JP2000111539A - ヘモグロビン類の測定方法 - Google Patents
ヘモグロビン類の測定方法Info
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Abstract
類の測定方法を提供する。 【解決手段】 陽イオン交換液体クロマトグラフィーに
よるヘモグロビン類の測定方法において、カオトロピッ
クイオンを含有し、かつpH4.0〜6.8で緩衝能を
持つ無機酸、有機酸及び/またはこれらの塩を含む溶離
液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方
法。
Description
測定方法に関し、より詳細には安定型ヘモグロビンA1
cの測定を目的とした、陽イオン交換液体クロマトグラ
フィーによるヘモグロビン類の測定方法に関する。
と略す)は、すべてのヘモグロビンに対するその構成比
率が、過去1〜2カ月間の平均的な血糖値(血液中のグ
ルコース濃度)を反映しているため、糖尿病のスクリー
ニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握する検査
項目として繁用されている。
グロビンA(以下、HbAと略す)とが反応して生成さ
れた糖化ヘモグロビン( 以下、GHbと略す) であり、
可逆的に反応したものを不安定型HbA1c(unstable
HbA1c)と呼び、不安定型HbA1cを経て不可逆的に
反応したものを安定型HbA1c(stable HbA1c)と呼ん
でいる。
ト2つずつから構成される4量体のタンパク質である。
HbAのサブユニットはα鎖とβ鎖であり、このβ鎖の
N末端アミノ酸にグルコースが結合したものがHbA1
cである。過去1〜2カ月間の平均的な血糖値を良く反
映するのは安定型HbA1cであり、臨床検査分野で
は、高精度に安定型HbA1c値(%)を得ることがで
きる測定法の開発が望まれている。
血液検体を溶血希釈して調製した試料中のヘモグロビン
類を、陽イオン交換法により、ヘモグロビン成分毎に異
なるプラス荷電状態の違いを利用して分離する液体クロ
マトグラフィー(以下、LCと略す)が用いられてき
た。(例えば、日本国・特公平8−7198号公報
等)。
けて溶血試料中のヘモグロビン類を分離すると、通常は
ヘモグロビンA1a(以下、HbA1aと略す)及びヘ
モグロビンA1b(以下、HbA1bと略す)、ヘモグ
ロビンF(以下、HbFと略す)、不安定型HbA1
c、安定型HbA1c及びヘモグロビンA0(以下、H
bA0と略す)の順に溶離されてくる。HbA1a、H
bA1b及びHbA1cはHbAが糖化されたGHb、
HbFはα鎖とγ鎖から成る胎児性ヘモグロビン、Hb
A0はHbAを主成分とする一群のヘモグロビン成分で
あって、HbA1cより強くカラムに保持されたもので
ある。
安定型HbA1cを十分に分離することができないばか
りでなく、時にアセチル化ヘモグロビン(以下、AHb
と略す)やカルバミル化ヘモグロビン(以下、CHbと
略す)等の「修飾ヘモグロビン」が安定型HbA1cと
重なって溶離してくるという問題があった。
HbA1c値(%)の測定を目的として、血液検体のヘ
モグロビン類を測定する際、安定型HbA1cの測定値
に影響を与えないように、安定型HbA1cと溶出挙動
が近似している不安定型HbA1cやAHb及びCHb
ピークを、安定型HbA1cピークから分離することが
困難であった。
度に安定型HbA1cを測定するために、上述した従来
技術の欠点を解消し、短時間でしかも分離能に優れたヘ
モグロビン類の測定方法を提供することにある。
下、 本発明1という)は、陽イオン交換液体クロマトグ
ラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、カ
オトロピックイオンを含有し、かつpH4.0〜6.8
で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び/またはこれらの塩
を含む溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビン類
の測定方法である。
う)は、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによるヘ
モグロビン類の測定方法において、カオトロピックイオ
ンを含有し、かつ酸解離定数(pKa)が2.15〜
6.39の範囲及び6.40〜10.50の範囲にある
緩衝剤を含む溶離液を用いることを特徴とするヘモグロ
ビン類の測定方法である。
に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、測定目的
のピークを分離するのに際し、pHの異なる少なくとも
2種以上の溶離液を用い、該pHの異なる少なくとも2
種以上の溶離液が、同一の緩衝剤を含むものであること
を特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
ずれか1項に記載のヘモグロビン類の測定方法であっ
て、HbA0を溶出するために、カラムに流入する際の
pHがヘモグロビンの等電点と等しいか、または等電点
よりアルカリ側になる溶離液を用いることを特徴とする
ヘモグロビン類の測定方法である。
う)は、 陽イオン交換液体クロマトグラフィーによるヘ
モグロビン類の測定方法において、HbA0を溶出する
ために、カラムに流入する際のpHがヘモグロビンの等
電点と等しいか、または等電点よりアルカリ側になる溶
離液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方
法である。
ヘモグロビン類の測定方法であって、前記溶離液がさら
にカオトロピックイオンを含有することを特徴とするヘ
モグロビン類の測定方法である。
ずれか1項に記載のヘモグロビン類の測定方法であっ
て、前記溶離液のpHが6.8以上であることを特徴と
するヘモグロビン類の測定方法である。
ずれか1項に記載のヘモグロビン類の測定方法であっ
て、ヘモグロビンA0よりも前に溶出するヘモグロビン
類の溶出に、pH4.0〜6.8の溶離液を用いること
を特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
ヘモグロビン類の測定方法であって、ヘモグロビンA0
よりも前に溶出するヘモグロビン類の溶出に、少なくと
も溶出力の異なる2種以上の溶離液を用い、 溶出力の弱
い溶離液から順に送液することを特徴とするヘモグロビ
ン類の測定方法である。
いずれか1項に記載のヘモグロビン類の測定方法であっ
て、少なくとも溶出力の異なる3種の溶離液を用い、H
bA0を溶出するための溶離液を送液する前に、該Hb
