JP5462841B2 - ヘモグロビンの分析方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ヘモグロビンの分析方法及び分析用キットに関する。
ヘモグロビンのなかでも、糖化ヘモグロビンの１種であるヘモグロビンＡ１ｃの量は、血糖値の指標として、糖尿病やメタボリックシンドロームを含む生活習慣病の検査及び血糖管理に利用されており、今後も重要な指標と１つとなることが予想されている。ヘモグロビンＡ１ｃのなかでも、安定型ヘモグロビンＡ１ｃは特に重要な指標であり、安定型ヘモグロビンＡ１ｃをより正確に測定できる技術が求められている。安定型ヘモグロビンＡ１ｃは、電気泳動やＨＰＬＣなどの分離分析方法で分析することができる。
電気泳動には、支持体の有無、支持体の種類等に応じて様々な方法があり、例えば、ポリアクリルアミド電気泳動、アガロースゲル電気泳動、デンプンゲル電気泳動、ろ紙電気泳動、セルロースアセテート膜電気泳動、電気クロマトグラフィー、無担体（フリーフロー）電気泳動、キャピラリー電気泳動法等が知られている。アガロースゲル電気泳動法を用いた分析としては、例えば、硫酸コンドロイチン等の硫酸化多糖類を添加したアガロースゲルを用いて糖化ヘモグロビンを分離する方法等が提案されている。キャピラリー電気泳動を用いた分析方法としては、例えば、キャピラリー電気泳動法の一種である動電クロマトグラフィーを用い、コンドロイチン硫酸等のポリアニオンやポリカチオンを泳動緩衝液に含有させることによって短時間で試料を分析する方法（特許文献１）、泳動装置をマイクロチップ化して、分析装置を小型化する方法（特許文献２及び３）等が提案されている。
電気泳動やＨＰＬＣなどの分離分析方法でヘモグロビンを分析する場合、ヘモグロビンが変性することにより、測定値に誤差が生じ得るという問題がある。例えば、電気泳動の場合、泳動液の温度上昇にともないヘモグロビンが酸化（メト化）する。また、ＨＰＬＣの場合であっても時間の経過に伴いヘモグロビンが酸化（メト化）することがある。そこで、本発明は、分離分析方法においてヘモグロビンの変性を抑制できる分析方法を提供する。
本発明は、分離分析方法により試料中のヘモグロビンを分析する方法であって、亜硫酸化合物及び亜ジチオン酸化合物の少なくとも一方の存在下でヘモグロビンを分離することを含む分析方法に関する。
本発明はその他の態様において、本発明の分析方法に使用する分析用キットであって、試料調製液、泳動液、又は移動相として使用する、亜硫酸化合物又は亜ジチオン酸化合物を含む組成物、及び、前記分析方法が記載された説明書を含む分析用キットに関する。
本発明によれば、例えば、ヘモグロビンの変性を抑制しながらヘモグロビンの分離分析方法が行えるという効果を奏する。また、本発明によれば、好ましくは、ヘモグロビンの変性を抑制することで正確なヘモグロビンの分析が可能になるという効果を奏する。
本発明は、ヘモグロビンの分離分析方法において、時間の経過とともに、及び／又は、分析条件が酸性になるほど、ヘモグロビンが酸化（メト化）され、ヘモグロビンの吸収特性が変化し（極大波長４１５ｎｍ→４０５ｎｍ）、その結果として測定値に誤差を生じるおそれがあるという知見に基づく。さらに、本発明は、分離分析におけるヘモグロビンの変性は、亜硫酸化合物及び亜ジチオン酸化合物の少なくとも一方の使用により抑制できるという知見に基づく。すなわち、本発明は、分離分析方法により試料中のヘモグロビンを分析する方法であって、亜硫酸化合物及び亜ジチオン酸化合物の少なくとも一方の存在下でヘモグロビンを分離することを含む分析方法（以下、「本発明の分析方法」ともいう。）に関する。本発明によれば、例えば、ヘモグロビンの変性を抑制しながらヘモグロビンの分離分析方法が行えるという効果を奏する。また、本発明によれば、好ましくは、ヘモグロビンの変性を抑制することで正確なヘモグロビンの分析が可能になるという効果を奏する。
亜硫酸化合物及び亜ジチオン酸化合物の少なくとも一方の存在下でヘモグロビンの変性が抑制されるメカニズムの詳細は明らかではないが、亜硫酸化合物及び亜ジチオン酸化合物が、分析中に生じる酸化作用に対してヘモグロビンの代わりに酸化されることで、ヘモグロビンの酸化を防ぐ犠牲剤として働くと推測される。但し、本発明は上記メカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
