CN114729321A - 使用人永生化髓样细胞体外评价物质的安全性的方法 - Google Patents
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Abstract
一种体外评价物质安全性的方法，发现了一种通过使用人永生化髓样细胞而更具稳定性、重现性、经济性及操作容易性的方法。一种使用人永生化髓样细胞评价待测物质的皮肤致敏性和/或发热性的方法、检测样品中的皮肤致敏性物质和/或发热性物质的方法、以及评价样品对免疫细胞的功能所产生的作用的方法，本发明的方法包括测定人永生化髓样细胞的培养液中的IL‑6和/或IL‑8的产量的步骤。
Description
相关申请的交叉引用
本国际申请要求基于2019年11月19日向日本专利局申请的日本专利申请第2019-208711号的优先权，日本专利申请第2019-208711号的全部内容通过参考引用在本国际申请中。
技术领域
本发明涉及一种使用人永生化髓样细胞体外评价物质的皮肤致敏性和/或发热性的方法、检测样品中的皮肤致敏性物质和/或发热性物质的方法、以及评价样品对免疫细胞的功能所产生的作用的方法。
背景技术
当提供供人类等饮食或涂抹的产品及物质时，需要预先确认该产品中所含的物质是否安全，是否会引起过敏反应等。
在其测试方法中，例如，作为是否为会诱发过敏等的物质的评价方法，采用了如下方法：例如将该物质对小鼠或豚鼠等实验动物给药或涂布等，观察该实验动物的皮肤上的炎症反应等。另外，作为用于确认食品及化妆品等是否被病毒或菌类等污染的测试，存在利用兔子进行的发热性测试。然而，从保护动物等观点出发，减轻所使用动物的痛苦、及减少所使用动物的数量成为大势所趋，要求向替代方法转变。
迄今为止，作为皮肤致敏性的评价方法，已经建立了利用实验动物进行的豚鼠最大值试验Guinea Pig Maximization Test(GPMT)、佐剂和斑贴试验Adjuvant and PatchTest(A&P)、Buehler Test(BT)、局部***试验Local Lymph Node Assay(LLNA)等。
例如，在GPMT、A&P、BT测试中，将豚鼠用作实验动物，通过数次皮下给药或者封闭贴敷溶解有物质的测试液，使豚鼠致敏，然后再次封闭贴敷测试液，除去该测试液后，观察皮肤反应，对红斑及浮肿进行评分，以评价是否存在皮肤致敏性。
另外，在LLNA测试中，将小鼠用作实验动物，向小鼠的耳廓数次涂布测试液后，静脉给药放射性标记物质(例如，3H-胸腺嘧啶)，测定耳廓的***中标记物质的摄取量，将淋巴细胞增殖是否激活作为指标来评价有无皮肤致敏性。
另外，如上所述，作为发热性测试的评价方法，已经建立了使用兔子进行的测试。预先使用温度传感器测定直肠温度之后，向兔子的耳廓静脉等投予测试液，测定数小时后的体温升高情况，并以升高程度为标准进行判断，以评价是否包含发热性物质。
近年来，以欧州为主，推崇动物保护3R(从实验动物向其它评价方法转变(Replacement)、减少所使用的数量(Reduction)、减轻动物的痛苦(Refinement))，并且，自2009年起，欧州全面禁止化妆品及其原料的动物实验，并制定法律禁止销售曾实施动物实验的产品。因此，近年来，正在开发及报道替代动物实验的评价方法。
例如，皮肤致敏性是指因致敏物质接触或渗透至皮肤而产生的反应。其机理如下：1)物质接触皮肤；2)物质被经皮吸收；3)与蛋白质结合并被树突状细胞吞噬；4)吞噬后的树突状细胞激活，迁移至所属***；5)在所属***中，T细胞接受树突状细胞的抗原提呈，从而激活并增殖。若产生了这些过程，则会产生免疫诱导，若再次接触相同的物质，则会从增殖后的T细胞中释放炎症细胞因子，从而引发过敏性炎症反应(红斑及浮肿)。
基于该机理，开发了体外评价中的替代测试。例如，直接肽反应性测定(DirectPeptide Reactivity Assay，DPRA)是指使用液相色谱测定蛋白质与物质是否容易结合的方法。另外，人细胞系活化试验(h-CLAT)是指，在树突状细胞激活的过程中，使用THP-1细胞，通过流式细胞仪来测定是否表达激活标志物的方法。这些是不使用动物的方法。
h-CLAT是2016年收录在经济合作与发展组织(OECD)的指南中的皮肤致敏性测试替代方法。株式会社资生堂等发现，在皮肤上，作为抗原提呈细胞的朗格汉斯细胞的CD86或CD54、MHC ClassII的细胞表面蛋白量因皮肤致敏性物质而增加，并开发了利用该现象的替代方法。但是，朗格汉斯细胞仅存在于表皮中，而且，显示出朗格汉斯细胞样的树突状细胞也难以稳定供应，因此，建立了利用人单核细胞(THP-1)的替代方法h-CLAT。
与例如LLNA评价相比，作为实验动物替代方法的h-CLAT在评价时不使用动物(小鼠)、测试时间较短等，因此实用性较高。然而，其作为体外评价方法，与所构筑的其它方法例如DPRA相比，操作繁琐，限制较多。例如，必须预先准备THP-1细胞，及预先通过预测试掌握添加浓度，并且，表面标志物测定时使用流式细胞仪。并且，还存在如下课题：必须对阳性对照及介质对照持续测定；及重现性(约80％)不高(非专利文献1)。
另外，还存在如下课题：THP-1细胞中的氧化还原酶细胞色素P450不足，细胞色素P450通过由单核细胞分化而不断激活，在物质通过氧化、还原而显示皮肤致敏性时，则不能检测出来(非专利文献2)。
因此，需要一种与h-CLAT相比能够更简便稳定地体外评价物质的皮肤致敏性的方法。
另外，在发热性测试中，开发了实验动物替代方法。开发了如下方法：可以使用非哺乳动物马蹄蟹的血液来判定是否被革兰氏阴性菌污染；及利用来自人急性单核细胞白血病的Mono-Mac-6细胞及人外周血，通过可能被菌类等污染的标本进行刺激，从而产生IL-6等细胞因子，进而利用这样现象进行测定。
然而，用马蹄蟹的血液仅能够检测革兰氏阴性菌。另外，用Mono-Mac-6的方法的灵敏度比人血低。并且，人外周血虽然能够在体外评价人的状态，但由于利用通过献血等得到的血液，因此难以稳定供应，同时还会产生个体差异。
因此，需要一种用于检测皮肤致敏性物质和/或发热性物质的方法，其利用与人的树突状细胞类似的组织及细胞，能够稳定且大量供应。
另外，免疫细胞通过所释放的细胞因子而发挥功能，目前，尚不存在可以测试药剂及食品等对免疫细胞的直接作用的***。
例如，为了评价食品素材对免疫细胞的功能所产生的作用，具有利用人外周血进行的方法，但由于利用通过献血等得到的血液，因此难以稳定供应，有时还会产生个体差异。
因此，需要一种能够简便稳定地供应且能够评价体外功能性的方法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：皮肤致敏性测试评价报告书JaCVAM皮肤致敏性测试资料编撰委员会
非专利文献2：Takao Ashikaga等，ATLA 38，275-284，2010
发明内容
发明要解决的问题
即，本发明的课题在于，发现一种体外评价物质的皮肤致敏性和/或发热性的方法、检测样品中的皮肤致敏性物质和/或发热性物质的方法、以及样品对免疫细胞的功能所产生的作用的评价方法，这些方法更具有稳定性、重现性、经济性、及操作容易性。
解决问题的方法
本发明的发明人为了摸索到一种提供适合在体外评价皮肤致敏性和/或发热性、检测皮肤致敏性物质和/或发热性物质、及评价对免疫细胞的功能所产生的作用的动物实验替代细胞的方法，使用通过各种方法制备的单核细胞及树突状细胞进行了研究。结果发现，通过使用向来自人脐带血、ES细胞、iPS细胞或骨髄细胞或者外周血的CD14阳性细胞中导入基因而得到的可增殖人单核细胞、及通过分化诱导该单核细胞而得到的具有吞噬能力的细胞(例如，树突状细胞)，能够评价皮肤致敏性和/或发热性、检测皮肤致敏性物质和/或发热性物质、以及评价对免疫细胞的功能所产生的作用，从而完成了本发明。特别是，通过使用这些细胞，1)可以稳定地提供细胞；2)可以提供状态一致的细胞(传代数目、分化状态)；3)可以检测到更接近生物体的反应。评价皮肤致敏性和/或发热性、以及评价对免疫细胞的功能所产生的作用时，着眼于通过添加物质来产生细胞因子(IL-6、IL-8等)，进而，本发明的发明人提供了一种评价皮肤致敏性和/或发热性、以及对免疫细胞的功能所产生的作用的新方法。
并且，本发明将来自人脐带血、ES细胞、iPS细胞或骨髄细胞或者外周血的CD14阳性细胞永生化后使用，从而解决了这些课题。即，通过采用将CD14阳性细胞永生化的方法，可以稳定地得到仅髓样细胞的集落。因此，与现有的细胞相比，可以稳定地提供更接近生物体的髓样细胞，可以认为其为适合安全性评价的细胞。由此，本发明提供一种使用永生化髓样细胞评价皮肤致敏性和/或发热性、及检测皮肤致敏性物质和/或发热性物质等的安全性评价方法。另外，本发明还提供一种使用永生化髓样细胞评价样品对免疫细胞的功能所产生的作用的方法。
具体而言，本发明涉及以下的发明。
