JP5875160B2 - ヘモグロビン類の分析方法 - Google Patents
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Description
また、新鮮血よりも劣化血の方がブロードや二峰性の溶出ピークを生じやすい傾向がある。これは劣化により生じるメトヘモグロビンが増加することが原因である。そのため、再検査等で保存検体の分析を行う場合に測定値への影響が懸念されている。
しかしながら、特許文献1〜3に開示されている方法を用いても、血液検体にオキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビン、メトヘモグロビン等の各種ヘモグロビン類が混在する状況においては、HPLCで測定した場合に溶出ピークがブロード化したり二峰性を示したりすることがある。
なお、各種ヘモグロビン類の検出、定量には一般的に分光光度計による吸光度が用いられるが、オキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビン、メトヘモグロビン、アジドメトヘモグロビン、シアンメトヘモグロビンはそれぞれの吸光スペクトルが異なっているため、これらが混在していると正確なヘモグロビン量を測定することができないことがある。
以下に本発明を詳述する。
酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で検体を処理することにより、ヘモグロビン類の分離能を向上させつつヘモグロビン類の溶出時間を短縮できる。更に、HPLC装置のデガッサーの立ち上げ直後の気体除去能力が安定しない場合においても、ヘモグロビン類の溶出時間の変動が発生しなくなるとともに、検出される溶出ピークがブロード化したり二峰性を示したりすることがなく、ヘモグロビン類が高精度に分離される。
なお、本発明において、「予め検体を酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で処理する」とは、ヘモグロビン類が分離カラムで分離される前に、検体を酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で処理することを意味し、液体クロマトグラフィーでの測定開始前に処理することに限定されない。具体的には例えば、検体前処理液及び/又は溶離液に、表1に記載した組み合わせのいずれかで酸化剤と三価のヘム鉄への結合剤とを配合することにより、ヘモグロビン類が分離される前に検体を酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で処理できる。表1中、「○」は配合することを意味し、「−」は配合しないことを意味する。
酸化剤としては、ヘモグロビン類のヘム鉄を二価から三価に変化させる効果があれば特に限定されず、例えば、亜硝酸塩、フェリシアン化カリウム、メチレンブルー、過酸化水素、アスコルビン酸、硫化水素等が挙げられる。なかでも、亜硝酸塩が好適であり、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウムがより好適である。これらの酸化剤を用いることで、酸化力が強すぎてヘモグロビン類が分解したりすることがなく、また、メトヘモグロビンと結合して溶出パターンが大きく変化したり、ヘモグロビン類を検出する波長と酸化剤の吸光スペクトルが干渉してHPLC測定中にベースラインの変動が生じたりすることがなく、ヘモグロビン類の定量性により優れたものとなる。
三価のヘム鉄への結合剤としては、例えば、アジ化物、シアン化物等が挙げられる。三価のヘム鉄への結合剤としてアジ化物又はシアン化物を用いることにより、メトヘモグロビンの構造を大きく変えてしまうことがなく、ヘモグロビン類の溶出挙動を大きく変化させてしまうこともない。従って、ヘモグロビン類の定量性により優れたものとなる。
シアン化物としては、例えば、シアン化カリウム、シアン化水素、シアン化ナトリウム、シアン化銀、シアン化水銀、シアン化銅、シアン化鉛、シアン化鉄、シアン化リチウム、シアン化アンモニウム等が挙げられる。
これらの三価のヘム鉄への結合剤のなかでも、アジ化ナトリウムが好適である。
有機酸としては、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
アミノ酸類としては、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
無機酸としては、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
また、緩衝液には、必要に応じて、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等が適宜添加されていてもよい。
有機酸としては、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
アミノ酸類としては、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
無機酸としては、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
また、緩衝液は、必要に応じて、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等が適宜添加されていてもよい。
イオン交換液体クロマトグラフィーとしては、公知の方法を用いることができる。例えば、ポンプを用いて溶離液を分離カラムに送液する際に、溶離液を、デガッサーを通した後に測定試料を注入して分離カラムに送り、分離カラムでヘモグロビン類を分離させて、溶出してきた溶出液中の分離成分を検出器により検出する方法が挙げられる。
充填剤粒子としては、無機系粒子、有機系粒子等が挙げられる。
無機系粒子としては、シリカ、ジルコニア等で構成される粒子が挙げられる。
有機系粒子としては、セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子粒子や、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子粒子が挙げられる。
陽イオン交換基としては、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。
測定試料は、通常、界面活性剤等の溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された血液検体を希釈したものを用いる。測定試料の注入量は、血液検体の希釈倍率により異なるが、好ましくは0.1〜100μL程度である。
即ち、本発明によれば、液体クロマトグラフィーによって、ヘモグロビン類を短時間で高精度に分離し、分析できる。
ヘモグロビンSを含む血液検体を検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100を含有するリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
