JP4420539B2 - ヘモグロビンａ２の分離方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ２の分離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘモグロビンＡ２は、α鎖とδ鎖からなるヘモグロビンであり、ヘモグロビンＦと共に地中海性貧血（ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ）の診断指標として用いられている。地中海性貧血症を検査したい場合、一般的には、カチオン交換液体クロマトグラフィーを用いて、ヘモグロビン混合物からヘモグロビンＡ２（以下、ＨｂＡ２という）を分離、定量することによって行われている。
【０００３】
通常、カチオン交換液体クロマトグラフィーを用いて、ヘモグロビン混合物、すなわち、溶血液試料を分離すると、ヘモグロビンＡ１ａ（以下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、ＨｂＦという）、不安定型ヘモグロビン（以下、不安定型ＨｂＡ１ｃという）、安定型ヘモグロビン（以下、安定型ＨｂＡ１ｃという）並びにヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という）などのピークが出現する。この際、ヘモグロビンＡ０とＨｂＡ２のカチオン交換カラムに対する保持力が近いためピークが近接し、これらを完全に分離するには、長時間を要していた。
【０００４】
ヘモグロビン（以下、Ｈｂという）混合物からＨｂＡ２を分離する方法として、例えば、米国特許４，８１０，３９１号公報には、弱カチオン交換充填剤を用いた方法が開示されている。この方法によれば、リン酸濃度とｐＨが異なる３種の緩衝溶離液を用いることを特徴とするものであり、第１の溶離液は、１〜２０ｍＭのりん酸緩衝液で、ｐＨが６．５〜６．９に設定されており、ＨｂＡ１ａとＨｂＡ１ｂの溶出に用いられ、第２の溶離液は、１５〜５５ｍＭのりん酸緩衝液でｐＨが６．４〜６．８に設定されており、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０の溶出に用いられ、第３の溶離液は、６０〜１００ｍＭのりん酸緩衝液でｐＨが６．４〜６．８に設定されており、ＨｂＡ２の溶出に用いられる。
【０００５】
しかしながら、上記方法においては、各溶離液の違いはほぼ塩濃度のみであるため、測定時間が非常に長く、多量の検体について迅速に分離測定を行うことができないという問題点があった。これに加え、ＨｂＡ１ｃの分離が不十分であるために、ＨｂＡ２の分離測定に加えてＨｂＡ１ｃを同時に分離測定したい場合であっても、ＨｂＡ１ｃの測定精度が極めて低いという問題点もあった。さらに、溶離液ｐＨがＨｂの等電点以下であるために、充填剤にＨｂ等の生体成分が蓄積しやすくカラムの寿命も短いという問題点もあった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、Ｈｂ混合物からＨｂＡ２を分離する方法の上記問題点に鑑み、従来法より、ＨｂＡ２を精度良く、かつ短時間に分離可能なＨｂＡ２の分離方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明（以下「本発明１」という）は、カチオン交換液体クロマトグラフィーによる、ヘモグロビン混合物からのヘモグロビンＡ２の分離方法において、ヘモグロビンＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類を溶出させるための溶離液（溶離液Ａ）と、ヘモグロビンＡ０以降に溶出するヘモグロビン類を溶出させるための溶離液（溶離液Ｂ）の少なくとも２種の溶離液を用い、前記溶離液ＡのｐＨが４．０〜６．０であって、前記溶離液ＢのｐＨが、前記溶離液ＡのｐＨより０．５以上高いことを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【０００８】
請求項２記載の発明は、請求項１記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、前記溶離液Ｂの塩濃度が、前記溶離液Ａの塩濃度より低いことを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【０００９】
請求項３記載の発明は、請求項１または２記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、さらに、少なくともヘモグロビンＡ２を溶出させるための溶離液（溶離液Ｄ）を用い、前記溶離液ＤのｐＨが、前記溶離液ＢのｐＨより０．５以上低いことを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【００１０】
請求項４記載の発明は、請求項３記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、前記溶離液Ｂの塩濃度が、前記溶離液Ａの塩濃度より低く、前記溶離液Ｄの塩濃度が、前記溶離液Ｂの塩濃度より高いことを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【００１１】
請求項５記載の発明は、請求項３または４記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、さらに、前記溶離液Ｂ及び溶離液Ｄよりも溶出力の弱い溶離液（溶離液Ｃ）を用い、前記溶離液Ｂを送液した後に、前記溶離液Ｃを送液し、その後前記溶離液Ｄを送液することを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【００１２】
請求項６記載の発明（以下「本発明２」という）は、カチオン交換液体クロマトグラフィーによる、ヘモグロビン混合物からのヘモグロビンＡ２の分離方法において、カオトロピックイオンが含有され、かつｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩が含有される溶離液（以下「溶離液Ｅ」という）と、ｐＨ６．５〜８．０で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩が含有される溶離液（以下「溶離液Ｆ」という）の少なくとも２種の溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【００１３】
請求項７記載の発明は、請求項６記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、さらに、前記溶離液ＦよりもｐＨが低く、かつ塩濃度が高い溶離液（以下「溶離液Ｇ」という）を用い、前記溶離液Ｆの送液後に前記溶離液Ｇを送液することを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【００１４】
請求項８載の発明は、請求項１〜７いずれか一項に記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、前記溶離液Ｂ、溶離液Ｄ、溶離液Ｆまたは溶離液Ｇの送液後に、 ｐＨが６．８〜１２の溶離液（溶離液Ｈ）を送液することを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【００１５】
請求項９記載の発明は、請求項８記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、前記溶離液Ｈにカオトロピックイオンが含有されることを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【００１６】
請求項１０記載の発明は、請求項１〜９のいずれか一項に記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、前記溶離液Ａ〜Ｈのうち少なくとも一種の溶離液、及び／または、溶血液に、アジ化物イオンが含有されることを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【００１７】
請求項１１記載の発明は、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、充填剤として、少なくとも一種の強カチオン交換基を有する充填剤を用いることを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【００１８】
まず本発明１について説明する。
【００１９】
本発明１における「ヘモグロビンＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類を溶出させるための溶離液（本明細書においては、「溶離液Ａ」という）」とは、カチオン交換液体クロマトグラフィーによってヘモグロビン混合物を分離する際に、ＨｂＡ０よりも保持時間の短いＨｂ類を溶出させるのに用いる溶離液を意味する。この溶離液Ａによって溶出されるＨｂ類としては、一般的には、 ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、安定型ＨｂＡ１ｃ及び不安定型ＨｂＡ１ｃ等が挙げられる。但し、溶離液Ａのみによって上記Ｈｂ類の全てが溶出される必要はなく、上記Ｈｂ類のうち少なくとも１種のＨｂが溶出されればよい。また、本発明１は、ＨｂＡ２を分離することを主目的とするが、溶離液Ａで、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、安定型ＨｂＡ１ｃ及び不安定型ＨｂＡ１ｃを溶出することにより、安定型ＨｂＡ１ｃの分離定量を同時に行うことも可能である。
【００２０】
上記溶離液ＡのｐＨは、４．０〜６．０であり、より好ましいｐＨは、４．５〜５．８である。これは、溶離液ＡのｐＨが４．０未満であるとヘモグロビンが変性する可能性があり、６．０を超えるとヘモグロビンのプラス電荷が減少し、カチオン交換基に保持され難くなって、分離能が悪くなるためである。なお、溶離液Ａは、必ずしも単一種類の溶離液である必要はなく、上記条件を満たす範囲で、組成・溶出力等の異なる複数種類の溶離液から構成される溶離液群Ａであってもよい（以下、溶離液Ａがｎ種類の溶離液で構成される場合は、「溶離液Ａ１、溶離液Ａ２、…、溶離液Ａｎ」のように表わす。）。ＨｂＡ２の分離に加えて、安定型ＨｂＡ１ｃをより短時間で分離定量する場合においては、溶離液Ａ１、溶離液Ａ２、溶離液Ａ３等を溶出力の弱いものから強いものへ勾配溶出法若しくは段階溶出法により、あるいは勾配溶出法と段階溶出法との併用により送液するのがよい。
【００２１】
本発明１における「ヘモグロビンＡ０以降に溶出するヘモグロビン類を溶出させるための溶離液（本明細書においては、「溶離液Ｂ」という）」とは、カチオン交換液体クロマトグラフィーによってヘモグロビン混合物を分離する際に、ＨｂＡ０の保持時間以上の保持時間を有するＨｂ類を溶出させるのに用いる溶離液を意味する。この溶離液Ｂによって溶出されるＨｂ類としては、一般的には、 ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等が挙げられるが、これらのＨｂ類の全てが溶離液Ｂによって溶出される必要はない。本発明１において、溶離液Ａと溶離液Ｂのみを用いる場合等においては、この溶離液ＢによってＨｂＡ０、ＨｂＡ２等が溶出される。また、後述のようにＨｂＡ２を溶出させるために溶離液Ｄを用いる場合においては、上記溶離液Ｂによって、少なくともＨｂＡ０のみが溶出されればよい。また、溶離液Ｂによって少なくともＨｂＡ０が溶出される限り、溶離液Ｂによって、安定型ＨｂＡ１ｃや不安定型ＨｂＡ１ｃ等が溶出されてもよい。特に、安定型ＨｂＡ１ｃの定量を行わないで、ＨｂＦ及びＨｂＡ２の定量を行う場合においては、溶離液Ｂによって安定型ＨｂＡ１ｃが溶出される方がより迅速な分離を可能とする。
【００２２】
上記溶離液ＢのｐＨは、溶離液ＡのｐＨよりも０．５以上高いことを特徴とする。これは、溶離液ＢのｐＨを、溶離液ＡのｐＨよりも０．５以上高くすることによって、ＨｂＡ０とＨｂＡ２の分離度をより向上させることができるためである。より好ましくは、溶離液ＢのｐＨを、溶離液ＡのｐＨよりも０．８以上高く設定する。溶離液Ｂの好ましいｐＨの範囲は、ヘモグロビン類の等電点（ヘモグロビン類の等電点については、理化学事典（第４版、１９８７年９月、岩波書店、久保亮五ら編集）、１１７８頁に記載あるように、ｐＨ６．８〜７．０である）付近のｐＨである６．０〜８．０である。なお、溶離液Ｂは、必ずしも単一種類の溶離液である必要はなく、上記条件を満たす範囲で、組成・溶出力等の異なる複数種類の溶離液から構成される溶離液群Ｂであってもよい（以下、溶離液Ｂがｎ種類の溶離液で構成される場合は、「溶離液Ｂ１、溶離液Ｂ２、…、溶離液Ｂｎ」のように表わす。）。
【００２３】
本発明１において、より好ましくは、溶離液Ｂの塩濃度を、溶離液Ａの塩濃度より低く設定する。ここで言う溶離液の塩濃度とは、溶離液中の総陽イオン濃度を意味する。溶離液Ｂの塩濃度を溶離液Ａの塩濃度より低く設定することによって、ＨｂＡ０とＨｂＡ２との分離度をより向上させることができる。なお、溶離液Ｂの塩濃度は、溶離液Ａの塩濃度よりも１０ｍＭ以上低く設定することが好ましく、より好ましくは４０ｍＭ以上低く設定する。
【００２４】
本発明１においては、上記溶離液Ａ及び溶離液Ｂに加えて、さらに、少なくともヘモグロビンＡ２を溶出させるための溶離液（本明細書においては、「溶離液Ｄ」という）を用いるのがより好ましい。この溶離液Ｄを用いることにより、ＨｂＡ０とＨｂＡ２との分離度及びＨｂＡ２とそれ以降に溶出するＨｂ類との分離度をより向上させることができる。この溶離液Ｄは、少なくともＨｂＡ２を溶出させる溶離液であればよい。従って、ＨｂＡ２が溶出されさえすれば、ＨｂＳやＨｂＣ等については、溶離液Ｄによって溶出されてもよいし、後述の溶離液Ｈ等によって溶出されてもよい。
【００２５】
上記溶離液ＤのｐＨは、溶離液ＢのｐＨよりも０．５以上低いことを特徴とする。これは、溶離液ＤのｐＨを、溶離液ＢのｐＨよりも０．５以上低くすることによって、ＨｂＡ０とＨｂＡ２との分離度及びＨｂＡ２とそれ以降に溶出するＨｂ類との分離度をより向上させることができるためである。より好ましくは、溶離液ＤのｐＨを、溶離液Ｂよりも０．８以上低く設定する。なお、溶離液Ｄは、必ずしも単一種類の溶離液である必要はなく、上記条件を満たす範囲で、組成・溶出力等の異なる複数種類の溶離液から構成される溶離液群Ｄであってもよい（以下、溶離液Ｄがｎ種類の溶離液で構成される場合は、「溶離液Ｄ１、溶離液Ｄ２、溶離液Ｄｎ」のように表わす。）。この様な、溶離液群Ｄを用いることにより、より短時間で精度よくＨｂＡ２を分離すると同時に、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を分離定量することも可能となる。
【００２６】
上記溶離液Ｄを用いる場合において、より好ましくは、溶離液Ｂの塩濃度を、溶離液Ａの塩濃度より低く、溶離液Ｄの塩濃度を、溶離液Ｂの塩濃度より高く設定する。なお、溶離液Ｂの塩濃度を、溶離液Ａの塩濃度よりも１０ｍＭ以上低く設定し、溶離液Ｄの塩濃度を、溶離液Ｂの塩濃度よりも１０ｍＭ以上高く設定することが好ましく、より好ましくは溶離液Ｂの塩濃度を、溶離液Ａの塩濃度よりも５０ｍＭ以上低く設定し、溶離液Ｄの塩濃度を、溶離液Ｂの塩濃度よりも５０ｍＭ以上高く設定する
【００２７】
本発明１においては、上記溶離液Ａ、溶離液Ｂ及び溶離液Ｄの他に、上記溶離液Ｂ及び溶離液Ｄよりも溶出力の弱い溶離液（本明細書においては、「溶離液Ｃ」という）を用い、溶離液Ｂを送液した後に、溶離液Ｃを送液し、その後溶離液Ｄを送液することも可能である。この溶離液Ｃを送液することで、ＨｂＡ２の溶出時間を遅くさせ、ＨｂＡ２をより精度良く分離することができる。
【００２８】
上記溶離液Ｃは、溶離液Ｂ及び溶離液Ｄより溶出力が弱い溶離液であればよく、ｐＨは特に限定されない。溶出力が弱い溶離液とは、カチオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン混合物を分離した際に、各Ｈｂ類の溶出時間を遅くするような溶離液のことを言い、溶出力を弱くするには、例えば、溶離液の塩濃度を下げる方法、ｐＨを下げる方法等が挙げられる。ここでの溶離液Ｃは、ｐＨもしくは塩濃度、或いはその両者が溶離液Ｂ及び溶離液Ｄより低いものである。
【００２９】
本発明１においては、溶離液Ａ・溶離液Ｂを通常この順に用い、溶離液Ｄも用いる場合には、溶離液Ａ・溶離液Ｂ・溶離液Ｄの順に、さらに、溶離液Ｃを用いる場合には、溶離液Ａ・溶離液Ｂ・溶離液Ｃ・溶離液Ｄの順に送液する。溶離液の溶出力は、通常、溶離液Ａ・溶離液Ｂ・溶離液Ｄの順に強くなるように用いる。
【００３０】
本発明１において用いられる、上記溶離液Ａ〜Ｄ（以下、本発明１の説明においては、単に「溶離液」という）は、緩衝液から構成される。もちろん、この緩衝液に後述の添加剤を適宜添加して用いてもよい。緩衝液に含まれる緩衝剤としては、下記の無機酸、有機酸もしくはこれらの塩が挙げられる。
【００３１】
上記無機酸としては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸等が挙げられる。
上記有機酸としては、例えば、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、アミン、イミダゾール、ピリジン、カコジル酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、グリシルグリシン、ピロリン酸等が挙げられる。
【００３２】
上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸等が挙げられる。
上記ジカルボン酸としては、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸等が挙げられる。
上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β、β−ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、アミノ酪酸等が挙げられる。
上記ヒドロキシカルボン酸としては、例えば、クエン酸、酒石酸、乳酸等が挙げられる。
上記アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシン等が挙げられる。
上記アミン類としては、例えば、エチレンジアミン、トリエタノールアミン、等が挙げられる。
上記イミダゾール類としては、例えば、イミダゾール、５（４）−メチルイミダゾール、２，５（４）−ジメチルイミダゾール等が挙げられる。
【００３３】
上記無機酸または有機酸の塩としては、公知のものでよく、例えばナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。
【００３４】
また、上記緩衝剤として、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、グリシルグリシン、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものも使用できる。また、ＢｒｉｔｔｏｎとＲｏｂｉｎｓｏｎの緩衝液；ＧＴＡ緩衝液も使用できる。
【００３５】
上記無機酸、有機酸又はこれらの塩は、単独でも、また複数種混合して用いても良く、無機酸と有機酸を混合して用いてもよい。
【００３６】
上記緩衝剤の溶離液中の濃度は、水に溶解された状態で緩衝作用がある範囲であればよく、０．１ｍＭ〜１０００ｍＭであり、好ましくは１〜５００ｍＭである。
【００３７】
上記溶離液には、以下に示す（１）無機塩類、（２）カオトロピックイオン、（３）ｐＨ調節剤、（４）水溶性有機溶媒等を添加してもよい。
【００３８】