(1)一种评价待测物质的皮肤致敏性和/或发热性的方法，包括：测定在待测物质存在下培养人永生化髓样细胞而得到的培养液中的IL-6和/或IL-8的产量的步骤。
(2)根据(1)所述的方法，其中，上述人永生化髓样细胞是人永生化单核细胞或由该人永生化单核细胞制备的树突状细胞。
(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中，培养所述人永生化髓样细胞时，上述待测物质的浓度包括大于0μg/mL且1000μg/mL以下之间的至少三种浓度。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的方法，其中，上述培养时间选自3小时～48小时之间的至少一种。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的方法，其中，所述产量通过免疫测定法测定。
(6)根据(5)所述的方法，其中，上述免疫测定法为ELISA。
(7)根据(1)～(6)中任一项所述的方法，其还包括：当上述产量相对于阴性对照的产量为1.5倍以上时，判定上述待测物质具有皮肤致敏性和/或发热性的步骤。
(8)一种检测样品中的皮肤致敏性物质和/或发热性物质的方法，包括：测定在样品存在下培养人永生化髓样细胞而得到培养液中的IL-6和/或IL-8的产量的步骤。
(9)根据(8)所述的方法，其中，上述人永生化髓样细胞是人永生化单核细胞或由该人永生化单核细胞制备的树突状细胞。
(10)根据(8)或(9)所述的方法，其中，培养上述人永生化髓样细胞时，上述样品的浓度包括至少三种浓度。
(11)根据(8)～(10)中任一项所述的方法，其中，上述培养时间选自3小时～48小时之间的至少一种。
(12)根据(8)～(11)中任一项所述的方法，其中，上述产量通过免疫测定法测定。
(13)根据(12)所述的方法，其中，上述免疫测定法为ELISA。
(14)根据(8)～(13)中任一项所述的方法，其还包括：当上述产量相对于阴性对照的产量增加时，判定上述样品中包含皮肤致敏性物质和/或发热性物质的步骤。
(15)根据(8)～(14)中任一项所述的方法，其中，上述皮肤致敏性物质和/或发热性物质为脂多糖(LPS)和/或金黄色葡萄球菌Cowan 1(SAC)。
(16)一种评价样品对免疫细胞的功能所产生的作用的方法，包括：测定在上述样品的存在下培养人永生化髓样细胞而得到培养液中的细胞因子的产量的步骤。
(17)根据(16)所述的方法，其中，上述人永生化髓样细胞是人永生化单核细胞或由该人永生化单核细胞制备的树突状细胞。
(18)根据(16)或(17)所述的方法，其中，上述细胞因子选自：IL-1a、IL-1b、IL-1ra、IL-2、IL-2Ra、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-12(p40)、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-18、CTACK、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF basic)、G-CSF、GM-CSF、GRO-α、HGF、IFN-α2、IFN-γ、IP-10、LIF、MCP-1(MCAF)、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、MIP-1α、MIP-1β、β-NGF、PDGF-BB、RANTES、SCF、SCGF-β、SDF-1a、TNF-α、TNF-β、TRAIL、及VEGF-A。
(19)根据(16)～(18)中任一项所述的方法，其中，对上述免疫细胞的功能所产生的作用为选自下述作用的功能：增加免疫细胞的细胞因子产量；减少免疫细胞的细胞因子产量；免疫细胞诱导炎症；免疫细胞诱发炎症抑制；免疫细胞诱导免疫激活；免疫细胞诱导免疫抑制；免疫细胞刺激肥大细胞；免疫细胞强化IgE产生；免疫细胞抑制IgE产生；免疫细胞强化IgA产生；免疫细胞使淋巴细胞增殖及激活；免疫细胞增加嗜酸性粒细胞产生；免疫细胞促进白细胞迁移；免疫细胞诱导细胞凋亡；免疫细胞抑制细胞凋亡；免疫细胞增加病毒抗性；免疫细胞促进细胞增殖；免疫细胞诱导血管新生；免疫细胞治癒伤口；免疫细胞促进造血细胞增殖；免疫细胞分化祖细胞；及免疫细胞抑制细胞分化。
(20)根据(16)～(19)中任一项所述的方法，其中，上述培养时间为3～48小时。
(21)根据(16)～(20)中任一项所述的方法，其还包括：当在上述样品存在下培养上述人永生化髓样细胞而得到上述培养液中的上述细胞因子的上述产量相对于在阴性对照存在下培养上述人永生化髓样细胞而得到的培养液中的细胞因子的产量为2倍以上时，判定上述样品具有功能性的步骤。
(22)根据(16)～(21)中任一项所述的方法，其中，上述样品为功能性饮料。
(23)一种用于(16)～(22)中任一项所述的方法的试剂盒，包括人永生化单核细胞或由该人永生化单核细胞制备的树突状细胞。
发明的效果
根据本发明，可以进行与物质的皮肤致敏性及发热性的检测等相关的安全性测试的研究及评价。例如，即使是针对以往通过来自人献血的血细胞材料难以稳定地进行评价及研究的安全性研究及评价，通过使用本发明，也可以更加精密且高灵敏度地进行评价，并且可以进行安全性研究及评价。另外，通过本发明的方法，可以评价药剂的安全性，同时减少误差。并且，通过上述特征，本发明的方法也可以用作安全性评价的筛选方法。另外，通过上述特征，本发明的方法还可以用作样品对免疫细胞的功能所产生的作用的评价方法、及筛选具有对免疫细胞的功能所产生的作用的物质的方法。
附图说明
图1是示出各待测物质的皮肤致敏性和/或发热性评价的结果、及现有的皮肤致敏性评价方法的结果的图。
图2中，图2A和图2B是在各浓度的LPS存在下将iPS-ML2培养6小时和24小时而得到的培养上清液中的IL-6及IL-8的产量通过ELISA测定而得到的曲线图。曲线图的纵轴表示ELISA的测定值，曲线图的横轴表示LPS的浓度。图2C和图2D是在各浓度的SAC存在下将iPS-ML2培养6小时和24小时而得到的培养上清液中的IL-6和IL-8的产量通过ELISA测定而得到的曲线图。曲线图的纵轴表示ELISA的测定值，曲线图的横轴表示SAC的稀释倍率。
图3是在各浓度的功能性饮料存在下将iPS-ML2培养24小时而得到的培养上清液中的IL-6产量通过ELISA测定，并用产量比(Stim.Index)表示而得到的曲线图，其中，产量比是用在各功能性饮料存在下培养后的细胞上清液的测定值除以阴性对照的测定值而得到的值。曲线图的纵轴表示产量比，曲线图的横轴表示功能性饮料的浓度(％)。
发明的具体实施方式
<术语的定义>
本说明书中，“皮肤致敏性”是一种迟发型超敏反应，是指因物质的过度免疫反应导致皮肤产生炎症的现象。
本说明书中，“物质”可以为单原子分子或化合物等。
本说明书中，“发热性物质”是指通过摄入体内而引起体温升高的物质，可列举例如：内毒素、肽聚糖、革兰氏阳性菌的外毒素、病毒、病原性细菌、病原性真菌、脂多糖(LPS)、金黄色葡萄球菌Cowan 1(SAC)等。上述体温升高也可以是由已接种该物质的样品的免疫应答所引起的。
本说明书中，“髓样细胞”被定义为表达CD11b分子或CD33分子的细胞，其来源没有特别限定，具有例如：来自多能干细胞的髓样细胞、或从生物体(例如，外周血)采集的髓样细胞。具体而言，作为髓样细胞，可列举：单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞等。
本说明书中，“待测物质”只要为要评价其皮肤致敏性和/或发热性的物质，则没有特别限定。
本说明书中，“样品”可列举：来自人或动物的体液(例如，血液、泪液、唾液、或尿液)或组织、植物及其提取液、果实及蔬菜等食物及其提取液、加工食品及饮料等食品、肥皂、洗发水、弹力素及护发素、清洁剂、染料、纤维、布、化妆品、药物、化合物、混合物(例如，食品、食品提取物、植物提取物)、大气中的微量物质、尾气、废液、工业废弃物、细胞培养液、培养细胞、细胞培养用培养基、细胞培养用添加物、细胞保存液、保健功能食品、补品等。
本说明书中，“保健功能食品”是指为了保持或增进健康而食用的加工食品及饮料等食品类、包括特定保健用食品、营养功能食品、及功能性显示食品。本说明书中，“功能性”是指有效保持及增进健康(例如，调节体质、提高免疫力、预防疾病等)的性质。本说明书中，“功能性饮料”是指包含具有功能性的成分(例如，乳酸菌)的饮料。
本说明书中，“约”表示±10％的范围。
<永生化单核细胞的制备方法>
在本发明中，作为原料的单核细胞能够通过下述等方法获得：从外周血中采集的方法；由多能干细胞分化诱导的方法；及从成纤维细胞等其它体细胞分化诱导的方法。
