JP2003107069A

JP2003107069A - ヘモグロビン類の測定方法

Info

Publication number: JP2003107069A
Application number: JP2001303263A
Authority: JP
Inventors: Yuji Setoguchi; 雄二瀬戸口
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 2001-09-28
Filing date: 2001-09-28
Publication date: 2003-04-09

Abstract

(57)【要約】【課題】従来法より安定的に安定型ＨｂＡ１ｃを短時
間に精度良く分離することのできるヘモグロビン類の測
定方法を提供する。【解決手段】カチオン交換液体クロマトグラフィーに
よるヘモグロビン類の測定方法において、ヘモグロビン
Ａ０よりも前に溶出するヘモグロビン類を溶出させるた
めの溶離液（以下「溶離液Ａ」という）、ヘモグロビン
Ａ０を溶出させるための溶離液（以下「溶離液Ｂ」とい
う）、溶離液Ｂの溶出力を低下させるための溶離液（以
下「溶離液Ｃ」という）の少なくとも３種の溶離液を用
い、溶離液ＢのｐＨがヘモグロビン類の等電点より高
く、溶離液ＣのｐＨが溶離液ＡのｐＨと同一またはそれ
以下であって、溶離液ＣのｐＨと溶離液ＡのｐＨとの差
が０〜１．０の範囲にあり、溶離液Ｃの塩濃度が溶離液
Ａの塩濃度より１ｍＭ〜５００ｍＭ低いことを特徴とす
るヘモグロビン類の測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、液体クロマトグラ
フィーによるヘモグロビン類の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃ
という）は、血液中の糖が赤血球に入った後に、ヘモグ
ロビンと不可逆的に結合して生成したものであり、過去
１〜２ヶ月間の血液中の平均的な血糖値（血液中のグル
コース濃度）を反映する。このため、ＨｂＡ１ｃは、糖
尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態
を把握する等の糖尿病診断の指標として広く利用されて
いる。

【０００３】より詳細にはＨｂＡ１ｃは、血液中のグル
コースとヘモグロビンＡ（以下、ＨｂＡという）とが、
反応して生成された糖化ヘモグロビン（以下、ＧＨｂと
いう）であり、これが可逆的に反応したものを不安定型
ヘモグロビンＡ１ｃ（unstable HbA1c：以下、不安定型
ＨｂＡ１ｃという）と呼び、不安定型ＨｂＡ１ｃを経て
不可逆的に反応したものを安定型ヘモグロビンＡ１ｃ
（stable HbA1c：以下、安定型ＨｂＡ１ｃという）と呼
んでいる。そして、上記糖尿病診断の指標としては、安
定型ＨｂＡ１ｃを用いることが好ましく、臨床検査分野
では、高精度に安定型ＨｂＡ１ｃの比率を測定しうる方
法の開発が望まれていた。

【０００４】従来、このＨｂＡ１ｃの測定方法として
は、一般に液体クロマトグラフィー法や免疫法が用いら
れている。

【０００５】液体クロマトグラフィー法によるＨｂＡ１
ｃの測定は、主にカチオン交換液体クロマトグラフィー
法により行われている（特公平８−７１９８号公報な
ど）。溶血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフィ
ーにより分離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ（以
下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以
下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、Ｈｂ
Ｆという）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ並
びにヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という）などの
ピークが出現する。

【０００６】また、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ及びＨｂＡ
１ｃは、ＨｂＡが糖化されたＧＨｂであり、ＨｂＦは、
α鎖とγ鎖からなる胎児性ヘモグロビンで、該ＨｂＦ値
は、溶血性貧血の診断指標としても用いられている。

【０００７】糖尿病の診断の指標として使用されている
ＨｂＡ１ｃは、最近では、上記したとおり安定型ＨｂＡ
１ｃであり、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定
型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）として求められ
ている。

【０００８】しかし、安定型ＨｂＡ１ｃピークと不安定
型ＨｂＡ１ｃピークの分離が困難であるため、特開昭６
３−２９８０６３号公報には、赤血球および／または、
ヘモグロビンを含む試料を、リン酸縮合体および／また
はリン酸縮合体の塩を含む解離溶媒質と接触させて、不
安定型ヘモグロビンをヘモグロビンとグルコースに解離
して測定する方法が記載されている。しかしながら、こ
の方法では、安定型ＨｂＡ１ｃの分離が不十分なため、
測定精度が悪いという欠点があった。