分離カラムとして、粒子表面にスルホン酸基を導入した陽イオン交換樹脂充填剤をカラム本体に充填したカラムを用いた。
HPLC装置には、オートサンプラーとしてSIL−20AC(島津製作所社製)、送液ポンプとしてLC−20AD(島津製作所社製)、デガッサーとしてDGU−20A5(島津製作所社製)、カラムオーブンとしてCTO−20AC(島津製作所社製)、検出器としてSPD−M20A(島津製作所社製)を用い、溶離液の流速を1.7mL/分、検出波長を415nm、測定試料注入量を10μLとした。
溶離液としては、0.5分までは溶離液1(60mmol/L過塩素酸ナトリウム、1mmol/L亜硝酸ナトリウム、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含む40mmol/Lリン酸緩衝液(pH5.4))にて溶出し、0.5分を超え1.0分までは溶離液2(10mmol/L過塩素酸ナトリウム、1mmol/L亜硝酸ナトリウム、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))にて溶出し、1.0分を超え1.1分までは溶離液3(0.8重量%トリトンX−100、300mmol/L過塩素酸ナトリウム、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含む40mmol/Lリン酸緩衝液(pH8.0))にて溶出し、1.1分を超え1.5分までは溶離液1にて溶出して測定試料の測定を行った。
なお、HPLC装置の立ち上げ直後から連続して15回測定を行った。
測定試料は、実施例1と同様のものを用いた。
溶離液1を溶離液4(60mmol/L過塩素酸ナトリウム、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含む40mmol/Lリン酸緩衝液(pH5.4))、溶離液2を溶離液5(10mmol/L過塩素酸ナトリウム、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))に変更したこと以外は、実施例1と同様にして測定試料の測定を行った。
グリコヘモグロビンコントロールレベル2(シスメックス社製)を200μLの注射用水で溶解した後、検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100を含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンSを含む血液検体を検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100を含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
分離カラムは実施例1と同様の分離カラムを用いた。
実施例1と同様のHPLC装置を用い、流速を1.7mL/分、検出波長を415nm、測定試料注入量を10μLとした。
溶離液は、第1溶離液として溶離液6(30mmol/L過塩素酸ナトリウム、1mmol/L亜硝酸ナトリウム、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH5.4))と第2溶離液として溶離液7(0.8重量%トリトンX−100、300mmol/L過塩素酸ナトリウム、1mmol/L亜硝酸ナトリウム、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含む40mmol/Lリン酸緩衝液(pH8.0))とを用い、2液リニアグラジエントにて溶出して測定試料の測定を行った。第1溶離液と第2溶離液のグラジエント条件を図2に示した。図2は、第1溶離液と第2溶離液との合計量に対する第2溶離液の割合(重量%)を示している。また、得られたクロマトグラムを図3に示した。
グリコヘモグロビンコントロールレベル2(シスメックス社製)を200μLの注射用水で溶解した後、検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100、1mmol/L亜硝酸ナトリウム、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンSを含む血液検体を検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100、1mmol/L亜硝酸ナトリウム、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第2溶離液を、実施例1で用いた溶離液3(0.8重量%トリトンX−100、300mmol/L過塩素酸ナトリウム、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含む40mmol/Lリン酸緩衝液(pH8.0))に変更したこと以外は、実施例2と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図4に示した。
グリコヘモグロビンコントロールレベル2(シスメックス社製)を200μLの注射用水で溶解した後、検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100を含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンSを含む血液検体を検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100を含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第1溶離液を、溶離液8(30mmol/L過塩素酸ナトリウム、10mmol/L亜硝酸ナトリウム、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH5.4))に変更し、第2溶離液を、溶離液9(0.8重量%トリトンX−100、300mmol/L過塩素酸ナトリウム、10mmol/L亜硝酸ナトリウム、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含む40mmol/Lリン酸緩衝液(pH8.0))に変更したこと以外は、実施例2と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図5に示した。