［分離分析方法］
本明細書において「分離分析方法」とは、電気泳動法及びクロマトグラフィー等による分析方法を含み、分析対象を分離して検出及び測定することを含む分析方法をいう。本明細書において「電気泳動法」とは、物質を、その大きさや電荷の違い等による電場での移動速度の差を利用して分離する方法のことをいう。本発明の分析方法は、例えば、ポリアクリルアミド電気泳動、アガロースゲル電気泳動、デンプンゲル電気泳動、ろ紙電気泳動、セルロースアセテート膜電気泳動、動電クロマトグラフィー、無担体（フリーフロー）電気泳動、キャピラリー電気泳動等の様々な電気泳動法を用いた分析方法に使用できる。中でも、本発明の分析方法は、キャピラリー電気泳動、好ましくは動電クロマトグラフィーに適しており、マイクロチップ化された電気泳動チップを用いたキャピラリー電気泳動に特に適している。
本明細書において「分離分析方法」とは、電気泳動法及びクロマトグラフィー等による分析方法を含み、分析対象を分離して検出及び測定することを含む分析方法をいう。本明細書において「電気泳動法」とは、物質を、その大きさや電荷の違い等による電場での移動速度の差を利用して分離する方法のことをいう。本発明の分析方法は、例えば、ポリアクリルアミド電気泳動、アガロースゲル電気泳動、デンプンゲル電気泳動、ろ紙電気泳動、セルロースアセテート膜電気泳動、動電クロマトグラフィー、無担体（フリーフロー）電気泳動、キャピラリー電気泳動等の様々な電気泳動法を用いた分析方法に使用できる。中でも、本発明の分析方法は、キャピラリー電気泳動、好ましくは動電クロマトグラフィーに適しており、マイクロチップ化された電気泳動チップを用いたキャピラリー電気泳動に特に適している。
［ヘモグロビン］
本明細書において「ヘモグロビン」とは、血中における複数種類の形態のヘモグロビンを含み、具体的には、正常ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン、変異ヘモグロビン、修飾ヘモグロビン等が挙げられ、より具体的には、ヘモグロビンＡ０（ＨｂＡ０）、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、ヘモグロビンＡ２（ＨｂＡ２）、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ、鎌状赤血球ヘモグロビン）、ヘモグロビン（ＨｂＦ、胎児ヘモグロビン）、ヘモグロビンＭ（ＨｂＭ）、ヘモグロビンＣ（ＨｂＣ）、メトヘモグロビン、カルバミル化ヘモグロビン、アセチル化ヘモグロビン等が挙げられる。ＨｂＡ１ｃとしては、安定型ＨｂＡ１ｃ、不安定型ＨｂＡ１ｃがある。本明細書において「ヘモグロビンの分析」とは、安定型ＨｂＡ１ｃと不安定型ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ０とを分離し安定型ＨｂＡ１ｃ及び/又は不安定型ＨｂＡ１ｃを検出及び／又は測定することを含む。
本明細書において「ヘモグロビン」とは、血中における複数種類の形態のヘモグロビンを含み、具体的には、正常ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン、変異ヘモグロビン、修飾ヘモグロビン等が挙げられ、より具体的には、ヘモグロビンＡ０（ＨｂＡ０）、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、ヘモグロビンＡ２（ＨｂＡ２）、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ、鎌状赤血球ヘモグロビン）、ヘモグロビン（ＨｂＦ、胎児ヘモグロビン）、ヘモグロビンＭ（ＨｂＭ）、ヘモグロビンＣ（ＨｂＣ）、メトヘモグロビン、カルバミル化ヘモグロビン、アセチル化ヘモグロビン等が挙げられる。ＨｂＡ１ｃとしては、安定型ＨｂＡ１ｃ、不安定型ＨｂＡ１ｃがある。本明細書において「ヘモグロビンの分析」とは、安定型ＨｂＡ１ｃと不安定型ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ０とを分離し安定型ＨｂＡ１ｃ及び/又は不安定型ＨｂＡ１ｃを検出及び／又は測定することを含む。
