WO2009153960A1 - 糖鎖付加ｇｌｐ－１ペプチド - Google Patents

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WO2009153960A1
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glycosylated
peptide
sugar chain
xaa
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梶原康宏
辻孝
坂本泉
南部由利
林直宏
石井一之
深江一博
手塚克成
朝井洋明
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大塚化学株式会社
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a glycosylated GLP-1 peptide.
  • GLP-1 (glucagon-like peptide-1) is a peptide of intestinal origin that is deeply involved in the regulation of sugar homeostasis. GLP-1 is synthesized in intestinal L cells by tissue-specific post-translational processing of the glucagon precursor preproglucagon and is released into the circulation in response to a diet. This peptide is the major mediator of the enteroaxial axis and acts by binding to specific receptors.
  • GLP-1 is known to act mainly on the pancreas and promote insulin release by ⁇ cells in a glucose concentration-dependent manner. It has also been suggested that it may suppress glucagon secretion, delay gastric cavitation, and increase peripheral glucose processing.
  • GLP-1 can normalize postprandial glucose levels in non-insulin dependent diabetic patients, suggesting the possibility of GLP-1 as a therapeutic agent.
  • GLP-1 also has the effect of improving glycemic control in insulin dependent diabetic patients.
  • the insulin release promoting action of GLP-1 depends on the plasma glucose concentration, GLP-1 mediated insulin release is low at low plasma glucose concentrations, and there is an advantage that serious hypoglycemia does not occur. Therefore, it is considered that highly safe treatment of diabetes can be achieved by controlling the blood GLP-1 level as necessary.
  • the half-life of GLP-1 in blood is as extremely short as 2 to 6 minutes, and there is a problem that its potential as a therapeutic agent is limited.
  • Patent Document 1 discloses a PEGylated GLP-1 compound comprising a GLP-1 compound conjugated to at least one polyethylene glycol (PEG) molecule.
  • PEG polyethylene glycol
  • each PEG is bound to the GLP-1 compound at the Cys or Lys amino acid or at the carboxy terminal amino acid.
  • the PEGylated GLP-1 compound has an elimination half-life of at least 1 hour.
  • Patent Document 1 a physiologically active peptide with an extended half-life and delayed clearance is obtained as compared to an unPEGylated peptide.
  • PEGylated GLP-1 compounds and compositions also have diabetes, obesity, irritable bowel syndrome, and lower blood glucose, suppress stomach and / or intestinal motility, and It is disclosed that it is useful for treatment of health conditions such as suppressing intestinal excretion or suppressing food intake (eg, Non-Patent Document 1).
  • Non-patent Document 1 Since PEG is a compound that is not metabolized in vivo, if PEGylated GLP-1 compound is continuously administered, PEG accumulates in the body and there is a risk of causing harm to the body (Non-patent Document 1). .
  • Patent Documents 3 and 4 describe a method of introducing a glycosylated amino acid at positions 26, 34, and / or 37 of GLP-1, but the type of sugar chain and the position at which the sugar chain is added are described. However, it is not necessarily optimized.
  • Patent Document 4 describes a method of binding a modified hyaluronic acid having a molecular weight of about 200 KDa to a GLP-1 analog.
  • exendin-4 (exendin-4) discovered from saliva of lizard (Heloderma) as a compound having a structure similar to GLP-1, similar activity, and high blood stability (non-patent) Although literature 2) is marketed in the United States, exendin-4 is a non-human sequence, and there is concern over the emergence of neutralizing antibodies due to long-term administration and the accompanying decrease in drug efficacy (Non-patent documents 3 to 5).
  • Patent Document 2 A method for obtaining a glycopeptide having a constant composition has also been tried (Patent Document 2), but it cannot be said to be a sufficient production method from the viewpoint of simplicity and mass production, and in particular, a long sugar chain existing in a living body. Is not a practical manufacturing method.
  • Special table 2006-520818 Table 2005-095331 Reissue 2006-095775 International Publication No. 2007/063907 Pamphlet Toxicological Science, 42, 152-157 (1998). J Biol Chem. 267, 402-5 (1992) Vascular Health and Risk Management 2, 69-77 (2006) JAMA. 298, 194-206 (2007) Endocrine Reviews 28, 187-218 (2007)
  • An object of the present invention is to provide a glycosylated GLP-1 peptide that has increased blood stability compared to GLP-1, and more preferably exhibits high blood glucose level inhibitory activity.
  • the present invention may have the following features. That is, the present invention provides (a) GLP-1; (B) a peptide in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in GLP-1; or (C) an analog of GLP-1; And a glycosylated GLP-1 peptide having GLP-1 activity, wherein at least two amino acids are substituted with glycosylated amino acids.
  • the present invention also provides: (A) GLP-1; or (B) a peptide in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in GLP-1, and which has GLP-1 activity; And a glycosylated GLP-1 peptide having GLP-1 activity, wherein at least two amino acids are substituted with glycosylated amino acids.
  • GLP-1 is a glycosylated GLP-1 peptide in which two or more amino acids are substituted with glycosylated amino acids, and at least one substitution site is 18, 20, 22, 26, 30, 34 Or a glycosylated GLP-1 peptide at position 36; or (B) a glycosylated GLP-1 peptide in which one or several amino acids other than the glycosylated amino acid are deleted, substituted or added in the glycosylated GLP-1 peptide defined in (a); And can be a glycosylated GLP-1 peptide having GLP-1 activity.
  • GLP-1 is a glycosylated GLP-1 peptide in which two or more amino acids are substituted with a glycosylated amino acid, and each substitution site is 18, 20, 22, 26, 30, 34 or 36
  • the glycosylated amino acid may preferably be glycosylated Asn or glycosylated Cys in some embodiments, but is not limited thereto.
  • the plurality of glycosylated amino acids bonded to the glycosylated GLP-1 peptide may be the same or different in the type of sugar chain or amino acid.
  • the sugar chain and the amino acid can be bound via a linker or can be bound without a linker. In some embodiments, it is preferably linked (directly) without a linker.
  • the sugar chain is a sugar chain composed of 4 or more sugars. Further, in some embodiments, a sugar chain consisting of 5 to 11 sugars may be preferable.
  • the sugar chain is preferably a double-stranded complex type sugar chain depending on the embodiment.
  • the sugar chain is preferably selected from the group consisting of a disialo sugar chain, a monosialo sugar chain, an asialo sugar chain, a diglucnac sugar chain, and a dimannose sugar chain, but is not limited thereto.
  • the sugar chain may be a sugar chain represented by the following formula in some embodiments, but is not limited thereto.
  • R 1 and R 2 are the same or different, Indicates.
  • Ac represents an acetyl group.
  • the present invention may be a glycosylated GLP-1 peptide in which at least one amino acid is substituted with a glycosylated amino acid and the sugar chain is oligohyaluronic acid.
  • oligohyaluronic acid include sugar chains of 2 units (4 sugars) or more and 8 units or less when the unit consisting of N-acetylglucosamine and glucuronic acid is 1 unit. Sugar) or 4 units (8 sugars).
  • the present invention may also be a glycosylated GLP-1 peptide in which a sugar chain is bound to at least one amino acid via a linker.
  • the amino acid of the GLP-1 peptide to which the linker is bound include Lys.
  • the linker may contain an amino acid at the end on the sugar chain side.
  • Asn can be mentioned, for example.
  • the sugar chains are preferably substantially uniform, for example, preferably 90% or more, or 99% or more.
  • glycosylated GLP-1 peptide of the present invention preferably has increased blood stability compared to GLP-1.
  • glycosylated GLP-1 peptide of the present invention is preferably 5 times or more, more preferably 10 times or more, more preferably 20 times or more of OGTT (Oral Glucose Tolerance Test) compared with GLP-1. May have activity.
  • OGTT Oral Glucose Tolerance Test
  • the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention may have a DPP-IV resistance that is preferably 20 times or more, more preferably 30 times or more, and even more preferably 50 times or more compared to GLP-1.
  • glycosylated GLP-1 peptide of the present invention can be used for medical purposes as a novel active ingredient.
  • Such medical uses include the treatment or prevention of diseases associated with GLP-1.
  • a typical example of such a disease is, for example, diabetes.
  • any combination of one or more of the above-described features of the present invention is also a glycosylated GLP-1 peptide of the present invention.
  • the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention has increased blood stability compared to GLP-1, and in one embodiment of the present invention, the glycosylated GLP-1 peptide has a blood glucose level inhibitory activity compared to GLP-1. It is increasing. Therefore, the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention can reduce the dose and frequency of administration compared to GLP-1.
  • the sugar chain added to the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention is easily decomposed in the living body, its accumulation does not cause phytotoxicity to the living body.
  • a part or all of the sugar chain added to the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention is a sugar chain existing in a living body such as mammals including humans and birds, or a modified form thereof, and is administered into the body. Even so, it is unlikely to show side effects or antigenicity. There are few concerns about allergic reactions, antibody production, and inability to obtain medicinal effects.
  • FIG. 1 shows an increase in blood glucose level due to administration of a glycosylated GLP-1 peptide (GLP-1 at positions 26 and 34, Cys-disialoglycosylated GLP-1 or 18, Cys-disialoglycosylated GLP-1 at position 36) or GLP-1.
  • GLP-1 glycosylated GLP-1 peptide
  • OGTT oral glucose tolerance test
  • glycosylated GLP-1 peptide 22-position, 30-position Cys disialo-glycosylated GLP-1, 22-position, 36-position Cys-disialo-glycosylated GLP-1 or 30-position, 36-position Cys-disialo-glycosylated
  • OGTT oral glucose tolerance test
  • FIG. 3 shows the effect of suppressing the increase in blood glucose level by administration of a glycosylated GLP-1 peptide (position 36 Cys-hyaluronic acid tetrasaccharide added GLP-1 or position 36 Cys-hyaluronic acid octasaccharide added GLP-1) or GLP-1.
  • OGTT oral glucose tolerance test
  • FIG. 4 shows the results of measuring the inhibitory effect on the increase in blood glucose level by the administration of glycosylated GLP-1 peptide (position 26 Lys-asialoglycan Asn linker-modified GLP-1) or GLP-1 by oral glucose tolerance test (OGTT). Indicates.
  • the 26th position Lys-asialo sugar chain Asn linker-modified GLP-1 and GLP-1 were administered at 9 nmol / kg.
  • FIG. 5 shows the results of an oral glucose tolerance test (OGTT) conducted to examine the effect of the dose of glycosylated GLP-1 peptide on the blood glucose level increase inhibitory effect.
  • OGTT oral glucose tolerance test
  • GLP-1 refers to glucagon-like peptide-1 and refers to GLP-1 (7-37).
  • GLP-1 (7-37) has the following amino acid sequence. His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp- Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (SEQ ID NO: 2)
  • an analog of GLP-1 means a peptide structurally similar to GLP-1 and / or a peptide having a structure overlapping with GLP-1, such as: 1 or several amino acids in GLP-1 A peptide in which one or several amino acids of GLP-1 are conservatively substituted; a GLP-1 variant; a GLP-1 having GLP-1 activity Fragments; extended GLP-1 having GLP-1 activity; and exendin-4 (hereinafter sometimes referred to as “Ex-4”) and analogs thereof (Curr. Opin. Investig. Drugs 8, 842-8 (2007), J. Pharmacol.Exp.Ther.307, 490-496 (2003), Di. betes 50,2530-9 (2001), etc.).
  • amino acid is used in its broadest sense and includes not only natural amino acids but also non-natural amino acids such as amino acid variants and derivatives.
  • amino acids herein, for example, natural proteogenic L-amino acids; D-amino acids; chemically modified amino acids such as amino acid variants and derivatives; norleucine, It will be understood that natural non-proteogenic amino acids such as ⁇ -alanine, ornithine; and chemically synthesized compounds having properties known in the art that are characteristic of amino acids.
  • unnatural amino acids examples include ⁇ -methyl amino acids (such as ⁇ -methylalanine), D-amino acids, histidine-like amino acids (2-amino-histidine, ⁇ -hydroxy-histidine, homohistidine, ⁇ -fluoromethyl-histidine and ⁇ -Methyl-histidine, etc.), amino acids with extra methylene in the side chain (“homo" amino acids) and amino acids in which the carboxylic acid functional amino acids in the side chain are replaced with sulfonic acid groups (such as cysteic acid).
  • GLP-1 analogs with GLP-1 activity are known to contain unnatural amino acids.
  • the amino acid contained in the compound of the present invention consists only of natural amino acids.
  • the number of substituted amino acids is not particularly limited as long as it retains GLP-1 activity.
  • the amino acid to be substituted or added can be a natural amino acid, a non-natural amino acid or an amino acid analog, and is preferably a natural amino acid.
  • GLP-1 peptides in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added include, for example, Ala at position 8 and Gly at position 35, the unnatural amino acid ⁇ -methylalanine (aminoisobutanoic acid).
  • BIM51077 (Curr. Opin. Investig. Drugs 8, 842-8 (2007)) in which Gly at position 37 is deleted and Arg at position 36 is amidated.
  • one or several amino acids of an amino acid are conservatively substituted means that the hydrophilicity index and / or hydrophobicity index of the amino acid substituted with the original amino acid in amino acid substitution is Similar substitutions that refer to substitutions that do not cause a clear decrease or disappearance of GLP-1 activity before and after such substitution.
  • GLP-1 variant is a compound obtained by natural or artificial modification of GLP-1, and examples of such modifications include residues of one or more amino acids of GLP-1. Examples include alkylation, acylation (for example, acetylation), amidation, carboxylation, ester formation, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, phosphorylation, hydroxylation, label component coupling, and the like.
  • a fragment of GLP-1 having GLP-1 activity means that one or more amino acids have been deleted from the N-terminus and / or C-terminus of GLP-1, and GLP-1 It is a peptide that maintains its activity.
  • extended GLP-1 having GLP-1 activity means that one or more amino acids are added to the N-terminus and / or C-terminus of GLP-1 and GLP-1 activity is increased. Maintained peptides (see, eg, Endocrinology, 125, 3109-14 (1989)).
  • a peptide in which one or several amino acids are further added to the C-terminus (position 37) of GLP-1 is referred to as 38 in order from the amino acid added to the C-terminus of GLP-1.
  • the amino acid at the position, the amino acid at the 39th position, etc., and “the peptide in which one or several amino acids are further added to the N-terminus (position 7) of GLP-1” In order from the amino acid added to the N-terminal, the amino acid at the 6th position, the amino acid at the 5th position, etc. shall be called.
  • a peptide in which one amino acid is further added to the C-terminus of GLP-1 (position 37) includes a peptide in which Asn or Cys is bound to Gly at position 37 of GLP-1.
  • glycosylated GLP-1 peptide of the present invention is characterized in that at least one amino acid is substituted with a glycosylated amino acid.
  • “glycosylated GLP-1 peptide” means a peptide in which at least one amino acid of GLP-1 is substituted with a glycosylated amino acid, and at least one amino acid in the above GLP-1 analog. Including a peptide substituted with a glycosylated amino acid, and each glycosylated GLP-1 peptide even if one or several amino acids other than the glycosylated amino acid are deleted, substituted or added include.
  • Peptides in which the C-terminus of these peptides is amidated for example, His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala -Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH 2 (SEQ ID NO: 3) at least one of GLP-1 (7-36) NH 2
  • a peptide in which one amino acid is substituted with a glycosylated amino acid is also included in the glycosylated GLP-1 peptide. Further, salts of these peptides are also included in the glycosylated GLP-1 peptide.
  • the salt may be either an acid addition salt or a base addition salt.
  • Acids commonly used to form acid addition salts include inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and p-toluenesulfonic acid, methanesulfonic acid, oxalic acid, p- Organic acids such as bromophenyl sulfonic acid, carboxylic acid, succinic acid, citric acid, benzoic acid and acetic acid.
  • Base addition salts include salts derived from inorganic bases such as ammonium hydroxide or alkali or alkaline earth metal hydroxides, carbonates, bicarbonates and the like. In particular, a pharmaceutically acceptable salt is preferable.
  • the “glycosylated amino acid” is an amino acid to which a sugar chain is bound, and the sugar chain and the amino acid may be bound via a linker.
  • the amino acid is bound to the reducing end of the sugar chain.
  • the type of amino acid to which the sugar chain is bound and either a natural amino acid or a non-natural amino acid can be used.
  • the glycosylated amino acid has the same or similar structure as that present as a glycopeptide (glycoprotein) in the living body
  • the glycosylated amino acid is a glycosylated Asn such as an N-linked sugar chain.
  • Glycosylated Ser such as O-linked glycan and Thrylated Thr are preferred, and Glycylated Asn is particularly preferred.
  • the amino acid of the sugar chain-added amino acid has two or more amino acids in the molecule such as aspartic acid and glutamic acid.
  • Amino acids with carboxyl groups, lysine, arginine, histidine, tryptophan, etc. amino acids with two or more amino groups in the molecule, amino acids with hydroxyl groups in molecules such as serine, threonine, tyrosine, and thiol groups in molecules such as cysteine
  • amino acids having an amide group in the molecule such as asparagine and glutamine.
  • aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, serine, threonine, cysteine, asparagine, and glutamine are preferable.
  • glycosylated GLP-1 peptide of the present invention when the sugar chain structure, the structure other than the sugar chain, the sugar chain addition site and the number of sugar chains added are the same, the glycosylated amino acid is There is no significant difference between the glycosylated Asn (not via the linker) and the glycosylated Cys (via the linker) in the activity of inhibiting the increase in blood glucose level of the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention.
  • the linker when the sugar chain and the amino acid on the GLP-1 skeleton are bonded via a linker, the linker preferably includes an amino acid at the sugar chain side end.
  • the type of amino acid is not particularly limited, but a preferred example is Asn.
  • glycosylated amino acid of the glycosylated GLP-1 peptide when the sugar chain and the amino acid are bound via a linker, compared to when the sugar chain and the amino acid are bound via a linker.
  • the antigenicity of the glycosylated GLP-1 peptide can be reduced.
  • the glycosylated amino acid of the glycosylated GLP-1 peptide when the sugar chain and the amino acid are bound via a linker, compared to when the sugar chain and the amino acid are bound without a linker.
  • the blood stability of the glycosylated GLP-1 peptide can be increased.
  • glycosylated GLP-1 peptide of the present invention is limited by its description (for example, the description “glycosylated GLP-1 peptide in which an amino acid is substituted with a glycosylated amino acid”). Rather, any glycosylated GLP-1 peptide produced by any of methods A to C described below is included in the “glycosylated GLP-1 peptide in which an amino acid is substituted with a glycosylated amino acid”. It is.
  • a sugar chain-added GLP-1 peptide in which a sugar chain to which no amino acid is bonded is bonded to an amino acid on the peptide directly or via a linker Glycosylated GLP-1 peptide obtained by extending a sugar chain already added by adding a sugar or sugar chain; one or several amino acids are bonded to the amino group and / or carboxyl group of the glycosylated amino acid
  • a glycosylated GLP-1 peptide in which this is linked to one or a plurality of GLP-1 fragments; a glycosylated GLP-1 peptide in which a sugar chain to which an amino acid is bound is bound to an amino acid on the peptide via a linker Are included in the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention as long as the final structure is consistent.
  • the number of amino acids in GLP-1 to be substituted with glycosylated amino acids depends on the physiological activity such as blood stability and blood glucose level inhibitory activity, the number of amino acids present in the final glycosylated GLP-1 peptide, and glycosylation. What is necessary is just to adjust suitably according to the molecular weight etc. of the sugar chain addition GLP-1 peptide before and behind.
  • 1 to 5 are preferably substituted, and 1 to 3 are more preferably substituted.
  • two or more are preferably substituted, for example, 2 to 5 are preferably substituted, and 2 to 3 are more preferably substituted. From the standpoint of simplicity, it may be preferable to select one substitution if the desired activity is obtained with one substitution.
  • glycosylated GLP-1 peptide in which one amino acid of GLP-1 is substituted with a glycosylated amino acid, when one or more amino acids other than the glycosylated amino acid are further substituted with a glycosylated amino acid, The blood stability increases and the blood glucose level inhibitory activity tends to decrease (however, the increased blood stability can compensate for the decreased blood glucose level inhibitory activity).
  • the site where an amino acid is substituted with a glycosylated amino acid can be appropriately adjusted depending on blood stability and blood glucose level inhibitory activity.
  • the site for substituting an amino acid with a glycosylated amino acid can be selected from any site of GLP-1 from the viewpoint of blood stability of the glycosylated GLP-1 peptide,
  • substitution of an amino acid at a site near the N-terminus of GLP-1 is also preferred.
  • substitution at positions 18 and 36 substitution at positions 26 and 34, substitution at positions 22 and 30 of GLP-1 , substitution at positions 22 and 36, substitution at positions 30 and 36, and the like.
  • the site at which an amino acid is substituted with a glycosylated amino acid is, for example, 18, 20, 22, 26, 30 of GLP-1 from the viewpoint of the blood glucose level inhibitory action of the glycosylated GLP-1 peptide.
  • 34, 36 and 38 addition of a glycosylated amino acid to the 37th amino acid, preferably one or more selected from positions 18, 26, 30, 34 and 36 In particular, one or more sites selected from positions 30 and 36.
  • substitution of GLP-1 at positions 18 and 36 from the viewpoint of blood glucose level inhibitory action of glycosylated GLP-1 peptide for example, substitution of GLP-1 at positions 18 and 36 from the viewpoint of blood glucose level inhibitory action of glycosylated GLP-1 peptide , Substitution at positions 26 and 34, substitution at positions 22 and 30, substitution at positions 22 and 36, substitution at positions 30 and 36, and the like.
  • the site at which an amino acid is substituted with a glycosylated amino acid is preferably 22, 26, 27, from the viewpoint of the ability to synthesize cAMP among the GLP-1 activities of the glycosylated GLP-1 peptide.
  • the site at which an amino acid is substituted with a glycosylated amino acid is one or more sites selected from sites other than positions 8, 9 and 12 of GLP-1. In one embodiment of the present invention, the site at which an amino acid is substituted with a glycosylated amino acid is one or more sites selected from sites other than positions 7, 10, 13, 15, 19, 21, 28, and 29 of GLP-1. In particular, one or more sites selected from sites other than positions 7, 10, 15 and 28.
  • the site at which an amino acid is substituted with a glycosylated amino acid can also be determined from the binding site of GLP-1 to the GLP-1 receptor.
  • any combination of the above can be adopted as the site where amino acids are substituted with glycosylated amino acids. It is not limited. For example, a combination in which one site is selected from the preferred sites and the other site is selected from any site of GLP-1; one site is selected from the preferred sites and the other site is GLP-1 Combinations selected from arbitrary sites of one or several amino acids further added to the C-terminus (position 37) of the present invention are also included in a preferred embodiment of the present invention.
  • deletion, substitution or addition of one or several amino acids of amino acids other than glycosylated amino acids in GLP-1 Substitution of Ala at position 8 with any one amino acid of the group consisting of Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp and Lys; Glu at position 9 is replaced with any one amino acid of the group consisting of Asp and Lys; Substitution of Thr at position 11 with any one amino acid of the group consisting of Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp and Lys; Substitution of Phe at position 12 with any one amino acid of the group consisting of Trp and Tyr; Thr at position 13 replaced with Ser; Ser at position 14 is substituted with any one amino acid of the group consisting of Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp and Lys; Asp at position 15 replaced with Glu; Val at position 16 is substituted with any one amino acid of the group consisting of Phe
  • the site where deletion, substitution or addition of amino acids other than glycosylated amino acids occurs is from sites other than positions 7, 10, 13, 15, 19, 21, 28 and 29 of GLP-1.
  • One or more sites selected, for example, one or more sites selected from sites other than positions 7, 10, 15 and 28 are preferred (Structure-Activity Studies of Glucagon-like Peptide-l, THE JOURNAL OF. BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.269, No. 9, Issue of March 4, pp. 6276-6278.1994).
  • glycosylated GLP-1 peptide of the present invention examples include: General formula (1) His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa 18 -Xaa 19 -Leu-Glu-Xaa 22 -Gln-Ala-Ala-Xaa 26 -Glu-Phe-Ile- Xaa 30 -Trp-Leu-Val-Xaa 34 -Gly-Xaa 36 -Xaa 37 [Wherein Xaa 18 represents Ser, glycosylated Cys, or glycosylated Asn. Xaa 19 represents Tyr, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 22 represents Gly, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 26 represents Lys, sugar chain addition Cys, sugar chain addition Asn, or sugar chain addition Lys.
  • Xaa 30 represents Ala, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 34 represents Lys, sugar chain addition Cys, sugar chain addition Asn, or sugar chain addition Lys.
  • Xaa 36 represents Arg, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 37 represents Gly, NH 2 , Gly-glycosylated Cys or Gly-glycosylated Asn.
  • Xaa 18 is Ser
  • Xaa 19 is Tyr
  • Xaa 22 is Gly
  • Xaa 26 is Lys
  • Xaa 30 is Ala
  • Xaa 34 is Lys
  • Xaa 36 is Arg
  • Xaa 37 represents Gly-glycosylated Cys or Gly-glycosylated Asn.
  • each of the sugar chain addition Cys, the sugar chain addition Asn, and the sugar chain addition Lys may include a linker between the sugar chain and the amino acid.
  • the peptide represented by the general formula (1) is represented by SEQ ID NO: 1.