グリコヘモグロビンコントロールレベル2(シスメックス社製)を200μLの注射用水で溶解した後、検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100を含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンSを含む血液検体を検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100を含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第1溶離液を、溶離液10(30mmol/L過塩素酸ナトリウム、1mmol/L亜硝酸ナトリウム、10mmol/Lアジ化ナトリウムを含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH5.4))に変更し、第2溶離液を、溶離液11(0.8重量%トリトンX−100、300mmol/L過塩素酸ナトリウム、1mmol/L亜硝酸ナトリウム、10mmol/Lアジ化ナトリウムを含む40mmol/Lリン酸緩衝液(pH8.0))に変更したこと以外は、実施例2と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図6に示した。
グリコヘモグロビンコントロールレベル2(シスメックス社製)を200μLの注射用水で溶解した後、検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100を含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンSを含む血液検体を検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100を含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第1溶離液を、溶離液12(30mmol/L過塩素酸ナトリウム、10mmol/L亜硝酸ナトリウム、10mmol/Lアジ化ナトリウムを含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH5.4))に変更し、第2溶離液を、溶離液13(0.8重量%トリトンX−100、300mmol/L過塩素酸ナトリウム、10mmol/L亜硝酸ナトリウム、10mmol/Lアジ化ナトリウムを含む40mmol/Lリン酸緩衝液(pH8.0))に変更したこと以外は、実施例2と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図7に示した。
グリコヘモグロビンコントロールレベル2(シスメックス社製)を200μLの注射用水で溶解した後、検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100、1mmol/Lフェリシアン化カリウム、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンSを含む血液検体を検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100、1mmol/Lフェリシアン化カリウム、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第1溶離液を、溶離液14(30mmol/L過塩素酸ナトリウム、1mmol/Lフェリシアン化カリウム、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH5.4))に変更し、第2溶離液を、溶離液15(0.8重量%トリトンX−100、300mmol/L過塩素酸ナトリウム、1mmol/Lフェリシアン化カリウム、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含む40mmol/Lリン酸緩衝液(pH8.0))に変更したこと以外は、実施例2と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図8に示した。
グリコヘモグロビンコントロールレベル2(シスメックス社製)を200μLの注射用水で溶解した後、検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンSを含む血液検体を検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第1溶離液を、溶離液16(30mmol/L過塩素酸ナトリウム、1mmol/Lフェリシアン化ナトリウム、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH5.4))に変更し、第2溶離液を、実施例1で用いた溶離液3(0.8重量%トリトンX−100、300mmol/L過塩素酸ナトリウム、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含む40mmol/Lリン酸緩衝液(pH8.0))に変更したこと以外は、実施例2と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図9に示した。
グリコヘモグロビンコントロールレベル2(シスメックス社製)を200μLの注射用水で溶解した後、検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンSを含む血液検体を検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第1溶離液を、溶離液17(30mmol/L過塩素酸ナトリウム、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH5.4))に変更し、第2溶離液を、実施例1で用いた溶離液3(0.8重量%トリトンX−100、300mmol/L過塩素酸ナトリウム、1mmol/Lアジ化ナトリウムを含む40mmol/Lリン酸緩衝液(pH8.0))に変更したこと以外は、実施例2と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図10に示した。
グリコヘモグロビンコントロールレベル2(シスメックス社製)を200μLの注射用水で溶解した後、検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100、1mmol/L亜硝酸ナトリウムを含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンSを含む血液検体を検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100、1mmol/L亜硝酸ナトリウムを含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第1溶離液を、溶離液18(30mmol/L過塩素酸ナトリウム、1mmol/L亜硝酸ナトリウムを含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH5.4))に変更し、第2溶離液を、溶離液19(0.8重量%トリトンX−100、300mmol/L過塩素酸ナトリウム、1mmol/L亜硝酸ナトリウムを含む40mmol/Lリン酸緩衝液(pH8.0))に変更したこと以外は、実施例2と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図11に示した。