（１）無機塩類：例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。これらの塩類の濃度は、特に限定されないが、好ましくは１〜１５００ｍＭである。
【００３９】
（２）カオトロピックイオン：具体例としては、後述する本発明２の溶離液Ｅの説明におけるカオトロピックイオンと同様のものが挙げられる。カオトロピックイオンの溶離液中の濃度は、０．１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ましく、１ｍＭ〜１０００ｍＭがより好ましく、特に好ましくは、１０ｍＭ〜５００ｍＭである。
【００４０】
（３）ｐＨ調節剤：公知の酸、塩基が用いられる。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等が挙げられ、また、塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。これらの酸、塩基の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、０．００１〜５００ｍＭである。
【００４１】
（４）水溶性有機溶媒：メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトンなどが挙げられる。これらの有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、好ましくは０〜８０体積％であり、カオトロピックイオン、無機酸、有機酸、これらの塩などが析出しない程度で用いるのが好ましい。
【００４２】
次に本発明２について説明する。
【００４３】
本発明２においては、カオトロピックイオンが含有され、かつｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩が含有される溶離液（本明細書においては、「溶離液Ｅ」という）と、ｐＨ６．５〜８．０で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩が含有される溶離液（本明細書においては、「溶離液Ｆ」という）の少なくとも２種の溶離液を用いる。
【００４４】
上記溶離液Ｅには、カオトロピックイオンが含有される。このカオトロピックイオンとは、水溶液に解離して生じたイオンにより、水の構造が破壊され、疎水性物質と水が接触したときに起こる、水のエントロピー減少を抑制するもので、具体的には、陰イオンとしては、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化物イオン、酢酸イオン等が挙げられ、またその他に尿素等が挙げられる。また、陽イオンとしては、バリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオン、グアニジンイオン等が挙げられる。
【００４５】
上記カオトロピックイオンの中でも、分離精度をより向上させるために、陰イオンとして、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン等を用い、陽イオンとして、バリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、グアニジンイオン等を用いるのがより好ましい。特に好ましくは、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、ヨウ化物イオン、チオシアン酸イオン、過塩素酸イオン、硝酸イオン、グアニジンイオン等が用いられる。
【００４６】
上記カオトロピックイオンの溶離液Ｅ中の濃度は、０．１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ましく、１ｍＭ〜１０００ｍＭがより好ましく、特に好ましくは、１０ｍＭ〜５００ｍＭである。これは、０．１ｍＭより低いと、分離効果が低下し測定精度が悪くなるためであり、３０００ｍＭよりも高くてもヘモグロビン類の分離効果はそれ以上向上しないためである。また、これらカオトロピックイオンは、単独でもまた、複数種混合して用いてもよい。
【００４７】
さらに溶離液Ｅには、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩が含有される。これらの無機物、有機物及びこれらの塩は、上述の本発明１における緩衝液に含まれる緩衝剤と同様のものを用いることができる。
【００４８】
上記緩衝剤の溶離液Ｅ中の濃度は、水に溶解された状態で、溶離液のｐＨを４．０〜６．８にする緩衝作用がある範囲であればよく、好ましくは１ｍＭ〜１０００ｍＭであり、より好ましくは１０〜５００ｍＭである。
【００４９】
溶離液ＥのｐＨは、４．０〜６．８であるが、より好ましくは、４．５〜５．８とする。ｐＨが４．０未満では、ヘモグロビンが変性する可能性があり、ｐＨが６．８を超えると、ヘモグロビン類のプラス電荷が減少し、カチオン交換基に保持されにくくなり、分離能が悪くなるためである。
【００５０】
上記溶離液Ｆには、以下に示すような、ｐＨ６．５〜８．０で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩が含有される。
【００５１】
上記無機酸としては、リン酸、ホウ酸が挙げられる。また、有機酸としては、ジカルボン酸、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、イミダゾール類、アミン類、アルコール類などが挙げられる。
【００５２】
上記ジカルボン酸としては、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フタル酸などが挙げられる。ヒドロキシカルボン酸としては、クエン酸などが挙げられる。アミノ酸としては、アスパラギン、ヒスチジン、セリンなどが挙げられる。イミダゾール類としては、５（４）-ヒドロキシイミダゾール、イミダゾール、５（４）-メチルイミダゾール、２，５-ジメチルイミダゾール、２，５（４）−ジメチルイミダゾールなどが挙げられる。アミン類としては、エチレンジアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミンなどが挙げられる。アルコール類としては、２-アミノ-２-メチル-１、３-プロパンジオール、２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオールなどが挙げられる。
【００５３】
その他として、２，４，６-コリジン、Ｎ−エチルモルホリン、モルホリン、４−アミノピリジン、ピロリン酸、４−アミノピリジン、カコジル酸、５，５-ジエチルバルビツール酸、β，β’-ジメチルグルタル酸、グリセロールリン酸などが挙げられる。
【００５４】
また、Ｇｏｏｄの緩衝剤、例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ−ｐｒｏｐａｎｅ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、グリシルグリシン、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳなどを用いることもできる。
【００５５】
上記無機酸または有機酸の塩としては、公知のものでよく、例えばナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。
【００５６】
上記無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩は、単独でもまた、複数混合して用いても良く、さらに、無機酸と有機酸を混合して用いてもよい。
【００５７】
上記緩衝剤の溶離液Ｆ中の濃度は、水に溶解された状態で、溶離液のｐＨを６．５〜８．０にする緩衝作用がある範囲であればよく、好ましくは１ｍＭ〜１０００ｍＭであり、より好ましくは１０〜５００ｍＭである。
【００５８】
溶離液ＦのｐＨは、ｐＨ６．５〜８．０であり、好ましくはｐＨ６．７〜７．８である。ｐＨが６．５未満では、ヘモグロビンＡ２の分離が不十分となり、ｐＨが８．０を超えてもヘモグロビンＡ２の分離が不十分になるためである。
【００５９】
本発明２においては、上記溶離液Ｅ及び溶離液Ｆに加えて、さらに、前記溶離液ＦよりもｐＨが低く、かつ塩濃度が高い溶離液（本明細書においては、「溶離液Ｇ」という）を用い、上記溶離液Ｆの送液後に上記溶離液Ｇを送液することもできる。
【００６０】
溶離液ＧのｐＨは、溶離液ＦのｐＨより０．１〜５．０低いのが好ましく、より好ましくは０．５〜４．０低く、特に好ましくは１．０〜３．０低く設定する。これは、溶離液ＧのｐＨを溶離液ＦのｐＨより０．１以上低く設定しないとヘモグロビンＡ２の分離が悪くなり、溶離液ＧのｐＨが溶離液ＦのｐＨより５．０以上低くなるとヘモグロビンが変性してヘモグロビン類の測定精度が悪くなることがあるためである。
【００６１】
さらに、溶離液Ｇの塩濃度は、溶離液Ｆの塩濃度より高く設定される。ここで、塩濃度の差は、溶離液中の総陽イオン濃度の差で表わされる。溶離液Ｇの塩濃度は、溶離液Ｆの塩濃度より、０．５ｍＭ〜２００ｍＭ高く設定するのが好ましく、より好ましくは、１ｍＭ〜１７５ｍＭ、特に好ましくは５ｍＭ〜１５０ｍＭ高く設定される。これは、溶離液Ｇの塩濃度が溶離液Ｆの塩濃度に比べて０．５ｍＭより低いとヘモグロビンＡ２を十分に溶出できなくなり、溶離液Ｇの塩濃度が溶離液Ｆに比べて、２００ｍＭより高いとヘモグロビンＡ２の分離が悪くなることがあるためである。
【００６２】
溶離液Ｇに含有される緩衝剤としては、上記溶離液Ｅに含有されるｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩を使用することができる。また、溶離液Ｆ・Ｇには、上記溶離液Ｅと同様にカオトロピックイオンを添加するのが好ましい。
【００６３】
本発明２において、溶離液Ｅ、溶離液Ｆ及び溶離液Ｇには、以下に示した、（１）無機塩類、（２）ｐＨ調節剤、（３）水溶性有機溶媒、（４）安定剤、（５）アミン類、（６）界面活性剤等を添加してもよい。
【００６４】
（１）無機塩類、（２）ｐＨ調節剤、（３）水溶性有機溶媒として、上述の本発明１の溶離液に添加されるのと同様のものを用いることができる。
【００６５】
（４）ヘモグロビンの安定剤：例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、グルタチオン等の還元剤・酸化防止剤等が挙げれる。
【００６６】
（５）アミン類：主として、ヘモグロビンの非特異的吸着を少なくするために添加する。該アミン類としては、公知のものが用いられ、好ましくは、分子量２０〜５００の第１級アミン、第２級アミン及び第３級アミンが用いられる。
【００６７】
（６）界面活性剤：ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤等が挙げられる。界面活性剤を用いることにより、溶血を効率よく行うだけでなく、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等で測定を行う場合、溶血試薬の通過する流路等を洗浄する効果がある。上記界面活性剤の中でも、好ましくはノニオン性界面活性剤が使用され、例えば、ポリオキシエチレン類（以下、ポリオキシエチレンをＰＯＥ、エチレンオキシド付加モル数を（ｎ）で表す。）、ＰＯＥ（７）デシルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ドデシルエーテル、ＰＯＥ（１０）トリデシルエーテル、ＰＯＥ（１１）テトラデシルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）セチルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ステアリルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）オレイルエーテル、ＰＯＥ（１７）セチルステアリルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）オクチルフェニルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ノニルフェニルエーテル、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノラウリン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノパルミチン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノステアリン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノオレイン酸ソルビタン等が挙げられる。
これらの界面活性剤は、単独でもまた複数混合して用いてもよい。これらの界面活性剤の添加量は、好ましくは０．０１〜１０重量％である。
【００６８】
以下に、本発明１及び本発明２（以下、「本発明」という）に共通する発明の構成について説明する。
【００６９】
上記本発明においては、主としてカラム洗浄を目的として、ｐＨが６．８〜１２の溶離液（本明細書においては、「溶離液Ｈ」という）を送液するのが好ましい。溶離液ＨのｐＨを６．８以上とするのは、これより低いとカラムを通過する際のｐＨがヘモグロビンの等電点に到達せず、カラムを効果的に洗浄することができないためであり、ｐＨを１２以下とするのは、これよりｐＨが高いと充填剤の分解が起こる可能性があるためである。溶離液ＨのｐＨは、７．５〜１１であるのがより好ましく、８．０〜９．５が特に好ましい。但し、充填剤の分解が測定に影響ない場合は、溶離液ＨのｐＨを１２以上にすることも可能である
【００７０】
溶離液Ｈとしては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸などの無機酸又は、その塩；クエン酸などのヒドロキシカルボン酸、β、β−ジメチルグルタル酸などのカルボン酸誘導体、マレイン酸などのジカルボン酸、カコジル酸、などの有機酸又は、その塩が含有される緩衝液が用いられる。その他、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｔｒｉｓ等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものも使用できる。また、イミダゾール等のイミダゾール類；ジエタノールアミン、トリエタノールアミンなどのアミン類；グリシンなどのアミノ酸類；などの有機物も使用できる。また、これらの無機酸、有機酸及びこれらの塩は、複数混合して用いても良く、また、無機酸と有機酸を混合して用いても良い。
【００７１】
上記溶離液Ｈ中の無機酸、有機酸及びこれらの塩の濃度は、水に溶解された状態で溶離液のｐＨを６．８以上にする緩衝作用がある範囲であればよく、好ましくは、１ｍＭ〜１０００ｍＭであり、より好ましくは１０〜５００ｍＭである。
【００７２】
また、より効果的にカラム洗浄を行うためには、上記溶離液Ｈに、カオトロピックイオンを添加することが好ましい。このカオトロピックイオンは、前述したのと同様のものを用いることができる。カオトロピックイオンの溶離液Ｈ中の濃度は、１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ましく、１０ｍＭ〜１０００ｍＭがより好ましく、特に好ましくは、５０ｍＭ〜５００ｍＭである。
【００７３】
上記溶離液Ｈには、前述した溶離液Ｅ、溶離液Ｆ及び溶離液Ｇに添加される各種添加剤、例えば、（１）無機塩類、（２）ｐＨ調節剤、（３）水溶性有機溶媒、（４）安定剤、（５）アミン類、（６）界面活性剤等の物質を添加してもよい。
【００７４】
本発明１において、溶離液Ｈを用いる場合には、溶離液Ａ・溶離液Ｂ・溶離液Ｈ、溶離液Ａ・溶離液Ｂ・溶離液Ｄ・溶離液Ｈ、あるいは溶離液Ａ・溶離液Ｂ・溶離液Ｃ・溶離液Ｄ・溶離液Ｈの順に送液する。また、本発明２において、溶離液Ｈを用いる場合には、溶離液Ｅ・溶離液Ｆ・溶離液Ｈあるいは溶離液Ｅ・溶離液Ｆ・溶離液Ｇ・溶離液Ｈの順に送液する。
【００７５】
また、本発明においては、上記溶離液Ａ〜Ｈの少なくとも一種の溶離液にアジ化物イオンを添加するのがより好ましい。また、溶血液にアジ化物イオンを添加することもできる。アジ化物イオンは、溶離液または溶血液の少なくとも一方に含有されていれば良く、また両方に含有されていても良い。このアジ化物イオンの添加に際しては、水溶液中で解離してアジ化物イオンを生成する塩を用いれば良く、例えば、公知のアジ化物塩等が用いられ、好ましくは、アジ化ナトリウム、アジ化バリウム等が用いられる。
【００７６】
また、上記アジ化物イオンの溶離液あるいは溶血液中の濃度は、０．００１〜０．５重量％であることが好ましく、より好ましくは、０．００５〜０．４重量％である。上記濃度が、０．００１重量％より少ないと、分離能向上の効果がなく、また０．５重量％より多くても分離能は向上しないためである。
【００７７】
本発明におけるカチオン交換液体クロマトグラフィーに用いられる充填剤は、少なくとも１種以上のカチオン交換基を有している粒子よりなるものであり、例えば、高分子粒子にカチオン交換基を導入することで得られる。
【００７８】
該カチオン交換基は、公知のものでよく特に制限はない。例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基などのカチオン交換基が挙げられる。また、このカチオン交換基は、複数種導入しても良い。
【００７９】
より好ましい充填剤としては、少なくとも一種の強カチオン交換基を有する充填剤を用いる。強カチオン交換基とは、上記カチオン交換基のなかでもスルホン酸基等を用いたものであり、 ｐＨ２〜３程度の溶離液中においてもイオン交換作用を発揮することができる。この少なくとも一種の強カチオン交換基を有する充填剤を用いることにより、溶離液のｐＨを低くすることが可能となり、ｐＨを低くすることでＨｂ類のプラス電荷が強くなってカラムに保持され易くなり、結果として分離能を高めることができる。
【００８０】
上記粒子の直径は、好ましくは０．１〜２０μｍ、より好ましくは０．２〜８μｍである。また、粒度分布は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準偏差÷平均直径×１００（％））として、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下である。
【００８１】
上記高分子粒子としては、例えば、シリカ、ジルコニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリアミノ酸、キトサンなどの天然高分子粒子；ポリスチレン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子などが挙げられる。
【００８２】
上記高分子粒子は、導入されるイオン交換基以外の構成成分は、より親水性であることが好ましい。また耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが好ましい。
【００８３】
上記高分子粒子へのカチオン交換基の導入は、公知の方法により行うことができるが、例えば、高分子粒子を調製後、粒子が有する官能基（水酸基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基など）に、化学反応でカチオン交換基を粒子に導入させる方法により行うことができる。
【００８４】
また、カチオン交換基を有する単量体を重合して高分子粒子を調製する方法によってもカチオン交換充填剤を調製できる。例えば、カチオン交換基含有単量体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下に重合する方法などが挙げられる。
【００８５】