A0を溶出するための溶離液以外の溶離液を送液するこ
とを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
のいずれか1項に記載のヘモグロビン類の測定方法であ
って、溶離液を勾配溶出法または段階溶出法によって送
液し、その途中において溶離液の溶出力を低下させるこ
とを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
1で用いられる溶離液は、カオトロピックイオンを含有
し、かつ、pH4.0〜6.8で緩衝能を持つ無機酸、
有機酸及び/またはこれらの塩を含む。
水溶液に溶解したときに解離により生じたイオンであ
り、水の構造を破壊し、疎水性物質と水が接触したとき
に起こる水のエントロピー減少を抑制するものである。
は、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チ
オシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、
ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化
物イオン、酢酸イオン等が挙げられる。また、陽イオン
のカオトロピックイオンとしては、バリウムイオン、カ
ルシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カ
リウムイオン、マグネシウムイオン、グアニジンイオン
等が挙げられる。
オンとして、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イ
オン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸
イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオ
ン等を、陽イオンとして、バリウムイオン、カルシウム
イオン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、セシウ
ムイオン、グアニジンイオン等を用いるのが好ましい。
さらに、より好ましくは、チオシアン酸イオン、過塩素
酸イオン、硝酸イオン、グアニジンイオン等が用いられ
る。
度が、0.1mMより低いとヘモグロビン類の測定にお
いて、分離効果が低下するおそれがあり、また、300
0mMよりも高いと、ヘモグロビン類の分離効果はそれ
以上向上しないので、0.1mM〜3000mMが好ま
しく、1mM〜1000mMがより好ましく、更に、1
0mM〜500mMが好ましい。
して用いても良い。上記カオトロピックイオンは、測定
試料と接触する液、例えば、溶血試薬、試料希釈液等に
添加しても良い。
能を有する物質として、無機酸、有機酸またはこれらの
塩が含まれる。上記無機酸としては、例えば、炭酸、リ
ン酸等が挙げられる。上記有機酸としては、例えば、カ
ルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキ
シカルボン酸、アミノ酸、カコジル酸、ピロリン酸等が
挙げられる。
プロピオン酸等が挙げられる。上記ジカルボン酸として
は、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピ
ン酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸等が挙げられ
る。上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β、β−
ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、アミノ酪酸等が
挙げられる。上記ヒドロキシカルボン酸としては、例え
ば、クエン酸、酒石酸、乳酸等が挙げられる。上記アミ
ノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン
等が挙げられる。
知のもので良く、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等
が挙げられる。
複数種混合して用いても良く、無機酸と有機酸を混合し
て用いても良い。
塩の溶離液中の濃度、複数種用いる場合には複数種の合
計の濃度は、溶離液のpHを4.0〜6.8にする緩衝
作用があれば良く、1〜1000mMが好ましく、10
〜500mMが特に好ましい。
は、4.0〜6.8に限定され、好ましくは4.5〜
5.8である。溶離液のpHが4未満であると、ヘモグ
ロビン類が変性する可能性があり、pHが6.8を超え
ると、ヘモグロビン類のプラス荷電が減少し、陽イオン
交換基に保持されにくくなり、ヘモグロビン類の分離が
悪くなる。
良い。
リウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリ
ウム等)を添加しても良い。これらの塩類の濃度は、特
に限定されないが、好ましくは1〜1500mMであ
る。
を加えても良い。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、
硝酸、硫酸等が、塩基としては、水酸化ナトリウム、水
酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、
水酸化バリウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。こ
れらの酸、塩基の濃度は、特に限定されないが、好まし
くは、0.001〜500mMである。
トリル、アセトン等の水溶性有機溶媒を混合しても良
い。これらの有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、
好ましくは0〜80%(v/v)であり、カオトロピッ
クイオン、無機酸、有機酸、これらの塩等が析出しない
程度で用いるのが好ましい。
腐剤を添加しても良い。
の安定剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDT
A)等のキレート剤、グルタチオン、アジ化ナトリウム
等の還元剤・酸化防止剤等を添加しても良い。
2では、上記カオトロピックイオンを含有し、かつ酸解
離定数(pKa)が、2.15〜6.39の範囲及び
6.40〜10.50の範囲にある緩衝剤を含有する溶
離液が用いられる。
クイオンとその濃度等については、本発明1の場合と同
様であるため、上述した本発明1におけるカオトロピッ
クイオンについての説明を援用することにより省略す
る。
酸解離定数(pKa)が、2.15〜6.39及び6.