なお、ヘモグロビンは、酸化の状態及び酸素との結合の有無によって分類される。酸素の結合したヘモグロビンはオキシヘモグロビン又は酸素化ヘモグロビンという。また、酸素と結合していないヘモグロビンはデオキシヘモグロビン又は還元ヘモグロビンという。さらに、ヘモグロビンが酸化され、ヘム部分のＦe原子が３価となり酸素結合力がなくなったヘモグロビンをメトヘモグロビン又は酸化ヘモグロビンという。本明細書において「変性したヘモグロビン」とは、メトヘモグロビンを含む。
［亜硫酸化合物及び亜ジチオン酸化合物］
本明細書において「亜硫酸化合物」は、亜硫酸、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩を含み、塩の形態としては、ナトリウム塩、アンモニウム塩、カリウム塩が含まれる。具体的には、亜硫酸ナトリウム（Na2SO3）、亜硫酸水素ナトリウム（NaHSO3）、二亜硫酸ジナトリウム（ピロ亜硫酸ナトリウム、Na2S2O5）が挙げられる。本明細書において「亜ジチオン酸化合物」は、亜ジチオン酸及び亜ジチオン酸塩を含み、塩の形態としては、ナトリウム塩、アンモニウム塩、カリウム塩が含まれる。具体的には、亜ジチオン酸ナトリウム（Na2S2O4）が挙げられる。
本明細書において「亜硫酸化合物」は、亜硫酸、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩を含み、塩の形態としては、ナトリウム塩、アンモニウム塩、カリウム塩が含まれる。具体的には、亜硫酸ナトリウム（Na2SO3）、亜硫酸水素ナトリウム（NaHSO3）、二亜硫酸ジナトリウム（ピロ亜硫酸ナトリウム、Na2S2O5）が挙げられる。本明細書において「亜ジチオン酸化合物」は、亜ジチオン酸及び亜ジチオン酸塩を含み、塩の形態としては、ナトリウム塩、アンモニウム塩、カリウム塩が含まれる。具体的には、亜ジチオン酸ナトリウム（Na2S2O4）が挙げられる。
［試料、泳動液、移動相］
本明細書において「試料」とは、試料原料から調製したものをいう。試料原料としては、生体試料が挙げられ、好ましくはヘモグロビンを含む試料である。生体試料としては、血液、赤血球成分を含む血液由来物、唾液、髄液等が含まれる。血液としては、生体から採取された血液が挙げられ、好ましくは動物の血液、より好ましくは哺乳類の血液、さらに好ましくはヒトの血液である。赤血球成分を含む血液由来物としては、血液から分離又は調製されたものであって赤血球成分を含むものが挙げられ、例えば、血漿が除かれた血球画分や、血球濃縮物、血液又は血球の凍結乾燥物、全血を溶血処理した溶血試料、遠心分離血液、自然沈降血液などを含む。本明細書において「試料調製液（試料希釈液）」とは、試料原料と混合して試料を調製するために用いるものであって、例えば、試料原料を希釈するためのものを含む。試料中の試料原料濃度（含有量）としては、ヘモグロビンの変性抑制の観点から１〜３０重量％が好ましい。
本明細書において「試料」とは、試料原料から調製したものをいう。試料原料としては、生体試料が挙げられ、好ましくはヘモグロビンを含む試料である。生体試料としては、血液、赤血球成分を含む血液由来物、唾液、髄液等が含まれる。血液としては、生体から採取された血液が挙げられ、好ましくは動物の血液、より好ましくは哺乳類の血液、さらに好ましくはヒトの血液である。赤血球成分を含む血液由来物としては、血液から分離又は調製されたものであって赤血球成分を含むものが挙げられ、例えば、血漿が除かれた血球画分や、血球濃縮物、血液又は血球の凍結乾燥物、全血を溶血処理した溶血試料、遠心分離血液、自然沈降血液などを含む。本明細書において「試料調製液（試料希釈液）」とは、試料原料と混合して試料を調製するために用いるものであって、例えば、試料原料を希釈するためのものを含む。試料中の試料原料濃度（含有量）としては、ヘモグロビンの変性抑制の観点から１〜３０重量％が好ましい。
本明細書において「泳動液」とは、電気泳動法において試料を分離するための流路、担体、空間等に充填又は浸透される液をいう。また、本明細書において「移動相」とは、液体クロマトグラフィーにおいて使用される移動相をいう。
［緩衝剤］