グリコヘモグロビンコントロールレベル2(シスメックス社製)を200μLの注射用水で溶解した後、検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100を含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンSを含む血液検体を検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100を含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第1溶離液を、溶離液20(30mmol/L過塩素酸ナトリウム、1mmol/Lフェリシアン化カリウムを含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH5.4))に変更し、第2溶離液を、溶離液21(0.8重量%トリトンX−100、300mmol/L過塩素酸ナトリウムを含む40mmol/Lリン酸緩衝液(pH8.0))に変更したこと以外は、実施例2と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図12に示した。
グリコヘモグロビンコントロールレベル2(シスメックス社製)を200μLの注射用水で溶解した後、検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100を含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンSを含む血液検体を検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100を含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第1溶離液を、溶離液22(30mmol/L過塩素酸ナトリウム、25mmol/L亜硝酸ナトリウム、25mmol/Lアジ化ナトリウムを含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH5.4))に変更し、第2溶離液を、溶離液23(0.8重量%トリトンX−100、300mmol/L過塩素酸ナトリウム、25mmol/L亜硝酸ナトリウム、25mmol/Lアジ化ナトリウムを含む40mmol/Lリン酸緩衝液(pH8.0))に変更したこと以外は、実施例2と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図13に示した。
グリコヘモグロビンコントロールレベル2(シスメックス社製)を200μLの注射用水で溶解した後、検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100を含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
また、ヘモグロビンSを含む血液検体を検体前処理液(0.1重量%トリトンX−100を含有する10mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを測定試料として用いた。
第1溶離液を、溶離液24(30mmol/L過塩素酸ナトリウム、50mmol/L亜硝酸ナトリウム、50mmol/Lアジ化ナトリウムを含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH5.4))に変更し、第2溶離液を、溶離液25(0.8重量%トリトンX−100、300mmol/L過塩素酸ナトリウム、50mmol/L亜硝酸ナトリウム、50mmol/Lアジ化ナトリウムを含む40mmol/Lリン酸緩衝液(pH8.0))に変更したこと以外は、実施例2と同様にして測定試料の測定を行った。得られたクロマトグラムを図14に示した。
図3〜7(実施例2〜6)において、ピーク(A)、ピーク(C)はシャープな単一ピークとして分離していることが確認された。図8(実施例7)はクロマトグラムに少しドリフトが確認されたために定量性が若干低下したが、ピーク同定は可能なレベルであった。一方、図9(実施例8)のピーク(A)、ピーク(C)はわずかに3峰性又は2峰性を示すピークとして検出されたが、問題の無い程度であった。
また、図3〜9(実施例2〜8)ではピーク(B)はピーク(A)から分離していることが確認されたが、図10(比較例2)ではグリコヘモグロビンコントロール2を含有する測定試料ではピーク(B)はピーク(A)から全く分離できておらず、ヘモグロビンSを含有する測定試料ではピーク(A)の後ろにピーク(B)がわずかにショルダーとして確認できる程度であった。同様の現象は他のヘモグロビン種に対しても起こりえるものと考えられ、本発明を用いることで含有量の多いヘモグロビン種に隣接したピークを高精度に分離させ易くなる。
図11、12(比較例3、4)では亜硝酸ナトリウム又はフェリシアン化カリウムによりメト化されたヘモグロビンがピークとして検出されているが、ヘモグロビン類の分解物とみられるピークが検出された。
図13、14(比較例5、6)は亜硝酸ナトリウムとアジ化ナトリウムが共存していることから、単一ピークを形成しているものの、添加量が多過ぎるために溶出時間が早くなりすぎていた。しかしながら、単一ピークが形成されているので、緩衝剤濃度等の他の条件を調整することで、定量性を確保することが可能である。
Claims (7)
- 陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビン類の分析方法であって、前記ヘモグロビン類は、ヘモグロビンS、又は、ヘモグロビンA0とヘモグロビンSの両方であり、検体前処理液及び/又は溶離液に酸化剤と三価のヘム鉄への結合剤とを配合することにより、予め検体を酸化剤及び三価のヘム鉄への結合剤で処理するものであり、前記検体前処理液又は溶離液中の酸化剤の濃度が0.05〜10mmol/Lかつ三価のヘム鉄への結合剤の濃度が0.05〜10mmol/Lであることを特徴とするヘモグロビン類の分析方法。
- 酸化剤は、ヘモグロビンをメト化させる物質であることを特徴とする請求項1記載のヘモグロビン類の分析方法。
- 酸化剤は、亜硝酸塩であることを特徴とする請求項2記載のヘモグロビン類の分析方法。
- 酸化剤は、亜硝酸ナトリウムであることを特徴とする請求項3記載のヘモグロビン類の分析方法。
- 三価のヘム鉄への結合剤は、メトヘモグロビン中の三価の鉄に結合する物質であることを特徴とする請求項1記載のヘモグロビン類の分析方法。
- 三価のヘム鉄への結合剤は、アジ化物であることを特徴とする請求項5記載のヘモグロビン類の分析方法。
- 三価のヘム鉄への結合剤は、アジ化ナトリウムであることを特徴とする請求項6記載のヘモグロビン類の分析方法。
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