KR101609005B1 - 당쇄 부가 ｇｌｐ－１ 펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 GLP-1과 비교하여, 혈중 반감기가 길고, 또한 바람직하게는 높은 혈당치 억제활성을 나타내는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 제공하는 것을 과제로 하는 것이다.
본 발명은, (a) GLP-1; (b) GLP-1에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 펩티드; 또는, (c) GLP-1의 유연체(類緣體);에 있어서 2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는, GLP-1 활성을 갖는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 (a), (b) 또는 (c)에 있어서, 1개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 GLP-1 활성을 갖는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당쇄가 올리고히알루론산을 포함하는 당쇄인 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 제공한다. 당쇄 부가 아미노산은 당쇄와 아미노산이 링커를 매개로 결합되어 있어도 된다.

Description

당쇄 부가 ＧＬＰ－１ 펩티드{Glycosylated GLP-1 peptide}
본 발명은 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 관한 것이다.
GLP-1(글루카곤 유사 펩티드-1:glucagon-like peptide-1)은, 당의 호메오스타시스(homeostasis)의 제어에 깊이 관여하는 장 기원의 펩티드이다. GLP-1은, 글루카곤 전구체의 프레프로글루카곤의 조직 특이적인 번역 후 프로세싱에 의해 장의 L세포에 있어서 합성되고, 식사에 반응하여 순환 중으로 방출된다. 이 펩티드는, 장인슐린축(enteroinsular axis)의 주요 메디에이터로, 특정 수용체에 결합함으로써 작용한다.
GLP-1은 주로 췌장에 작용하여, β세포에 의한 인슐린 방출을 글루코오스 농도 의존적으로 촉진하는 것이 알려져 있다. 또한, 글루카곤의 분비를 억제하고, 위의 공동화를 지연시켜, 말초의 글루코오스 처리를 높일 가능성이 시사되어 있다.
GLP-1의 투여에 의해 인슐린 비의존형 당뇨병 환자에게 있어서 식후의 글루코오스 레벨이 정상화될 수 있는 것으로부터, GLP-1의 치료제로서의 가능성이 시사되어 있다. 또한, GLP-1은 인슐린 의존형 당뇨병 환자에게 있어서 혈당 조절을 개선하는 작용도 가지고 있다. 또한, GLP-1의 인슐린 방출 촉진작용은 혈장 글루코오스 농도에 의존하고 있기 때문에, 낮은 혈장 글루코오스 농도에서는 GLP-1 개재성의 인슐린 방출이 낮아, 심각한 저혈당증을 초래하지 않는 장점이 있다. 따라서, 필요에 따라, 혈중의 GLP-1량을 조절함으로써, 안전성이 높은 당뇨병 치료가 가능해질 것으로 생각된다. 그러나, GLP-1의 혈중 반감기는, 2~6분으로 매우 짧아, 그 치료제로서의 가능성이 한정된다고 하는 문제가 있다.
이러한 문제를 해결하는 수단으로서, GLP-1을 개변하는 시도가 이루어지고 있다. 예를 들면, 특허문헌 1에는, 1개 이상의 폴리에틸렌글리콜(PEG) 분자에 공액적으로 결합한 GLP-1 화합물을 포함하는 페그화 GLP-1 화합물이 개시되어 있다. 당해 페그화 GLP-1 화합물에서는, 각 PEG가 GLP-1 화합물에, Cys 또는 Lys 아미노산에서, 또는 카르복시 말단 아미노산에서 결합되어 있다. 당해 페그화 GLP-1 화합물은, 1시간 이상의 배출 반감기를 갖는다.
특허문헌 1에 의하면, 비페그화(unPEGylated) 펩티드와 비교하여, 반감기가 연장되고, 클리어런스가 지연화된 생리활성 펩티드가 얻어진다. 또한, 이들 페그화(PEGylated) GLP-1 화합물 및 조성물은, 당뇨병, 비만, 과민성장증후군, 및 혈당을 저하시키는 것, 위 및/또는 장운동성을 억제하는 것, 및 위 및/또는 장내용 배출을 억제하는 것, 또는 음식물 섭취를 억제하는 것 등, 건강상태의 치료에 유용한 것이 개시되어 있다(예를 들면, 비특허문헌 1).
그러나, PEG는 생체내에서 대사되지 않는 화합물이기 때문에, 페그화 GLP-1 화합물의 투여를 계속하면, PEG가 생체내에 축적되어, 생체에 약해를 줄 위험성이 있다(비특허문헌 1).
또한, 반감기를 연장하기 위해, GLP-1이나 그의 개변체에 당쇄를 부가하는 방법도 제안되어 있다(예를 들면, 특허문헌 3 및 4). 특허문헌 3에는, GLP-1의 26번 위치, 34번 위치, 및/또는 37번 위치에 당쇄 부가 아미노산을 도입하는 방법 등이 기재되어 있으나, 당쇄의 종류나 당쇄를 부가하는 위치가, 반드시 최적화되어 있다고는 할 수 없다. 한편, 특허문헌 4에는, 분자량 200 KDa 정도의 히알루론산 수식물을 GLP-1 아날로그에 결합시키는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 이와 같이 거대한 히알루론산 분자를 대량으로 제조하는 경우, 길이와 구조를 균일하게 하는 것은 곤란하여, 실제로는 각 히알루론산의 구조와 길이에는 상당히 편차가 생겨 있는 것으로 생각된다. 의약품으로서 사용하는 경우에는, 길이와 구조가 균일한 당쇄 부가 펩티드가 필요로 된다.
또한, GLP-1과 유사한 구조로, 동일한 활성을 가지며, 또한 혈중 안정성이 높은 화합물로서, 도마뱀(Heloderma)의 타액으로부터 발견된 엑센딘-4(exendin-4)(비특허문헌 2)가 미국에서 시판되고 있으나, exendin-4는 비인간형 서열로, 장기 투여에 의한 중화항체의 출현과 그에 수반되는 약효의 감약이 우려된다(비특허문헌 3~5).
한편, 당쇄는 생체내에 있어서 다양한 역할을 담당하고 있는 것이 명확해지고 있어, 그 연구의 중요성을 인식하면서도, 구조의 복잡함이나 다양성에 의해 연구가 늦어지고 있다. 조성이 일정한 당펩티드를 얻기 위한 방법도 시도되고 있으나(특허문헌 2), 간편함과 대량생산의 관점에서 충분한 제조방법이라고는 할 수 없고, 또한, 특히 생체내에 존재하는 긴 당쇄에 관해서는 실용적인 제조방법이라고는 할 수 없다.
특허문헌 1 : 일본국 특허공표 제2006-520818호 공보
특허문헌 2 : 일본국 재공표 제2005-095331호 공보
특허문헌 3 : 일본국 재공표 제2006-095775호 공보
특허문헌 4 : 국제공개 제2007/063907호 팸플릿
비특허문헌 1 : Toxicological Science,42,152-157(1998).
비특허문헌 2 : J Biol Chem.267,402-5(1992)
비특허문헌 3 : Vascular Health and Risk Management 2,69-77(2006)
비특허문헌 4 : JAMA.298,194-206(2007)
비특허문헌 5 : Endocrine Reviews 28,187-218(2007)
본 발명의 과제는, GLP-1과 비교하여 혈중 안정성이 증대되어 있고, 더욱 바람직하게는, 높은 혈당치 억제활성을 나타내는, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 제공하는 것에 있다.
이상의 과제를 해결하기 위해 본 발명은 이하의 특징을 가질 수 있다. 즉, 본 발명은 (a) GLP-1;
(b) GLP-1에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 펩티드; 또는,
(c) GLP-1의 유연체(類緣體);
에 있어서, 2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는, GLP-1 활성을 갖는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드일 수 있다.
또한, 본 발명은
(a) GLP-1; 또는,
(b) GLP-1에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 펩티드로서, GLP-1 활성을 갖는 펩티드;
에 있어서, 2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는, GLP-1 활성을 갖는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드일 수 있다.
또한, 본 발명은
(a) GLP-1에 있어서, 2 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드로서, 하나 이상의 치환부위가 18, 20, 22, 26, 30, 34 또는 36번 위치인 당쇄 부가 GLP-1 펩티드; 또는,
(b) (a)로 정의되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 있어서, 당쇄 부가 아미노산 이외의 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드;
로서, GLP-1 활성을 갖는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드일 수 있다.
또한, 본 발명은
(a) GLP-1에 있어서, 2 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드로서, 어느 치환부위도 18, 20, 22, 26, 30, 34 또는 36번 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드; 또는,
(b) (a)로 정의되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 있어서, 당쇄 부가 아미노산 이외의 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드;
로서, GLP-1 활성을 갖는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드일 수 있다.
본 발명에 있어서, 당쇄 부가 아미노산은 실시태양에 따라서는, 바람직하게는 당쇄 부가 Asn 또는 당쇄 부가 Cys일 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명에 있어서, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 결합한 복수의 당쇄 부가 아미노산은, 당쇄나 아미노산의 종류에 있어서 동일한 것이어도 되고, 상이한 것이어도 된다.
또한, 본 발명에 있어서, 당쇄 부가 아미노산에 있어서는, 당쇄와 아미노산이 링커를 매개로 결합하는 것도, 링커를 매개로 하지 않고 결합하는 것도 가능하다. 실시태양에 따라서는, 바람직하게는, 링커를 매개로 하지 않고(직접) 결합되어 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 당쇄는, 4개 이상의 당으로 되는 당쇄인 것이, 일반적으로는 바람직하다. 또한, 실시태양에 따라서는, 5개~11개의 당으로 되는 당쇄인 것이 바람직한 경우가 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 당쇄는, 실시태양에 따라서는, 이중가닥(biantennary) 복합형 당쇄가 바람직하다. 또한, 실시태양에 따라서는, 디시알로 당쇄, 모노시알로 당쇄, 아시알로 당쇄, 디글크낙(diGlcNAc) 당쇄 및 디만노오스 당쇄로 이루어진 군으로부터 선택되는 당쇄인 것이 바람직한 경우가 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명에 있어서, 당쇄는, 실시태양에 따라서는, 이하의 식으로 표시되는 당쇄가 바람직한 경우가 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
Figure 112011002379669-pct00001
[식 중, R1 및 R2는 동일 또는 상이하고,
Figure 112011002379669-pct00002
를 나타낸다. Ac는 아세틸기를 나타낸다.]
또한, 본 발명은 1개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되고, 그 당쇄가 올리고히알루론산인 당쇄 부가 GLP-1 펩티드일 수 있다. 올리고히알루론산으로서는, 예를 들면, N-아세틸글루코사민과 글루크론산으로 되는 단위를 1단위로 한 경우에, 2단위(4당) 이상 8단위 이하의 당쇄를 들 수 있고, 2단위(4당)나 4단위(8당)로 할 수 있다.
또한, 본 발명은, 1개 이상의 아미노산에 링커를 매개로 당쇄가 결합되어 있는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드일 수 있다. 링커가 결합하는 GLP-1 펩티드의 아미노산으로서는, 예를 들면, Lys를 들 수 있다. 이 경우, 링커가 그 당쇄측 말단에 아미노산을 포함하고 있어도 된다. 링커의 당쇄측 말단에 포함되는 아미노산으로서는, 예를 들면, Asn을 들 수 있다.
본 발명에 있어서는, 당쇄가 실질적으로 균일한 것이 바람직하고, 예를 들면, 90% 이상 균일, 또는 99% 이상 균일한 것이 바람직하다.
본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는, 바람직하게는 GLP-1과 비교하여 증대된 혈중 안정성을 갖는다.
본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는, GLP-1과 비교하여 바람직하게는 5배 이상, 더욱 바람직하게는 10배 이상, 더욱 바람직하게는 20배 이상의 OGTT(Oral Glucose Tolerance Test)에 있어서의 혈당치 억제활성을 가질 수 있다.
본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는, GLP-1과 비교하여 바람직하게는 20배 이상, 보다 바람직하게는 30배 이상, 더욱 바람직하게는 50배 이상의 DPP-IV 내성을 가질 수 있다.
본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 신규한 유효성분으로서 의약용도로 사용할 수 있다. 그러한 의약용도로서는, GLP-1에 관련된 질환의 치료 또는 예방이 포함된다. 그러한 질환의 대표예는, 예를 들면, 당뇨병이다.
이상 기술한 본 발명의 특징 중 하나 또는 복수를, 임의로 조합시킨 것도, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드인 것은 물론이다.
본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는, GLP-1과 비교하여, 혈중 안정성이 증대되고, 또한, 본 발명의 일태양에 있어서, GLP-1과 비교하여, 혈당치 억제활성이 증대되어 있다. 따라서, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는, GLP-1과 비교하여, 그 투여량 및 투여횟수를 저감할 수 있다.
또한, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 부가되는 당쇄는, 생체내에서 용이하게 분해되기 때문에, 그 축적에 의해 생체에 약해를 주는 경우는 없다.
또한, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 부가되는 당쇄의 일부 또는 전부는, 인간을 포함하는 포유류, 조류 등의 생체내에 존재하는 당쇄나 그의 개변체로, 체내에 투여해도 부작용이나 항원성을 나타낼 가능성이 낮다. 알레르기반응이나, 항체생산이 발생하거나, 그것에 의해 약효가 얻어지지 않게 되는 등의 걱정이 적다.
또한, 본 발명에서 사용되는 당쇄에는, 비교적 짧은 것이 많기 때문에, 복잡한 제조공정을 거치지 않고, 균일한 구조의 것을 얻을 수 있다. 따라서, 대규모로 또한 안정하게 의약품 레벨의 고품질 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 얻을 수 있다.
도 1은 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(26번 위치, 34번 위치 Cys 디시알로 당쇄 부가 GLP-1 또는 18번 위치, 36번 위치 Cys 디시알로 당쇄 부가 GLP-1) 또는 GLP-1의 투여에 의한 혈당치 상승 억제작용을 경구 내당능 시험(OGTT)에 의해 측정한 결과를 나타낸다. 26번 위치, 34번 위치 Cys 디시알로 당쇄 부가 GLP-1, 18번 위치, 36번 위치 Cys 디시알로 당쇄 부가 GLP-1은 0.9 nmol/㎏ 투여하고, GLP-1은 9 nmol/㎏ 투여하였다.