また、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチルなどの重合性カチオン交換基含有エステルを架橋性単量体などと混合し、重合開始剤存在下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エステルをカチオン交換基に変換させてもよい。
【００８６】
更に、特公平８−７１９７号公報に記載のように、架橋重合体粒子を調製した後、カチオン交換基を有する単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、該単量体を重合させても良い。
【００８７】
上記充填剤はカラムに充填されて液体クロマトグラフィー測定に用いられる。カラムのサイズは、内径０．１〜５０ｍｍ、長さ１〜３００ｍｍのものが好ましく、内径０．２〜３０ｍｍ、長さ５〜２００ｍｍのものがより好ましい。カラムサイズは、内径０．１ｍｍ、長さ１ｍｍより小さくなると作業性が悪く分離能も悪くなる。また、内径５０ｍｍ、長さ３００ｍｍより大きくなると使用する充填剤量が多くなるだけでなく、分離能も悪くなる。
【００８８】
充填剤のカラムへの充填方法は、公知の任意の方法が使用できるがスラリー充填法がより好ましい。具体的には、例えば、充填剤粒子を溶離液などの緩衝液に分散させたスラリーを送液ポンプなどによりカラムに圧入することにより行う。
【００８９】
上記カラムの素材としては、公知のステンレス等の金属、ガラス、ＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）等の樹脂などが用いられる。また、カラム内表面のように充填剤が接触する部分については、不活性な素材で被覆することが好ましく、このような素材としては、例えば、ＰＥＥＫ、ポリエチレン、テフロン、チタン化合物、珪素化合物、シリコン膜等が挙げられる。
【００９０】
また、カラムのフィルターあるいはプレフィルターを用いることもできるが、この場合は、少なくとも表面が不活性な素材のフィルターを用いるのが好ましい。この不活性な素材としては、セルロースエステル、セルロースアセテート、セルローストリアセテート、セルロース、セルロースナイトレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフロライド、ポリスルフォン、ポリエチレン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン、ガラス素材、アクリル共重合体、酸化物セラミック、炭化物セラミック、窒化物セラミック、珪化物セラミック、硼化物セラミック、チタン等が挙げられ、適宜これらの素材を複数種組み合わせて用いることもできる。また、ステンレスなどの不活性でない素材を用いた場合は、上記の不活性な素材で被覆する方法、シリコーン処理などの不活性処理をする方法、牛血清アルブミン、ゼラチン、カゼイン、グロブリン、ヘモグロビンなどのブロッキング試薬でブロッキングする方法などを適宜使用できる。
【００９１】
本発明の分離方法に使用される液体クロマトグラフィーは、公知のものでよく、例えば、送液ポンプ、試料注入装置（サンプラ）、カラム、検出器などから構成される。また、他の付属装置（カラム恒温槽や溶離液の脱気装置など）が適宜付属されてもよい。
【００９２】
また、本発明においては、上記液体クロマトグラフィーとして、セミミクロ対応装置、すなわち、装置の接液部であるポンプ、ミキシングカラム、サンプラ、配管、プレフィルター（ホルダー、フィルター）、カラム及び検出器（セル）などのデッドボリュームを可及的に小さくした装置を用いることもできる。この場合、例えば、ミキシングカラム容量は５００μｌ以下が好ましく、２５０μｌ以下が特に好ましい。また、サンプラのインジェクションバルブ容量は１０μｌ以下が好ましく、５μｌ以下がより好ましく、２μｌ以下が特に好ましい。また、配管は、内径０．２５ｍｍ以下が好ましく、０．１３ｍｍ以下がより好ましく、０．０６５ｍｍ以下が特に好ましい。また、サンプラ、プレフィルター、カラム、検出器などを配管で連結する場合、配管の長さは、可及的に短い方が好ましい。また、検出器（セル）の容量は、２０μｌ以下が好ましく、１０μｌ以下がより好ましく、５μｌ以下が特に好ましい。送液ポンプは、脈流が極めて少ない安定した送液が可能なものが好ましい。上記装置の中でも短時間でより精度の良い分離を行うためには、例えば、装置の接液部に、テフロン、ＰＥＥＫ等の不活性な素材を用い、さらに装置内のデッドボリュームを極めて小さくする。
【００９３】
段階溶出法によって分離を行う場合の液体クロマトグラフィーの構成例を図１に示した。溶離液ａ、ｂ、ｃ、ｄは、各々溶出力の異なる溶離液であり、電磁弁１によって設定時間ごとに各溶離液に切り替えられるように、構成されている。溶離液は、送液ポンプ２により、試料注入部３から導入された試料とともにカラム４に導かれ、各成分が検出器５により検出される。各ピーク面積、高さ等はインテグレータ６により算出される。
【００９４】
本発明の分離方法における、他の条件としては、公知の条件でよく、溶離液の流速は、好ましくは０．０５〜５ｍｌ／分、より好ましくは０．２〜３ｍｌ／分である。また、上記セミミクロ対応装置を用いた場合、溶離液の流速は、好ましくは０．００１〜３ｍｌ／分、より好ましくは０．０１〜１．８ｍｌ／分、更に好ましくは、０．０３〜１ｍｌ／分である。０．００１ｍｌ／分より遅いと流速が安定せず、３ｍｌ／分より早いと分離精度が低下する。
【００９５】
また、本発明の分離方法において溶離液の送液方法としては、特に限定されるものではないが、例えば勾配溶出法（グラディエント溶出法）、段階溶出法（ステップワイズ溶出法）で送液する方法が挙げられる。
【００９６】
ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎｍの可視光が好ましいが、特にこれのみに限定されるわけではない。
【００９７】
なお、本発明方法で分離される対象となるヘモグロビン混合物は、通常、界面活性剤など溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いる。液体クロマトグラフィーへの注入量は、希釈倍率により異なるが、好ましくは０．１〜１００μｌ程度である。
【００９８】
【実施例】
次に、実施例、比較例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００９９】
［実施例１］
（充填剤の調製）
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４５０ｇ及び２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（和光純薬社製）５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）２ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍｌに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に昇温し、１．５時間重合した。次いで、反応系を３５℃に冷却した後、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東京化成社製）の５０％水溶液４００ｇ、メタノール４００ｍｌを添加し１時間攪拌しながら再び８０℃に昇温し１．３時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６．５μｍの粒子を得た。
【０１００】
（カラムへの充填）
得られた充填剤をカラムに以下のようにして充填した。粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
【０１０１】
得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビンＡ２の分離、測定を行った。
（測定条件）
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ａ：１７０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液Ｂ：１３０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
溶離液Ｈ：３００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
測定開始より０〜１分の間は溶離液Ａを流し、１〜２分の間は溶離液Ｂを流し、２〜２．２分の間は溶離液Ｈを流し、２．２〜３分の間は溶離液Ａを流した。
流速：１．０ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【０１０２】
（測定試料１）
健常人血を採血し、抗血液凝固剤としてフッ化ナトリウム１０ｍｇ／ｍｌを添加した。これに、１５０倍量の溶血液（０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００、東京化成社製）と２０ｍＭリン酸緩衝溶液からなる溶血液（ｐＨ７．０））を添加して溶血し、測定試料とした。
（測定試料２）
ライホチェックＨｂＡ２コントロール・レベル２（バイオラッド社製）を１ｍＬの水に溶解させ、１００倍量で希釈し、測定試料とした。
【０１０３】
（測定結果）
上記測定条件により、試料１を測定して得られたクロマトグラムを図２に示す。ピーク１１はＨｂＡ１ａ及びｂ、ピーク１２はＨｂＦ、ピーク１３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１５はＨｂＡ０、ピーク１６はＨｂＡ２、ピーク１７はその他のＨｂを示す。その結果、ＨｂＡ２（ピーク１６）が良好に、分離されていることがわかる。
また、上記試料１及び２を１０回繰り返し測定したときの、Ａ２ピーク面積（％）の測定精度（ＳＤ；標準偏差、ＣＶ値（％）；変動係数値）を求めた結果を表１に示す。その結果、試料１及び２とも精度良く測定できることがわかる。
さらに、上記試料１について３０００検体を連続測定した時のＨｂＡ２の保持時間を５００検体ごとに表２に示す。その結果、保持時間の変化率が小さいことがわかる。
変化率＝（１回目測定のＡ２保持時間−３０００回目測定のＡ２保持時間）
／１回目測定のＡ２保持時間）×１００
【０１０４】
【表１】
【０１０５】
【表２】
【０１０６】
［実施例２］
溶離液及び溶出条件を下記のようにした以外は、実施例１と同様の条件でヘモグロビンＡ２の分離、測定を行った。
溶離液：溶離液Ａ：１７０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液Ｂ：１３０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
溶離液Ｃ：１７０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液Ｄ：１３０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）
溶離液Ｈ：３００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
測定開始より０〜１分の間は溶離液Ａを流し、１〜１．４分の間は溶離液Ｂを流し、１．４〜１．６分の間は溶離液Ｃを流し、１．６〜２分の間は溶離液Ｄを流し、２〜２．２分の間は溶離液Ｈを流し、２．２〜３分の間は溶離液Ａを流した。
上記測定条件により、試料１を測定して得られたクロマトグラムを図３に示す。その結果ＨｂＡ２（ピーク１６）が良好に分離されていることがわかる。また、測定精度を表１に、保持時間の変化率を表２に示す。結果、測定精度、保持時間の変化率とも小さく良好に測定できていることがわかる。
【０１０７】
［比較例１］
溶離液及び溶出条件を下記のようにした以外は、実施例１と同様の条件でヘモグロビン類の測定を行った。
溶離液：溶離液１：１７０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液２：３００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
測定開始より０〜１４．５分の間は溶離液１を流し、１４．５〜１５．２分の間は溶離液２を流し、１５．２〜１６分の間は溶離液１を流した。
上記測定条件により、試料１を測定して得られたクロマトグラムを図４に示す。その結果、測定に長時間を要したにもかかわらずＨｂＡ２（ピーク１６）は良好に分離されなかった。また、測定精度を表１に保持時間の変化率を表２に示す。結果、測定精度、保持時間の変化率とも大きくなった。
【０１０８】
［比較例２］
溶離液及び溶出条件を下記のようにした以外は、実施例１と同様の条件でヘモグロビン類の測定を行った。
溶離液：溶離液１：１７０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液２：２５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液３：３００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
測定開始より０〜１分の間は溶離液１を流し、１〜３．５分の間は溶離液２を流し、３．５〜４．２分の間は溶離液３を流し、４．２〜５分の間は溶離液１を流した。
上記測定条件により、試料１を測定して得られたクロマトグラムを図５に示す。その結果、ＨｂＡ２（ピーク１６）は良好に分離されなかった。また、測定精度を表１に保持時間の変化率を表２に示す。結果、測定精度、保持時間の変化率とも大きくなった。
【０１０９】
［実施例３］
溶離液及び溶出条件を下記のようにした以外は、実施例１と同様の条件で試料１の測定を行った。
溶離液：溶離液Ａ１：４５ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ａ２：５５ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｂ：２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）
溶離液Ｄ：１２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液Ｈ：３００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
測定開始より０〜１分の間は溶離液Ａ１を流し、１〜１．５分の間は溶離液Ａ２を流し、１．５〜２．１分の間は溶離液Ｂを流し、２．１〜２．５分の間は溶離液Ｄを流し、２．５〜２．７分の間は溶離液Ｈを流し、２．７〜３．５分の間は溶離液Ａ１を流した。
流速：２．０ｍｌ／分
【０１１０】
得られたクロマトグラムを図６に示す。その結果ＨｂＡ２（ピーク１６）と共に安定型ＨｂＡ１ｃ（ピーク１４）も良好に分離されていることがわかる。
【０１１１】
［実施例４］
溶離液及び溶出条件を下記のようにした以外は、実施例１と同様の条件で下記試料３の測定を行った。
（測定試料３）
ＡＦＳＣコントロール（ヘレナ社製）を６７倍量の溶血試薬で希釈したものを用いた。
（測定条件）
溶離液：溶離液Ａ１：４５ｍＭの過塩素酸、０．０３重量％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ａ２：５５ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｂ：２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）
溶離液Ｄ１：１２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液Ｄ２：１５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液Ｈ：３００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
測定開始より０〜１分の間は溶離液Ａ１を流し、１〜１．５分の間は溶離液Ａ２を流し、１．５〜２．１分の間は溶離液Ｂを流し、２．１〜２．５分の間は溶離液Ｄ１を流し、２．５〜３．０分の間は溶離液Ｄ２を流し、３．０〜３．２分の間は溶離液Ｈを流し、３．２〜４．０分の間は溶離液Ａ１を流した。
流速：２．０ｍｌ／分
【０１１２】
得られたクロマトグラムを図７に示す。その結果ＨｂＡ２（ピーク１６）と共に、ＨｂＳ・ＨｂＣ（ピーク１８・ピーク１９）も良好に分離されていることがわかる。
【０１１３】
［比較例３］
溶離液及び溶出条件を下記のようにした以外は、実施例４と同様の条件で試料３の測定を行った。
溶離液：溶離液１：４５ｍＭの過塩素酸、０．０３重量％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液２：５５ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液３：２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）
溶離液４：３５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）
溶離液５：４０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）
溶離液６：３００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
測定開始より０〜１分の間は溶離液１を流し、１〜１．５分の間は溶離液２を流し、１．５〜２．１分の間は溶離液３を流し、２．１〜２．５分の間は溶離液４を流し、２．５〜３．０分の間は溶離液５を流し、３．０〜３．２分の間は溶離液６を流し、３．２〜４．０分の間は溶離液１を流した。
得られたクロマトグラムを図８に示す。その結果、ＨｂＡ２（ピーク１６）、ＨｂＳ（ピーク１８）及びＨｂＣ（ピーク１９）間の分離が悪いことがわかる。
【０１１４】
［実施例５］
（充填剤の調製）
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４５０ｇ及び２−ヒドロキシ−１，３ジメタクリロキシプロパン（和光純薬社製）５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）２ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍｌに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に昇温し、１．５時間重合した。次いで、反応系を３５℃に冷却した後、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東京化成社製）の５０％水溶液４００ｇ、メタノール４００ｍｌを添加し１時間攪拌しながら再び８０℃に昇温し１．３時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６．５μｍの粒子を得た。
【０１１５】
（カラムの充填）
得られた充填剤をカラムに以下のようにして充填した。粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（内径４．６×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
【０１１６】
得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビンＡ２の分離、測定を行った。
（測定条件）
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ｅ：４５ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｆ：２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．５）