【０００９】また、液体クロマトグラフィーによるヘモ
グロビン類の測定方法においては、アセチル化ヘモグロ
ビン（以下、ＡＨｂという）やカルバミル化ヘモグロビ
ン（以下ＣＨｂという）などの修飾ヘモグロビンの影響
を受けると言われ、ＡＨｂやＣＨｂのピークも安定型Ｈ
ｂＡ１ｃピーク付近に出現するため、従来では安定型Ｈ
ｂＡ１ｃの分離を良くするために安定型Ａ１ｃまでの分
離を２種類の溶離液を用いたグラディエント溶出法で行
う方法も存在した。しかしこの方法では、使用する溶離
液の経時的な濃縮による影響、カラムのロット間差、使
用によるカラムの劣化等により安定的にしかも精度良く
安定型ＨｂＡ１ｃを分離出来ないこともあった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
従来法によるヘモグロビン類の測定方法の問題点に鑑
み、従来法より安定的に安定型ＨｂＡ１ｃを短時間に精
度良く分離することのできるヘモグロビン類の測定方法
を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、カチオン交換
液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方
法において、ヘモグロビンＡ０よりも前に溶出するヘモ
グロビン類を溶出させるための溶離液（以下「溶離液
Ａ」という）、ヘモグロビンＡ０を溶出させるための溶
離液（以下「溶離液Ｂ」という）、溶離液Ｂの溶出力を
低下させるための溶離液（以下「溶離液Ｃ」という）の
少なくとも３種の溶離液を用い、溶離液ＢのｐＨがヘモ
グロビン類の等電点より高く、溶離液ＣのｐＨが溶離液
ＡのｐＨと同一またはそれ以下であって、溶離液Ｃのｐ
Ｈと溶離液ＡのｐＨとの差が０〜１．０の範囲にあり、
溶離液Ｃの塩濃度が溶離液Ａの塩濃度より１ｍＭ〜５０
０ｍＭ低いことを特徴とするヘモグロビン類の測定方法
である。

【００１２】また本発明では、さらに上記溶離液Ａがカ
オトロピックイオンを含有し、かつ、ｐＨ４．０〜６．
８で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの
塩を含有するのが好ましい。

【００１３】さらに、本発明においては上記溶離液Ａ、
Ｂ及びＣのそれぞれがアジ化物イオンを含有するのがよ
り好ましい。以下に本発明について詳細に説明する。

【００１４】通常カチオン交換液体クロマトグラフィー
によりヘモグロビン類の分離を行うと、ＨｂＡ１ａ及び
ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型Ｈｂ
Ａ１ｃ、ＨｂＡ０の順にピークが出現する。本発明のヘ
モグロビン類の測定方法では、溶離液ＡによりＨｂＡ０
よりも前に溶出するヘモグロビン類、すなわちＨｂＡ１
ａから安定型ＨｂＡ１ｃまでを溶出させ、次に溶離液Ｂ
によりＨｂＡ０を溶出させ、その後に、溶離液Ｃを流し
て溶離液Ｂの溶出力を弱めることを特徴とする。

【００１５】本発明で用いられる上記溶離液Ａとして
は、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、有機酸
及び／またはこれらの塩を含有する溶液を用いるのがよ
い。

【００１６】上記ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無
機酸、有機酸及び／またはこれらの塩としては、以下の
ものが挙げられる。

【００１７】上記無機酸としては、例えば、リン酸等が
挙げられる。また、上記有機酸としては、例えば、カル
ボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシ
カルボン酸、カコジル酸、アミノ酸等が挙げられる。

【００１８】上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、
プロピオン酸等が挙げられる。上記ジカルボン酸として
は、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピ
ン酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸等が挙げられ
る。上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β、β−
ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、アミノ酪酸等が
挙げられる。上記ヒドロキシカルボン酸としては、例え
ば、クエン酸、酒石酸、乳酸等が挙げられる。上記アミ
ノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、ヒスチジン等
が挙げられる。

【００１９】上記無機酸または有機酸の塩としては、公
知のものでよく、例えばナトリウム塩、カリウム塩等が
挙げられる。

【００２０】上記無機酸、有機酸またはこれらの塩は、
単独でも，また複数種混合して用いても良く、さらに、
無機酸と有機酸を混合して用いてもよい。

【００２１】また、上記無機酸、有機酸等として、酸解
離定数（ｐＫａ）値が２．１５〜６．３９にある物質
と、ｐＫａ値が６．４〜１０．５にある物質とを組み合
わせて用いるのも良い。このように２種以上の物質を組
み合わせて用いる代わりに、単一の物質でｐＫａ値が
２．１５〜６．３９及び６．４〜１０．５の両方にある
ものを用いても良い。なお、ｐＫａ値のより好ましい範
囲は、２．６１〜６．３９及び６．４０〜１０．５０で
あり、さらに好ましい範囲は、２．８０〜６．３５及び
６．８０〜１０．００であり、特に好ましい範囲は、
３．５０〜６．２５及び７．００〜９．５０である。

【００２２】上記溶離液Ａ中のこれら無機酸、有機酸等
の濃度は、水に溶解された状態で、溶離液ＡのｐＨを
４．０〜６．８にする緩衝作用がある範囲であればよ
く、好ましくは１ｍＭ〜１０００ｍＭであり、より好ま
しくは１０ｍＭ〜５００ｍＭである。

