WO2011096420A1 - ヘモグロビンｓの分析方法、ヘモグロビンａ２の分析方法、及び、ヘモグロビンａ０の分析方法 - Google Patents

ヘモグロビンｓの分析方法、ヘモグロビンａ２の分析方法、及び、ヘモグロビンａ０の分析方法 Download PDF

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岡　孝之
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Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing hemoglobin S that can be separated with a sharp peak having high symmetry even in hemoglobin S, hemoglobin A2, and hemoglobin A0 having strong retention in cation exchange high performance liquid chromatography.
  • the present invention relates to a method for analyzing hemoglobin A2 and a method for analyzing hemoglobin A0.
  • Patent Literature 1 discloses liquid chromatography that separates hemoglobins in a sample prepared by hemolyzing a blood sample by using a difference in positive charge states that differ for each hemoglobin component by a cation exchange method. The method used is disclosed. As the number of diabetic patients has increased in recent years, the number of hemoglobin A1c measurements has been increasing, and high precision measurement and shortening of the measurement time are also required in HPLC measurement.
  • hemoglobins include oxyhemoglobin to which oxygen is bound, deoxyhemoglobin to which carbon dioxide is bound, and methemoglobin in which iron contained in heme is oxidized to form trivalent iron ions.
  • azide and cyanide when azide and cyanide coexist, it is known that azide and cyanide bind to methemoglobin trivalent iron ions and stabilize as azidomethemoglobin and cyanmethemoglobin. Yes.
  • HPLC using cation exchange liquid chromatography there may be a difference between the elution time of oxyhemoglobin and the elution time of these azidomethemoglobin and cyanmethemoglobin. Since the difference in charge between these hemoglobins is slight, the peaks cannot be completely separated and are broadened or bimodal.
  • hemoglobin S is the most common abnormal hemoglobin, and is a causative agent of sickle cell disease causing severe anemia, so that there is a great demand for separation and detection.
  • hemoglobin A1c which is a marker for diabetes
  • hemoglobin A2 it is necessary to measure hemoglobin A2 in the diagnosis of thalassemia, but since it is a trace component and is often eluted adjacent to hemoglobin A0 that is present in large amounts, both hemoglobin A0 and A2 have sharp peaks. It is preferable to separate them as
  • a component having a relatively strong retention with the cation exchange column has a problem that the peak is likely to be broadened or bimodal.
  • the deteriorated blood tends to generate broader or bimodal peaks than the fresh blood. This is caused by an increase in methemoglobin caused by deterioration. For this reason, there is a concern about the influence on the measured value when the stored sample is analyzed by retesting or the like.
  • the present invention relates to a method for analyzing hemoglobin S that can be separated with a sharp peak having high symmetry even in hemoglobin S, hemoglobin A2, and hemoglobin A0 having strong retention in cation exchange high performance liquid chromatography.
  • An object of the present invention is to provide a method for analyzing hemoglobin A2 and a method for analyzing hemoglobin A0.
  • the present invention 1 is a method for analyzing hemoglobin S by cation exchange high performance liquid chromatography, comprising 0.1 to 50 mmol / L of azide or cyanide, and having a pH of 6 near the isoelectric point of hemoglobin. This is a method for analyzing hemoglobin S using an eluent of 80 to 7.50.
  • the present invention 2 is a method for analyzing hemoglobin A2 by cation exchange high performance liquid chromatography, comprising 0.1 to 50 mmol / L of azide or cyanide, and having a pH of 6 near the isoelectric point of hemoglobin. This is an analysis method of hemoglobin A2 using an eluent of .45 to 6.85.
  • the present invention 3 is a method for analyzing hemoglobin A0 by cation exchange high performance liquid chromatography, comprising 0.1 to 50 mmol / L of azide or cyanide, and having a pH of 6 near the isoelectric point of hemoglobin. This is an analysis method of hemoglobin A0 using an eluent of 0.000 to 6.75.
  • the present invention is described in detail below.
  • hemoglobins having a strong holding power when separating hemoglobins having a strong holding power, an eluent having a pH of less than 6 is usually used, and the present inventors have found that this pH range greatly affects the peak shape. . Therefore, the inventors of the present invention maintain the pH of the eluent in which methemoglobin is stabilized by blending azide or cyanide at a specific concentration to a specific range near the isoelectric point of hemoglobin. It has been found that even strong hemoglobins can be separated with sharp peaks with high symmetry, and the present invention has been completed.
  • haemoglobins having strong holding power mean hemoglobin A0, hemoglobin A2, and hemoglobin S having high holding power for the cation exchange column.
  • hemoglobins having a weak holding power mean hemoglobins having a low holding power for a cation exchange column, and hemoglobin A1a, hemoglobin A1b, hemoglobin F, unstable hemoglobin A1c, and stable hemoglobin A1c. Etc.
  • the retention strength also changes depending on the three-dimensional structure of hemoglobin, the isoelectric point and the elution order are not always the same in ion exchange chromatography.
  • hemoglobin S of the present invention 1 the analysis method of hemoglobin A2 of the present invention 2, and the analysis method of hemoglobin A0 of the present invention 3 is used.
  • the eluent contains the azide or cyanide, methemoglobin can be stabilized.
  • hemoglobins are quantified by measuring the absorbance near 415 nm, but there is almost no difference in the absorbance spectra near 415 nm between oxyhemoglobin and azidomethemoglobin and cyanmethemoglobin, which hinders quantitativeness. It is not considered.
  • azide examples include sodium azide, diphenyl phosphate azide, 4-dodecylbenzenesulfonyl azide, 4-acetylaminobenzenesulfonyl azide, potassium azide, lithium azide, iron azide, hydrogen azide, and azide. Lead, mercury azide, copper azide, silver azide and the like can be mentioned.
  • Examples of the cyanide include potassium cyanide, hydrogen cyanide, sodium cyanide, silver cyanide, mercury cyanide, copper cyanide, lead cyanide, iron cyanide, lithium cyanide, ammonium cyanide and the like.
  • the lower limit of the concentration of the azide or cyanide in the eluent is 0.1 mmol / L
  • the upper limit is 50 mmol / L.
  • the preferable lower limit of the concentration of the azide or the cyanide is 0.5 mmol / L, the preferable upper limit is 30 mmol / L, the more preferable lower limit is 1 mmol / L, and the more preferable upper limit is 10 mmol / L.