40〜10.50の範囲に存在するものが用いられる。
すなわち、緩衝剤として、pKaを、2.15〜6.3
9及び6.40〜10.50の範囲に少なくとも一つず
つもつ単一の物質を用いても良く、あるいは、2.15
〜6.39の範囲に少なくとも一つのpKaをもつ物質
と6.40〜10.50の範囲に少なくとも一つのpK
aをもつ物質とを組み合わせて緩衝剤として用いても良
い。また、上記緩衝剤を複数組み合わせて用いても良
い。
ピークを分離するのに適切な溶離液のpH付近におい
て、より優れた緩衝能を発揮できるように、2.61〜
6.39及び6.40〜10.50の範囲が好ましく、
より好ましくは、2.80〜6.35及び6.80〜1
0.00の範囲である。さらに好ましくは、3.50〜
6.25及び7.00〜9.50の範囲である。
ウ酸、炭酸等の無機物のほか、カルボン酸、ジカルボン
酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アニリ
ンまたはアニリン誘導体、アミノ酸、アミン類、イミダ
ゾール類、アルコール類等の有機物が挙げられる。ま
た、エチレンジアミン四酢酸、ピロリン酸、ピリジン、
カコジル酸、グリセロールリン酸、2,4,6−コリジ
ン、N−エチルモルホリン、モルホリン、4−アミノピ
リジン、アンモニア、エフェドリン、ヒドロキシプロリ
ン、ペリジン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタ
ン、グリシルグリシン等の有機物でも良い。
プロピオン酸、安息香酸等が挙げられる。
ン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン
酸、フタル酸、フマル酸等が挙げられる。
β,β’−ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、5,
5−ジエチルバルビツール酸、γ−アミノ酪酸、ピルビ
ン酸、フランカルボン酸、ε−アミノカプロン酸等が挙
げられる。
ば、酒石酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸等が挙げられ
る。
は、例えば、アニリン、ジメチルアニリン等が挙げられ
る。
ギン酸、アスパラギン、グリシン、α−アラニン、β−
アラニン、ヒスチジン、セリン、ロイシン等が挙げられ
る。
ジアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジエ
タノールアミン等が挙げられる。上記イミダゾール類と
しては、例えば、イミダゾール、5(4)−ヒドロキシ
イミダゾール、5(4)−メチルイミダゾール、2,5
(4)−ジメチルイミダゾール等が挙げられる。
アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオール、2−
アミノ−2−エチル−1,3−プロパンジオール、2−
アミノ−2−メチル−1−プロパノール等が挙げられ
る。
リホリノ)エタンスルホン酸(MES)、ビス(2−ヒ
ドロキシエチル)イミノトリス−(ヒドロキシメチル)
メタン(Bistris)、N−(2−アセトアミド)
イミドジ酢酸(ADA)、ピペラジン−N,N’−ビス
(2−エタンスルホン酸)(PIPES)、1,3−ビ
ス(トリス(ヒドロキシメチル)−メチルアミノ)プロ
パン(Bistrispropane)、N−(アセト
アミド)−2−アミノエタンスルホン酸(ACES)、
3−(N−モルフォリン)プロパンスルホン酸(MOP
S)、N,N’−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−
アミノエタンスルホン酸(BES)、N−トリス(ヒド
ロキシメチル)メチル−2−アミノエタンスルホン酸
(TES)、N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−
N’−エタンスルホン酸(HEPES)、N−2−ヒド
ロキシエチルピペラジン−N’−プロパンスルホン酸
(HEPPS)、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチ
ルグリシン(Tricine)、トリス(ヒドロキシメ
チル)アミノエタン(Tris)、N,N’−ビス(2
−ヒドロキシエチル)グリシン(Bicine)、グリ
シルグリシン、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル
−3−アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、グリシ
ン、シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸(CAP
S)等の一般にグッド(Good)の緩衝液といわれる
ものを組成する物質も使用できる。これらの物質のpK
aを表1・2に示す(引用文献:堀尾武一・山下仁平
蛋白質・酵素の基礎実験法 南江堂 1985年)。
ある範囲であれば良く、好ましくは1〜1000mM、
より好ましくは10〜500mMである。また、上記緩
衝剤は、単独でも複数混合して用いても良く、例えば、
有機物と無機物を混合して用いても良い。
1と同様に、無機塩類、pH調節剤、水溶性有機溶媒、
防腐剤、ヘモグロビン安定剤等を添加しても良い。
る少なくとも2種類以上の上記溶離液を用いるのが好ま
しい。また、その場合、測定目的のピークを分離するに
あたって用いる溶離液は、同一の緩衝剤を含むものを用
いるのが好ましいが、溶離液を切り替える際の、(検出
器出力の)ベースライン変動が、測定値に悪影響を与え
なければ、その必要はない。
るために、上記測定目的のピークを分離するにあたって
用いる溶離液は、緩衝剤の濃度も同一であるものを用い
るのがより好ましい。なお、溶離液のpHは、例えば、
前述のpH調節剤の添加量により調節できる。
勾配溶出法、あるいは段階溶出法によって送液しても良
い。
HbA1b、HbF、不安定型HbA1c、安定型Hb
A1c、AHb、CHb、HbA0、HbA2 、Hb
S、HbC等が挙げられる。
類を分離するための溶離液のpHは、4.0未満である
と、ヘモグロビン類が変性する可能性があり、6.8を
超えるとヘモグロビンのプラス電荷が減少し、陽イオン
交換基に保持されにくくなり、分離能が低下するので
4.0〜6.8が好ましく、4.5〜5.8がより好ま
しい。
カラムに流入する際のpHがヘモグロビンの等電点と等
しいか、または等電点よりアルカリ側になる溶離液を用
いる。上記溶離液は、 カオトロピックイオンを含有する
ことがより好ましい。 このカオトロピックイオンとその
濃度等については、本発明1の場合と同様である。ま
た、溶離液には、本発明1と同様に、無機塩類、pH調
節剤、水溶性有機溶媒、防腐剤、ヘモグロビン安定剤等
を添加しても良い。