当从外周血中采集单核细胞时，公知有分离并制备人外周血中表达CD14分子的细胞的方法。例如，将人外周血用等量的生理盐水、磷酸缓冲生理盐水或Hanks缓冲溶液等平稳地稀释。将稀释后的血液轻轻层叠在离心管中的Ficoll(注册商标)(GE Health Care公司)上，在15～30℃下，按照500～1000×G离心分离20分钟。回收微黄色的血浆和透明的Ficoll的中间的白色带状层作为由淋巴细胞及单核细胞构成的外周血单核细胞(PBMC)组分。回收的外周血单核细胞组分可以根据需要进一步清洗后使用。可以从回收的PBMC组分中进一步回收表达CD14分子的细胞，从而得到单核细胞。例如，使抗CD14抗体所结合的固相与PBMC接触，以使单核细胞结合于该固相，并清洗除去非结合的细胞，由此能够分离回收单核细胞。例如，已知有使用磁珠作为上述固相的方法等(Dynabeads(注册商标)CD14(ThermoFisher Scientific Inc.)等)。另外，也可以不从外周血中分离PBMC，而直接使外周血与抗CD14抗体所结合的固相接触，由此获得单核细胞。
当由多能性细胞分化获得单核细胞时，从多能性细胞诱导单核细胞的方法是公知的。本说明书中，“多能干细胞”表示具有多能性及自我复制能力的细胞。本说明书中，“多能性”与多潜能性含义相同，表示可以通过分化而分化为多种***的细胞的细胞状态。本说明书中的多能性包括：可以分化为构成生物体的全部种类的细胞的状态(分化全能性(totipotency))、可以分化为除胚外组织之外的全部种类的细胞的状态(分化万能性(pluripotency))、可以分化为属于细胞谱系的一部的细胞的状态(分化多能性(multipotency))、及可以分化为一种细胞的状态(分化单能性(unipotency))。由此，本说明书中的“多能干细胞”包括干细胞、胚胎干(ES)细胞、来自通过细胞核移植得到的克隆胚胎的胚胎干细胞(“ntES细胞”)、生殖干细胞(“GS细胞”)、胚胎生殖细胞(“EG细胞”)、及诱导多能干(iPS)细胞、及造血干细胞。就某一细胞是否为多能干细胞而言，例如，当待测细胞在体外培养***中形成拟胚体(embryoid body)时、或在分化诱导条件下培养(分化处理)后分化为所需的细胞时，则能够判定该细胞为多能干细胞。获取多能干细胞的方法是公知的，报道有例如：通过向体细胞中导入三种以上初始化基因(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Esrrb、Glis1、E-cadherin、shp53、UTX及H1foo等)来得到iPS细胞。
作为从多能干细胞向单核细胞的分化诱导，能够通过使例如巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白细胞介素3(IL-3)(参照Fernadndo O.Mar tinez等，ExperimentalHematology(2008)；36：1167-1175)或者IFN-γ或PMA(Annabelle Grolleau等，J Immunol1999；162：3491-3497)与多能干细胞接触来进行。根据需要，可以通过上述的方法从经分化诱导的单核细胞中仅回收并精制表达CD14的细胞。
作为从成纤维细胞等其它体细胞中分化诱导单核细胞的方法，可列举：TakahiroSuzuki等，“Reconstruction of Monocyte Transcriptional Regulatory NetworkAccompanies Monocytic Functions in Human Fibroblasts.”PLoS One(2012)doi：10.1371/journal.pone.0033474中所述的方法。
针对得到的单核细胞，通过向其中导入选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因、及LYL1基因中的至少一个基因、及cMYC基因，可以在保持单核细胞的功能的同时，附加增殖能力。优选选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、及HIF1A基因中的至少一个基因和cMYC基因的组合；或者BMI1基因、BCL2基因或LYL1基因及cMYC基因的组合。可以参考WO2012/043651及日本特开2017-131136号的记载来向单核细胞导入这些基因。例如，可以通过用搭载有这些基因的慢病毒载体感染单核细胞来导入这些基因。
<树突状细胞的制备方法>
可以根据现有报道(Francoise Chapuis等，Eur J Immunol.(1997)27(2)：431-41.；Marc Dauer等，J Immunol(2003)170(8)：4069-4076.；Figdor CG等，Nat Med.(2004)10(5)：475-80；Helmut Jonuleit等，Eur J Immunol.(1997)27(12)：3135-42)，在例如200IU/ml的GM-CSF及200IU/ml的IL-4存在下培养单核细胞，从而从永生化单核细胞中诱导树突状细胞。
<使用永生化单核细胞或树突状细胞评价物质的皮肤致敏性和/或发热性>
按照下面所示的步骤，使用永生化单核细胞或树突状细胞评价物质的皮肤致敏性和/或发热性。
第一步骤中，准备用于评价的细胞。作为用于评价的细胞，已知有上述永生化单核细胞或树突状细胞。作为进行评价时和/或评价前后用于培养的培养基，可列举例如：IMDM溶液、RPMI溶液、α-MEM溶液、MEM培养基、DMEM溶液。另外，作为添加物，可以包含：人或牛血浆蛋白质组分、胎牛血清或人血清、葡萄糖、D-甘露醇等糖类、氨基酸、腺嘌呤等核酸碱基、磷酸氢钠、α-生育酚、亚油酸、胆固醇、***钠、人全铁转铁蛋白、人胰岛素、乙醇胺、2-巯基乙醇、G-CSF、GM-CSF、碳酸氢钠、甲基纤维素等。另外，还可以根据需要添加庆大霉素、氨苄青霉素、青霉素、链霉素等抗生素；无机盐类；HEPES，磷酸缓冲剂、乙酸缓冲剂等缓冲剂。作为具体的例子，能够使用：添加有非必需氨基酸的α-MEM(10％胎牛血清)培养基、向α-MEM中添加有2或5％HPL(Human platelet lysate(人血小板裂解物)，来自人血小板的补充剂)的培养液、或向包含次黄嘌呤、HEPES(SIGMA公司)的RPMI1640培养基(SIGMA公司)中添加有10％胎牛血清、碳酸氢钠、100unit/mL青霉素、100mg/mL的链霉素的培养基来进行。
将永生化单核细胞或树突状细胞接种于上述的培养基，并进行规定次数的细胞传代。传代次数例如可以为1次，也可以为2次、3次、4次或5次以上。并且，将传代后的细胞清洗规定次数(例如，2次、3次或4次以上)，使用进行评价时所用的培养基，调节为规定的浓度后进行评价。需要说明的是，细胞的浓度可以按照后述的免疫测定法的流程来设置。
第二步骤中，在待测物质存在下，培养上述永生化单核细胞或树突状细胞。待测物质用溶解液溶解后用于评价。作为溶解待测物质的溶解液，可以使用乙醇、DMSO、水、PBS等。另外，将待测物质稀释，以按照预设的最终浓度与细胞接触，并用于评价。预设的最终浓度被调节为大于0μg/mL且1000μg/mL以下之间的一种以上、优选为至少三种浓度。需要说明的是，调节至的浓度可以为三种，也可也为四种，还可以为五种，还可以为六种以上。待测物质可以使用上述培养基进行稀释。
作为永生化单核细胞或树突状细胞的培养时间，可以设置为一种时间，也可以设置为两种时间。另外，还可以设置为三种以上时间。例如，培养时间可以设置选自3～48小时、优选6～24小时之间的任意的时间。另外，培养时的温度可以为约37℃，培养时的二氧化碳浓度可以为约5％。
第三步骤中，测定培养后的永生化单核细胞或树突状细胞的培养液中的IL-6和/或IL-8。需要说明的是，作为培养液，可列举例如培养上清液。可以使用公知的免疫测定法来进行该测定。免疫测定法可以为例如ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，酶联免疫吸附测定)、免疫层析法、放射免疫分析法或蛋白质印迹。另外，这些免疫测定可以使用市售的试剂盒来进行。
基于所测得的IL-6和/或IL-8的产量来判定待测物质是否具有皮肤致敏性和/或发热性。具体而言，当在待测物质存在下培养任意时间而得到的永生化单核细胞或树突状细胞的培养液中，IL-6和/或IL-8的产量相对于阴性对照增加时，则判定该待测物质具有皮肤致敏性和/或发热性。例如，可以将相对于阴性对照的一定增加率设为阈值，当该增加为超过该增加率的产量时，则可以判定待测物质具有皮肤致敏性和/或发热性。作为这样的增加率，可以设为1.2～2.0倍之间的值，例如1.5倍。另外，当使用多种浓度的待测物质进行评价时，若在所制备的多种浓度中的至少一种浓度的待测物质存在下进行培养而得到的该细胞的培养液中，IL-6和/或IL-8的产量与阴性对照相比增加，则判定该待测物质具有皮肤致敏性和/或发热性。另外，当在待测物质存在下的培养时间设置多个而进行评价时，若在任意浓度的待测物质存在下培养所设置的多个培养时间中的至少一种时间而得到的该细胞的培养液中，IL-6和/或IL-8的产量与阴性对照相比增加时，则判定该待测物质具有皮肤致敏性和/或发热性。