本発明で使用される試料、泳動液、及び移動相は、試料の安定化及びｐＨの変化抑制の点から、緩衝剤を含むことが好ましい。試料、泳動液、及び移動相に含まれる緩衝剤は、一種類でもよく、或いは、複数種類でもよい。緩衝剤としては、緩衝能を有する公知の溶液を用いることができ、具体的には例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸及びその塩類；グリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類；塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等の無機酸及びその塩類等が挙げられる。
本発明で使用される試料、泳動液、及び移動相は、試料の安定化及びｐＨの変化抑制の点から、緩衝剤を含むことが好ましい。試料、泳動液、及び移動相に含まれる緩衝剤は、一種類でもよく、或いは、複数種類でもよい。緩衝剤としては、緩衝能を有する公知の溶液を用いることができ、具体的には例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸及びその塩類；グリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類；塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等の無機酸及びその塩類等が挙げられる。
［ヘモグロビンの分析方法］
本発明の分析方法は、上述のとおり、分離分析方法により試料中のヘモグロビンを分析する方法であって、亜硫酸化合物及び亜ジチオン酸化合物の少なくとも一方の存在下でヘモグロビンを分離することを含む分析方法に関する。「亜硫酸化合物及び亜ジチオン酸化合物の少なくとも一方の存在下でヘモグロビンを分離すること」の一実施形態としては、亜硫酸化合物及び亜ジチオン酸化合物の少なくとも一方を含む泳動液又は移動相を用いて電気泳動法又は液体クロマトグラフィーにてヘモグロビンを分離することが挙げられる。
本発明の分析方法は、上述のとおり、分離分析方法により試料中のヘモグロビンを分析する方法であって、亜硫酸化合物及び亜ジチオン酸化合物の少なくとも一方の存在下でヘモグロビンを分離することを含む分析方法に関する。「亜硫酸化合物及び亜ジチオン酸化合物の少なくとも一方の存在下でヘモグロビンを分離すること」の一実施形態としては、亜硫酸化合物及び亜ジチオン酸化合物の少なくとも一方を含む泳動液又は移動相を用いて電気泳動法又は液体クロマトグラフィーにてヘモグロビンを分離することが挙げられる。
例えば、マイクロチップ化された電気泳動チップ等を用いた電気泳動法においては、ヘモグロビンを分離する工程においてヘモグロビンの周辺温度が３０℃以上、或いは４０℃以上、場合によっては５０℃以上となり、ヘモグロビンが非常に酸化（メト化）しやすい状態となる。また、室温や低温状態にあっても、溶存酸素が存在したり、酸化物質が存在したりする条件下ではヘモグロビンは酸化（メト化）するおそれがある。本発明の分析方法によれば、そのようなヘモグロビンの変性を抑制することができる。
［ｐＨ］
ヘモグロビンを分離する際の泳動液、及び移動相のｐＨは、亜硫酸化合物及び亜ジチオン酸化合物の安定性の観点から６以下が好ましく、５．５以下がより好ましく、５以下がさらに好ましい。また、ヘモグロビンの変性抑制の観点から３以上が好ましく、３．５以上がより好ましく、４以上がさらに好ましい。同様の観点から、試料及び試料調製液のｐＨも同様の範囲であることが好ましい。
ヘモグロビンを分離する際の泳動液、及び移動相のｐＨは、亜硫酸化合物及び亜ジチオン酸化合物の安定性の観点から６以下が好ましく、５．５以下がより好ましく、５以下がさらに好ましい。また、ヘモグロビンの変性抑制の観点から３以上が好ましく、３．５以上がより好ましく、４以上がさらに好ましい。同様の観点から、試料及び試料調製液のｐＨも同様の範囲であることが好ましい。
［濃度］
ヘモグロビンを分離する際の亜硫酸化合物又は亜ジチオン酸化合物の濃度としては、ヘモグロビンの変性を抑制する観点から、０．００１ｍＭ以上が好ましく、０．０１ｍＭ以上がより好ましく、０．１ｍＭ以上がさらに好ましい。とりわけ、ヘモグロビンのメト化を抑制する点から、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、及び二亜硫酸ナトリウムの濃度は０．５ｍＭ以上が好ましく、１ｍＭ以上であることがより好ましく、亜ジチオン酸ナトリウムの濃度は０．２５ｍＭ以上が好ましく、０．５ｍＭ以上がより好ましい。