  • hemoglobin S analysis method of the present invention 1 is used, even a hemoglobin S having a strong holding power can be separated with a sharp peak having high symmetry.
  • the lower limit of the pH of the eluent is 6.80, and the upper limit is 7.50.
  • the pH of the eluent is less than 6.80, the peak reading when measuring hemoglobin S using HPLC increases, the peak becomes broad, or exhibits bimodality.
  • the pH of the eluent exceeds 7.50, the retention with the cation exchange column is weakened, the elution time becomes extremely fast, the peak tailing becomes large, the peak becomes broad, and the bimodality is increased. To show.
  • the preferable lower limit of the pH of the eluent is 6.95
  • the preferable upper limit is 7.45
  • the more preferable lower limit is 7.00
  • the more preferable upper limit is 7.40.
  • hemoglobin A2 analysis method of the present invention 2 is used, even a hemoglobin A2 having a strong holding power can be separated with a sharp peak having high symmetry.
  • the lower limit of the pH of the eluent is 6.45, and the upper limit is 6.85.
  • the pH of the eluent is less than 6.45, the peak reading when measuring hemoglobin A2 using HPLC increases, the peak becomes broad, or exhibits bimodality.
  • the pH of the eluent exceeds 6.85, the retention with the cation exchange column is weakened, the elution time becomes extremely fast, the peak tailing becomes large, the peak becomes broad, and the bimodality is increased.
  • the preferable lower limit of the pH of the eluent is 6.50, and the preferable upper limit is 6.80.
  • hemoglobin A0 analysis method of the present invention 3 even a hemoglobin A0 having a strong retention can be separated with a sharp peak with high symmetry.
  • the lower limit of the pH of the eluent is 6.00, and the upper limit is 6.75.
  • the pH of the eluent is less than 6.00, the peak reading when measuring hemoglobin A0 using HPLC increases, the peak becomes broad, or exhibits bimodality.
  • the pH of the eluent exceeds 6.75, the retention with the cation exchange column is weakened, the elution time becomes extremely fast, the peak tailing becomes large, the peak becomes broad, and the bimodality is increased.
  • the preferable lower limit of the pH of the eluent is 6.20, the preferable upper limit is 6.70, the more preferable lower limit is 6.40, and the more preferable upper limit is 6.65.
  • the pH is not particularly limited as long as it is within the above-mentioned range.
  • a known buffer containing a buffer such as an organic acid and a salt thereof, an amino acid, an inorganic acid and a salt thereof, and Good's buffer is used.
  • the organic acid include citric acid, succinic acid, tartaric acid, malic acid, and the like.
  • the amino acids include glycine, taurine, arginine and the like.
  • inorganic acid examples include hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, boric acid, acetic acid, and the like.
  • surfactant various polymers, a hydrophilic low molecular weight compound, etc. suitably to the said buffer solution as needed.
  • the buffer concentration of the eluent is not particularly limited, but the preferred lower limit is 5 mmol. / L, the preferred upper limit is 500 mmol / L. If the buffering agent concentration is less than 5 mmol / L, the buffering action may not be sufficiently obtained. If the buffer concentration exceeds 500 mmol / L, the buffer may precipitate and cause clogging of the HPLC flow path, or the switching efficiency of the eluent may be reduced and may take time for equilibration. . A more preferable lower limit of the buffer concentration is 10 mmol / L, and a more preferable upper limit is 200 mmol / L.
  • the eluent contains inorganic salts such as sodium perchlorate, sodium chloride, potassium chloride, sodium sulfate, potassium sulfate, sodium phosphate, sodium thiocyanate for the purpose of optimizing the peak elution of hemoglobins. May be.
  • the concentration of the salt in the eluent is not particularly limited. 500 mmol / L.
  • the concentration of the salt exceeds 500 mmol / L, the salt may precipitate and adversely affect the system.
  • a more preferable upper limit of the salt concentration is 200 mmol / L.
  • the eluent may contain a known acid or base as a pH adjuster.
  • the acid include hydrochloric acid, phosphoric acid, nitric acid, sulfuric acid, and the like.
  • Examples of the base include sodium hydroxide, potassium hydroxide, lithium hydroxide, magnesium hydroxide, barium hydroxide, calcium hydroxide. Etc.
  • the eluent may contain a water-soluble organic solvent such as methanol, ethanol, acetonitrile, or acetone.
  • concentration of the water-soluble organic solvent is preferably such that no salt is precipitated, and the preferred upper limit is 80% (v / v).
  • hemoglobin S In the method for analyzing hemoglobin S according to the present invention 1, the method for analyzing hemoglobin A2 according to the present invention 2, and the method for analyzing hemoglobin A0 according to the present invention 3, the hemoglobin S, hemoglobin A2, and hemoglobin A0 having strong holding power have been described above.
  • hemoglobins having a weak holding power may be eluted using another eluent having a lower pH than the eluent described above prior to the eluent described above. In that case, it is preferable that each eluent uses a buffer solution containing the same component.
  • the baseline fluctuation of the detector output when switching the eluent does not adversely affect the measured value, it is not necessarily the same. It is not limited to what uses the buffer solution containing a component. Furthermore, in order to further reduce the baseline fluctuation, it is more preferable to use the same buffer concentration.
  • cation exchange high performance liquid chromatography is used.
  • a known method can be used as the cation exchange high performance liquid chromatography.
  • the eluent is sent using a pump, passed through a degasser, then sent to a cation exchange column, and hemoglobins retained on the cation exchange column are separated to elute the mobile phase eluted from the cation exchange column. Can be used.
  • the cation exchange column used in the analysis method of hemoglobin S of the present invention 1, the analysis method of hemoglobin A2 of the present invention 2, and the analysis method of hemoglobin A0 of the present invention 3 is a column body packed with a stationary phase.
  • the stationary phase include filler particles and porous bodies, and filler particles are preferable.
  • the filler particles include inorganic particles and organic particles.
  • the inorganic particles include particles composed of silica, zirconia and the like.
  • the organic particles include natural polymer particles such as cellulose, polyamino acid, and chitosan, and synthetic polymer particles such as polystyrene and polyacrylate.
  • the stationary phase it is preferable to use a stationary phase having a cation exchange group.
  • the cation exchange group include a carboxyl group, a phosphate group, and a sulfonate group.
  • the measurement conditions in the analysis method of hemoglobin S of the present invention 1, the analysis method of hemoglobin A2 of the present invention 2, and the analysis method of hemoglobin A0 of the present invention 3 are appropriately determined depending on the type of measurement sample used, cation exchange column, etc.