【００２３】上記溶離液ＡのｐＨは、ｐＨ４．０〜６．
８が好ましく、より好ましくはｐＨ４．５〜５．８であ
る。ｐＨが４．０未満では、ヘモグロビンが変性する可
能性があり、ｐＨが６．８を超えると、ヘモグロビン類
のプラス電荷が減少し、カチオン交換基に保持されにく
くなり、分離能が悪くなるためである。

【００２４】上記溶離液Ａには、カオトロピックイオン
をさらに含有させるのが好ましい。上記カオトロピック
イオンとは、水溶液に解離して生じたイオンにより、水
の構造が破壊され、疎水性物質と水が接触したときに起
こる、水のエントロピー減少を抑制するもので、具体的
には、陰イオンとしては、トリブロモ酢酸イオン、トリ
クロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオ
ン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオ
ン、臭化物イオン、塩化物イオン、酢酸イオン等が挙げ
られ、またその他に尿素等が挙げられる。また、陽イオ
ンとしては、バリウムイオン、カルシウムイオン、マグ
ネシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カ
リウムイオン、グアニジンイオン等が挙げられる。

【００２５】上記カオトロピックイオンの中でも、安定
型ＨｂＡ１ｃの測定精度を向上させるためには、好まし
くは、陰イオンとしては、トリブロモ酢酸イオン、トリ
クロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオ
ン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオ
ン、臭化物イオン等が挙げられ、陽イオンとしては、バ
リウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオ
ン、リチウムイオン、セシウムイオン、グアニジンイオ
ン等であり、より好ましくは、トリブロモ酢酸イオン、
トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物
イオン、過塩素酸イオン、硝酸イオン、グアニジンイオ
ン等が用いられる。

【００２６】上記カオトロピックイオンの溶離液Ａ中の
濃度は、０．１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ましく、１ｍＭ
〜１０００ｍＭがより好ましい、さらに好ましくは、１
０ｍＭ〜５００ｍＭである。カオトロピックイオンの濃
度が０．１ｍＭより低いとヘモグロビン類の測定におい
て、分離効果が低下し、測定精度が悪くなる。また、３
０００ｍＭよりも高くてもヘモグロビン類の分離効果は
それ以上向上しないので、測定精度は向上しない。ま
た、これらカオトロピックイオンは、単独でもまた、複
数種混合して用いてもよい。さらに、測定試料と接触す
る液、例えば、試料希釈液等に添加して用いることもで
きる。

【００２７】上記溶離液Ａには、アジ化物イオンを含有
させるのがより好ましい。上記アジ化物イオンとして
は、水溶液中で解離してアジ化物イオンを生成するので
あれば特に限定されず、例えば、公知のアジ化物塩等が
用いられ、好ましくは、アジ化ナトリウム、アジ化バリ
ウム等が挙げられる。

【００２８】また、上記アジ化物の溶離液Ａ中の濃度
は、０．１５ｍＭ〜７６．９ｍＭ（０．００１重量％〜
０．５重量％）であることが好ましく、より好ましく
は、０．７７ｍＭ〜６１．５ｍＭ（０．００５重量％〜
０．４重量％）である。上記濃度が、０．１５ｍＭ
（０．００１重量％）より少ないと、ＨｂＦの分離が悪
くなり、７６．９ｍＭ（０．５重量％）より多くてもＨ
ｂＦの分離は向上しないためである。

【００２９】さらに上記溶離液Ａには、以下に示した
（１）〜（６）の物質を添加してもよい。（１）無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩
化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナ
トリウムなどが挙げられる。これらの塩類の濃度は、特
に限定されないが、好ましくは１〜１５００ｍＭであ
る。（２）ｐＨ調節剤として、公知の酸、塩基を添加しても
よい。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸
等が挙げられ、また、塩基としては、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシ
ウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等が挙げられ
る。これらの酸、塩基の濃度は、特に限定されないが、
好ましくは、０．００１〜５００ｍＭである。（３）メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセ
トンなどの水溶性有機溶媒と混合してもよい。これらの
有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、好ましくは８
０体積％以下であり、カオトロピックイオン、無機酸、
有機酸、これらの塩などが析出しない程度で用いるのが
好ましい。（４）ヘモグロビンの安定剤として、公知の安定剤を添
加してもよい。該安定剤としては、例えば、エチレンジ
アミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、グルタチオ
ン等の還元剤・酸化防止剤等を添加してもよい。（５）ヘモグロビンの非特異的吸着を少なくするため
に、アミン類を添加してもよい。該アミン類としては、
公知のものが用いられ、好ましくは、分子量２０〜５０
０の第１級アミン、第２級アミン及び第３級アミンが挙
げられる。