  • glycosylated GLP-1 peptide of the present invention for example, (A1) In the general formula (1), Xaa 18 represents glycosylated Cys, Xaa 19 represents Tyr, Xaa 22 represents Gly, Xaa 26 represents Lys, Xaa 30 represents Ala, and Xaa 34 Represents Lys, Xaa 36 represents Arg, and Xaa 37 represents Gly (SEQ ID NO: 4); (A2) In the general formula (1), Xaa 18 represents Ser, Xaa 19 represents Tyr, Xaa 22 represents glycosylated Cys, Xaa 26 represents Lys, Xaa 30 represents Ala, and Xaa 34 A peptide in which Xaa represents Lys, Xaa 36 represents Arg, and Xaa 37 represents Gly (SEQ ID NO: 5); (A3) In the general formula (1), Xaa 18 represents Ser, Xaa 19 represents Tyr, Xaa 22 represents Gly, Xa
  • a peptide wherein Xaa 36 represents glycosylated Cys and Xaa 37 represents Gly (SEQ ID NO: 9); (A7) In the general formula (1), Xaa 18 represents Ser, Xaa 19 represents Tyr, Xaa 22 represents Gly, Xaa 26 represents Lys, Xaa 30 represents Ala, and Xaa 34 represents Lys.
  • a peptide wherein Xaa 36 indicates glycosylated Asn and Xaa 37 indicates Gly (SEQ ID NO: 17); (A15)
  • Xaa 18 represents Ser
  • Xaa 19 represents Tyr
  • Xaa 22 represents Gly
  • Xaa 26 represents Lys
  • Xaa 30 represents Ala
  • Xaa 34 represents Lys.
  • Xaa 18 represents Ser
  • Xaa 19 represents Tyr
  • Xaa 22 represents Gly
  • Xaa 26 represents Lys
  • Xaa 30 represents Ala
  • Xaa 34 represents Lys.
  • Peptide (SEQ ID NO: 31) showing additional Asn, Xaa 36 showing Arg and Xaa 37 showing NH 2 ; (A29)
  • Xaa 18 represents Ser
  • Xaa 19 represents Tyr
  • Xaa 22 represents Gly
  • Xaa 26 represents Lys
  • Xaa 30 represents Ala
  • Xaa 34 represents Lys.
  • the sugar chain is preferably, for example, oligohyaluronic acid or a high mannose sugar chain.
  • the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention includes (A31) In the general formula (1), Xaa 18 represents Ser, Xaa 19 represents Tyr, Xaa 22 represents Gly, Xaa 26 represents glycosylated Lys, Xaa 30 represents Ala, and Xaa 34 Is a peptide in which Xaa 36 is Arg and Xaa 37 is Gly (SEQ ID NO: 34); or (a32) in the general formula (1), Xaa 18 indicates Ser, and Xaa 19 indicates Tyr.
  • Xaa 22 indicates Gly
  • Xaa 26 indicates Lys
  • Xaa 30 indicates Ala
  • Xaa 34 indicates glycosylated Lys
  • Xaa 36 indicates Arg
  • Xaa 37 indicates Gly (SEQ ID NO: 35).
  • the sugar chain and Lys in the glycosylated Lys are bonded via a linker.
  • the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention includes (A33) In the general formula (1), Xaa 18 represents glycosylated Cys, Xaa 19 represents Tyr, Xaa 22 represents Gly, Xaa 26 represents Lys, Xaa 30 represents Ala, and Xaa 34 Represents Lys, Xaa 36 represents glycosylated Cys, and Xaa 37 represents Gly (SEQ ID NO: 36); (A34) In the general formula (1), Xaa 18 represents Ser, Xaa 19 represents Tyr, Xaa 22 represents glycosylated Cys, Xaa 26 represents Lys, and Xaa 30 represents glycosylated Cys.
  • Xaa 34 represents Lys, Xaa 36 represents Arg, and Xaa 37 represents Gly (SEQ ID NO: 37);
  • Xaa 18 represents Ser, Xaa 19 represents Tyr, Xaa 22 represents glycosylated Cys, Xaa 26 represents Lys, Xaa 30 represents Ala, and Xaa 34 Represents Lys, Xaa 36 represents glycosylated Cys, and Xaa 37 represents Gly (SEQ ID NO: 38);
  • A36 In the general formula (1), Xaa 18 represents Ser, Xaa 19 represents Tyr, Xaa 22 represents Gly, Xaa 26 represents glycosylated Cys, Xaa 30 represents Ala, and Xaa 34 Represents a glycosylated Cys, Xaa 36 represents Arg, and Xaa 37 represents Gly (SEQ ID NO: 39);
  • Xaaa 18 represents Ser, Xaa 19 represents Tyr, Xaa
  • Xaa 34 represents Lys, Xaa 36 represents Arg, and Xaa 37 represents Gly (SEQ ID NO: 42);
  • Xaa 18 represents Ser, Xaa 19 represents Tyr, Xaa 22 represents glycosylated Asn, Xaa 26 represents Lys, Xaa 30 represents Ala, and Xaa 34 Represents Lys, Xaa 36 represents glycosylated Asn, and Xaa 37 represents Gly (SEQ ID NO: 43);
  • Xaa 18 represents Ser, Xaa 19 represents Tyr, Xaa 22 represents Gly, Xaa 26 represents glycosylated Asn, Xaa 30 represents Ala, and Xaa 34 Represents a glycosylated Asn, Xaa 36 represents Arg, and Xaa 37 represents Gly (SEQ ID NO: 44);
  • Xaa 18 represents Ser, Xaa 19 represents Tyr, Xaa 22 represents Gly, Xaa
  • the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention includes (A43) In the general formula (1), Xaa 18 represents glycosylated Cys, Xaa 19 represents Tyr, Xaa 22 represents glycosylated Cys, Xaa 26 represents Lys, and Xaa 30 represents Ala.
  • Xaa 34 represents Lys
  • Xaa 36 represents Arg
  • Xaa 37 represents Gly-glycosylated Cys (SEQ ID NO: 46);
  • Xaa 18 represents glycosylated Cys
  • Xaa 19 represents Tyr
  • Xaa 22 represents glycosylated Cys
  • Xaa 26 represents glycosylated Cys
  • Xaa 30 represents A peptide indicating Ala
  • Xaa 34 indicating Lys
  • Xaa 36 indicating Arg
  • Xaa 37 indicating Gly (SEQ ID NO: 47);
  • Xaa 18 represents Ser
  • Xaa 19 represents Tyr
  • Xaa 22 represents Gly
  • Xaa 26 represents glycosylated Asn
  • Xaa 30 represents Ala
  • Xaa 36 represents glycosylated Asn
  • Xaa 37 represents Gly-glycosylated Cys
  • examples of the glycosylated GLP-1 peptide analog of the present invention include those obtained by adding a sugar chain to exendin-4 having the following amino acid sequence.
  • Glycosylated exendin-4 is represented, for example, by the following general formula (2).
  • Xaa 14 represents Met, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 16 represents Glu, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 20 represents Arg, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 24 represents Glu, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 28 represents Asn, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 30 represents Gly, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • At least one of Xaa 12 , Xaa 14 , Xaa 16 , Xaa 20 , Xaa 24 , Xaa 28 and Xaa 30 is glycosylated Cys or glycosylated Asn. ] (SEQ ID NO: 51)
  • Xaa 24 and / or Xaa 30 are preferably glycosylated Cys or glycosylated Asn, and in particular, Xaa 30 is preferably glycosylated Cys.
  • BIM51077 having the following amino acid sequence: And those having a sugar chain added thereto. His-R2-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp- Leu-Val-Lys-R2-Arg-NH 2 [Wherein R2 represents ⁇ -methylalanine.
  • Sugar chain addition BIM51077 is represented by the following general formula (3), for example.
  • General formula (3) His-R2-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa 18 -Tyr-Xaa 20 -Glu-Xaa 22 -Gln-Ala-Ala-Xaa 26 -Glu-Phe-Ile- Xaa 30 -Trp-Leu-Val-Xaa 34 -R2-Xaa 36 -NH 2 [Wherein R2 represents ⁇ -methylalanine, Xaa 18 represents Ser, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 20 represents Leu, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 22 represents Gly, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 26 represents Lys, sugar chain addition Cys, sugar chain addition Asn, or sugar chain addition Lys.
  • Xaa 30 represents Ala, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 34 represents Lys, sugar chain addition Cys, sugar chain addition Asn, or sugar chain addition Lys.
  • Xaa 36 represents Arg, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • At least one of Xaa 18 , Xaa 20 , Xaa 22 , Xaa 26 , Xaa 30 , Xaa 34 and Xaa 36 is glycosylated Cys or glycosylated Asn. ] (SEQ ID NO: 53)
  • exendin-4 and BIM51077 peptides that are originally amidated at the C-terminus do not amidate the C-terminus when synthesizing a glycosylated amino acid in which a sugar chain is added to the C-terminal amino acid. In some cases.
  • sugar chain refers to a compound in which one or more unit sugars (monosaccharides and / or derivatives thereof) are connected. When two or more unit sugars are connected, each unit sugar is bound by dehydration condensation by a glycosidic bond.
  • sugar chains include monosaccharides and polysaccharides (glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, sialic acid, and complexes thereof contained in the living body.
  • sugar chains that are decomposed or derived from complex biomolecules such as degraded polysaccharides, glycoproteins, proteoglycans, glycosaminoglycans, glycolipids, and the like, but are not limited thereto.
  • the sugar chain may be linear or branched.
  • sugar chain also includes sugar chain derivatives.
  • sugar chain derivatives include sugars having a carboxyl group (for example, C-1 Oxidized aldonic acid converted to carboxylic acid (for example, D-gluconic acid oxidized D-glucose), uronic acid whose terminal C atom became carboxylic acid (D-glucose oxidized D-glucose) Glucuronic acid)), sugars having amino groups or amino group derivatives (eg acetylated amino groups) (eg N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl-D-galactosamine etc.), amino groups and carboxyls Sugars having both groups (eg, N-acetylneuraminic acid (sialic acid), N-acetylmuramic acid, etc.), deoxygenated sugars (eg, 2-deoxy-D-ribo Scan), sulfated sugar including a sulfuric acid group, including but sugar chains
  • a preferred sugar chain when a preferred sugar chain is added to GLP-1 (when it is substituted with an amino acid of GLP-1 in the form of a glycosylated amino acid), it increases the blood stability of GLP-1. And more preferably, it is a sugar chain that does not lose its blood glucose level inhibitory activity. In one embodiment of the present invention, when a preferred sugar chain is added to GLP-1 (when it is substituted with an amino acid of GLP-1 in the form of a glycosylated amino acid), the blood sugar level inhibitory activity of GLP-1 is exhibited. It is a sugar chain to increase.
  • the sugar chain in the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention is not particularly limited, and may be a sugar chain that exists as a complex carbohydrate (glycopeptide (or glycoprotein), proteoglycan, glycolipid, etc.) in vivo. However, it may be a sugar chain that does not exist as a complex carbohydrate in vivo.
  • a sugar chain that exists as a complex carbohydrate in vivo is preferable from the viewpoint that the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention is administered to the living body.
  • sugar chains include N-linked sugar chains and O-linked sugar chains that are sugar chains bound to peptides (or proteins) as glycopeptides (or glycoproteins) in vivo.
  • an N-linked sugar chain is used.
  • the N-linked sugar chain include a high mannose type, a complex type, and a hybrid type, and a complex type is particularly preferable.
  • GLP-1 in the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention, even if the sugar chain is a sugar chain that exists as a complex carbohydrate in vivo, GLP-1 can be obtained by a method other than the O-linked type and the N-linked type. It may be bound to a peptide. For example, as described above, those having a sugar chain bound to Cys or Lys via a linker are also included in the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention.
  • the sugar chain is a relatively low molecular weight glycosaminoglycan containing hyaluronic acid, chondroitin, chondroitin sulfate A to C, heparin, heparan sulfate, and keratan sulfate.
  • these sugar chains repeating disaccharide units composed of amino sugar (N-acetylglucosamine or N-acetylgalactosamine) and uronic acid (glucuronic acid or L-iduronic acid) are linearly linked.
  • the relatively low molecular weight glycosaminoglycan means, for example, that the molecular weight is about 10 kDa or less, preferably 6 kDa or less, more preferably about 4 kDa or less, or the number of sugars is about 50. Hereinafter, it is preferably 30 or less, more preferably 20 or less.
  • the sugar chain in the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention is a sugar chain composed of 4 or more, for example, 5 or more, 7 or more, particularly 9 or more, 11 or more sugars. Preferably there is.
  • the sugar chain in the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention is a sugar chain composed of 5 to 11, 9 to 11 or 11 sugars.
  • the sugar chain in the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention is a double-chain complex sugar chain.
  • the complex-type sugar chain includes two or more types of monosaccharides, and has a basic structure shown below and a lactosamine structure represented by Gal ⁇ 1-4GlcNAc.
  • the double-stranded complex type sugar chain refers to one in which a single-chain sugar chain composed of 0 to 3 sugars is bonded to two mannoses at the end of the basic structure.
  • double-stranded complex type sugar chain for example, the following diasial sugar chain, Monosialo sugar chain, Asialo sugar chain, Ziglucnac sugar chain, Dimannose sugar chain, And the like, more preferably a dicialo sugar chain.
  • dicialo sugar chain “monosialo sugar chain”, “asialo sugar chain”, “diglucnac sugar chain”, and “dimannose sugar chain” are represented by the chemical formulas shown above. Examples having different binding modes from these examples are also included, and such sugar chains are also preferably used as the sugar chains of the present invention. Examples of such sugar chains include those in which sialic acid and galactose are bonded by a ( ⁇ 2 ⁇ 3) bond in a dicialo sugar chain or an asialog sugar chain.
  • the high mannose type sugar chain used in the present invention is a sugar chain in which two or more mannoses are further bonded to the basic structure of the complex type sugar chain described above. Since the high mannose type sugar chain is bulky, the stability in blood can be increased by binding the high mannose type sugar chain to the peptide.
  • a sugar chain containing 5 to 9 mannose is preferable like a mammalian high mannose sugar chain, but may be a sugar chain containing more mannose like a high mannose sugar chain of yeast.
  • As a high mannose type sugar chain preferably used in the present invention for example, Highman North-5 (M-5) Highman North-9 (M-9) Etc.
  • preferable sugar chains include, for example, sugar chains existing as glycoproteins bound to proteins in the human body (for example, sugar chains described in “FEBS LETTERS Vol. 50, No. 3, Feb. 1975”). ) And a sugar chain having the same structure (a sugar chain having the same kind of constituent sugars and their coupling mode) or a sugar chain from which one or more sugars have been lost from the non-reducing end thereof. 4 can be mentioned.
  • a preferable sugar chain is a sugar chain having a linear structure.
  • sugar chains include oligohyaluronic acid.
  • oligohyaluronic acid refers to a sugar chain in which N-acetylglucosamine and glucuronic acid are alternately linked to 2 to 32 sugars, preferably 2 to 16 sugars, more preferably 4 to 8 sugars, and linearly linked.
  • oligohyaluronic acids used in the present invention particularly preferred are sugars having 2 units (4 sugars) or more and 8 units (16 sugars) or less when the unit consisting of N-acetylglucosamine and glucuronic acid is 1 unit.
  • a chain more preferably 2 units (4 sugars) to 4 units (8 sugars), most preferably 2 units (4 sugars).
  • hyaluronic acid preferably used in the present invention, for example, Tetrasaccharide oligohyaluronic acid, Octasaccharide oligohyaluronic acid Etc.
  • the structure of the sugar chain in the glycopeptide of the present invention is uniform.
  • the structure of a sugar chain in a glycopeptide is uniform when compared between glycopeptides, the sugar chain addition site in the peptide, the type of each sugar constituting the sugar chain, the binding order, In addition, it means that the sugars are uniformly bonded, and the sugar chain structure is at least 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more.
  • a glycopeptide having a uniform sugar chain has a constant quality and is particularly preferred in the fields of pharmaceutical production and assay.
  • the uniform sugar chain ratio can be measured, for example, by a method using HPLC, capillary electrophoresis, NMR, mass spectrometry or the like.
  • a preferred glycosylated GLP-1 peptide is, for example, a glycosylated GLP-1 peptide (SEQ ID NOs: 54 to 66) produced in Examples 1 to 15 described later. That is, the following GLP-1 sequence: His 7 -Ala 8 -Glu 9 -Gly 10 -Thr 11 -Phe 12 -Thr 13 -Ser 14 -Asp 15 -Val 16 -Ser 17 -Ser 18 -Tyr 19 -Leu 20 -Glu 21 -Gly 22 -Gln 23 In -Ala 24 -Ala 25 -Lys 26 -Glu 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp 31 -Leu 32 -Val 33 -Lys 34 -Gly 35 -Arg 36 -Gly 37 (SEQ ID NO: 2): (B1) Glycosylated GLP-1 peptide in which Lys at position 26 and Lys at position 34 are
  • B15 The following BIM51077 sequence: His 7 -R2 8 -Glu 9 -Gly 10 -Thr 11 -Phe 12 -Thr 13 -Ser 14 -Asp 15 -Val 16 -Ser 17 -Ser 18 -Tyr 19 -Leu 20 -Glu 21 -Gly 22 -Gln 23 -Ala 24 -Ala 25 -Lys 26 -Glu 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp 31 -Leu 32 -Val 33 -Lys 34 -R2 35 -Arg 36 -NH 2 [wherein R2 is ⁇ - Indicates methylalanine.
  • SEQ ID NO: 52 This is a glycosylated GLP-1 peptide (Example 15) (SEQ ID NO: 68) in which Lys at position 26 is substituted with dicialoglycosylated Cys. Also, (B16) A glycosylated GLP-1 peptide (Example 16) in which Gly at position 30 in the exendin-4 sequence (SEQ ID NO: 50) is substituted with a high mannose sugar chain (M5) -added Cys.
  • M5 mannose sugar chain
  • the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention can be produced by incorporating a glycosylation step into a peptide synthesis method known to those skilled in the art.
  • a glycosylation step a method utilizing the reverse reaction of the enzyme, represented by transglutaminase, can also be used.
  • transglutaminase a method utilizing the reverse reaction of the enzyme, represented by transglutaminase
  • a large amount of sugar chain to be added is required, and purification after the final step is complicated.
  • it can be used for small-scale synthesis for assays, etc., but for large-scale production such as pharmaceutical production. It may not be a practical method.
  • glycosylated GLP-1 peptide in which a sugar chain and an amino acid are linked via a linker in the glycosylated amino acid and the linker contains an amino acid at the sugar chain side terminal
  • glycosylation is performed. After binding one end of the linker to Asn, an N-hydroxysuccinimidyl group is bound to the other end of the linker, and the N-hydroxysuccinimidyl group is reacted with the side chain amino group of the Lys residue of the GLP-1 peptide.
  • Method C for producing a glycosylated GLP-1 peptide is shown below.
  • glycosylated GLP-1 peptides With reference to these production methods, those skilled in the art can produce various glycosylated GLP-1 peptides.
  • the resulting glycosylated GLP-1 peptide and its production method are particularly useful for pharmaceutical production. Very useful in the field.
  • these methods A to C can be performed in combination of two or more. In the case of a small amount of synthesis used in an assay or the like, it is also possible to combine a sugar chain elongation reaction by a transferase with the above method.
  • the method A is described in International Publication No. WO 2004/005330 pamphlet (US2005222382 (A1)), and the method B is described in International Publication No. WO2005 / 010053 pamphlet (US2007060543 (A1)).
  • Method for producing glycosylated GLP-1 peptide First, (1) a hydroxyl group of a resin having a hydroxyl group (resin) is esterified with a carboxyl group of an amino acid whose amino group nitrogen is protected with a lipophilic protecting group. In this case, since the amino group nitrogen of the amino acid is protected with a fat-soluble protecting group, self-condensation between amino acids is prevented, and esterification occurs due to the reaction between the hydroxyl group of the resin and the carboxyl group of the amino acid. Next, (2) the lipophilic protecting group of the ester obtained above is eliminated to form a free amino group, and (3) any free amino group and any amino group nitrogen protected with the lipophilic protecting group.
  • the resin having a hydroxyl group may be any resin (resin) having a hydroxyl group generally used in solid phase synthesis.
  • resin resin having a hydroxyl group generally used in solid phase synthesis.
  • Amino-PEGA resin manufactured by Merck
  • Wang resin manufactured by Merck
  • HMPA -PEGA resin manufactured by Merck
  • amino acids all amino acids can be used.
  • natural amino acids such as serine (Ser), asparagine (Asn), valine (Val), leucine (Leu), isoleucine (Ile), alanine (Ala), tyrosine (Tyr), glycine (Gly), lysine (Lys), arginine (Arg), histidine (His), aspartic acid (Asp), glutamic acid (Glu), glutamine (Gln), threonine (Thr), cysteine (Cys), Examples include methionine (Met), phenylalanine (Phe), tryptophan (Trp), and proline (Pro).
  • the fat-soluble protective group examples include carbonate-based or amide groups such as 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) group, t-butyloxycarbonyl (Boc) group, benzyl group, allyl group, allyloxycarbonyl group, and acetyl group.
  • Protecting groups of the system can be mentioned.
  • the fat-soluble protecting group for example, when introducing the Fmoc group, 9-fluorenylmethyl-N-succinimidyl carbonate and sodium hydrogen carbonate can be added and reacted. The reaction is carried out at 0 to 50 ° C., preferably at room temperature, for about 1 to 5 hours.
  • the above-mentioned amino acid can be produced by the above-described method.
  • Commercially available products can also be used.
  • Examples include Fmoc-Glu, Fmoc-Gln, Fmoc-Thr, Fmoc-Cys, Fmoc-Met, Fmoc-Phe, Fmoc-Trp, and Fmoc-Pro.
  • dehydration condensing agents such as 1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole (MSNT), dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropylcarbodiimide (DIPCDI), and the like can be used.
  • MSNT 1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • DIPCDI diisopropylcarbodiimide
  • the use ratio of the amino acid and the dehydration condensing agent is usually 1 to 10 parts by weight, preferably 2 to 5 parts by weight, with respect to 1 part by weight of the former.
  • the esterification reaction is preferably performed, for example, by placing a resin in a solid phase column, washing the resin with a solvent, and then adding an amino acid solution.
  • the cleaning solvent include dimethylformamide (DMF), 2-propanol, methylene chloride and the like.
  • the solvent that dissolves amino acids include dimethyl sulfoxide (DMSO), DMF, and methylene chloride.
  • the esterification reaction is carried out at 0 to 50 ° C., preferably at room temperature, for about 10 minutes to 30 hours, preferably about 15 minutes to 24 hours.
  • the elimination of the lipophilic protecting group can be carried out, for example, by treatment with a base.
  • a base include piperidine and morpholine.
  • a solvent examples include DMSO, DMF, methanol and the like.
  • amidation reaction between the free amino group and the carboxyl group of any amino acid whose amino group nitrogen is protected with a fat-soluble protecting group is preferably performed in the presence of an activator and a solvent.
  • activator examples include dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (WSC / HCl), diphenylphosphoryl azide (DPPA), carbonyldiimidazole (CDI).
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • WSC / HCl 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • DPPA diphenylphosphoryl azide
  • CDI carbonyldiimidazole
  • Diethyl cyanophosphonate (DEPC), benzotriazol-1-yloxy-trispyrrolidinophosphonium (DIPCI), benzotriazol-1-yloxy-trispyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), Hydroxysuccinimide (HOSu), dimethylaminopyridine (DMAP), 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt), hydroxyphthalimide (HOP) t), pentafluorophenol (Pfp-OH), 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), O- (7-aza Benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphonate (HATU), O-benzotriazol-1-yl-1,1,3,3-
  • the activator is used in an amount of 1 to 20 equivalents, preferably 1 to 10 equivalents, more preferably 1 to 5 equivalents with respect to any amino acid in which the amino group nitrogen is protected with a fat-soluble protecting group. Is preferred.
  • the solvent examples include DMSO, DMF, methylene chloride and the like.
  • the reaction is carried out at 0 to 50 ° C., preferably at room temperature, for about 10 to 30 hours, preferably about 15 minutes to 24 hours.
  • the elimination of the lipophilic protecting group can be carried out in the same manner as described above.
  • the acid include trifluoroacetic acid (TFA) and hydrogen fluoride (HF).
  • the carboxyl group of the asparagine moiety of the sugar chain asparagine in which the amino group nitrogen is protected with the fat-soluble protecting group in (6) above, and the free amino group of the peptide are amidated, and the fat-soluble protecting group in (7) is A glycopeptide having at least two or more sugar chain asparagines at any position of the peptide chain can be produced by appropriately adding a step of leaving to form a free amino group. Further, at this time, by using different sugar chain asparagines, glycopeptides having two or more kinds of sugar chain asparagines at arbitrary positions of the peptide chain can also be produced.
  • an amidation reaction is performed with the carboxyl group of the asparagine portion of the sugar chain asparagine in which the amino group nitrogen is protected with a fat-soluble protecting group in (6) above, and then the fat-soluble protecting group in (7) is eliminated to form a free amino group.
  • step (1) when performing the said process (1), it replaces with the amino acid by which the amino group nitrogen was protected by the fat-soluble protecting group, and the carboxyl group of the asparagine part of the sugar chain asparagine by which the amino group nitrogen was protected by the fat-soluble protecting group.
  • step (6) By carrying out an esterification reaction with the hydroxyl group of the resin, a glycopeptide having a sugar chain asparagine at the C-terminus can be produced.
  • step (6) may or may not be further performed.