  • a preferable lower limit of the eluent flow rate is 0.05 mL / min
  • a preferable upper limit is 5 mL / min
  • a more preferable lower limit is 0.2 mL / min
  • a more preferable upper limit is 3 mL / min.
  • the detection wavelength of hemoglobins is preferably 415 nm, but is not particularly limited thereto.
  • the measurement sample one obtained by diluting hemolyzed blood with a solution containing a substance having hemolytic activity such as a surfactant is usually used.
  • the sample injection amount varies depending on the dilution rate of the blood sample, but is preferably about 0.1 to 100 ⁇ L.
  • hemoglobin S which has strong retention, can be separated with a sharp peak having high symmetry even with hemoglobin S, hemoglobin A2, and hemoglobin A0.
  • the method, the analysis method of hemoglobin A2, and the analysis method of hemoglobin A0 can be provided.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between the pH of eluents 2 to 13 and the symmetry coefficient of peak 2 in measurement sample A.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between the pH of eluents 2 to 13 and the elution time difference between peak 2 of measurement sample A and peak 3 of measurement sample B.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between the pH of eluents 2 to 13 and the separation degree of peak 2 in measurement sample A.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between the pH of eluents 2 to 13 in measurement sample A and the height of valleys between peak 1 and peak 2. It is the chromatogram of the measurement specimen D which used the eluent 16 for the elution over 0.7 minutes to 1.1 minutes. It is the chromatogram of the measurement specimen D which used the eluent 17 for the elution over 0.7 minutes to 1.1 minutes. It is the chromatogram of the measurement specimen D which used the eluent 18 for elution over 0.7 minutes to 1.1 minutes. It is the chromatogram of the measurement sample D which used the eluent 19 for the elution over 0.7 minutes to 1.1 minutes.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between the pH of the eluents 16 to 22 in the measurement sample D and the symmetry coefficient of peak 4. It is the chromatogram of the measurement specimen E which used the eluent 25 for the elution over 0.6 minutes to 1.0 minutes.
  • FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the pH of eluents 25 to 31 in the measurement sample E and the symmetry coefficient of peak 1;
  • Example 1 The following three samples were used as measurement samples.
  • a sample A was prepared by diluting blood containing hemoglobin S 100-fold with a diluent (phosphate buffer (pH 7.00) containing 0.1% Triton X-100).
  • An AFSC control (manufactured by Helena Laboratories) diluted 50-fold with (phosphate buffer (pH 7.00) containing 0.1% Triton X-100) was used as measurement sample B.
  • Measurement sample C was prepared by mixing measurement sample A and measurement sample B at a ratio of 1: 1.
  • a cation exchange resin packed product is used as the cation exchange column, and the HPLC apparatus includes SPD-M20A (manufactured by Shimadzu Corporation) as a detector, LC-20AD (manufactured by Shimadzu Corporation) as a liquid feed pump, and DGU- as a degasser.
  • SPD-M20A manufactured by Shimadzu Corporation
  • LC-20AD manufactured by Shimadzu Corporation
  • DGU- degasser
  • Elution with eluent 2 shown in Table 1 for more than 0.5 minutes to 1.0 minutes, and eluent for more than 1.0 minutes to 1.1 minutes 4 (0.8 wt% Triton X-100, 300 mmol / L sodium perchlorate, 1 mmol / L 40 mM phosphate phosphate buffer (pH 8.00) containing sodium azide), 1.1 minutes
  • elution was carried out with Eluent 1 for up to 1.5 minutes.
  • the elution time of hemoglobin S was set to about 50 seconds when the measurement sample A was measured by adjusting the buffer concentration.
  • the detection wavelength was 415 nm.
  • Examples 2 to 5 and Comparative Examples 1 to 7 Samples A, B, and C were measured in the same manner as in Example 1 except that eluents 3 to 13 shown in Table 1 were used as eluents for elution over 0.5 minutes to 1.0 minutes. Was measured.
  • the elution time of hemoglobin S was set to about 50 seconds when the measurement sample A was measured by adjusting the buffer concentration.
  • the pH and salt concentration of eluents 4 to 13 were adjusted so that the elution time of hemoglobin S was 50 seconds when the measurement sample A was measured (FIG. 1).
  • the measurement sample C was in a state where oxyhemoglobin and methemoglobin were present in the same ratio, and was used to set conditions under which peak bimodality would easily occur. 2 to 13, when eluents 2 to 6 were used, chromatograms in which peak 2 of measurement sample A was sharp were obtained. In the measurement sample C, a bimodal peak consisting of peaks 2 and 3 was confirmed when eluents 7 to 11 were used.
  • FIG. 14 shows the relationship between the pH of the eluents 2 to 13 and the symmetry coefficient of peak 2 in the measurement sample A.
  • FIG. 14 shows that the symmetry coefficient approaches 1 and the peak symmetry increases as the pH approaches 7 near the isoelectric point of hemoglobin.
  • FIG. 15 shows the relationship between the pH of eluents 2 to 13 calculated from the measurement results of measurement sample A and measurement sample B, and the elution time difference between peak 2 of measurement sample A and peak 3 of measurement sample B. It was. FIG. 15 shows that the elution times of peak 2 and peak 3 are the closest in the vicinity of pH 7.
  • the degree of separation of peak 2 in measurement sample A was calculated using the JP (Japanese Pharmacopoeia) method. The results are shown in Table 2. Further, FIG. 16 shows the relationship between the pH of the eluents 2 to 13 in the measurement sample A and the resolution of peak 2. From FIG. 16, it was confirmed that the degree of separation was improved as the pH near the isoelectric point of hemoglobin was closer to 7, and the separation between peak 1 and peak 2 was improved. Further, the height of the valley between the peak 1 and the peak 2 in the measurement sample A was calculated. The height of the valley between peak 1 and peak 2 in measurement sample A was used in combination with the degree of separation as an index indicating the degree of separation between adjacent peaks.
  • FIG. 17 shows the relationship between the pH of the eluents 2 to 13 in the measurement sample A and the valley height between the peak 1 and the peak 2. In FIG. 17, as the pH approached 7, the height of the valley fell, and it was confirmed that the separation between peak 1 and peak 2 was improved.