ヘモグロビンを分離する際の亜硫酸化合物又は亜ジチオン酸化合物の濃度としては、ヘモグロビンの変性を抑制する観点から、０．００１ｍＭ以上が好ましく、０．０１ｍＭ以上がより好ましく、０．１ｍＭ以上がさらに好ましい。とりわけ、ヘモグロビンのメト化を抑制する点から、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、及び二亜硫酸ナトリウムの濃度は０．５ｍＭ以上が好ましく、１ｍＭ以上であることがより好ましく、亜ジチオン酸ナトリウムの濃度は０．２５ｍＭ以上が好ましく、０．５ｍＭ以上がより好ましい。
また、ヘモグロビンをデオキシ化（還元型）とすることなくオキシＨｂの状態を維持しながらヘモグロビンの測定をする観点から、亜硫酸化合物又は亜ジチオン酸化合物の濃度は、２０ｍＭ以下が好ましく、１０ｍＭ以下がより好ましい。具体的には、亜硫酸化合物（亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム）を使用する場合、ヘモグロビンをデオキシ化（還元型）とすることなくオキシＨｂの状態を維持しながらヘモグロビンの測定をする観点から、２０ｍＭ以下が好ましく、１５ｍＭ以下がより好ましく、１０ｍＭ以下がさらに好ましい。とりわけ、二亜硫酸ナトリウムを使用する場合は、同様の観点から、１０ｍＭ以下が好ましく、５ｍＭ以下がより好ましく、２ｍＭ以下がさらに好ましい。また、亜ジチオン酸化合物（亜ジチオン酸ナトリウム）を使用する場合は、同様の観点から、１０ｍＭ以下が好ましく、５ｍＭ以下がより好ましく、２ｍＭ以下がさらに好ましい。
泳動液及び移動相における亜硫酸化合物又は亜ジチオン酸化合物の濃度も、上述の範囲とすることが好ましい。よって、試料を調製する場合にも亜硫酸化合物又は亜ジチオン酸化合物の濃度が上述の範囲とすることができる試料調製液（試料希釈液）を使用することが好ましい。
本発明の分析方法において、ヘモグロビンは、測定誤差を抑制する点から、デオキシＨｂ又はオキシＨｂのいずれか一方の状態で測定することが好ましく、オキシＨｂの状態で測定することが好ましい。
［分光光度計］
本発明の分析方法において、ヘモグロビンの検出及び測定は、ヘモグロビンを簡便に検出できる観点から、分光光度計で吸光度を測定することにより行うことが好ましい。この場合、亜硫酸化合物及び亜ジチオン酸化合物の分解を抑制する観点から、分光光度計の光源から照射される光の波長は、３００ｎｍ以上であることが好ましい。
本発明の分析方法において、ヘモグロビンの検出及び測定は、ヘモグロビンを簡便に検出できる観点から、分光光度計で吸光度を測定することにより行うことが好ましい。この場合、亜硫酸化合物及び亜ジチオン酸化合物の分解を抑制する観点から、分光光度計の光源から照射される光の波長は、３００ｎｍ以上であることが好ましい。
［分析用キット］
本発明はその他の態様において、本発明の分析方法に使用する組成物であって試料調製液、泳動液、又は移動相として使用する亜硫酸化合物又は亜ジチオン酸化合物を含む組成物、及び、前記分析方法が記載された説明書を含む分析用キットに関する。なお、本発明の分析用キットは、説明書が本発明の分析用キットの同梱されることなくウェブ上で提供される場合も含みうる。
本発明はその他の態様において、本発明の分析方法に使用する組成物であって試料調製液、泳動液、又は移動相として使用する亜硫酸化合物又は亜ジチオン酸化合物を含む組成物、及び、前記分析方法が記載された説明書を含む分析用キットに関する。なお、本発明の分析用キットは、説明書が本発明の分析用キットの同梱されることなくウェブ上で提供される場合も含みうる。
本発明の分析用キットにおいて、試料調製液、泳動液、又は移動相は上述のとおりである。また、本発明の分析用キットは、一実施形態として、さらに、電気泳動チップを含むことが好ましい。電気泳動チップは、試料貯留槽、泳動液貯留槽及び流路を含み、試料貯留槽と泳動液貯留槽とが流路により連通している電気泳動チップであることが好ましい。また、電気泳動チップの流路には、上記泳動液が充填されていてもよい。電気泳動チップとしては、例えば、国際公開第２００８／１３６４６５号に記載の電気泳動チップが挙げられる。
以下に、実施例及び比較例を用いて本発明をさらに説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定して解釈されない。
［Ｈｂ変性抑制効果］