需要说明的是，作为阴性对照，可以使用用于溶解待测物质的溶解液，也可以使用用于培养永生化单核细胞或树突状细胞的培养基等。
<使用永生化单核细胞或树突状细胞检测样品中的皮肤致敏性物质和/或发热性物质>
测定在样品存在下培养永生化单核细胞或树突状细胞而得到的培养液中的IL-6和/或IL-8的产量，由此使用永生化单核细胞或树突状细胞来检测样品中的皮肤致敏性物质和/或发热性物质。
需要说明的是，关于检测样品中的皮肤致敏性物质和/或发热性物质的方法，基本的方法与上述<使用永生化单核细胞及树突状细胞评价物质的皮肤致敏性和/或发热性>相同，因此，在本项中仅详细叙述不同点。
皮肤致敏性物质和/或发热性物质(例如，LPS和/或SAC)经溶解液溶解后用于评价。作为这样的溶解液，可以使用乙醇、DMSO、水、PBS等。另外，将皮肤致敏性物质和/或发热性物质稀释，以按照预设的最终浓度与细胞接触，并用于评价。
作为预设的最终浓度，例如，LPS调节为大于0.0001pg/mL且1000000pg/mL以下之间的一种以上、优选至少三种浓度；SAC调节为稀释倍率101倍～1010倍之间的一种以上、优选至少三种浓度。需要说明的是，所调节的浓度可以为三种，也可以为四种，还可以为五种，还可以为六种以上。皮肤致敏性物质和/或发热性物质的稀释可以使用<使用永生化单核细胞及树突状细胞评价物质的皮肤致敏性和/或发热性>一项中记载的培养基来进行。需要说明的是，这样的皮肤致敏性物质和/或发热性物质可以在检测样品中的皮肤致敏性物质和/或发热性物质时用作阳性对照。
用于评价的样品可以按照任意的稀释倍率进行稀释。任意的稀释倍率可以选自1.2倍～100倍之间的一种。需要说明的是，所选择的稀释倍率可以为两种，也可以为三种，还可以为四种以上。可以使用水、生理盐水、用于培养永生化单核细胞或树突状细胞的培养基等来稀释样品。
检测样品中的皮肤致敏性物质和/或发热性物质时，基于所测得的IL-6和/或IL-8的产量进行判定。具体而言，当在样品存在下培养了任意时间的永生化单核细胞或树突状细胞的培养液中，IL-6和/或IL-8的产量相比阴性对照增加时，则判定该样品中包含皮肤致敏性物质和/或发热性物质。另外，当样品存在下的培养时间设置多个进行评价时，若在所设置的多个培养时间中的至少一种时间下，该细胞培养液中的IL-6和/或IL-8的产量相比阴性对照增加时，则判定该样品中包含皮肤致敏性物质和/或发热性物质。
另外，当按照多个稀释倍率将样品稀释后用于评价时，若在按照多个稀释倍率稀释后的样品中的至少一种稀释倍率的样品存在下进行培养而得到的该细胞的培养液中，IL-6和/或IL-8的产量相比阴性对照增加，则判定该样品中包含皮肤致敏性物质和/或发热性物质。
需要说明的是，作为阴性对照，可以使用用于溶解皮肤致敏性物质和/或发热性物质的溶解液及生理盐水、用于培养永生化单核细胞或树突状细胞的培养基等。
<使用永生化单核细胞或树突状细胞评价样品对免疫细胞的功能所产生的功能>
通过测定永生化单核细胞或树突状细胞所产生的各种细胞因子，能够测定免疫细胞的功能。由此，本发明可以通过测定这些永生化单核细胞或树突状细胞所产生的各种细胞因子来评价样品所具有的对免疫细胞的功能所产生的作用。作为永生化单核细胞或树突状细胞所产生的细胞因子，可列举：白细胞介素、趋化因子、肿瘤坏死因子超家族、干扰素、生长因子、造血因子、集落刺激因子等。
作为白细胞介素，可列举：IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、IL-2、IL-2Ra、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12(p70)、IL-12(p40)、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-18等。
在这些白细胞介素中，已知例如IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17A及IL-18为炎症细胞因子，参与皮肤的炎症及体温升高。另一方面，已知IL-4及IL-10为抗炎症细胞因子，由此，在一个实例中，免疫细胞的功能可以为诱导皮肤的炎症及体温升高等炎症的作用、或诱发炎症抑制作用。
另外，已知白细胞介素具有与健康相关的各种生理活性。已知IL-4及IL-13诱导IgE产生，已知IL-9刺激肥大细胞增殖。另一方面，已知IL-12具有抑制IgE产生的作用。由此，在一个实例中，免疫细胞的功能可以为刺激肥大细胞的作用、强化IgE产生的作用、或抑制IgE产生的作用。
另外，已知IL-5及IL-6强化IgA的产生(Jpn J.Lactic Acid Bact，2007，18(2)，54-57)。由此，在一个实例中，免疫细胞的功能可以为强化IgA产生的作用。
已知IL-2、IL-2Ra具有T细胞、B细胞、及自然杀伤(NK)细胞的增殖及激活作用。另外，已知IL-7参与B细胞、T细胞、NK细胞的存活、分化等。另外，已知IL-15具有增殖及激活T细胞及B细胞的作用。由此，在一个实例中，免疫细胞的功能可以为淋巴细胞(即，T细胞、B细胞、及NK细胞)的增殖及激活作用。
已知IL-5具有增加嗜酸性粒细胞产生的作用。由此，在一个实例中，免疫细胞的功能可以为增加嗜酸性粒细胞产生的作用。
已知IL-17A诱导产生炎症细胞因子，IL-18与IL-2共同诱导产生干扰素γ，IL-18单独诱导产生IL-4。由此，在一个实例中，免疫细胞的功能可以为增加细胞因子产生的作用。
作为趋化因子，可列举：IL-8、CTACK、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)、GRO-α、IP-10、MCP-1、MCP-3、MIG、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、SDF-1α等。这些趋化因子导致白细胞从血管内向炎症组织内迁移。
例如，一般认为，IL-8通过激活中性粒细胞等而具有防御感染的效果(病原菌根除效果)(The Japanese Journal of Antibiotics，2013，66-6，305-310)。另外，已知CTACK是皮肤特异性趋化因子，其参与增加嗜酸性粒细胞的产生。已知嗜酸粒细胞趋化因子具有强大的嗜酸性粒细胞迁移活性。已知GRO-α为细胞***功能性物质及中性粒细胞激活物质。已知IP-10会引起针对单核细胞及巨噬细胞等的迁移。已知MCP-1(MCAF)、MCP-3会引起单核细胞及巨噬细胞的迁移。已知MIG使T细胞及一部分巨噬细胞等向炎症部位迁移。已知MIP-1α会引起单核细胞及嗜碱性粒细胞的迁移。已知MIP-1β会引起单核细胞及嗜酸性粒细胞的迁移。已知RANTES会引起单核细胞、嗜酸性粒细胞、及嗜碱性粒细胞的迁移。已知SDF-1α是淋巴细胞有效的趋化因子，向新形成的血管补充淋巴细胞，从而参与生物体的血管新生。
需要说明的是，在上述白细胞介素中，已知IL-16也具有促使CD4阳性T细胞迁移的作用。
由此，在一个实例中，免疫细胞的功能可以为促进白细胞(即，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞)迁移的作用、或防御感染的作用。
作为肿瘤坏死因子超家族，可列举：肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)。已知TNF-α及TNF-β通过表达细胞粘附分子、诱导细胞凋亡、增强炎症介质(IL-1、IL-6及***素E2等)来参与感染预防及抗肿瘤作用。另外，已知TRAIL在癌细胞中诱导细胞凋亡。
由此，在一个实例中，免疫细胞的功能可以为诱导细胞凋亡的作用。
作为干扰素，可列举：IFN-α(1、2、4、5、6、7、8、10、13、14、16、17、21)、IFN-β、及IFN-γ等。已知干扰素通过抑制病毒复制来提高细胞的病毒抗性。
由此，在一个实例中，免疫细胞的功能可以为增加病毒抗性的作用。
作为生长因子、可列举：碱性成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factorbasic：FGF basic)、肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor：HGF)、神经生长因子(Nerve Growth Factor：NGF)、血小板衍生生长因子(Platelet Derived Growth Factor：PDGF)、造血干细胞生长因子(Stem Cell Growth Factor：SCGF)α、β、血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor：VEGF)A-E、表皮生长因子(Epidermal GrowthFactor；EGF)等。