  • Hemoglobin A2 freeze-dried product (manufactured by Sigma, "Hemoglobin A2, Ferrous Stabilized human lyophilized powder") 5 mg diluted solution (containing 0.1% Triton X-100) after adding 100 ⁇ L of purified water
  • a sample diluted with a phosphate buffer (pH 7.00) was used as a measurement sample D.
  • a cation exchange resin packed product is used as the cation exchange column, and the HPLC apparatus includes SPD-M20A (manufactured by Shimadzu Corporation) as a detector, LC-20AD (manufactured by Shimadzu Corporation) as a liquid feed pump, and DGU- as a degasser.
  • Example 6 and 7 and Comparative Examples 9 to 12 The measurement sample D was measured in the same manner as in Comparative Example 8, except that eluents 17 to 22 shown in Table 3 were used as eluents for elution exceeding 0.7 minutes and up to 1.1 minutes.
  • Glycohemoglobin control level I (manufactured by Sysmex Corporation) was dissolved in 200 ⁇ L of purified water, and then diluted with 10 mL of a diluent (phosphate buffer (pH 7.00) containing 0.1% Triton X-100). This was designated as measurement sample E.
  • a cation exchange resin packed product is used as the cation exchange column, and the HPLC apparatus includes SPD-M20A (manufactured by Shimadzu Corporation) as a detector, LC-20AD (manufactured by Shimadzu Corporation) as a liquid feed pump, and DGU- as a degasser.
  • Example 8 to 10 and Comparative Examples 14 to 16 The measurement sample E was measured in the same manner as in Comparative Example 13 except that the eluents 26 to 31 shown in Table 4 were used as eluents used for elution exceeding 0.6 minutes and up to 1.0 minutes.
  • hemoglobin S which has strong retention, can be separated with a sharp peak having high symmetry even with hemoglobin S, hemoglobin A2, and hemoglobin A0.
  • the method, the analysis method of hemoglobin A2, and the analysis method of hemoglobin A0 can be provided.

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Abstract

本発明は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーにおいて、保持力の強いヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＡ２、及び、ヘモグロビンＡ０であっても対称性の高いシャープなピークで分離することができるヘモグロビンＳの分析方法、ヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、ヘモグロビンＡ０の分析方法を提供することを目的とする。 本発明は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＳの分析方法であって、アジ化物又はシアン化物を０．１～５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨが６．８０～７．５０である溶離液を用いるヘモグロビンＳの分析方法である。

Description

ヘモグロビンＳの分析方法、ヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、ヘモグロビンＡ０の分析方法
本発明は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーにおいて、保持力の強いヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＡ２、及び、ヘモグロビンＡ０であっても対称性の高いシャープなピークで分離することができるヘモグロビンＳの分析方法、ヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、ヘモグロビンＡ０の分析方法に関する。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるヘモグロビン類の分析は現在広く行われており、糖尿病診断ではグリコヘモグロビンの一種であるヘモグロビンＡ１ｃの定量や異常ヘモグロビンの分析等に用いられている。例えば、特許文献１には、血液検体を溶血希釈して調製した試料中のヘモグロビン類を、陽イオン交換法により、ヘモグロビン成分毎に異なるプラス荷電状態の違いを利用して分離する液体クロマトグラフィーを用いた方法が開示されている。近年の糖尿病患者の増加に伴い、ヘモグロビンＡ１ｃの測定件数も増加傾向にあり、ＨＰＬＣでの測定においても高精度測定と測定時間の短縮が求められている。
生体内において、ヘモグロビン類には、酸素が結合したオキシヘモグロビン、二酸化炭素が結合したデオキシヘモグロビン、ヘムに含まれている鉄が酸化されて三価の鉄イオンとなったメトヘモグロビンが存在する。また、アジ化物やシアン化物が共存している場合、アジ化物やシアン化物がメトヘモグロビンの三価の鉄イオンに結合し、アジドメトヘモグロビンやシアンメトヘモグロビンとなって安定化することが知られている。しかしながら、陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いるＨＰＬＣでは、オキシヘモグロビンの溶出時間と、これらのアジドメトヘモグロビンやシアンメトヘモグロビンの溶出時間とに違いが生じることがある。これらのヘモグロビン類の電荷の違いはわずかであるため、ピークが完全分離できずにブロード化したり二峰性を示したりする。
ＨＰＬＣを用いたヘモグロビン類の分析は、糖尿病診断の他に主に貧血を引き起こす異常ヘモグロビン症やサラセミアといった診断にも使用されている。なかでも、ヘモグロビンＳは最も多くみられる異常ヘモグロビンであり、重篤な貧血症状を引き起こす鎌状赤血球症の原因物質であるため、分離、検知の需要は大きい。また、糖尿病のマーカーであるヘモグロビンＡ１ｃを測定する際には、ヘモグロビンＳをはじめとした異常ヘモグロビンを分離することが望ましく、ピークがブロード化したり二峰性となっていたりしては正常ヘモグロビンとの分離が困難となるとともに、測定値への悪影響が懸念されるため、シャープなピークとして分離させることが好ましい。一方、サラセミアの診断ではヘモグロビンＡ２を測定する必要があるが、微量成分であるとともに、多量に存在しているヘモグロビンＡ０と隣接して溶出されることが多いため、ヘモグロビンＡ０、Ａ２ともにシャープなピークとして分離させることが好ましい。しかしながら、陽イオン交換クロマトグラフィーにおいて、陽イオン交換カラムとの保持力が比較的強い成分は、ピークがブロード化したり二峰性となったりしやすいという問題がある。
また、新鮮血よりも劣化血の方がブロードや二峰性のピークを生じやすい傾向がある。これは劣化により生じるメトヘモグロビンが増加することが原因である。そのため、再検査等で保存検体の分析を行う場合に測定値への影響が懸念されている。
特開２０００－１１１５３９号公報