도 2는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(22번 위치, 30번 위치 Cys 디시알로 당쇄 부가 GLP-1, 22번 위치, 36번 위치 Cys 디시알로 당쇄 부가 GLP-1 또는 30번 위치, 36번 위치 Cys 디시알로 당쇄 부가 GLP-1) 또는 GLP-1의 투여에 의한 혈당치 상승 억제작용을 경구 내당능 시험(OGTT)에 의해 측정한 결과를 나타낸다. 22번 위치, 30번 위치 Cys 디시알로 당쇄 부가 GLP-1, 22번 위치, 36번 위치 Cys 디시알로 당쇄 부가 GLP-1, 30번 위치, 36번 위치 Cys 디시알로 당쇄 부가 GLP-1은 0.9 nmol/㎏ 투여하고, GLP-1은 9 nmol/㎏ 투여하였다.
도 3은 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(36번 위치 Cys-히알루론산 4당 부가 GLP-1 또는 36번 위치 Cys-히알루론산 8당 부가 GLP-1) 또는 GLP-1의 투여에 의한 혈당치 상승 억제작용을 경구 내당능 시험(OGTT)에 의해 측정한 결과를 나타낸다. 36번 위치 Cys-히알루론산 4당 부가 GLP-1, 36번 위치 Cys-히알루론산 8당 부가 GLP-1 및 GLP-1은 9 nmol/㎏ 투여하였다.
도 4는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(26번 위치 Lys-아시알로 당쇄 Asn 링커 수식 GLP-1) 또는 GLP-1의 투여에 의한 혈당치 상승 억제작용을 경구 내당능 시험(OGTT)에 의해 측정한 결과를 나타낸다. 26번 위치 Lys-아시알로 당쇄 Asn 링커 수식 GLP-1 및 GLP-1은 9 nmol/㎏ 투여하였다.
도 5는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 투여량이 혈당치 상승 억제작용에 미치는 영향을 조사하기 위해 실시한 경구 내당능 시험(OGTT)의 결과를 나타낸다. 18번 위치, 36번 위치 Cys 디시알로 당쇄 부가 GLP-1은 0.9 nmol/㎏ 투여하고, GLP-1은 9 nmol/㎏ 투여하였다.
본 명세서에 있어서 「GLP-1」이란, 글루카곤 유사 펩티드-1(glucagon-like peptide-1)을 나타내고, GLP-1(7-37)을 가리킨다.
GLP-1(7-37)은, 하기의 아미노산 서열을 갖는다.
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly(서열번호 2)
본 발명에 있어서, 「GLP-1의 유연체(類緣體)」란, GLP-1과 구조상 유사한 펩티드 및/또는 GLP-1과 중복된 구조를 갖는 펩티드, 예를 들면: GLP-1의 아미노산에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 펩티드; GLP-1의 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 보존적으로 치환된 펩티드; GLP-1 개변체; GLP-1 활성을 갖는 GLP-1의 프래그먼트; GLP-1 활성을 갖는 신장 GLP-1; 및 엑센딘-4(이하, 「Ex-4」로 기재하는 경우도 있다.) 및 그의 유연체를 들 수 있다(Curr.Opin.Investig.Drugs 8,842-8(2007),J.Pharmacol.Exp.Ther.307,490-496(2003),Diabetes 50,2530-9(2001)등).
본 명세서 중에 있어서, 「아미노산」이란, 그 가장 넓은 의미로 사용되어, 천연 아미노산 뿐 아니라 아미노산 변이체 및 유도체 등과 같은 비천연 아미노산을 포함한다. 당업자라면, 이 넓은 정의를 고려하여, 본 명세서에 있어서의 아미노산으로서, 예를 들면, 천연 단백 원성 L-아미노산; D-아미노산; 아미노산 변이체 및 유도체 등의 화학수식된 아미노산; 노르류신(norleucine), β-알라닌, 오르니틴 등의 천연 비단백 원성 아미노산; 및 아미노산의 특징인 당업계에서 공지의 특성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물 등을 들 수 있는 것을 이해할 수 있을 것이다. 비천연 아미노산의 예로서, α-메틸아미노산(α-메틸알라닌 등), D-아미노산, 히스티딘 유사 아미노산(2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 및 α-메틸-히스티딘 등), 측쇄에 여분의 메틸렌을 갖는 아미노산(「호모」아미노산) 및 측쇄 중의 카르복실산 관능기 아미노산이 설폰산기로 치환되는 아미노산(시스테인산 등)을 들 수 있다. GLP-1 활성을 갖는 GLP-1 유연체의 몇 가지는, 비천연 아미노산을 포함하는 것이 알려진다. 바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 화합물에 포함되는 아미노산은, 천연 아미노산만으로 된다.
본 명세서 중에 있어서, 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되었다고 하는 경우, 치환 등되는 아미노산의 개수는, GLP-1 활성을 보유하는 한 특별히 한정되지 않으나, 1~9개, 바람직하게는 1~5개, 보다 바람직하게는 1~3개 정도이거나 또는 전체 길이의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내이다. 치환 또는 부가되는 아미노산은, 천연의 아미노산, 비천연의 아미노산 또는 아미노산 아날로그일 수 있고, 바람직하게는 천연의 아미노산이다. 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 GLP-1 펩티드의 예로서는, 예를 들면, 8번 위치의 Ala와 35번 위치의 Gly를 비천연 아미노산의 α-메틸알라닌(아미노이소부탄산, Aib라고도 부른다)으로 치환하고, 37번 위치의 Gly를 결실시켜, 36번 위치의 Arg가 아미드화된 BIM51077(Curr.Opin.Investig.Drugs 8,842-8(2007)) 을 들 수 있다.
본 명세서 중에 있어서, 「아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 보존적으로 치환된」것이란, 아미노산 치환에 있어서, 원래의 아미노산과 치환되는 아미노산의 친수성 지수 및/또는 소수성 지수가 유사한 치환으로서, 그러한 치환의 전후에서, GLP-1 활성의 명확한 저하 또는 소실을 발생시키지 않는 치환을 말한다.
본 명세서 중에 있어서, 「GLP-1 개변체」란, GLP-1을 천연 또는 인공적으로 개변한 화합물로, 그러한 개변으로서는, 예를 들면, GLP-1의 1 또는 복수의 아미노산 잔기의, 알킬화, 아실화(예를 들면 아세틸화), 아미드화, 카르복실화, 에스테르 형성, 디설피드 결합형성, 글리코실화, 지질화, 인산화, 수산화, 표지성분의 결합 등을 들 수 있다.
본 명세서 중에 있어서, 「GLP-1 활성을 갖는 GLP-1의 프래그먼트」란, GLP-1의 N 말단 및/또는 C 말단으로부터 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실되고, 또한 GLP-1 활성을 유지한 펩티드이다.
본 명세서 중에 있어서, 「GLP-1 활성을 갖는 신장 GLP-1」이란, GLP-1의 N 말단 및/또는 C 말단에 1개 또는 그 이상의 아미노산이 부가되고, 또한 GLP-1 활성을 유지한 펩티드이다(예를 들면, Endocrinology,125,3109-14(1989)를 참조).
본 명세서 중에 있어서, 「GLP-1의 C 말단(37번 위치)에 추가적으로 1 또는 수개의 아미노산이 부가된 펩티드」라고 하는 경우, GLP-1의 C 말단에 부가된 아미노산부터 순서대로, 38번 위치의 아미노산, 39번 위치의 아미노산…등으로 부르고, 또한, 「GLP-1의 N 말단(7번 위치)에 추가적으로 1 또는 수개의 아미노산이 부가된 펩티드」라고 하는 경우, GLP-1의 N 말단에 부가된 아미노산부터 순서대로, 6번 위치의 아미노산, 5번 위치의 아미노산…등으로 부르는 것으로 한다. 예를 들면, 「GLP-1의 C 말단(37번 위치)에 추가적으로 1개의 아미노산이 부가된 펩티드」로서, GLP-1의 37번 위치의 Gly에 Asn 또는 Cys가 결합한 펩티드를 들 수 있다.
본 발명의 「당쇄 부가 GLP-1 펩티드」는, 1개 이상의 아미노산이, 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 한다.
본 명세서 중에 있어서, 「당쇄 부가 GLP-1 펩티드」에는, GLP-1의 1개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 펩티드, 상기 GLP-1 유연체에 있어서 1개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 펩티드가 포함되고, 각각, 추가적으로 당쇄 부가 아미노산 이외의 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되어 있어도, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 포함된다. 이들 펩티드의 C 말단이 아미드화된 펩티드(예를 들면, His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 GLP-1(7-36) NH2의 1개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 펩티드)도, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 포함된다. 또한, 이들 펩티드의 염도, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 포함된다.
본 명세서 중에 있어서, 염은, 산부가염 또는 염기 부가염 중 어느 것이어도 된다. 산부가염을 형성하기 위해 통상 사용되는 산은, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 인산 등의 무기산 및 p-톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 옥살산, p-브로모페닐설폰산, 카르복실산, 숙신산, 구연산, 안식향산, 초산 등의 유기산이다. 염기 부가염으로서는, 수산화암모늄 또는 알칼리 또는 알칼리토류금속 수산화물, 탄산염, 중탄산염 등의 무기염기로부터 유도된 염을 들 수 있다. 특히, 약학적으로 허용되는 염이 바람직하다.
본 명세서 중에 있어서, 「당쇄 부가 아미노산」이란, 당쇄가 결합한 아미노산으로, 여기에서 당쇄와 아미노산은, 링커를 매개로 결합되어 있어도 된다. 당쇄와 아미노산의 결합부위에 특별히 제한은 없으나, 당쇄의 환원 말단에 아미노산이 결합되어 있는 것이 바람직하다.
당쇄가 결합하는 아미노산의 종류에 특별히 한정은 없고, 천연 아미노산, 비천연 아미노산 중 어느 것을 사용하는 것도 가능하다. 당쇄 부가 아미노산이 생체내에 당펩티드(당단백질)로서 존재하는 것과 동일 또는 유사한 구조를 갖는다고 하는 관점에서는, 당쇄 부가 아미노산은, N-결합형 당쇄와 같은 당쇄 부가 Asn, O-결합형 당쇄와 같은 당쇄 부가 Ser 및 당쇄 부가 Thr이 바람직하며, 특히 당쇄 부가 Asn이 바람직하다.
또한, 당쇄와 아미노산이 링커를 매개로 결합되어 있는 경우, 링커와의 결합 용이성이라는 관점에서는, 당쇄 부가 아미노산의 아미노산은, 아스파라긴산이나 글루타민산 등의 분자 내에 둘 이상의 카르복실기를 갖는 아미노산, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 트립토판 등의 분자 내에 2 이상의 아미노기를 갖는 아미노산, 세린, 트레오닌, 티로신 등의 분자 내에 수산기를 갖는 아미노산, 시스테인 등의 분자 내에 티올기를 갖는 아미노산, 아스파라긴, 글루타민 등의 분자 내에 아미드기를 갖는 아미노산이 바람직하다. 특히, 반응성의 관점에서는, 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민이 바람직하다.
또한, 본 발명의 임의의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 대해서, 당쇄 구조, 당쇄 이외의 구조, 당쇄의 부가 부위 및 당쇄의 부가 수가 동일한 경우에, 당쇄 부가 아미노산이, 당쇄 부가 Asn(링커를 매개로 하지 않는다)의 경우와 당쇄 부가 Cys(링커를 매개로 한다)의 경우에서, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 상승 억제활성에 커다란 차이는 보이지 않는다.
당쇄와 아미노산이 링커를 매개로 결합되어 있는 경우, 링커로서는, 당해 분야에서 사용되고 있는 것을 넓게 사용할 수 있는데, 예를 들면, -NH-(CO)-(CH2)a-CH2-(식 중, a는 정수이고, 목적으로 하는 링커 기능을 저해하지 않는 한 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 0~4의 정수를 나타낸다.), C1-10 폴리메틸렌, -CH2-R-(여기서, R은 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 탄소환기, 치환된 탄소환기, 복소환기 및 치환된 복소환기로 이루어진 군으로부터 선택되는 기로부터 수소원자가 1개 이탈되어 생기는 기이다.), -(CO)-(CH2)a-(CO)-(식 중, a는 정수이고, 목적으로 하는 링커 기능을 저해하지 않는 한 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 0~4의 정수를 나타낸다.) 등을 들 수 있다.
당쇄 부가 아미노산에 있어서 당쇄와 GLP-1 골격 상의 아미노산이 링커를 매개로 결합되어 있는 경우, 링커가, 당쇄측 말단에 아미노산을 포함하는 것도 바람직하다. 아미노산의 종류는 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 예로서는 Asn을 들 수 있다.
당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 당쇄 부가 아미노산에 있어서, 당쇄와 아미노산이 링커를 매개로 하지 않고 결합되어 있는 경우, 당쇄와 아미노산이 링커를 매개로 결합되어 있는 경우와 비교하여, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 항원성은 낮아질 수 있다. 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 당쇄 부가 아미노산에 있어서, 당쇄와 아미노산이 링커를 매개로 결합되어 있는 경우, 당쇄와 아미노산이 링커를 매개로 하지 않고 결합되어 있는 경우와 비교하여, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 혈중 안정성이 높아질 수 있다.
또한, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는, 그 기재(예를 들면, 「아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드」라는 기재)에 의해 조금도 제조방법이 한정되는 것은 아니고, 후술하는 A법~C법 중 어느 방법으로 제조한 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이더라도, 「아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드」에 포함된다. 또한, 예를 들면, 아미노산이 결합되어 있지 않은 당쇄를, 펩티드 상의 아미노산에 직접 또는 링커를 매개로 결합한 당쇄 부가 GLP-1 펩티드; 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 있어서, 부가한 당쇄에 추가적으로 당 또는 당쇄를 부가 함으로써 이미 부가된 당쇄를 신장시킨 당쇄 부가 GLP-1 펩티드; 당쇄 부가 아미노산의 아미노기 및/또는 카르복실기에 1 또는 수개의 아미노산을 결합시키고, 추가적으로 이를 1 또는 복수의 GLP-1 프래그먼트와 연결시킨 당쇄 부가 GLP-1 펩티드; 아미노산이 결합한 당쇄를, 펩티드 상의 아미노산에 링커를 매개로 결합한 당쇄 부가 GLP-1 펩티드 등도 최종적인 구조가 일치하고 있는 한, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 포함된다.