A0の溶出に際し、すなわち、HbA1cより強く充填
剤に保持されたHbA等から成る「HbA0成分」を溶
出するためには、カラムに流入する際のpHをヘモグロ
ビンの等電点よりアルカリ側になるように設定した溶離
液を用いるのが好ましい。この条件を実現するには、p
Hがヘモグロビンの等電点よりアルカリ側であるひとつ
の溶離液を送液する方法や、pHの異なる2種以上の溶
離液を用いる方法がある。
らアルカリ側になると、総荷電がプラスからマイナスに
変わるため、充填剤の陽イオン交換基との「電気的反発
力によってHbA0成分を溶出」させることができる。
月、岩波書店、久保亮五ら編集)、1178頁に記載さ
れているように、ヘモグロビンの等電点はpH6.8〜
7.0である。そのため、HbA0成分を溶出するため
に、カラムに流入する際の溶離液のpHを6.8以上に
することがより好ましい。
液の内、少なくともひとつの溶離液のpHが6.8以上
であることが必要である。本溶離液のpHは望ましくは
7.0〜12.0であり、7.5〜11.0がより好ま
しく、更には8.0〜9.5が好ましい。溶離液のpH
が6.8未満になるとHbA0成分の溶出が不十分とな
る。溶離液のpHは、用いる充填剤の分解が起こらない
範囲に設定すれば良い。
pHが6.8以上で緩衝能をもつ溶離液としては、例え
ば、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機酸または、その塩;
クエン酸等のヒドロキシカルボン酸、β、β−ジメチル
グルタル酸等のカルボン酸誘導体、マレイン酸等のジカ
ルボン酸、カコジル酸、等の有機酸または、その塩から
なる緩衝液が挙げられる。その他、2−(N−モリホリ
ノ)エタンスルホン酸(MES)、N−2−ヒドロキシ
エチルピペラジン−N’−エタンスルホン酸(HEPE
S)、ビス(2−ヒドロキシエチル)イミノトリス−
(ヒドロキシメチル)メタン(Bistris)、Tr
is、ADA、PIPES、Bistrispropa
ne、ACES、MOPS、BES、TES、HEPE
S、HEPPS、Tricine、Bicine、グリ
シルグリシン、TAPS、CAPS等の一般にグッド
(Good)の緩衝液といわれるものも使用できる。ま
た、BrittonとRobinsonの緩衝液;GT
A緩衝液も使用できる。また、イミダゾール等のイミダ
ゾール類;エチレンジアミン、メチルアミン、エチルア
ミン、トリエチルアミン、ジエタノールアミン、トリエ
タノールアミン等のアミン類;グリシン、β−アラニ
ン、アスパラギン酸、アスパラギン等のアミノ酸類;等
の有機物も使用できる。
酸の塩;有機物は、複数混合して用いても良く、また、
有機酸、無機酸及び有機物を混合しても良い。
には、上記溶離液にカオトロピックイオンを添加するの
が好ましい。添加するカオトロピックイオンは本発明1
の場合と同様である。
〜3000mMで、好ましくは、10〜1000mM、
更には、50〜500mMが好ましい。
力の異なる3種の溶離液を用い、HbA0を溶出するた
めの溶離液を送液する前に、該HbA0を溶出するため
の溶離液以外の溶離液を送液しても良い。
溶離液が(送液ポンプで)送液されてカラムに通液され
るとHbA0成分が溶出されてくる。このHbA0成分
を溶出するための溶離液を送液する前、すなわち、Hb
A0より前に溶出されてくる各ヘモグロビン成分を分離
するために、HbA0成分を溶出する溶離液以外の溶離
液を送液する。
類の溶出に、pH4.0〜6.8の溶離液を少なくとも
2種類以上用い、塩濃度勾配法やpH勾配法またはこの
2つの組み合わせにより、安定型HbA1c等の測定対
象ピークをシャープに溶出させることが可能になる。
前に溶出するヘモグロビン類(HbA1a及びb、Hb
F、不安定型HbA1c、安定型HbA1c)の溶出に
は、少なくとも2種類以上の溶離液を用い、かつ、溶出
力の最も弱い溶離液を先に流すこともできる。
方法では、好ましくは、溶離液を勾配溶出法または段階
溶出法によって送液し、その途中において溶離液の溶出
力を低下させることが望ましい。
シャープにしたり、隣り合って溶出する2つ以上のピー
クの分離度を向上させたりするために、複数の溶離液を
用いた勾配溶出法や段階溶出法が利用されている。
れている。すなわち、複数台の送液ポンプを用い、溶出
力が異なる複数の溶離液の送液比率を連続的に変化させ
て送液する。それによって、図20に示すように、時間
と共に溶出力が連続的に上昇するように溶出が行われ
る。
出」と称されている。この方法では、1台の送液ポンプ
を、電磁弁等を介して複数の溶離液に連結する。そし
て、電磁弁を切り換えることにより、溶出力の低い溶離
液から、溶出力の高い溶離液に切り換えて送液する。従
って、図21に示すように、溶出力は段階的に上昇いて
いく。
類似していたり、短時間で溶出することが要求されてい
る場合、従来の勾配溶出法や段階溶出法では、類似した
性質の成分間でピークが重なり、分離度が低下するおそ
れがあった。
たは段階溶出法によって溶離液を送液するに際し、その
途中、すなわち勾配溶出法または段階溶出法により複数
の溶離液を順に切り替えて送液していく途中において、
分離対象のピークまたはピーク間の溶離タイミングを考
慮して分離対象のピークまたはピーク間の分離状態が良
くなるように、溶離液の溶出力を一旦低下させることも
できる。具体的には、段階溶出法の場合、溶出力の弱い
溶離液から溶出力の強い溶離液に切り替えて送液した
後、溶出力の弱い溶離液に切り替え、しばらくしてから
溶出力の強い溶離液に切り替えて送液する。
力を低下させるには、溶離液の塩濃度を下げる方法やp
Hを下げる方法、またはこの2つを組み合わせる方法が
挙げられる。
げる方法やpHを上げる方法、逆相クロマトグラフィー
では溶離液の有機溶媒の極性を上げる方法、順相クロマ
トグラフィーでは溶離液の有機溶媒の極性を下げる方法
が挙げられる。
によって送液し、その途中において溶離液の溶出力を低
下させる方法により、ヘモグロビンを分離する場合をよ
り具体的に説明する。
充填剤が充填されたカラムを用い、溶離液を塩濃度20
〜1000mM、pH4〜9の範囲で勾配溶出法または
段階溶出法によって送液させ、その途中において溶離液
の塩濃度を5〜500mM、pHを0.1〜3の範囲で
下げることによって溶離液の溶出力を低下させて分離を
行う。
合の、装置の構成例を図17に示した。溶離液A,B,
C,Dは、各々溶出力の異なる(例えば、塩濃度、p
H、極性等において異なる)ものであり、電磁弁1によ
って設定時間に各溶離液に切り替えられるように構成さ
れている。溶離液は、送液ポンプ2により、試料注入部
3から導入された試料とともにカラム4に導かれ、各成
分が検出器5により検出される。各ピークの面積、高さ
等はインテグレータ6により算出される。
可能性のあるHbA2、HbS、HbC等のヘモグロビ
ン成分を含む血液検体を測定する場合、HbA0成分
(ピーク)として主にHbAを溶出させ、それより後に