本発明は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーにおいて、保持力の強いヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＡ２、及び、ヘモグロビンＡ０であっても対称性の高いシャープなピークで分離することができるヘモグロビンＳの分析方法、ヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、ヘモグロビンＡ０の分析方法を提供することを目的とする。
本発明１は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＳの分析方法であって、アジ化物又はシアン化物を０．１～５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨがヘモグロビンの等電点付近の６．８０～７．５０である溶離液を用いるヘモグロビンＳの分析方法である。
本発明２は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ２の分析方法であって、アジ化物又はシアン化物を０．１～５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨがヘモグロビンの等電点付近の６．４５～６．８５である溶離液を用いるヘモグロビンＡ２の分析方法である。
本発明３は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ０の分析方法であって、アジ化物又はシアン化物を０．１～５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨがヘモグロビンの等電点付近の６．００～６．７５である溶離液を用いるヘモグロビンＡ０の分析方法である。
以下に本発明を詳述する。
従来、保持力の強いヘモグロビン類を分離する場合、通常、ｐＨ６未満の溶離液が使用されており、本発明者らは、このｐＨ範囲がピークの形状に大きく影響を及ぼしていることを見出した。
そこで本発明者らは、特定の濃度でアジ化物又はシアン化物を配合することによってメトヘモグロビンを安定化させた溶離液のｐＨをヘモグロビンの等電点付近の特定の範囲に調整することにより、保持力の強いヘモグロビン類であっても対称性の高いシャープなピークで分離することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
なお、本明細書において「保持力の強いヘモグロビン類」とは、陽イオン交換カラムに対する保持力の強いヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＳを意味する。ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＳの等電点は６．９５～７．４５の範囲内であることが知られている。また、本明細書において「保持力の弱いヘモグロビン類」とは、陽イオン交換カラムに対する保持力の弱いヘモグロビン類を意味し、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＦ、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ等が挙げられる。なお、保持力はヘモグロビンの立体構造によっても変化するため、イオン交換クロマトグラフィーにおいて、等電点と溶出順は必ずしも一致するとは限らない。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法では、アジ化物又はシアン化物を含有する溶離液を用いる。
上記溶離液が上記アジ化物又は上記シアン化物を含有することにより、メトヘモグロビンを安定化させることができる。なお、一般的にヘモグロビン類の定量は４１５ｎｍ付近の吸光度により測定しているが、オキシヘモグロビンと、アジドメトヘモグロビン及びシアンメトヘモグロビンとの４１５ｎｍ付近の吸光度スペクトルにはほとんど差はなく、定量性に支障はないと考えられる。一方、溶離液中にアジ化物又はシアン化物が含まれていない場合、メトヘモグロビンとして存在し、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーでは溶出時間が大幅に遅くなることが知られている。また、外部環境による異なるが、吸光度の極大値が４０５ｎｍ付近となるため、４１５ｎｍの波長では定量性に悪影響を及ぼすことがある。
上記アジ化物としては、例えば、アジ化ナトリウム、ジフェニルリン酸アジド、４－ドデシルベンゼンスルフォニルアジド、４－アセチルアミノベンゼンスルフォニルアジド、アジ化カリウム、アジ化リチウム、アジ化鉄、アジ化水素、アジ化鉛、アジ化水銀、アジ化銅、アジ化銀等が挙げられる。
上記シアン化物としては、例えば、シアン化カリウム、シアン化水素、シアン化ナトリウム、シアン化銀、シアン化水銀、シアン化銅、シアン化鉛、シアン化鉄、シアン化リチウム、シアン化アンモニウム等が挙げられる。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法において、上記溶離液中の上記アジ化物又は上記シアン化物の濃度の下限は０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、上限は５０ｍｍｏｌ／Ｌである。上記アジ化物又は上記シアン化物の濃度が０．１ｍｍｏｌ／Ｌであると、メトヘモグロビンを安定化する効果が充分に得られない。上記アジ化物又は上記シアン化物の濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、過度なメト化の進行やヘモグロビン類の分解が発生する。上記アジ化物又は上記シアン化物の濃度の好ましい下限は０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は３０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい下限は１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法を用いれば、保持力の強いヘモグロビンＳであっても、対称性の高いシャープなピークで分離することができる。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法において、上記溶離液のｐＨの下限は６．８０、上限は７．５０である。上記溶離液のｐＨが６．８０未満であると、ＨＰＬＣを用いてヘモグロビンＳを測定した際のピークのリーディングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰性を示したりする。上記溶離液のｐＨが７．５０を超えると、陽イオン交換カラムとの保持が弱まり溶出時間が極端に早くなるほか、ピークのテーリングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰性を示したりする。本発明１のヘモグロビンＳの分析方法において、上記溶離液のｐＨの好ましい下限は６．９５、好ましい上限は７．４５、より好ましい下限は７．００、より好ましい上限は７．４０である。
また、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法を用いれば、保持力の強いヘモグロビンＡ２であっても、対称性の高いシャープなピークで分離することができる。
本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法において、上記溶離液のｐＨの下限は６．４５、上限は６．８５である。上記溶離液のｐＨが６．４５未満であると、ＨＰＬＣを用いてヘモグロビンＡ２を測定した際のピークのリーディングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰性を示したりする。上記溶離液のｐＨが６．８５を超えると、陽イオン交換カラムとの保持が弱まり溶出時間が極端に早くなるほか、ピークのテーリングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰性を示したりする。本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法において、上記溶離液のｐＨの好ましい下限は６．５０、好ましい上限は６．８０である。
更に、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法を用いれば、保持力の強いヘモグロビンＡ０であっても、対称性の高いシャープなピークで分離することができる。
本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法において、上記溶離液のｐＨの下限は６．００、上限は６．７５である。上記溶離液のｐＨが６．００未満であると、ＨＰＬＣを用いてヘモグロビンＡ０を測定した際のピークのリーディングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰性を示したりする。上記溶離液のｐＨが６．７５を超えると、陽イオン交換カラムとの保持が弱まり溶出時間が極端に早くなるほか、ピークのテーリングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰性を示したりする。本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法において、上記溶離液のｐＨの好ましい下限は６．２０、好ましい上限は６．７０、より好ましい下限は６．４０、より好ましい上限は６．６５である。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法において、上記溶離液としては、上記アジ化物又は上記シアン化物の濃度、及び、ｐＨが上述した範囲内であれば特に限定されず、例えば、有機酸及びその塩類、アミノ酸類、無機酸及びその塩類、グッドの緩衝剤等の緩衝剤を含有する公知の緩衝液を用いることができる。