【００３０】（６）界面活性剤として、ノニオン性界面
活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤
等を添加してもよい。界面活性剤を用いることにより、
溶血を効率よく行うだけでなく、例えば高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）等で測定を行う場合、溶血試
薬の通過する流路等を洗浄する効果がある。上記界面活
性剤は、好ましくはノニオン性界面活性剤が使用され、
例えば、ポリオキシエチレン類（以下、ポリオキシエチ
レンをＰＯＥ、エチレンオキシド付加モル数を（ｎ）で
表す。）、ＰＯＥ（７）デシルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）
ドデシルエーテル、ＰＯＥ（１０）トリデシルエーテ
ル、ＰＯＥ（１１）テトラデシルエーテル、ＰＯＥ
（ｎ）セチルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ステアリルエーテ
ル、ＰＯＥ（ｎ）オレイルエーテル、ＰＯＥ（１７）セ
チル−ステアリルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）オクチルフェ
ニルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ノニルフェニルエーテル、
モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタ
ン、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソル
ビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノラウリン酸ソルビタン、ＰＯ
Ｅ（ｎ）モノパルミチン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モ
ノステアリン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノオレイン
酸ソルビタン等が挙げられる。これらの界面活性剤は、
単独でもまた複数混合して用いてもよい。また、これら
の界面活性剤の添加量は、好ましくは０．０１〜１０重
量％である。

【００３１】次に、溶離液Ｂについて説明する。本発明
において用いられる溶離液Ｂは、ｐＨがヘモグロビン類
の等電点より高いことを特徴とする。カチオン交換液体
クロマトグラフィーで分離されるヘモグロビン類のう
ち、ＨｂＡ０は、ＨｂＡ等からなり、ＨｂＡ１ｃより後
に溶出して強く充填剤に保持され、そのために測定時間
が長くなる傾向にある。そのため、溶離液Ｂとしては、
ヘモグロビン類の溶出力が高いものが用いられ、具体的
には溶離液のｐＨがへモグロビン類の等電点より高いも
のが用いられる。具体的には、ｐＨ７．０〜１２のもの
が用いられ、より好ましくは７．１〜１１．０のもので
あり、更に好ましくは８．０〜９．５のものが用いられ
る。

【００３２】上記溶離液Ｂとしては、例えば、リン酸、
ホウ酸、炭酸などの無機酸又はその塩；クエン酸などの
ヒドロキシカルボン酸、β、β−ジメチルグルタル酸な
どのカルボン酸誘導体、マレイン酸などのジカルボン
酸、カコジル酸などの有機酸又は、その塩を含有する緩
衝液が用いられる。その他、２−（Ｎ−モリホリノ）エ
タンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチル
ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、
ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロ
キシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｔｒｉｓ、Ａ
ＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ、Ａ
ＣＥＡ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒ
ｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ等の一
般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものも使用
できる。また、イミダゾール等のイミダゾール類；ジエ
タノールアミン、トリエタノールアミンなどのアミン
類；グリシンなどのアミノ酸類；などの有機物を含有す
る緩衝液も使用できる。また、無機酸、有機酸及び／ま
たはこれらの塩、及び有機物は、複数混合して用いても
良く、また、無機酸と有機物を混合して用いても良い。

【００３３】また、より効果的にＨｂＡ０成分を溶出す
るためには、上記溶離液Ｂに、カオトロピックイオンを
添加することが好ましい。カオトロピックイオンは、前
述した溶離液Ａと同様のものを用いることができる。カ
オトロピックイオンの溶離液Ｂ中の濃度は、１ｍＭ〜３
０００ｍＭが好ましく、１０ｍＭ〜１０００ｍＭがより
好ましく、特に好ましくは５０ｍＭ〜５００ｍＭであ
る。

【００３４】また、溶離液Ｂには、上述のアジ化物イオ
ンを含有させるのがより好ましい。溶離液Ｂに含有され
るアジ化物イオンの濃度は、溶離液Ａに含有されるアジ
化物イオンの濃度と同程度とするのがよい。

【００３５】上記溶離液Ｂには、前述した溶離液Ａに添
加される各種添加剤、例えば、（１）無機塩類（２）ｐ
Ｈ調節剤（３）水溶性有機溶媒（４）安定剤（５）アミ
ン類（６）界面活性剤等の物質を添加してもよい。