已知碱性成纤维细胞生长因子(FGF basic)除促进细胞***之外，在血管新生及伤口的治癒中也起到重要的作用。已知HGF在促进细胞***、血管新生及组织修复等中起到重要的作用。已知NGF具有延长神经轴突及促进神经递质合成的作用、保持神经细胞的作用、修复细胞损伤作用等。已知PDGF主要参与间充质细胞的迁移及增殖等调控，同时也参与血管新生及伤口的治癒。已知SCGFα、β主要参与造血细胞的增殖。已知VEGFA-E参与血管内皮细胞的增殖、血管新生等。已知EGF也参与上皮细胞的增殖、伤口的治癒。
由此，在一个实例中，免疫细胞的功能可以为促进细胞增殖作用、诱导血管新生作用、或伤口治癒作用。
作为造血因子，可列举干细胞因子(Stem Cell Factor：SCF)等。SCF是通过c-kit受体介导的信号转导起作用的造血生长因子，它是对于造血细胞的存活、增殖及分化而言非常重要的因子。
需要说明的是，在上述白细胞介素中，已知IL-3也具有作为支持未成熟血细胞增殖的造血因子的作用。
由此，在一个实例中，免疫细胞的功能可以为促进造血细胞增殖的作用。
作为集落刺激因子，可列举：粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating Factor：G-CSF)、粒细胞单核细胞集落刺激因子(Granulocyte Macrophagecolony-stimulating Factor：GM-CSF)、单核细胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating Factor：M-CSF)等。已知GM-CSF作用于粒细胞及巨噬细胞祖细胞以使其分化为粒细胞祖细胞和巨噬细胞祖细胞，G-CSF作用于粒细胞祖细胞以使其分化为中性粒细胞，M-CSF作用于巨噬细胞祖细胞以使其分化为巨噬细胞，从而显示出各种生理作用(日内会刊1996，85，844-849)。
由此，在一个实例中，免疫细胞的功能可以为祖细胞分化作用。
另外，作为其它细胞因子，白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor：LIF)是一种抑制细胞分化而对细胞的生长因子产生影响的IL-6家族的细胞因子。由此，在一个实例中，免疫细胞的功能可以为抑制细胞分化的作用。
另外，巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage Migration Inhibitory Factor：MIF)诱导TNF-α及IL-1β等细胞因子而加重过敏等炎症症状，同时具有控制癌症抑制基因p53的表达诱导的作用，从而具有抑制由p53诱导的细胞凋亡的作用(Carcinogenesis.2009，30，1597-605)。由此，在一个实例中，免疫细胞的功能可以为控制p53的表达诱导的作用、或抑制细胞凋亡的作用。
需要说明的是，免疫细胞的功能并不限定于上述功能，还可以为例如减少免疫细胞的细胞因子产量的作用、免疫细胞诱导免疫激活的作用、或免疫细胞诱导免疫抑制的作用等。
可以通过测定在样品存在下培养永生化单核细胞或树突状细胞而得到的培养液中的细胞因子的产量来进行本发明的评价方法。在本方法中，可以将细胞因子的产量作为指标来评价对免疫细胞的功能所产生的作用。下面，对具体的评价方法进行详细叙述。
需要说明的是，评价样品对免疫细胞的功能所产生的作用时，可以依据上述<使用永生化单核细胞及树突状细胞评价物质的皮肤致敏性和/或发热性>来进行。
在本发明的评价方法中，待测产量的细胞因子优选为IL-6、IL-8、IL-12(p40)、MIP-1α、MIP-1β、GRO-α、TNF-α、MCP-1(MCAF)、IFN-γ、及G-CSF。
样品可以被溶解液、悬浮液或者稀释液溶解、悬浮或者稀释后用于评价，或直接用于评价。作为这样的溶解液，可以使用例如：有机溶剂(乙醇、DMSO等)、水、培养基(<使用永生化单核细胞及树突状细胞评价物质的皮肤致敏性和/或发热性>一项中记载的培养基等)、缓冲液(PBS等)。需要说明的是，样品可以使用市售的产品(例如，功能性饮料或药物)。
另外，可以将样品溶解或稀释，以按照预设的最终浓度或稀释倍率与细胞接触，然后用于评价。最终浓度可以调节为大于0％且50％以下之间的一种以上、优选至少三种浓度。需要说明的是，最终浓度或稀释倍率的种类可以为三种，也可以为四种，还可以为五种，还可以为六种以上。
测定培养后的永生化单核细胞或树突状细胞的培养液中的细胞因子的产量。需要说明的是，作为待测定培养液，通常使用培养上清液，但也可以根据需要使用细胞破碎液。可以使用公知的免疫测定法来进行该测定。免疫测定法可以为例如ELISA(酶联免疫吸附测定，Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)、免疫层析法、放射免疫分析法或蛋白质印迹、多重测定法。另外，这些免疫测定可以使用市售的试剂盒来进行。
基于所测得的细胞因子的产量来判定样品是否具有对免疫细胞的功能所产生的作用。具体而言，当在样品存在下培养任意时间而得到的永生化单核细胞或树突状细胞的培养液中，细胞因子的产量相比阴性对照增加时，则判定该样品具有对免疫细胞的功能所产生的作用。需要说明的是，在该情况下，例如，可以将相对于阴性对照的一定的增加率设为阈值，当该产量的增加超过该增加率时，则可以判定样品具有功能性。这样的增加率可以为1.2倍以上，具体而言，可以为2倍、3倍、5倍、10倍以上。
另外，当使用多种浓度的样品进行评价时，若所制备的多种浓度中的至少一种浓度的样品存在下进行培养而得到的该细胞的培养液中，细胞因子的产量相比阴性对照增加，则可以判定该样品具有对免疫细胞的功能所产生的作用。另外，当样品存在下的培养时间设置多个而进行评价时，若在任意浓度的样品存在下培养设置的多个培养时间中的至少一种时间而得到的该细胞的培养液中，细胞因子的产量相比阴性对照增加，则可以判定该样品具有对免疫细胞的功能所产生的作用。
需要说明的是，作为阴性对照，可以使用例如用于培养永生化单核细胞或树突状细胞的培养基等。
<评价试剂盒>
本发明涉及一种用于评价物质的皮肤致敏性和/或发热性、检测样品中的发热性物质、和/或评价对免疫细胞的功能所产生的作用的试剂盒，其包括人永生化单核细胞或由该人永生化单核细胞制备的树突状细胞。该试剂盒除上述单核细胞或树突状细胞之外，还可以包括包装、说明书，另外，还可以包含培养用培养基、培养添加物、实验仪器、抗IL-6抗体和/或抗IL-8抗体、任意的抗细胞因子抗体，以及任意的标准物质。需要说明的是，培养用培养基可以使用<使用永生化单核细胞或树突状细胞评价物质的皮肤致敏性和/或发热性>一项中记载的培养基。
实施例
下面，基于实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明并不限定于下面的实施例。需要说明的是，本申请全文引用的所有文献通过参照直接并入本申请。
(实施例1)来自人外周血的永生化单核细胞的制作及树突状细胞的制作
(来自人外周血的永生化单核细胞的制作)
参考现有报道(WO2012/043651及日本特开2017-131136)制作来自人外周血的永生化单核细胞。详细而言，从人外周血中提取CD14阳性组分，按照现有报道，向其中导入关于人永生化单核细胞制作所报道的基因(c-MYC、BMI1以及BCL-2)，从而制作永生化单核细胞。永生化单核细胞系在含有20％FBS(Cytiva Inc.、Cat#：SH30088.03)、50ng/mL M-CSF(Peprotech Inc.、Cat#：AF-300-25)、及50ng/mL GM-CSF(Peprotech Inc.、Cat#：300-03)的α-MEM培养基中培养，培养开始3～5周后，获得增殖性细胞，使用市售的细胞保存液、例如无血清细胞保存液BAMBANKER(GCLTEC Inc.，Cat#：CS-02-001)在液氮下保存。
(确认所制备的细胞)
测定所制备细胞的表面标志物，及通过吉姆萨染色等进行形貌观察等。表面标志物测定时，使用CD11抗体、CD14抗体(均由Biolegend公司制)，通过Sysmex公司的流式细胞仪CyFlowspace来进行测定。通过测定确认到CD11及CD14表达，从而确认所制备的细胞表达单核细胞样标志物。另外，染色时，使用市售的染色液(Sigma公司)，基于公知的染色法进行吉姆萨染色或者迈格吉染色，再利用高倍显微镜(400～1000倍)测定。
(由永生化单核细胞制备树突状细胞)
将保存的永生化单核细胞系在α-MEM培养基(含有20％FBS、50ng/mL M-CSF及50ng/mL GM-CSF)中、37℃、5％CO2培养箱内培养，3天更换一次培养基，由此保持并制备永生化单核细胞。将永生化单核细胞在50ng/mL M-CSF、50ng/mL GM-CSF及100ng/mL IL-4存在下培养3天，使其向树突状细胞分化，从而制备树突状细胞。