上記有機酸としては、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
上記アミノ酸類としては、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
上記無機酸としては、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
また、上記緩衝液には、必要に応じて、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等を適宜添加してもよい。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法において、上記溶離液の緩衝剤濃度は特に限定されないが、好ましい下限は５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は５００ｍｍｏｌ／Ｌである。上記緩衝剤濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、緩衝作用が充分に得られないことがある。上記緩衝剤濃度が５００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、緩衝剤の析出が起こりＨＰＬＣの流路を詰まらせる原因となったり、溶離液の切り替え効率が低下して平衡化に時間がかかる原因となったりする。上記緩衝剤濃度のより好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は２００ｍｍｏｌ／Ｌである。
上記溶離液は、ヘモグロビン類のピーク溶出を最適化することを目的として、過塩素酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム等の無機塩類を含有してもよい。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法において、上記溶離液中における塩の濃度は特に限定されないが、好ましい上限は５００ｍｍｏｌ／Ｌである。上記塩の濃度が５００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、塩が析出してシステムに悪影響を及ぼすことがある。上記塩の濃度のより好ましい上限は２００ｍｍｏｌ／Ｌである。
上記溶離液は、ｐＨ調整剤として、公知の酸、塩基を含有してもよい。上記酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等が挙げられ、上記塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。
上記溶離液は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等の水溶性有機溶媒を含有していてもよい。上記水溶性有機溶媒の濃度は、塩等が析出しない程度で用いることが好ましく、好ましい上限は８０％（ｖ／ｖ）である。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法において、保持力の強いヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＡ２、及び、ヘモグロビンＡ０は上述した溶離液で分離するが、保持力の弱いヘモグロビン類は、上述した溶離液に先立って、上述した溶離液よりもｐＨの低い他の溶離液を用いて溶出してもよい。その場合、各溶離液は同一の成分を含む緩衝液を用いるものであることが好ましいが、溶離液を切り替える際の検出器出力のベースライン変動が測定値に悪影響を与えなければ、必ずしも同一の成分を含む緩衝液を用いるものに限定されない。
更に、ベースライン変動をより小さくするために、緩衝剤濃度も同一であるものを用いることがより好ましい。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法では、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーを用いる。上記陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーとしては、公知の方法を用いることができる。例えば、ポンプを用いて溶離液を送液し、デガッサーを通した後に陽イオン交換カラムに送り、陽イオン交換カラムに保持されたヘモグロビン類を分離させて、陽イオン交換カラムから溶出してきた移動相を検出する方法を用いることができる。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法で用いる陽イオン交換カラムは、カラム本体に固定相が充填されたものである。固定相としては、充填剤粒子、多孔質体等が挙げられ、充填剤粒子が好ましい。
上記充填剤粒子としては、無機系粒子、有機系粒子等が挙げられる。
上記無機系粒子としては、シリカ、ジルコニア等で構成される粒子が挙げられる。
上記有機系粒子としては、セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子粒子や、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子粒子が挙げられる。
上記固定相としては、陽イオン交換基を有する固定相を用いることが好ましい。
上記陽イオン交換基としては、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法における測定条件は、使用する測定試料、陽イオン交換カラム等の種類によって適宜選択できるが、上記溶離液の流速の好ましい下限は０．０５ｍＬ／分、好ましい上限は５ｍＬ／分、より好ましい下限は０．２ｍＬ／分、より好ましい上限は３ｍＬ／分である。ヘモグロビン類の検出波長は４１５ｎｍが好ましいが、特にこれのみに限定されるわけではない。測定試料は、通常、界面活性剤等の溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いる。試料注入量は、血液検体の希釈倍率により異なるが、好ましくは０．１～１００μＬ程度である。
本発明によれば、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーにおいて、保持力の強いヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＡ２、及び、ヘモグロビンＡ０であっても対称性の高いシャープなピークで分離することができるヘモグロビンＳの分析方法、ヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、ヘモグロビンＡ０の分析方法を提供することができる。
ヘモグロビンＳの溶出時間が５０秒となる溶離液のｐＨと過塩素酸ナトリウムの濃度との関係を示した図である。 ０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液２を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。 ０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液３を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。 ０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液４を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。 ０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液５を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。 ０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液６を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。 ０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液７を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。 ０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液８を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。 ０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液９を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。 ０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液１０を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。 ０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液１１を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。 ０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液１２を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。 ０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液１３を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。 測定検体Ａにおける溶離液２～１３のｐＨとピーク２のシンメトリー係数との関係を示した図である。 溶離液２～１３のｐＨと、測定検体Ａのピーク２と測定検体Ｂのピーク３との溶出時間差との関係を示した図である。 測定検体Ａにおける溶離液２～１３のｐＨとピーク２の分離度との関係を示した図である。 測定検体Ａにおける溶離液２～１３のｐＨと、ピーク１とピーク２との谷落ち高さとの関係を示した図である。 ０．７分を超え１．１分までの溶出に溶離液１６を用いた測定検体Ｄのクロマトグラムである。 ０．７分を超え１．１分までの溶出に溶離液１７を用いた測定検体Ｄのクロマトグラムである。 ０．７分を超え１．１分までの溶出に溶離液１８を用いた測定検体Ｄのクロマトグラムである。 ０．７分を超え１．１分までの溶出に溶離液１９を用いた測定検体Ｄのクロマトグラムである。 ０．７分を超え１．１分までの溶出に溶離液２０を用いた測定検体Ｄのクロマトグラムである。 ０．７分を超え１．１分までの溶出に溶離液２１を用いた測定検体Ｄのクロマトグラムである。 ０．７分を超え１．１分までの溶出に溶離液２２を用いた測定検体Ｄのクロマトグラムである。 測定検体Ｄにおける溶離液１６～２２のｐＨとピーク４のシンメトリー係数との関係を示した図である。 ０．６分を超え１．０分までの溶出に溶離液２５を用いた測定検体Ｅのクロマトグラムである。 ０．６分を超え１．０分までの溶出に溶離液２６を用いた測定検体Ｅのクロマトグラムである。 ０．６分を超え１．０分までの溶出に溶離液２７を用いた測定検体Ｅのクロマトグラムである。 ０．６分を超え１．０分までの溶出に溶離液２８を用いた測定検体Ｅのクロマトグラムである。 ０．６分を超え１．０分までの溶出に溶離液２９を用いた測定検体Ｅのクロマトグラムである。 ０．６分を超え１．０分までの溶出に溶離液３０を用いた測定検体Ｅのクロマトグラムである。 ０．６分を超え１．０分までの溶出に溶離液３１を用いた測定検体Ｅのクロマトグラムである。 測定検体Ｅにおける溶離液２５～３１のｐＨとピーク１のシンメトリー係数との関係を示した図である。
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されない。
（実施例１）
測定検体には以下の３種を用いた。
ヘモグロビンＳを含む血液を希釈液（０．１％トリトンＸ－１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．００））で１００倍に希釈したものを測定検体Ａとした。
ＡＦＳＣコントロール（ヘレナ研究所社製）を（０．１％トリトンＸ－１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．００））で５０倍に希釈したものを測定検体Ｂとした。
測定検体Ａと測定検体Ｂとを１：１で混合したものを測定検体Ｃとした。
陽イオン交換カラムとして陽イオン交換樹脂充填品を用い、ＨＰＬＣ装置には、検出器としてＳＰＤ－Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）、送液ポンプとしてＬＣ－２０ＡＤ（島津製作所社製）、デガッサーとしてＤＧＵ－２０Ａ５（島津製作所社製）、カラムオーブンとしてＣＴＯ－２０ＡＣ（島津製作所社製）、オートサンプラーとしてＳＩＬ－２０ＡＣ（島津製作所社製）を用い、流速を１．７ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長を４１５ｎｍ、試料注入量を１０μＬとして、０～０．５分は溶離液１（６０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．３５））にて溶出し、０．５分を超え１．０分までは表１に示した溶離液２にて溶出し、１．０分を超え１．１分までは溶離液１４（０．８重量％トリトンＸ－１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．００））にて溶出し、１．１分を超え１．５分までは溶離液１にて溶出して測定を行った。溶離液２では緩衝剤濃度を調整することで測定検体Ａを測定した時にヘモグロビンＳの溶出時間が約５０秒となるよう設定した。
検出波長は４１５ｎｍで行った。
（実施例２～５、及び、比較例１～７）
０．５分を超え１．０分までの溶出に用いる溶離液として表１に示した溶離液３～１３を用いたこと以外は実施例１と同様にして測定検体Ａ、Ｂ、及び、Ｃを測定した。溶離液３では緩衝剤濃度を調整することで測定検体Ａを測定した時にヘモグロビンＳの溶出時間が約５０秒となるよう設定した。また、溶離液４～１３は、測定検体Ａを測定した時にヘモグロビンＳの溶出時間が５０秒となるようにｐＨと塩濃度を調整した（図１）。
＜評価＞
実施例１～５、及び、比較例１～７において、溶離液２～１３を送液している０．５分を超え１．０分までの領域を抜粋した測定検体Ａ、Ｂ、及び、Ｃのクロマトグラムを図２～１３に示す。図２～１３において、ピーク１はヘモグロビンＡ０、ピーク２はオキシ状態のヘモグロビンＳ、ピーク３はアジドメトヘモグロビンＳを示す。なお、一般的にヘモグロビンＳを含む検体は測定検体Ａと同様のクロマトグラムを示し、オキシ状態のヘモグロビンがリッチな状態である。測定検体Ｂはほとんどのヘモグロビンがメト化しているものであり、メトヘモグロビンがリッチな状態である。これは通常検体を極端に劣化させた場合と同様の状態である。測定検体Ｃはオキシ状態のヘモグロビンとメトヘモグロビンをそれぞれ同程度の比率で存在した状態であり、ピークの二峰性が生じやすい条件を設定するために用いた。
図２～１３より、溶離液２～６を用いた場合、測定検体Ａのピーク２がシャープとなるクロマトグラムが得られた。また、測定検体Ｃにおいては溶離液７～１１を用いた場合にピーク２、３からなる二峰性ピークが確認された。
（ピーク形状）
測定検体Ａにおけるピーク２のシンメトリー係数を算出した。シンメトリー係数は１に近いほどピーク形状が正規分布に近いことを示しており、ピーク形状の判断指標として用いた。通常、シンメトリー係数の算出にはピーク高さの５％位置のピーク幅を用いるが、本例ではピーク２の前にピーク１が隣接しているため、５％位置のピーク幅が算出できなかったことから、半値幅を用いて算出した。結果を表２に示した。また、測定検体Ａにおける溶離液２～１３のｐＨとピーク２のシンメトリー係数との関係を図１４に示した。図１４より、ｐＨがヘモグロビンの等電点付近の７に近づくほどシンメトリー係数が１に近づき、ピークの対称性が高まることが分かる。
更に、測定検体Ａのピーク２と測定検体Ｂのピーク３との溶出時間差を算出した。測定検体Ａのピーク２と測定検体Ｂのピーク３の溶出時間差はオキシ状態のヘモグロビンＳとアジドメトヘモグロビンの溶出時間差を示しており、この差が小さいほど溶出時間が近づき単一ピークとなるため、シンメトリー係数と合わせてピーク形状の判断指標として用いた。結果を表２に示した。また、測定検体Ａと測定検体Ｂの測定結果から算出した、溶離液２～１３のｐＨと、測定検体Ａのピーク２と測定検体Ｂのピーク３との溶出時間差との関係を図１５に示した。図１５より、ｐＨ７付近でピーク２とピーク３の溶出時間が最も近づくことが分かる。
（隣接ピーク間の分離程度）
測定検体Ａにおけるピーク２の分離度を、ＪＰ（日本薬局方）法を用いて算出した。結果を表２に示した。また、測定検体Ａにおける溶離液２～１３のｐＨとピーク２の分離度との関係を図１６に示した。図１６より、ヘモグロビンの等電点付近のｐＨが７に近づくほど分離度が向上しており、ピーク１とピーク２の分離が向上していることが確認された。
更に、測定検体Ａにおけるピーク１とピーク２との谷落ち高さを算出した。測定検体Ａにおけるピーク１とピーク２との谷落ち高さは隣接ピーク間の分離程度を示す指標として分離度と合わせて用いた。なお、ピーク１とピーク２との谷落ち高さとはピーク１とピーク２の間で最も高さが低い位置を示す。結果を表２に示した。また、測定検体Ａにおける溶離液２～１３のｐＨとピーク１とピーク２との谷落ち高さとの関係を図１７に示した。図１７でもｐＨが７に近づくことで谷落ち高さが低下しており、ピーク１とピーク２の分離が向上していることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（比較例８）
ヘモグロビンＡ２凍結乾燥品（シグマ社製、「Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　Ａ２，　Ｆｅｒｒｏｕｓ　Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ　ｐｏｗｄｅｒ」）５ｍｇに精製水１００μＬを加えて溶解させた後、５ｍＬの希釈液（０．１％トリトンＸ－１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．００））で希釈したものを測定検体Ｄとした。