【００３６】次に、溶離液Ｃについて説明する。本発明
において用いられる溶離液Ｃは、ｐＨが溶離液ＡのｐＨ
と同一またはそれ以下であって、溶離液ＡのｐＨとの差
［＝（溶離液AのｐH）−（溶離液CのｐH）］が０〜１．
０の範囲にあることを特徴とする。また、溶離液Ｃはそ
の塩濃度が溶離液Ａの塩濃度より１ｍＭ〜５００ｍＭ低
いことを特徴とする。これは、溶離液ＣのｐＨが溶離液
ＡのｐＨより大きくなると溶離液Ｂの溶出力を十分に低
下させることができなくなり、安定型ＨｂＡ１ｃの分離
性能が悪くなるためである。また、溶離液Ｃと溶離液Ａ
のｐＨの差が１．０より大きくなると溶離液ＣのｐＨが
低くなりすぎてヘモグロビン類の変性が起こりやすくな
り、安定型ＨｂＡ１ｃの分離性能が悪くなるためであ
る。なおより好ましくは、溶離液Ｃと溶離液ＡのｐＨの
差は、０〜０．５である。溶離液Ｃを流すタイミング
は、少なくとも溶離液Ｂの溶出力を弱めることができれ
ば良く、特に限定されるものではないが、基本的には溶
離液Ｂの後であって、溶離液Ａの前に流すのがよい。溶
離液Ｃは、ｐＨが溶離液Ａと同一またはそれ以下であ
り、塩濃度が溶離液Ａの塩濃度より１ｍＭ〜５００ｍＭ
低いので、ヘモグロビン類の溶出力は溶離液Ａよりも低
い。従って、溶出力の高い溶離液Ｂの後に、溶離液Ａを
流すのに先だって、この溶離液Ｃを流すことにより、よ
り短時間かつ効率的にカラム内の液性を溶離液Ａに近づ
けることが可能となり、結果として安定型ＨｂＡ１ｃを
短時間に精度良く分離することができるようになるので
ある。

【００３７】また溶離液Ｃの塩濃度は、溶離液Ａの塩濃
度より１ｍＭ〜５００ｍＭ低く設定される。ここでいう
塩濃度とは、溶離液中の総陰イオン濃度のことを意味す
る。溶離液Ｃの塩濃度と溶離液Ａの塩濃度との差が、１
ｍＭ未満であると短時間に溶離液Ｂの溶出力を弱め、溶
離液Ａにカラム内の液性を近づけることが出来ず、安定
化ＨｂＡ１ｃの短時間測定ができない。逆に５００ｍＭ
を超えると溶離液Ｂ、溶離液Ａとの塩濃度差が大きくな
りカラム圧力変動が大きくなって安定化ＨｂＡ１ｃ測定
の再現性が悪くなる。

【００３８】上記溶離液Ｃとしては、ｐＨ４．０〜６．
８で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの
塩を含有する溶液を用いるのがよく、上述した溶離液Ａ
に含有されるのと同様の物質を用いることができる。

【００３９】また溶離液Ｃにも、カオトロピックイオン
を添加することが好ましい。カオトロピックイオンは、
前述した溶離液Ａと同様のものを用いることができる。
カオトロピックイオンの溶離液Ｃ中の濃度は、０．１ｍ
Ｍ〜４００ｍＭが好ましく、０．２ｍＭ〜３００ｍＭが
より好ましく、特に好ましくは０．５ｍＭ〜２００ｍＭ
である。

【００４０】また溶離液Ｃにも、上述のアジ化物イオン
を含有させるのがより好ましい。溶離液Ｃに含有される
アジ化物イオンの濃度は、０．１５ｍＭ〜５０ｍＭが好
ましい。

【００４１】上記溶離液Ｃにも、前述した溶離液Ａに添
加される各種添加剤、例えば、（１）無機塩類（２）ｐ
Ｈ調節剤（３）水溶性有機溶媒（４）安定剤（５）アミ
ン類（６）界面活性剤等の物質を添加してもよい。

【００４２】本発明のヘモグロビン類の測定方法におい
て用いられる充填剤は、少なくとも１種以上のカチオン
交換基を有している粒子よりなるものであり、例えば、
高分子粒子にカチオン交換基を導入することで得られ
る。

【００４３】該カチオン交換基は、公知のものでよく特
に制限はない。例えば、カルボキシル基、スルホン酸
基、リン酸基などのカチオン交換基等が挙げられる。ま
た、このカチオン交換基は、複数種導入しても良い。

【００４４】上記粒子の直径は、好ましくは０．５〜２
０μｍ、より好ましくは１〜１０μｍである。また、粒
度分布は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準偏差÷平
均直径×１００（％））として、好ましくは４０％以
下、より好ましくは３０％以下である。

【００４５】上記高分子粒子としては、例えば、シリ
カ、ジルコニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリア
ミノ酸、キトサンなどの天然高分子粒子；ポリスチレ
ン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子など
が挙げられる。また、公知の非多孔性粒子を用いること
もできる。上記高分子粒子は、導入されるイオン交換基
以外の構成成分は、より親水性であることが好ましい。
また耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが好ま
しい。

【００４６】上記高分子粒子へのカチオン交換基の導入
は、公知の方法により行うことができるが、例えば、高
分子粒子を調製後、粒子が有する官能基（水酸基、アミ
ノ基、カルボキシル基、エポキシ基など）に、化学反応
でカチオン交換基を粒子に導入させる方法により行うこ
とができる。また、カチオン交換基を有する単量体を重
合して高分子粒子を調製する方法によってもカチオン交
換充填剤を調製できる。例えば、カチオン交換基含有単
量体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下
に重合する方法などが挙げられる。また、（メタ）アク
リル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチルなどの重合性
カチオン交換基含有エステルを架橋性単量体などと混合
し、重合開始剤存在下で重合した後、得られた粒子を加
水分解処理し、エステルをカチオン交換基に変換させて
もよい。更に、特公平８−７１９７号公報に記載のよう
に、架橋重合体粒子を調製した後、カチオン交換基を有
する単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、該単
量体を重合させても良い。