(实施例2)(来自人诱导多能干细胞的永生化单核细胞的制作)
参考现有报道(WO2012/043651，日本特开2017-131136及日本特开2018-171005)制作来自人诱导多能干(iPS)细胞的永生化单核细胞。详细而言，将未分化的iPS细胞(由京都大学iPS细胞研究所提供)接种在直径10cm的培养皿(AGC TECHNO GLASS CO.,LTD.、Cat#：1012-100)或6孔板(Corning Inc.，Cat#：3516)上，培养皿或6孔板预先包被有层粘连蛋白511(iMatrix-511-E8，Nippi公司，Cat#：892-012)作为基底膜，向α-MEM培养基(富士胶片和光纯药株式会社，Cat#：137-17215)中添加20％FBS(Cytiva Inc.，Cat#：SH30088.03)，得到培养液(下面记作α-MEM培养基(含有20％FBS))，使用该培养液开始分化诱导培养。之后，3天更换一次α-MEM培养基(含有20％FBS)，同时继续进行培养。分化诱导开始14～21天后，等量混合TrypLETM Select(含有1mM乙二胺四乙酸(EDTA))(GIBCO Inc.，Cat#：A12859-01)及0.5mM EDTA/PBS(Nacalai Tesque公司，Cat#：13567-84)，使用所制备的溶液(最终浓度0.75mM EDTA)处理细胞(37℃，60分钟)，以将其解离并回收，通过吹打操作制作细胞悬浮液。随后，将从直径10cm的一个培养皿或6孔板的一个孔中回收的细胞悬浮液悬浮在10mLD-MEM培养基(富士胶片和光纯药株式会社，Cat#：044-29765)(含有10％FBS(Cytiva Inc.，Cat#：SH30088.03))中，并接种于无饲养细胞、无层粘连蛋白包被的直径10cm的两个或一个培养皿中，在37℃、5％CO2培养箱内静置。约16小时后，回收未贴附于培养皿的细胞，并使其通过100微米网眼(BD Falcon公司制造的细胞过滤器)，从而得到除去凝集细胞团后的细胞悬浮液。
将上述得到的除去凝集细胞团后的细胞悬浮液接种于α-MEM培养基(含有20％FBS、100ng/mL M-CSF(Peprotech Inc.，Cat#：AF-300-25)、及100ng/mL GM-CSF(PeprotechInc.，Cat#：300-03))，用T25烧瓶(CellSeed公司，HydroCell，Cat#：CSF025、或者ThermoFisher Scientific Inc.，Cat#：169900)进行培养。然后，经过3～9天左右，出现具有悬浮性或弱贴附性的细胞，观察到细胞数逐渐增加。回收该悬浮细胞(iPS-MC)，使用流式细胞仪，确定白细胞标志物分子CD45、及髓样细胞标志物CD11b或CD33的表达(未图示)。
使用用于表达蛋白质的启动子为EF1a的第3代慢病毒载体(SignaGen Inc.)，向上述得到的悬浮细胞(iPS-MC)导入针对小鼠永生化造血干细胞制作所报道的基因(Myc、Myb、Hob8、TLX1、E2A-pbx1、MLL、Ljx2、RARA、Hoxa9、Notch1、v-raf/v-myc、MYST3-NCOA2、Evi1、HOXB6、HOXB4、β-连环蛋白、Id1)或者针对人永生化单核细胞制作所报道的基因(c-MYC及BMI1、EZH2、MDM2、MDM4、HIFIA中的至少一个)，从而制作来自人诱导多能干细胞的永生化单核细胞，其中，第3代慢病毒载体为人类免疫缺陷病毒1型(HIV-I)增殖力等缺失后的毒株。将该永生化单核细胞系用24孔板内的含有20％FBS、50ng或50～100ng/mL M-CSF、及50ng或50～100ng/mL GM-CSF的α-MEM培养基培养，培养开始3～5周后，获得增殖性细胞。另外，来自人诱导多能干细胞的永生化单核细胞使用市售的细胞保存液、例如无血清细胞保存液BAMBANKER(GCLTEC Inc.，Cat#：CS-02-001)在液氮下保存。
(实施例3)表达M-CSF及GM-CSF的来自人诱导多能干细胞的永生化单核细胞的制作
参考现有报道(日本特开2018-171005)制作表达M-CSF及GM-CSF的来自人诱导多能干细胞的永生化单核细胞。详细而言，使用用于表达蛋白质的启动子为EF1a的第3代慢病毒载体(SignaGen Inc.)，向实施例2中得到的来自人诱导多能干细胞的永生化单核细胞同时导入人M-CSF基因和人GM-CSF基因的表达载体，其中，第3代慢病毒载体为人类免疫缺陷病毒1型(HIV-I)增殖力等缺失的毒株。从基因导入3天后起，在不包含人M-CSF及GM-CSF的α-MEM(含有20％FBS)培养基中进行培养，培养开始3～5周后，获得增殖性细胞，使用市售的细胞保存液在液氮下保存。下面，将实施例3中制备的人永生化单核细胞记作iPS-ML2。
(实施例4)使用永生化单核细胞系评价测试物质的皮肤致敏性和/或发热性
按照下面的流程评价测试皮肤致敏性和/或发热性。测试中使用iPS-ML2。使冷冻保存的iPS-ML2在室温下溶解，清洗后，接种于装入10mL培养基(含10％FCSα-MEM(GIBCO))的T-25(Thermo Fisher Scientific Inc)培养瓶中，然后，传代3次以上后，用于测试。
1.将悬浮的iPS-ML2从T-25培养瓶转移至15mL管中。然后，在室温下，在300×G下离心分离5分钟，并弃掉上清液。
2.向iPS-ML2的团块(pellet)中加入10mLPBS(富士胶片和光纯药株式会社)，在室温下，按照300×G离心分离5分钟，并弃掉上清液。再重复一次该操作。
3.将清洗后的iPS-ML2悬浮于培养基(含10％FCS的α-MEM(GIBCO))。
4.使用台盼蓝，对细胞数进行计数。
5.将iPS-ML2接种于平底96-孔板(Coring)，以使每孔细胞数达到1×104个/100μL。
6.将作为待测物质的下表1所示的化合物用溶解液溶解，通过培养基(含10％FCS的α-MEM(GIBCO))将该溶解液调节为浓度400μg/mL。
7.将400μg/mL的待测物质用培养基(含10％FCS的α-MEM(GIBCO))稀释2倍，共计制备11种浓度。
8.将各浓度的待测物质添加在项目5中准备的培养板中，每孔添加100μL。由此，待测物质的浓度被稀释2倍，物质的最高的最终浓度采用200μg/mL。
9.iPS-ML2培养开始6小时后，从每个孔中回收培养上清液。用于ELISA之前，回收的上清液在-80℃下保存。
10.按照IL-6ELISA KIT(BIOLEGEND，ELISA MAXTM DELUXE SETHUMAN IL-6)及IL-8ELISA KIT(BIOLEGEND，ELISA MAXTM DELUXE SET HUMAN IL-8)的流程，使用读板器(TECAN，Infinite 200PRO M nano)测定所回收的培养上清液中的各细胞因子量。
【表1】
表1待测物质及使用的溶解液
| ⅠD | 被测物质 | 溶解液 |
| P1 | 2,4-二硝基氯苯 | DMSO |
| P2 | 4-苯二胺 | EtOH |
| P3 | 硫酸镍 | PBS |
| P4 | 2-巯基苯并噻唑 | EtOH |
| P5 | R(+)柠檬烯 | EtOH |
| P6 | 咪唑烷基脲 | PBS |
| N7 | 乳酸 | DMSO |
(结果)
由测试结果可知，N7添加于iPS-ML2的6小时后，产生IL-6及IL-8。
另一方面，P1、P3、P4添加于iPS-ML2的6小时后，相对于未加入待测物质的仅由培养基组成的阴性对照，产生了1.5倍以上的IL-6及IL-8。另外，P2、P5、P6添加于iPS-ML2的6小时后，相对于未加入待测物质的仅由培养基组成的阴性对照，产生了1.5倍以上的IL-8。图1中，相对于未加入待测物质的仅由培养基组成的阴性对照，产量达到1.5倍以上时，记作具有皮肤致敏性和/或发热性(P)，低于1.5倍时，记作无皮肤致敏性和/或发热性(N)。
将本评价的结果与现有的评价方法(LLNA、h-CLAT)中的各待测物质的结果进行比较(参见图1)。LLNA中的评价结果(LLNA potency)引用自ATLA 38，275-284，2010。当不具有皮肤致敏性时，记作非致敏剂(Non-sensitiser)，当具有弱皮肤致敏性时，记作弱(weak)，随着皮肤致敏性强度提升，依次记作中(moderate)、强(strong)、极强(extreme)。h-CLAT的结果(h-CLAT CD86及CD54)引用自ATLA 38，275-284，2010，当相对于阴性对照，表达升高150％以上(CD86)或200％以上(CD54)时，为阳性(P)，当低于上述值时，为阴性(N)。在该情况下，如果CD86和CD54中的任意一者为阳性，则认为具有皮肤致敏性。