溶離液Ｈ：２００ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
測定開始より０〜１．７分の間は溶離液Ｅを流し、１．７〜３．５分の間は溶離液Ｆを流し、３．５〜３．６分の間は溶離液Ｈを流し、３．６〜４．０分の間は溶離液Ｅを流した。
流速：２．０ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【０１１７】
（測定試料４）
健常人血を採血し、抗血液凝固剤としてフッ化ナトリウムを１０ｍｇ／ｍｌとなるよう添加した。これに、１５０倍量の溶血液（界面活性剤として０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００、東京化成社製）を含むリン酸緩衝溶液（ｐＨ７））を添加して溶血し、測定試料４とした。
（測定試料５：ＣＨｂ含有試料）
健常人血１０ｍｌに、０．３重量％のシアン酸ナトリウムの生理食塩水１ｍｌを添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血液により溶血し、１５０倍に希釈して、測定試料５とした。
（測定試料６：ＡＨｂ含有試料）
健常人血１０ｍｌに、０．３重量％のアセトアルデヒドの生理食塩水１ｍｌを添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血液により溶血し、１５０倍に希釈して、測定試料６とした。
【０１１８】
（測定結果）
上記測定条件により、試料４、５及び６を測定して得られたクロマトグラムを図９〜１１に示した。図９は測定試料４、図１０は測定試料５、図１１は測定試料６を測定した結果である。ピーク１１はＨｂＡ１ａ及びｂ、ピーク１２はＨｂＦ、ピーク１３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１５はＨｂＡ０、ピーク１６はＨｂＡ２、ピーク２０はＣＨｂ、ピーク２１はＡＨｂを示す。図９より、安定型ＨｂＡ１ｃ（ピーク１４）及びＨｂＡ２（ピーク１６）が良好に分離できたことが分かる。図１０ではＣＨｂ（ピーク２０）、図１１ではＡＨｂ（ピーク２１）が安定型ＨｂＡ１ｃ（ピーク１４）から良好に分離されており、また、ＨｂＡ２（ピーク１６）も良好に分離されている。
【０１１９】
［実施例６］
溶離液を以下の組成としたこと以外は、実施例５と同様の条件でヘモグロビン類の測定を行った。
溶離液：溶離液Ｅ：５０ｍＭの過塩素酸を含有する２５ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｆ：２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．５）
溶離液Ｈ：２５０ｍＭの過塩素酸を含有する２０ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４）
測定試料は、実施例５と同じ測定試料４、５及び６を用いた。その結果、実施例５と同様に良好な結果が得られた。
【０１２０】
［実施例７］
溶離液Ｆの組成を以下のようにした以外は、実施例６と同様にして測定試料４、５及び６を測定した。
溶離液Ｆ：４０ｍＭ Ｂｉｓｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．８）
【０１２１】
［実施例８］
溶離液Ｆの組成を以下のようにした以外は、実施例６と同様にして測定試料４、５及び６を測定した。
溶離液Ｆ：４０ｍＭ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）
【０１２２】
［実施例９］
溶離液Ｆの組成を以下のようにした以外は、実施例６と同様にして測定試料４、５及び６を測定した。
溶離液Ｆ：１５ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．１）
【０１２３】
［実施例１０］
溶離液Ｆの組成を以下のようにした以外は、実施例６と同様にして測定試料４、５及び６を測定した。
溶離液Ｆ：４０ｍＭ Ｂｃｉｎｅ緩衝液（ｐＨ７．６）
【０１２４】
［実施例１１］
溶離液Ｆの組成を以下のようにした以外は、実施例６と同様にして測定試料４、５及び６を測定した。
溶離液Ｆ：４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）
【０１２５】
［実施例１２］
溶離液Ｆの組成を以下のようにした以外は、実施例６と同様にして測定試料４、５及び６を測定した。
溶離液Ｆ：４０ｍＭ ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）
【０１２６】
［実施例１３］
溶離液Ｆの組成を以下のようにした以外は、実施例６と同様にして測定試料４、５及び６を測定した。
溶離液Ｆ：２０ｍＭ マレイン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
【０１２７】
（実施例７〜１３の測定結果）
実施例７〜１３では、実施例５と同様に良好な結果が得られた。
【０１２８】
［実施例１４］
（セミミクロ対応装置）
以下の測定装置、測定条件を用いた以外は、実施例６と同様に測定を行った。
測定装置：送液ポンプ：イナートポンプ２００１，ＮＡＮＯＳＰＡＣＥ ＳＩ−１（資生堂社製）
オートサンプラ：オートサンプラー２００３（資生堂社製）
検出器：ＵＶ−ＶＩＳ検出器２００２（資生堂社製）
カラム：ステンレス製カラム本体（内径１．５ｍｍ×長さ４０ｍｍ）に実施例５と同じ充填剤を同様の方法で充填してカラムを作成した。
溶離液：溶離液Ｅ：４６ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｆ：２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．５）
溶離液Ｈ：２００ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
測定開始より０〜１．７分の間は溶離液Ｅを流し、１．７〜３．５分の間は溶離液Ｆを流し、３．５〜３．６分の間は溶離液Ｈを流し、３．６〜４．０分の間は溶離液Ｅを流した。
流速：０．２ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：３μｌ
【０１２９】
（測定結果）
実施例１４で得られた結果を図１２〜１４に示した。図１２は測定試料４、図１３は測定試料５、図１４は測定試料６を測定した結果である。実施例５と同様に安定型ＨｂＡ１ｃ（ピーク１４）がＣＨｂ（ピーク２０）及びＡＨｂ（ピーク２１）などの修飾Ｈｂから良好に分離され、しかも、ＨｂＡ２（ピーク１６）も良好に分離された。
【０１３０】
［比較例４］
以下に示す溶離液２を、実施例６における溶離液Ｆの代わりに用いたこと以外は、実施例６と同様にして測定試料４を測定した。
溶離液２：２０ｍＭ リンゴ酸緩衝液（ｐＨ５．７）
（測定結果）
図１５に示したように、比較例４では、安定型ＨｂＡ１ｃ（ピーク１４）は分離できたが、ＨｂＡ２（ピーク１６）の分離が不十分であった。
【０１３１】
（ＨｂＦ、安定型ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ２の測定精度評価）
上記実施例５〜１０及び比較例４における測定試料４の測定結果を表３及び表４に示した。
【０１３２】
【表３】
【０１３３】
【表４】
【０１３４】
その結果、実施例５〜１０では、ＨｂＡ２の測定精度（ＣＶ値）が非常に高いと同時に、ＨｂＦ及び安定型ＨｂＡ１ｃの測定精度も良かった。また、ＨｂＡ２値は、いずれも２．３％と非常に測定精度が良かった。一方、比較例４では、ＨｂＡ２の定精度が非常に悪かった。
【０１３５】
［実施例１５］
溶離液を以下の組成としたこと以外は、実施例５と同様の条件で下記測定試料７・８について、ヘモグロビンＡ２の分離を行った。
溶離液：溶離液Ｅ：５０ｍＭの過塩素酸、０．０３重量％アジ化ナトリウムを含有する２５ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｆ：０．０３重量％アジ化ナトリウムを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）
溶離液Ｇ：０．０３重量％アジ化ナトリウムを含有する９０ｍＭの過塩素酸を含有する５ｍＭコハク酸−１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｈ：２５０ｍＭの過塩素酸を含有する２０ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４）
測定開始より０〜１．７分の間は溶離液Ｅを流し、１．７〜３．０分の間は溶離液Ｆを流し、３．０〜３．５分の間は溶離液Ｇを流し、３．５〜３．６分の間は溶離液Ｈを流し、３．６〜４．０分の間は溶離液Ｅを流した。
流速：２．０ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【０１３６】
（測定試料７）
Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ａ２ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｌｅｖｅｌ２（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を添付文書に従って、水１ｍｌで溶解し、更に、これを、６０倍量の溶血液（界面活性剤として０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００、東京化成社製）を含有するリン酸緩衝溶液（ｐＨ７））を添加希釈して、測定試料７とした。
【０１３７】
（測定試料８）
Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ＡＦＳＣ ＨＥＭＯ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を、６０倍量の溶血液（界面活性剤として０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００、東京化成社製）を含有するリン酸緩衝溶液（ｐＨ７））を添加希釈して、測定試料８とした。
【０１３８】
（測定結果）
実施例１５で得られたクロマトグラムを図１６・１７に示した。測定試料７の結果を図１６に、測定試料８の結果を図１７に示した。図１６・１７から明らかのようにＨｂＦ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣを良好に分離出来た。また、表５に示すように、測定精度も良好であった。
【０１３９】
【表５】
【０１４０】
［実施例１６］
実施例１５における溶離液Ｅを以下の組成としたこと以外は、実施例１５と同様の条件でヘモグロビン類の測定を行った。
溶離液Ｅ：５０ｍＭの過塩素酸を含有する２５ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
【０１４１】
（測定結果）
実施例１６で得られたクロマトグラムを図１８・１９に示した。測定試料７の結果を図１８に、測定試料８の結果を図１９に示した。図１８・１９から、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣは良好に分離出来るが、ＨｂＦについては分離が悪いことが分かる。
【０１４２】
【発明の効果】
本発明は以上の構成からなるので、Ｈｂ混合物からＨｂＡ２分離するに際し、従来法よりも精度良く、かつ短時間に分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】液体クロマトグラフィー装置の構成の一例を示した図。
【図２】実施例１の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料１）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図３】実施例２の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料１）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図４】比較例１の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料１）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図５】比較例２の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料１）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図６】実施例３の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料１）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図７】実施例４の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料３）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図８】比較例３の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料３）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図９】実施例５の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料４）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１０】実施例５の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料５）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１１】実施例５の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料６）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１２】実施例１４の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料４）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１３】実施例１４の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料５）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１４】実施例１４の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料６）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１５】比較例４の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料４）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１６】実施例１５の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料７）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１７】実施例１５の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料８）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１８】実施例１６の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料７）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１９】実施例１６の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料８）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【符号の説明】
ａ，ｂ，ｃ，ｄ 溶離液群
１ 電磁弁
２ 送液ポンプ
３ 試料注入部
４ カラム
５ 検出器
６ インテグレータ
１１ ＨｂＡ１ａ及びｂのピーク
１２ ＨｂＦのピーク
１３ 不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
１４ 安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
１５ ＨｂＡ０のピーク
１６ ＨｂＡ２のピーク
１７ その他のＨｂのピーク
１８ ＨｂＳのピーク
１９ ＨｂＣのピーク
２０ ＣＨｂのピーク
２１ ＡＨｂのピーク
【発明の属する技術分野】
本発明は、カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ２の分離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘモグロビンＡ２は、α鎖とδ鎖からなるヘモグロビンであり、ヘモグロビンＦと共に地中海性貧血（ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ）の診断指標として用いられている。地中海性貧血症を検査したい場合、一般的には、カチオン交換液体クロマトグラフィーを用いて、ヘモグロビン混合物からヘモグロビンＡ２（以下、ＨｂＡ２という）を分離、定量することによって行われている。
【０００３】
通常、カチオン交換液体クロマトグラフィーを用いて、ヘモグロビン混合物、すなわち、溶血液試料を分離すると、ヘモグロビンＡ１ａ（以下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、ＨｂＦという）、不安定型ヘモグロビン（以下、不安定型ＨｂＡ１ｃという）、安定型ヘモグロビン（以下、安定型ＨｂＡ１ｃという）並びにヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という）などのピークが出現する。この際、ヘモグロビンＡ０とＨｂＡ２のカチオン交換カラムに対する保持力が近いためピークが近接し、これらを完全に分離するには、長時間を要していた。
【０００４】
ヘモグロビン（以下、Ｈｂという）混合物からＨｂＡ２を分離する方法として、例えば、米国特許４，８１０，３９１号公報には、弱カチオン交換充填剤を用いた方法が開示されている。この方法によれば、リン酸濃度とｐＨが異なる３種の緩衝溶離液を用いることを特徴とするものであり、第１の溶離液は、１〜２０ｍＭのりん酸緩衝液で、ｐＨが６．５〜６．９に設定されており、ＨｂＡ１ａとＨｂＡ１ｂの溶出に用いられ、第２の溶離液は、１５〜５５ｍＭのりん酸緩衝液でｐＨが６．４〜６．８に設定されており、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０の溶出に用いられ、第３の溶離液は、６０〜１００ｍＭのりん酸緩衝液でｐＨが６．４〜６．８に設定されており、ＨｂＡ２の溶出に用いられる。
【０００５】