【００４７】上記充填剤はカラムに充填されて液体クロ
マトグラフィー測定に用いられる。カラムのサイズは、
内径０．１〜５０ｍｍ、長さ１〜３００ｍｍのものが好
ましく、より好ましくは、内径０．２〜３０ｍｍ、長さ
５〜２００ｍｍである。カラムサイズは、内径０．１ｍ
ｍ、長さ１ｍｍより小さくなると作業性が悪く分離能も
悪くなる。また、内径５０ｍｍ、長さ３００ｍｍより大
きくなると使用する充填剤量が多くなるだけでなく、分
離能も悪くなる。

【００４８】充填剤のカラムへの充填方法は、公知の任
意の方法が使用できるが、スラリー充填法がより好まし
い。具体的には、例えば、充填剤粒子を溶離液などの緩
衝液に分散させたスラリーを送液ポンプなどによりカラ
ムに圧入することにより行う。

【００４９】上記カラムの素材としては、公知のステン
レス等の金属、ガラス、ＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテ
ルケトン）等の樹脂などが用いられる。また、充填剤と
カラム本体が接する部位を、不活性（イナート）な素材
で被覆してもよく、その素材としては、例えばＰＥＥ
Ｋ、ポリエチレン、テフロン（登録商標）、チタン化合
物、珪素化合物、シリコン膜等が挙げられる。

【００５０】本発明で用いられるクロマトグラフィーに
おけるカラムフィルター、プレフィルターとしては、イ
ナートな素材からなるフィルター、または、そのフィル
ターの表面がイナートな素材で覆われているフィルター
を用いるのが好ましい。イナートな素材の例としては、
セルロースエステル、セルロースアセテート、セルロー
ストリアセテート、セルロース、セルロースナイトレー
ト、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフ
ロライド、ポリスルフォン、ポリエチレン、ポリエーテ
ルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルスルホ
ン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリフッ化ビニリデ
ン、ガラス素材、アクリル共重合体、酸化物セラミッ
ク、炭化物セラミック、窒化物セラミック、珪化物セラ
ミック、硼化物セラミック、チタン等が挙げられる。ま
た、これらの素材を適宜組み合わせて用いることもでき
る。また、ステンレスなどのイナートでない素材を用い
た場合は、上記のイナートな素材で被覆する方法、シリ
コーン処理などのイナートな処理をする方法、牛血清ア
ルブミン、ゼラチン、カゼイン、グロブリン、ヘモグロ
ビンなどのブロッキング試薬でブロッキングする方法な
どを適宜使用するのが好ましい。

【００５１】本発明方法に使用される液体クロマトグラ
フィー装置は、公知のものでよく、例えば、送液ポン
プ、試料注入装置（サンプラ）、カラム、検出器などか
ら構成される。また、他の付属装置（カラム恒温槽や溶
離液の脱気装置など）が適宜付属されてもよい。

【００５２】ヘモグロビン類を測定する際のカラム温度
は、安定型ＨｂＡ１ｃの分離を良くするために、２５〜
６０℃が良く、より好ましくは、３５〜５５℃である。

【００５３】また、ヘモグロビン類を測定する際のカラ
ム圧力は、カラム耐久性及び装置の耐久性を良くするた
めに、９．８×１０⁴〜３．９×１０⁶Ｐａ（１〜４０ｋ
ｇｆ／ｃｍ²）が良い。より好ましくは、２．０×１０⁵
〜３．４×１０⁶Ｐａ(２〜３５ｋｇｆ／ｃｍ²)である。

【００５４】本発明方法における、他の測定条件として
は、公知の条件でよく、溶離液の流速は、好ましくは
０．０５〜５ｍｌ／分、より好ましくは０．２〜３ｍｌ
／分である。ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎｍの可
視光を用いるのが好ましいが、特にこれのみに限定され
るわけではない。測定試料は、公知の溶血試薬により溶
血された試料を用いる。液体クロマトグラフィー装置へ
の試料注入量は、希釈倍率により異なるが、好ましくは
０．１〜１００μｌ程度である。

【００５５】段階溶出法によって測定を行う場合の装置
の構成例を図１に示した。溶離液Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄは、各
々溶出力の異なる（すなわち、ｐＨあるいは塩濃度のい
ずれか、あるいは両方が異なる）溶離液であり、電磁弁
１によって設定時間ごとに各溶離液に切り替えられるよ
うに、構成されている。溶離液は、送液ポンプ２によ
り、試料注入部３から導入された試料とともにカラム４
に導かれ、各成分が検出器５により検出される。各ピー
ク面積、高さ等はインテグレータ６により算出される。