  • glycosylated GLP-1 peptide in which the desired position is substituted with glycosylated Asn can be obtained.
  • Method for producing glycosylated GLP-1 peptide (Method B) First, a peptide containing Cys is produced by a solid phase synthesis method, a liquid phase synthesis method, cell synthesis, a method of separating and extracting naturally occurring ones, and the like. By changing the position of Cys, a sugar chain can be added to a desired position.
  • the haloacetamide-conjugated complex sugar chain derivative is produced by reacting with the Cys-containing peptide obtained above.
  • the above reaction is usually carried out at 0 to 80 ° C., preferably 10 to 60 ° C., more preferably 15 to 35 ° C.
  • the reaction time is preferably about 30 minutes to 5 hours. After completion of the reaction, it may be appropriately purified by a known method (for example, high performance liquid column chromatography (HPLC)).
  • HPLC high performance liquid column chromatography
  • the haloacetamide-conjugated glycan derivative is, for example, a hydroxyl group bonded to the 1-position carbon of a conjugated asparagine-linked glycan, represented by —NH— (CO) — (CH 2 ) a —CH 2 X (X is The halogen atom, a is an integer, and is not limited as long as the desired linker function is not inhibited, but preferably represents an integer of 0 to 4.
  • a haloacetamide-conjugated complex sugar chain derivative and a Cys-containing peptide are reacted in a phosphate buffer at room temperature. After completion of the reaction, a glycosylated GLP-1 peptide substituted with glycosylated Cys can be obtained by purification with HPLC.
  • Method for producing glycosylated GLP-1 peptide First, a peptide containing Lys is produced by a solid phase synthesis method, a liquid phase synthesis method, cell synthesis, a method of separating and extracting naturally occurring ones, and the like. Next, glutaric acid is bound to the glycosylated amino acid. For example, a glycosylated amino acid is dissolved in a DMSO solution, and a DMSO solution in which glutaric acid-EDC is mixed is added to this solution, followed by stirring at room temperature for 1 day.
  • the reaction mixture is appropriately diluted and then fractionated by molecular weight exclusion gel chromatography or the like to obtain a glycosylated amino acid in which glutaric acid is bound to an ⁇ -amino group.
  • a DMSO solution of N-hydroxysuccinimide and a DMSO solution of EDC are added to a DMSO solution of a glutaric acid-linked glycosylated amino acid, and the mixture is stirred at room temperature for 6 hours.
  • N-hydroxysuccinimidyl esters of glycosylated amino acids can be synthesized.
  • the glycosylated amino acid at the desired site of the GLP-1 peptide By replacing the amino acid at the desired site of the GLP-1 peptide with Lys, or by replacing the Lys residue contained in the wild type of the GLP-1 peptide with another amino acid, the glycosylated amino acid at the desired site It is possible to obtain a glycosylated GLP-1 peptide to which is bound. Further, according to the method C, when a glycosylation is added to Lys contained in wild type GLP-1, a glycosylated GLP-1 peptide having the same peptide backbone as that of the wild type can be obtained.
  • glycosylated GLP-1 peptide of the present invention has GLP-1 activity.
  • GLP-1 activity refers to part or all of a physiological activity known for GLP-1.
  • GLP-1 has, for example, insulin secretion associated with cAMP synthesis induction, islet protection (inhibition of apoptosis), islet growth, pancreatic islet action, appetite suppression, gastrointestinal motility suppression, calcitonin It is known to have secretion enhancement, cardioprotective action during ischemia, and the like. Therefore, GLP-1 activity refers to all or part of the physiological activity related to these actions, and can be measured using techniques known to those skilled in the art.
  • the blood glucose level inhibitory activity is the measurement of the blood glucose level lowering effect in diabetic mice (db / db mice) and the blood glucose level inhibitory effect in the oral glucose tolerance test (OGTT: Oral Glucose Tolerance Test). It can measure using the measurement of this.
  • “suppressing blood sugar level” includes both concepts of suppressing an increase in blood sugar level and lowering the blood sugar level.
  • the blood glucose level inhibitory action in db / db mice is sometimes referred to as “blood glucose level lowering action”
  • the blood glucose level inhibitory action in OGTT is sometimes referred to as “blood sugar level increase inhibitory action”.
  • the blood glucose level inhibitory activity by OGTT can be determined by measuring the suppression of an increase in blood glucose level when a mouse is forced to drink sugar. For example, when the method of Test Example 2 described below is used, first, the test compound is administered to a mouse fasted overnight, and a glucose solution is orally administered 30 minutes later. Glucose administration increases the blood glucose level in mice, reaches a maximum about 30 minutes after administration, and gradually decreases.
  • the blood glucose level inhibitory action of the glycosylated GLP-1 peptide can be measured by measuring the blood glucose level 30 minutes after glucose administration and comparing it with the blood glucose level in the case of GLP-1 administration.
  • the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention is preferably 80% or less, more preferably 60% or less, still more preferably 40%.
  • the blood glucose level is particularly preferably 30% or less.
  • the blood glucose level inhibiting activity of the glycosylated GLP-1 peptide is , 10 times that of GLP-1.
  • the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention has a blood glucose level inhibitory activity that is preferably 5 times or more, more preferably 10 times or more, compared to GLP-1.
  • glycosylated GLP-1 peptide is obtained by adding a sugar chain to a peptide in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in GLP-1, or the GLP-1 analog has a sugar chain.
  • GLP-1 analogs and GLP-1 peptides having the same amino acid sequence other than the glycosylated amino acid and the glycosylated GLP-1 peptide are used as targets for comparison of GLP-1 activity. It may be used.
  • the blood glucose level inhibitory activity using db / db mice can be determined by measuring the blood glucose level after administering the test compound to diabetic mice. For example, the blood glucose level after administration of the test compound is measured over time. For example, if the blood glucose level for 120 minutes after administration is lower than that at the time of administration, the blood glucose level lowering effect can be confirmed. Further, for example, by measuring the blood glucose level for 300 minutes after administration, the persistence of the blood glucose level lowering action can also be determined. For example, when the blood glucose level at 120 minutes after administration is compared with the case of GLP-1 administration, the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention is preferably 80% or less, more preferably 70% or less, particularly preferably 60%. The blood glucose level is less than%.
  • the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention is preferably 70% or less, more preferably 60% or less, particularly preferably 50%.
  • the blood glucose level is% or less (for example, 45% or less).
  • the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention preferably exhibits a blood glucose level of 70% or less, more preferably 50% or less.
  • the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention preferably exhibits a blood glucose level of 70% or less, more preferably 50% or less. .
  • insulin secretion activity in GLP-1 activity can be measured using an in vitro cAMP synthesis ability test or the like.
  • GLP-1 increases intracellular cAMP concentration by binding to the GLP-1 receptor, and promotes insulin secretion. Therefore, for example, by stimulating mouse GLP-1 receptor-expressing CHO-K1 cells with glycosylated GLP-1 peptide, measuring the amount of cAMP synthesized in the cells, and comparing the EC50 value with GLP-1 Insulin secretion activity of the glycosylated GLP-1 peptide can be measured.
  • the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention has increased blood stability compared to GLP-1.
  • Blood stability can be measured using methods known to those skilled in the art. For example, stability in plasma and resistance to DPP-IV (dipeptidyl peptidase IV) are measured, half-life, AUC (drug The blood concentration-area under the time curve) can be used as an index.
  • an increase in renal clearance also contributes to an increase in blood stability.
  • glycosylated GLP-1 peptide of the present invention has increased plasma stability compared to GLP-1.
  • Resistance to DPP-IV can be determined by measuring the half-life in a DPP-IV solution as in Test Example 1 described later, for example.
  • the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention has increased resistance to DPP-IV compared to GLP-1, and the resistance to DPP-IV was measured using, for example, the method of Test Example 1 described below.
  • the half-life is 1.2 times or more (for example, 2 times or more), preferably 5 times or more, more preferably 10 times or more, particularly preferably 20 times or more (for example, 100 times) compared with GLP-1. Above) has increased.
  • the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention preferably has a blood half-life of at least 1 hour, more preferably at least 3, 5, 7, 10, 15, 20 hours and even more preferably at least 24 hours. .
  • the pharmaceutical composition containing the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention as an active ingredient is effective for the treatment or prevention of diseases associated with GLP-1.
  • GLP-1 is known to have various actions, and there are various diseases associated with these actions.
  • GLP-1 has been found to cause glucose uptake by cells and lower blood glucose levels by stimulating insulin release. It has also been found to suppress stomach and / or intestinal motility, suppress stomach and / or bowel content excretion, and suppress food intake.
  • diseases associated with GLP-1 include, for example, non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM), insulin dependent diabetes mellitus, stroke (see International Publication No. WO00 / 16797 by Efendic), myocardial infarction (by Efendic) International Publication No. WO 98/08531), obesity (see International Publication No. WO 98/19698 by Efendic), functional dyspepsia, irritable bowel syndrome (International Publication No. WO 99/64060 by Efendic) (See brochure), including islet transplantation.
  • the pharmaceutical composition containing the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention as an active ingredient is particularly effective for the treatment or prevention of diabetes, and more specifically, for the prevention of type 1 diabetes and the treatment of type 2 diabetes. It is.
  • the above pharmaceutical composition is a normal pharmaceutical composition using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, moisturizers, disintegrants, surfactants, lubricants and the like that are usually used. It was formulated in the form of Examples of such a pharmaceutical composition include tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, granules, capsules, suppositories, injections, and the like.
  • the amount of the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention contained in the pharmaceutical composition is not particularly limited and can be appropriately selected from a wide range.
  • the sugar chain of the present invention is contained in the pharmaceutical composition. It is preferable to contain 1 to 70% by weight of the added GLP-1 peptide.
  • the pharmaceutical composition containing the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention as an active ingredient may further contain other active ingredients, or may be used in combination with a pharmaceutical composition containing other active ingredients. it can.
  • the pharmaceutical composition containing the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention as an active ingredient can further contain one or more different glycosylated GLP-1 peptides of the present invention as an active ingredient. It can also be used in combination with a pharmaceutical composition containing one or more glycosylated GLP-1 peptides of the present invention as an active ingredient.
  • the administration method of the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited, and it is administered by a method according to various preparation forms, patient age, sex, disease state, and other conditions.
  • Examples of the administration method in the case of tablets, pills, liquids, suspensions, emulsions, granules and capsules include oral administration.
  • it can be administered intravenously, intramuscularly, intradermally, subcutaneously or intraperitoneally alone or mixed with a normal fluid such as glucose or amino acid.
  • a suppository it is administered intrarectally.
  • the dosage of the above pharmaceutical composition may be appropriately selected according to the usage, patient age, sex, disease severity, and other conditions.
  • the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention per 1 kg body weight Is a dose of 0.1 to 900 nmol, preferably 1 to 90 nmol.
  • the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention has very high blood stability compared to GLP-1, and in one aspect, the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention has a higher blood glucose level than GLP-1. Since the value suppressing activity is very high, there is an advantage that the dose can be reduced.
  • the number of administrations of the pharmaceutical composition may be appropriately selected according to usage, patient age, sex, disease severity, and other conditions. For example, 3 times / 1 day, 2 times / 1 day, 1 time / A less frequent number of administrations (for example, once / week, once / month, etc.) may be selected depending on the stability of the blood in one day. Preferably, the frequency of administration of the pharmaceutical composition is not more than once / day.
  • the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention has an advantage that the number of administrations can be reduced because blood stability is much higher than that of GLP-1.
  • the sugar chain added to the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention is easily degraded in the body's metabolic system.
  • the sugar chain has a structure that exists as a glycopeptide (or glycoprotein) in vivo. Therefore, the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention and the pharmaceutical composition containing the peptide as an active ingredient do not exhibit side effects or antigenicity even when administered in vivo, and are effective due to allergic reactions or antibody production. There is an advantage that there is little worry that it cannot be obtained.
  • glycosylated GLP-1 peptide of the present invention can be stably and easily supplied in large quantities, and is very useful from the viewpoint of providing a high-quality pharmaceutical product with stable quality.
  • the present invention also provides a method for treating or preventing a disease associated with GLP-1, which comprises administering an effective amount of the glycosylated GLP-1 peptide of the present invention.
  • Embodiments of the present invention may be described with reference to schematic diagrams, but in the case of schematic diagrams, they may be exaggerated for clarity of explanation.
  • terms such as first, second, etc. are used to represent various elements, it is understood that these elements should not be limited by those terms. These terms are only used to distinguish one element from another, for example, the first element is referred to as the second element, and similarly, the second element is the first element. Can be made without departing from the scope of the present invention.
  • HMPB-PEGA resin was washed thoroughly with DMF and DCM to obtain HMPB-PEGA resin and used as the solid phase for solid phase synthesis.
  • Fmoc-Gly (0.50 mmol), MSNT (0.50 mmol) and N-methylimidazole (0.375 mmol) were dissolved in DCM (2 ml), placed in a column for solid phase synthesis, and stirred at 25 ° C. for 3 hours. .
  • HPLC column: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 ⁇ m), ⁇ 4.6 ⁇ 250 mm, gradient: liquid A: 0.1% TFA water, liquid B: 0.09% TFA / 10 GLP-1 obtained by purifying with% water / 90% AN 0.7 ml / min; solution B 35 ⁇ 60% 20 min linear gradient], and Lys at positions 26 and 34 of GLP-1 was replaced with glycosylated Cys 0.1 mg of -1 peptide (26, 34 Cys GLP-1-disialo) was obtained.
  • Fmoc-Gly (0.50 mmol), MSNT (0.50 mmol) and N-methylimidazole (0.375 mmol) were dissolved in DCM (2 ml), placed in a column for solid phase synthesis, and stirred at 25 ° C. for 3 hours. .
  • the obtained residue was HPLC [column: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 ⁇ m), ⁇ 20 ⁇ 250 mm, gradient: A solution: 0.1% TFA water, B solution: 0.09% TFA / 10% water / 90% AN Purification with 8.0 ml / min; B solution 35 ⁇ 60% 20 min linear gradient] gave a peptide in which Ser at position 18 and Arg at position 36 of GLP-1 were substituted with Cys.
  • bromoacetylated dicialosaccharide chain (a) (manufactured by Otsuka Chemical Co., Ltd.) and 2.1 mg of the peptide chain synthesized above are dissolved in 100 mM phosphate buffer pH 7.5, 210 ⁇ l, and reacted at 37 ° C. for 4 hours. I let you.
  • HPLC column: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 ⁇ m), ⁇ 4.6 ⁇ 250 mm, gradient: liquid A: 0.1% TFA water, liquid B: 0.09% TFA / 10 % Water / 90% AN 0.7 ml / min; B liquid 35 ⁇ 60% 20 min linear gradient], GLP-1 18-position Ser and 36-position Arg substituted with glycosylated Cys 0.8 mg of chain-added GLP-1 peptide (18, 36 Cys GLP-1-disialo) was obtained.
  • Fmoc-Gly (0.50 mmol), MSNT (0.50 mmol) and N-methylimidazole (0.375 mmol) were dissolved in DCM (2 ml), placed in a column for solid phase synthesis, and stirred at 25 ° C. for 3 hours. .
  • the obtained residue was subjected to HPLC [column: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 ⁇ m), ⁇ 20 ⁇ 250 mm, gradient: A solution: 0.1% TFA water, B solution: 0.09% TFA / 10% water / 90% AN 8 0 ml / min, purified by B solution 35 ⁇ 60% 20 min linear gradient], and a peptide in which Gly at position 22 and Ala at position 30 of GLP-1 were substituted with Cys was obtained.
  • bromoacetylated dicialosaccharide chain (a) (manufactured by Otsuka Chemical Co., Ltd.) and 1.3 mg of the peptide chain synthesized above were dissolved in 200 ⁇ l of 100 mM phosphate buffer pH 7.4 and reacted at 37 ° C. for 4 hours. I let you.
  • HPLC column: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 ⁇ m), ⁇ 4.6 ⁇ 250 mm, gradient: liquid A: 0.1% TFA water, liquid B: 0.09% TFA / 10 % Water / 90% AN 0.7 ml / min; B liquid 35 ⁇ 60% 20 min linear gradient], GLP-1 22nd position Gly and 30th position Ala substituted with glycosylated Cys 1.0 mg of chain-added GLP-1 peptide (22,30 Cys GLP-1-disialo) was obtained.
  • Fmoc-Gly (0.50 mmol), MSNT (0.50 mmol) and N-methylimidazole (0.375 mmol) were dissolved in DCM (2 ml), placed in a column for solid phase synthesis, and stirred at 25 ° C. for 3 hours. .
  • the obtained residue was HPLC [column: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 ⁇ m), ⁇ 20 ⁇ 250 mm, gradient: A solution: 0.1% TFA water, B solution: 0.09% TFA / 10% water / 90% AN Purification with 8.0 ml / min; B solution 35 ⁇ 60% 20 min linear gradient] gave a peptide in which Gly at position 22 and Arg at position 36 of GLP-1 were substituted with Cys.
  • HPLC column: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 ⁇ m), ⁇ 4.6 ⁇ 250 mm, gradient: liquid A: 0.1% TFA water, liquid B: 0.09% TFA / 10 % Water / 90% AN 0.7 ml / min; B liquid 35 ⁇ 60% 20 min linear gradient], GLP-1 with Gly at position 22 and Arg at position 36 substituted with glycosylated Cys 2.9 mg of chain-added GLP-1 peptide (22,36 Cys GLP-1-disialo) was obtained.
  • Fmoc-Gly (0.50 mmol), MSNT (0.50 mmol) and N-methylimidazole (0.375 mmol) were dissolved in DCM (2 ml), placed in a column for solid phase synthesis, and stirred at 25 ° C. for 3 hours. .
  • the amino acids protected with the Fmoc group include Fmoc-Gly, Cys (Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp (Boc), Cys (Trt), Fmoc- Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln (Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Lu Fmoc-Tyr (tBu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp (OtBu), Fmoc-Ser (tBu),
  • the obtained residue was HPLC [column: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 ⁇ m), ⁇ 20 ⁇ 250 mm, gradient: A solution: 0.1% TFA water, B solution: 0.09% TFA / 10% water / 90% AN Purification with 8.0 ml / min; B solution 35 ⁇ 60% 20 min linear gradient] gave a peptide in which ALP at position 30 and Arg at position 36 of GLP-1 were substituted with Cys.
  • HPLC column: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 ⁇ m), ⁇ 4.6 ⁇ 250 mm, gradient: liquid A: 0.1% TFA water, liquid B: 0.09% TFA / 10 % Water / 90% AN 0.7 ml / min; B liquid 35 ⁇ 60% 20 min linear gradient], GLP-1 30th-position Ala and 36th-position Arg substituted with glycosylated Cys 1.6 mg of chain-added GLP-1 peptide (30, 36 Cys GLP-1-disialo) was obtained.
  • Example 6 Synthesis Method of GLP-1 Peptide with Position 30 Cys-Hyaluronic Acid Tetrasaccharide (HA-4) Addition Hyaluronic acid tetrasaccharide obtained in Synthesis Example 1 (hereinafter, in the examples, oligohyaluronic acid is simply referred to as “hyaluronic acid”. It may also be called “acid”.) 22.7 ⁇ l of water and 483 ⁇ l of dimethyl sulfoxide (DMSO) were dissolved in 12.7 mg. 200 mg of ammonium bicarbonate was added to this solution, treated at 37 ° C. for 30 hours, and then lyophilized.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Example 8 Addition of Cys-hyaluronic acid tetrasaccharide (HA-4) at position 36 GLP-1 peptide synthesis method 15.4 mg of the hyaluronic acid tetrasaccharide obtained in Synthesis Example 1 was added to 25.4 ⁇ l of water and dimethyl sulfoxide (DMSO). 483 ⁇ l was added and dissolved. 200 mg of ammonium bicarbonate was added to this solution, treated at 37 ° C. for 30 hours, and then lyophilized.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Example 9 Synthesis Method of 36-position Cys-hyaluronic acid octasaccharide (HA-8) -added GLP-1 peptide 8.7 mg of hyaluronic acid octasaccharide obtained in Synthesis Example 1 was added to 17.4 ⁇ l of water and dimethyl sulfoxide (DMSO). 314 ⁇ l was added and dissolved. 100 mg of ammonium bicarbonate was added to this solution, treated at 37 ° C. for 45 hours, and then lyophilized.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Example 10 Synthesis Method of Cys-Hyaluronic Acid 16 Saccharide (HA-16) Addition GLP-1 Peptide at Position 30 11.6 mg of hyaluronic acid 16 saccharide obtained in Synthesis Example 1 was mixed with 35 ⁇ l of water and 680 ⁇ l of dimethyl sulfoxide (DMSO). In addition it melted. To this solution, 260 mg of ammonium bicarbonate was added, treated at 37 ° C. for 75 hours, and then lyophilized.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • HPLC columnumn: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 ⁇ m), ⁇ 4.6 ⁇ 250 mm, gradient: A solution: 0.1% TFA water, B solution: 0.09% TFA / 10% water / 90% AN 0.7 ml / min; B liquid 35 ⁇ 60% 20 min linear gradient], and GLP-1 substituted at 30 position Ala with hyaluronic acid 16-saccharide-added Cys 0.4 mg of added GLP-1 peptide (30Cys GLP-1-HA-16) was obtained.
  • Example 11 Synthesis Method of 36-position Cys-hyaluronic acid 16 sugar (HA-16) -added GLP-1 peptide Synthesis in Synthesis Example 3 with 4.9 mg of bromoacetylated hyaluronic acid 16 sugar (III) prepared in Example 10 1.2 mg of the 36-position CysGLP-1 peptide chain (SEQ ID NO: 78) was dissolved in 190 ⁇ l of 100 mM phosphate buffer, pH 7.5, and 36 ⁇ l of 10 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride aqueous solution was added. Reacted for hours.
  • Example 12 Synthesis of 36-position Cys high mannose sugar chain (M5) added GLP-1 peptide 100 g of soybean powder was washed twice with 500 ml of acetone and twice with 500 ml of methanol to obtain 61.4 g of defatted soybean powder. It was. To 43.0 g of the obtained defatted soybean powder, 430 ml of water and 4.3 g of liquefied enzyme T (manufactured by HBI) were added and reacted at 70 ° C. for 19 hours with stirring. The reaction solution was centrifuged (10000 G, 10 minutes) to separate into a supernatant and a precipitate, and 800 ml of the supernatant was obtained.
  • M5 Cys high mannose sugar chain
  • the solution after the reaction was filtered to remove insoluble matters, and concentrated by a rotary evaporator until the amount of the solution became 400 ml.
  • the obtained liquid was subjected to ultrafiltration using an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off of 1K (manufactured by Minimate TFF Capsule 1K membrane Paul). After 6 hours of treatment, 230 ml of liquid that did not permeate the membrane was recovered. 20 ml of 1M Tris-HCl buffer pH 8.0, 250 mg of sodium azide, and 423.5 mg of actinase E (manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.) were added to the collected liquid and reacted at 37 ° C. for 82 hours.
  • the reaction solution was filtered to remove insolubles, and then concentrated with a rotary evaporator until the liquid volume reached 100 ml.
  • the concentrated solution was divided into two halves and fractionated on a Sephadex-G25 ( ⁇ 25 mm ⁇ 100 mm) column, and only the sugar chain-containing fractions were collected and concentrated to obtain 2.22 g.
  • Distilled water (21.0 ml) and ethanol (14.9 ml) were added to the resulting sugar chain-containing fraction to dissolve, and sodium hydrogen carbonate (1.13 g) and Fmoc-OSu (2.02 g) were added and reacted at room temperature for 16 hours.
  • Example 13 Synthesis Method of 26th-position Lys-Asialo Sugar Chain Asn Linker Modified Arg34GLP-1 (7-37) Peptide (1) Synthesis of Asparagine-linked Asialo Sugar Chain Glutaric Acid Asparagine-linked asialo sugar chain in a 10 mL eggplant type flask (50.6 mg, 28.7 ⁇ mol) was dissolved in DMSO-water (4: 1, v / v, 1.5 mL). To this solution was added a 0.52 M glutaric acid-EDC mixture (1: 1, mol / mol) DMSO solution (100 ⁇ L, 51.7 ⁇ mol), and the mixture was stirred at room temperature for 1 day.
  • reaction mixture was diluted with distilled water (1.5 mL) and then fractionated three times by molecular weight exclusion gel chromatography (Sephadex G-25, ⁇ 1.5 ⁇ 45 cm, distilled water). After lyophilization, the following asparagine-linked asialo sugar chain glutaric acid (c) (51.4 mg) was obtained.
  • Example 14 Synthesis Method of 30th-Cys- Disialoglycosylated Exendin -4 12.0 mg of 39-residue peptide in which Gly at position 30 of Ex-4 synthesized in Synthesis Example 5 was substituted with Cys and bromoacetyl 36 mg of the converted dicialo sugar chain (a) (manufactured by Otsuka Chemical Co., Ltd.) was reacted at 37 ° C. for 1 hour in 1 mL of 100 mM sodium phosphate buffer pH 7.4, 5 mM triscarboxyethylphosphine.
  • Example 15 Synthesis Method of 26th-Cys-Disialoglycosylated BIM51077 30-residue peptide (2.4 mg, 0.72 ⁇ mol) in which Lys at 26th position of BIM51077 synthesized in Synthetic Example 6 was substituted with Cys Guanidine (216 mg) is dissolved in distilled water (240 ⁇ L), followed by an aqueous TCEP solution (100 mM, 100 ⁇ L), a bromoacetylated disialo sugar chain (a) (10 mg / mL, 100 ⁇ L, 4.26 ⁇ mol), and 500 mM phosphoric acid. Sodium buffer (pH 7.4, 100 ⁇ L) was added. The reaction was performed at 37 ° C. for 2 hours.