HbA2、HbS、HbC等を溶離させる測定方法を設
定することがある。これにより、HbA0ピークからH
bA以外のヘモグロビン成分を除けるため、より正確な
安定型HbA1c(%)を算出できる。
測定方法を設定する場合、前述した少なくとも溶出力の
異なる3種の溶離液を用いる方法における「HbA0を
溶出するための溶離液」は、HbAを主成分とするHb
A0ピークを溶出する溶離液を意味している。このと
き、「HbA0を溶出するための溶離液」の後に、Hb
A2、HbS、HbC等を溶離するために、より溶出力
の強い溶離液を送液することが必要となる。
るカチオン交換液体クロマトグラフィーの充填剤は、少
なくとも1種以上のカチオン交換基を有している粒子よ
りなるものであり、例えば、高分子粒子にカチオン交換
基を導入することで得られる。
に制限はない。例えば、カルボキシル基、スルホン酸
基、リン酸基などのカチオン交換基等が挙げられる。ま
た、このカチオン交換基は、複数種導入しても良い。
0μm、より好ましくは1〜10μmである。また、粒
度分布は、変動係数値(CV値)(粒径の標準偏差÷平
均直径×100)として、好ましくは40%以下、より
好ましくは30%以下である。
カ、ジルコニアなどの無機系粒子;セルロース、ポリア
ミノ酸、キトサンなどの天然高分子粒子;ポリスチレ
ン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子など
が挙げられる。上記高分子粒子は、導入されるイオン交
換基以外の構成成分は、より親水性であることが好まし
い。また耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが
好ましい。
は、公知の方法により行うことができるが、例えば、高
分子粒子を調製後、粒子が有する官能基(水酸基、アミ
ノ基、カルボキシル基、エポキシ基など)に、化学反応
でカチオン交換基を粒子に導入させる方法により行うこ
とができる。
合して高分子粒子を調製する方法によってもカチオン交
換充填剤を調製できる。例えば、カチオン交換基含有単
量体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下
に重合する方法などが挙げられる。
タ)アクリル酸エチルなどの重合性カチオン交換基含有
エステルを架橋性単量体などと混合し、重合開始剤存在
下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エス
テルをカチオン交換基に変換させてもよい。
ように、架橋重合体粒子を調製した後、カチオン交換基
を有する単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、
該単量体を重合させても良い。
マトグラフィー測定に用いられる。上記カラムは公知の
ステンレス製、ガラス製、樹脂製など、特に限定されな
い。カラムサイズとしては、内径0.1〜50mm、長
さ1〜300mmのものが好ましく、内径0.2〜30
mm、長さ5〜200mmのものがより好ましい。充填
剤のカラムへの充填方法は、公知の任意の方法が使用で
きるがスラリー充填法がより好ましい。具体的には、例
えば、充填剤粒子を溶離液などの緩衝液に分散させたス
ラリーを送液ポンプなどによりカラムに圧入することに
より行う。
ので良く、例えば、送液ポンプ、試料注入装置(サンプ
ラ)、カラム、検出器等から構成される。また、他の付
属装置(カラム恒温槽や溶離液の脱気装置等)が適宜付
加されても良い。
は、公知の条件で良く、溶離液の流速は、好ましくは
0.05〜5mL/分、より好ましくは0.2〜3mL
/分である。ヘモグロビン類の検出は、415nmの可
視光が好ましいが、特にこれのみに限定されるわけでは
ない。測定試料は、通常、界面活性剤等溶血活性を有す
る物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したも
のを用いる。試料注入量は、血液検体の希釈倍率により
異なるが、好ましくは0.1〜100μL程度である。
詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定
されるものではない。
学社製)400g及び2−アクリルアミド−2−メチル
プロパンスルホン酸150gの混合物に過酸化ベンゾイ
ル(和光純薬社製)1.5gを溶解した。これを4重量
%ポリビニルアルコール(日本合成化学社製)水溶液2
500mLに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で7
5℃に昇温し、8時間重合した。重合後、洗浄し乾燥し
た後、分級して平均粒径6μmの粒子を得た。
子0.7gを、50mMリン酸緩衝液(pH5.8)3
0mLに分散し、5分間超音波処理した後、よく撹拌し
た。全量をステンレス製の空カラム(内径4.6×30
mm)を接続したパッカー(梅谷精機社製)に注入し
た。パッカーに送液ポンプ(サヌキ工業社製)を接続
し、圧力300kg/cm2 で定圧充填した。
ン類の測定を行った。 (測定条件) システム:送液ポンプ:LC−9A(島津製作所社製) オートサンプラ:ASU−420(積水化学工業社製) 検出器:SPD−6AV(島津製作所社製) 溶離液:溶離液A:50mMの過塩素酸を含有する 50mMリン酸緩衝液(pH5.3) 溶離液B:200mMの過塩素酸を含有する 50mMリン酸緩衝液(pH8.0) なお、リン酸のpKaは表1に記載の通りである。測定
開始より0〜3分の間は溶離液Aを送液し、3〜3.2
分の間は溶離液Bを送液し、3.2〜5分の間は溶離液
Aを送液した。 流速:2.0mL/分 検出波長:415nm 試料注入量:10μL
採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶
血試薬として、0.1重量%ポリエチレングリコールモ
ノ−4−オクチルフェニルエーテル(トリトンX−10
0)(東京化成社製)を含有させたリン酸緩衝液溶液
(pH7.0)を用いた。 a)糖負荷血:全血検体に500mg/dLのグルコー
ス水溶液を添加し、37℃で3時間反応させ、次いで上
記溶血試薬により溶血し、150倍に希釈して試料aと
した。 b)CHb含有試料:全血検体10mLに、0.3重量
%のシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液1mLを添加
し、37℃で3時間反応させ、次いで上記溶血試薬によ
り溶血し、150倍に希釈して試料bとした。 c)AHb含有試料:全血検体10mLに、0.3重量
%のアセトアルデヒドの生理食塩水溶液1mLを添加
し、37℃で3時間反応させ、次いで上記溶血試薬によ
り溶血し、150倍に希釈して試料cとした。
測定して得られたクロマトグラムを図1〜3に示す。図
1は試料a、図2は試料b、図3は試料cを測定した結