陽イオン交換カラムとして陽イオン交換樹脂充填品を用い、ＨＰＬＣ装置には、検出器としてＳＰＤ－Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）、送液ポンプとしてＬＣ－２０ＡＤ（島津製作所社製）、デガッサーとしてＤＧＵ－２０Ａ５（島津製作所社製）、カラムオーブンとしてＣＴＯ－２０ＡＣ（島津製作所社製）、オートサンプラーとしてＳＩＬ－２０ＡＣ（島津製作所社製）を用い、流速を１．７ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長を４１５ｎｍ、試料注入量を１０μＬとして、０～０．７分は溶離液１（６０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．３５））にて溶出し、０．７分を超え１．１分までは表３に示した溶離液１６にて溶出し、１．１分を超え１．２分までは溶離液１４（０．８重量％トリトンＸ－１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．００））にて溶出し、１．２分を超え１．５分までは溶離液１にて溶出して測定を行った。
（実施例６、７、及び、比較例９～１２）
０．７分を超え１．１分までの溶出に用いる溶離液として表３に示した溶離液１７～２２を用いたこと以外は比較例８と同様にして測定検体Ｄを測定した。
＜評価＞
実施例６、７、及び、比較例８～１２において、溶離液１６～２２を送液している０．７分を超え１．１分までの領域を抜粋した測定検体Ｄのクロマトグラムを図１８～２４に示す。図１８～２４において、ピーク４はヘモグロビンＡ２を示す。
図１８～２４より、溶離液１８及び溶離液１９を用いた場合、測定検体Ｄのピーク４がシャープとなるクロマトグラムが得られた。また、溶離液１６、１７、２０～２２を用いた場合、ピークのリーディングやテーリングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰化したりすることが確認された。
（ピーク形状）
測定検体Ｄにおけるピーク４のシンメトリー係数を算出した。シンメトリー係数は１に近いほどピーク形状が正規分布に近いことを示しており、ピーク形状の判断指標として用いた。シンメトリー係数の算出にはピーク高さの５％位置のピーク幅を用いた。測定検体Ｄにおける溶離液１６～２２のｐＨとピーク４のシンメトリー係数との関係を図２５に示した。図２５より、ｐＨが高いほどシンメトリー係数が低下し、ｐＨ６．２５～６．７０で１に近づくことが分かる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（比較例１３）
グリコヘモグロビンコントロール　レベルＩ（シスメックス社製）に精製水２００μＬを加えて溶解させた後、１０ｍＬの希釈液（０．１％トリトンＸ－１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．００））で希釈したものを測定検体Ｅとした。
陽イオン交換カラムとして陽イオン交換樹脂充填品を用い、ＨＰＬＣ装置には、検出器としてＳＰＤ－Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）、送液ポンプとしてＬＣ－２０ＡＤ（島津製作所社製）、デガッサーとしてＤＧＵ－２０Ａ５（島津製作所社製）、カラムオーブンとしてＣＴＯ－２０ＡＣ（島津製作所社製）、オートサンプラーとしてＳＩＬ－２０ＡＣ（島津製作所社製）を用い、流速を１．７ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長を４１５ｎｍ、試料注入量を１０μＬとして、０～０．６分は溶離液１（６０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．３５））にて溶出し、０．６分を超え１．０分までは表４に示した溶離液２５にて溶出し、１．０分を超え１．１分までは溶離液１４（０．８重量％トリトンＸ－１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．００））にて溶出し、１．１分を超え１．５分までは溶離液１にて溶出して測定を行った。
（実施例８～１０、及び、比較例１４～１６）
０．６分を超え１．０分までの溶出に用いる溶離液として表４に示した溶離液２６～３１を用いたこと以外は比較例１３と同様にして測定検体Ｅを測定した。
＜評価＞
実施例８～１０、及び、比較例１３～１６において、溶離液２５～３１を送液している０．６分を超え１．０分までの領域を抜粋した測定検体Ｅのクロマトグラムを図２６～３２に示す。図２６～３２において、ピーク１はヘモグロビンＡ０を示す。
図２６～３２より、溶離液２８～３０を用いた場合、測定検体Ｅのピーク１がシャープとなるクロマトグラムが得られた。また、溶離液２５～２７、３１を用いた場合、ピークのリーディングやテーリングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰化したりすることが確認された。
（ピーク形状）
測定検体Ｅにおけるピーク１のシンメトリー係数を算出した。シンメトリー係数は１に近いほどピーク形状が正規分布に近いことを示しており、ピーク形状の判断指標として用いた。シンメトリー係数の算出にはピーク高さの５％位置のピーク幅を用いた。測定検体Ｅにおける溶離液２５～３１のｐＨとピーク１のシンメトリー係数との関係を図３３に示した。図３３より、ｐＨが高いほどシンメトリー係数が低下し、ｐＨ６．６０～７．００で１に近づくことが分かる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
本発明によれば、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーにおいて、保持力の強いヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＡ２、及び、ヘモグロビンＡ０であっても対称性の高いシャープなピークで分離することができるヘモグロビンＳの分析方法、ヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、ヘモグロビンＡ０の分析方法を提供することができる。
１　ヘモグロビンＡ０
２　オキシ状態のヘモグロビンＳ
３　アジドメトヘモグロビンＳ
４　ヘモグロビンＡ２

Claims (9)

  1. 陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＳの分析方法であって、
    アジ化物又はシアン化物を０．１～５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨが６．８０～７．５０である溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビンＳの分析方法。
  2. 溶離液の塩濃度が、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする請求項１記載のヘモグロビンＳの分析方法。
  3. 溶離液の緩衝剤濃度が、５～５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１又は２記載のヘモグロビンＳの分析方法。
  4. 陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ２の分析方法であって、
    アジ化物又はシアン化物を０．１～５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨが６．４５～６．８５である溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビンＡ２の分析方法。
  5. 溶離液の塩濃度が、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする請求項４記載のヘモグロビンＡ２の分析方法。
  6. 溶離液の緩衝剤濃度が、５～５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項４又は５記載のヘモグロビンＡ２の分析方法。
  7. 陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ０の分析方法であって、
    アジ化物又はシアン化物を０．１～５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨが６．００～６．７５である溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビンＡ０の分析方法。
  8. 溶離液の塩濃度が、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする請求項７記載のヘモグロビンＡ０の分析方法。
  9. 溶離液の緩衝剤濃度が、５～５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項７又は８記載のヘモグロビンＡ０の分析方法。
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