关于P1～P6，在LLNA中，确认其具有皮肤致敏性，在h-CLAT中，添加有P1～P6的细胞中可见CD86和/或CD54的表达量增加。因此，本评价中获得了与h-CLAT中的结果相关的结果。
由此，向通过本实施例所述的方法制作的iPS-ML2中添加各待测物质并培养6小时，测定得到的培养上清液中的IL-6和/或IL-8的产量，由此能够评价该待测物质的皮肤致敏性和/或发热性。
需要说明的是，对不同细胞批次实施同样的皮肤致敏性和/或发热性的评价后，在各批次间的皮肤致敏性和/或发热性的结果中未见差异。即，确认本评价方法的重现性高。
另外，本评价中，能够通过ELISA进行测定，因此，可以通过比现有的方法(例如，h-CLAT)更简便的方法来测定。因此，例如，认为本评价也可以用作在通过现有的方法进行测试前的筛选测试。
(实施例5)使用永生化人单核细胞检测测试样品中的皮肤致敏性物质和/或发热性物质
按照下面的流程，进行检测样品中的皮肤致敏性物质和/或发热性物质的测试。测试中使用iPS-ML2。将冷冻保存的iPS-ML2在室温溶解，清洗后，接种于装入10mL培养基(含有10％FCS的α-MEM(GIBCO))的T-25培养瓶(Thermo Fisher Scientific Inc)中，然后，传代3次以上传代后，用于测试。
1.将悬浮的iPS-ML2从T-25培养瓶转移到15mL管中。然后，在室温下，按照300×G离心分离5分钟，弃掉上清液。
2.向iPS-ML2的团块中加入10mL PBS(富士胶片和光纯药株式会社)，在室温下，按照300×G离心分离5分钟，弃掉上清液。再重复进行一次该操作。
3.将清洗后的iPS-ML2悬浮于培养基(含10％FCS的α-MEM(GIBCO))。
4.使用台盼蓝，对细胞数进行计数。
5.将iPS-ML2接种于平底96-孔板(Coring)，使每孔细胞数达到1×104个/100μL。
6.作为包含皮肤致敏性物质和/或发热性物质的样品，将LPS及SAC用溶解液溶解并悬浮。LPS用培养基(含10％FCS的α-MEM(GIBCO))制备其溶解液，使浓度达到2000000pg/mL。SAC用培养基(含10％FCS的α-MEM(GIBCO))稀释5倍。
7.将2000000pg/mL的LPS及稀释5倍的SAC用培养基(含10％FCS的α-MEM(GIBCO))稀释10倍，从而共计制备10个浓度。
8.将包含各浓度的皮肤致敏性物质和/或发热性物质的样品添加于项目5中准备的培养板中，每孔添加100μL。由此，皮肤致敏性物质和/或发热性物质的浓度稀释2倍，LPS的最高的最终浓度达到1000000pg/mL，SAC的最小的稀释倍率采用10倍。
9.iPS-ML2培养开始6小时后及24小时后，从每个孔中回收培养上清液。用于ELISA前，回收的上清液在-80℃下保存。
10.按照IL-6ELISA KIT(BIOLEGEND，ELISA MAXTM DELUXE SETHUMAN IL-6)及IL-8ELISA KIT(BIOLEGEND，ELISA MAXTM DELUXE SET HUMAN IL-8)的流程，使用读板器(TECAN，Infinite 200PRO M nano)测定所回收的培养上清液中的各细胞因子量。
(结果)
向iPS-ML2中添加各浓度的LPS或SAC，并培养6小时及24小时，由此得到的iPS-ML2的培养上清液中的IL-6及IL-8的产量示于图2。
LPS时，培养6小时后及培养24小时后，相对于仅由培养基组成的阴性对照，培养上清液中的IL-6及IL-8的产量均浓度依赖性增加(参见图2A及图2B)。需要说明的是，图2A及图2B中，阴性对照在曲线图的纵轴上示作圆点(培养6小时后的阴性对照)及方点(培养24小时后的阴性对照)。
SAC时，培养6小时后及培养24小时后，稀释倍率越低，即浓度越高，相对于仅由培养基组成的阴性对照，IL-6及IL-8的产量越增加(参见图2C及图2D)。与上述的LPS时相同，图2C及图2D中，阴性对照在曲线图的右端示作圆点(培养6小时后的阴性对照)及方点(培养24小时后的阴性对照)。
由此，向通过本实施例所述的方法制作的iPS-ML2中添加包含皮肤致敏性物质和/或发热性物质的样品，培养6小时和/或24小时，测定由此得到的培养上清液中的IL-6和/或IL-8的产量，从而能够检测皮肤致敏性物质和/或发热性物质。
需要说明的是，通过本检测方法进行皮肤致敏性物质和/或发热性物质检测时，与现有的测试(例如，PBMC测试)的检测极限相比，可见同等以上的检测性能。另外，当在不同细胞批次中实施同样的检测测试时，各批次间的结果未见差异。即表示本检测方法的重现性高。
(实施例6)使用永生化单核细胞系评价功能性饮料所引起的细胞因子产生的测试
对功能性饮料引起永生化单核细胞系产生细胞因子的情况进行评价。测试中使用实施例3中制成的iPS-ML2。另外，使用下面的功能性饮料作为待测样品。
【表2】
具体的测试按照下面的流程进行。
1.将冷冻的iPS-ML2在室温下解冻，并向团块中加入10mL PBS(富士胶片和光纯药株式会社)，在室温下，按照300×G离心分离5分钟，弃掉上清液。再重复一次该操作。
2.使清洗后的iPS-ML2悬浮于10mL培养基10％FBS(Cytiva Inc.，Cat#：SH30088.03)或向α-MEM(Gibco BRL)中添加2或5％HPL(Human platelet lysate，来自人血小板的补充剂(AdvantaCell公司，Cat#：HPCH XCGL50))而得到的培养液。
3.使用台盼蓝，对细胞数进行计数。
4.将iPS-ML2接种于平底96-孔板(Corning)，使每孔的细胞数达到1×104个/100μL。
5.将作为样品的表2所示的市售的各种功能性饮料用培养基(含10％FCS的α-MEM(GIBCO))稀释2倍，制备从原液(100％)至0.05％之间的共计11种浓度。
6.将各浓度的各种功能性饮料添加于项目5中准备的培养板中，每孔添加100μL。由此，各种功能性饮料的浓度稀释2倍，最大的最终浓度达到50％，最小的最终浓度采用0.025％。
7.将iPS-ML2在37℃、5％CO2培养箱中培养，培养开始24小时后，从每个孔中回收培养上清液。用于ELISA之前，回收的上清液在-80℃下保存。
8.按照IL-6ELISA KIT(BIOLEGEND，ELISA MAXTM DELUXE SETHUMAN IL-6，Cat#：430504)的流程，使用读板器(TECAN，Infinite 200PRO M nano)测定所回收的培养上清液中的各细胞因子量。
9.IL-6的产量表示为产量比(刺激指数，Stimulation Index)，产量比(Stimulation Index)按照下面的公式计算。需要说明的是，使用培养基作为阴性对照。
Stimulation Index＝(添加有各种功能性饮料的细胞上清液的IL-6产量测定值)/(阴性对照的IL-6产量测定值)
(结果)
将向iPS-ML2中添加各浓度的各种功能性饮料并培养24小时后的iPS-ML2培养上清液中的IL-6的产量比示于图3。曲线图的横轴表示样品的浓度(％)，纵轴表示相对于阴性对照的产量(＝1)的产量比。需要说明的是，图3中，阴性对照在曲线图的纵轴上示作方点。
例如，当使用iMUSE(注册商标)作为样品时，若按照6.25％的浓度进行添加，则IL-6产量比为17倍左右。由该结果可知，各种样品间的IL-6的最大产量存在差异；IL-6的产量根据样品的稀释浓度产生变化。另外还可以明确判断，在样品浓度高的条件下，例如样品的最终浓度为约50％时，在很多组中，随着渗透压的变化而不能观测到充分的评价结果。
由此表示，使用本实施例所制作的iPS-ML2细胞，可以测定免疫细胞的IL-6等细胞因子的产量，且可以以该产量为指标评价引发炎症的程度、及进行筛选评价。
(实施例7)使用永生化单核细胞系全面评价功能性饮料引起的细胞因子产生的测试
按照下面的流程，对样品所引起的细胞因子产生的情况进行全面评价测试。测试中使用iPS-ML2。将冷冻保存的iPS-ML2在室温下溶解，清洗后，接种于放入10mL培养基(含10％FCS的α-MEM(GIBCO))的T-25培养瓶(Thermo Fisher Scientific Inc)中，然后，传代3次以上后，用于测试。
1.将悬浮的iPS-ML2从T-25培养瓶转移至15mL管中。然后，在室温下，按照300×G离心分离5分钟，弃掉上清液。
2.向iPS-ML2的团块中加入10mL PBS(富士胶片和光纯药株式会社)，在室温下，按照300×G离心分离5分钟，弃掉上清液。再重复进行一次该操作。
3.将清洗后的iPS-ML2悬浮于10mL培养基(含10％FCS的α-MEM(GIBCO))，或向α-MEM(Gibco BRL)中添加2或5％HPL(Human plate let lysate，来自人血小板的补充剂(AdvantaCell公司，Cat#：HPCHXCGL50))而得到的培养液中。