  • Example 16 Synthesis Method of Position 30-Cys-M5 Glycosylated Exendin -4 1.2 mg of 39-residue peptide in which Gly at position 30 of Ex-4 synthesized in Synthesis Example 5 was substituted with Cys
  • the bromoacetylated M5 sugar chain (b) 3.9 mg synthesized in 12 was reacted in 0.17 mL of 35 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 and 1 mM triscarboxyethylphosphine at 37 ° C. for 3 hours.
  • Table 5 below shows MS spectrum data (MALDI-TOF mass) of the glycosylated GLP-1 peptide obtained in Examples 1 to 16.
  • Fmoc-Gly (0.50 mmol), MSNT (0.50 mmol) and N-methylimidazole (0.375 mmol) were dissolved in DCM (2 ml), placed in a column for solid phase synthesis, and stirred at 25 ° C. for 3 hours. .
  • Synthesis Example 1 Synthesis of Oligohyaluronic Acid Sugar Chain
  • hyaluronic acid manufactured by Shiseido Co., Ltd., average molecular weight 1,200,000
  • acetic acid buffer solution pH 4 and stirred well until dissolved.
  • Hyaluronidase (CALBIOCHEM, manufactured by Bovine Tests) was added at 2.5 kU and reacted at 37 ° C. for 2 days.
  • the obtained molecular weight 1 to 3 kDa hyaluronic acid fraction contains a plurality of types of oligohyaluronic acid
  • fractionation was performed by HPLC in order to separate them.
  • the oligohyaluronic acid fraction having a molecular weight of 1 to 3 kDa is dissolved in a small amount of water and purified by HPLC (column: Shodex Asahipak NH2P-90 20F 9 ⁇ m, ⁇ 20.0 ⁇ 300 mm, mobile phase: 180 mM NaH2PO4 aq), It fractionated for every elution peak.
  • the obtained fraction was desalted by gel filtration and freeze-dried to obtain oligohyaluronic acid (tetrasaccharide to saccharide 18). The yield of each oligohyaluronic acid is shown below.
  • Fmoc-Gly (0.50 mmol), MSNT (0.50 mmol) and N-methylimidazole (0.375 mmol) were dissolved in DCM (2 ml), placed in a column for solid phase synthesis, and stirred at 25 ° C. for 3 hours. . After stirring, the resin was washed with DCM and DMF. The Fmoc group was deprotected using a 20% piperidine / DMF solution (2 ml) for 15 minutes. After washing with DMF, subsequent peptide chain elongation was performed by sequentially condensing amino acids using the method shown below.
  • the obtained residue was HPLC [column: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 ⁇ m), ⁇ 20 ⁇ 250 mm, gradient: A solution: 0.1% TFA water, B solution: 0.09% TFA / 10% water / 90% AN Purification was performed with 8.0 ml / min, B solution 35 ⁇ 60%, 20 min linear gradient], and a 31-residue peptide in which Ala at position 30 of GLP-1 was substituted with Cys was obtained (SEQ ID NO: 76).
  • Fmoc-Gly (0.50 mmol), MSNT (0.50 mmol) and N-methylimidazole (0.375 mmol) were dissolved in DCM (2 ml), placed in a column for solid phase synthesis, and stirred at 25 ° C. for 3 hours. . After stirring, the resin was washed with DCM and DMF. The Fmoc group was deprotected using a 20% piperidine / DMF solution (2 ml) for 15 minutes. After washing with DMF, subsequent peptide chain elongation was performed by sequentially condensing amino acids using the method shown below.
  • the obtained residue was HPLC [column: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 ⁇ m), ⁇ 20 ⁇ 250 mm, gradient: A solution: 0.1% TFA water, B solution: 0.09% TFA / 10% water / 90% AN Purification with 8.0 ml / min; B solution 35 ⁇ 60% 20 min linear gradient] gave a 31-residue peptide in which Arg at position 36 of GLP-1 was substituted with Cys (SEQ ID NO: 78).
  • Fmoc-Gly (0.50 mmol), MSNT (0.50 mmol) and N-methylimidazole (0.375 mmol) were dissolved in DCM (2 ml), placed in a column for solid phase synthesis, and stirred at 25 ° C. for 3 hours. . After stirring, the resin was washed with DCM and DMF. The Fmoc group was deprotected using a 20% piperidine / DMF solution (2 ml) for 15 minutes. After washing with DMF, subsequent peptide chain elongation was performed by sequentially condensing amino acids using the method shown below.
  • the amino acids protected with the Fmoc group include Fmoc-Gly, Fmoc-Arg (Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Arg (Pbf), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp (Boc), Fmoc-Ala, Fmoc -Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln (Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Glu , Fmoc-Tyr (tBu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp (OtBu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Thr
  • the obtained residue was HPLC [column: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 ⁇ m), ⁇ 20 ⁇ 250 mm, gradient: A solution: 0.1% TFA water, B solution: 0.09% TFA / 10% water / 90% AN Purification was performed with 8.0 ml / min, B solution 35 ⁇ 60%, 20 min linear gradient], and a 31-residue peptide in which Lys at position 34 of GLP-1 was substituted with Arg was obtained (SEQ ID NO: 80).
  • Synthesis Example 6 Method for synthesizing a peptide in which position 26 of BIM51077 was substituted with Cys After washing Rink-Amido-PEGA resin (manufactured by Merck) (100 ⁇ mol) with DMF on a solid phase synthesis column, the elongation of the peptide chain was as follows: The amino acids were sequentially condensed using the method shown.
  • Amino acids protected with Fmoc group include Fmoc-Arg (Pbf), Fmoc-Aminoisobutyric Acid (Aib), Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp (Boc), Fmoc-Trp (Boc), -Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Cys (Trt), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln (Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Lu , Fmoc-Tyr (tBu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp (OtBu), Fmoc-Ser (tBu
  • the glycosylated GLP-1 peptide produced in each of the above examples has the following GLP-1 sequence: His 7 -Ala 8 -Glu 9 -Gly 10 -Thr 11 -Phe 12 -Thr 13 -Ser 14 -Asp 15 -Val 16 -Ser 17 -Ser 18 -Tyr 19 -Leu 20 -Glu 21 -Gly 22 -Gln 23 In -Ala 24 -Ala 25 -Lys 26 -Glu 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp 31 -Leu 32 -Val 33 -Lys 34 -Gly 35 -Arg 36 -Gly 37 (SEQ ID NO: 2): (B1) Glycosylated GLP-1 peptide in which Lys at position 26 and Lys at position 34 are replaced with dicialoglycosylated Cys (Example 1) (SEQ ID NO: 54); (B2) Glycosylated GLP-1 peptide in which
  • (B16) A glycosylated GLP-1 peptide (Example 16) in which Gly at position 30 in the exendin-4 sequence (SEQ ID NO: 50) is substituted with a high mannose sugar chain (M5) -added Cys.
  • SEQ ID NO: 50 Gly at position 30 in the exendin-4 sequence
  • M5 high mannose sugar chain
  • Test Example 1 (Resistance test for dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV)) 17.7 nmol of the glycosylated GLP-1 peptide produced in the example or GLP-1 produced in Comparative Example 1 and DPP-IV (Dipeptidyl Peptidase IV from porcine kidney, manufactured by SIGMA) 2 in a 0.5 ml Eppendorf tube .2 mU was added to prepare 100 ⁇ L of the total amount of 100 mM sodium phosphate buffer and reacted at 37 ° C.
  • Table 6 shows representative values evaluated for the example glycosylated GLP-1 peptides.
  • glycosylated GLP-1 peptide of each Example exhibited DPP-IV resistance 2.1 to 128 times that of GLP-1 of Comparative Example 1.
  • the blood glucose level inhibitory effect of 18,36 Cys GLP-1-disalo at a dose of 0.9 nmol / kg was almost the same as that of GLP-1 at a dose of 9 nmol / kg.
  • the inhibitory effect of 18,36Cys GLP-1-disalo on the increase in blood glucose level was about 10 times that of GLP-1.
  • SEQ ID NO: 1 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by the general formula (1).
  • SEQ ID NO: 2 is GLP-1 (7-37).
  • SEQ ID NO: 3 is GLP-1 (7-36) NH 2 .
  • SEQ ID NO: 4 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a1).
  • SEQ ID NO: 5 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a2).
  • SEQ ID NO: 6 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a3).
  • SEQ ID NO: 7 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a4).
  • SEQ ID NO: 8 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a5).
  • SEQ ID NO: 9 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a6).
  • SEQ ID NO: 10 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a7).
  • SEQ ID NO: 11 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a8).
  • SEQ ID NO: 12 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a9).
  • SEQ ID NO: 13 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a10).
  • SEQ ID NO: 14 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a11).
  • SEQ ID NO: 15 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a12).
  • SEQ ID NO: 16 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a13).
  • SEQ ID NO: 17 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a14).
  • SEQ ID NO: 18 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a15).
  • SEQ ID NO: 19 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a16).
  • SEQ ID NO: 20 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a17).
  • SEQ ID NO: 21 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a18).
  • SEQ ID NO: 22 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a19).
  • SEQ ID NO: 23 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a20).
  • SEQ ID NO: 24 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a21).
  • SEQ ID NO: 25 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a22).
  • SEQ ID NO: 26 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a23).
  • SEQ ID NO: 27 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a24).
  • SEQ ID NO: 28 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a25).
  • SEQ ID NO: 29 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a26).
  • SEQ ID NO: 30 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a27).
  • SEQ ID NO: 31 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a28).
  • SEQ ID NO: 32 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a29).
  • SEQ ID NO: 33 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a30).
  • SEQ ID NO: 34 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a31).
  • SEQ ID NO: 35 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a32).
  • SEQ ID NO: 36 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a33).
  • SEQ ID NO: 37 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a34).
  • SEQ ID NO: 38 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a35).
  • SEQ ID NO: 39 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a36).
  • SEQ ID NO: 40 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a37).
  • SEQ ID NO: 41 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a38).
  • SEQ ID NO: 42 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a39).
  • SEQ ID NO: 43 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a40).
  • SEQ ID NO: 44 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a41).
  • SEQ ID NO: 45 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a42).
  • SEQ ID NO: 46 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a43).
  • SEQ ID NO: 47 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a44).
  • SEQ ID NO: 48 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a45).
  • SEQ ID NO: 49 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (a46).
  • SEQ ID NO: 50 is exendin-4.
  • SEQ ID NO: 51 is glycosylated exendin-4 represented by the general formula (2).
  • Sequence number 52 is BIM51077.
  • SEQ ID NO: 53 is glycosylated BIM51077 represented by general formula (3).
  • SEQ ID NO: 54 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (b1).
  • SEQ ID NO: 55 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (b2).
  • SEQ ID NO: 56 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (b3).
  • SEQ ID NO: 57 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (b4).
  • SEQ ID NO: 58 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (b5).
  • SEQ ID NO: 59 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (b6).
  • SEQ ID NO: 60 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (b7).
  • SEQ ID NO: 61 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (b8).
  • SEQ ID NO: 62 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (b9).
  • SEQ ID NO: 63 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (b10).
  • SEQ ID NO: 64 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (b11).
  • SEQ ID NO: 65 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (b12).
  • SEQ ID NO: 66 is a glycosylated GLP-1 peptide represented by (b13).
  • SEQ ID NO: 67 is glycosylated exendin-4 represented by (b14).
  • SEQ ID NO: 68 is glycosylated BIM51077 represented by (b15).
  • SEQ ID NO: 69 is a 31-residue peptide with a protecting group synthesized in Example 1.
  • SEQ ID NO: 70 is a 31-residue peptide with a protecting group synthesized in Example 2.
  • SEQ ID NO: 71 is a 31-residue peptide with a protecting group synthesized in Example 3.
  • SEQ ID NO: 72 is a 31-residue peptide with a protecting group synthesized in Example 4.
  • SEQ ID NO: 73 is a 31-residue peptide with a protecting group synthesized in Example 5.
  • SEQ ID NO: 74 is a 31-residue peptide having a protecting group synthesized in Comparative Example 1.
  • SEQ ID NO: 75 is a 31-residue peptide having a protecting group synthesized in Synthesis Example 2.
  • SEQ ID NO: 76 is a 31-residue peptide synthesized in Synthesis Example 2.
  • SEQ ID NO: 77 is a 31-residue peptide having a protecting group synthesized in Synthesis Example 3.
  • SEQ ID NO: 78 is a 31-residue peptide synthesized in Synthesis Example 3.
  • SEQ ID NO: 79 is a 31-residue peptide with a protecting group synthesized in Synthesis Example 4.
  • SEQ ID NO: 80 is a 31-residue peptide synthesized in Synthesis Example 4.
  • SEQ ID NO: 81 is a 39-residue peptide having a protecting group synthesized in Synthesis Example 5.
  • SEQ ID NO: 82 is the 39-residue peptide synthesized in Synthesis Example 5.
  • SEQ ID NO: 83 is a 30-residue peptide having a protecting group synthesized in Synthesis Example 6.
  • SEQ ID NO: 84 is a 30-residue peptide synthesized in Synthesis Example 6.
  • the present invention provides a glycosylated GLP-1 peptide having increased blood stability and preferably increased blood glucose level inhibitory activity compared to GLP-1.
  • the present invention is particularly useful in the pharmaceutical field.

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Abstract

　本発明は、ＧＬＰ－１と比べて、血中半減期が長く、かつ好ましくは高い血糖値抑制活性を示す糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを提供することを課題とするものである。 　本発明は、（ａ）ＧＬＰ－１；（ｂ）ＧＬＰ－１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；又は、（ｃ）ＧＬＰ－１の類縁体；において少なくとも２個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、ＧＬＰ－１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを提供する。本発明はまた、前記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）において、少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたＧＬＰ－１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、前記糖鎖がオリゴヒアルロン酸を含む糖鎖である糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを提供する。糖鎖付加アミノ酸は、糖鎖とアミノ酸がリンカーを介して結合していてもよい。

Description

糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド
　本発明は、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドに関する。
ＧＬＰ－１（グルカゴン様ペプチド－１：ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ－１）は、糖のホメオスタシスの制御に深く関与する腸起源のペプチドである。ＧＬＰ－１は、グルカゴン前駆体のプレプログルカゴンの組織特異的な翻訳後プロセシングにより腸のＬ細胞において合成され、食事に反応して循環中へ放出される。このペプチドは、腸島軸（ｅｎｔｅｒｏｉｎｓｕｌａｒ　ａｘｉｓ）の主要メディエーターであり、特定の受容体に結合することによって作用する。
　ＧＬＰ－１は、主として膵臓に作用し、β細胞によるインスリン放出をグルコース濃度依存的に促進することが知られている。また、グルカゴンの分泌を抑制し、胃の空洞化を遅らせ、末梢のグルコース処理を高める可能性が示唆されている。
　ＧＬＰ－１の投与によりインスリン非依存型糖尿病患者において食後のグルコースレベルが正常化され得ることから、ＧＬＰ－１の治療薬としての可能性が示唆されている。また、ＧＬＰ－１はインスリン依存型糖尿病患者において血糖コントロールを改善する作用も有している。さらに、ＧＬＰ－１のインスリン放出促進作用は血漿グルコース濃度に依存しているため、低い血漿グルコース濃度ではＧＬＰ－１介在性のインスリン放出が低く、重篤な低血糖症を招かないメリットがある。従って、必要に応じ、血中ＧＬＰ－１量をコントロールすることによって、安全性の高い糖尿病治療が可能になると考えられる。しかしながら、ＧＬＰ－１の血中の半減期は、２～６分と極めて短く、その治療剤としての可能性が限定されるという問題がある。
　このような問題を解決する手段として、ＧＬＰ－１を改変する試みがなされている。例えば、特許文献１には、少なくとも１個のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子に共役的に結合したＧＬＰ－１化合物を含むペグ化ＧＬＰ－１化合物が開示されている。当該ペグ化ＧＬＰ－１化合物では、各ＰＥＧがＧＬＰ－１化合物に、Ｃｙｓ又はＬｙｓアミノ酸にて、もしくはカルボキシ末端アミノ酸にて結合している。当該ペグ化ＧＬＰ－１化合物は、少なくとも１時間の排出半減期を有する。
　特許文献１によれば、非ペグ化（ｕｎＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ペプチドと比べて、半減期が延長され、クリアランスが遅延化された生理活性ペプチドが得られる。また、これらのペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ＧＬＰ－１化合物及び組成物は、糖尿病、肥満、過敏性腸症候群、ならびに血糖を低下させること、胃及び／又は腸運動性を抑制すること、及び、胃及び／又は腸内容排出を抑制すること、又は食物摂取を抑制すること等、健康状態の治療に有用であることが開示されている（例えば、非特許文献１）。
　しかしながら、ＰＥＧは、生体内で代謝されない化合物であるため、ペグ化ＧＬＰ－１化合物の投与を続けると、ＰＥＧが生体内に蓄積され、生体に薬害を与える危険性がある（非特許文献１）。
　また、半減期を延長するために、ＧＬＰ－１やその改変体に糖鎖を付加する方法も提案されている（例えば、特許文献３及び４）。特許文献３には、ＧＬＰ－１の２６位、３４位、および／又は３７位に糖鎖付加アミノ酸を導入する方法等が記載されているが、糖鎖の種類や糖鎖を付加する位置が、必ずしも最適化されているとはいえない。一方、特許文献４には、分子量２００ＫＤａ程度のヒアルロン酸修飾物をＧＬＰ－１アナログに結合させる方法が記載されている。しかしながら、このように巨大なヒアルロン酸分子を大量に製造する場合、長さや構造を均一にするのは困難であり、実際には各ヒアルロン酸の構造や長さにはかなりばらつきが生じているものと考えられる。医薬品として用いる場合には、長さや構造が均一な糖鎖付加ペプチドが必要とされる。
　また、ＧＬＰ－１に類似した構造で、同様の活性を有し、かつ、血中安定性の高い化合物として、トカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ）の唾液から発見されたエキセンジン－４（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）（非特許文献２）が米国で上市されているが、ｅｘｅｎｄｉｎ－４は非ヒト型配列であり、長期投与による中和抗体の出現やそれに伴う薬効の減弱が懸念される（非特許文献３～５）。
　一方、糖鎖は生体内において様々な役割を担っていることが明らかになってきており、その研究の重要性を認識されながらも、構造の複雑さや多様性によって研究が遅れている。組成が一定した糖ペプチドを得るための方法も試みられているが（特許文献２）、簡便さや大量生産の観点から充分な製造方法とは言えず、また、特に生体内に存在する長い糖鎖に関しては実用的な製造方法とはいえない。
特表２００６－５２０８１８号公報 再表２００５－０９５３３１号公報 再表２００６－０９５７７５号広報 国際公開第２００７／０６３９０７号パンフレット Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２，１５２－１５７（１９９８）。 Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．２６７，４０２－５（１９９２） Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｒｉｓｋ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　２，６９－７７（２００６） ＪＡＭＡ．２９８，１９４－２０６（２００７） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　２８，１８７－２１８（２００７）
　本発明の課題は、ＧＬＰ－１と比べて、血中安定性が増大しており、さらに好ましくは、高い血糖値抑制活性を示す、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを提供することにある。
　以上の課題を解決するために本発明は以下の特徴を有し得る。すなわち、本発明は、（ａ）　ＧＬＰ－１；
（ｂ）　ＧＬＰ－１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；又は、
（ｃ）　ＧＬＰ－１の類縁体；
において、少なくとも２個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、ＧＬＰ－１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであり得る。
　また、本発明は、
（ａ）　ＧＬＰ－１；又は、
（ｂ）　ＧＬＰ－１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチドであって、ＧＬＰ－１活性を有するペプチド；
において、少なくとも２個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、ＧＬＰ－１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであり得る。
　また、本発明は、
（ａ）　ＧＬＰ－１において、２以上のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、少なくとも１つの置換部位が、１８、２０、２２、２６、３０、３４又は３６位である糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド；又は、
（ｂ）（ａ）で定義される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド；
であって、ＧＬＰ－１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであり得る。
　また、本発明は、
（ａ）　ＧＬＰ－１において、２以上のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、いずれの置換部位も１８、２０、２２、２６、３０、３４又は３６位からなる群から選択される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド；又は、
（ｂ）（ａ）で定義される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド；
であって、ＧＬＰ－１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであり得る。
　本発明において、糖鎖付加アミノ酸は、実施態様によっては、好ましくは糖鎖付加Ａｓｎ又は糖鎖付加Ｃｙｓであり得るが、これらに限定されない。
　また、本発明において、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドに結合した複数の糖鎖付加アミノ酸は、糖鎖やアミノ酸の種類において同じものであってもよいし、異なるものであってもよい。
　また、本発明において、糖鎖付加アミノ酸においては、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合することも、リンカーを介することなく結合することもできる。実施態様によっては、好ましくは、リンカーを介することなく（直接に）結合している。
　また、本発明において、糖鎖は、４個以上の糖からなる糖鎖であることが、一般には好ましい。さらに、実施態様によっては、５個～１１個の糖からなる糖鎖であることが好ましい場合がある。
　また、本発明において、糖鎖は、実施態様によっては、２本鎖複合型糖鎖が好ましい。また、実施態様によっては、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖及びジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖であることが好ましい場合があるが、これらに限定されない。
　また、本発明において、糖鎖は、実施態様によっては、以下の式で表される糖鎖が好ましい場合があるが、これらに限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 を示す。Ａｃは、アセチル基を示す。］
　また、本発明は、少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換され、該糖鎖がオリゴヒアルロン酸である糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであり得る。オリゴヒアルロン酸としては、例えば、Ｎ－アセチルグルコサミンとグルクロン酸とからなる単位を１単位とした場合に、２単位（４糖）以上８単位以下の糖鎖を挙げることができ、２単位（４糖）や４単位（８糖）とすることができる。
　また、本発明は、少なくとも１個のアミノ酸にリンカーを介して糖鎖が結合している糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであり得る。リンカーが結合するＧＬＰ－１ペプチドのアミノ酸としては、例えばＬｙｓを挙げることができる。この場合、リンカーが、その糖鎖側の末端にアミノ酸を含んでいてもよい。リンカーの糖鎖側末端に含まれるアミノ酸としては、例えばＡｓｎを挙げることができる。
　本発明においては、糖鎖が実質的に均一であることが好ましく、例えば、９０％以上均一、あるいは９９％以上均一であることが好ましい。
　本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは、好ましくは、ＧＬＰ－１と比較して増大した血中安定性を有する。
　本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは、ＧＬＰ－１と比較して好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは２０倍以上のＯＧＴＴ（Ｏｒａｌ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　Ｔｅｓｔ）における血糖値抑制活性を有し得る。
　本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは、ＧＬＰ－１と比較して好ましくは２０倍以上、より好ましくは３０倍以上、さらに好ましくは５０倍以上のＤＰＰ－ＩＶ耐性を有し得る。