【００５６】

【実施例】次に、実施例、比較例を挙げて本発明につい
てさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に
のみ限定されるものではない。

【００５７】［実施例１］（充填剤の調製）テトラエチレングリコールジメタクリ
レート（新中村化学社製）４５０ｇ及び２−ヒドロキシ
−１，３−ジメタクリロキシプロパン（和光純薬社製）
５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）２
ｇを溶解させた。これを４重量％ポリビニルアルコール
（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍｌに分散させ、
撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に昇温し、１．５時
間重合した。次いで、反応系を３５℃に冷却した後、２
−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東
京化成社製）の５０％水溶液４００ｇ、メタノール４０
０ｍｌを添加し１時間攪拌しながら再び８０℃に昇温し
て１．３時間重合した。重合後、洗浄して乾燥させた
後、分級して平均粒径６．５μｍの粒子を得た。

【００５８】（カラムの充填）得られた充填剤をカラム
に以下のようにして充填した。充填剤粒子０．７ｇを、
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍｌに分散
し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をス
テンレス製の空カラム（内径４．６×３５ｍｍ）を接続
したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに
送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋ
ｇｆ／ｃｍ²（約３×１０⁷Ｐａ）で定圧充填した。

【００５９】（ヘモグロビン類の測定）得られたカラム
を用いて、以下の測定条件でヘモグロビン類の測定を行
った。（測定条件）システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製）検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）溶離液：溶離液Ａ：５０ｍＭの過塩素酸を含有する、５
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｂ：２００ｍＭの過塩素酸を含有する、５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶離液Ｃ：４５ｍＭの過塩素酸を含有する、５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ５．３）測定開始より０〜１．５分の間は溶離液Ａを流し、１．
５〜１．６分の間は溶離液Ｂを流し、１．６〜１．９分
の間は溶離液Ｃを流し、１．９〜２．０分の間は溶離液
Ａを流した。流速：２．０ｍｌ／分検出波長：４１５ｎｍ試料注入量：１０μｌ

【００６０】（測定試料Ａ）健常人血を採血し、抗血液
凝固剤としてフッ化ナトリウムを１０ｍｇ／ｍｌとなる
よう添加した。これに、１５０倍量の溶血試薬（界面活
性剤として０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−
４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００、
東京化成社製）とリン酸緩衝溶液（ｐＨ７））を添加し
て溶血し、測定試料Ａとした。

【００６１】（測定結果）上記測定条件により、試料Ａ
を測定して得られたクロマトグラムを図２に示した。ピ
ーク７はＨｂＡ１ａ及びｂ、ピーク８はＨｂＦ、ピーク
９は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１０は安定型ＨｂＡ１
ｃ、ピーク１１はＨｂＡ０を示す。図２より、ピーク８
と９及び１０とが良好に分離されていることが分かる。

【００６２】［実施例２］溶離液を以下の組成としたこ
と以外は、実施例１と同様の条件でヘモグロビン類の測
定を行った。溶離液：溶離液Ａ：５０ｍＭの過塩素酸を含有する、２
５ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｂ：２５０ｍＭの過塩素酸を含有する、２０ｍＭ
コハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶離液Ｃ：２５ｍＭの過塩素酸を含有する、２５ｍＭコ
ハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）得られたクロマトグラムは図２と同様で、各ピーク間の
分離は良好であった。

【００６３】［実施例３］溶離液を以下の組成としたこ
と以外は、実施例１と同様の条件でヘモグロビン類の測
定を行った。溶離液：溶離液Ａ：５０ｍＭの過塩素酸を含有する、２
５ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｂ：２５０ｍＭの過塩素酸を含有する、２０ｍＭ
コハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶離液Ｃ：５ｍＭの過塩素酸を含有する、３ｍＭコハク
酸−５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）得られたクロマトグラムは図２と同様で、各ピーク間の
分離は良好であった。

【００６４】［実施例４］溶離液及び測定試料Ｂを以下
のようにしたこと以外は、実施例１と同様の条件でヘモ
グロビン類の測定を行った。溶離液：溶離液Ａ：５０ｍＭの過塩素酸、４．６ｍＭ
（０．０３重量％）アジ化ナトリウムを含有する、２５
ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｂ：２５０ｍＭの過塩素酸、４．６ｍＭ（０．０
３重量％）アジ化ナトリウムを含有するを含有する、２
０ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶離液Ｃ：５ｍＭの過塩素酸、４．６ｍＭ（０．０３重
量％）アジ化ナトリウムを含有するを含有する、３ｍＭ
コハク酸−５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）