GLP-1의 아미노산을 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 수는, 혈중 안정성이나 혈당치 억제활성 등의 생리활성, 최종적인 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 존재하는 아미노산의 개수나 당쇄 부가 전후의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 분자량 등으로 적절히 조절하면 된다. 예를 들면, 1~5개 치환하는 것이 바람직하고, 1~3개 치환하는 것이 보다 바람직하다. 본 발명의 일태양에 있어서는, 2개 이상 치환하는 것이 바람직하고, 예를 들면 2~5개 치환하는 것이 바람직하며, 2~3개 치환하는 것이 보다 바람직하다. 간편성의 관점에서는, 1개의 치환으로 목적하는 활성이 얻어지는 것이라면, 1개의 치환을 선택하는 것이 바람직할 것이다. 일반적으로, GLP-1의 1개의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 있어서, 당쇄 부가 아미노산 이외의 아미노산의 1개 이상을 추가적으로 당쇄 부가 아미노산으로 치환한 경우, 혈중 안정성은 증대되고, 혈당치 억제활성은 감소하는 경향이 있다(단, 혈중 안정성이 증대됨으로써, 감소한 혈당치 억제활성을 보상하는 것이 가능하다).
본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 있어서, 아미노산을 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 부위는, 혈중 안정성이나 혈당치 억제활성으로 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 일태양에 있어서, GLP-1 아미노산을 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 부위는, 목적하는 활성에 따라 GLP-1의 임의의 부위를 선택할 수 있고, 예를 들면, GLP-1의 8, 9, 12, 18, 19, 20, 22, 26, 30, 34, 36 및 38번 위치(=37번 위치의 아미노산에 당쇄 부가 아미노산을 부가)로부터 선택되는 1 이상의 부위이고, 바람직하게는 18, 20, 22, 26, 30, 34, 36 및 38번 위치로부터 선택되는 1 이상의 부위이며, 예를 들면, 18, 26, 30, 34 및 36번 위치로부터 선택되는 1 이상의 부위이고, 특히 30 및 36번 위치로부터 선택되는 1 이상의 부위이다.
본 발명의 일태양에 있어서, 아미노산을 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 부위는, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 혈중 안정성이라는 관점에서는, GLP-1의 임의의 부위를 선택할 수 있고, 예를 들면, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 32, 34, 36 및 38번 위치(=37번 위치의 아미노산에 당쇄 부가 아미노산을 부가)로부터 선택되는 1 이상의 부위이고, 바람직하게는 9, 10, 11, 12, 14 및 28번 위치로부터 선택되는 1 이상의 부위이며, 특히 바람직하게는 9, 10, 11 및 12로부터 선택되는 1 이상의 부위이다. 특히 GLP-1의 N 말단에 가까운 부위의 아미노산의 치환도 바람직하다. 특히 GLP-1의 2 이상의 아미노산을 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 부위의 예로서, 예를 들면 GLP-1의 18번 위치와 36번 위치의 치환, 26번 위치와 34번 위치의 치환, 22번 위치와 30번 위치의 치환, 22번 위치와 36번 위치의 치환, 30번 위치와 36번 위치의 치환 등을 들 수 있다.
본 발명의 일태양에 있어서, 아미노산을 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 부위는, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 억제작용이라는 관점에서는, 예를 들면 GLP-1의 18, 20, 22, 26, 30, 34, 36 및 38번 위치(=37번 위치의 아미노산에 당쇄 부가 아미노산을 부가)로부터 선택되는 1 이상의 부위로서, 바람직하게는 18, 26, 30, 34 및 36번 위치로부터 선택되는 1 이상의 부위이며, 특히 30 및 36번 위치로부터 선택된 1 이상의 부위이다. 특히 GLP-1의 2 이상의 아미노산을 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 부위의 예로서, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 억제작용이라는 관점에서, 예를 들면 GLP-1의 18번 위치와 36번 위치의 치환, 26번 위치와 34번 위치의 치환, 22번 위치와 30번 위치의 치환, 22번 위치와 36번 위치의 치환, 30번 위치와 36번 위치의 치환 등을 들 수 있다.
본 발명의 일태양에 있어서, 아미노산을 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 부위는, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 GLP-1 활성 중, cAMP 합성능에 관한 관점에서는, 바람직하게는 22, 26, 27, 30, 34, 36 및 38번 위치(=37번 위치의 아미노산에 당쇄 부가 아미노산을 부가)로부터 선택되는 1 이상의 부위이고, 보다 바람직하게는 22, 26, 30, 34, 36 및 38번 위치로부터 선택되는 1 이상의 부위이다.
본 발명의 일태양에 있어서, 아미노산을 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 부위는, GLP-1의 8, 9 및 12번 위치 이외의 부위로부터 선택되는 1 이상의 부위이다.
본 발명의 일태양에 있어서, 아미노산을 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 부위는, GLP-1의 7, 10, 13, 15, 19, 21, 28 및 29번 위치 이외의 부위로부터 선택되는 1 이상의 부위, 특히, 7, 10, 15 및 28번 위치 이외의 부위로부터 선택되는 1 이상의 부위이다.
본 발명의 일태양에 있어서, 아미노산을 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 부위는, GLP-1의 GLP-1 수용체로의 결합부위로부터도 결정할 수 있다.
본 발명의 일태양에 있어서, 2 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있는 경우에, 아미노산을 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 부위는, 상기 중 어느 조합도 채용할 수 있으나 이것에 한정되지 않는다. 예를 들면, 하나의 부위가 상기의 바람직한 부위로부터 선택되고, 다른 부위가 GLP-1의 임의의 부위로부터 선택되는 조합; 하나의 부위가 상기의 바람직한 부위로부터 선택되고, 다른 부위가 GLP-1의 C 말단(37번 위치)에 추가적으로 부가된 1 또는 수개의 아미노산의 임의의 부위로부터 선택되는 조합 등도 또한, 본 발명의 바람직한 일태양에 포함된다.
본 발명의 일태양에 있어서, 당쇄 부가 아미노산 이외의 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가는, GLP-1에 있어서의:
8번 위치의 Ala가 Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 및 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
9번 위치의 Glu가 Asp 및 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
11번 위치의 Thr이 Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 및 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
12번 위치의 Phe가 Trp 및 Tyr로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
13번 위치의 Thr이 Ser로 치환;
14번 위치의 Ser이 Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 및 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
15번 위치의 Asp가 Glu로 치환;
16번 위치의 Val이 Phe, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Tyr, Glu, Asp 및 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
17번 위치의 Ser이 Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 및 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
18번 위치의 Ser이 Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 및 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
19번 위치의 Tyr이 Phe, Trp, Glu, Asp 및 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
20번 위치의 Leu가 Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 및 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
21번 위치의 Glu가 Asp 및 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
22번 위치의 Gly가 Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 및 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
23번 위치의 Gln이 Asn, Arg, Glu, Asp 및 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
24번 위치의 Ala가 Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp 및 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
25번 위치의 Ala가 Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 및 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
26번 위치의 Lys가 Arg, Gln, Glu, Asp 및 His로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
27번 위치의 Glu가 Asp, Ile 및 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
28번 위치의 Phe가 Trp로 치환;
29번 위치의 Ile가 Leu, Val 및 Ala로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
30번 위치의 Ala가 Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 및 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
31번 위치의 Trp가 Phe, Tyr, Glu, Asp 및 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
32번 위치의 Leu가 Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp 및 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
33번 위치의 Val이 Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp 및 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
34번 위치의 Lys가 Arg, Glu, Asp 및 His로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
35번 위치의 Gly가 Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 및 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
36번 위치의 Arg가 Lys, Glu, Asp 및 His로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환; 및/또는 37번 위치의 Gly가 Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 및 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
인 것인 바람직하나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일태양에 있어서, 당쇄 부가 아미노산 이외의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가가 발생하는 부위는, GLP-1의 7, 10, 13, 15, 19, 21, 28 및 29번 위치 이외의 부위로부터 선택되는 1 이상의 부위, 예를 들면, 7, 10, 15 및 28번 위치 이외의 부위로부터 선택되는 1 이상의 부위인 것이 바람직하다(Structure-Activity Studies of Glucagon-like Peptide-l, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.269,No.9,Issue of March 4,pp.6276-6278.1994).
본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드로서는, 예를 들면,
일반식(1)
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Xaa19-Leu-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Gly-Xaa36-Xaa37
[식 중, Xaa18은 Ser, 당쇄 부가 Cys, 또는 당쇄 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa19은 Tyr, 당쇄 부가 Cys, 또는 당쇄 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa22는 Gly, 당쇄 부가 Cys, 또는 당쇄 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa26는 Lys, 당쇄 부가 Cys, 당쇄 부가 Asn, 또는 당쇄 부가 Lys를 나타낸다.
Xaa30는 Ala, 당쇄 부가 Cys, 또는 당쇄 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa34는 Lys, 당쇄 부가 Cys, 당쇄 부가 Asn, 또는 당쇄 부가 Lys를 나타낸다.
Xaa36는 Arg, 당쇄 부가 Cys, 또는 당쇄 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa37은 Gly, NH2, Gly-당쇄 부가 Cys 또는 Gly-당쇄 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa18이 Ser이고, Xaa19이 Tyr이며, Xaa22가 Gly이고, Xaa26가 Lys이며, Xaa30이 Ala이고, Xaa34이 Lys이며, 또한 Xaa36가 Arg인 경우, Xaa37은 Gly-당쇄 부가 Cys 또는 Gly-당쇄 부가 Asn을 나타낸다.]
로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드로서: 2 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드; 당쇄가 올리고히알루론산인 당쇄 부가 GLP-1 펩티드; 당쇄가 고만노오스형 당쇄인 당쇄 부가 GLP-1 펩티드 등을 들 수 있다. 또한, 당쇄 부가 Cys, 당쇄 부가 Asn 및 당쇄 부가 Lys는, 모두 당쇄와 아미노산 사이에 링크를 포함해도 된다. 본 명세서에 있어서, 일반식(1)로 표시되는 펩티드를 서열번호 1로 나타낸다.
구체적으로는, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드로서는, 예를 들면,
(a1) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 당쇄 부가 Cys를 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 4);
(a2) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 당쇄 부가 Cys를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 5);
(a3) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 당쇄 부가 Cys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 6);
(a4) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 당쇄 부가 Cys를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 7)
(a5) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 당쇄 부가 Cys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 8)
(a6) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 당쇄 부가 Cys를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 9);
(a7) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly-당쇄 부가 Cys를 나타내는 펩티드(서열번호 10);
(a8) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 당쇄 부가 Cys를 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 11);
(a9) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 당쇄 부가 Asn을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 12);
(a10) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 당쇄 부가 Asn을 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 13);
(a11) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 당쇄 부가 Asn을 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 14);
(a12) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 당쇄 부가 Asn을 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 15);
(a13) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 당쇄 부가 Asn을 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 16);
(a14) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 당쇄 부가 Asn을 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 17);
(a15) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly-당쇄 부가 Asn을 나타내는 펩티드(서열번호 18);
(a16) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 당쇄 부가 Asn을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 19);
(a17) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 당쇄 부가 Cys를 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 펩티드(서열번호 20);
(a18) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 당쇄 부가 Cys를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 화합물(서열번호 21);
(a19) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 당쇄 부가 Cys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 화합물(서열번호 22);
(a20) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 당쇄 부가 Cys를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 화합물(서열번호 23);
(a21) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 당쇄 부가 Cys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 화합물(서열번호 24);
(a22) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 당쇄 부가 Cys를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 펩티드(서열번호 25);
(a23) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 당쇄 부가 Cys를 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 펩티드(서열번호 26);
(a24) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 당쇄 부가 Asn을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 펩티드(서열번호 27);
(a25) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 당쇄 부가 Asn을 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 펩티드(서열번호 28);
(a26) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 당쇄 부가 Asn을 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 펩티드(서열번호 29);
(a27) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 당쇄 부가 Asn을 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 펩티드(서열번호 30);
(a28) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 당쇄 부가 Asn을 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 펩티드(서열번호 31);
(a29) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 당쇄 부가 Asn을 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 펩티드(서열번호 32); 또는
(a30) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 당쇄 부가 Asn을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 펩티드(서열번호 33) 등을 들 수 있다.
이상의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 예에 있어서, 당쇄는, 예를 들면 올리고히알루론산이나, 고만노오스형 당쇄인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드로서는,
(a31) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 당쇄 부가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 34); 또는
(a32) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 당쇄 부가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 35) 등도 들 수 있다.
이상의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 예에 있어서는, 예를 들면, 당쇄 부가 Lys에 있어서의 당쇄와 Lys가 링커를 매개로 결합되어 있는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드로서는,
(a33) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 당쇄 부가 Cys를 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 당쇄 부가 Cys를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 36);
(a34) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 당쇄 부가 Cys를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 당쇄 부가 Cys를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 37);
(a35) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 당쇄 부가 Cys를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 당쇄 부가 Cys를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 38);
(a36) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 당쇄 부가 Cys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 당쇄 부가 Cys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 39);
(a37) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 당쇄 부가 Cys를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 당쇄 부가 Cys를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 40);
(a38) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 당쇄 부가 Asn을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 당쇄 부가 Asn을 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 41);
(a39) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 당쇄 부가 Asn을 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 당쇄 부가 Asn을 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 42);
(a40) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 당쇄 부가 Asn을 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 당쇄 부가 Asn을 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 43);
(a41) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 당쇄 부가 Asn을 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 당쇄 부가 Asn을 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 44);
(a42) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 당쇄 부가 Asn을 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 당쇄 부가 Asn을 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 45) 등도 들 수 있다.