　本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを新規な有効成分として医療用途に用いることができる。そのような医療用途としては、ＧＬＰ－１に関連する疾患の治療又は予防が含まれる。そのような疾患の代表例は、例えば、糖尿病である。
　以上述べた本発明の特徴の一又は複数を、任意に組み合わせたものも、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであることはいうまでもない。
　本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは、ＧＬＰ－１と比較して、血中安定性が増大し、また、本発明の一態様において、ＧＬＰ－１と比較して、血糖値抑制活性が増大している。よって、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは、ＧＬＰ－１と比較して、その投与量及び投与回数を低減することができる。
　また、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドに付加される糖鎖は、生体内で容易に分解されるので、その蓄積により生体に薬害を与えることはない。
　また、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドに付加される糖鎖の一部又は全部は、ヒトを含む哺乳類、鳥類等の生体内に存在する糖鎖やその改変体であり、体内に投与しても副作用や抗原性を示す可能性が低い。アレルギー反応や、抗体産生が生じたり、それによって薬効が得られなくなったりする等の心配が少ない。
　さらに、本発明で用いられる糖鎖には、比較的短いものが多いので、複雑な製造工程を経ずに、均一な構造のものを得ることができる。従って、大規模かつ安定に医薬品レベルの高品質な糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを得ることができる。
図１は、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（２６位，３４位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ－１又は１８位，３６位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ－１）又はＧＬＰ－１の投与による血糖値上昇抑制作用を経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）により測定した結果を示す。２６位，３４位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ－１、１８位，３６位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ－１は０．９ｎｍｏｌ／ｋｇ投与し、ＧＬＰ－１は９ｎｍｏｌ／ｋｇ投与した。 図２は、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（２２位，３０位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ－１、２２位，３６位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ－１又は３０位，３６位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ－１）又はＧＬＰ－１の投与による血糖値上昇抑制作用を経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）により測定した結果を示す。２２位，３０位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ－１、２２位，３６位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ－１、３０位，３６位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ－１は０．９ｎｍｏｌ／ｋｇ投与し、ＧＬＰ－１は９ｎｍｏｌ／ｋｇ投与した。 図３は、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（３６位Ｃｙｓ－ヒアルロン酸４糖付加ＧＬＰ－１又は３６位Ｃｙｓ－ヒアルロン酸８糖付加ＧＬＰ－１）又はＧＬＰ－１の投与による血糖値上昇抑制作用を経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）により測定した結果を示す。３６位Ｃｙｓ－ヒアルロン酸４糖付加ＧＬＰ－１、３６位Ｃｙｓ－ヒアルロン酸８糖付加ＧＬＰ－１およびＧＬＰ－１は９ｎｍｏｌ／ｋｇ投与した。 図４は、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（２６位Ｌｙｓ－アシアロ糖鎖Ａｓｎリンカー修飾ＧＬＰ－１）又はＧＬＰ－１の投与による血糖値上昇抑制作用を経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）により測定した結果を示す。２６位Ｌｙｓ－アシアロ糖鎖Ａｓｎリンカー修飾ＧＬＰ－１およびＧＬＰ－１は９ｎｍｏｌ／ｋｇ投与した。 図５は、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの投与量が血糖値上昇抑制作用に与える影響を調べるために実施した経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）の結果を示す。１８位，３６位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ－１は０．９ｎｍｏｌ／ｋｇ投与し、ＧＬＰ－１は９ｎｍｏｌ／ｋｇ投与した。
　本明細書において「ＧＬＰ－１」とは、グルカゴン様ペプチド－１（ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ－１）を示し、ＧＬＰ－１（７－３７）を指す。
　ＧＬＰ－１（７－３７）は、下記のアミノ酸配列を有する。
Ｈｉｓ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ（配列番号２）
　本発明において、「ＧＬＰ－１の類縁体」とは、ＧＬＰ－１と構造上類似したペプチド及び／又はＧＬＰ－１と重複した構造を有するペプチド、例えば：ＧＬＰ－１のアミノ酸において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；ＧＬＰ－１のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド；ＧＬＰ－１改変体；ＧＬＰ－１活性を有するＧＬＰ－１のフラグメント；ＧＬＰ－１活性を有する伸長ＧＬＰ－１；並びにエキセンジン－４（以下、「Ｅｘ－４」と記載する場合もある。）及びその類縁体が挙げられる（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ　８，８４２－８（２００７），Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０７，４９０－４９６（２００３），Ｄｉａｂｅｔｅｓ　５０，２５３０－９（２００１）等）。
　本明細書中において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えば、天然タンパク原性Ｌ－アミノ酸；Ｄ－アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β－アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク原性アミノ酸；及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。非天然アミノ酸の例として、α－メチルアミノ酸（α－メチルアラニンなど）、Ｄ－アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（２－アミノ－ヒスチジン、β－ヒドロキシ－ヒスチジン、ホモヒスチジン、α－フルオロメチル－ヒスチジン及びα－メチル－ヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。ＧＬＰ－１活性を有するＧＬＰ－１類縁体のいくつかは、非天然アミノ酸を含むことが知られる。好ましい態様において、本発明の化合物に含まれるアミノ酸は、天然アミノ酸のみからなる。
　本明細書中において、アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたという場合、置換等されるアミノ酸の個数は、ＧＬＰ－１活性を保持する限り特に限定されないが、１～９個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個程度であるかあるいは全体の長さの２０％以内、好ましくは１０％以内である。置換又は付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸又はアミノ酸アナログであり得、好ましくは天然のアミノ酸である。アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたＧＬＰ－１ペプチドの例としては、例えば、８位のＡｌａと３５位のＧｌｙを非天然アミノ酸のα－メチルアラニン（アミノイソブタン酸、Ａｉｂとも呼ぶ）で置換し、３７位のＧｌｙを欠失させ、３６位のＡｒｇがアミド化されたＢＩＭ５１０７７（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ　８，８４２－８（２００７））が挙げられる。
　本明細書中において、「アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換された」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数及び／又は疎水性指数が類似している置換であって、そのような置換の前後で、ＧＬＰ－１活性の明らかな低下又は消失を生じない置換をいう。
　本明細書中において、「ＧＬＰ－１改変体」とは、ＧＬＰ－１を天然又は人工的に改変した化合物であり、そのような改変としては、例えば、ＧＬＰ－１の１又は複数のアミノ酸残基の、アルキル化、アシル化（例えばアセチル化）、アミド化、カルボキシル化、エステル形成、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、水酸化、標識成分の結合等が挙げられる。
　本明細書中において、「ＧＬＰ－１活性を有するＧＬＰ－１のフラグメント」とは、ＧＬＰ－１のＮ末端及び／又はＣ末端から１個又はそれ以上のアミノ酸が欠失し、かつＧＬＰ－１活性を維持したペプチドである。
　本明細書中において、「ＧＬＰ－１活性を有する伸長ＧＬＰ－１」とは、ＧＬＰ－１のＮ末端及び／又はＣ末端に１個又はそれ以上のアミノ酸が付加され、かつＧＬＰ－１活性を維持したペプチドである（例えば、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２５，３１０９－１４（１９８９）を参照）。
　本明細書中において、「ＧＬＰ－１のＣ末端（３７位）にさらに、１若しくは数個のアミノ酸が付加されたペプチド」という場合、ＧＬＰ－１のＣ末端に付加されたアミノ酸から順に、３８位のアミノ酸、３９位のアミノ酸・・・等と呼び、また、「ＧＬＰ－１のＮ末端（７位）にさらに、１若しくは数個のアミノ酸が付加されたペプチド」という場合、ＧＬＰ－１のＮ末端に付加されたアミノ酸から順に、６位のアミノ酸、５位のアミノ酸・・・等と呼ぶものとする。例えば、「ＧＬＰ－１のＣ末端（３７位）にさらに、１個のアミノ酸が付加されたペプチド」として、ＧＬＰ－１の３７位のＧｌｙにＡｓｎ又はＣｙｓが結合したペプチドが挙げられる。
　本発明の「糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド」は、少なくとも１個のアミノ酸が、糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする。
　本明細書中において、「糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド」には、ＧＬＰ－１の少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたペプチド、上記ＧＬＰ－１類縁体において少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたペプチドが含まれ、それぞれ、さらに糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていても、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドに含まれる。これらのペプチドのＣ末端がアミド化されたペプチド（たとえば、Ｈｉｓ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＮＨ２（配列番号３）のアミノ酸配列を有するＧＬＰ－１（７－３６）ＮＨ２の少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたペプチド）も、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドに含まれる。さらに、これらのペプチドの塩も、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドに含まれる。
　本明細書中において、塩は、酸付加塩又は塩基付加塩のいずれであってもよい。酸付加塩を形成するために通常用いられる酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等の無機酸及びｐ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ－ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等の有機酸である。塩基付加塩としては、水酸化アンモニウム又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等の無機塩基から誘導された塩が挙げられる。特に、薬学的に許容される塩が好ましい。
　本明細書中において、「糖鎖付加アミノ酸」とは、糖鎖が結合したアミノ酸であり、ここで糖鎖とアミノ酸とは、リンカーを介して結合していてもよい。糖鎖とアミノ酸との結合部位に特に制限はないが、糖鎖の還元末端にアミノ酸が結合していることが好ましい。
　糖鎖が結合するアミノ酸の種類に特に限定はなく、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のいずれを用いることもできる。糖鎖付加アミノ酸が生体内に糖ペプチド（糖たんぱく質）として存在するものと同一又は類似の構造を有するという観点からは、糖鎖付加アミノ酸は、Ｎ－結合型糖鎖のような糖鎖付加Ａｓｎ、Ｏ－結合型糖鎖のような糖鎖付加Ｓｅｒ及び糖鎖付加Ｔｈｒが好ましく、特に糖鎖付加Ａｓｎが好ましい。
　また、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとの結合容易性という観点からは、糖鎖付加アミノ酸のアミノ酸は、アスパラギン酸やグルタミン酸等の分子内に２つ以上のカルボキシル基を持つアミノ酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン等の分子内に２以上のアミノ基を持つアミノ酸、セリン、スレオニン、チロシン等の分子内に水酸基を持つアミノ酸、システイン等の分子内にチオール基を持つアミノ酸、アスパラギン、グルタミン等の分子内にアミド基を持つアミノ酸、が好ましい。特に、反応性の観点からは、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミンが好ましい。
　なお、本発明の任意の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドについて、糖鎖構造、糖鎖以外の構造、糖鎖の付加部位及び糖鎖の付加数が同一である場合に、糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ａｓｎ（リンカーを介さない）の場合と糖鎖付加Ｃｙｓ（リンカーを介する）の場合で、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの血糖値上昇抑制活性に大きな違いはみられない。
　糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとしては、当該分野において用いられているものを広く使用することができるが、例えば、－ＮＨ－（ＣＯ）－（ＣＨ２）ａ－ＣＨ２－（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０～４の整数を示す。）、Ｃ１－１０ポリメチレン、－ＣＨ２－Ｒ－（ここで、Ｒは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基及び置換された複素環基からなる群より選択される基から水素原子が１つ脱離して生ずる基である）、－（ＣＯ）－（ＣＨ２）ａ－（ＣＯ）－（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０～４の整数を示す。）等を挙げることができる。
　糖鎖付加アミノ酸において糖鎖とＧＬＰ－１骨格上のアミノ酸がリンカーを介して結合している場合、リンカーが、糖鎖側の末端にアミノ酸を含むことも好ましい。アミノ酸の種類は特に限定されないが、好ましい例としてはＡｓｎを挙げることができる。
　糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合している場合、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合と比較して、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの抗原性は低くなり得る。糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合している場合と比較して、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの血中安定性が高くなり得る。
　なお、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは、その記載（例えば、「アミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド」という記載）によって何ら製造方法が限定されるものではなく、後述のＡ法～Ｃ法のいずれの方法で製造した糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであっても、「アミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド」に含まれる。また、例えば、アミノ酸の結合していない糖鎖を、ペプチド上のアミノ酸に直接又はリンカーを介して結合した糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド；糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドにおいて、付加した糖鎖にさらに糖又は糖鎖を付加することですでに付加された糖鎖を伸長させた糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド；糖鎖付加アミノ酸のアミノ基及び／又はカルボキシル基に１又は数個のアミノ酸を結合させ、さらにこれを１又は複数のＧＬＰ－１フラグメントと連結させた糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド；アミノ酸の結合した糖鎖を、ペプチド上のアミノ酸にリンカーを介して結合した糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド、なども最終的な構造が一致している限り、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドに含まれる。
　ＧＬＰ－１のアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する数は、血中安定性や血糖値抑制活性等の生理活性、最終的な糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドに存在するアミノ酸の個数や糖鎖付加前後の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの分子量、等により適宜調節すればよい。例えば、１～５個置換することが好ましく、１～３個置換することがより好ましい。本発明の一態様においては、２個以上置換することが好ましく、例えば、２～５個置換することが好ましく、２～３個置換することがより好ましい。簡便性の観点からは、１個の置換で所望の活性が得られるのであれば、１個の置換を選択することが好ましいであろう。一般に、ＧＬＰ－１の１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１個以上をさらに糖鎖付加アミノ酸で置換した場合、血中安定性は増大し、血糖値抑制活性は減少する傾向がある（但し、血中安定性が増大することで、減少した血糖値抑制活性を補償することが可能である）。
　本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドにおいて、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、血中安定性や血糖値抑制活性により適宜調節することができる。
　本発明の一態様において、ＧＬＰ－１アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、所望の活性に応じてＧＬＰ－１の任意の部位を選択することができ、例えばＧＬＰ－１の８、９、１２、１８、１９、２０、２２、２６、３０、３４、３６及び３８位（＝３７位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を付加）から選択される１以上の部位であり、好ましくは、１８、２０、２２、２６、３０、３４、３６及び３８位から選択される１以上の部位であり、例えば、１８、２６、３０、３４及び３６位から選択される１以上の部位であり、特に３０及び３６位から選択される１以上の部位である。
　本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの血中安定性という観点からは、ＧＬＰ－１の任意の部位を選択することができ、例えばＧＬＰ－１の９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２２、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３２、３４、３６及び３８位（＝３７位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を付加）から選択される１以上の部位であり、好ましくは９、１０、１１、１２、１４及び２８位から選択される１以上の部位であり、特に好ましくは９、１０、１１及び１２から選択される１以上の部位である。特にＧＬＰ－１のＮ末端に近い部位のアミノ酸の置換も好ましい。特にＧＬＰ－１の２以上のアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位の例として、例えばＧＬＰ－１の１８位と３６位の置換、２６位と３４位の置換、２２位と３０位の置換、２２位と３６位の置換、３０位と３６位の置換などを挙げることができる。
　本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの血糖値抑制作用という観点からは、例えばＧＬＰ－１の１８、２０、２２、２６、３０、３４、３６及び３８位（＝３７位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を付加）から選択される１以上の部位であり、好ましくは１８、２６、３０、３４及び３６位から選択される１以上の部位であり、特に３０及び３６位から選択され１以上の部位である。特にＧＬＰ－１の２以上のアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位の例として、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの血糖値抑制作用という観点から、例えばＧＬＰ－１の１８位と３６位の置換、２６位と３４位の置換、２２位と３０位の置換、２２位と３６位の置換、３０位と３６位の置換などを挙げることができる。
　本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドのＧＬＰ－１活性のうち、ｃＡＭＰ合成能に関する観点からは、好ましくは２２、２６、２７、３０、３４、３６及び３８位（＝３７位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を付加）から選択される１以上の部位であり、より好ましくは２２、２６、３０、３４、３６及び３８位から選択される１以上の部位である。
　本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、ＧＬＰ－１の８、９及び１２位以外の部位から選択される１以上の部位である。
　本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、ＧＬＰ－１の７、１０、１３、１５、１９、２１、２８及び２９位以外の部位から選択される１以上の部位、特に、７、１０、１５及び２８位以外の部位から選択される１以上の部位である。
　本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、ＧＬＰ－１のＧＬＰ－１受容体への結合部位からも、決定することができる。
　本発明の一態様において、２以上のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されている場合に、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、上記のいずれの組み合わせも採用することができるがこれに限定されない。例えば、１の部位が上記の好ましい部位から選択され、他の部位がＧＬＰ－１の任意の部位から選択される組み合わせ；１の部位が上記の好ましい部位から選択され、他の部位がＧＬＰ－１のＣ末端（３７位）にさらに付加された１若しくは数個のアミノ酸の任意の部位から選択される組み合わせ等もまた、本発明の好ましい一態様に含まれる。
　本発明の一態様において、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、ＧＬＰ－１における：　
８位のＡｌａがＧｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸での置換；
９位のＧｌｕがＡｓｐ及びＬｙｓ　からなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
１１位のＴｈｒがＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
１２位のＰｈｅがＴｒｐ及びＴｙｒからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
１３位のＴｈｒがＳｅｒで置換；
１４位のＳｅｒがＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
１５位のＡｓｐがＧｌｕで置換；
１６位のＶａｌがＰｈｅ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｔｙｒ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
１７位のＳｅｒがＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
１８位のＳｅｒがＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
１９位のＴｙｒがＰｈｅ，Ｔｒｐ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
２０位のＬｅｕがＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
２１位のＧｌｕがＡｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
２２位のＧｌｙがＡｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
２３位のＧｌｎがＡｓｎ，Ａｒｇ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
２４位のＡｌａがＧｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ａｒｇ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
２５位のＡｌａが　Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
２６位のＬｙｓがＡｒｇ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＨｉｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
２７位のＧｌｕがＡｓｐ，Ｉｌｅ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
２８位のＰｈｅがＴｒｐで置換；
２９位のＩｌｅがＬｅｕ，Ｖａｌ及びＡｌａからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
３０位のＡｌａがＧｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
３１位のＴｒｐ　がＰｈｅ，Ｔｙｒ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
３２位のＬｅｕ　がＧｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
３３位のＶａｌ　がＧｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
３４位のＬｙｓ　がＡｒｇ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＨｉｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
３５位のＧｌｙ　がＡｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
３６位のＡｒｇがＬｙｓ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＨｉｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；及び／又は３７位のＧｌｙがＡｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
であることが好ましいが、これらに限定されるものではない。
　本発明の一態様において、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加が生ずる部位は、ＧＬＰ－１の７、１０、１３、１５、１９、２１、２８及び２９位以外の部位から選択される１以上の部位、例えば、７、１０、１５及び２８位以外の部位から選択される１以上の部位であることが好ましい（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｌ，ＴＨＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　Ｖｏｌ．２６９，Ｎｏ．９，Ｉｓｓｕｅ　ｏｆ　Ｍａｒｃｈ　４，ｐｐ．６２７６－６２７８．１９９４）。
　本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドとしては、例えば、
一般式（１）
Ｈｉｓ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｘａａ１８－Ｘａａ１９－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｘａａ２２－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｘａａ２６－Ｇｌｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｘａａ３０－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｘａａ３４－Ｇｌｙ－Ｘａａ３６－Ｘａａ３７
［式中、Ｘａａ１８は、Ｓｅｒ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１９は、Ｔｙｒ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、糖鎖付加Ｃｙｓ、糖鎖付加Ａｓｎ、又は糖鎖付加Ｌｙｓを示す。
Ｘａａ３０は、Ａｌａ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ３４は、Ｌｙｓ、糖鎖付加Ｃｙｓ、糖鎖付加Ａｓｎ、又は糖鎖付加Ｌｙｓを示す。
Ｘａａ３６は、Ａｒｇ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ３７は、Ｇｌｙ、ＮＨ２、Ｇｌｙ－糖鎖付加Ｃｙｓ又はＧｌｙ－糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１８がＳｅｒであり、Ｘａａ１９がＴｙｒであり、Ｘａａ２２がＧｌｙであり、Ｘａａ２６がＬｙｓであり、Ｘａａ３０がＡｌａであり、Ｘａａ３４がＬｙｓであり、かつＸａａ３６がＡｒｇである場合、Ｘａａ３７は、Ｇｌｙ－糖鎖付加Ｃｙｓ又はＧｌｙ－糖鎖付加Ａｓｎを示す。］
で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって：２以上のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド；糖鎖がオリゴヒアルロン酸である糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド；糖鎖が高マンノース型糖鎖である糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド等が挙げられる。尚、糖鎖付加Ｃｙｓ、糖鎖付加Ａｓｎ及び糖鎖付加Ｌｙｓは、いずれも糖鎖とアミノ酸との間にリンカーを含んでもよい。本明細書において、一般式（１）で表されるペプチドを配列番号１で示す。
　具体的には、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドとしては、例えば、
（ａ１）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号４）；
（ａ２）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号５）；
（ａ３）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号６）；
（ａ４）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号７）
（ａ５）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号８）
（ａ６）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号９）；
（ａ７）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙ－糖鎖付加Ｃｙｓを示すペプチド（配列番号１０）；
（ａ８）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号１１）；
（ａ９）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号１２）；
（ａ１０）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号１３）；
（ａ１１）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号１４）；
（ａ１２）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号１５）；
（ａ１３）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号１６）；
（ａ１４）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号１７）；
（ａ１５）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙ－糖鎖付加Ａｓｎを示すペプチド（配列番号１８）；
（ａ１６）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号１９）；
（ａ１７）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号２０）；
（ａ１８）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示す化合物（配列番号２１）；
（ａ１９）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示す化合物（配列番号２２）；
（ａ２０）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示す化合物（配列番号２３）；
（ａ２１）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示す化合物（配列番号２４）；
（ａ２２）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号２５）；
（ａ２３）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号２６）；
（ａ２４）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号２７）；
（ａ２５）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号２８）；
（ａ２６）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号２９）；
（ａ２７）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号３０）；
（ａ２８）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号３１）；
（ａ２９）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号３２）；又は
（ａ３０）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号３３）等が挙げられる。
　以上の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの例において、糖鎖は、例えばオリゴヒアルロン酸や、高マンノース型糖鎖であることが好ましい。
　また、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドとしては、
（ａ３１）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ｌｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号３４）；又は
（ａ３２）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４が糖鎖付加Ｌｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号３５）等も挙げられる。
　以上の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの例においては、例えば、糖鎖付加Ｌｙｓにおける糖鎖とＬｙｓがリンカーを介して結合していることが好ましい。
　また、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドとしては、
（ａ３３）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号３６）；
（ａ３４）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号３７）；
（ａ３５）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号３８）；
（ａ３６）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号３９）；
（ａ３７）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号４０）；
（ａ３８）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号４１）；
（ａ３９）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号４２）；
（ａ４０）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号４３）；
（ａ４１）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号４４）；
（ａ４２）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号４５）等も挙げられる。
　以上の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの例において糖鎖は、例えば、２本鎖複合型糖鎖であることが好ましい。
　また、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドとしては、
（ａ４３）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙ－糖鎖付加Ｃｙｓを示すペプチド（配列番号４６）；
（ａ４４）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号４７）；
（ａ４５）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙ－糖鎖付加Ａｓｎを示すペプチド（配列番号４８）；
（ａ４６）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号４９）等も挙げることができる。
　以上の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの例において糖鎖は、例えば、２本鎖複合型糖鎖であることが好ましい。
　また、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド類縁体として、例えば、以下のアミノ酸配列を有するエキセンジン－４に糖鎖を付加したものを挙げることができる。
Ｈ－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－ＮＨ２（配列番号５０）
　糖鎖付加エキセンジン－４は、例えば、以下の一般式（２）で表わされる。
一般式（２）
Ｈ－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｘａａ１２－Ｇｌｎ－Ｘａａ１４－Ｇｌｕ－Ｘａａ１６－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｘａａ２０－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｘａａ２４－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｘａａ２８－Ｇｌｙ－Ｘａａ３０－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－ＮＨ２
［式中、Ｘａａ１２は、Ｌｙｓ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１４は、Ｍｅｔ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１６は、Ｇｌｕ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２０は、Ａｒｇ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２４は、Ｇｌｕ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２８は、Ａｓｎ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ３０は、Ｇｌｙ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１２、Ｘａａ１４、Ｘａａ１６、Ｘａａ２０、Ｘａａ２４、Ｘａａ２８及びＸａａ３０の少なくとも１つは糖鎖付加Ｃｙｓまたは糖鎖付加Ａｓｎである。］（配列番号５１）