下記のように試料原料（全血）から試料を調製し、下記のＨｂ変性検出方法によりＨｂ変性の有無を測定した。
下記のように試料原料（全血）から試料を調製し、下記のＨｂ変性検出方法によりＨｂ変性の有無を測定した。
〔試料の調製方法〕
１００ｍＭリンゴ酸‐アルギニン緩衝液（ｐＨ５．０）１．５ｍＬに添加剤を下記表１の最終濃度となるように添加して試料調製液を調製し、この試料調製液１．４９ｍＬに試料原料である全血を０．０１ｍＬ添加して混合し試料を調製した（実施例１〜８、比較例１〜７）。添加剤として、実施例１及び５には亜硫酸水素ナトリウム（NaHSO3、ナカライテスク社製）、実施例２及び６には亜硫酸ナトリウム（Na2SO3、ナカライテスク社製）、実施例３、７、及び８）には二亜硫酸ジナトリウム（ピロ亜硫酸ナトリウム、Na2S2O5、ナカライテスク社製）、実施例４には亜ジチオン酸ナトリウム（Na2S2O4、ナカライテスク社製）をそれぞれ使用し、比較例２にはベンジルトリメチルアンモニウム（和光純薬社製）、比較例３には還元型グルタチオン（ナカライテスク社製）、比較例４にはＴＡＰＳ−スルホナート（C7H18BrNO2S2、和光純薬社製）、比較例５にはアスコルビン酸（和光純薬社製）、比較例６には硫酸ヒドロキシアミン（ナカライテスク社製）、比較例７には亜硝酸（和光純薬社製）をそれぞれ使用した。なお、比較例１は添加剤を添加しなかった。
１００ｍＭリンゴ酸‐アルギニン緩衝液（ｐＨ５．０）１．５ｍＬに添加剤を下記表１の最終濃度となるように添加して試料調製液を調製し、この試料調製液１．４９ｍＬに試料原料である全血を０．０１ｍＬ添加して混合し試料を調製した（実施例１〜８、比較例１〜７）。添加剤として、実施例１及び５には亜硫酸水素ナトリウム（NaHSO3、ナカライテスク社製）、実施例２及び６には亜硫酸ナトリウム（Na2SO3、ナカライテスク社製）、実施例３、７、及び８）には二亜硫酸ジナトリウム（ピロ亜硫酸ナトリウム、Na2S2O5、ナカライテスク社製）、実施例４には亜ジチオン酸ナトリウム（Na2S2O4、ナカライテスク社製）をそれぞれ使用し、比較例２にはベンジルトリメチルアンモニウム（和光純薬社製）、比較例３には還元型グルタチオン（ナカライテスク社製）、比較例４にはＴＡＰＳ−スルホナート（C7H18BrNO2S2、和光純薬社製）、比較例５にはアスコルビン酸（和光純薬社製）、比較例６には硫酸ヒドロキシアミン（ナカライテスク社製）、比較例７には亜硝酸（和光純薬社製）をそれぞれ使用した。なお、比較例１は添加剤を添加しなかった。
〔Ｈｂ変性の検出〕
上述のように調製した実施例１〜８及び比較例１〜７の試料を５０℃で６０秒間インキュベートし、その前後で４００ｎｍの吸光度を測定し、変化量（６０秒後の吸光度−初期吸光度）を求めた。その結果を下記表１に示す。なお、吸光度の測定は分光光度計（商品名：UV−2400PC、島津製作所社製）を用いて行った。
上述のように調製した実施例１〜８及び比較例１〜７の試料を５０℃で６０秒間インキュベートし、その前後で４００ｎｍの吸光度を測定し、変化量（６０秒後の吸光度−初期吸光度）を求めた。その結果を下記表１に示す。なお、吸光度の測定は分光光度計（商品名：UV−2400PC、島津製作所社製）を用いて行った。
上記表１に示す通り、実施例１〜４の試料では５０℃６０秒間のインキュベーション後でも吸光度の変化がなく、ヘモグロビンの変性が抑制され、オキシヘモグロビンの状態が維持されていた。一方、実施例５〜８では５０℃６０秒後の吸光度が低下しており、ヘモグロビンがデオキシヘモグロビン（還元ヘモグロビン）となっていた。デオキシヘモグロビンは、本来の血中のヘモグロビンの状態とは異なるが、安定であるため、この状態であってもヘモグロビンの分析は可能である。一方、比較例１〜７では５０℃６０秒後の吸光度が上昇しておりヘモグロビンが変性、すなわちメト化（酸化）しており、一部メト化ヘモグロビンの析出も観察された。
［ヘモグロビンの分析］
上記実施例１〜８の試料を下記のマイクロチップ及び下記条件を用いて電気泳動し、試料中のＨｂＡ０、不安定型ＨｂＡ１ｃ及び安定型ＨｂＡ１ｃを検出した。
上記実施例１〜８の試料を下記のマイクロチップ及び下記条件を用いて電気泳動し、試料中のＨｂＡ０、不安定型ＨｂＡ１ｃ及び安定型ＨｂＡ１ｃを検出した。
〔マイクロチップ〕