이상의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 예에 있어서 당쇄는, 예를 들면, 이중가닥(biantennary) 복합형 당쇄인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드로서는,
(a43) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 당쇄 부가 Cys를 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 당쇄 부가 Cys를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly-당쇄 부가 Cys를 나타내는 펩티드(서열번호 46);
(a44) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 당쇄 부가 Cys를 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 당쇄 부가 Cys를 나타내고, Xaa26가 당쇄 부가 Cys를 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 47);
(a45) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 Ser를 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 당쇄 부가 Asn을 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 당쇄 부가 Asn을 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly-당쇄 부가 Asn을 나타내는 펩티드(서열번호 48);
(a46) 상기 일반식(1)에 있어서 Xaa18이 당쇄 부가 Asn을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 당쇄 부가 Asn을 나타내고, Xaa26가 당쇄 부가 Asn을 나타내며, Xaa30가 Ala를 나타내고, Xaa34가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 펩티드(서열번호 49) 등도 들 수 있다.
이상의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 예에 있어서 당쇄는, 예를 들면, 이중가닥 복합형 당쇄인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드 유연체로서, 예를 들면, 이하의 아미노산 서열을 갖는 엑센딘-4에 당쇄를 부가한 것을 들 수 있다.
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2(서열번호 50)
당쇄 부가 엑센딘-4는, 예를 들면, 이하의 일반식(2)로 표시된다.
일반식(2)
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xaa12-Gln-Xaa14-Glu-Xaa16-Glu-Ala-Val-Xaa20-Leu-Phe-Ile-Xaa24-Trp-Leu-Lys-Xaa28-Gly-Xaa30-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
[식 중, Xaa12는 Lys, 당쇄 부가 Cys, 또는 당쇄 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa14은 Met, 당쇄 부가 Cys, 또는 당쇄 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa16은 Glu, 당쇄 부가 Cys, 또는 당쇄 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa20는 Arg, 당쇄 부가 Cys, 또는 당쇄 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa24는 Glu, 당쇄 부가 Cys, 또는 당쇄 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa28는 Asn, 당쇄 부가 Cys, 또는 당쇄 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa30는 Gly, 당쇄 부가 Cys, 또는 당쇄 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa12, Xaa14, Xaa16, Xaa20, Xaa24, Xaa28 및 Xaa30 중 하나 이상은 당쇄 부가 Cys 또는 당쇄 부가 Asn이다.](서열번호 51)
이 중에서도, 예를 들면, Xaa24 및/또는 Xaa30가 당쇄 부가 Cys 또는 당쇄 부가 Asn인 것이 바람직하고, 특히, Xaa30가 당쇄 부가 Cys인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 중, 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 GLP-1에 당쇄를 부가한 예로서, 예를 들면, 이하의 아미노산 서열을 갖는 BIM51077에 당쇄를 부가한 것을 들 수 있다.
His-R2-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-R2-Arg-NH2
[식 중, R2는 α-메틸알라닌을 나타낸다.](서열번호 52)
당쇄 부가 BIM51077은, 예를 들면, 이하의 일반식(3)으로 표시된다.
일반식(3)
His-R2-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Xaa20-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-R2-Xaa36-NH2
[식 중, R2는 α-메틸알라닌을 나타내고,
Xaa18은 Ser, 당쇄 부가 Cys, 또는 당쇄 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa20는 Leu, 당쇄 부가 Cys, 또는 당쇄 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa22는 Gly, 당쇄 부가 Cys, 또는 당쇄 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa26는 Lys, 당쇄 부가 Cys, 당쇄 부가 Asn, 또는 당쇄 부가 Lys를 나타낸다.
Xaa30는 Ala, 당쇄 부가 Cys, 또는 당쇄 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa34는 Lys, 당쇄 부가 Cys, 당쇄 부가 Asn, 또는 당쇄 부가 Lys를 나타낸다.
Xaa36는 Arg, 당쇄 부가 Cys, 또는 당쇄 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa18, Xaa20, Xaa22, Xaa26, Xaa30, Xaa34 및 Xaa36 중 하나 이상은 당쇄 부가 Cys 또는 당쇄 부가 Asn이다.](서열번호 53)
또한, 엑센딘-4나 BIM51077과 같이, 본래 C 말단이 아미드화되어 있는 펩티드에 대해서는, 당해 C 말단의 아미노산에 당쇄를 부가한 당쇄 부가 아미노산을 합성하는 경우, C 말단을 아미드화하지 않는 경우도 있다.
본 명세서 중에 있어서, 「당쇄」란, 단위당(단당 및/또는 그의 유도체)이 하나 이상 연결되어 생긴 화합물을 말한다. 단위당이 둘 이상 연결되는 경우, 각각의 단위당끼리 사이는, 글리코시드 결합에 의한 탈수축합에 의해 결합한다. 이러한 당쇄로서는, 예를 들면, 생체 중에 함유되는 단당류 및 다당류(글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 푸코오스, 크실로오스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 시알산 및 그들의 복합체 및 유도체) 외에, 분해된 다당, 당단백질, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸, 당지질 등의 복합 생체분자로부터 분해 또는 유도된 당쇄 등 광범위한 것을 들 수 있으나 그들에 한정되지 않는다. 당쇄는 직쇄형이어도 되고 분지쇄형이어도 된다.
또한, 본 명세서 중에 있어서, 「당쇄」에는 당쇄의 유도체도 포함되고, 당쇄의 유도체로서는, 예를 들면, 당쇄를 구성하는 당이, 카르복실기를 갖는 당(예를 들면, C-1번 위치가 산화되어 카르복실산으로 된 알돈산(aldonic acid)(예를 들면, D-글루코오스가 산화된 D-글루콘산), 말단의 C원자가 카르복실산으로 된 우론산(uronic acid)(D-글루코오스가 산화된 D-글루크론산)), 아미노기 또는 아미노기의 유도체(예를 들면, 아세틸화된 아미노기)를 갖는 당(예를 들면, N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-갈락토사민 등), 아미노기 및 카르복실기를 양쪽 모두 갖는 당(예를 들면, N-아세틸뉴라민산(시알산), N-아세틸무람산 등), 데옥시화된 당(예를 들면, 2-데옥시-D-리보오스), 황산기를 포함하는 황산화당, 인산기를 포함하는 인산화당 등인 당쇄를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 바람직한 당쇄는, GLP-1에 부가된 경우(당쇄 부가 아미노산의 형태로 GLP-1의 아미노산과 치환된 경우)에, GLP-1의 혈중 안정성을 증대시키며, 또한, 보다 바람직하게는 혈당치 억제활성을 소실시키지 않는 당쇄이다. 본 발명의 어느 한 태양에 있어서, 바람직한 당쇄는, GLP-1에 부가된 경우(당쇄 부가 아미노산의 형태로 GLP-1의 아미노산과 치환된 경우)에, GLP-1의 혈당치 억제활성을 증대시키는 당쇄이다.
본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 있어서의 당쇄는 특별히 한정되지 않고, 생체내에서 복합 당질(당펩티드(또는 당단백질), 프로테오글리칸, 당지질 등)로서 존재하는 당쇄여도 되고, 생체내에서는 복합 당질로서 존재하지 않는 당쇄여도 된다.
생체내에서 복합 당질로서 존재하는 당쇄는, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드가 생체에 투여된다고 하는 관점에서 바람직하다. 이러한 당쇄로서는, 생체내에서 당펩티드(또는 당단백질)로서 펩티드(또는 단백질)에 결합되어 있는 당쇄인 N-결합형 당쇄, O-결합형 당쇄 등을 들 수 있다. 바람직하게는, N-결합형 당쇄가 사용된다. N 결합형 당쇄로서는, 예를 들면, 고만노오스(하이만노오스)형, 복합(컴플렉스)형, 혼성(하이브리드)형을 들 수 있고, 특히 바람직하게는 복합형이 좋다.
본 발명에서 사용하는 바람직한 복합형 당쇄로서는, 예를 들면, 하기 일반식
Figure 112011002379669-pct00003
[식 중, R1 및 R2는 동일 또는 상이하고,
Figure 112011002379669-pct00004
를 나타낸다. Ac는 아세틸기를 나타낸다.]
으로 표시되는 당쇄 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 있어서는, 당쇄가 생체내에서 복합 당질로서 존재하는 당쇄여도 되고, O-결합형 및 N-결합형 이외의 방법으로 GLP-1 펩티드에 결합되어 있어도 된다. 예를 들면, 전술한 바와 같이, 당쇄가 링커를 매개로 Cys나 Lys에 결합되어 있는 것도, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 포함된다.
본 발명의 바람직한 일태양에 있어서, 당쇄는, 히알루론산, 콘트로이틴, 콘드로이틴 황산 A~C, 헤파린, 헤파란 황산, 케라탄 황산을 포함하는, 비교적 저분자의 글리코사미노글리칸이다. 이들 당쇄는, 아미노당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)과, 우론산(글루크론산 또는 L-이두론산(L-iduronic acid))으로 되는 이당 단위의 반복이 직쇄상으로 연결되어 있다. 또한, 본 명세서에 있어서, 비교적 저분자의 글리코사미노글루칸이란, 예를 들면 분자량이 약 10 kDa 이하, 바람직하게는 6 kDa 이하, 더욱 바람직하게는 약 4 kDa 이하인 것, 또는, 당의 수가 약 50개 이하, 바람직하게는 30개 이하, 더욱 바람직하게는 20개 이하인 것을 말한다.
본 발명의 일태양에 있어서, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 있어서의 당쇄는, 4개 이상, 예를 들면 5개 이상, 7개 이상, 특히 9개 이상, 11개 이상의 당으로 되는 당쇄인 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 일태양에 있어서, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 있어서의 당쇄는, 5~11개, 9~11개 또는 11개의 당으로 되는 당쇄이다.
본 발명의 바람직한 일태양에 있어서, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 있어서의 당쇄는, 이중가닥의 복합형 당쇄이다. 복합형 당쇄란, 2종류 이상의 단당을 포함하고, 이하에 나타내는 기본구조와, Galβ1-4GlcNAc로 나타내어지는 락토사민 구조를 갖는 것을 특징으로 한다.
Figure 112011002379669-pct00005
이중가닥 복합형 당쇄란, 기본구조의 말단의 2개의 만노오스에, 각각 0~3당으로 되는 단일가닥(monoantenna)의 당쇄가 결합되어 있는 것을 말한다. 이중가닥 복합형 당쇄로서는, 예를 들면, 이하에 나타내는 디시알로 당쇄,
Figure 112011002379669-pct00006
모노시알로 당쇄,
Figure 112011002379669-pct00007
아시알로 당쇄,
Figure 112011002379669-pct00008
디글크낙 당쇄,
Figure 112011002379669-pct00009
디만노오스 당쇄,
Figure 112011002379669-pct00010
등이 바람직하고, 보다 바람직하게는 디시알로 당쇄이다.
또한, 본 명세서 중에 있어서 「디시알로 당쇄」, 「모노시알로 당쇄」, 「아시알로 당쇄」, 「디글크낙 당쇄」, 「디만노오스 당쇄」에는, 상기 화학식으로 나타낸 것 외에, 화학식으로 나타낸 예와 결합양식이 상이한 것도 포함되며, 이러한 당쇄도 본 발명의 당쇄로서 바람직하게 사용된다. 이러한 당쇄로서는, 예를 들면, 디시알로 당쇄 또는 아시알로 당쇄에 있어서 시알산과 갈락토오스가 (α2→3) 결합으로 결합되어 있는 것 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 고만노오스형 당쇄는, 전술한 복합형 당쇄의 기본구조에, 추가적으로 만노오스가 2개 이상 결합되어 있는 당쇄이다. 고만노오스형 당쇄는 부피가 크기 때문에, 펩티드에 고만노오스형 당쇄를 결합시킴으로써 혈중 안정성이 보다 높아질 수 있다. 포유류의 만노오스형 당쇄와 같이, 5~9개의 만노오스를 포함하는 당쇄가 바람직하나, 효모의 고만노오스형 당쇄와 같이, 보다 많은 만노오스를 포함하는 당쇄여도 된다. 본 발명에 바람직하게 사용되는 고만노오스형 당쇄로서는, 예를 들면,
하이만노오스-5(M-5)
Figure 112011002379669-pct00011
하이만노오스-9(M-9)
Figure 112011002379669-pct00012
등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 바람직한 당쇄로서는, 예를 들면, 인간 체내에 있어서, 단백질과 결합한 당단백질로서 존재하는 당쇄(예를 들면, 「FEBS LETTERS Vol. 50, No. 3, Feb. 1975」에 기재된 당쇄)와, 동일 구조를 갖는 당쇄(구성당의 종류 및 그들의 결합양식이 동일한 당쇄) 또는 이것의 비환원 말단으로부터 1 또는 복수의 당을 상실한 당쇄인, 하기 표 1~4에 기재된 당쇄를 들 수 있다.
Figure 112011002379669-pct00013
Figure 112011002379669-pct00014
Figure 112011002379669-pct00015
Figure 112011002379669-pct00016
또한, 본 발명의 일태양에 있어서, 바람직한 당쇄는, 직쇄구조를 갖는 당쇄이다. 이러한 당쇄로서는, 예를 들면, 올리고히알루론산을 들 수 있다. 본 명세서에 있어서, 올리고히알루론산이란, N-아세틸글루코사민과 글루크론산이 번갈아 2~32당, 바람직하게는 2~16당, 보다 바람직하게는 4~8당, 직쇄 상에 결합한 당쇄를 말한다.
본 발명에 사용되는 올리고히알루론산 중, 특히 바람직한 것으로서, N-아세틸글루코사민과 글루크론산으로 되는 단위를 1단위로 한 경우, 2단위(4당) 이상 8단위(16당) 이하의 당쇄를 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 2단위(4당)~4단위(8당), 가장 바람직하게는 2단위(4당)이다.
본 발명에 바람직하게 사용되는 히알루론산으로서는, 예를 들면,
4당의 올리고히알루론산,
Figure 112011002379669-pct00017
8당의 올리고히알루론산
Figure 112011002379669-pct00018
등을 들 수 있다.