しかしながら、上記方法においては、各溶離液の違いはほぼ塩濃度のみであるため、測定時間が非常に長く、多量の検体について迅速に分離測定を行うことができないという問題点があった。これに加え、ＨｂＡ１ｃの分離が不十分であるために、ＨｂＡ２の分離測定に加えてＨｂＡ１ｃを同時に分離測定したい場合であっても、ＨｂＡ１ｃの測定精度が極めて低いという問題点もあった。さらに、溶離液ｐＨがＨｂの等電点以下であるために、充填剤にＨｂ等の生体成分が蓄積しやすくカラムの寿命も短いという問題点もあった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、Ｈｂ混合物からＨｂＡ２を分離する方法の上記問題点に鑑み、従来法より、ＨｂＡ２を精度良く、かつ短時間に分離可能なＨｂＡ２の分離方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明（以下「本発明１」という）は、カチオン交換液体クロマトグラフィーによる、ヘモグロビン混合物からのヘモグロビンＡ２の分離方法において、ヘモグロビンＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類を溶出させるための溶離液（溶離液Ａ）と、ヘモグロビンＡ０以降に溶出するヘモグロビン類を溶出させるための溶離液（溶離液Ｂ）の少なくとも２種の溶離液を用い、前記溶離液ＡのｐＨが４．０〜６．０であって、前記溶離液ＢのｐＨが、前記溶離液ＡのｐＨより０．５以上高いことを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【０００８】
請求項２記載の発明は、請求項１記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、前記溶離液Ｂの塩濃度が、前記溶離液Ａの塩濃度より低いことを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【０００９】
請求項３記載の発明は、請求項１または２記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、さらに、少なくともヘモグロビンＡ２を溶出させるための溶離液（溶離液Ｄ）を用い、前記溶離液ＤのｐＨが、前記溶離液ＢのｐＨより０．５以上低いことを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【００１０】
請求項４記載の発明は、請求項３記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、前記溶離液Ｂの塩濃度が、前記溶離液Ａの塩濃度より低く、前記溶離液Ｄの塩濃度が、前記溶離液Ｂの塩濃度より高いことを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【００１１】
請求項５記載の発明は、請求項３または４記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、さらに、前記溶離液Ｂ及び溶離液Ｄよりも溶出力の弱い溶離液（溶離液Ｃ）を用い、前記溶離液Ｂを送液した後に、前記溶離液Ｃを送液し、その後前記溶離液Ｄを送液することを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【００１２】
請求項６記載の発明（以下「本発明２」という）は、カチオン交換液体クロマトグラフィーによる、ヘモグロビン混合物からのヘモグロビンＡ２の分離方法において、カオトロピックイオンが含有され、かつｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩が含有される溶離液（以下「溶離液Ｅ」という）と、ｐＨ６．５〜８．０で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩が含有される溶離液（以下「溶離液Ｆ」という）の少なくとも２種の溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【００１３】
請求項７記載の発明は、請求項６記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、さらに、前記溶離液ＦよりもｐＨが低く、かつ塩濃度が高い溶離液（以下「溶離液Ｇ」という）を用い、前記溶離液Ｆの送液後に前記溶離液Ｇを送液することを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【００１４】
請求項８載の発明は、請求項１〜７いずれか一項に記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、前記溶離液Ｂ、溶離液Ｄ、溶離液Ｆまたは溶離液Ｇの送液後に、 ｐＨが６．８〜１２の溶離液（溶離液Ｈ）を送液することを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【００１５】
請求項９記載の発明は、請求項８記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、前記溶離液Ｈにカオトロピックイオンが含有されることを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【００１６】
請求項１０記載の発明は、請求項１〜９のいずれか一項に記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、前記溶離液Ａ〜Ｈのうち少なくとも一種の溶離液、及び／または、溶血液に、アジ化物イオンが含有されることを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【００１７】
請求項１１記載の発明は、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、充填剤として、少なくとも一種の強カチオン交換基を有する充填剤を用いることを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法である。
【００１８】
まず本発明１について説明する。
【００１９】
本発明１における「ヘモグロビンＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類を溶出させるための溶離液（本明細書においては、「溶離液Ａ」という）」とは、カチオン交換液体クロマトグラフィーによってヘモグロビン混合物を分離する際に、ＨｂＡ０よりも保持時間の短いＨｂ類を溶出させるのに用いる溶離液を意味する。この溶離液Ａによって溶出されるＨｂ類としては、一般的には、 ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、安定型ＨｂＡ１ｃ及び不安定型ＨｂＡ１ｃ等が挙げられる。但し、溶離液Ａのみによって上記Ｈｂ類の全てが溶出される必要はなく、上記Ｈｂ類のうち少なくとも１種のＨｂが溶出されればよい。また、本発明１は、ＨｂＡ２を分離することを主目的とするが、溶離液Ａで、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、安定型ＨｂＡ１ｃ及び不安定型ＨｂＡ１ｃを溶出することにより、安定型ＨｂＡ１ｃの分離定量を同時に行うことも可能である。
【００２０】
上記溶離液ＡのｐＨは、４．０〜６．０であり、より好ましいｐＨは、４．５〜５．８である。これは、溶離液ＡのｐＨが４．０未満であるとヘモグロビンが変性する可能性があり、６．０を超えるとヘモグロビンのプラス電荷が減少し、カチオン交換基に保持され難くなって、分離能が悪くなるためである。なお、溶離液Ａは、必ずしも単一種類の溶離液である必要はなく、上記条件を満たす範囲で、組成・溶出力等の異なる複数種類の溶離液から構成される溶離液群Ａであってもよい（以下、溶離液Ａがｎ種類の溶離液で構成される場合は、「溶離液Ａ１、溶離液Ａ２、…、溶離液Ａｎ」のように表わす。）。ＨｂＡ２の分離に加えて、安定型ＨｂＡ１ｃをより短時間で分離定量する場合においては、溶離液Ａ１、溶離液Ａ２、溶離液Ａ３等を溶出力の弱いものから強いものへ勾配溶出法若しくは段階溶出法により、あるいは勾配溶出法と段階溶出法との併用により送液するのがよい。
【００２１】
本発明１における「ヘモグロビンＡ０以降に溶出するヘモグロビン類を溶出させるための溶離液（本明細書においては、「溶離液Ｂ」という）」とは、カチオン交換液体クロマトグラフィーによってヘモグロビン混合物を分離する際に、ＨｂＡ０の保持時間以上の保持時間を有するＨｂ類を溶出させるのに用いる溶離液を意味する。この溶離液Ｂによって溶出されるＨｂ類としては、一般的には、 ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等が挙げられるが、これらのＨｂ類の全てが溶離液Ｂによって溶出される必要はない。本発明１において、溶離液Ａと溶離液Ｂのみを用いる場合等においては、この溶離液ＢによってＨｂＡ０、ＨｂＡ２等が溶出される。また、後述のようにＨｂＡ２を溶出させるために溶離液Ｄを用いる場合においては、上記溶離液Ｂによって、少なくともＨｂＡ０のみが溶出されればよい。また、溶離液Ｂによって少なくともＨｂＡ０が溶出される限り、溶離液Ｂによって、安定型ＨｂＡ１ｃや不安定型ＨｂＡ１ｃ等が溶出されてもよい。特に、安定型ＨｂＡ１ｃの定量を行わないで、ＨｂＦ及びＨｂＡ２の定量を行う場合においては、溶離液Ｂによって安定型ＨｂＡ１ｃが溶出される方がより迅速な分離を可能とする。
【００２２】
上記溶離液ＢのｐＨは、溶離液ＡのｐＨよりも０．５以上高いことを特徴とする。これは、溶離液ＢのｐＨを、溶離液ＡのｐＨよりも０．５以上高くすることによって、ＨｂＡ０とＨｂＡ２の分離度をより向上させることができるためである。より好ましくは、溶離液ＢのｐＨを、溶離液ＡのｐＨよりも０．８以上高く設定する。溶離液Ｂの好ましいｐＨの範囲は、ヘモグロビン類の等電点（ヘモグロビン類の等電点については、理化学事典（第４版、１９８７年９月、岩波書店、久保亮五ら編集）、１１７８頁に記載あるように、ｐＨ６．８〜７．０である）付近のｐＨである６．０〜８．０である。なお、溶離液Ｂは、必ずしも単一種類の溶離液である必要はなく、上記条件を満たす範囲で、組成・溶出力等の異なる複数種類の溶離液から構成される溶離液群Ｂであってもよい（以下、溶離液Ｂがｎ種類の溶離液で構成される場合は、「溶離液Ｂ１、溶離液Ｂ２、…、溶離液Ｂｎ」のように表わす。）。
【００２３】
本発明１において、より好ましくは、溶離液Ｂの塩濃度を、溶離液Ａの塩濃度より低く設定する。ここで言う溶離液の塩濃度とは、溶離液中の総陽イオン濃度を意味する。溶離液Ｂの塩濃度を溶離液Ａの塩濃度より低く設定することによって、ＨｂＡ０とＨｂＡ２との分離度をより向上させることができる。なお、溶離液Ｂの塩濃度は、溶離液Ａの塩濃度よりも１０ｍＭ以上低く設定することが好ましく、より好ましくは４０ｍＭ以上低く設定する。
【００２４】
本発明１においては、上記溶離液Ａ及び溶離液Ｂに加えて、さらに、少なくともヘモグロビンＡ２を溶出させるための溶離液（本明細書においては、「溶離液Ｄ」という）を用いるのがより好ましい。この溶離液Ｄを用いることにより、ＨｂＡ０とＨｂＡ２との分離度及びＨｂＡ２とそれ以降に溶出するＨｂ類との分離度をより向上させることができる。この溶離液Ｄは、少なくともＨｂＡ２を溶出させる溶離液であればよい。従って、ＨｂＡ２が溶出されさえすれば、ＨｂＳやＨｂＣ等については、溶離液Ｄによって溶出されてもよいし、後述の溶離液Ｈ等によって溶出されてもよい。
【００２５】
上記溶離液ＤのｐＨは、溶離液ＢのｐＨよりも０．５以上低いことを特徴とする。これは、溶離液ＤのｐＨを、溶離液ＢのｐＨよりも０．５以上低くすることによって、ＨｂＡ０とＨｂＡ２との分離度及びＨｂＡ２とそれ以降に溶出するＨｂ類との分離度をより向上させることができるためである。より好ましくは、溶離液ＤのｐＨを、溶離液Ｂよりも０．８以上低く設定する。なお、溶離液Ｄは、必ずしも単一種類の溶離液である必要はなく、上記条件を満たす範囲で、組成・溶出力等の異なる複数種類の溶離液から構成される溶離液群Ｄであってもよい（以下、溶離液Ｄがｎ種類の溶離液で構成される場合は、「溶離液Ｄ１、溶離液Ｄ２、溶離液Ｄｎ」のように表わす。）。この様な、溶離液群Ｄを用いることにより、より短時間で精度よくＨｂＡ２を分離すると同時に、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を分離定量することも可能となる。
【００２６】
上記溶離液Ｄを用いる場合において、より好ましくは、溶離液Ｂの塩濃度を、溶離液Ａの塩濃度より低く、溶離液Ｄの塩濃度を、溶離液Ｂの塩濃度より高く設定する。なお、溶離液Ｂの塩濃度を、溶離液Ａの塩濃度よりも１０ｍＭ以上低く設定し、溶離液Ｄの塩濃度を、溶離液Ｂの塩濃度よりも１０ｍＭ以上高く設定することが好ましく、より好ましくは溶離液Ｂの塩濃度を、溶離液Ａの塩濃度よりも５０ｍＭ以上低く設定し、溶離液Ｄの塩濃度を、溶離液Ｂの塩濃度よりも５０ｍＭ以上高く設定する
【００２７】
本発明１においては、上記溶離液Ａ、溶離液Ｂ及び溶離液Ｄの他に、上記溶離液Ｂ及び溶離液Ｄよりも溶出力の弱い溶離液（本明細書においては、「溶離液Ｃ」という）を用い、溶離液Ｂを送液した後に、溶離液Ｃを送液し、その後溶離液Ｄを送液することも可能である。この溶離液Ｃを送液することで、ＨｂＡ２の溶出時間を遅くさせ、ＨｂＡ２をより精度良く分離することができる。
【００２８】
上記溶離液Ｃは、溶離液Ｂ及び溶離液Ｄより溶出力が弱い溶離液であればよく、ｐＨは特に限定されない。溶出力が弱い溶離液とは、カチオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン混合物を分離した際に、各Ｈｂ類の溶出時間を遅くするような溶離液のことを言い、溶出力を弱くするには、例えば、溶離液の塩濃度を下げる方法、ｐＨを下げる方法等が挙げられる。ここでの溶離液Ｃは、ｐＨもしくは塩濃度、或いはその両者が溶離液Ｂ及び溶離液Ｄより低いものである。
【００２９】
本発明１においては、溶離液Ａ・溶離液Ｂを通常この順に用い、溶離液Ｄも用いる場合には、溶離液Ａ・溶離液Ｂ・溶離液Ｄの順に、さらに、溶離液Ｃを用いる場合には、溶離液Ａ・溶離液Ｂ・溶離液Ｃ・溶離液Ｄの順に送液する。溶離液の溶出力は、通常、溶離液Ａ・溶離液Ｂ・溶離液Ｄの順に強くなるように用いる。
【００３０】
本発明１において用いられる、上記溶離液Ａ〜Ｄ（以下、本発明１の説明においては、単に「溶離液」という）は、緩衝液から構成される。もちろん、この緩衝液に後述の添加剤を適宜添加して用いてもよい。緩衝液に含まれる緩衝剤としては、下記の無機酸、有機酸もしくはこれらの塩が挙げられる。
【００３１】
上記無機酸としては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸等が挙げられる。
上記有機酸としては、例えば、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、アミン、イミダゾール、ピリジン、カコジル酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、グリシルグリシン、ピロリン酸等が挙げられる。
【００３２】
上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸等が挙げられる。
上記ジカルボン酸としては、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸等が挙げられる。
上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β、β−ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、アミノ酪酸等が挙げられる。
上記ヒドロキシカルボン酸としては、例えば、クエン酸、酒石酸、乳酸等が挙げられる。
上記アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシン等が挙げられる。
上記アミン類としては、例えば、エチレンジアミン、トリエタノールアミン、等が挙げられる。
上記イミダゾール類としては、例えば、イミダゾール、５（４）−メチルイミダゾール、２，５（４）−ジメチルイミダゾール等が挙げられる。
【００３３】
上記無機酸または有機酸の塩としては、公知のものでよく、例えばナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。
【００３４】
また、上記緩衝剤として、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、グリシルグリシン、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものも使用できる。また、ＢｒｉｔｔｏｎとＲｏｂｉｎｓｏｎの緩衝液；ＧＴＡ緩衝液も使用できる。
【００３５】
上記無機酸、有機酸又はこれらの塩は、単独でも、また複数種混合して用いても良く、無機酸と有機酸を混合して用いてもよい。
【００３６】
上記緩衝剤の溶離液中の濃度は、水に溶解された状態で緩衝作用がある範囲であればよく、０．１ｍＭ〜１０００ｍＭであり、好ましくは１〜５００ｍＭである。
【００３７】
上記溶離液には、以下に示す（１）無機塩類、（２）カオトロピックイオン、（３）ｐＨ調節剤、（４）水溶性有機溶媒等を添加してもよい。
【００３８】
（１）無機塩類：例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。これらの塩類の濃度は、特に限定されないが、好ましくは１〜１５００ｍＭである。
【００３９】
（２）カオトロピックイオン：具体例としては、後述する本発明２の溶離液Ｅの説明におけるカオトロピックイオンと同様のものが挙げられる。カオトロピックイオンの溶離液中の濃度は、０．１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ましく、１ｍＭ〜１０００ｍＭがより好ましく、特に好ましくは、１０ｍＭ〜５００ｍＭである。
【００４０】
（３）ｐＨ調節剤：公知の酸、塩基が用いられる。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等が挙げられ、また、塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。これらの酸、塩基の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、０．００１〜５００ｍＭである。
【００４１】
（４）水溶性有機溶媒：メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトンなどが挙げられる。これらの有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、好ましくは０〜８０体積％であり、カオトロピックイオン、無機酸、有機酸、これらの塩などが析出しない程度で用いるのが好ましい。
【００４２】
次に本発明２について説明する。
【００４３】
本発明２においては、カオトロピックイオンが含有され、かつｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩が含有される溶離液（本明細書においては、「溶離液Ｅ」という）と、ｐＨ６．５〜８．０で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩が含有される溶離液（本明細書においては、「溶離液Ｆ」という）の少なくとも２種の溶離液を用いる。
【００４４】