4.使用台盼蓝，对细胞数进行计数。
5.将iPS-ML2接种于平底96-孔板(Corning)，使每孔细胞数达到1×104个/100μL。
6.将功能性饮料(iMUSE(注册商标))用培养基(含10％FCS的α-MEM(GIBCO))稀释，使最终浓度达到10％，并添加于项目5中准备的培养板，每孔添加100μL。
7.将iPS-ML2在37℃、5％CO2培养箱中培养，培养开始6小时及24小时后，从每个孔中回收培养上清液。用于ELISA之前，回收的上清液在-80℃下保存。
8.按照Bio-Plex ProTM人细胞因子筛选48-Plex板(Bio-RAD公司，Cat#：12007283)的流程，使用测定设备(产品名：Bio-Plex 200，Bio-RAD公司)测定所回收的培养上清液中的各细胞因子量。
9.各细胞因子的产量示作产量比(Stimulation Index)，产量比按照下面的公式计算。阴性对照使用培养基。
Stimulation Index＝(添加有iMUSE(注册商标)的细胞上清液的细胞因子的产量测定值)/(阴性对照的细胞因子的产量测定值)
(结果)
将通过添加iMUSE(注册商标)而进行的细胞因子产量的比较示于表3。表3中，+表示产量比为2.5～5倍，++表示产量比为5～10倍，+++表示产量比为10倍以上。
【表3】
例如，24小时后IL-8的产量为10倍以上(+++)。由该结果明确判断，除实施例6中所示的IL-6以外，还产生了IL-8等细胞因子。
由此表明，通过使用所制作的iPS-ML2细胞，能够评价免疫细胞产生各种细胞因子的情况；且能够利用该细胞因子评价来评价各种物质的产细胞因子性能。
Claims (23)
1.一种评价待测物质的皮肤致敏性和/或发热性的方法，包括：
测定在所述待测物质存在下培养人永生化髓样细胞而得到的培养液中的IL-6和/或IL-8的产量的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述人永生化髓样细胞是人永生化单核细胞或由该人永生化单核细胞制备的树突状细胞。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，培养所述人永生化髓样细胞时，所述待测物质的浓度包括大于0μg/mL且1000μg/mL以下之间的至少三种浓度。
4.根据权利要求1～权利要求3中任一项所述的方法，其中，所述培养时间选自3小时～48小时之间的至少一种。
5.根据权利要求1～权利要求4中任一项所述的方法，其中，所述产量通过免疫测定法测定。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述免疫测定法为ELISA。
7.根据权利要求1～权利要求6中任一项所述的方法，其中，还包括：当所述产量相对于阴性对照的产量为1.5倍以上时，判定所述待测物质具有皮肤致敏性和/或发热性的步骤。
8.一种检测样品中的皮肤致敏性物质和/或发热性物质的方法，包括：测定在样品存在下培养人永生化髓样细胞而得到的培养液中的IL-6和/或IL-8的产量的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述人永生化髓样细胞是人永生化单核细胞或由该人永生化单核细胞制备的树突状细胞。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中，培养所述人永生化髓样细胞时，所述样品的浓度包括至少三种浓度。
11.根据权利要求8～权利要求10中任一项所述的方法，其中，所述培养时间选自3小时～48小时之间的至少一种。
12.根据权利要求8～权利要求11中任一项所述的方法，其中，所述产量通过免疫测定法测定。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述免疫测定法为ELISA。
14.根据权利要求8～权利要求13中任一项所述的方法，其中，还包括：当所述产量相对于阴性对照的产量增加时，判定所述样品中包含所述皮肤致敏性物质和/或发热性物质的步骤。
15.根据权利要求8～权利要求14中任一项所述的方法，其中，所述皮肤致敏性物质和/或发热性物质为脂多糖(LPS)和/或金黄色葡萄球菌Cow an 1(SAC)。
16.一种评价样品对免疫细胞的功能所产生的作用的方法，包括：测定在样品存在下培养人永生化髓样细胞而得到的培养液中的细胞因子的产量的步骤。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述人永生化髓样细胞是人永生化单核细胞或由该人永生化单核细胞制备的树突状细胞。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中，所述细胞因子选自IL-1a、IL-1b、IL-1ra、IL-2、IL-2Ra、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-12(p40)、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-18、CTACK、嗜酸性粒细胞趋化因子、碱性成纤维细胞生长因子、G-CSF、GM-CSF、GRO-α、HGF、IFN-α2、IFN-γ、IP-10、LIF、MCP-1(MCAF)、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、MIP-1α、MIP-1β、β-NGF、PDGF-BB、RANTES、SCF、SCGF-β、SDF-1a、TNF-α、TNF-β、TRAIL和VEGF-A。
19.根据权利要求16～权利要求18中任一项所述的方法，其中，对所述免疫细胞的功能所产生的作用为选自下述作用的功能：增加免疫细胞的细胞因子产量；减少免疫细胞的细胞因子产量；免疫细胞诱导炎症；免疫细胞诱发炎症抑制；免疫细胞诱导免疫激活；免疫细胞诱导免疫抑制；免疫细胞刺激肥大细胞；免疫细胞强化IgE产生；免疫细胞抑制IgE产生；免疫细胞强化IgA产生；免疫细胞增殖及激活淋巴细胞；免疫细胞增加嗜酸性粒细胞产生；免疫细胞促进白细胞迁移；免疫细胞诱导细胞凋亡；免疫细胞抑制细胞凋亡；免疫细胞增加病毒抗性；免疫细胞促进细胞增殖；免疫细胞诱导血管新生；免疫细胞治癒伤口；免疫细胞促进造血细胞增殖；免疫细胞分化祖细胞；及免疫细胞抑制细胞分化。
20.根据权利要求16～权利要求19中任一项所述的方法，其中，所述培养时间为3～48小时。
21.根据权利要求16～权利要求20中任一项所述的方法，其中，还包括：当在所述样品存在下培养所述人永生化髓样细胞而得到的所述培养液中的所述细胞因子的所述产量相对于在阴性对照存在下培养所述人永生化髓样细胞而得到的培养液中的细胞因子的产量为2倍以上时，判定所述样品具有功能性。
22.根据权利要求16～权利要求21中任一项所述的方法，其中，所述样品为功能性饮料。
23.一种用于权利要求1～权利要求22中任一项所述的方法的试剂盒，包括人永生化单核细胞或由该人永生化单核细胞制备的树突状细胞。
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| ROBERT KIKKERT等: "Cytokine induction by pyrogens:comparison of whole blood, mononuclear cells, and TLR-transfectants", 《J IMMUNOL METHODS》, vol. 336, no. 1, pages 45 - 55, XP022682290, DOI: 10.1016/j.jim.2008.03.010 * |
| YUKO NUKADA等: "Production of IL-8 in THP-1 cells following contact allergen stimulation via mitogen-activated protein kinase activation or tumor necrosis factor-α production", 《THE JOURNAL OF TOXICOLOGICAL SCIENCES》, vol. 33, no. 2, pages 175 - 185, XP055825759, DOI: 10.2131/jts.33.175 * |
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|---|---|
| US20220412958A1 (en) | 2022-12-29 |
| JPWO2021100828A1 (zh) | 2021-05-27 |
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