본 발명의 바람직한 일태양에 있어서, 본 발명의 당펩티드에 있어서의 당쇄의 구조는, 균일하다. 본 명세서 중에 있어서, 당펩티드에 있어서의 당쇄의 구조가 균일하다는 것은, 당펩티드간 비교한 경우에, 펩티드 중의 당쇄 부가 부위, 당쇄를 구성하는 각 당의 종류, 결합순서, 및 당간 결합양식이 동일한 것을 말하고, 적어도 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상의 당쇄의 구조가 균일한 것을 말한다. 당쇄가 균일한 당펩티드는, 품질이 일정하여, 특히 의약품의 제조나, 어세이 등의 분야에 있어서 바람직하다. 균일한 당쇄의 비율은, 예를 들면, HPLC, 캐필러리 전기영동, NMR, 질량분석 등을 사용한 방법에 의해 측정하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서, 바람직한 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는, 예를 들면, 후술하는 실시예 1~15에 있어서 제조한 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(서열번호 54~66)이다. 즉, 이하의 GLP-1의 서열:
His7-Ala8-Glu9-Gly10-Thr11-Phe12-Thr13-Ser14-Asp15-Val16-Ser17-Ser18-Tyr19-Leu20-Glu21-Gly22-Gln23-Ala24-Ala25-Lys26-Glu27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp31-Leu32-Val33-Lys34-Gly35-Arg36-Gly37(서열번호 2)에 있어서:
(b1) 26번 위치의 Lys 및 34번 위치의 Lys가 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 1)(서열번호 54);
(b2) 18번 위치의 Ser 및 36번 위치의 Arg가 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 2)(서열번호 55);
(b3) 22번 위치의 Gly 및 30번 위치의 Ala가 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 3)(서열번호 56);
(b4) 22번 위치의 Gly 및 36번 위치의 Arg가 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 4)(서열번호 57);
(b5) 30번 위치의 Ala 및 36번 위치의 Arg가 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 5)(서열번호 58);
(b6) 30번 위치의 Ala가 올리고히알루론산 4당(HA-4) 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 6)(서열번호 59);
(b7) 30번 위치의 Ala가 올리고히알루론산 8당(HA-8) 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 7)(서열번호 60);
(b8) 36번 위치의 Arg가 올리고히알루론산 4당(HA-4) 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 8)(서열번호 61);
(b9) 36번 위치의 Arg가 올리고히알루론산 8당(HA-8) 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 9)(서열번호 62);
(b10) 30번 위치의 Ala가 올리고히알루론산 16당(HA-16) 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 10)(서열번호 63);
(b11) 36번 위치의 Arg가 올리고히알루론산 16당(HA-16) 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 11)(서열번호 64);
(b12) 36번 위치의 Arg가 고만노오스형 당쇄(M5) 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 12)(서열번호 65);
(b13) 26번 위치의 Lys에, 링커를 매개로 아시알로 당쇄 부가 Asn이 결합한 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 13)(서열번호 66)이다.
또한,
(b14) 이하의 엑센딘-4의 서열:
H-His1-Gly2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Leu10-Ser11-Lys12-Gln13-Met14-Glu15-Glu16-Glu17-Ala18-Val19-Arg20-Leu21-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly30-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38-Ser39-NH2(서열번호 50)에 있어서:
30번 위치의 Gly가 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 14)(서열번호 67)이다.
또한,
(b15) 이하의 BIM51077의 서열:
His7-R28-Glu9-Gly10-Thr11-Phe12-Thr13-Ser14-Asp15-Val16-Ser17-Ser18-Tyr19-Leu20-Glu21-Gly22-Gln23-Ala24-Ala25-Lys26-Glu27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp31-Leu32-Val33-Lys34-R235-Arg36-NH2[식 중, R2는 α-메틸알라닌을 나타낸다.](서열번호 52)에 있어서:
26번 위치의 Lys가 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 15)(서열번호 68)이다.
또한,
(b16) 상기 엑센딘-4의 서열(서열번호 50)에 있어서, 30번 위치의 Gly가 고만노오스형 당쇄(M5) 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 16)이다.
본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는, 당업자에게 공지의 펩티드 합성방법에, 당쇄 부가 공정을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 당쇄 부가시에는, 트랜스글루타미나아제로 대표되는, 효소의 역반응을 이용하는 방법도 사용할 수 있으나, 이 경우, 부가하는 당쇄가 대량으로 필요해지고, 최공공정 후의 정제가 번잡해지며, 당쇄의 부가위치 및 부가 가능한 당쇄가 제한되는 등의 문제가 있기 때문에, 어세이용 등의 소량의 합성에는 사용하는 것이 가능하더라도, 의약품 제조 등의 대규모 제조에는 실용적인 방법이라고는 할 수 없는 경우가 있다.
본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 간편한 제조방법으로서, 또한, 당쇄의 구조가 균일한 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 안정한 제조방법의 구체예로서, 이하, 당쇄 부가 아미노산으로서 당쇄 부가 Asn을 사용하고, 고상합성, 액상합성 등의 공지의 펩티드 합성방법을 적용함으로써 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 제조하는 방법(A법), 및 GLP-1의 임의의 아미노산을 Cys로 치환한 펩티드를 공지의 펩티드 합성방법에 따라 제조하고, 그 후, Cys에 화학합성에 의해 당쇄를 부가하고, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 제조하는 방법(B법)을 예시한다. 또한, 당쇄 부가 아미노산에 있어서 당쇄와 아미노산이 링커를 매개로 결합하고 있으며, 또한, 당해 링커가 당쇄측 말단에 아미노산을 포함하는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 제조예로서, 먼저 당쇄 부가 Asn에 링커의 일단을 결합한 후, 링커의 타단에 N-히드록시숙신산이미딜기를 결합시키고, N-히드록시숙신산이미딜기를 GLP-1 펩티드의 Lys 잔기의 측쇄 아미노기와 반응시켜서, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 제조하는 방법(C법)을 나타낸다. 이들의 제조방법을 참고로, 당업자라면 다양한 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 제조하는 것이 가능하고, 얻어지는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드 및 그의 제조방법은, 특히 의약품 제조의 분야에 있어서, 매우 유용하다. 또한, 이들 A법~C법은, 둘 이상을 조합해서 행하는 것도 가능하다. 어세이 등에 사용하는 소량의 합성이라면, 또한, 상기 방법에, 전이효소에 의한 당쇄 신장반응을 조합시키는 것도 가능하다. 또한, A법은 국제공개 제WO 2004/005330호 팸플릿(US2005222382(A1))에, B법은 국제공개 제WO2005/010053호 팸플릿(US2007060543(A1))에 각각 기재되어 있고, 그 개시는 전체적으로 본 명세서에 참조로써 포함된다. 또한, A법 내지 C법에 있어서 사용되는 당쇄구조가 균일한 당쇄의 제조에 관해서는, 제WO03/008431호 팸플릿(US2004181054(A1)), 제WO2004/058984호 팸플릿(US2006228784(A1)), 제WO2004/058824호 팸플릿(US2006009421(A1)), 제WO2004/070046호 팸플릿(US2006205039(A1)), 제WO2007/011055호 팸플릿 등에 기재되어 있고, 그 개시는 전체적으로 본 명세서에 참조로써 포함된다.
당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 제조하는 방법(A법)
먼저, (1) 수산기를 갖는 수지(레진)의 수산기와, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산의 카르복실기를 에스테르화반응시킨다. 이 경우 아미노산의 아미노기 질소를 지용성 보호기로 보호하고 있기 때문에, 아미노산끼리의 자기결합은 방지되어, 레진의 수산기와 아미노산의 카르복실기가 반응하여 에스테르화가 일어난다.
다음으로 (2) 상기에서 얻어진 에스테르의 지용성 보호기를 이탈하여 유리(遊離) 아미노기를 형성시키고, (3) 이 유리 아미노기와, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산의 카르복실기와 아미드화반응시키며,
(4) 상기 지용성 보호기를 이탈하여 유리 아미노기를 형성시키고,
(5) 상기 (3) 및 (4)의 공정을 1회 이상 반복함으로써, 임의의 수의 임의의 아미노산이 연결된, 말단에 레진을 결합하고, 타단에 유리 아미노기를 갖는 펩티드가 얻어진다.
(6) 다음으로, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 당쇄 아스파라긴(당쇄 부가 아스파라긴)의 아스파라긴부분의 카르복실기와 상기 유리 아미노기를 아미드화반응시키고,
(7) 추가적으로 상기 지용성 보호기를 이탈하여 유리 아미노기를 형성시키며,
(8) 이 유리 아미노기와, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산의 카르복실기와 아미드화반응시키고,
(9) 상기 (7) 및 (8)의 공정을 1회 이상 반복하며,
(10) 상기 지용성 보호기를 이탈하여 유리 아미노기를 형성시킴으로써, 임의의 수의 임의의 아미노산이 연결된, 말단에 레진을 결합하고, 타단에 유리 아미노기를 가지며, 중간에 당쇄 아스파라긴을 갖는 당펩티드가 얻어진다.
(11) 그리고, 산으로 수지(레진)를 절단함으로써, 당쇄 아스파라긴을 펩티드 사슬의 임의의 위치에 갖는 당펩티드를 제조할 수 있다.
또한, 이 당쇄 아스파라긴을 펩티드 사슬의 단부에 도입하는 것도 가능하다.
수산기를 갖는 수지(레진)로서는, 통상, 고상합성에서 사용하는 수산기를 갖는 수지(레진)이면 되고, 예를 들면, Amino-PEGA 레진(머크사제), Wang 레진(머크사제), HMPA-PEGA 레진(머크사제) 등을 사용할 수 있다.
아미노산으로서는 모든 아미노산을 사용할 수 있고, 예를 들면, 천연 아미노산인, 세린(Ser), 아스파라긴(Asn), 발린(Val), 류신(Leu), 이소류신(Ile), 알라닌(Ala), 티로신(Tyr), 글리신(Gly), 리신(Lys), 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 아스파라긴산(Asp), 글루타민산(Glu), 글루타민(Gln), 트레오닌(Thr), 시스테인(Cys), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 트립토판(Trp), 프롤린(Pro)을 들 수 있다.
지용성 보호기로서는, 예를 들면 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)기, t-부틸옥시카르보닐(Boc)기, 벤질기, 알릴기, 알릴옥시카르보닐기, 아세틸기 등의, 카보네이트계 또는 아미드계의 보호기 등을 들 수 있다. 지용성 보호기를 도입하는데는, 예를 들면 Fmoc기를 도입하는 경우에는 9-플루오레닐메틸-N-숙시니미딜카보네이트와 탄산수소나트륨을 첨가하여 반응을 행함으로써 도입할 수 있다. 반응은 0~50℃, 바람직하게는 실온에서, 약 1~5시간 정도 행하는 것이 좋다.
지용성 보호기로 보호한 아미노산으로서는, 상기 아미노산을 상기 방법으로 제조할 수 있다. 또한, 시판의 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, Fmoc-Ser, Fmoc-Asn, Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Ile, Fmoc-AIa, Fmoc-Tyr, Fmoc-Gly, Fmoc-Lys, Fmoc-Arg, Fmoc-His, Fmoc-Asp, Fmoc-Glu, Fmoc-Gln, Fmoc-Thr, Fmoc-Cys, Fmoc-Met, Fmoc-Phe, Fmoc-Trp, Fmoc-Pro를 들 수 있다.
에스테르화 촉매로서, 예를 들면 1-메시틸렌설포닐-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT), 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 디이소프로필카르보디이미드(DIPCDI) 등의 공지의 탈수축합제를 사용할 수 있다. 아미노산과 탈수축합제의 사용비율은, 전자 1 중량부에 대해, 후자가 통상 1~10 중량부, 바람직하게는 2~5 중량부이다.
에스테르화반응은, 예를 들면, 고상 칼럼에 레진을 넣고, 이 레진을 용제로 세정하여, 그 후 아미노산의 용액을 첨가함으로써 행하는 것이 바람직하다. 세정용 용제로서는, 예를 들면 디메틸포름아미드(DMF), 2-프로판올, 염화메틸렌 등을 들 수 있다. 아미노산을 용해하는 용매로서는, 예를 들면 디메틸설폭시드(DMSO), DMF, 염화메틸렌 등을 들 수 있다. 에스테르화반응은 0~50℃, 바람직하게는 실온에서 약 10분~30시간 정도, 바람직하게는 15분~24시간 정도 행하는 것이 좋다.
이때 고상 상의 미반응의 수산기를 무수초산 등을 사용하여 아세틸화하여 캡핑하는 것도 바람직하다.
지용성 보호기의 이탈은, 예를 들면 염기로 처리함으로써 행할 수 있다. 염기로서는, 예를 들면 피페리딘, 모르폴린 등을 들 수 있다. 그때, 용매의 존재하 행하는 것이 바람직하다. 용매로서는, 예를 들면 DMSO, DMF, 메탄올 등을 들 수 있다.
유리 아미노기와, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산의 카르복실기의 아미드화반응은, 활성화제 및 용매의 존재하 행하는 것이 바람직하다.
활성화제로서는, 예를 들면, 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드·염산염(WSC/HCl), 디페닐포스포릴아지드(DPPA), 카르보닐디이미다졸(CDI), 디에틸시아노포스포네이트(DEPC), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스피롤리디노포스포늄(DIPCI), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(PyBOP), 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), 히드록시숙신이미드(HOSu), 디메틸아미노피리딘(DMAP), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt), 히드록시프탈이미드(HOPht), 펜타플루오로페놀(Pfp-OH), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트(HBTU), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스포네이트(HATU), O-벤조트리아졸-1-일-1,1,3,3-테트라메틸우로늄테트라플루오로보레이트(TBTU), 3,4-디히드로-3-히드로디-4-옥사-1,2,3-벤조트리아진(Dhbt) 등을 들 수 있다.
활성화제의 사용량은, 지용성의 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산에 대해, 1~20 당량, 바람직하게는 1~10 당량, 더욱 바람직하게는 1~5 당량으로 하는 것이 바람직하다.
용매로서는, 예를 들면 DMSO, DMF, 염화메틸렌 등을 들 수 있다. 반응은 0~50℃, 바람직하게는 실온에서, 약 10~30시간 정도, 바람직하게는 15분~24시간 정도 행하는 것이 좋다. 지용성 보호기의 이탈은, 상기와 동일하게 행할 수 있다.
수지(레진)로부터 펩티드 사슬을 절단하는데는 산으로 처리하는 것이 바람직하다. 산으로서는, 예를 들면 트리플루오로초산(TFA), 불화수소(HF) 등을 들 수 있다.