果である。ピーク1はHbA1a及びHbA1b、ピー
ク2はHbF、ピーク3は不安定型HbA1c、ピーク
4は安定型HbA1c、ピーク5はHbA0、ピーク6
はCHb、ピーク7はAHbを示す。図1では、ピーク
3および4が良好に分離されている。また、図2ではピ
ーク6(CHb)、図3ではピーク7(AHb)がピー
ク4から良好に分離されている。
との他は、実施例1と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。得られたクロマトグラムは図1〜3と同
様に良好であった。 溶離液:溶離液A:55mMの過塩素酸を含有する20mMコハク酸 −20mMリン酸緩衝液(pH5.3) 溶離液B:250mMの過塩素酸を含有する20mM コハク酸−20mMリン酸緩衝液(pH8.0) なお、コハク酸のpKaは、表1に記載の通りである。
との他は、実施例1と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。得られたクロマトグラムは図1〜3と同
様に良好であった。 溶離液:溶離液A:55mMの硝酸ナトリウムを含有する10mM マレイン酸−40mMリン酸緩衝液(pH5.3) 溶離液B:200mMの硝酸ナトリウムを含有する10mM マレイン酸−40mMリン酸緩衝液(pH8.3) なお、マレイン酸のpKaは、表1に記載の通りであ
る。
との他は、実施例1と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。得られたクロマトグラムは図1〜3と同
様に良好であった。 溶離液:溶離液A:50mMの過塩素酸を含有する10mMマレイン 酸−50mMリン酸緩衝液(pH5.3) 溶離液B:200mMの過塩素酸を含有する8mMマレイン 酸−50mMリン酸緩衝液(pH8.3)
との他は、実施例1と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。 溶離液:溶離液A:200mMのリン酸緩衝液(pH5.4) 溶離液B:330mMのリン酸緩衝液(pH6.0) 得られたクロマトグラムを図4〜6に示す。図4は試料
a、図5は試料b、図6は試料cを測定した結果であ
る。図1〜3に比較して、測定時間が長いにもかかわら
ず、分離状態が悪いことが分かる。
との他は、実施例1と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。 溶離液:溶離液A:55mMの過塩素酸を含有する50mMリン酸緩 衝液(pH5.3) 溶離液B:200mMの過塩素酸を含有する50mMリン酸 緩衝液(pH8.0) 測定開始より0〜3分の間は溶離液Aを送液し、3〜
3.2分の間は溶離液Bを送液し、3.2〜5分の間は
溶離液Aを送液した。
7〜9に示す。図7は試料a、図8は試料b、図9は試
料cを測定した結果である。ピーク1はHbA1a及び
b、ピーク2はHbF、ピーク3は不安定型HbA1
c、ピーク4は安定型HbA1c、ピーク5はHbA
0、ピーク6はCHb、ピーク7はAHbを示す。図7
では、ピーク3および4が良好に分離されている。ま
た、図8ではピーク6(CHb)、図9ではピーク7
(AHb)がピーク4から良好に分離されている。
との他は、実施例1と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。得られたクロマトグラムは図7〜9と同
様に良好であった。 溶離液:溶離液A:48mMの硝酸ナトリウムを含有する25mM コハク酸−20mMリン酸緩衝液(pH5.3) 溶離液B:200mMの硝酸ナトリウムを含有する25mM コハク酸−20mMリン酸緩衝液(pH8.0)
との他は、実施例1と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。得られたクロマトグラムは図7〜9と同
様に良好であった。 溶離液:溶離液A:53mMの過塩素酸を含有する25mMコハク酸 −20mMリン酸緩衝液(pH5.3) 溶離液B:200mMの過塩素酸を含有する25mMコハク 酸−20mMリン酸緩衝液(pH8.0)
との他は、実施例1と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。得られたクロマトグラムは図7〜9と同
様に良好であった。 溶離液:溶離液A:48mMの硝酸ナトリウムを含有する25mMコ ハク酸緩衝液(pH5.3) 溶離液B:200mMの硝酸ナトリウムを含有する30mM リン酸緩衝液(pH8.3)
との他は、実施例1と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。 溶離液:溶離液A:170mMリン酸緩衝液(pH5.3) 溶離液B:330mMリン酸緩衝液(pH5.7) 得られたクロマトグラムを図10〜12に示す。図10
は試料a、図11は試料b、図12は試料cを測定した
結果である。図7〜9に比較して、測定時間が長いにも
かかわらず、分離状態が悪いことが分かる。
との他は、実施例1と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。得られたクロマトグラムは図10〜12
と同様であった。 溶離液:溶離液A:100mMコハク酸緩衝液(pH5.6) 溶離液B:250mMコハク酸緩衝液(pH6.5) 実施例5〜8及び比較例2、3のクロマトグラムにおい
て、HbA0のピーク幅及び分離能を比較した結果、実
施例5〜8は、比較例2、3に比べて、HbA0のピー
ク幅は、狭く、しかも、分離能も良かった。
クリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸の代わり
に、 メタクリル酸(和光純薬)を用い、 溶離液を以下の
組成としたことの他は、実施例1と同様に操作してヘモ
グロビン類の測定を行った。 溶離液:溶離液A:70mMの硝酸ナトリウムを含有する 70mMリン酸緩衝液(pH5.7) 溶離液B:250mMの硝酸ナトリウムを含有する 70mMリン酸緩衝液(pH8.5)
ことの他は、実施例9と同様に操作してヘモグロビン類
の測定を行った。 溶離液:溶離液A:70mMの硝酸ナトリウムを含有する 70mMリン酸緩衝液(pH5.7) 溶離液B:250mMの硝酸ナトリウムを含有する 70mMリン酸緩衝液(pH12.0)
ことの他は、実施例1と同様に操作してヘモグロビン類
の測定を行った。 溶離液:溶離液A:50mMの過塩素酸を含有する 20mMコハク酸−30mMリン酸緩衝液(pH5.3) 溶離液B:250mMの過塩素酸を含有する 5mMコハク酸−50mMリン酸緩衝液(pH8.5)
ことの他は、実施例1と同様に操作してヘモグロビン類
の測定を行った。 溶離液:溶離液A:50mMの過塩素酸を含有する 20mMコハク酸−30mMリン酸緩衝液(pH5.3) 溶離液B:250mMの過塩素酸を含有する 5mMコハク酸−50mMリン酸緩衝液(pH12.5)