上記溶離液Ｅには、カオトロピックイオンが含有される。このカオトロピックイオンとは、水溶液に解離して生じたイオンにより、水の構造が破壊され、疎水性物質と水が接触したときに起こる、水のエントロピー減少を抑制するもので、具体的には、陰イオンとしては、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化物イオン、酢酸イオン等が挙げられ、またその他に尿素等が挙げられる。また、陽イオンとしては、バリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオン、グアニジンイオン等が挙げられる。
【００４５】
上記カオトロピックイオンの中でも、分離精度をより向上させるために、陰イオンとして、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン等を用い、陽イオンとして、バリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、グアニジンイオン等を用いるのがより好ましい。特に好ましくは、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、ヨウ化物イオン、チオシアン酸イオン、過塩素酸イオン、硝酸イオン、グアニジンイオン等が用いられる。
【００４６】
上記カオトロピックイオンの溶離液Ｅ中の濃度は、０．１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ましく、１ｍＭ〜１０００ｍＭがより好ましく、特に好ましくは、１０ｍＭ〜５００ｍＭである。これは、０．１ｍＭより低いと、分離効果が低下し測定精度が悪くなるためであり、３０００ｍＭよりも高くてもヘモグロビン類の分離効果はそれ以上向上しないためである。また、これらカオトロピックイオンは、単独でもまた、複数種混合して用いてもよい。
【００４７】
さらに溶離液Ｅには、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩が含有される。これらの無機物、有機物及びこれらの塩は、上述の本発明１における緩衝液に含まれる緩衝剤と同様のものを用いることができる。
【００４８】
上記緩衝剤の溶離液Ｅ中の濃度は、水に溶解された状態で、溶離液のｐＨを４．０〜６．８にする緩衝作用がある範囲であればよく、好ましくは１ｍＭ〜１０００ｍＭであり、より好ましくは１０〜５００ｍＭである。
【００４９】
溶離液ＥのｐＨは、４．０〜６．８であるが、より好ましくは、４．５〜５．８とする。ｐＨが４．０未満では、ヘモグロビンが変性する可能性があり、ｐＨが６．８を超えると、ヘモグロビン類のプラス電荷が減少し、カチオン交換基に保持されにくくなり、分離能が悪くなるためである。
【００５０】
上記溶離液Ｆには、以下に示すような、ｐＨ６．５〜８．０で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩が含有される。
【００５１】
上記無機酸としては、リン酸、ホウ酸が挙げられる。また、有機酸としては、ジカルボン酸、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、イミダゾール類、アミン類、アルコール類などが挙げられる。
【００５２】
上記ジカルボン酸としては、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フタル酸などが挙げられる。ヒドロキシカルボン酸としては、クエン酸などが挙げられる。アミノ酸としては、アスパラギン、ヒスチジン、セリンなどが挙げられる。イミダゾール類としては、５（４）-ヒドロキシイミダゾール、イミダゾール、５（４）-メチルイミダゾール、２，５-ジメチルイミダゾール、２，５（４）−ジメチルイミダゾールなどが挙げられる。アミン類としては、エチレンジアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミンなどが挙げられる。アルコール類としては、２-アミノ-２-メチル-１、３-プロパンジオール、２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオールなどが挙げられる。
【００５３】
その他として、２，４，６-コリジン、Ｎ−エチルモルホリン、モルホリン、４−アミノピリジン、ピロリン酸、４−アミノピリジン、カコジル酸、５，５-ジエチルバルビツール酸、β，β’-ジメチルグルタル酸、グリセロールリン酸などが挙げられる。
【００５４】
また、Ｇｏｏｄの緩衝剤、例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ−ｐｒｏｐａｎｅ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、グリシルグリシン、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳなどを用いることもできる。
【００５５】
上記無機酸または有機酸の塩としては、公知のものでよく、例えばナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。
【００５６】
上記無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩は、単独でもまた、複数混合して用いても良く、さらに、無機酸と有機酸を混合して用いてもよい。
【００５７】
上記緩衝剤の溶離液Ｆ中の濃度は、水に溶解された状態で、溶離液のｐＨを６．５〜８．０にする緩衝作用がある範囲であればよく、好ましくは１ｍＭ〜１０００ｍＭであり、より好ましくは１０〜５００ｍＭである。
【００５８】
溶離液ＦのｐＨは、ｐＨ６．５〜８．０であり、好ましくはｐＨ６．７〜７．８である。ｐＨが６．５未満では、ヘモグロビンＡ２の分離が不十分となり、ｐＨが８．０を超えてもヘモグロビンＡ２の分離が不十分になるためである。
【００５９】
本発明２においては、上記溶離液Ｅ及び溶離液Ｆに加えて、さらに、前記溶離液ＦよりもｐＨが低く、かつ塩濃度が高い溶離液（本明細書においては、「溶離液Ｇ」という）を用い、上記溶離液Ｆの送液後に上記溶離液Ｇを送液することもできる。
【００６０】
溶離液ＧのｐＨは、溶離液ＦのｐＨより０．１〜５．０低いのが好ましく、より好ましくは０．５〜４．０低く、特に好ましくは１．０〜３．０低く設定する。これは、溶離液ＧのｐＨを溶離液ＦのｐＨより０．１以上低く設定しないとヘモグロビンＡ２の分離が悪くなり、溶離液ＧのｐＨが溶離液ＦのｐＨより５．０以上低くなるとヘモグロビンが変性してヘモグロビン類の測定精度が悪くなることがあるためである。
【００６１】
さらに、溶離液Ｇの塩濃度は、溶離液Ｆの塩濃度より高く設定される。ここで、塩濃度の差は、溶離液中の総陽イオン濃度の差で表わされる。溶離液Ｇの塩濃度は、溶離液Ｆの塩濃度より、０．５ｍＭ〜２００ｍＭ高く設定するのが好ましく、より好ましくは、１ｍＭ〜１７５ｍＭ、特に好ましくは５ｍＭ〜１５０ｍＭ高く設定される。これは、溶離液Ｇの塩濃度が溶離液Ｆの塩濃度に比べて０．５ｍＭより低いとヘモグロビンＡ２を十分に溶出できなくなり、溶離液Ｇの塩濃度が溶離液Ｆに比べて、２００ｍＭより高いとヘモグロビンＡ２の分離が悪くなることがあるためである。
【００６２】
溶離液Ｇに含有される緩衝剤としては、上記溶離液Ｅに含有されるｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩を使用することができる。また、溶離液Ｆ・Ｇには、上記溶離液Ｅと同様にカオトロピックイオンを添加するのが好ましい。
【００６３】
本発明２において、溶離液Ｅ、溶離液Ｆ及び溶離液Ｇには、以下に示した、（１）無機塩類、（２）ｐＨ調節剤、（３）水溶性有機溶媒、（４）安定剤、（５）アミン類、（６）界面活性剤等を添加してもよい。
【００６４】
（１）無機塩類、（２）ｐＨ調節剤、（３）水溶性有機溶媒として、上述の本発明１の溶離液に添加されるのと同様のものを用いることができる。
【００６５】
（４）ヘモグロビンの安定剤：例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、グルタチオン等の還元剤・酸化防止剤等が挙げれる。
【００６６】
（５）アミン類：主として、ヘモグロビンの非特異的吸着を少なくするために添加する。該アミン類としては、公知のものが用いられ、好ましくは、分子量２０〜５００の第１級アミン、第２級アミン及び第３級アミンが用いられる。
【００６７】
（６）界面活性剤：ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤等が挙げられる。界面活性剤を用いることにより、溶血を効率よく行うだけでなく、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等で測定を行う場合、溶血試薬の通過する流路等を洗浄する効果がある。上記界面活性剤の中でも、好ましくはノニオン性界面活性剤が使用され、例えば、ポリオキシエチレン類（以下、ポリオキシエチレンをＰＯＥ、エチレンオキシド付加モル数を（ｎ）で表す。）、ＰＯＥ（７）デシルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ドデシルエーテル、ＰＯＥ（１０）トリデシルエーテル、ＰＯＥ（１１）テトラデシルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）セチルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ステアリルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）オレイルエーテル、ＰＯＥ（１７）セチルステアリルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）オクチルフェニルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ノニルフェニルエーテル、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノラウリン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノパルミチン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノステアリン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノオレイン酸ソルビタン等が挙げられる。
これらの界面活性剤は、単独でもまた複数混合して用いてもよい。これらの界面活性剤の添加量は、好ましくは０．０１〜１０重量％である。
【００６８】
以下に、本発明１及び本発明２（以下、「本発明」という）に共通する発明の構成について説明する。
【００６９】
上記本発明においては、主としてカラム洗浄を目的として、ｐＨが６．８〜１２の溶離液（本明細書においては、「溶離液Ｈ」という）を送液するのが好ましい。溶離液ＨのｐＨを６．８以上とするのは、これより低いとカラムを通過する際のｐＨがヘモグロビンの等電点に到達せず、カラムを効果的に洗浄することができないためであり、ｐＨを１２以下とするのは、これよりｐＨが高いと充填剤の分解が起こる可能性があるためである。溶離液ＨのｐＨは、７．５〜１１であるのがより好ましく、８．０〜９．５が特に好ましい。但し、充填剤の分解が測定に影響ない場合は、溶離液ＨのｐＨを１２以上にすることも可能である
【００７０】
溶離液Ｈとしては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸などの無機酸又は、その塩；クエン酸などのヒドロキシカルボン酸、β、β−ジメチルグルタル酸などのカルボン酸誘導体、マレイン酸などのジカルボン酸、カコジル酸、などの有機酸又は、その塩が含有される緩衝液が用いられる。その他、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｔｒｉｓ等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものも使用できる。また、イミダゾール等のイミダゾール類；ジエタノールアミン、トリエタノールアミンなどのアミン類；グリシンなどのアミノ酸類；などの有機物も使用できる。また、これらの無機酸、有機酸及びこれらの塩は、複数混合して用いても良く、また、無機酸と有機酸を混合して用いても良い。
【００７１】
上記溶離液Ｈ中の無機酸、有機酸及びこれらの塩の濃度は、水に溶解された状態で溶離液のｐＨを６．８以上にする緩衝作用がある範囲であればよく、好ましくは、１ｍＭ〜１０００ｍＭであり、より好ましくは１０〜５００ｍＭである。
【００７２】
また、より効果的にカラム洗浄を行うためには、上記溶離液Ｈに、カオトロピックイオンを添加することが好ましい。このカオトロピックイオンは、前述したのと同様のものを用いることができる。カオトロピックイオンの溶離液Ｈ中の濃度は、１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ましく、１０ｍＭ〜１０００ｍＭがより好ましく、特に好ましくは、５０ｍＭ〜５００ｍＭである。
【００７３】
上記溶離液Ｈには、前述した溶離液Ｅ、溶離液Ｆ及び溶離液Ｇに添加される各種添加剤、例えば、（１）無機塩類、（２）ｐＨ調節剤、（３）水溶性有機溶媒、（４）安定剤、（５）アミン類、（６）界面活性剤等の物質を添加してもよい。
【００７４】
本発明１において、溶離液Ｈを用いる場合には、溶離液Ａ・溶離液Ｂ・溶離液Ｈ、溶離液Ａ・溶離液Ｂ・溶離液Ｄ・溶離液Ｈ、あるいは溶離液Ａ・溶離液Ｂ・溶離液Ｃ・溶離液Ｄ・溶離液Ｈの順に送液する。また、本発明２において、溶離液Ｈを用いる場合には、溶離液Ｅ・溶離液Ｆ・溶離液Ｈあるいは溶離液Ｅ・溶離液Ｆ・溶離液Ｇ・溶離液Ｈの順に送液する。
【００７５】
また、本発明においては、上記溶離液Ａ〜Ｈの少なくとも一種の溶離液にアジ化物イオンを添加するのがより好ましい。また、溶血液にアジ化物イオンを添加することもできる。アジ化物イオンは、溶離液または溶血液の少なくとも一方に含有されていれば良く、また両方に含有されていても良い。このアジ化物イオンの添加に際しては、水溶液中で解離してアジ化物イオンを生成する塩を用いれば良く、例えば、公知のアジ化物塩等が用いられ、好ましくは、アジ化ナトリウム、アジ化バリウム等が用いられる。
【００７６】
また、上記アジ化物イオンの溶離液あるいは溶血液中の濃度は、０．００１〜０．５重量％であることが好ましく、より好ましくは、０．００５〜０．４重量％である。上記濃度が、０．００１重量％より少ないと、分離能向上の効果がなく、また０．５重量％より多くても分離能は向上しないためである。
【００７７】
本発明におけるカチオン交換液体クロマトグラフィーに用いられる充填剤は、少なくとも１種以上のカチオン交換基を有している粒子よりなるものであり、例えば、高分子粒子にカチオン交換基を導入することで得られる。
【００７８】
該カチオン交換基は、公知のものでよく特に制限はない。例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基などのカチオン交換基が挙げられる。また、このカチオン交換基は、複数種導入しても良い。
【００７９】
より好ましい充填剤としては、少なくとも一種の強カチオン交換基を有する充填剤を用いる。強カチオン交換基とは、上記カチオン交換基のなかでもスルホン酸基等を用いたものであり、 ｐＨ２〜３程度の溶離液中においてもイオン交換作用を発揮することができる。この少なくとも一種の強カチオン交換基を有する充填剤を用いることにより、溶離液のｐＨを低くすることが可能となり、ｐＨを低くすることでＨｂ類のプラス電荷が強くなってカラムに保持され易くなり、結果として分離能を高めることができる。
【００８０】
上記粒子の直径は、好ましくは０．１〜２０μｍ、より好ましくは０．２〜８μｍである。また、粒度分布は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準偏差÷平均直径×１００（％））として、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下である。
【００８１】
上記高分子粒子としては、例えば、シリカ、ジルコニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリアミノ酸、キトサンなどの天然高分子粒子；ポリスチレン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子などが挙げられる。
【００８２】
上記高分子粒子は、導入されるイオン交換基以外の構成成分は、より親水性であることが好ましい。また耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが好ましい。
【００８３】
上記高分子粒子へのカチオン交換基の導入は、公知の方法により行うことができるが、例えば、高分子粒子を調製後、粒子が有する官能基（水酸基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基など）に、化学反応でカチオン交換基を粒子に導入させる方法により行うことができる。
【００８４】
また、カチオン交換基を有する単量体を重合して高分子粒子を調製する方法によってもカチオン交換充填剤を調製できる。例えば、カチオン交換基含有単量体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下に重合する方法などが挙げられる。
【００８５】
また、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチルなどの重合性カチオン交換基含有エステルを架橋性単量体などと混合し、重合開始剤存在下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エステルをカチオン交換基に変換させてもよい。
【００８６】
更に、特公平８−７１９７号公報に記載のように、架橋重合体粒子を調製した後、カチオン交換基を有する単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、該単量体を重合させても良い。
【００８７】
上記充填剤はカラムに充填されて液体クロマトグラフィー測定に用いられる。カラムのサイズは、内径０．１〜５０ｍｍ、長さ１〜３００ｍｍのものが好ましく、内径０．２〜３０ｍｍ、長さ５〜２００ｍｍのものがより好ましい。カラムサイズは、内径０．１ｍｍ、長さ１ｍｍより小さくなると作業性が悪く分離能も悪くなる。また、内径５０ｍｍ、長さ３００ｍｍより大きくなると使用する充填剤量が多くなるだけでなく、分離能も悪くなる。
【００８８】
充填剤のカラムへの充填方法は、公知の任意の方法が使用できるがスラリー充填法がより好ましい。具体的には、例えば、充填剤粒子を溶離液などの緩衝液に分散させたスラリーを送液ポンプなどによりカラムに圧入することにより行う。
【００８９】
上記カラムの素材としては、公知のステンレス等の金属、ガラス、ＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）等の樹脂などが用いられる。また、カラム内表面のように充填剤が接触する部分については、不活性な素材で被覆することが好ましく、このような素材としては、例えば、ＰＥＥＫ、ポリエチレン、テフロン、チタン化合物、珪素化合物、シリコン膜等が挙げられる。
【００９０】
また、カラムのフィルターあるいはプレフィルターを用いることもできるが、この場合は、少なくとも表面が不活性な素材のフィルターを用いるのが好ましい。この不活性な素材としては、セルロースエステル、セルロースアセテート、セルローストリアセテート、セルロース、セルロースナイトレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフロライド、ポリスルフォン、ポリエチレン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン、ガラス素材、アクリル共重合体、酸化物セラミック、炭化物セラミック、窒化物セラミック、珪化物セラミック、硼化物セラミック、チタン等が挙げられ、適宜これらの素材を複数種組み合わせて用いることもできる。また、ステンレスなどの不活性でない素材を用いた場合は、上記の不活性な素材で被覆する方法、シリコーン処理などの不活性処理をする方法、牛血清アルブミン、ゼラチン、カゼイン、グロブリン、ヘモグロビンなどのブロッキング試薬でブロッキングする方法などを適宜使用できる。