상기 (6)의, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 당쇄 아스파라긴의 아스파라긴 부분의 카르복실기와 펩티드의 유리 아미노기를 아미드화반응시키고, (7)의, 상기 지용성 보호기를 이탈하여 유리 아미노기를 형성시키는 공정을, 적절히 추가함으로써, 적어도 둘 이상의 당쇄 아스파라긴을 펩티드 사슬의 임의의 위치에 갖는 당펩티드를 제조할 수 있다. 또한 이때, 상이한 당쇄 아스파라긴을 사용함으로써 2종 이상의 당쇄 아스파라긴을 펩티드 사슬의 임의의 위치에 갖는 당펩티드를 제조하는 것도 가능하다.
또한 상기 (6)의, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 당쇄 아스파라긴의 아스파라긴 부분의 카르복실기와 아미드화반응시키고, (7)의, 상기 지용성 보호기를 이탈하여 유리 아미노기를 형성시키는 공정을, 최종공정, 즉 공정(9) 및 (10) 대신에 행함으로써, 적어도 하나 이상의 당쇄 아스파라긴을 펩티드 사슬에 갖는 당펩티드를 제조할 수 있다.
또한, 상기 공정(1)을 행할 때, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산 대신에, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 당쇄 아스파라긴의 아스파라긴 부분의 카르복실기를, 레진의 수산기와 에스테르화반응시킴으로써, C 말단에 당쇄 아스파라긴을 갖는 당펩티드를 제조할 수 있다. 이대, 공정(6)을 추가적으로 행해도 되고, 행하지 않아도 된다.
이와 같이 하여, 목적하는 위치를 당쇄 부가 Asn으로 치환한 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 얻을 수 있다.
당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 제조하는 방법(B법)
먼저, Cys를 포함하는 펩티드를, 고상합성법, 액상합성법, 세포에 의한 합성, 천연에 존재하는 것을 분리 추출하는 방법 등에 의해 제조한다. Cys의 위치를 변경함으로써, 목적하는 위치에 당쇄를 부가할 수 있다.
다음으로, 할로아세타미드화 복합형 당쇄 유도체를 상기에서 얻은 Cys를 포함하는 펩티드와 반응시킴으로써 제조한다. 상기 반응은, 통상 0~80℃, 바람직하게는 10~60℃, 더욱 바람직하게는 15~35℃에서 행하는 것이 좋다. 반응시간은, 바람직하게는 통상 30분~5시간 정도이다. 반응종료 후에는, 적절히 공지의 방법(예를 들면, 고속액체칼럼크로마토그래피(HPLC))으로 정제하는 것이 좋다.
할로아세타미드화 복합형 당쇄 유도체는, 예를 들면, 복합형 아스파라긴 결합형 당쇄의 1번 위치의 탄소에 결합하고 있는 수산기를, -NH-(CO)-(CH2)a-CH2X(X는 할로겐원자, a는 정수로, 목적으로 하는 링커기능을 저해하지 않는 한 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 0~4의 정수를 나타낸다.)로 치환한 화합물이다.
구체적으로는, 할로아세타미드화 복합형 당쇄 유도체와 Cys 함유 펩티드를 인산완충액 중, 실온에서 반응시킨다. 반응종료 후, HPLC로 정제함으로써 당쇄 부가 Cys로 치환한 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 얻을 수 있다.
당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 제조하는 방법(C법)
먼저, Lys를 포함하는 펩티드를, 고상합성법, 액상합성법, 세포에 의한 합성, 천연에 존재하는 것을 분리 추출하는 방법 등에 의해 제조한다.
다음으로, 당쇄 부가 아미노산에, 글루타르산을 결합시킨다. 예를 들면, 당쇄 부가 아미노산을 DMSO용액에 용해시키고, 이 용액에, 글루타르산-EDC 혼합의 DMSO용액을 첨가하고, 실온에서 1일 교반한다. 반응혼합물을 적절히 희석한 후, 분자량 배제 겔 크로마토그래피 등으로 분획함으로써, α-아미노기에 글루타르산을 결합시킨 당쇄 부가 아미노산을 얻을 수 있다.
이어서, 글루타르산 결합 당쇄 부가 아미노산의 DMSO용액에, N-히드록시숙신산이미드의 DMSO용액 및 EDC의 DMSO용액을 첨가하고, 실온에서 6시간 교반한 후, EDC를 불활성화함으로써, 글루타르산 결합 당쇄 부가 아미노산의 N-히드록시숙신산 이미딜 에스테르를 합성할 수 있다.
계속해서, GLP-1 펩티드의 DMSO용액에, DIPEA 및 글루타르산 결합 당쇄 부가 아미노산의 N-히드록시숙신산 이미딜 에스테르를 첨가하고, 실온에서 2시간 교반한 후, 글리신수용액을 첨가하여 반응을 정지하고, 적절히 정제함으로써, GLP-1 펩티드의 Lys 잔기에 글루타르산 링커를 매개로 당쇄 부가 아미노산을 결합시킬 수 있다. 이렇게 하여, 당쇄 부가 아미노산에 있어서 당쇄와 아미노산(Lys)이 링커를 매개로 결합하고, 그 링커가 당쇄측 말단에 아미노산(Asn)을 포함하는 당쇄 부가 GLP-1이 얻어진다.
GLP-1 펩티드의 목적하는 부위의 아미노산을 Lys로 치환하거나, GLP-1 펩티드의 야생형에 포함되는 Lys 잔기를 다른 아미노산으로 치환하거나 함으로써, 목적하는 부위에 당쇄 부가 아미노산을 결합시킨 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 얻는 것이 가능하다. 또한, C법에 의하면, 야생형 GLP-1에 포함되는 Lys에 당쇄 부가하는 경우, 펩티드 골격이 야생형과 동일한 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 얻을 수 있다.
본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는, GLP-1 활성을 갖는다.
본 명세서 중에 있어서, 「GLP-1 활성」이란, GLP-1에 대해서 공지의 생리활성의 일부 또는 전부를 말한다. GLP-1은, 혈당치 억제작용 외에, 예를 들면, 췌장도작용(pancreatic islet effect)으로서, cAMP 합성유도에 수반되는 인슐린 분비, 췌장도 보호(아포토시스 억제), 췌장도 증식, 췌외작용(extra-pancreatic effect)으로서, 식욕 억제, 소화관운동 억제, 칼시토닌 분비 촉진, 허혈시의 심장 보호작용 등을 갖는 것이 알려진다. 따라서, GLP-1 활성이란, 이들 작용에 관련된 생리활성의 전부 또는 일부를 가리키고, 각각, 당업자에게 공지의 수법을 사용해서 측정할 수 있다.
예를 들면, GLP-1 활성 중, 혈당치 억제활성은, 당뇨병 마우스(db/db 마우스)에 있어서의 혈당치 저하작용의 측정이나, 경구 내당능 시험(OGTT: Oral Glucose Tolerance Test)에 있어서의 혈당치 상승 억제작용의 측정 등을 사용해서 측정할 수 있다. 또한, 본 명세서 중에 있어서, 「혈당치 억제」란, 혈당치의 상승을 억제하는 것 및 혈당치를 저하시키는 것 모두의 개념을 포함한다. 특히, 본 명세서 중에 있어서, db/db 마우스에 있어서의 혈당치 억제작용을 「혈당치 저하작용」, OGTT에 있어서의 혈당치 억제작용을 「혈당치 상승 억제작용」이라 하는 경우가 있다.
OGTT에 의한 혈당치 억제활성은, 마우스에 강제적으로 당을 마시게 했을 때의 혈당치 상승의 억제의 측정에 의해 판단할 수 있다. 예를 들면, 후술하는 시험예 2의 수법을 사용한 경우, 먼저, 피험화합물을 하룻밤 절식시킨 마우스에 투여하고, 그 30분 후에 글루코오스용액을 경구투여한다. 글루코오스 투여에 의해 마우스 혈당치는 상승하고, 투여 후 약 30분 후에 최대가 되고 서서히 감소한다. 글루코오스 투여 후 30분의 혈당치를 측정하고, GLP-1 투여의 경우의 혈당치와 비교함으로써, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 억제작용을 측정할 수 있다. 이 30분 후의 혈당치를 GLP-1을 투여한 경우와 비교한 경우, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는, 바람직하게는 80% 이하, 보다 바람직하게는 60% 이하, 더욱 바람직하게는 40% 이하, 특히 바람직하게는 30% 이하의 혈당치를 나타낸다. 또한, OGTT에 있어서 동정도의 혈당치 상승 억제작용이 확인되었을 때의 투여량을 비교함으로써, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 억제활성의 강도를 판단할 수 있다. 예를 들면, GLP-1을 10 투여한 경우와, 어느 한 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 1 투여한 경우에 동일한 혈당치 억제작용이 얻어지는 경우, 그 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 억제활성은, GLP-1의 10배이다. 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는, GLP-1과 비교하여, 바람직하게는 5배 이상, 보다 바람직하게는 10배 이상 또는 그 이상의 혈당치 억제활성을 갖는다.
또한, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드가, GLP-1에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 펩티드에 당쇄 부가한 것인 경우나, GLP-1 유연체에 당쇄 부가한 것인 경우, GLP-1 활성을 비교하는 대상으로서, GLP-1 유연체나, 그의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드와 당쇄 부가 아미노산 이외의 아미노산 서열이 동일한 GLP-1 펩티드를 사용해도 된다.
db/db 마우스를 사용한 혈당치 억제활성은, 당뇨병 마우스에 피험화합물을 투여 후의 혈당치의 측정에 의해 판단할 수 있다. 예를 들면, 피험화합물 투여 후의 혈당치를 경시로 측정하고, 예를 들면 투여 후 120분의 혈당치가 투여시보다 저하되어 있으면, 혈당치 저하작용을 확인할 수 있다. 또한, 예를 들면 투여 후 300분의 혈당치를 측정함으로써, 혈당치 저하작용의 지속성도 판단할 수 있다. 예를 들면, 투여 후 120분의 혈당치를 GLP-1 투여의 경우와 비교한 경우, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는, 바람직하게는 80% 이하, 보다 바람직하게는 70% 이하, 특히 바람직하게는 60% 이하의 혈당치를 나타낸다. 또한, 투여 후 120분의 혈당치를, 투여시의 혈당치와 비교한 경우, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는, 바람직하게는 70% 이하, 보다 바람직하게는 60% 이하, 특히 바람직하게는 50% 이하(예를 들면 45% 이하)의 혈당치를 나타낸다. 투여 후 300분의 혈당치를 GLP-1 투여의 경우와 비교한 경우, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는, 바람직하게는 70% 이하, 보다 바람직하게는 50% 이하의 혈당치를 나타낸다. 또한, 투여 후 300분의 혈당치를, 투여시의 혈당치와 비교한 경우, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는, 바람직하게는 70% 이하, 보다 바람직하게는 50% 이하의 혈당치를 나타낸다.
또한, 혈당치 억제활성이 GLP-1과 비교하여 낮은 경우이더라도, 혈중 안정성이 증대됨으로써, 이 활성의 낮음을 보상할 수 있다.
예를 들면, GLP-1 활성 중, 인슐린 분비활성은, 인 비트로(in vitro)에서의 cAMP 합성능 시험 등을 사용해서 측정할 수 있다. GLP-1은 GLP-1 수용체와 결합함으로써 세포내 cAMP 농도를 상승시켜, 인슐린 분비를 촉진시킨다. 따라서, 예를 들면, 마우스 GLP-1 수용체 발현 CHO-K1 세포를 당쇄 부가 GLP-1 펩티드로 자극하고, 세포내에서 합성되는 cAMP량을 측정하여, EC50값을 GLP-1과 비교함으로써, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 인슐린 분비활성을 측정할 수 있다.
본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는, GLP-1 보다도 증대된 혈중 안정성을 갖는다. 혈중 안정성은 당업자에게 공지의 수법을 사용해서 측정할 수 있고, 예를 들면, 혈장 중에 있어서의 안정성과, DPP-IV(디펩티딜펩티다아제 IV)에 대한 내성을 측정하여, 반감기, AUC(약물 혈중농도-시간 곡선하 면적) 등을 지표로 판단할 수 있다. 또한, 신장 클리어런스의 증대도 혈중 안정성의 증대에 기여한다.
본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는, GLP-1과 비교하여, 혈장 중에 있어서의 안정성이 증대되어 있다.
DPP-IV에 대한 내성은, 예를 들면 후술하는 시험예 1과 같이, DPP-IV용액 중에 있어서의 반감기의 측정에 의해 판단할 수 있다. 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는, GLP-1과 비교하여, DPP-IV에 대한 내성이 증대되고 있어, 예를 들면 후술하는 시험예 1의 수법을 사용하여 DPP-IV에 대한 내성을 측정한 경우, 그 반감기는 GLP-1과 비교하여 1.2배 이상(예를 들면 2배 이상), 바람직하게는 5배 이상, 보다 바람직하게는 10배 이상, 특히 바람직하게는 20배 이상(예를 들면 100배 이상) 증대되어 있다.
또한, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는, 바람직하게는 1시간 이상, 보다 바람직하게는 3, 5, 7, 10, 15, 20시간 이상 및 더욱 바람직하게는 24시간 이상의 혈중 반감기를 갖는다.
다음으로, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물에 대해서 설명한다.
본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물은, GLP-1에 관련된 질환의 치료 또는 예방에 유효하다. 전술한 바와 같이, GLP-1에는 각종 작용이 알려져 있고, 이들 작용에 관련된 질환도 다양하다. 예를 들면, GLP-1이, 인슐린 방출을 자극함으로써, 세포에 의한 글루코오스 흡수 및 혈당치의 저하를 일으키는 것이 발견되어 있다. 또한, 위 및/또는 장운동성을 억제하는 것, 위 및/또는 장 내용 배출을 억제하는 것 및 식물 섭취를 억제하는 것도 발견되어 있다. 따라서, GLP-1에 관련된 질환에는, 예를 들면, 비인슐린 의존성 당뇨병(NIDDM), 인슐린 의존성 당뇨병, 뇌졸중(Efendic에 의한 국제공개공보 제WO00/16797호 팸플릿을 참조), 심근경색(Efendic에 의한 국제공개공보 WO98/08531호 팸플릿을 참조), 비만(Efendic에 의한 국제공개공보 제WO98/19698호 팸플릿을 참조), 기능성 소화불량, 과민성장증후군(Efendic에 의한 국제공개공보 제WO99/64060호 팸플릿을 참조), 췌장도 이식이 포함된다. 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물은, 특히 당뇨병의 치료 또는 에방에 유효하고, 보다 특정하자면, 1형 당뇨병의 예방, 2형 당뇨병의 치료에 유효하다.