との他は、実施例9と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。 溶離液:溶離液A:70mMの硝酸ナトリウムを含有する 70mMリン酸緩衝液(pH5.7) 溶離液B:250mMの硝酸ナトリウムを含有する 70mMリン酸緩衝液(pH5.7)
との他は、実施例1と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。 溶離液:溶離液A:50mMの過塩素酸を含有する 20mMコハク酸−30mMリン酸緩衝液(pH5.3) 溶離液B:250mMの過塩素酸を含有する 5mMコハク酸−50mMリン酸緩衝液(pH5.3)
トグラムにおいて、HbA0のピーク幅及び分離能を比
較した結果、実施例9〜12は、比較例4、5に比べ
て、HbA0のピーク幅は、狭く、しかも、分離能も良
かった。また、実施例9〜12及び比較例4、5におい
て、試料を連続測定した場合のHbA1cの保持時間の
変化を図13に示した。 図13より、実施例9〜12で
は、比較例4、5に比べて保持時間の変化が少ないこと
が分かる。
の送液条件を以下のように変更した以外は、実施例1と
同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。 溶離液:溶離液A:55mMの過塩素酸を含有する50mMリン酸緩 衝液(pH5.3) 溶離液B:68mMの過塩素酸を含有する50mMリン酸緩 衝液(pH5.3) 溶離液C:200mMの過塩素酸を含有する50mMリン酸 緩衝液(pH8.0) 測定開始より0〜0.7分の間は溶離液Aを送液し、
0.7〜1.4分の間は溶離液Bを送液し、1.4〜
1.5分の間は溶離液Cを送液し、1.5〜1.9分の
間は溶離液Aを送液した。
14〜16に示す。図14は試料a、図15は試料b、
図16は試料cを測定した結果である。ピーク1はHb
A1a及びb、ピーク2はHbF、ピーク3は不安定型
HbA1c、ピーク4は安定型HbA1c、ピーク5は
HbA0、ピーク6はCHb、ピーク7はAHbを示
す。図14では、ピーク3および4が良好に分離されて
いる。また、図15ではピーク6(CHb)、図16で
はピーク7(AHb)がピーク4から良好に分離されて
いる。
ことの他は、実施例13と同様に操作してヘモグロビン
類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図14〜
16と同様に良好であった。 溶離液:溶離液A:48mMの過塩素酸を含有する25mMコハク酸 −20mMリン酸緩衝液(pH5.3) 溶離液B:67mMの過塩素酸を含有する25mMコハク酸 −20mMリン酸緩衝液(pH5.3) 溶離液C:200mMの過塩素酸を含有する25mMコハク 酸−20mMリン酸緩衝液(pH8.0)
ことの他は、実施例13と同様に操作してヘモグロビン
類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図14〜
16と同様に良好であった。 溶離液:溶離液A:53mMの過塩素酸を含有する20mMマレイン 酸−20mMリン酸緩衝液(pH5.3) 溶離液B:68mMの過塩素酸を含有する20mMマレイン 酸−20mMリン酸緩衝液(pH5.3) 溶離液C:200mMの過塩素酸を含有する20mMマレイ ン酸−20mMリン酸緩衝液(pH8.5)
ことの他は、実施例13と同様に操作してヘモグロビン
類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図14〜
16と同様に良好であった。 溶離液:溶離液A:48mMの硝酸ナトリウムを含有する25mM コハク酸緩衝液(pH5.3) 溶離液B:71mMの硝酸ナトリウムを含有する25mM コハク酸緩衝液(pH5.3) 溶離液C:200mMの硝酸ナトリウムを含有する30mM リン酸緩衝液(pH8.3)
て、血液試料中のヘモグロビン類の測定を行った。カラ
ムには陽イオン交換樹脂(ミクロネックスA1c HS
−IV、積水化学工業社製)を充填したものを用いた。溶
離液Aとして170mM、溶離液Bとして190mM、
溶離液Cとして150mM、溶離液Dとして330mM
の、それぞれリン酸緩衝液で、溶離液A〜CはpH6の
ものを、溶離液DはpH7.2のものを用いた。試料と
しては、実施例1で用いた全血検体を溶血試薬を用いて
100倍に溶血、希釈したものを用いた。2分間でHb
A1c(後述のピークP5)を各ヘモグロビン類のピー
クから分離するように溶離液を段階溶出法を用いて切り
替えた。溶離液の切り替え条件および得られたクロマト
グラムを図18に示した。すなわち、溶離液は0〜38
秒は溶離液Aを、38〜58秒は溶出力のより高い溶離
液Bを、58〜78秒はより溶出力の低い溶離液Cを、
78〜100秒は溶出力の最も高い溶離液Dを、100
〜120秒は溶離液Aを再び送液した。ピークの検出に
は415nmの吸収強度を用いた。図18のクロマトグ
ラムにおいて、ピークP1〜P3は、HbA1a及びH
bA1b類であり、ピークP4はHbFであり、ピーク
P5はHbA1cであり、ピークP6はHbA0であ
る。
の切り替えにより溶出力を上昇させたことによりピーク
P6が早く溶出して、HbA1cのピークであるピーク
P5の正確な検出を妨害するのを防ぐため、溶離液Bか
ら溶出力のより低い溶離液Cへの切り替えを行ってい
る。
試料について10回繰り返し測定し、次式によりHbA
1c値を算出した。10回の各測定値、その平均値およ
びCV値(%)を表3に示した。 HbA1c値(%)=ピークP5の面積÷(ピークP1
の面積+ピークP2の面積+ピークP3の面積+ピーク
P4の面積+ピークP5の面積+ピークP6の面積)×
100
を用いなかったこと、および溶離液Bの代わりに溶離液
B1(180mM、pH6のリン酸緩衝液)を用いた他
は、実施例17に準じて実施例17と同一の試料中のヘ
モグロビン類の測定を行った。溶離液の切り替え条件お
よび得られたクロマトグラムを図19に示した。すなわ
ち、溶離液は0〜38秒は溶離液Aを、38〜78秒は
溶離液B1を、78〜100秒は溶出力の最も高い溶離
液Dを、100〜120秒は溶離液Aを再び送液した。
溶離液Aから溶離液Bよりも溶出力の低い溶離液B1へ
切り替えたため、ピークP6の一部が早く溶出すること
はないが、ピークP5はシャープにならず、図19に○
で囲んだように、ピークP5にピークP4およびピーク
P6が一部重なっていることが分かる。
について10回繰り返し測定し、実施例1と同様にして
HbA1c値を算出した。10回の各測定値、その平均
値およびCV値(%)を表3に示した。
のヘモグロビン類の測定方法における問題点であったヘ
モグロビン類の分離性能が改善され、特に安定型HbA
1cを高い再現性で精密に分離できる。また、短時間