【００９１】
本発明の分離方法に使用される液体クロマトグラフィーは、公知のものでよく、例えば、送液ポンプ、試料注入装置（サンプラ）、カラム、検出器などから構成される。また、他の付属装置（カラム恒温槽や溶離液の脱気装置など）が適宜付属されてもよい。
【００９２】
また、本発明においては、上記液体クロマトグラフィーとして、セミミクロ対応装置、すなわち、装置の接液部であるポンプ、ミキシングカラム、サンプラ、配管、プレフィルター（ホルダー、フィルター）、カラム及び検出器（セル）などのデッドボリュームを可及的に小さくした装置を用いることもできる。この場合、例えば、ミキシングカラム容量は５００μｌ以下が好ましく、２５０μｌ以下が特に好ましい。また、サンプラのインジェクションバルブ容量は１０μｌ以下が好ましく、５μｌ以下がより好ましく、２μｌ以下が特に好ましい。また、配管は、内径０．２５ｍｍ以下が好ましく、０．１３ｍｍ以下がより好ましく、０．０６５ｍｍ以下が特に好ましい。また、サンプラ、プレフィルター、カラム、検出器などを配管で連結する場合、配管の長さは、可及的に短い方が好ましい。また、検出器（セル）の容量は、２０μｌ以下が好ましく、１０μｌ以下がより好ましく、５μｌ以下が特に好ましい。送液ポンプは、脈流が極めて少ない安定した送液が可能なものが好ましい。上記装置の中でも短時間でより精度の良い分離を行うためには、例えば、装置の接液部に、テフロン、ＰＥＥＫ等の不活性な素材を用い、さらに装置内のデッドボリュームを極めて小さくする。
【００９３】
段階溶出法によって分離を行う場合の液体クロマトグラフィーの構成例を図１に示した。溶離液ａ、ｂ、ｃ、ｄは、各々溶出力の異なる溶離液であり、電磁弁１によって設定時間ごとに各溶離液に切り替えられるように、構成されている。溶離液は、送液ポンプ２により、試料注入部３から導入された試料とともにカラム４に導かれ、各成分が検出器５により検出される。各ピーク面積、高さ等はインテグレータ６により算出される。
【００９４】
本発明の分離方法における、他の条件としては、公知の条件でよく、溶離液の流速は、好ましくは０．０５〜５ｍｌ／分、より好ましくは０．２〜３ｍｌ／分である。また、上記セミミクロ対応装置を用いた場合、溶離液の流速は、好ましくは０．００１〜３ｍｌ／分、より好ましくは０．０１〜１．８ｍｌ／分、更に好ましくは、０．０３〜１ｍｌ／分である。０．００１ｍｌ／分より遅いと流速が安定せず、３ｍｌ／分より早いと分離精度が低下する。
【００９５】
また、本発明の分離方法において溶離液の送液方法としては、特に限定されるものではないが、例えば勾配溶出法（グラディエント溶出法）、段階溶出法（ステップワイズ溶出法）で送液する方法が挙げられる。
【００９６】
ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎｍの可視光が好ましいが、特にこれのみに限定されるわけではない。
【００９７】
なお、本発明方法で分離される対象となるヘモグロビン混合物は、通常、界面活性剤など溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いる。液体クロマトグラフィーへの注入量は、希釈倍率により異なるが、好ましくは０．１〜１００μｌ程度である。
【００９８】
【実施例】
次に、実施例、比較例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００９９】
［実施例１］
（充填剤の調製）
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４５０ｇ及び２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（和光純薬社製）５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）２ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍｌに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に昇温し、１．５時間重合した。次いで、反応系を３５℃に冷却した後、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東京化成社製）の５０％水溶液４００ｇ、メタノール４００ｍｌを添加し１時間攪拌しながら再び８０℃に昇温し１．３時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６．５μｍの粒子を得た。
【０１００】
（カラムへの充填）
得られた充填剤をカラムに以下のようにして充填した。粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
【０１０１】
得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビンＡ２の分離、測定を行った。
（測定条件）
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ａ：１７０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液Ｂ：１３０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
溶離液Ｈ：３００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
測定開始より０〜１分の間は溶離液Ａを流し、１〜２分の間は溶離液Ｂを流し、２〜２．２分の間は溶離液Ｈを流し、２．２〜３分の間は溶離液Ａを流した。
流速：１．０ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【０１０２】
（測定試料１）
健常人血を採血し、抗血液凝固剤としてフッ化ナトリウム１０ｍｇ／ｍｌを添加した。これに、１５０倍量の溶血液（０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００、東京化成社製）と２０ｍＭリン酸緩衝溶液からなる溶血液（ｐＨ７．０））を添加して溶血し、測定試料とした。
（測定試料２）
ライホチェックＨｂＡ２コントロール・レベル２（バイオラッド社製）を１ｍＬの水に溶解させ、１００倍量で希釈し、測定試料とした。
【０１０３】
（測定結果）
上記測定条件により、試料１を測定して得られたクロマトグラムを図２に示す。ピーク１１はＨｂＡ１ａ及びｂ、ピーク１２はＨｂＦ、ピーク１３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１５はＨｂＡ０、ピーク１６はＨｂＡ２、ピーク１７はその他のＨｂを示す。その結果、ＨｂＡ２（ピーク１６）が良好に、分離されていることがわかる。
また、上記試料１及び２を１０回繰り返し測定したときの、Ａ２ピーク面積（％）の測定精度（ＳＤ；標準偏差、ＣＶ値（％）；変動係数値）を求めた結果を表１に示す。その結果、試料１及び２とも精度良く測定できることがわかる。
さらに、上記試料１について３０００検体を連続測定した時のＨｂＡ２の保持時間を５００検体ごとに表２に示す。その結果、保持時間の変化率が小さいことがわかる。
変化率＝（１回目測定のＡ２保持時間−３０００回目測定のＡ２保持時間）
／１回目測定のＡ２保持時間）×１００
【０１０４】
【表１】
【表２】
［実施例２］
溶離液及び溶出条件を下記のようにした以外は、実施例１と同様の条件でヘモグロビンＡ２の分離、測定を行った。
溶離液：溶離液Ａ：１７０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液Ｂ：１３０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
溶離液Ｃ：１７０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液Ｄ：１３０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）
溶離液Ｈ：３００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
測定開始より０〜１分の間は溶離液Ａを流し、１〜１．４分の間は溶離液Ｂを流し、１．４〜１．６分の間は溶離液Ｃを流し、１．６〜２分の間は溶離液Ｄを流し、２〜２．２分の間は溶離液Ｈを流し、２．２〜３分の間は溶離液Ａを流した。
上記測定条件により、試料１を測定して得られたクロマトグラムを図３に示す。その結果ＨｂＡ２（ピーク１６）が良好に分離されていることがわかる。また、測定精度を表１に、保持時間の変化率を表２に示す。結果、測定精度、保持時間の変化率とも小さく良好に測定できていることがわかる。
【０１０７】
［比較例１］
溶離液及び溶出条件を下記のようにした以外は、実施例１と同様の条件でヘモグロビン類の測定を行った。
溶離液：溶離液１：１７０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液２：３００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
測定開始より０〜１４．５分の間は溶離液１を流し、１４．５〜１５．２分の間は溶離液２を流し、１５．２〜１６分の間は溶離液１を流した。
上記測定条件により、試料１を測定して得られたクロマトグラムを図４に示す。その結果、測定に長時間を要したにもかかわらずＨｂＡ２（ピーク１６）は良好に分離されなかった。また、測定精度を表１に保持時間の変化率を表２に示す。結果、測定精度、保持時間の変化率とも大きくなった。
【０１０８】
［比較例２］
溶離液及び溶出条件を下記のようにした以外は、実施例１と同様の条件でヘモグロビン類の測定を行った。
溶離液：溶離液１：１７０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液２：２５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液３：３００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
測定開始より０〜１分の間は溶離液１を流し、１〜３．５分の間は溶離液２を流し、３．５〜４．２分の間は溶離液３を流し、４．２〜５分の間は溶離液１を流した。
上記測定条件により、試料１を測定して得られたクロマトグラムを図５に示す。その結果、ＨｂＡ２（ピーク１６）は良好に分離されなかった。また、測定精度を表１に保持時間の変化率を表２に示す。結果、測定精度、保持時間の変化率とも大きくなった。
【０１０９】
［実施例３］
溶離液及び溶出条件を下記のようにした以外は、実施例１と同様の条件で試料１の測定を行った。
溶離液：溶離液Ａ１：４５ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ａ２：５５ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｂ：２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）
溶離液Ｄ：１２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液Ｈ：３００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
測定開始より０〜１分の間は溶離液Ａ１を流し、１〜１．５分の間は溶離液Ａ２を流し、１．５〜２．１分の間は溶離液Ｂを流し、２．１〜２．５分の間は溶離液Ｄを流し、２．５〜２．７分の間は溶離液Ｈを流し、２．７〜３．５分の間は溶離液Ａ１を流した。
流速：２．０ｍｌ／分
【０１１０】
得られたクロマトグラムを図６に示す。その結果ＨｂＡ２（ピーク１６）と共に安定型ＨｂＡ１ｃ（ピーク１４）も良好に分離されていることがわかる。
【０１１１】
［実施例４］
溶離液及び溶出条件を下記のようにした以外は、実施例１と同様の条件で下記試料３の測定を行った。
（測定試料３）
ＡＦＳＣコントロール（ヘレナ社製）を６７倍量の溶血試薬で希釈したものを用いた。
（測定条件）
溶離液：溶離液Ａ１：４５ｍＭの過塩素酸、０．０３重量％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ａ２：５５ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｂ：２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）
溶離液Ｄ１：１２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液Ｄ２：１５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液Ｈ：３００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
測定開始より０〜１分の間は溶離液Ａ１を流し、１〜１．５分の間は溶離液Ａ２を流し、１．５〜２．１分の間は溶離液Ｂを流し、２．１〜２．５分の間は溶離液Ｄ１を流し、２．５〜３．０分の間は溶離液Ｄ２を流し、３．０〜３．２分の間は溶離液Ｈを流し、３．２〜４．０分の間は溶離液Ａ１を流した。
流速：２．０ｍｌ／分
【０１１２】
得られたクロマトグラムを図７に示す。その結果ＨｂＡ２（ピーク１６）と共に、ＨｂＳ・ＨｂＣ（ピーク１８・ピーク１９）も良好に分離されていることがわかる。
【０１１３】
［比較例３］
溶離液及び溶出条件を下記のようにした以外は、実施例４と同様の条件で試料３の測定を行った。
溶離液：溶離液１：４５ｍＭの過塩素酸、０．０３重量％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液２：５５ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液３：２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）
溶離液４：３５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）
溶離液５：４０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）
溶離液６：３００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
測定開始より０〜１分の間は溶離液１を流し、１〜１．５分の間は溶離液２を流し、１．５〜２．１分の間は溶離液３を流し、２．１〜２．５分の間は溶離液４を流し、２．５〜３．０分の間は溶離液５を流し、３．０〜３．２分の間は溶離液６を流し、３．２〜４．０分の間は溶離液１を流した。
得られたクロマトグラムを図８に示す。その結果、ＨｂＡ２（ピーク１６）、ＨｂＳ（ピーク１８）及びＨｂＣ（ピーク１９）間の分離が悪いことがわかる。
【０１１４】
［実施例５］
（充填剤の調製）
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４５０ｇ及び２−ヒドロキシ−１，３ジメタクリロキシプロパン（和光純薬社製）５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）２ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍｌに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に昇温し、１．５時間重合した。次いで、反応系を３５℃に冷却した後、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東京化成社製）の５０％水溶液４００ｇ、メタノール４００ｍｌを添加し１時間攪拌しながら再び８０℃に昇温し１．３時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６．５μｍの粒子を得た。
【０１１５】
（カラムの充填）
得られた充填剤をカラムに以下のようにして充填した。粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（内径４．６×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
【０１１６】
得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビンＡ２の分離、測定を行った。
（測定条件）
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ｅ：４５ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｆ：２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．５）
溶離液Ｈ：２００ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
測定開始より０〜１．７分の間は溶離液Ｅを流し、１．７〜３．５分の間は溶離液Ｆを流し、３．５〜３．６分の間は溶離液Ｈを流し、３．６〜４．０分の間は溶離液Ｅを流した。
流速：２．０ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【０１１７】
（測定試料４）
健常人血を採血し、抗血液凝固剤としてフッ化ナトリウムを１０ｍｇ／ｍｌとなるよう添加した。これに、１５０倍量の溶血液（界面活性剤として０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００、東京化成社製）を含むリン酸緩衝溶液（ｐＨ７））を添加して溶血し、測定試料４とした。
（測定試料５：ＣＨｂ含有試料）
健常人血１０ｍｌに、０．３重量％のシアン酸ナトリウムの生理食塩水１ｍｌを添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血液により溶血し、１５０倍に希釈して、測定試料５とした。
（測定試料６：ＡＨｂ含有試料）
健常人血１０ｍｌに、０．３重量％のアセトアルデヒドの生理食塩水１ｍｌを添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血液により溶血し、１５０倍に希釈して、測定試料６とした。
【０１１８】
（測定結果）
上記測定条件により、試料４、５及び６を測定して得られたクロマトグラムを図９〜１１に示した。図９は測定試料４、図１０は測定試料５、図１１は測定試料６を測定した結果である。ピーク１１はＨｂＡ１ａ及びｂ、ピーク１２はＨｂＦ、ピーク１３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１５はＨｂＡ０、ピーク１６はＨｂＡ２、ピーク２０はＣＨｂ、ピーク２１はＡＨｂを示す。図９より、安定型ＨｂＡ１ｃ（ピーク１４）及びＨｂＡ２（ピーク１６）が良好に分離できたことが分かる。図１０ではＣＨｂ（ピーク２０）、図１１ではＡＨｂ（ピーク２１）が安定型ＨｂＡ１ｃ（ピーク１４）から良好に分離されており、また、ＨｂＡ２（ピーク１６）も良好に分離されている。
【０１１９】
［実施例６］