상기 의약 조성물은, 통상 사용되는 충전제, 증량제, 결합제, 보습제, 붕괴제, 표면활성제, 활택제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여, 통상의 의약 조성물의 형태로 제제한 것이다.
이러한 의약 조성물로서는, 예를 들면, 정제, 환제, 산제, 액제, 현탁제, 유제, 과립제, 캡슐제, 좌제, 주사제 등을 들 수 있다.
의약 조성물 중에 함유되는 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 양은, 특별히 한정되지 않고 넓은 범위내에서 적절히 선택할 수 있으나, 통상, 의약 조성물 중에 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 1~70 중량% 함유시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물은, 추가적으로 다른 유효성분을 함유하는 것도 가능하고, 다른 유효성분을 함유하는 의약 조성물과 조합해서 사용하는 것도 가능하다. 또한, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물은, 추가적으로 상이한 1 이상의 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 것도 가능하고, 상이한 1 이상의 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물과 조합해서 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 의약 조성물의 투여방법으로서는 특별히 제한은 없고, 각종 제제 형태, 환자의 연령, 성별, 질환의 상태, 기타 조건에 따른 방법으로 투여된다. 정제, 환제, 액제, 현탁제, 유제, 과립제 및 캡슐제의 경우의 투여방법으로서는, 예를 들면, 경구투여를 들 수 있다. 또한, 주사제의 경우에는, 단독으로, 또는 포도당, 아미노산 등의 통상의 보액과 혼합하여, 정맥내, 근육내, 피내, 피하 또는 복강내에 투여할 수 있다. 좌제의 경우에는, 직장내에 투여된다.
상기 의약 조성물의 투여량은, 용법, 환자의 연령, 성별, 질환의 정도, 기타 조건에 따라 적절히 선택하면 되고, 통상, 체중 1 ㎏에 대해 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드가 0.1~900 nmol, 바람직하게는 1~90 nmol이 되는 투여량이다. 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는 GLP-1에 비해, 혈중 안정성이 매우 높고, 또한 일태양에 있어서, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는 GLP-1에 비해, 혈당치 억제활성이 매우 높기 때문에, 투여량을 줄일 수 있다고 하는 이점이 있다.
상기 의약 조성물의 투여횟수는, 용법, 환자의 연령, 성별, 질환의 정도, 기타 조건에 따라 적절히 선택하면 되고, 예를 들면, 3회/1일, 2회/1일, 1회/1일, 더 나아가서는 그 혈중 안정성에 따라, 보다 빈도가 적은 투여횟수(예를 들면, 1회/주, 1회/월 등)도 선택할 수 있다. 바람직하게는, 상기 의약 조성물의 투여횟수는, 1회 이하/1일이다. 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는 GLP-1에 비해, 혈중 안정성이 매우 높기 때문에, 투여횟수를 줄일 수 있다는 이점이 있다.
본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 부가된 당쇄는, 체내의 대사계에서 용이하게 분해된다. 또한, 본 발명의 일태양에 있어서, 그 당쇄는 생체내에서 당펩티드(또는 당단백질)로서 결합하여 존재하는 구조를 갖는다. 따라서, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드 및 그 펩티드를 유효성분으로서 포함하는 의약 조성물은, 생체내에 투여해도 부작용이나 항원성을 나타내지 않아, 알레르기반응이나, 항체생산에 의해 약효가 얻어지지 않게 될 우려가 적은 등의 이점을 갖는다.
또한, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는 안정하여 간편하게 대량으로 제공하는 것이 가능하여, 품질이 안정한, 고품질의 의약품의 제공이라는 관점에서도, 매우 유용하다.
본 발명은 또한, 본 발명의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는, GLP-1에 관련된 질환의 치료 또는 예방방법도 제공한다.
또한, 본 명세서에 있어서 사용되는 용어는, 특정 실시태양을 설명하기 위해 사용되는 것으로, 발명을 한정하는 의도는 아니다.
또한, 본 명세서에 있어서 사용되는 「포함한다」는 용어는, 문맥상 명확히 상이한 이해를 해야 하는 경우를 제외하고, 기술된 사항(부재, 스텝, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 의도하는 것으로, 그 이외의 사항(부재, 스텝, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 배제하지 않는다.
상이한 정의가 없는 한, 여기에 사용되는 모든 용어(기술용어 및 과학용어를 포함한다.)는, 본 발명이 속하는 기술의 당업자에게 있어서 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 여기에 사용되는 용어는, 상이한 정의가 명시되어 있지 않는 한, 본 명세서 및 관련기술분야에 있어서의 의미와 정합적인 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하고, 이상화되거나, 또는 과도하게 형식적인 의미에서 해석되어서는 안 된다.
본 발명의 실시태양은 모식도를 참조하면서 설명되는 경우가 있으나, 모식도인 경우, 설명을 명확하게 하기 위해, 과장되어 표현되고 있는 경우가 있다.
제1, 제2 등의 용어가 각종 요소를 표현하기 위해 사용되나, 이들 요소는 그들 용어에 의해 한정되어서는 안 되는 것이 이해된다. 이들 용어는 하나의 요소를 다른 요소와 구별하기 위해서만 사용되고 있는 것으로, 예를 들면, 제1 요소를 제2 요소로 기재하고, 마찬가지로, 제2 요소는 제1 요소로 기재하는 것은, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 가능하다.
이하에 있어서, 본 발명을, 실시예를 참조하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 여러 태양에 의해 구현화할 수 있어, 여기에 기재되는 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예를 토대로 구체적으로 설명하나 조금도 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 26번 위치, 34번 위치 Cys-디시알로 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μmol)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 mmol), TBTU(0.25 mmol) 및 N-에틸모르폴린(0.25 mmol)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 mmol), MSNT(0.50 mmol) 및 N-메틸이미다졸(0.375 mmol)을 DCM(2 ㎖)에 용해시켜서, 고상합성용 칼럼에 넣고, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용하여 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시켜서, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(O.4 mmol)를 첨가한 후에, 고상합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 mmol)를 고상합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하여, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 mmol)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하여, 고상 수지 상에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Cys(Trt)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기의 펩티드를 얻었다(서열번호 69).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상합성용 칼럼에 덜어, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하고, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 26번 위치 및 34번 위치의 Lys가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
이하에 나타내는 브로모아세틸화한 디시알로 당쇄(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 10.5 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 2.1 ㎎을 100 mM 인산완충액 pH 7.5, 210 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다.
Figure 112011002379669-pct00019
HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그대로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 26번 위치 및 34번 위치의 Lys가 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(26, 34 Cys GLP-1-disialo)를 0.1 ㎎ 얻었다.
실시예 2 18번 위치, 36번 위치 Cys-디시알로 당쇄 부가 GLP-1의 합성법
고상합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μmol)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 mmol), TBTU(0.25 mmol) 및 N-에틸모르폴린(0.25 mmol)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 mmol), MSNT(0.50 mmol) 및 N-메틸이미다졸(0.375 mmol)을 DCM(2 ㎖)에 용해시켜서, 고상합성용 칼럼에 넣고, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용하여 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시켜서, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(O.4 mmol)를 첨가한 후에, 고상합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 mmol)를 고상합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하여, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 mmol)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하여, 고상 수지에 Gly-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 70).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상합성용 칼럼에 덜어, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하고, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 18번 위치의 Ser 및 36번 위치의 Arg가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당쇄(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 10.5 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 2.1 ㎎을 100 mM 인산완충액 pH 7.5, 210 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그대로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 18번 위치의 Ser 및 36번 위치의 Arg가 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(18, 36 Cys GLP-1-disialo)를 0.8 ㎎ 얻었다.
실시예 3 22번 위치, 30번 위치 Cys-디시알로 당쇄 부가 GLP-1의 합성법
고상합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μmol)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 mmol), TBTU(0.25 mmol) 및 N-에틸모르폴린(0.25 mmol)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 mmol), MSNT(0.50 mmol) 및 N-메틸이미다졸(0.375 mmol)을 DCM(2 ㎖)에 용해시켜서, 고상합성용 칼럼에 넣고, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용하여 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시켜서, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(O.4 mmol)를 첨가한 후에, 고상합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 mmol)를 고상합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하여, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 mmol)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(Trt), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하여, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 71).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상합성용 칼럼에 덜어, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하고, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 22번 위치의 Gly 및 30번 위치의 Ala가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당쇄(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 7.9 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 1.3 ㎎을 100 mM 인산완충액 pH 7.4, 200 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그대로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 22번 위치의 Gly 및 30번 위치의 Ala가 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(22, 30 Cys GLP-1-disialo)를 1.0 ㎎ 얻었다.
실시예 4 22번 위치, 36번 위치 Cys-디시알로 당쇄 부가 GLP-1의 합성법
고상합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μmol)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 mmol), TBTU(0.25 mmol) 및 N-에틸모르폴린(0.25 mmol)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 mmol), MSNT(0.50 mmol) 및 N-메틸이미다졸(0.375 mmol)을 DCM(2 ㎖)에 용해시켜서, 고상합성용 칼럼에 넣고, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용하여 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시켜서, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(O.4 mmol)를 첨가한 후에, 고상합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 mmol)를 고상합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하여, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 mmol)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하여, 고상 수지에 Gly-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 72).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상합성용 칼럼에 덜어, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하고, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 22번 위치의 Gly 및 36번 위치의 Arg가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당쇄(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 11.9 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 2.0 ㎎을 100 mM 인산완충액 pH 7.4, 400 ㎕에 녹이고, 37℃에서 1시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그대로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 22번 위치의 Gly 및 36번 위치의 Arg가 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(22, 36 Cys GLP-1-disialo)를 2.9 ㎎ 얻었다.
실시예 5 30번 위치, 36번 위치 Cys-디시알로 당쇄 부가 GLP-1의 합성법
고상합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μmol)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 mmol), TBTU(0.25 mmol) 및 N-에틸모르폴린(0.25 mmol)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 mmol), MSNT(0.50 mmol) 및 N-메틸이미다졸(0.375 mmol)을 DCM(2 ㎖)에 용해시켜서, 고상합성용 칼럼에 넣고, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용하여 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시켜서, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(O.4 mmol)를 첨가한 후에, 고상합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 mmol)를 고상합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하여, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 mmol)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Cys(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Cys(Trt), Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하여, 고상 수지에 Gly-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 73).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상합성용 칼럼에 덜어, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하고, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 30번 위치의 Ala 및 36번 위치의 Arg가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당쇄(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 11.4 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 2.1 ㎎을 100 mM 인산완충액 pH 7.4, 400 ㎕에 녹이고, 37℃에서 1시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그대로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 30번 위치의 Ala 및 36번 위치의 Arg가 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(30, 36 Cys GLP-1-disialo)를 1.6 ㎎ 얻었다.
실시예 6 30번 위치 Cys-히알루론산 4당(HA-4) 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
합성예 1에서 얻어진 히알루론산 4당(이하, 실시예에 있어서, 올리고히알루론산을 간단히 「히알루론산」으로 부르는 경우도 있다.) 12.7 ㎎에 물 25.4 ㎕, 디메틸설폭시드(DMSO) 483 ㎕를 첨가하여 녹였다. 이 용액에 탄산수소암모늄 200 ㎎을 첨가하고 37℃에서 30시간 처리한 후, 동결건조하였다. 얻어진 동결건조품에 탄산수소나트륨 22.4 ㎎, 물 300 ㎕를 첨가하고, 사전에 17 ㎕의 N,N-디메틸포름아미드(DMF)에 용해시킨 무수 브로모초산(알드리치사제) 34.9 ㎎을 첨가하고, 빙냉하면서 1시간 반응시켰다. 1시간 후, 반응계를 실온으로 되돌리고 추가적으로 1시간 반응시킨 후, 겔 여과로 정제를 행하여, 이하에 나타내는 브로모아세틸화 히알루론산 4당(I) 11.5 ㎎을 얻었다.
Figure 112011002379669-pct00020
얻어진 브로모아세틸화 히알루론산 4당(I) 2.4 ㎎과 합성예 2에서 합성한 GLP-1의 30번 위치의 Ala가 Cys로 치환된 펩티드(서열번호 76) 1.3 ㎎을 100 mM 인산완충액 pH 7.5, 130 ㎕에 녹이고, 37℃에서 1.5시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그대로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, 30번 위치의 Ala가 히알루론산 4당 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(30 Cys GLP-1-HA-4) 1.0 ㎎을 얻었다.
실시예 7 30번 위치 Cys-히알루론산 8당(HA-8) 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
합성예 1에서 얻어진 히알루론산 8당 8.7 ㎎에 물 17.4 ㎕, 디메틸설폭시드(DMSO) 314 ㎕를 첨가하여 녹였다. 이 용액에 탄산수소암모늄 100 ㎎을 첨가하고 37℃에서 45시간 처리한 후, 동결건조하였다. 얻어진 동결건조품에 탄산수소나트륨 7.6 ㎎, 물 180 ㎕를 첨가하고, 사전에 7 ㎕의 N,N-디메틸포름아미드(DMF)에 용해시킨 무수 브로모초산(알드리치사제) 13.8 ㎎을 첨가하고, 빙냉하면서 1시간 반응시켰다. 1시간 후, 반응계를 실온으로 되돌리고 추가적으로 1시간 반응시킨 후, 겔 여과로 정제를 행하여, 이하에 나타내는 브로모아세틸화 히알루론산 8당(II) 7.3 ㎎을 얻었다.