で、ベースライン変動が少ないと共に、 カラム耐久性も
向上されたヘモグロビン類の測定方法を提供することが
できる。
の測定(試料a)を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。
の測定(試料b)を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。
の測定(試料c)を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。
の測定(試料a)を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。
の測定(試料b)を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。
の測定(試料c)を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。
の測定(試料a)を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。
の測定(試料b)を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。
の測定(試料c)を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。
類の測定(試料a)を行った際に得られたクロマトグラ
ムを示す図である。
類の測定(試料b)を行った際に得られたクロマトグラ
ムを示す図である。
類の測定(試料c)を行った際に得られたクロマトグラ
ムを示す図である。
て、試料を連続測定した場合のHbA1cの保持時間の
変化を示した図である。
ン類の測定(試料a)を行った際に得られたクロマトグ
ラムを示す図である。
ン類の測定(試料b)を行った際に得られたクロマトグ
ラムを示す図である。
ン類の測定(試料c)を行った際に得られたクロマトグ
ラムを示す図である。
成例を示す図である。
得られたクロマトグラムを示す図である。
られたクロマトグラムを示す図である。
る。
る。
Claims (11)
- 【請求項1】 陽イオン交換液体クロマトグラフィーに
よるヘモグロビン類の測定方法において、カオトロピッ
クイオンを含有し、かつpH4.0〜6.8で緩衝能を
持つ無機酸、有機酸及び/またはこれらの塩を含む溶離
液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方
法。 - 【請求項2】 陽イオン交換液体クロマトグラフィーに
よるヘモグロビン類の測定方法において、カオトロピッ
クイオンを含有し、かつ酸解離定数(pKa)が2.1
5〜6.39の範囲及び6.40〜10.50の範囲に
ある緩衝剤を含む溶離液を用いることを特徴とするヘモ
グロビン類の測定方法。 - 【請求項3】 請求項1または2に記載のヘモグロビン
類の測定方法であって、測定目的のピークを分離するの
に際し、pHの異なる少なくとも2種以上の溶離液を用
い、該pHの異なる少なくとも2種以上の溶離液が、同
一の緩衝剤を含むものであることを特徴とするヘモグロ
ビン類の測定方法。 - 【請求項4】 請求項1〜3のいずれか1項に記載のヘ
モグロビン類の測定方法であって、HbA0を溶出する
ために、カラムに流入する際のpHがヘモグロビンの等
電点と等しいか、または等電点よりアルカリ側になる溶
離液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方
法。 - 【請求項5】 陽イオン交換液体クロマトグラフィーに
よるヘモグロビン類の測定方法において、HbA0を溶
出するために、カラムに流入する際のpHがヘモグロビ
ンの等電点と等しいか、または等電点よりアルカリ側に
なる溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の
測定方法。 - 【請求項6】 請求項5に記載のヘモグロビン類の測定
方法であって、前記溶離液がさらにカオトロピックイオ
ンを含有することを特徴とするヘモグロビン類の測定方
法。 - 【請求項7】 請求項4〜6のいずれか1項に記載のヘ
モグロビン類の測定方法であって、前記溶離液のpHが
6.8以上であることを特徴とするヘモグロビン類の測
定方法。 - 【請求項8】 請求項1〜7のいずれか1項に記載のヘ
モグロビン類の測定方法であって、ヘモグロビンA0よ
りも前に溶出するヘモグロビン類の溶出に、pH4.0
〜6.8の溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビ
ン類の測定方法。 - 【請求項9】 請求項8に記載のヘモグロビン類の測定
方法であって、ヘモグロビンA0よりも前に溶出するヘ
モグロビン類の溶出に、少なくとも溶出力の異なる2種
以上の溶離液を用い、 溶出力の弱い溶離液から順に送液
することを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。 - 【請求項10】 請求項1〜9のいずれか1項に記載の
ヘモグロビン類の測定方法であって、少なくとも溶出力
の異なる3種の溶離液を用い、HbA0を溶出するため
の溶離液を送液する前に、該HbA0を溶出するための
溶離液以外の溶離液を送液することを特徴とするヘモグ
ロビン類の測定方法。 - 【請求項11】 請求項1〜10のいずれか1項に記載
のヘモグロビン類の測定方法であって、溶離液を勾配溶
出法または段階溶出法によって送液し、その途中におい
て溶離液の溶出力を低下させることを特徴とするヘモグ
ロビン類の測定方法。
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JP22457298 | 1998-08-07 | ||
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---|---|---|---|---|
JP2001349894A (ja) * | 2000-06-06 | 2001-12-21 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビン類の測定方法 |
JP2002082105A (ja) * | 2000-06-20 | 2002-03-22 | Sekisui Chem Co Ltd | 液体クロマトグラフィー用充填剤、カラム、及びそれを用いたヘモグロビン類の測定方法 |
JP2007078361A (ja) * | 2005-09-09 | 2007-03-29 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビン類の測定方法 |
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