　この中でも、例えば、Ｘａａ２４及び／又はＸａａ３０が糖鎖付加Ｃｙｓ又は糖鎖付加Ａｓｎであることが好ましく、特に、Ｘａａ３０が糖鎖付加Ｃｙｓであることが好ましい。
　また、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１のうち、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたＧＬＰ－１に糖鎖を付加した例として、例えば、以下のアミノ酸配列を有するＢＩＭ５１０７７に糖鎖を付加したものを挙げることができる。
Ｈｉｓ－Ｒ２－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｒ２－Ａｒｇ－ＮＨ２
［式中、Ｒ２は、α－メチルアラニンを示す。］（配列番号５２）
糖鎖付加ＢＩＭ５１０７７は、例えば、以下の一般式（３）で表わされる。
一般式（３）
Ｈｉｓ－Ｒ２－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｘａａ１８－Ｔｙｒ－Ｘａａ２０－Ｇｌｕ－Ｘａａ２２－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｘａａ２６－Ｇｌｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｘａａ３０－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｘａａ３４－Ｒ２－Ｘａａ３６－ＮＨ２
［式中、Ｒ２は、α－メチルアラニンを示し、
Ｘａａ１８は、Ｓｅｒ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２０は、Ｌｅｕ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、糖鎖付加Ｃｙｓ、糖鎖付加Ａｓｎ、又は糖鎖付加Ｌｙｓを示す。
Ｘａａ３０は、Ａｌａ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ３４は、Ｌｙｓ、糖鎖付加Ｃｙｓ、糖鎖付加Ａｓｎ、又は糖鎖付加Ｌｙｓを示す。
Ｘａａ３６は、Ａｒｇ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１８、Ｘａａ２０、Ｘａａ２２、Ｘａａ２６、Ｘａａ３０、Ｘａａ３４及びＸａａ３６のすくなくとも１つは糖鎖付加Ｃｙｓまたは糖鎖付化Ａｓｎである。］（配列番号５３）
　なお、エキセンジン－４やＢＩＭ５１０７７のように、本来Ｃ末端がアミド化されているペプチドについては、当該Ｃ末端のアミノ酸に糖鎖を付加した糖鎖付加アミノ酸を合成する場合、Ｃ末端をアミド化しない場合もある。
　本明細書中において、「糖鎖」とは、単位糖（単糖及び／又はその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される単糖類及び多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、シアル酸並びにそれらの複合体及び誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解又は誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。糖鎖は直鎖型であっても分岐鎖型であってもよい。
　また、本明細書中において、「糖鎖」には糖鎖の誘導体も含まれ、糖鎖の誘導体としては、例えば、糖鎖を構成する糖が、カルボキシル基を有する糖（例えば、Ｃ－１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ－グルコースが酸化されたＤ－グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ－グルコースが酸化されたＤ－グルクロン酸））、アミノ基又はアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミンなど）、アミノ基及びカルボキシル基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ－アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ－アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２－デオキシ－Ｄ－リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などである糖鎖が挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明において、好ましい糖鎖は、ＧＬＰ－１に付加された場合（糖鎖付加アミノ酸の形でＧＬＰ－１のアミノ酸と置換された場合）に、ＧＬＰ－１の血中安定性を増大させ、かつ、より好ましくは血糖値抑制活性を消失させない糖鎖である。本発明のある態様において、好ましい糖鎖は、ＧＬＰ－１に付加された場合（糖鎖付加アミノ酸の形でＧＬＰ－１のアミノ酸と置換された場合）に、ＧＬＰ－１の血糖値抑制活性を増大させる糖鎖である。
　本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドにおける糖鎖は特に限定されず、生体内で複合糖質（糖ペプチド（又は糖タンパク質）、プロテオグリカン、糖脂質等）として存在する糖鎖であってもよいし、生体内では複合糖質として存在しない糖鎖であってもよい。
　生体内で複合糖質として存在する糖鎖は、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドが生体に投与されるという観点から好ましい。かかる糖鎖としては、生体内で糖ペプチド（又は糖タンパク質）としてペプチド（又はタンパク質）に結合している糖鎖であるＮ－結合型糖鎖、Ｏ－結合型糖鎖等が挙げられる。好ましくは、Ｎ－結合型糖鎖が用いられる。Ｎ結合型糖鎖としては、例えば、高マンノース（ハイマンノース）型、複合（コンプレックス）型、混成（ハイブリッド）型を挙げることができ、特に好ましくは、複合型が良い。
　本発明で使用する好ましい複合型糖鎖としては、例えば、下記一般式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 ［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 を示す。Ａｃはアセチル基を示す。］
で表される糖鎖等が挙げられる。
　尚、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドにおいては、糖鎖が生体内で複合糖質として存在する糖鎖であっても、Ｏ－結合型及びＮ－結合型以外の方法でＧＬＰ－１ペプチドに結合していてもよい。例えば、上述のとおり、糖鎖がリンカーを介してＣｙｓやＬｙｓに結合しているものも、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドに含まれる。
　本発明の好ましい一態様において、糖鎖は、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ～Ｃ、ヘパリン、へパラン硫酸、ケラタン硫酸を含む、比較的低分子のグリコサミノグリカンである。これらの糖鎖は、アミノ糖（Ｎ－アセチルグルコサミン又はＮ－アセチルガラクトサミン）と、ウロン酸（グルクロン酸又はＬ－イズロン酸）とからなる二糖単位の繰り返しが直鎖状に連なっている。なお、本明細書において、比較的低分子のグリコサミノグリカンとは、例えば分子量が約１０ｋＤａ以下、好ましくは６ｋＤａ以下、さらに好ましくは約４ｋＤａ以下であること、あるいは、糖の数が約５０個以下、好ましくは３０個以下、さらに好ましくは２０個以下であることをいう。
　本発明の一態様において、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドにおける糖鎖は、４個以上、例えば５個以上、７個以上、特に９個以上、１１個以上の糖からなる糖鎖であることが好ましい。
　本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドにおける糖鎖は、５～１１個、９～１１個又は１１個の糖からなる糖鎖である。
　本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドにおける糖鎖は、２本鎖の複合型糖鎖である。複合型糖鎖とは、２種類以上の単糖を含み、以下に示す基本構造と、Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃで示されるラクトサミン構造を有することを特徴とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 　２本鎖複合型糖鎖とは、基本構造の末端の２つのマンノースに、それぞれ０～３糖からなる１本鎖の糖鎖が結合しているものをいう。２本鎖複合型糖鎖としては、例えば、以下に示すジシアロ糖鎖、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 モノシアロ糖鎖、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 アシアロ糖鎖、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ジグルクナック糖鎖、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 ジマンノース糖鎖、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 等が好ましく、より好ましくはジシアロ糖鎖である。
　また、本明細書中において「ジシアロ糖鎖」、「モノシアロ糖鎖」、「アシアロ糖鎖」、「ジグルクナック糖鎖」、「ジマンノース糖鎖」には、上記化学式で示したもののほか、化学式で示した例と結合様式の異なるものも含まれ、かかる糖鎖も本発明の糖鎖として好ましく用いられる。かかる糖鎖としては、例えば、ジシアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖においてシアル酸とガラクトースが（α２→３）結合で結合しているもの等が挙げられる。
　また、本発明で用いられる高マンノース型糖鎖は、上述した複合型糖鎖の基本構造に、さらにマンノースが２個以上結合している糖鎖である。高マンノース型糖鎖は嵩高いので、ペプチドに高マンノース型糖鎖を結合させることにより血中安定性がより高くなりうる。哺乳類の高マンノース型糖鎖のように、５～９個のマンノースを含む糖鎖が好ましいが、酵母の高マンノース型糖鎖のように、より多くのマンノースを含む糖鎖であってもよい。本発明に好ましく用いられる高マンノース型糖鎖としては、例えば、
ハイマンノース－５（Ｍ－５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 ハイマンノース－９（Ｍ－９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 等を挙げることができる。
　本発明において、好ましい糖鎖としては、例えば、ヒト体内において、タンパク質と結合した糖タンパク質として存在する糖鎖（例えば、「ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴＥＲＳ　Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．３，Ｆｅｂ．１９７５」に記載の糖鎖）と、同一の構造を有する糖鎖（構成糖の種類及びそれらの結合様式が同一の糖鎖）又はこれの非還元末端から１又は複数の糖を失った糖鎖である、下記表１～４に記載の糖鎖を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　また、本発明の一態様において、好ましい糖鎖は、直鎖構造を有する糖鎖である。かかる糖鎖としては、例えば、オリゴヒアルロン酸が挙げられる。本明細書において、オリゴヒアルロン酸とは、Ｎ－アセチルグルコサミンとグルクロン酸が交互に２～３２糖、好ましくは２～１６糖、より好ましくは４～８糖、直鎖上に結合した糖鎖をいう。
　本発明に用いられるオリゴヒアルロン酸のうち、特に好ましいものとして、Ｎ－アセチルグルコサミンとグルクロン酸とからなる単位を１単位とした場合、２単位（４糖）以上８単位（１６糖）以下の糖鎖が挙げられ、さらに好ましくは、２単位（４糖）～４単位（８糖）、最も好ましくは２単位（４糖）である。
　本発明に好ましく用いられるヒアルロン酸としては、例えば、
４糖のオリゴヒアルロン酸、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 ８糖のオリゴヒアルロン酸
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 等が挙げられる。
　本発明の好ましい一態様において、本発明の糖ペプチドにおける糖鎖の構造は、均一である。本明細書中において、糖ペプチドにおける糖鎖の構造が均一であるとは、糖ペプチド間で比較した場合に、ペプチド中の糖鎖付加部位、糖鎖を構成する各糖の種類、結合順序、及び糖間の結合様式が同一であることをいい、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の糖鎖の構造が均一であることを言う。糖鎖が均一である糖ペプチドは、品質が一定であり、特に医薬品の製造や、アッセイなどの分野において好ましい。均一な糖鎖の割合は、例えば、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動、ＮＭＲ、質量分析等を用いた方法によって測定することが可能である。
　本発明において、好ましい糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは、例えば、後述の実施例１～１５において製造した糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（配列番号５４～６６）である。すなわち、以下のＧＬＰ－１の配列：
Ｈｉｓ７－Ａｌａ８－Ｇｌｕ９－Ｇｌｙ１０－Ｔｈｒ１１－Ｐｈｅ１２－Ｔｈｒ１３－Ｓｅｒ１４－Ａｓｐ１５－Ｖａｌ１６－Ｓｅｒ１７－Ｓｅｒ１８－Ｔｙｒ１９－Ｌｅｕ２０－Ｇｌｕ２１－Ｇｌｙ２２－Ｇｌｎ２３－Ａｌａ２４－Ａｌａ２５－Ｌｙｓ２６－Ｇｌｕ２７－Ｐｈｅ２８－Ｉｌｅ２９－Ａｌａ３０－Ｔｒｐ３１－Ｌｅｕ３２－Ｖａｌ３３－Ｌｙｓ３４－Ｇｌｙ３５－Ａｒｇ３６－Ｇｌｙ３７（配列番号２）において：
（ｂ１）２６位のＬｙｓ及び３４位のＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例１）（配列番号５４）；
（ｂ２）１８位のＳｅｒ及び３６位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例２）（配列番号５５）；
（ｂ３）２２位のＧｌｙ及び３０位のＡｌａがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例３）（配列番号５６）；
（ｂ４）２２位のＧｌｙ及び３６位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例４）（配列番号５７）；
（ｂ５）３０位のＡｌａ及び３６位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例５）（配列番号５８）；
（ｂ６）３０位のＡｌａがオリゴヒアルロン酸４糖（ＨＡ－４）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例６）（配列番号５９）；
（ｂ７）３０位のＡｌａがオリゴヒアルロン酸８糖（ＨＡ－８）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例７）（配列番号６０）；
（ｂ８）３６位のＡｒｇがオリゴヒアルロン酸４糖（ＨＡ－４）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例８）（配列番号６１）；
（ｂ９）３６位のＡｒｇがオリゴヒアルロン酸８糖（ＨＡ－８）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例９）（配列番号６２）；
（ｂ１０）３０位のＡｌａがオリゴヒアルロン酸１６糖（ＨＡ－１６）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例１０）（配列番号６３）；
（ｂ１１）３６位のＡｒｇがオリゴヒアルロン酸１６糖（ＨＡ－１６）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例１１）（配列番号６４）；
（ｂ１２）３６位のＡｒｇが高マンノース型糖鎖（Ｍ５）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例１２）（配列番号６５）；
（ｂ１３）２６位のＬｙｓに、リンカーを介してアシアロ糖鎖付加Ａｓｎが結合した糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例１３）（配列番号６６）である。
また、
（ｂ１４）以下のエキセンジン－４の配列：
Ｈ－Ｈｉｓ１－Ｇｌｙ２－Ｇｌｕ３－Ｇｌｙ４－Ｔｈｒ５－Ｐｈｅ６－Ｔｈｒ７－Ｓｅｒ８－Ａｓｐ９－Ｌｅｕ１０－Ｓｅｒ１１－Ｌｙｓ１２－Ｇｌｎ１３－Ｍｅｔ１４－Ｇｌｕ１５－Ｇｌｕ１６－Ｇｌｕ１７－Ａｌａ１８－Ｖａｌ１９－Ａｒｇ２０－Ｌｅｕ２１－Ｐｈｅ２２－Ｉｌｅ２３－Ｇｌｕ２４－Ｔｒｐ２５－Ｌｅｕ２６－Ｌｙｓ２７－Ａｓｎ２８－Ｇｌｙ２９－Ｇｌｙ３０－Ｐｒｏ３１－Ｓｅｒ３２－Ｓｅｒ３３－Ｇｌｙ３４－Ａｌａ３５－Ｐｒｏ３６－Ｐｒｏ３７－Ｐｒｏ３８－Ｓｅｒ３９－ＮＨ２（配列番号５０）において：
３０位のＧｌｙがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例１４）（配列番号６７）である。
　さらに、
（ｂ１５）以下のＢＩＭ５１０７７の配列：
Ｈｉｓ７－Ｒ２８－Ｇｌｕ９－Ｇｌｙ１０－Ｔｈｒ１１－Ｐｈｅ１２－Ｔｈｒ１３－Ｓｅｒ１４－Ａｓｐ１５－Ｖａｌ１６－Ｓｅｒ１７－Ｓｅｒ１８－Ｔｙｒ１９－Ｌｅｕ２０－Ｇｌｕ２１－Ｇｌｙ２２－Ｇｌｎ２３－Ａｌａ２４－Ａｌａ２５－Ｌｙｓ２６－Ｇｌｕ２７－Ｐｈｅ２８－Ｉｌｅ２９－Ａｌａ３０－Ｔｒｐ３１－Ｌｅｕ３２－Ｖａｌ３３－Ｌｙｓ３４－Ｒ２３５－Ａｒｇ３６－ＮＨ２［式中、Ｒ２はα－メチルアラニンを示す。］（配列番号５２）において：
２６位のＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例１５）（配列番号６８）である。
　また、
（ｂ１６）上記エキセンジン‐４の配列（配列番号５０）において、３０位のＧｌｙが高マンノース型糖鎖（Ｍ５）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例１６）である。
　本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは、当業者に公知のペプチド合成方法に、糖鎖付加工程を組み込むことで製造することができる。糖鎖付加に際しては、トランスグルタミナーゼに代表される、酵素の逆反応を利用する方法も用いることができるが、この場合、付加する糖鎖が大量に必要になる、最終工程後の精製が煩雑になる、糖鎖の付加位置及び付加可能な糖鎖が制限される、等の問題があるため、アッセイ用等の少量の合成には用いることが可能でも、医薬品製造等の大規模な製造には実用的な方法とは言えないことがある。
　本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの簡便な製造方法であって、かつ、糖鎖の構造が均一である糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの安定した製造方法の具体例として、以下、糖鎖付加アミノ酸として糖鎖付加Ａｓｎを使用し、固相合成、液相合成等の公知のペプチド合成方法を適用することにより糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを製造する方法（Ａ法）、及びＧＬＰ－１の任意のアミノ酸をＣｙｓで置換したペプチドを公知のペプチド合成方法に従って製造し、その後、Ｃｙｓに化学合成により糖鎖を付加し、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを製造する方法（Ｂ法）を例示する。さらに、糖鎖付加アミノ酸において糖鎖とアミノ酸がリンカーを介して結合しており、且つ、当該リンカーが糖鎖側末端にアミノ酸を含む糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの製造例として、まず糖鎖付加Ａｓｎにリンカーの一端を結合した後、リンカーの他端にＮ－ヒドロキシコハク酸イミジル基を結合させ、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミジル基をＧＬＰ－１ペプチドのＬｙｓ残基の側鎖アミノ基と反応させて、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを製造する方法（Ｃ法）を示す。これらの製造方法を参考に、当業者であれば様々な糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを製造することが可能であり、得られる糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド及びその製造方法は、特に医薬品製造の分野において、非常に有用である。また、これらのＡ法～Ｃ法は、２つ以上を組み合わせて行うことも可能である。アッセイなどに用いる少量の合成であれば、さらに、上記の方法に、転移酵素による糖鎖伸長反応を組み合わせることも可能である。なお、Ａ法は、国際公開第ＷＯ２００４／００５３３０号パンフレット（ＵＳ２００５２２２３８２（Ａ１））に、Ｂ法は、国際公開第ＷＯ２００５／０１００５３号パンフレット（ＵＳ２００７０６０５４３（Ａ１））に、それぞれ記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。また、Ａ法乃至Ｃ法において用いられる糖鎖構造が均一な糖鎖の製造に関しては、第ＷＯ０３／００８４３１号パンフレット（ＵＳ２００４１８１０５４（Ａ１））、第ＷＯ２００４／０５８９８４号パンフレット（ＵＳ２００６２２８７８４（Ａ１））、第ＷＯ２００４／０５８８２４号パンフレット（ＵＳ２００６００９４２１（Ａ１））、第ＷＯ２００４／０７００４６号パンフレット（ＵＳ２００６２０５０３９（Ａ１））、第ＷＯ２００７／０１１０５５号パンフレット等に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
　糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを製造する方法（Ａ法）
　先ず、（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基をエステル化反応させる。この場合アミノ酸のアミノ基窒素を脂溶性保護基で保護しているので、アミノ酸同士の自己縮合は防止され、レジンの水酸基とアミノ酸のカルボキシル基が反応してエステル化が起こる。
次に（２）上記で得られたエステルの脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、（３）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
（４）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（５）上記（３）及び（４）の工程を１回以上繰り返すことにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結した、末端にレジンを結合し、他端に遊離アミノ基を有するペプチドが得られる。
（６）次に、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギン（糖鎖付加アスパラギン）のアスパラギン部分のカルボキシル基と上記遊離アミノ基をアミド化反応させ、
（７）更に上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（８）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
（９）上記（７）及び（８）の工程を１回以上繰り返し、
（１０）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させることにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結した、末端にレジンを結合し、他端に遊離アミノ基を有し、中間に糖鎖アスパラギンを有する糖ペプチドが得られる。
（１１）そして、酸で樹脂（レジン）を切断することにより、糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することができる。
　また、この糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の端部に導入することもできる。
　水酸基を有する樹脂（レジン）としては、通常、固相合成で使用する水酸基を有する樹脂（レジン）であればよく、例えば、Ａｍｉｎｏ－ＰＥＧＡレジン（メルク社製）Ｗａｎｇレジン（メルク社製）、ＨＭＰＡ－ＰＥＧＡレジン（メルク社製）等を用いることができる。
　アミノ酸としては全てのアミノ酸を用いることができ、例えば、天然アミノ酸である、セリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）を挙げることができる。
　脂溶性保護基としては、例えば９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基等の、カーボネート系又はアミド系の保護基等を挙げることができる。脂溶性保護基を導入するには、例えばＦｍｏｃ基を導入する場合には９－フルオレニルメチル－Ｎ－スクシニミジルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は０～５０℃、好ましくは室温で、約１～５時間程度行うのが良い。
　脂溶性保護基で保護したアミノ酸としては、上記のアミノ酸を上記の方法で製造することができる。また、市販のものも使用することができる。例えば、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ－ＡＩａ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏを挙げることができる。
　エステル化触媒として、例えば１－メシチレンスルホニル－３－ニトロ－１，２，４－トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。アミノ酸と脱水縮合剤との使用割合は、前者１重量部に対して、後者が、通常１～１０重量部、好ましくは２～５重量部である。
　エステル化反応は、例えば、固相カラムにレジンを入れ、このレジンを溶剤で洗浄し、その後アミノ酸の溶液を加えることにより行うのが好ましい。洗浄用溶剤としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２－プロパノール、塩化メチレン等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。エステル化反応は０～５０℃、好ましくは室温で、約１０分～３０時間程度、好ましくは１５分～２４時間程度行うのが良い。
　この時固相上の未反応の水酸基を無水酢酸等を用いてアセチル化してキャッピングすることも好ましい。
　脂溶性保護基の脱離は、例えば塩基で処理することにより行うことができる。塩基としては、例えばピペリジン、モルホリン等を挙げることができる。その際、溶媒の存在下行うのが好ましい。溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール等を挙げることができる。
　遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とのアミド化反応は、活性化剤及び溶媒の存在下行うのが好ましい。
　活性化剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ／ＨＣｌ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－トリスピロリジノホスホニウム（ＤＩＰＣＩ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、ヒドロキシフタルイミド（ＨＯＰｈｔ）、ペンタフルオロフェノール（Ｐｆｐ－ＯＨ）、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスホネート（ＨＡＴＵ）、Ｏ－ベンゾトリアゾール－１－イル－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロジ－４－オキサ－１，２，３－ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ）等を挙げることができる。
　活性化剤の使用量は、脂溶性の保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、１～２０当量、好ましくは１～１０当量、さらに好ましくは、１～５当量とするのが好ましい。
　溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。反応は０～５０℃、好ましくは室温で、約１０～３０時間程度、好ましくは１５分～２４時間程度行うのが良い。脂溶性保護基の脱離は、上記と同様に行うことができる。
　樹脂（レジン）からペプチド鎖を切断するには酸で処理するのが好ましい。酸としては、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、弗化水素（ＨＦ）等を挙げることができる。
　上記（６）の、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基とペプチドの遊離アミノ基をアミド化反応させ、（７）の、上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程を、適宜追加することにより、少なくとも２以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することができる。またこの時、異なる糖鎖アスパラギンを用いることにより２種以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することもできる。
　また上記（６）の、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基とアミド化反応させ、（７）の、上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程を、最終工程、即ち工程（９）及び（１０）に代えて行うことにより、少なくとも１以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖に有する糖ペプチドを製造することができる。
　また、上記工程（１）を行う際、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸に代えて、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基を、レジンの水酸基とエステル化反応させることにより、Ｃ末端に糖鎖アスパラギンを有する糖ペプチドを製造することができる。このとき、工程（６）をさらに行ってもよく、行わなくてもよい。
　このようにして、所望の位置を糖鎖付加Ａｓｎで置換した糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを得ることができる。
　糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを製造する方法（Ｂ法）
　先ず、Ｃｙｓを含むペプチドを、固相合成法、液相合成法、細胞による合成、天然に存在するものを分離抽出する方法等により製造する。Ｃｙｓの位置を変えることにより、所望の位置に糖鎖を付加することができる。
　次に、ハロアセタミド化複合型糖鎖誘導体を上記で得たＣｙｓを含むペプチドと反応させることにより製造する。上記反応は、通常０～８０℃、好ましくは、１０～６０℃、更に好ましくは１５～３５℃で行うのが良い。反応時間は、好ましくは、通常３０分～５時間程度である。反応終了後は、適宜、公知の方法（例えば、高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））で精製するのが良い。
　ハロアセタミド化複合型糖鎖誘導体は、例えば、複合型アスパラギン結合型糖鎖の１位の炭素に結合している水酸基を、－ＮＨ－（ＣＯ）－（ＣＨ２）ａ－ＣＨ２Ｘ（Ｘはハロゲン原子、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０～４の整数を示す。）で置換した化合物である。
　具体的には、ハロアセタミド化複合型糖鎖誘導体とＣｙｓ含有ペプチドとをリン酸緩衝液中、室温で反応させる。反応終了後、ＨＰＬＣで精製することにより糖鎖付加Ｃｙｓで置換した糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを得ることができる。
　糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを製造する方法（Ｃ法）
　先ず、Ｌｙｓを含むペプチドを、固相合成法、液相合成法、細胞による合成、天然に存在するものを分離抽出する方法等により製造する。
　次に、糖鎖付加アミノ酸に、グルタル酸を結合させる。例えば、糖鎖付加アミノ酸をＤＭＳＯ溶液に溶解させ、この溶液に、グルタル酸－ＥＤＣ混合のＤＭＳＯ溶液を加え、室温で１日撹拌する。反応混合物を適宜希釈した後、分子量排除ゲルクロマトグラフィー等で分画することにより、α－アミノ基にグルタル酸を結合させた糖鎖付加アミノ酸を得ることができる。
　次いで、グルタル酸結合糖鎖付加アミノ酸のＤＭＳＯ溶液に、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミドのＤＭＳＯ溶液およびＥＤＣのＤＭＳＯ溶液を加え、室温で６時間撹拌した後、ＥＤＣを不活化することにより、グルタル酸結合糖鎖付加アミノ酸のＮ－ヒドロキシコハク酸イミジルエステルを合成することができる。
　続いて、ＧＬＰ－１ペプチドのＤＭＳＯ溶液に、ＤＩＰＥＡ及びグルタル酸結合糖鎖付加アミノ酸のＮ－ヒドロキシコハク酸イミジルエステルを加え、室温で２時間撹拌した後、グリシン水溶液を加えて反応を停止し、適宜精製することにより、ＧＬＰ－１ペプチドのＬｙｓ残基にグルタル酸リンカーを介して糖鎖付加アミノ酸を結合させることができる。こうして、糖鎖付加アミノ酸において糖鎖とアミノ酸（Ｌｙｓ）がリンカーを介して結合し、該リンカーが糖鎖側の末端にアミノ酸（Ａｓｎ）を含む糖鎖付加ＧＬＰ－１が得られる。
　ＧＬＰ－１ペプチドの所望の部位のアミノ酸をＬｙｓに置換したり、ＧＬＰ－１ペプチドの野生型に含まれるＬｙｓ残基を他のアミノ酸で置換したりすることにより、所望の部位に糖鎖付加アミノ酸を結合させた糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを得ることが可能である。また、Ｃ法によれば、野生型ＧＬＰ－１に含まれるＬｙｓに糖鎖付加する場合、ペプチド骨格が野生型と同一の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを得ることができる。
　本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは、ＧＬＰ－１活性を有する。
　本明細書中において、「ＧＬＰ－１活性」とは、ＧＬＰ－１について公知の生理活性の一部又は全部をいう。ＧＬＰ－１は、血糖値抑制作用のほか、例えば、膵島作用として、ｃＡＭＰ合成誘導に伴うインスリン分泌、膵島保護（アポトーシス抑制）、膵島増殖、膵外作用として、食欲抑制、消化管運動抑制、カルシトニン分泌促進、虚血時の心保護作用等を有することが知られる。従って、ＧＬＰ－１活性とは、これらの作用に関連する生理活性の全部又は一部を指し、それぞれ、当業者に公知の手法を用いて測定することができる。
　例えば、ＧＬＰ－１活性のうち、血糖値抑制活性は、糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂマウス）における血糖値低下作用の測定や、経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ：　Ｏｒａｌ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　Ｔｅｓｔ）における血糖値上昇抑制作用の測定などを用いて測定することができる。なお、本明細書中において、「血糖値抑制」とは、血糖値の上昇を抑制すること及び血糖値を低下させることのいずれの概念も含む。特に、本明細書中において、ｄｂ／ｄｂマウスにおける血糖値抑制作用を「血糖値低下作用」、ＯＧＴＴにおける血糖値抑制作用を「血糖値上昇抑制作用」ということがある。
　ＯＧＴＴによる血糖値抑制活性は、マウスに強制的に糖を飲ませた際の血糖値上昇の抑制の測定によって判断することができる。例えば、後述の試験例２の手法を用いた場合、まず、被験化合物を一晩絶食させたマウスに投与し、その３０分後にグルコース溶液を経口投与する。グルコース投与によりマウス血糖値は上昇し、投与後約３０分後に最大となり徐々に減少する。グルコース投与後３０分の血糖値を測定し、ＧＬＰ－１投与の場合の血糖値と比較することで、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの血糖値抑制作用を測定することができる。この３０分後の血糖値をＧＬＰ－１を投与した場合と比較した場合、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは、好ましくは８０％以下、より好ましくは６０％以下、さらに好ましくは４０％以下、特に好ましくは３０％以下の血糖値を示す。また、ＯＧＴＴにおいて同程度の血糖値上昇抑制作用が確認された際の投与量を比較することで、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの血糖値抑制活性の強さを判断することができる。例えば、ＧＬＰ－１を１０投与した場合と、ある糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを１投与した場合で同じ血糖値抑制作用が得られる場合、該糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの血糖値抑制活性は、ＧＬＰ－１の１０倍である。本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは、ＧＬＰ－１と比較して、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上もしくはそれ以上の血糖値抑制活性を有する。
　なお、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドが、ＧＬＰ－１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチドに糖鎖付加したものである場合や、ＧＬＰ－１類縁体に糖鎖付加したものである場合、ＧＬＰ－１活性を比較する対象として、ＧＬＰ－１類縁体や、その糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドと糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸配列が同一であるＧＬＰ－１ペプチドを用いてもよい。
　ｄｂ／ｄｂマウスを用いた血糖値抑制活性は、糖尿病マウスに被験化合物を投与後の血糖値の測定によって判断することができる。例えば、被験化合物投与後の血糖値を経時で測定し、例えば投与後１２０分の血糖値が投与時より低下していれば、血糖値低下作用を確認することができる。また、例えば投与後３００分の血糖値を測定することで、血糖値低下作用の持続性も判断することができる。例えば、投与後１２０分の血糖値をＧＬＰ－１投与の場合と比較した場合、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは、好ましくは８０％以下、より好ましくは７０％以下、特に好ましくは６０％以下、の血糖値を示す。また、投与後１２０分の血糖値を、投与時の血糖値と比較した場合、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは、好ましくは７０％以下、より好ましくは６０％以下、特に好ましくは５０％以下（例えば４５％以下）の血糖値を示す。投与後３００分の血糖値をＧＬＰ－１投与の場合と比較した場合、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは、好ましくは７０％以下、より好ましくは５０％以下の血糖値を示す。また、投与後３００分の血糖値を、投与時の血糖値と比較した場合、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは、好ましくは７０％以下、より好ましくは５０％以下の血糖値を示す。
　なお、血糖値抑制活性がＧＬＰ－１と比較して低い場合あっても、血中安定性が増大することで、この活性の低さを補償することができる。
　例えば、ＧＬＰ－１活性のうち、インスリン分泌活性は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのｃＡＭＰ合成能試験などを用いて測定することができる。ＧＬＰ－１はＧＬＰ－１受容体と結合することにより細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させ、インシュリン分泌を促進させる。従って、例えば、マウスＧＬＰ－１受容体発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞を糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドで刺激し、細胞内で合成されるｃＡＭＰ量を測定し、ＥＣ５０値をＧＬＰ－１と比較することで、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドのインスリン分泌活性を測定することができる。
　本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは、ＧＬＰ－１よりも増大した血中安定性を有する。血中安定性は当業者に公知の手法を用いて測定することができ、例えば、血漿中における安定性や、ＤＰＰ－ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）に対する耐性を測定し、半減期、ＡＵＣ（薬物血中濃度－時間曲線下面積）等を指標に判断することができる。また、腎クリアランスの増大も血中安定性の増大に寄与する。
　本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは、ＧＬＰ－１と比較して、血漿中における安定性が増大している。
　ＤＰＰ－ＩＶに対する耐性は、例えば後述の試験例１のように、ＤＰＰ－ＩＶ溶液中における半減期の測定により判断することができる。本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは、ＧＬＰ－１と比較して、ＤＰＰ－ＩＶに対する耐性が増大しており、例えば後述の試験例１の手法を用いてＤＰＰ－ＩＶに対する耐性を測定した場合、その半減期は、ＧＬＰ－１と比較して１．２倍以上、（例えば２倍以上）、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上、特に好ましくは２０倍以上（例えば１００倍以上）増大している。
　また、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは、好ましくは少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも３、５、７、１０、１５、２０時間及びさらに好ましくは少なくとも２４時間の血中半減期を有する。
　次に、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物について説明する。
　本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、ＧＬＰ－１に関連する疾患の治療又は予防に有効である。上述の通り、ＧＬＰ－１には種々の作用が知られており、これらの作用に関連する疾患も様々である。例えば、ＧＬＰ－１が、インスリン放出を刺激することにより、細胞によるグルコース取り込み及び血糖値の低下を引き起こすことが見出されている。また、胃及び／又は腸運動性を抑制すること、胃及び／又は腸内容排出を抑制すること並びに食物摂取を抑制することも見出されている。従って、ＧＬＰ－１に関連する疾患には、例えば、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、インスリン依存性糖尿病、脳卒中（Ｅｆｅｎｄｉｃによる国際公開公報第ＷＯ００／１６７９７号パンフレットを参照）、心筋梗塞（Ｅｆｅｎｄｉｃによる国際公開公報第ＷＯ９８／０８５３１号パンフレットを参照）、肥満（Ｅｆｅｎｄｉｃによる国際公開公報第ＷＯ９８／１９６９８号パンフレットを参照）、機能性消化不良、過敏性腸症候群（Ｅｆｅｎｄｉｃによる国際公開公報第ＷＯ９９／６４０６０号パンフレットを参照）、膵島移植が含まれる。本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、特に糖尿病の治療又は予防に有効であり、より特定すれば、１型糖尿病の予防、２型糖尿病の治療に有効である。
