍｙｃは、マクロファージを悪性形質転換し得、そしてｉＰＳ由来マウスにおいて腫瘍を誘導し得る。しかしながら、ＫＬＦ４の同時発現は、ｃ−Ｍｙｃのみを発現するマクロファージとは対照的にｃ−ＭｙｃおよびＫＬＦ−４の両方を発現するマクロファージが腫瘍原性でないことが観察されているように、ｃ−Ｍｙｃの腫瘍原性能を阻害するようである。しかしながら、従って、Ｍａｆ−ＤＫＯ細胞におけるｃ−ＭｙｃおよびＫＬＦ４の制御されそして共同のアップレギュレーションは、細胞周期制御における因子の部分的なアンタゴニスト活性の微調整された釣合いを確実にすることによって悪性病変を抑制し得る。共に本発明者らの結果は、完全に分化した細胞の増強された増幅は、多能性（pluri-potent）または多能性（multi-potent）幹細胞中間体を通過することなく、ｃ−ＭｙｃおよびＫＬＦ４の調節された活性化に依存する機序によって達成することができることを示す。これらの所見は、組織再生における細胞療法のための新たな展望を開拓し得る。

実施例２：ＷＴＢリンパ球の自己再生
材料および方法：
細胞および培地：正常な野生型Ｃ５７／Ｂｌ６マウスからの骨髄を、ＩＭＤＭ、４％ＦＢＳ、５０ng/ml ＳＣＦ、５０ng/ml Ｆｌｔ３、１０ng/ml ＩＬ６、１０ng/ml ＩＬ７および１４０μのβ−メルカプトエタノール中で２日間かけて刺激し、そして、トランスフェクションしたｐＮＸｅパッケージング細胞株からの上清との共培養によって、空、ｃ−Ｍｙｃのみ、ＫＬＦ４のみ、またはｃ−ＭｙｃおよびＫＬＦ４の両方を発現するレトロウイルスを用いて感染させ、その後、ＩＬ−７を含むＭｅｔｈｏｃｕｌｔ−３６３０（Stem Cell Technologies）中に１２５，０００個の細胞/mlで播種した。分化から８日後に、半固体培地からの細胞を洗浄し、そしてＩＬ−７を含むＭｅｔｈｏｃｕｌｔ−３６３０中に１００，０００個の細胞/mlで再播種し、そして種々の細胞濃度で連続的に再播種して、出現するコロニーの計測を容易にした。いずれの場合にも、計測および再播種は、インキュベーションから８日後に実施した。

アッセイ：４回目の再播種後、半固体培地からの全細胞を、ＰＢＳ中で繰り返し洗浄することによって洗浄した。ＦＡＣＳ抗体染色を、記載（Aziz et al., 2006）のようにＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ／２mM ＥＤＴＡ中で実施した。細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＦＡＣＳＣａｎｔｏまたはＬＳＲＩＩで分析し、そしてＤＩＶＡ（登録商標）（Becton-Dickinson）またはFlowJo（登録商標）ソフトウェアを使用してＦＡＣＳＡｒｉａで選別した。

結果：
ＫＬＦ−４およびｃ−Ｍｙｃが、他の細胞型における自己再生も誘導し得るかどうかを調べるために、本発明者らは、ｗｔＢ細胞においてＫＬＦ−４およびｃ−Ｍｙｃをレトロウイルスにより発現させた。本発明者らは実際に、ｃ−ＭｙｃおよびＫＬＦ４が、少なくとも４回におよぶＢ細胞の連続的な再播種能を可能としたが、対照ウイルスで感染させた細胞は再播種できなかったことを観察できた。マクロファージと同じように、ｃ−Ｍｙｃのみの感染Ｂ細胞もまた最初はコロニーを生じたが、おそらくｃ−Ｍｙｃにより誘導されるアポトーシスに因り、３回の後には再播種することができず、このことは再度、ｃ−ＭｙｃおよびＫＬＦ４の組合せ作用が、自己再生を可能とするのに必要とされることを示す。

実施例３：赤血球細胞の自己再生
材料および方法：
ＲＯＳＡ２６−ｒｔＴＡヘテロ接合性骨髄からのＭＡＣＳで枯渇させた系統陰性細胞を、ＩＭＤＭ、４％ＦＢＳ、５０ng/ml ＳＣＦ、５０ng/ml Ｆｌｔ３、１０ng/ml ＩＬ１１、１０ng/ml ＩＬ７および１４０μのβ−メルカプトエタノール中で２４時間維持した。その後、細胞を、丸底９６ウェルプレート中で５０，０００個の細胞の密度で接種した。それらを４μg/mlのポリブレンの存在下において２４時間、ＭＯＩ４０で、Ｋｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃのいずれかを発現するドキシサイクリン誘導性ベクターを有する濃縮されたレンチウイルスを用いて感染させた。コロニーアッセイを、ＭｅｔｈｏｃｕｌｔＭ３２３１（Stem cell technology）で２回、１μg/mlのドキシサイクリンおよび５０ng/mlのｒＥＰＯ（Sigma）の存在下において実施して、赤芽球を検出した。

結果：
ＫＬＦ−４およびｃ−Ｍｙｃがまた他の細胞型においても自己再生を誘導し得るかどうかを調べるために、本発明者らはまた、ＲＯＳＡ２６遺伝子座にｒＴＡ−ノックインしたヘテロ接合性骨髄からの造血細胞を、誘導性Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ含有、Ｋｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃのいずれかを発現するドキシサイクリン誘導性ベクター、または対照ベクターを用いて感染させた。先行するデータもまた、ｃ−ＭｙｃおよびＫＬＦ４の組合せ発現がまた、赤血球細胞の増加した増殖を誘導し得ることを示す。

参考文献：
本出願全体を通じて、種々の参考文献は、本発明が属する技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。

Claims

Ｍｙｃファミリー遺伝子及びＫｌｆファミリー遺伝子をコードするウイルスベクターを使用することによってか、またはＭｙｃファミリー遺伝子をコードするウイルスベクター及びＫｌｆファミリー遺伝子をコードするウイルスベクターを使用することによって、細胞におけるＭｙｃファミリー遺伝子およびＫｌｆファミリー遺伝子の発現を活性化する工程を含む、Ｂリンパ球、赤芽球、又はマクロファージの増強された自己再生を誘導するためのin vitroにおける方法であって、Ｍｙｃファミリー遺伝子がｃ−Ｍｙｃであり、Ｋｌｆファミリー遺伝子がＫｌｆ４である、方法。
ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１記載のin vitroにおける方法。
レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項２記載のin vitroにおける方法。
ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１記載のin vitroにおける方法。
Ｂリンパ球、赤芽球、又はマクロファージの増強された自己再生を誘導するための方法において使用するための、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子およびＫｌｆ４遺伝子の組合せ。
Ｂリンパ球、赤芽球、又はマクロファージの増強された自己再生を誘導するための方法において使用するための、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子およびＫｌｆ４遺伝子を含むキット。
Ｂリンパ球、赤芽球、又はマクロファージの増強された自己再生を誘導するためのＭｙｃファミリー遺伝子およびＫｌｆファミリー遺伝子のin vitroにおける使用であって、Ｍｙｃファミリー遺伝子Ｍｙｃファミリー遺伝子が、ｃ−Ｍｙｃであり、Ｋｌｆファミリー遺伝子がＫｌｆ４である、使用。