【００６５】（測定試料Ｂ）ＨｂＦ高値血液検体を採血
し、抗血液凝固剤としてフッ化ナトリウムを１０ｍｇ／
ｍｌとなるよう添加した。これに、１５０倍量の溶血試
薬（界面活性剤として０．１重量％ポリエチレングリコ
ールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ
−１００、東京化成社製）とリン酸緩衝溶液（ｐＨ
７））を添加して溶血し、測定試料Ｂとした。

【００６６】（測定結果）上記測定条件により、試料Ｂ
を測定して得られたクロマトグラムを図３に示した。ピ
ーク７はＨｂＡ１ａ及びｂ、ピーク８はＨｂＦ、ピーク
９は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１０は安定型ＨｂＡ１
ｃ、ピーク１１はＨｂＡ０を示す。図３より、ピーク８
と９及び１０とが良好に分離されていることが分かる。

【００６７】［実施例５］溶離液Ｃを以下のようにした
こと以外は、実施例２と同様の条件でヘモグロビン類の
測定を行った。溶離液Ｃ：２５ｍＭの過塩素酸を含有する、２５ｍＭコ
ハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．８）（測定結果）測定結果は、図２とほぼ同様で、良好な結
果が得られた。

【００６８】［比較例１］溶離液を以下の組成としたこ
と以外は、実施例１と同様の条件でヘモグロビン類の測
定を行った。溶離液：溶離液Ａ：５０ｍＭの過塩素酸を含有する、２
５ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｂ：２５０ｍＭの過塩素酸を含有する、２０ｍＭ
コハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４）測定開始より０〜１．５分の間は溶離液Ａを流し、１．
５〜１．６分の間は溶離液Ｂを流し、１．６〜２分の間
は溶離液Ａを流した。

【００６９】（測定結果）得られたクロマトグラムを図
４に示した。ピーク７はＨｂＡ１ａ及びｂ、ピーク８は
ＨｂＦ、ピーク９は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１０は
安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１１はＨｂＡ０を示す。比較
例１では、実施例に比べてピーク７、ピーク８及びピー
ク９はブロードで各ピーク間の分離も悪かった。

【００７０】［比較例２］溶離液Ｃを以下の組成とした
こと以外は、実施例２と同様の条件でヘモグロビン類の
測定を行った。溶離液Ｃ：２５ｍＭの過塩素酸を含有する、２５ｍＭコ
ハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．０）（測定結果）測定結果は、溶離液ＣのｐＨが４．０と低
いために、測定試料中のヘモグロビン類が変性しやすく
なって、クロマトグラムの悪化が起こり良好な結果が得
られなかった。

【００７１】

【発明の効果】本発明は以上の構成からなるため、安定
型ＨｂＡ１ｃのピークをシャープに分離し、しかも溶離
液が経時的に濃縮した場合でも分離パターンが影響を受
け難く、安定的にしかも短時間に精度良く安定型ＨｂＡ
１ｃを分離することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明で用いられるカチオン交換液体クロマ
トグラフィー装置の一例を示す図。

【図２】実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料Ａ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図。

【図３】実施例４の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料Ｂ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図。

【図４】比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料Ａ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図。

【符号の説明】

Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ溶離液１電磁弁２送液ポンプ３試料注入部４カラム５検出器６インテグレータ７ＨｂＡ１ａ及びｂのピーク８ＨｂＦのピーク９不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク１０安定型ＨｂＡ１ｃのピーク１１ＨｂＡ０のピーク

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 30/54 Ｇ０１Ｎ 30/54 Ｆ 30/56 30/56 Ａ 30/74 30/74 Ｅ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】カチオン交換液体クロマトグラフィーに
よるヘモグロビン類の測定方法において、ヘモグロビン
Ａ０よりも前に溶出するヘモグロビン類を溶出させるた
めの溶離液（以下「溶離液Ａ」という）、ヘモグロビン
Ａ０を溶出させるための溶離液（以下「溶離液Ｂ」とい
う）、溶離液Ｂの溶出力を低下させるための溶離液（以
下「溶離液Ｃ」という）の少なくとも３種の溶離液を用
い、溶離液ＢのｐＨがヘモグロビン類の等電点より高く、溶
離液ＣのｐＨが溶離液ＡのｐＨと同一またはそれ以下で
あって、溶離液ＣのｐＨと溶離液ＡのｐＨとの差が０〜
１．０の範囲にあり、溶離液Ｃの塩濃度が溶離液Ａの塩
濃度より１ｍＭ〜５００ｍＭ低いことを特徴とするヘモ
グロビン類の測定方法。
【請求項２】請求項１記載のヘモグロビン類の測定方
法であって、溶離液Ａがカオトロピックイオンを含有
し、かつ、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、
有機酸及び／またはこれらの塩を含有することを特徴と
するヘモグロビン類の測定方法。
【請求項３】請求項２記載のヘモグロビン類の測定方
法において、溶離液Ａ、Ｂ及びＣのそれぞれがアジ化物
イオンを含有することを特徴とするヘモグロビン類の測
定方法。