　上記医薬組成物は、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤を用いて、通常の医薬組成物の形態に製剤したものである。
　このような医薬組成物としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤等が挙げられる。
　医薬組成物中に含有される本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの量は、特に限定されず広い範囲内から適宜選択することができるが、通常、医薬組成物中に本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを１～７０重量％含有させるのが好ましい。
　本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、さらに他の有効成分を含有することもできるし、他の有効成分を含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。また、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、さらに異なる１以上の本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを有効成分として含有することもできるし、異なる１以上の本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。
　本発明に係る医薬組成物の投与方法としては特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、疾患の状態、その他の条件に応じた方法で投与される。錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤の場合の投与方法としては、例えば、経口投与が挙げられる。また、注射剤の場合には、単独で、又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して、静脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内に投与することができる。坐剤の場合には、直腸内に投与される。
　上記医薬組成物の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、通常、体重１ｋｇに対して本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドが０．１～９００ｎｍｏｌ、好ましくは１～９０ｎｍｏｌとなる投与量である。本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドはＧＬＰ－１に比べ、血中安定性が非常に高く、また、一態様において、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドはＧＬＰ－１に比べ、血糖値抑制活性が非常に高いため、投与量を減らすことができるという利点がある。
　上記医薬組成物の投与回数は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、例えば、３回／１日、２回／１日、１回／１日、さらにはその血中安定性に応じて、より頻度の少ない投与回数（例えば、１回／週、１回／月など）も選択しうる。好ましくは、上記医薬組成物の投与回数は、１回以下／１日である。本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドはＧＬＰ－１に比べ、血中安定性が非常に高いため、投与回数を減らすことができるという利点がある。
　本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドに付加された糖鎖は、体内の代謝系で容易に分解される。また、本発明の一態様において、該糖鎖は生体内で糖ペプチド（又は糖タンパク質）として結合して存在する構造を有する。従って、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド及び該ペプチドを有効成分として含む医薬組成物は、生体内に投与しても副作用や抗原性を示すことがなく、アレルギー反応や、抗体産生により薬効が得られなくなる心配が少ないなどの利点を有する。
　さらに、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは安定して簡便に大量に供給することが可能であり、品質の安定した、高品質の医薬品の提供という観点からも、非常に有用である。
　本発明はまた、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの有効量を投与することを特徴とする、ＧＬＰ－１に関連する疾患の治療又は予防方法も提供する。
　なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
　また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
　異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
　本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
　第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、　例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
　以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
　以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが何らこれらに限定されるものではない。
　実施例１　２６位，３４位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの合成法
　固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４－ヒドロキシメチル－３－メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ－エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。
　Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
　攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ　ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ　ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂上にＧｌｙ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｖａｌ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ａｌａ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基のペプチドを得た（配列番号６９）。
　得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０　ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ－１の２６位及び３４位のＬｙｓがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。
　以下に示すブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）１０．５ｍｇと上記で合成したペプチド鎖２．１ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、２１０μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ－１の２６及び３４位のＬｙｓが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（２６，３４Ｃｙｓ　ＧＬＰ－１－ｄｉｓｉａｌｏ）を０．１ｍｇ得た。
　実施例２　１８位，３６位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ－１の合成法
　固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４－ヒドロキシメチル－３－メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ－エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。
　Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
　攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ　ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ　ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｖａｌ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ａｌａ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号７０）。
　得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０　ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ－１の１８位のＳｅｒ及び３６位のＡｒｇがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。
　ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）１０．５ｍｇと上記で合成したペプチド鎖２．１ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、２１０μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ－１の１８位のＳｅｒ及び３６位のＡｒｇが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（１８，３６Ｃｙｓ　ＧＬＰ－１－ｄｉｓｉａｌｏ）を０．８ｍｇ得た。
　実施例３　２２位，３０位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ－１の合成法
　固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４－ヒドロキシメチル－３－メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ－エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。
　Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
　攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ　ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ　ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｖａｌ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ａｌａ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号７１）。
　得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ－１の２２位のＧｌｙ及び３０位のＡｌａがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。
　ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）７．９ｍｇと上記で合成したペプチド鎖１．３ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４、２００μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ－１の２２位のＧｌｙ及び３０位のＡｌａが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（２２，３０Ｃｙｓ　ＧＬＰ－１－ｄｉｓｉａｌｏ）を１．０ｍｇ得た。
　実施例４　２２位，３６位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ－１の合成法
　固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４－ヒドロキシメチル－３－メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ－エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。
　Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
　攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ　ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ　ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｖａｌ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ａｌａ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号７２）。
　得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０　ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ－１の２２位のＧｌｙ及び３６位のＡｒｇがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。
　ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）１１．９ｍｇと上記で合成したペプチド鎖２．０ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４、４００μｌに溶かし、３７℃で１時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ－１の２２位のＧｌｙ及び３６位のＡｒｇが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（２２，３６Ｃｙｓ　ＧＬＰ－１－ｄｉｓｉａｌｏ）を２．９ｍｇ得た。
　実施例５　３０位，３６位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ－１の合成法
　固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４－ヒドロキシメチル－３－メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ－エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。
　Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
　攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ　ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ　ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｖａｌ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ａｌａ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号７３）。
　得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０　ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ－１の３０位のＡｌａ及び３６位のＡｒｇがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。
　ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）１１．４ｍｇと上記で合成したペプチド鎖２．１ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４、４００μｌに溶かし、３７℃で１時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ－１の３０位のＡｌａ及び３６位のＡｒｇが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（３０，３６Ｃｙｓ　ＧＬＰ－１－ｄｉｓｉａｌｏ）を１．６ｍｇ得た。
　実施例６　３０位Ｃｙｓ－ヒアルロン酸４糖（ＨＡ－４）付加ＧＬＰ－１ペプチドの合成法
　合成例１にて得られたヒアルロン酸４糖（以下、実施例において、オリゴヒアルロン酸を単に「ヒアルロン酸」と呼ぶこともある。）１２．７ｍｇに水２５．４μｌ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）４８３μｌを加えて溶かした。この溶液に炭酸水素アンモニウム２００ｍｇを加え３７℃で３０時間処理した後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品に炭酸水素ナトリウム２２．４ｍｇ、水３００μｌを加え、予め１７μｌのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた無水ブロモ酢酸（アルドリッチ社製）３４．９ｍｇを加え、氷冷しながら１時間反応させた。１時間後、反応系を室温に戻しさらに１時間反応させた後、ゲルろ過にて精製を行い、以下に示すブロモアセチル化ヒアルロン酸４糖（Ｉ）１１．５ｍｇを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　得られたブロモアセチル化ヒアルロン酸４糖（Ｉ）２．４ｍｇと合成例２で合成したＧＬＰ－１の３０位のＡｌａがＣｙｓで置換されたペプチド（配列番号７６）１．３ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１３０μｌに溶かし、３７℃で１．５時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、３０位のＡｌａがヒアルロン酸４糖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（３０Ｃｙｓ　ＧＬＰ－１－ＨＡ－４）１．０ｍｇを得た。
　実施例７　３０位Ｃｙｓ－ヒアルロン酸８糖（ＨＡ－８）付加　ＧＬＰ－１ペプチドの合
成法
　合成例１にて得られたヒアルロン酸８糖８．７ｍｇに水１７．４μｌ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）３１４μｌを加えて溶かした。この溶液に炭酸水素アンモニウム１００ｍｇを加え３７℃で４５時間処理した後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品に炭酸水素ナトリウム７．６ｍｇ、水１８０μｌを加え、予め７μｌのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた無水ブロモ酢酸（アルドリッチ社製）１３．８ｍｇを加え、氷冷しながら１時間反応させた。１時間後、反応系を室温に戻しさらに１時間反応させた後、ゲルろ過にて精製を行い、以下に示すブロモアセチル化ヒアルロン酸８糖（ＩＩ）７．３ｍｇを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　得られたブロモアセチル化ヒアルロン酸８糖（ＩＩ）２．９ｍｇと合成例２で合成したＧＬＰ－１の３０位のＡｌａがＣｙｓで置換されたペプチド（配列番号７６）１．５ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１５０μｌに溶かし、３７℃で１．５時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、３０位のＡｌａがヒアルロン酸８糖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（３０Ｃｙｓ　ＧＬＰ－１－ＨＡ－８）０．５ｍｇを得た。
　実施例８　３６位Ｃｙｓ－ヒアルロン酸４糖（ＨＡ－４）付加　ＧＬＰ－１ペプチドの合成法
　合成例１にて得られたヒアルロン酸４糖１２．７ｍｇに水２５．４μｌ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）４８３μｌを加えて溶かした。この溶液に炭酸水素アンモニウム２００ｍｇを加え３７℃で３０時間処理した後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品に炭酸水素ナトリウム２２．４ｍｇ、水３００μｌを加え、予め１７μｌのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた無水ブロモ酢酸（アルドリッチ社製）３４．９ｍｇを加え、氷冷しながら１時間反応させた。１時間後、反応系を室温に戻しさらに１時間反応させた後、ゲルろ過にて精製を行いブロモアセチル化ヒアルロン酸４糖（Ｉ）１１．５ｍｇを得た。
　得られたブロモアセチル化ヒアルロン酸４糖（Ｉ）１．１ｍｇと合成例３で合成したＧＬＰ－１の３６位のＡｒｇがＣｙｓで置換されたＧＬＰ－１ペプチド（配列番号７８）１．５ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１３０μｌに溶かし、３７℃で１．５時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、３６位のＡｒｇがヒアルロン酸４糖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（３６Ｃｙｓ　ＧＬＰ－１－ＨＡ－４）０．９ｍｇを得た。
　実施例９　３６位Ｃｙｓ－ヒアルロン酸８糖（ＨＡ－８）付加ＧＬＰ－１ペプチドの合成法
　合成例１にて得られたヒアルロン酸８糖８．７ｍｇに水１７．４μｌ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）３１４μｌを加えて溶かした。この溶液に炭酸水素アンモニウム１００ｍｇを加え３７℃で４５時間処理した後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品に炭酸水素ナトリウム７．６ｍｇ、水１８０μｌを加え、予め７μｌのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた無水ブロモ酢酸（アルドリッチ社製）１３．８ｍｇを加え、氷冷しながら１時間反応させた。１時間後、反応系を室温に戻しさらに１時間反応させた後、ゲルろ過にて精製を行いブロモアセチル化ヒアルロン酸８糖（ＩＩ）７．３ｍｇを得た。
　得られたブロモアセチル化ヒアルロン酸８糖（ＩＩ）２．４ｍｇと合成例３で合成したＧＬＰ－１の３６位のＡｒｇがＣｙｓで置換されたＧＬＰ－１ペプチド（配列番号７８）１．５ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１３０μｌに溶かし、３７℃で２時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、３６位のＡｒｇがヒアルロン酸８糖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（３６Ｃｙｓ　ＧＬＰ－１－ＨＡ－８）０．５ｍｇを得た。
　実施例１０　３０位Ｃｙｓ－ヒアルロン酸１６糖（ＨＡ－１６）付加ＧＬＰ－１ペプチドの合成法
　合成例１にて得られたヒアルロン酸１６糖１１．６ｍｇに水３５μｌ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）６８０μｌを加えて溶かした。この溶液に炭酸水素アンモニウム２６０ｍｇを加え３７℃で７５時間処理した後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品に炭酸水素ナトリウム５．５ｍｇ、水２３０μｌを加え、予め５．１μｌのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた無水ブロモ酢酸（アルドリッチ社製）１０．２ｍｇを加え、氷冷しながら１時間反応させた。１時間後、反応系を室温に戻しさらに１時間反応させた後、ゲルろ過にて精製を行い、以下に示すブロモアセチル化ヒアルロン酸１６糖（ＩＩＩ）８．７ｍｇを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 　ブロモアセチル化ヒアルロン酸（ＩＩＩ）１６糖３．１ｍｇと合成例２で合成したペプチド鎖（配列番号７６）１．０ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１９０μｌに溶かし、１０ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩水溶液１０μｌを加え、３７℃で８時間反応させた。ＨＰＬＣで原料の減少が見られなくなったため、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ－１の３０位のＡｌａがヒアルロン酸１６糖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（３０Ｃｙｓ　ＧＬＰ－１－ＨＡ－１６）を０．４ｍｇ得た。
　実施例１１　３６位Ｃｙｓ－ヒアルロン酸１６糖（ＨＡ－１６）付加ＧＬＰ－１ペプチドの合成法
　実施例１０にて調製したブロモアセチル化ヒアルロン酸１６糖（ＩＩＩ）４．９ｍｇと合成例３で合成した３６位ＣｙｓＧＬＰ－１ペプチド鎖（配列番号７８）１．２ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１９０μｌに溶かし、１０ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩水溶液３６μｌを加え、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ－１の３６位のＡｒｇがヒアルロン酸１６糖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（３６Ｃｙｓ　ＧＬＰ－１－ＨＡ－１６）を０．３ｍｇ得た。
　実施例１２　３６位Ｃｙｓ高マンノース型糖鎖（Ｍ５）付加ＧＬＰ－１ペプチドの合成法
　大豆パウダー１００ｇを、５００ｍｌのアセトンで２回、５００ｍｌのメタノールで２回洗浄し脱脂大豆パウダー６１．４ｇを得た。
　得られた脱脂大豆パウダー４３．０ｇに水４３０ｍｌ、液化酵素Ｔ（ＨＢＩ社製）４．３ｇを加え、撹拌しながら７０℃で１９時間反応させた。反応液を遠心分離（１００００Ｇ、１０分）して上清と沈殿物に分け、上清８００ｍｌを得た。さらに沈殿物に水４３０ｍｌ、液化酵素Ｔ４．３ｇを加えて再度７０℃で１９時間反応させ、反応液を遠心分離（１００００Ｇ、１０分）して上清と沈殿物に分け、上清６００ｍｌを得た。得られた上清を合わせ（計１４００ｍｌ）、５００ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０を１００ｍｌ、オリエンターゼＯＮＳ（ＨＢＩ社製）３．０ｇを加え、撹拌しながら５０℃で１９時間反応を行った。反応後の液をろ過して不溶物を除き、ロータリーエバポレーターにて液量が４００ｍｌになるまで濃縮した。得られた液を分画分子量１Ｋの限外ろ過膜（Ｍｉｎｉｍａｔｅ　ＴＦＦ　Ｃａｐｓｕｌｅ　１Ｋ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ポール社製）を用いて限外ろ過を行った。
　６時間の処理の後、膜を透過しなかった液２３０ｍｌを回収した。回収した液に１Ｍトリス－塩酸緩衝液ｐＨ８．０を２０ｍｌ、アジ化ナトリウム２５０ｍｇ、アクチナーゼＥ（科研製薬社製）４２３．５ｍｇを加え３７℃で８２時間反応させた。反応液をろ過して不溶物を除いた後、ロータリーエバポレーターにて液量が１００ｍｌになるまで濃縮した。濃縮液を半分ずつ２回にわけてＳｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ２５（φ２５ｍｍ×１００ｍｍ）カラムにて分画し、糖鎖含有画分のみを集めて濃縮し２．２２ｇを得た。
　得られた糖鎖含有画分に蒸留水２１．０ｍｌ、エタノール１４．９ｍｌを加えて溶かし、炭酸水素ナトリウム１．１３ｇ、Ｆｍｏｃ－ＯＳｕ　２．０２ｇを加え室温で１６時間反応させた。反応後アセトン２５０ｍｌを加え沈殿物をメンブレンフィルター（φ４７ｍｍ、保持粒子経０．５μｍ　アドバンテック東洋社製）でろ過した。膜上に残った不溶物を蒸留水に溶かして回収し、ロータリーエバポレーターにて液量が１０ｍｌ以下になるまで濃縮した。濃縮液をＳｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ２５（φ２５ｍｍ×１００ｍｍ）カラムにて分画し、糖鎖含有画分を集めて濃縮し１．３７ｇを得た。
　これをさらに蒸留水４ｍｌに溶かしてＯＤＳカラム（ワコーゲル１００Ｃ１８、φ２５ｍｍ×１５０ｍｍ）にて分画し、糖鎖含有画分のみを集めて濃縮し、粗精製糖鎖４８．６ｍｇを得た。粗精製糖鎖をＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ－ＰａｃｋＯＤＳ－ＡＭ　φ２０×２５０ｍｍ、溶離液：アセトニトリル／２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液＝８２／１８、流速：８．０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、ハイマンノース型Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖鎖（Ｍ５糖鎖）１３．０ｍｇを得た。
　得られたＭ５糖鎖１１．０ｍｇに水１６５μｌを加えて溶かした。この溶液に炭酸水素アンモニウム２００ｍｇを加え室温で４１時間処理した後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品に炭酸水素ナトリウム１２．５ｍｇ、水１１０μｌを加え、予め１０μｌのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた無水ブロモ酢酸（アルドリッチ社製）１９．９ｍｇを加え、氷冷しながら１時間反応させた。１時間後、反応系を室温に戻しさらに１時間反応させた後、ゲルろ過にて精製を行い、以下に示すブロモアセチル化Ｍ５糖鎖（ｂ）７．９ｍｇを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 　得られたブロモアセチル化Ｍ５糖鎖（ｂ）４．１ｍｇと合成例３で合成した３６位のＡｒｇがＣｙｓで置換されたＧＬＰ－１ペプチド（配列番号７８）１．２ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１９０μｌに溶かし、１００ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩水溶液２４μｌを加え、３７℃で１０時間反応させた。反応後、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ－１の３６位のＡｒｇが高マンノース型Ｍ５糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（３６Ｃｙｓ　ＧＬＰ－１－Ｍ５）を０．３ｍｇ得た。
　実施例１３　２６位Ｌｙｓ－アシアロ糖鎖Ａｓｎリンカー修飾Ａｒｇ３４ＧＬＰ－１（７－３７）ペプチドの合成法
（１）アスパラギン結合アシアロ糖鎖グルタル酸の合成
　１０ｍＬのナス型フラスコにて、アスパラギン結合アシアロ糖鎖（５０．６ｍｇ、２８．７μｍｏｌ）をＤＭＳＯ－水（４：１、ｖ／ｖ、１．５ｍＬ）に溶解させた。この溶液に０．５２Ｍのグルタル酸－ＥＤＣ混合（１：１、ｍｏｌ／ｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液（１００μＬ、５１．７μｍｏｌ）を加え、室温にて１日間撹拌した。反応混合物を蒸留水（１．５ｍＬ）で希釈した後、分子量排除ゲルクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５、φ１．５×４５ｃｍ、蒸留水）で３回繰り返し分画した。凍結乾燥後、以下に示すアスパラギン結合アシアロ糖鎖グルタル酸（ｃ）（５１．４ｍｇ）を得た。（ＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ　Ｍａｓｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｆｏｒ　［Ｍ＋Ｎａ］＋　１８９１．６６，ｆｏｕｎｄ　１８９１．７８）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 （２）アスパラギン結合アシアロ糖鎖グルタル酸Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミジルエステルの合成
　１．５ｍＬのエッペンドルフチューブにて、アスパラギン結合アシアロ糖鎖グルタル酸（ｃ）（１７．２ｍｇ、９．２μｍｏｌ）のＤＭＳＯ（２００μＬ）溶液に、０．４４ＭのＮ－ヒドロキシコハク酸イミドのＤＭＳＯ溶液（２５μＬ、１１．０μｍｏｌ）および０．３７ＭのＥＤＣのＤＭＳＯ溶液（７５μＬ、２７．６μｍｏｌ）を加えた。室温にて６時間撹拌した後、ＤＴＴ（５．７ｍｇ、３６．８μｍｏｌ）を加え、ＥＤＣを不活性化した（Ｇｒａｂａｒｅｋ，Ｚ．，Ｇｅｒｇｅｌｙ，Ｊ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０，１８５，１３１－１３５）。そのまま、以下に示すアスパラギン結合アシアロ糖鎖グルタル酸Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミジルエステル（ｄ）を含むこの混合液を糖リンカー試薬（０．０３Ｍ溶液）としてペプチドとの縮合に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 （３）２６位Ｌｙｓ－アシアロ糖鎖Ａｓｎリンカー修飾Ａｒｇ３４ＧＬＰ－１（７－３７）の合成
　１．５ｍＬのエッペンドルフチューブにて、合成例４で合成したＬｙｓ２６Ａｒｇ３４ＧＬＰ－１（７－３７）（配列番号８０）（２．８ｍｇ、０．８３μｍｏｌ）のＤＭＳＯ（３００μＬ）溶液に、ＤＩＰＥＡ（４．８μＬ、２７．６μｍｏｌ）および上記にて調製した０．０３Ｍの糖リンカー試薬（１５０μＬ、４．５μｍｏｌ）を加えた。室温にて２時間撹拌した後、グリシン（２ｍｇ、２６．６μｍｏｌ）の水溶液（２００μＬ）を加え反応を停止し、そのままＨＰＬＣ［カラム：Ｚｏｒｂａｘ　３００ＳＢ－ＣＮ、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　１．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液１０→４０％（０－８ｍｉｎ）４０→５０％（８－２０ｍｉｎ）ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて保持時間１５．５ｍｉｎのピークの画分を集め、凍結乾燥後、以下に示す２６位Ｌｙｓ－アシアロ糖鎖Ａｓｎリンカー修飾Ａｒｇ３４ＧＬＰ－１（７－３７）（０．７ｍｇ）を得た。（ＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ　Ｍａｓｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｆｏｒ　［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋　５２３６．３５，ｆｏｕｎｄ　５２３６．１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　実施例１４　３０位－Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加エキセンジン－４の合成法
　合成例５にて合成したＥｘ－４の３０位のＧｌｙがＣｙｓで置換された３９残基のペプチド１２．０ｍｇとブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）３６ｍｇを１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４、５ｍＭトリスカルボキシエチルホスフィン　１ｍＬ中、３７℃で１時間反応させた。そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　８ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→５０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、Ｅｘ－４の３０位のＧｌｙがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加Ｅｘ－４ペプチド（３０Ｃｙｓ　Ｅｘ－４－ｄｉｓｉａｌｏ）を１０．６ｍｇ得た。（Ｍ：Ｃ２７１Ｈ４２２Ｎ５８Ｏ１２３Ｓ　ＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ　Ｍａｓｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｆｏｒ　［Ｍ＋Ｈ］＋　６４９３．６３，ｆｏｕｎｄ　６４９４．３３）
　実施例１５　２６位－Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加ＢＩＭ５１０７７の合成法
　合成例６にて合成したＢＩＭ５１０７７の２６位のＬｙｓがＣｙｓで置換された３０残基のペプチド（２．４ｍｇ，０．７２μｍｏｌ）およびグアニジン（２１６ｍｇ）を蒸留水（２４０μＬ）に溶解し、順次ＴＣＥＰ水溶液（１００ｍＭ、１００μＬ）、ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（１０ｍｇ／ｍＬ，１００μＬ，４．２６μｍｏｌ）ならびに　、５００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４，１００μＬ）を加えた。３７℃で２時間反応させた。そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＢＩＭ５１０７７の２６位のＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＢＩＭ５１０７７ペプチド（２６Ｃｙｓ　ＢＩＭ５１０７７－ｄｉｓｉａｌｏ）を１．９　ｍｇ得た。（ＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ　Ｍａｓｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｆｏｒ　［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋　５５７８．７２，ｆｏｕｎｄ　５５７８．７４）
　実施例１６　３０位－Ｃｙｓ－Ｍ５糖鎖付加エキセンジン－４の合成法
　合成例５にて合成したＥｘ－４の３０位のＧｌｙがＣｙｓで置換された３９残基のペプチド１．２ｍｇと実施例１２で合成したブロモアセチル化したＭ５糖鎖（ｂ）３．９ｍｇを３５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４、１ｍＭトリスカルボキシエチルホスフィン　０．１７ｍＬ中、３７℃で３時間反応させた。そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→５０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、Ｅｘ－４の３０位のＧｌｙが高マンノース型Ｍ５糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加Ｅｘ－４ペプチド（３０Ｃｙｓ　Ｅｘ－４－Ｍ５）を０．５ｍｇ得た。（　Ｍ：Ｃ２３３Ｈ３６２Ｎ５４Ｏ９７Ｓ　ＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ　Ｍａｓｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｆｏｒ　［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋　５５０４．７４，ｆｏｕｎｄ　５５０６．８５）
　以下の表５は、実施例１～１６で得られた糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドのＭＳスペクトルデータ（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ｍａｓｓ）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　比較例１
　固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎ（１００μｍｏｌ）を入れ、ＤＣＭ、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４－ヒドロキシメチル－３－メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）、Ｎ－エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。
　Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）とＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
　攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮＭＰ（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５ＭＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に，固相合成用カラムに加え、続いて０．９ＭＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｖａｌ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ａｌａ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号７４）。
　ＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、３１残基のペプチド５μｍｏｌ相当の樹脂をエッペンチューブに移した。
　得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ　ｃｏｌｕｍｎ　　Ｃ１８　１００×１０ｍｍ　展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝９５：５→５：９５　１５分　流速３．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製し、ＧＬＰ－１を得た。
　合成例１　オリゴヒアルロン酸糖鎖の合成
　ヒアルロン酸（資生堂社製、平均分子量１２０万）５００ｍｇにｐＨ４の酢酸緩衝液１００ｍｌを加え溶けるまでよく撹拌した。ヒアルロニダーゼ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、Ｂｏｖｉｎｅ　Ｔｅｓｔｅｓ由来）を２．５ｋＵ加え、３７℃で２日間反応させた。この溶液を濃縮後、再度４５ｍｌの酢酸緩衝液（ｐＨ４）に溶かし、ヒアルロニダーゼ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、Ｂｏｖｉｎｅ　Ｔｅｓｔｅｓ由来）を４．５ｋＵ加え、３７℃でさらに２日間反応させた。反応液を分子量分画３ｋＤａ、１ｋＤａ限外ろ過膜（ミリポア社製）を用いて分画し、凍結乾燥して分子量１～３ｋＤａのヒアルロン酸画分２６８．４ｍｇを得た。