溶離液を以下の組成としたこと以外は、実施例５と同様の条件でヘモグロビン類の測定を行った。
溶離液：溶離液Ｅ：５０ｍＭの過塩素酸を含有する２５ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｆ：２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．５）
溶離液Ｈ：２５０ｍＭの過塩素酸を含有する２０ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４）
測定試料は、実施例５と同じ測定試料４、５及び６を用いた。その結果、実施例５と同様に良好な結果が得られた。
【０１２０】
［実施例７］
溶離液Ｆの組成を以下のようにした以外は、実施例６と同様にして測定試料４、５及び６を測定した。
溶離液Ｆ：４０ｍＭ Ｂｉｓｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．８）
【０１２１】
［実施例８］
溶離液Ｆの組成を以下のようにした以外は、実施例６と同様にして測定試料４、５及び６を測定した。
溶離液Ｆ：４０ｍＭ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）
【０１２２】
［実施例９］
溶離液Ｆの組成を以下のようにした以外は、実施例６と同様にして測定試料４、５及び６を測定した。
溶離液Ｆ：１５ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．１）
【０１２３】
［実施例１０］
溶離液Ｆの組成を以下のようにした以外は、実施例６と同様にして測定試料４、５及び６を測定した。
溶離液Ｆ：４０ｍＭ Ｂｃｉｎｅ緩衝液（ｐＨ７．６）
【０１２４】
［実施例１１］
溶離液Ｆの組成を以下のようにした以外は、実施例６と同様にして測定試料４、５及び６を測定した。
溶離液Ｆ：４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）
【０１２５】
［実施例１２］
溶離液Ｆの組成を以下のようにした以外は、実施例６と同様にして測定試料４、５及び６を測定した。
溶離液Ｆ：４０ｍＭ ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）
【０１２６】
［実施例１３］
溶離液Ｆの組成を以下のようにした以外は、実施例６と同様にして測定試料４、５及び６を測定した。
溶離液Ｆ：２０ｍＭ マレイン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
【０１２７】
（実施例７〜１３の測定結果）
実施例７〜１３では、実施例５と同様に良好な結果が得られた。
【０１２８】
［実施例１４］
（セミミクロ対応装置）
以下の測定装置、測定条件を用いた以外は、実施例６と同様に測定を行った。
測定装置：送液ポンプ：イナートポンプ２００１，ＮＡＮＯＳＰＡＣＥ ＳＩ−１（資生堂社製）
オートサンプラ：オートサンプラー２００３（資生堂社製）
検出器：ＵＶ−ＶＩＳ検出器２００２（資生堂社製）
カラム：ステンレス製カラム本体（内径１．５ｍｍ×長さ４０ｍｍ）に実施例５と同じ充填剤を同様の方法で充填してカラムを作成した。
溶離液：溶離液Ｅ：４６ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｆ：２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．５）
溶離液Ｈ：２００ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
測定開始より０〜１．７分の間は溶離液Ｅを流し、１．７〜３．５分の間は溶離液Ｆを流し、３．５〜３．６分の間は溶離液Ｈを流し、３．６〜４．０分の間は溶離液Ｅを流した。
流速：０．２ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：３μｌ
【０１２９】
（測定結果）
実施例１４で得られた結果を図１２〜１４に示した。図１２は測定試料４、図１３は測定試料５、図１４は測定試料６を測定した結果である。実施例５と同様に安定型ＨｂＡ１ｃ（ピーク１４）がＣＨｂ（ピーク２０）及びＡＨｂ（ピーク２１）などの修飾Ｈｂから良好に分離され、しかも、ＨｂＡ２（ピーク１６）も良好に分離された。
【０１３０】
［比較例４］
以下に示す溶離液２を、実施例６における溶離液Ｆの代わりに用いたこと以外は、実施例６と同様にして測定試料４を測定した。
溶離液２：２０ｍＭ リンゴ酸緩衝液（ｐＨ５．７）
（測定結果）
図１５に示したように、比較例４では、安定型ＨｂＡ１ｃ（ピーク１４）は分離できたが、ＨｂＡ２（ピーク１６）の分離が不十分であった。
【０１３１】
（ＨｂＦ、安定型ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ２の測定精度評価）
上記実施例５〜１０及び比較例４における測定試料４の測定結果を表３及び表４に示した。
【０１３２】
【表３】
【表４】
その結果、実施例５〜１０では、ＨｂＡ２の測定精度（ＣＶ値）が非常に高いと同時に、ＨｂＦ及び安定型ＨｂＡ１ｃの測定精度も良かった。また、ＨｂＡ２値は、いずれも２．３％と非常に測定精度が良かった。一方、比較例４では、ＨｂＡ２の定精度が非常に悪かった。
【０１３５】
［実施例１５］
溶離液を以下の組成としたこと以外は、実施例５と同様の条件で下記測定試料７・８について、ヘモグロビンＡ２の分離を行った。
溶離液：溶離液Ｅ：５０ｍＭの過塩素酸、０．０３重量％アジ化ナトリウムを含有する２５ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｆ：０．０３重量％アジ化ナトリウムを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）
溶離液Ｇ：０．０３重量％アジ化ナトリウムを含有する９０ｍＭの過塩素酸を含有する５ｍＭコハク酸−１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｈ：２５０ｍＭの過塩素酸を含有する２０ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４）
測定開始より０〜１．７分の間は溶離液Ｅを流し、１．７〜３．０分の間は溶離液Ｆを流し、３．０〜３．５分の間は溶離液Ｇを流し、３．５〜３．６分の間は溶離液Ｈを流し、３．６〜４．０分の間は溶離液Ｅを流した。
流速：２．０ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【０１３６】
（測定試料７）
Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ａ２ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｌｅｖｅｌ２（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を添付文書に従って、水１ｍｌで溶解し、更に、これを、６０倍量の溶血液（界面活性剤として０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００、東京化成社製）を含有するリン酸緩衝溶液（ｐＨ７））を添加希釈して、測定試料７とした。
【０１３７】
（測定試料８）
Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ＡＦＳＣ ＨＥＭＯ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を、６０倍量の溶血液（界面活性剤として０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００、東京化成社製）を含有するリン酸緩衝溶液（ｐＨ７））を添加希釈して、測定試料８とした。
【０１３８】
（測定結果）
実施例１５で得られたクロマトグラムを図１６・１７に示した。測定試料７の結果を図１６に、測定試料８の結果を図１７に示した。図１６・１７から明らかのようにＨｂＦ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣを良好に分離出来た。また、表５に示すように、測定精度も良好であった。
【０１３９】
【表５】
［実施例１６］
実施例１５における溶離液Ｅを以下の組成としたこと以外は、実施例１５と同様の条件でヘモグロビン類の測定を行った。
溶離液Ｅ：５０ｍＭの過塩素酸を含有する２５ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
【０１４１】
（測定結果）
実施例１６で得られたクロマトグラムを図１８・１９に示した。測定試料７の結果を図１８に、測定試料８の結果を図１９に示した。図１８・１９から、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣは良好に分離出来るが、ＨｂＦについては分離が悪いことが分かる。
【０１４２】
【発明の効果】
本発明は以上の構成からなるので、Ｈｂ混合物からＨｂＡ２分離するに際し、従来法よりも精度良く、かつ短時間に分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】液体クロマトグラフィー装置の構成の一例を示した図。
【図２】実施例１の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料１）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図３】実施例２の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料１）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図４】比較例１の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料１）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図５】比較例２の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料１）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図６】実施例３の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料１）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図７】実施例４の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料３）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図８】比較例３の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料３）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図９】実施例５の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料４）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１０】実施例５の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料５）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１１】実施例５の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料６）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１２】実施例１４の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料４）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１３】実施例１４の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料５）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１４】実施例１４の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料６）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１５】比較例４の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料４）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１６】実施例１５の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料７）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１７】実施例１５の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料８）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１８】実施例１６の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料７）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１９】実施例１６の測定条件により、ヘモグロビンＡ２の分離（試料８）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【符号の説明】
ａ，ｂ，ｃ，ｄ 溶離液群
１ 電磁弁
２ 送液ポンプ
３ 試料注入部
４ カラム
５ 検出器
６ インテグレータ
１１ ＨｂＡ１ａ及びｂのピーク
１２ ＨｂＦのピーク
１３ 不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
１４ 安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
１５ ＨｂＡ０のピーク
１６ ＨｂＡ２のピーク
１７ その他のＨｂのピーク
１８ ＨｂＳのピーク
１９ ＨｂＣのピーク
２０ ＣＨｂのピーク
２１ ＡＨｂのピーク
Claims (11)
- カチオン交換液体クロマトグラフィーによる、ヘモグロビン混合物からのヘモグロビンＡ２の分離方法において、
ヘモグロビンＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類を溶出させるための溶離液（以下「溶離液Ａ」という）と、ヘモグロビンＡ０の保持時間以上の保持時間を有するヘモグロビン類を溶出させるための溶離液（以下「溶離液Ｂ」という）の少なくとも２種の溶離液を用い、
前記溶離液ＡのｐＨが４．０〜６．０であって、前記溶離液ＢのｐＨが、前記溶離液ＡのｐＨより０．５以上高いことを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法。 - 請求項１記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、
前記溶離液Ｂの塩濃度が、前記溶離液Ａの塩濃度より低いことを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法。 - 請求項１または２記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、
さらに、少なくともヘモグロビンＡ２を溶出させるための溶離液（以下「溶離液Ｄ」という）を用い、
前記溶離液ＤのｐＨが、前記溶離液ＢのｐＨより０．５以上低いことを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法。 - 請求項３記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、
前記溶離液Ｂの塩濃度が、前記溶離液Ａの塩濃度より低く、前記溶離液Ｄの塩濃度が、前記溶離液Ｂの塩濃度より高いことを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法。 - 請求項３または４記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、
さらに、前記溶離液Ｂ及び溶離液Ｄよりも溶出力の弱い溶離液（以下「溶離液Ｃ」という）を用い、
前記溶離液Ｂを送液した後に、前記溶離液Ｃを送液し、その後前記溶離液Ｄを送液することを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法。 - カチオン交換液体クロマトグラフィーによる、ヘモグロビン混合物からのヘモグロビンＡ２の分離方法において、
カオトロピックイオンが含有され、かつｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩が含有される溶離液（以下「溶離液Ｅ」という）と、ｐＨ６．５〜８．０で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩が含有される溶離液（以下「溶離液Ｆ」という）の少なくとも２種の溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法。 - 請求項６記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、
さらに、前記溶離液ＦよりもｐＨが低く、かつ塩濃度が高い溶離液（以下「溶離液Ｇ」という）を用い、
前記溶離液Ｆの送液後に前記溶離液Ｇを送液することを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法。 - 請求項１〜７のいずれか一項に記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、
前記溶離液Ｂ、溶離液Ｄ、溶離液Ｆまたは溶離液Ｇの送液後に、 ｐＨが６．８〜１２の溶離液（以下「溶離液Ｈ」という）を送液することを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法。 - 請求項８記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、
前記溶離液Ｈにカオトロピックイオンが含有されることを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法。 - 請求項１〜９のいずれか一項に記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、
前記溶離液Ａ〜Ｈのうち少なくとも一種の溶離液、及び／または、溶血液に、アジ化物イオンが含有されることを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法。 - 請求項１〜１０のいずれか一項に記載のヘモグロビンＡ２の分離方法であって、
充填剤として、少なくとも一種の強カチオン交換基を有する充填剤を用いることを特徴とするヘモグロビンＡ２の分離方法。
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Cited By (1)
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