図１に示す構造を有する電気泳動チップ（ポリメタクリレート製、長さ：７０ｍｍ、幅３０ｍｍ）を用いた。電気泳動チップは、矩形の流路３を有し、流路３の両端にはそれぞれ試料貯留槽２ａ（容積：０．０５ｍＬ）と泳動液貯留槽２ｂ（容積：０．０５ｍＬ）とが形成されている。流路３の長さは４０ｍｍとし、流路３の幅及び深さはそれぞれ４０μｍとした（流路の内径：４０μｍ）。また、試料貯留槽２ａの中心と泳動液貯留槽２ｂの中心との距離は４６ｍｍとした。
図１に示す構造を有する電気泳動チップ（ポリメタクリレート製、長さ：７０ｍｍ、幅３０ｍｍ）を用いた。電気泳動チップは、矩形の流路３を有し、流路３の両端にはそれぞれ試料貯留槽２ａ（容積：０．０５ｍＬ）と泳動液貯留槽２ｂ（容積：０．０５ｍＬ）とが形成されている。流路３の長さは４０ｍｍとし、流路３の幅及び深さはそれぞれ４０μｍとした（流路の内径：４０μｍ）。また、試料貯留槽２ａの中心と泳動液貯留槽２ｂの中心との距離は４６ｍｍとした。
〔泳動液〕
泳動液は、１．０重量％コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム（生化学工業）、１ｍＭ ＮａＮ3、１００ｍＭリンゴ酸‐アルギニン緩衝液（ｐＨ５．０）、２ｍＭプロピオン酸ナトリウム、及び２ｍＭ ＣｙＤＴＡを含む泳動液であって、さらに、実施例１〜８の試料とそれぞれ同じ亜硫酸化合物又は亜ジチオン酸化合物を同じ濃度で含む泳動液を使用した。なお、泳動液は、Ｌ−アルギニンでｐＨ５．０に調整した。
泳動液は、１．０重量％コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム（生化学工業）、１ｍＭ ＮａＮ3、１００ｍＭリンゴ酸‐アルギニン緩衝液（ｐＨ５．０）、２ｍＭプロピオン酸ナトリウム、及び２ｍＭ ＣｙＤＴＡを含む泳動液であって、さらに、実施例１〜８の試料とそれぞれ同じ亜硫酸化合物又は亜ジチオン酸化合物を同じ濃度で含む泳動液を使用した。なお、泳動液は、Ｌ−アルギニンでｐＨ５．０に調整した。
〔電気泳動〕
電気泳動チップの泳動液貯留槽２ｂに泳動液を導入し、毛細管作用により、流路３に泳動液を充填した。ついで、試料貯留槽２ａに試料を導入した。試料貯留槽２ａ及び泳動液貯留槽２ｂのそれぞれに電極を挿入し、挿入した電極に１４００Ｖの電圧を印加して電気泳動を行った。試料貯留槽２ａ側の流路３の端部から２０ｍｍの位置で、４００ｎｍにおける吸光度を測定した。得られたエレクトロフェログラムの一例（実施例１に対応する結果）を図２に示す。また、実施例２〜８の試料を用いた分析結果は、図２と同様の結果であった。
電気泳動チップの泳動液貯留槽２ｂに泳動液を導入し、毛細管作用により、流路３に泳動液を充填した。ついで、試料貯留槽２ａに試料を導入した。試料貯留槽２ａ及び泳動液貯留槽２ｂのそれぞれに電極を挿入し、挿入した電極に１４００Ｖの電圧を印加して電気泳動を行った。試料貯留槽２ａ側の流路３の端部から２０ｍｍの位置で、４００ｎｍにおける吸光度を測定した。得られたエレクトロフェログラムの一例（実施例１に対応する結果）を図２に示す。また、実施例２〜８の試料を用いた分析結果は、図２と同様の結果であった。
図２は、実際に得られたエレクトロフェログラムと、該エレクトロフェログラムを処理して得られた吸光度の変化を示し、Ｘ軸が泳動時間（秒）、Ｙ軸（左側）が実測の吸光度（ｍＡｂｓ）、Ｙ軸（右側）が実測の吸光度を処理して得られた単位時間あたりの吸光度（ｍＡｂｓ／ｓｅｃ）を示す。また、図２において、不安定型Ａ１ｃ、安定型Ａ１ｃ、ＨｂＡ０は、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ０のピークをそれぞれ示す。図２に示すように、実施例１の試料からＨｂＡ１ｃとＨｂＡ０とが明確に分離され、さらに、ＨｂＡ１ｃが不安定型ＨｂＡ１ｃと安定型ＨｂＡ１ｃとに明確に分離された。すなわち、亜硫酸化合物又は亜ジチオン酸化合物が試料や泳動液中に存在しても、マイクロチップを用いた検出方法にネガティブな影響を与えないことが示された。
［溶存酸素除去効果］
１００ｍＭリンゴ酸‐アルギニン緩衝液（ｐＨ５．０）１０ｍＬに添加剤を下記表２の濃度となるように添加して溶液（参考例１〜５）を調製し、３０℃と５０℃とにおける溶存酸素を下記条件で測定した。添加剤として、参考例１には亜硫酸水素ナトリウム（NaHSO3、ナカライテスク社製）、参考例２には亜硫酸ナトリウム（Na2SO3、ナカライテスク社製）、参考例３には二亜硫酸ジナトリウム（ピロ亜硫酸ナトリウム、Na2S2O4、ナカライテスク社製）、参考例４には亜ジチオン酸ナトリウム（Na2S2O4、ナカライテスク社製）をそれぞれ使用した。なお、参考例５には添加剤を添加しなかった。