　得られた分子量１～３ｋＤａヒアルロン酸画分には複数種類のオリゴヒアルロン酸が含まれているため、これを分離するためにＨＰＬＣにて分取を行った。分子量１～３ｋＤａのオリゴヒアルロン酸画分を少量の水に溶解させＨＰＬＣ［カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　Ａｓａｈｉｐａｋ　ＮＨ２Ｐ－９０　２０Ｆ　９μｍ，φ２０．０ｘ３００ｍｍ、移動相：１８０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４　ａｑ］にて数回に分けて精製し、溶出ピークごとに分画した。得られた画分をゲルろ過にて脱塩し、凍結乾燥してオリゴヒアルロン酸（４糖～１８糖）を得た。以下に各オリゴヒアルロン酸の収量を示す。
　オリゴヒアルロン酸４糖２２．５ｍｇ（ｔＲ＝１０．０ｍｉｎ）
　オリゴヒアルロン酸６糖５１．１ｍｇ（ｔＲ＝１１．８ｍｉｎ）
　オリゴヒアルロン酸８糖５２．７ｍｇ（ｔＲ＝１４．０ｍｉｎ）
　オリゴヒアルロン酸１０糖２７．０ｍｇ（ｔＲ＝１７．０ｍｉｎ）
　オリゴヒアルロン酸１２糖９．６ｍｇ（ｔＲ＝２１．４ｍｉｎ）
　オリゴヒアルロン酸１４糖７．８ｍｇ（ｔＲ＝２７．６ｍｉｎ）
　オリゴヒアルロン酸１６糖４．１ｍｇ（ｔＲ＝３６．０ｍｉｎ）
　オリゴヒアルロン酸１８糖２．０ｍｇ（ｔＲ＝４７．４ｍｉｎ）
　合成例２　ＧＬＰ－１の３０位がＣｙｓで置換されたペプチドの合成法
　固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４－ヒドロキシメチル－３－メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ－エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。
　Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
　攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ　ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ　ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｖａｌ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ａｌａ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号７５）。
　得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０　ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ－１の３０位のＡｌａがＣｙｓで置換された３１残基ペプチドが得られた（配列番号７６）。
　合成例３　ＧＬＰ－１の３６位がＣｙｓで置換されたペプチドの合成法
　固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４－ヒドロキシメチル－３－メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ－エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。
　Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
　攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ　ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ　ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｖａｌ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ａｌａ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号７７）。
　得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０　ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ－１の３６位のＡｒｇがＣｙｓで置換された３１残基ペプチドが得られた（配列番号７８）。
　合成例４　ＧＬＰ－１の３４位がＡｒｇで置換されたペプチドの合成法
　固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４－ヒドロキシメチル－３－メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ－エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。
　Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
　攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ　ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ　ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｇｌｙ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｖａｌ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ａｌａ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号７９）。
　得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０　ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ－１の３４位のＬｙｓがＡｒｇで置換された３１残基ペプチドが得られた（配列番号８０）。
　合成例５　エキセンジン－４の３０位がＣｙｓで置換されたペプチドの合成法
　　固相合成用カラムにＲｉｎｋ－Ａｍｉｄｏ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）をＤＭＦで洗浄後、ペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を０．４５Ｍ　ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（２．５ｍｍｏｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ　ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（２．５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｏｍｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、
固相樹脂にＳｅｒ（ｔＢｕ）－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｍｅｔ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）
の３９残基ペプチドを得た（配列番号８１）。
　得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０　ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、Ｅｘ－４の３０位のＧｌｙがＣｙｓで置換された３９残基のペプチドが得られた。（ＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ　Ｍａｓｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｆｏｒ　［Ｍ＋Ｈ］＋　４２３０．６０，ｆｏｕｎｄ　４２３１．２７）（配列番号８２）
　合成例６　ＢＩＭ５１０７７の２６位がＣｙｓで置換されたペプチドの合成法
　固相合成用カラムにＲｉｎｋ－Ａｍｉｄｏ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）をＤＭＦで洗浄後、ペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を０．４５Ｍ　ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（２．５ｍｍｏｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ　ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（２．５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ－Ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ　Ａｃｉｄ（Ａｉｂ），Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ａｉｂ，Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂上にＡｒｇ（Ｐｂｆ）－Ａｉｂ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｖａｌ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ａｉｂ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３０残基ペプチドを得た（配列番号８３）。
　得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０　ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＢＩＭ５１０７７の２６位のＬｙｓがＣｙｓで置換された３０残基のペプチド１２ｍｇが得られた。（ＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ　Ｍａｓｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｆｏｒ　［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋　３３１５．６９，ｆｏｕｎｄ　３３１４．７２）（配列番号８４）
　以上の各実施例において製造された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは、以下のＧＬＰ－１の配列：
Ｈｉｓ７－Ａｌａ８－Ｇｌｕ９－Ｇｌｙ１０－Ｔｈｒ１１－Ｐｈｅ１２－Ｔｈｒ１３－Ｓｅｒ１４－Ａｓｐ１５－Ｖａｌ１６－Ｓｅｒ１７－Ｓｅｒ１８－Ｔｙｒ１９－Ｌｅｕ２０－Ｇｌｕ２１－Ｇｌｙ２２－Ｇｌｎ２３－Ａｌａ２４－Ａｌａ２５－Ｌｙｓ２６－Ｇｌｕ２７－Ｐｈｅ２８－Ｉｌｅ２９－Ａｌａ３０－Ｔｒｐ３１－Ｌｅｕ３２－Ｖａｌ３３－Ｌｙｓ３４－Ｇｌｙ３５－Ａｒｇ３６－Ｇｌｙ３７（配列番号２）において：
（ｂ１）２６位のＬｙｓ及び３４位のＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例１）（配列番号５４）；
（ｂ２）１８位のＳｅｒ及び３６位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例２）（配列番号５５）；
（ｂ３）２２位のＧｌｙ及び３０位のＡｌａがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例３）（配列番号５６）；
（ｂ４）２２位のＧｌｙ及び３６位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例４）（配列番号５７）；
（ｂ５）３０位のＡｌａ及び３６位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例５）（配列番号５８）；
（ｂ６）３０位のＡｌａがヒアルロン酸４糖（ＨＡ－４）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例６）（配列番号５９）；
（ｂ７）３０位のＡｌａがヒアルロン酸８糖（ＨＡ－８）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例７）（配列番号６０）；
（ｂ８）３６位のＡｒｇがヒアルロン酸４糖（ＨＡ－４）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例８）（配列番号６１）；
（ｂ９）３６位のＡｒｇがヒアルロン酸８糖（ＨＡ－８）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例９）（配列番号６２）；
（ｂ１０）３０位のＡｌａがヒアルロン酸１６糖（ＨＡ－１６）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例１０）（配列番号６３）；
（ｂ１１）３６位のＡｒｇがヒアルロン酸１６糖（ＨＡ－１６）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例１１）（配列番号６４）；
（ｂ１２）３６位のＡｒｇが高マンノース型糖鎖（Ｍ５）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例１２）（配列番号６５）；
（ｂ１３）２６位のＬｙｓに、リンカーを介してアシアロ糖鎖付加Ａｓｎが結合した糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例１３）（配列番号６６）；である。
　また、
（ｂ１４）以下のエキセンジン－４の配列：
Ｈ－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－ＮＨ２（配列番号５０）において：
３０位のＧｌｙがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例１４）（配列番号６７）である。
　さらに
（ｂ１５）以下のＢＩＭ５１０７７の配列：
Ｈｉｓ－Ｒ２－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｒ２－Ａｒｇ－ＮＨ２［式中、Ｒ２はα－メチルアラニンを示す。］（配列番号５２）において：
２６位のがＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例１５）（配列番号６８）である。
　また、
（ｂ１６）上記エキセンジン‐４の配列（配列番号５０）において、３０位のＧｌｙが高マンノース型糖鎖（Ｍ５）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド（実施例１６）である。
　実施例１～１５のいくつかの例について以下の試験例１及び／又は２を行った。
　試験例１（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ－ＩＶ）に対する耐性試験）
　０．５ｍｌのエッペンチューブ中に実施例で製造した糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド又は比較例１で製造したＧＬＰ－１を１７．７ｎｍｏｌとＤＰＰ－ＩＶ（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ　ＰｅｐｔｉｄａｓｅＩＶ　ｆｒｏｍ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｋｉｄｎｅｙ、ＳＩＧＭＡ社製）２．２ｍＵとを加え、それぞれ１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液全量で１００μＬになるように調製し、３７℃で反応させた。反応液１０μＬを、あらかじめ別のエッペンチューブに用意した１０％トリフルオロ酢酸１５μＬと混和させ、ＨＰＬＣに２０μＬインジェクションし、原料の消失をモニターした（ＨＰＬＣ条件：カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯＣＡＰＣＥＬＰＡＫ　Ｃ１８　ＵＧ１２０、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液、展開溶媒Ｂ：０．０９％ＴＦＡアセトニトリル／水＝９０／１０、グラジェントＡ／Ｂ＝６５／３０→３０／６０　２０分　流速０．７ｍｌ／分）。ＤＰＰ－ＩＶに対する耐性の指標となる半減期（ｔ１／２）を、糖鎖が付加していない比較例１のＧＬＰ－１の半減期（ｔ１／２）を基準（＝１）として、各実施例の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドについて評価した値の代表的なものを表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　各実施例の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドは、比較例１のＧＬＰ－１の２．１倍～１２８倍のＤＰＰ－ＩＶ耐性を示した。
　試験例２　経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ：　Ｏｒａｌ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　Ｔｅｓｔ）
　実施例で製造した糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド又は比較例１で製造したＧＬＰ－１のＰＢＳ溶液を、一晩絶食させたＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウス（１０週齢、雄）に１０ｍｌ／ｋｇの投与量で腹腔内に投与した。３０分後にグルコース溶液を１ｍｇ／ｇの投与量で経口投与した。グルコース投与前、グルコース投与３０分後、６０分後、１２０分後に眼窩採血を行い、アキュチェックアビバ（ロッシュダイアグノスティックス社）を用いて血糖値を測定した。代表的な結果を図１～４に示す。以下の図中、例えば、ＧＬＰ－１の２６位と３４位のアミノ酸がジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである「２６，３４Ｃｙｓ　ＧＬＰ－１－ｄｉｓｉａｌｏ」を必要に応じて「Ｃ２６，Ｃ３４」と記載することがある。他の糖鎖及びアミノ酸部位に関しても同様である。
　次に１８，３６Ｃｙｓ　ＧＬＰ－１－ｄｉｓｉａｌｏについて投与量を１／１０（０．９ｎｍｏｌ／ｋｇ）とし、ＧＬＰ－１について投与量を９ｎｍｏｌ／ｋｇとして、ＯＧＴＴを行い、比較した。結果を図５に示す。
　投与量０．９ｎｍｏｌ／ｋｇの１８，３６Ｃｙｓ　ＧＬＰ－１－ｄｉｓｉａｌｏの血糖値上昇抑制作用は投与量９ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＰ－１とほぼ同等であった。１８，３６Ｃｙｓ　ＧＬＰ－１－ｄｉｓｉａｌｏの血糖値上昇抑制作用はＧＬＰ－１に比べ１０倍程度増大していた。
　配列表フリーテキスト
　配列番号１は、一般式（１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号２は、ＧＬＰ－１（７－３７）である。
　配列番号３は、ＧＬＰ－１（７－３６）ＮＨ２である。
　配列番号４は、（ａ１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号５は、（ａ２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号６は、（ａ３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号７は、（ａ４）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号８は、（ａ５）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号９は、（ａ６）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号１０は、（ａ７）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号１１は、（ａ８）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号１２は、（ａ９）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号１３は、（ａ１０）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号１４は、（ａ１１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号１５は、（ａ１２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号１６は、（ａ１３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号１７は、（ａ１４）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号１８は、（ａ１５）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号１９は、（ａ１６）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号２０は、（ａ１７）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号２１は、（ａ１８）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号２２は、（ａ１９）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号２３は、（ａ２０）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号２４は、（ａ２１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号２５は、（ａ２２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号２６は、（ａ２３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号２７は、（ａ２４）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号２８は、（ａ２５）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号２９は、（ａ２６）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号３０は、（ａ２７）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号３１は、（ａ２８）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号３２は、（ａ２９）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号３３は、（ａ３０）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号３４は、（ａ３１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号３５は、（ａ３２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号３６は、（ａ３３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号３７は、（ａ３４）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号３８は、（ａ３５）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号３９は、（ａ３６）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号４０は、（ａ３７）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号４１は、（ａ３８）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号４２は、（ａ３９）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号４３は、（ａ４０）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号４４は、（ａ４１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号４５は、（ａ４２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号４６は、（ａ４３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号４７は、（ａ４４）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号４８は、（ａ４５）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号４９は、（ａ４６）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号５０は、エキセンジン－４である。
　配列番号５１は、一般式（２）で表わされる糖鎖付加エキセンジン－４である。
　配列番号５２は、ＢＩＭ５１０７７である。
　配列番号５３は、一般式（３）で表わされる糖鎖付加ＢＩＭ５１０７７である。
　配列番号５４は、（ｂ１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号５５は、（ｂ２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号５６は、（ｂ３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号５７は、（ｂ４）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号５８は、（ｂ５）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号５９は、（ｂ６）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号６０は、（ｂ７）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号６１は、（ｂ８）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号６２は、（ｂ９）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号６３は、（ｂ１０）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号６４は、（ｂ１１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号６５は、（ｂ１２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号６６は、（ｂ１３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号６７は、（ｂ１４）で表わされる糖鎖付加エキセンジン－４である。
　配列番号６８は、（ｂ１５）で表わされる糖鎖付加ＢＩＭ５１０７７である。
　配列番号６９は、実施例１において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
　配列番号７０は、実施例２において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
　配列番号７１は、実施例３において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
　配列番号７２は、実施例４において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
　配列番号７３は、実施例５において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
　配列番号７４は、比較例１において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
　配列番号７５は、合成例２において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
　配列番号７６は、合成例２において合成された３１残基ペプチドである。
　配列番号７７は、合成例３において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
　配列番号７８は、合成例３において合成された３１残基ペプチドである。
　配列番号７９は、合成例４において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
　配列番号８０は、合成例４において合成された３１残基ペプチドである。
　配列番号８１は、合成例５において合成された保護基を有する３９残基ペプチドである。
　配列番号８２は、合成例５において合成された３９残基ペプチドである。
　配列番号８３は、合成例６において合成された保護基を有する３０残基ペプチドである。
　配列番号８４は、合成例６において合成された３０残基ペプチドである。
　本発明は、ＧＬＰ－１と比べて、血中安定性が増大し、好ましくは、血糖値抑制活性の増大した、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを提供する。本発明は、特に医薬品の分野において有用である。

Claims (40)

  1. 　（ａ）　ＧＬＰ－１；
    　（ｂ）　ＧＬＰ－１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；又は、
    　（ｃ）　ＧＬＰ－１の類縁体；
    において、少なくとも２個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、ＧＬＰ－１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  2. 　（ａ）　ＧＬＰ－１；又は、
    　（ｂ）　ＧＬＰ－１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；
    において、少なくとも２個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、ＧＬＰ－１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  3. 　（ａ）　ＧＬＰ－１；又は、
    　（ｂ）　ＧＬＰ－１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチドであって、ＧＬＰ－１活性を有するペプチド；
    において、少なくとも２個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、ＧＬＰ－１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ａｓｎ及び／又は糖鎖付加Ｃｙｓである、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合していることを特徴とする、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも４個以上の糖からなる糖鎖である、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも２本鎖複合型糖鎖である、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  8. 　請求項７に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも独立に、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖及びジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖である、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  9. 　請求項１～８に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも独立に、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
     ［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
     を示す。Ａｃは、アセチル基を示す。］
    で表される糖鎖である、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  10. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、前記糖鎖が実質的に均一である、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  11. 　（ａ）　ＧＬＰ－１において、２以上のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、少なくとも１つの置換部位が、１８、２０、２２、２６、３０、３４又は３６位である糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド；又は、
    　（ｂ）（ａ）で定義される糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド；
    であって、ＧＬＰ－１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  12. 　請求項１１に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ａｓｎ及び／又は糖鎖付加Ｃｙｓである、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  13. 　請求項１１又は１２のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合していることを特徴とする、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  14. 　請求項１１～１３に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも４個以上の糖からなる糖鎖である、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  15. 　請求項１１～１４のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも２本鎖複合型糖鎖である、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  16. 　請求項１５に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも独立に、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖及びジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖である、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  17. 　請求項１１～１６のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも独立に、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
     ［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
     を示す。Ａｃは、アセチル基を示す。］
    で表される糖鎖である、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  18. 　請求項１１～１７のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、前記糖鎖が９９％以上均一である、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  19. 　請求項１１に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、
    　前記糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ａｓｎであり、
    　前記糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合しており、
    　前記糖鎖が４個以上の糖からなる糖鎖であり、
    　前記糖鎖がいずれも独立に、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖及びジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖である、
    　前記糖鎖が実質的に均一である、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  20. 　請求項１～１９のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、ＧＬＰ－１と比較して増大した血中安定性を有する、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  21. 　請求項１～２０のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、ＧＬＰ－１と比較して１０倍以上のＯＧＴＴ（Ｏｒａｌ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　Ｔｅｓｔ）における血糖値抑制活性を有する、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  22. 　請求項１～２０のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、ＧＬＰ－１と比較して３０倍以上のＤＰＰ－ＩＶ耐性を有する、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  23. 　請求項１～２２のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを有効成分として含む医薬組成物。
  24. 　請求項２３に記載の医薬組成物であってＧＬＰ－１に関連する疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
  25. 　請求項２４に記載の医薬組成物であってＧＬＰ－１に関連する疾患が糖尿病である医薬組成物。
  26. 　請求項１～２２のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドの有効量を投与することを特徴とする、ＧＬＰ－１に関連する疾患の治療又は予防方法。
  27. 　（ａ）　ＧＬＰ－１；
    　（ｂ）　ＧＬＰ－１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；又は、
    　（ｃ）　ＧＬＰ－１の類縁体；
    において、少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたＧＬＰ－１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、
    前記糖鎖がオリゴヒアルロン酸である糖鎖である糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  28. 　（ａ）　ＧＬＰ－１；又は、
    　（ｂ）　ＧＬＰ－１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；
    において、少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたＧＬＰ－１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、
    前記糖鎖がオリゴヒアルロン酸である糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  29. 　請求項２７又は２８に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、前記オリゴヒアルロン酸が、Ｎ－アセチルグルコサミンとグルクロン酸とからなる単位を１単位として２単位（４糖）以上、８単位（１６糖）以下の糖鎖である糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  30. 　請求項２７又は２８に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、前記オリゴヒアルロン酸が、Ｎ－アセチルグルコサミンとグルクロン酸とからなる単位を１単位として２単位（４糖）の糖鎖である糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  31. 　請求項２７～３０のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ｃｙｓである、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  32. 　（ａ）　ＧＬＰ－１；
    　（ｂ）　ＧＬＰ－１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；又は、
    　（ｃ）　ＧＬＰ－１の類縁体；
    において、少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたＧＬＰ－１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、
    前記糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸がリンカーを介して結合している、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  33. 　（ａ）　ＧＬＰ－１；又は、
    　（ｂ）　ＧＬＰ－１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；
    において、少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたＧＬＰ－１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、
    前記糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸がリンカーを介して結合している、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  34. 　請求項３２又は３３に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、前記リンカーと結合しているアミノ酸が、Ｌｙｓである、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  35. 　請求項３２～３４のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、前記リンカーが、前記糖鎖側の末端にアミノ酸を含む糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  36. 請求項３５に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、
    　前記リンカーに含まれるアミノ酸がＡｓｎである、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  37. 　請求項２７～３６のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドであって、前記糖鎖が実質的に均一である、糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチド。
  38. 　請求項２７～３７のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを有効成分として含む医薬組成物。
  39. 　請求項３８に記載の医薬組成物であって、前記糖鎖が９０％以上均一である医薬組成物。
  40. 　請求項３８または３９に記載の医薬組成物であって、ＧＬＰ－１に関連する疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
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