１００ｍＭリンゴ酸‐アルギニン緩衝液（ｐＨ５．０）１０ｍＬに添加剤を下記表２の濃度となるように添加して溶液（参考例１〜５）を調製し、３０℃と５０℃とにおける溶存酸素を下記条件で測定した。添加剤として、参考例１には亜硫酸水素ナトリウム（NaHSO3、ナカライテスク社製）、参考例２には亜硫酸ナトリウム（Na2SO3、ナカライテスク社製）、参考例３には二亜硫酸ジナトリウム（ピロ亜硫酸ナトリウム、Na2S2O4、ナカライテスク社製）、参考例４には亜ジチオン酸ナトリウム（Na2S2O4、ナカライテスク社製）をそれぞれ使用した。なお、参考例５には添加剤を添加しなかった。
〔溶存酸素の測定方法〕
溶存酸素は血液ガス分析装置（商品名：ABL5 ラジオメータ社製）を用いて測定した。その結果を下記表２に示す。
溶存酸素は血液ガス分析装置（商品名：ABL5 ラジオメータ社製）を用いて測定した。その結果を下記表２に示す。
上記表２に示す通り、亜硫酸化合物の場合、加熱状態において溶存酸素効果が発揮された。また、加熱状態にならないと反応が進まないため、亜硫酸化合物を含む泳動液等は保存可能であることが分かる。一方、亜ジチオン酸化合物は、反応が早く、即座に溶存酸素を排除した。しかし、反応性が早いため、保存する溶液に適用する場合には亜硫酸化合物が好ましいことが分かる。
［亜硫酸化合物及び亜ジチオン酸化合物の濃度と吸光度変化との関係］
亜硫酸化合物及び亜ジチオン酸化合物の添加濃度を下記表３のように変化させたほかは、上記表１の吸光度変化測定と同様の条件で、５０℃６０秒間のインキュベーション後の吸光度の変化量を測定した。その結果を下記表３及び図３に示す。
亜硫酸化合物及び亜ジチオン酸化合物の添加濃度を下記表３のように変化させたほかは、上記表１の吸光度変化測定と同様の条件で、５０℃６０秒間のインキュベーション後の吸光度の変化量を測定した。その結果を下記表３及び図３に示す。
上記表３及び図３に示す通り、亜硫酸化合物及び亜ジチオン酸化合物はそれぞれ、吸光度の変化量をゼロとすること、すなわち、ヘモグロビンの変性を抑制することができた。吸光度の変化量がゼロであった亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムの濃度は１〜１０ｍＭであり、二亜硫酸ナトリウムの濃度は１〜２ｍＭであり、亜ジチオン酸ナトリウムの濃度は０．５〜２ｍＭであった。
本発明の分析方法は、例えば、医療分野、臨床検査の分野、糖尿病の治療／予防分野等の様々な分野に有用である。
２ａ 試料貯留槽
２ｂ 泳動液貯留槽
３ 流路
２ｂ 泳動液貯留槽
３ 流路
Claims (8)
- 分離分析方法により試料中のヘモグロビンを分析する方法であって、亜硫酸化合物及び亜ジチオン酸化合物の少なくとも一方の存在下でヘモグロビンを分離することを含み、
試料、泳動液、又は移動相における亜硫酸化合物又は亜ジチオン酸化合物の濃度は、０．００１ｍＭ以上２０ｍＭ以下である、分析方法。 - 前記分離分析方法が、電気泳動法又は液体クロマトグラフィー法である、請求項１記載の分析方法。
- 分離分析の試料、泳動液、又は移動相のｐＨが、３〜６である、請求項１又は２に記載の分析方法。
- 前記試料、泳動液、又は移動相の亜硫酸化合物又は亜ジチオン酸化合物の濃度が、１０ｍＭ以下である、請求項１から３のいずれかに記載の分析方法。
- ヘモグロビンの検出又は測定を分光光度計で行うことを含む、請求項１から４のいずれかに記載の分析方法。
- 前記分光光度計の光源から照射される光の波長が、３００ｎｍ以上である、請求項５記載の分析方法。
- 分離する工程におけるヘモグロビンの周辺温度が３０℃以上である、請求項１から６のいずれかに記載の分析方法。
- 請求項１から７のいずれかに記載の分析方法に使用する分析用キットであって、試料調製液、泳動液、又は移動相として使用する、亜硫酸化合物又は亜ジチオン酸化合物を含む組成物、及び、前記分析方法が記載された説明書を含む、分析用キット。
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