얻어진 브로모아세틸화 히알루론산 8당(II) 2.9 ㎎과 합성예 2에서 합성한 GLP-1의 30번 위치의 Ala가 Cys로 치환된 펩티드(서열번호 76) 1.5 ㎎을 100 mM 인산완충액 pH 7.5, 150 ㎕에 녹이고, 37℃에서 1.5시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그대로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, 30번 위치의 Ala가 히알루론산 8당 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(30 Cys GLP-1-HA-8) 0.5 ㎎을 얻었다.
실시예 8 36번 위치 Cys-히알루론산 4당(HA-4) 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
합성예 1에서 얻어진 히알루론산 4당 12.7 ㎎에 물 25.4 ㎕, 디메틸설폭시드(DMSO) 483 ㎕를 첨가하여 녹였다. 이 용액에 탄산수소암모늄 200 ㎎을 첨가하고 37℃에서 30시간 처리한 후, 동결건조하였다. 얻어진 동결건조품에 탄산수소나트륨 22.4 ㎎, 물 300 ㎕를 첨가하고, 사전에 17 ㎕의 N,N-디메틸포름아미드(DMF)에 용해시킨 무수 브로모초산(알드리치사제) 34.9 ㎎을 첨가하고, 빙냉하면서 1시간 반응시켰다. 1시간 후, 반응계를 실온으로 되돌리고 추가적으로 1시간 반응시킨 후, 겔 여과로 정제를 행하여 브로모아세틸화 히알루론산 4당(I) 11.5 ㎎을 얻었다.
얻어진 브로모아세틸화 히알루론산 4당(I) 1.1 ㎎과 합성예 3에서 합성한 GLP-1의 36번 위치의 Arg가 Cys로 치환된 GLP-1 펩티드(서열번호 78) 1.5 ㎎을 100 mM 인산완충액 pH 7.5, 130 ㎕에 녹이고, 37℃에서 1.5시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그대로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, 36번 위치의 Arg가 히알루론산 4당 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(36 Cys GLP-1-HA-4) 0.9 ㎎을 얻었다.
실시예 9 36번 위치 Cys-히알루론산 8당(HA-8) 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
합성예 1에서 얻어진 히알루론산 8당 8.7 ㎎에 물 17.4 ㎕, 디메틸설폭시드(DMSO) 314 ㎕를 첨가하여 녹였다. 이 용액에 탄산수소암모늄 100 ㎎을 첨가하고 37℃에서 45시간 처리한 후, 동결건조하였다. 얻어진 동결건조품에 탄산수소나트륨 7.6 ㎎, 물 180 ㎕를 첨가하고, 사전에 7 ㎕의 N,N-디메틸포름아미드(DMF)에 용해시킨 무수 브로모초산(알드리치사제) 13.8 ㎎을 첨가하고, 빙냉하면서 1시간 반응시켰다. 1시간 후, 반응계를 실온으로 되돌리고 추가적으로 1시간 반응시킨 후, 겔 여과로 정제를 행하여 브로모아세틸화 히알루론산 8당(II) 7.3 ㎎을 얻었다.
얻어진 브로모아세틸화 히알루론산 8당(II) 2.4 ㎎과 합성예 3에서 합성한 GLP-1의 36번 위치의 Arg가 Cys로 치환된 GLP-1 펩티드(서열번호 78) 1.5 ㎎을 100 mM 인산완충액 pH 7.5, 130 ㎕에 녹이고, 37℃에서 2시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그대로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, 36번 위치의 Arg가 히알루론산 8당 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(36 Cys GLP-1-HA-8) 0.5 ㎎을 얻었다.
실시예 10 30번 위치 Cys-히알루론산 16당(HA-16) 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
합성예 1에서 얻어진 히알루론산 16당 11.6 ㎎에 물 35 ㎕, 디메틸설폭시드(DMSO) 680 ㎕를 첨가하여 녹였다. 이 용액에 탄산수소암모늄 260 ㎎을 첨가하고 37℃에서 75시간 처리한 후, 동결건조하였다. 얻어진 동결건조품에 탄산수소나트륨 5.5 ㎎, 물 230 ㎕를 첨가하고, 사전에 5.1 ㎕의 N,N-디메틸포름아미드(DMF)에 용해시킨 무수 브로모초산(알드리치사제) 10.2 ㎎을 첨가하고, 빙냉하면서 1시간 반응시켰다. 1시간 후, 반응계를 실온으로 되돌리고 추가적으로 1시간 반응시킨 후, 겔 여과로 정제를 행하여, 이하에 나타내는 브로모아세틸화 히알루론산 16당(III) 8.7 ㎎을 얻었다.
Figure 112011002379669-pct00022
브로모아세틸화 히알루론산 16당(III) 3.1 ㎎과 합성예 2에서 합성한 펩티드 사슬(서열번호 76) 1.0 ㎎을 100 mM 인산완충액 pH 7.5, 190 ㎕에 녹이고, 10 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염수용액 10 ㎕를 첨가하고, 37℃에서 8시간 반응시켰다. HPLC에서 원료의 감소가 보이지 않게 되었기 때문에, 그대로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 30번 위치의 Ala가 히알루론산 16당 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(30 Cys GLP-1-HA-16)를 0.4 ㎎ 얻었다.
실시예 11 36번 위치 Cys-히알루론산 16당(HA-16) 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
실시예 10에서 조제한 브로모아세틸화 히알루론산 16당(III) 4.9 ㎎과 합성예 3에서 합성한 36번 위치 Cys GLP-1 펩티드 사슬(서열번호 78) 1.2 ㎎을 100 mM 인산완충액 pH 7.5, 190 ㎕에 녹이고, 10 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염수용액 36 ㎕를 첨가하고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그대로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 36번 위치의 Arg가 히알루론산 16당 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(36 Cys GLP-1-HA-16)를 0.3 ㎎ 얻었다.
실시예 12 36번 위치 Cys 고만노오스형 당쇄(M5) 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
대두 파우더 100 g을, 500 ㎖의 아세톤으로 2회, 500 ㎖의 메탄올로 2회 세정하여 탈지 대두 파우더 61.4 g을 얻었다.
얻어진 탈지 대두 파우더 43.0 g에 물 430 ㎖, 액화 효소 T(HBI사제) 4.3 g을 첨가하고, 교반하면서 70℃에서 19시간 반응시켰다. 반응액을 원심분리(10000 G, 10분)하고 상청과 침전물로 나눠, 상청 800 ㎖를 얻었다. 추가적으로 침전물에 물 430 ㎖, 액화 효소 T 4.3 g을 첨가하여 재차 70℃에서 19시간 반응시키고, 반응액을 원심분리(10000 G, 10분)하고 상청과 침전물로 나눠, 상청 600 ㎖를 얻었다. 얻어진 상청을 합하여(계 1400 ㎖), 500 mM의 인산완충액 pH 7.0을 100 ㎖, 오리엔타아제 ONS(HBI사제) 3.0 g을 첨가하고, 교반하면서 50℃에서 19시간 반응을 행하였다. 반응 후의 용액을 여과하여 불용물을 제거하고, 회전 증발기(rotary evaporator)로 액량이 400 ㎖가 될 때까지 농축하였다. 얻어진 용액을 분획 분자량 1 K의 한외여과막(Minimate TFF Capsule 1 K membrane 폴사제)을 사용하여 한외여과를 행하였다.
6시간의 처리 후, 막을 투과하지 못한 용액 230 ㎖를 회수하였다. 회수한 액에 1 M 트리스-염산 완충액 pH 8.0을 20 ㎖, 아지드화나트륨 250 ㎎, 액티나아제 E(가켄제약사제) 423.5 ㎎을 첨가하고 37℃에서 82시간 반응시켰다. 반응액을 여과하고 불용물을 제거한 후, 회전 증발기로 액량이 100 ㎖가 될 때까지 농축하였다. 농축액을 절반씩 2회로 나눠 Sephadex-G25(ø25 ㎜×100 ㎜) 칼럼으로 분획하고, 당쇄 함유 분획만을 모아 농축하여 2.22 g을 얻었다.
얻어진 당쇄 함유 분획에 증류수 21.0 ㎖, 에탄올 14.9 ㎖를 첨가하여 녹이고, 탄산수소나트륨 1.13 g, Fmoc-OSu 2.02 g을 첨가하여 실온에서 16시간 반응시켰다. 반응 후 아세톤 250 ㎖를 첨가하고 침전물을 멤브레인 필터(ø47 ㎜, 보지(保持) 입자경 0.5 ㎛ 어드밴테크 도요사제)로 여과하였다. 막 상에 남은 불용물을 증류수에 녹여 회수하고, 회전 증발기로 액량이 10 ㎖ 이하가 될 때까지 농축하였다. 농축액을 Sephadex-G25(ø25 ㎜×100 ㎜) 칼럼으로 분획하고, 당쇄 함유 분획만을 모아 농축하여 1.37 g을 얻었다.
이것을 추가적으로 증류수 4 ㎖에 녹이고 ODS 칼럼(와코 겔 100C18, ø25 ㎜×150 ㎜)으로 분획하고, 당쇄 함유 분획만을 모아 농축하여, 조정제 당쇄 48.6 ㎎을 얻었다. 조정제 당쇄를 HPLC[칼럼: YMC-PackODS-AM ø20 ㎜×250 ㎜, 용리액: 아세토니트릴/25 mM 초산암모늄 완충액=82/18, 유속: 8.0 ㎖/min]로 정제하여, 하이만노오스형 Man5GlcNAc2 당쇄(M5 당쇄) 13.0 ㎎을 얻었다.
얻어진 M5 당쇄 11.0 ㎎에 물 165 ㎕를 첨가하여 녹였다. 이 용액에 탄산수소암모늄 200 ㎎을 첨가하고 실온에서 41시간 처리한 후, 동결건조하였다. 얻어진 동결건조품에 탄산수소나트륨 12.5 ㎎, 물 110 ㎕를 첨가하고, 사전에 10 ㎕의 N,N-디메틸포름아미드(DMF)에 용해시킨 무수 브로모초산(알드리치사제) 19.9 ㎎을 첨가하여, 빙냉하면서 1시간 반응시켰다. 1시간 후, 반응계를 실온으로 되돌리고 추가적으로 1시간 반응시킨 후, 겔여과로 정제를 행하여, 이하에 나타내는 브로모아세틸화 M5 당쇄(b) 7.9 ㎎을 얻었다.
Figure 112011002379669-pct00023
얻어진 브로모아세틸화 M5 당쇄(b) 4.1 ㎎과 합성예 3에서 합성한 36번 위치의 Arg가 Cys로 치환된 GLP-1 펩티드(서열번호 78) 1.2 ㎎을 100 mM 인산완충액 pH 7.5, 190 ㎕에 녹이고, 100 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염수용액 24 ㎕를 첨가하여, 37℃에서 10시간 반응시켰다. 반응 후, HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 36번 위치의 Arg가 고만노오스형 M5 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(36 Cys GLP-1-M5)를 0.3 ㎎ 얻었다.
실시예 13 26번 위치 Lys-아시알로 당쇄 Asn 링커 수식 Arg 34 GLP-1(7-37) 펩티드의 합성법
(1) 아스파라긴 결합 아시알로 당쇄 글루타르산의 합성
10 mL의 가지형 플라스크에서, 아스파라긴 결합 아시알로 당쇄(50.6 ㎎, 28.7 μmol)를 DMSO-물(4:1, v/v, 1.5 mL)에 용해시켰다. 이 용액에 0.52 M의 글루타르산-EDC 혼합(1:1, mol/mol)의 DMSO용액(100 μL, 51.7 μmol)을 첨가하고, 실온에서 1일간 교반하였다. 반응혼합물을 증류수(1.5 mL)로 희석한 후, 분자량 배제 겔 크로마토그래피(Sephadex G-25, ø1.5×45 ㎝, 증류수)로 3회 반복해서 분획하였다. 동결건조 후, 이하에 나타내는 아스파라긴 결합 아시알로 당쇄 글루타르산(c)(51.4 ㎎)을 얻었다.(MALDI TOF Mass calculated for [M+Na]+ 1891.66,found 1891.78)
Figure 112011002379669-pct00024
(2) 아스파라긴 결합 아시알로 당쇄 글루타르산 N-히드록시숙신산 이미딜 에스테르의 합성
1.5 mL의 에펜도르 튜브(Eppendorf tube)에서, 아스파라긴 결합 아시알로 당쇄 글루타르산(c)(17.2 ㎎, 9.2 μmol)의 DMSO(200 μL)용액에, 0.44 M의 N-히드록시숙신산이미드의 DMSO용액(25 μL, 11.0 μmol) 및 0.37 M의 EDC의 DMSO용액(75 μL, 27.6 μmol)을 첨가하였다. 실온에서 6시간 교반한 후, DTT(5.7 ㎎, 36.8 μmol)를 첨가하고, EDC를 불활성화하였다(Grabarek, Z., Gergely, J. Anal. Biochem. 1990, 185, 131-135). 그대로, 이하에 나타내는 아스파라긴 결합 아시알로 당쇄 글루타르산 N-히드록시숙신산 이미딜 에스테르(d)를 포함하는 이 혼합액을 당 링커 시약(0.03 M용액)으로서 펩티드와의 축합에 사용하였다.
Figure 112011002379669-pct00025
(3) 26번 위치 Lys-아시알로 당쇄 Asn 링커 수식 Arg 34 GLP-1(7-37)의 합성
1.5 mL의 에펜도르 튜브에서, 합성예 4에서 합성한 Lys26Arg34GLP-1(7-37)(서열번호 80)(2.8 ㎎, 0.83 μmol)의 DMSO(300 μL)용액에, DIPEA(4.8 μL, 27.6 μmol) 및 상기에서 조제한 0.03 M의 당 링커 시약(150 μL, 4.5 μmol)을 첨가하였다. 실온에서 2시간 교반한 후, 글리신(2 ㎎, 26.6 μmol)의 수용액(200 μL)을 첨가하여 반응을 정지하고, 그대로 HPLC[칼럼: Zorbax 300SB-CN, ø4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 1.0 ㎖/min, ;B액 10→40%(0-8 min) 40→50%(8-20 min) linear gradient]로 보지시간 15.5 min의 피크의 분획을 모아, 동결건조 후, 이하에 나타내는 26번 위치 Lys-아시알로 당쇄 Asn 링커 수식 Arg34GLP-1(7-37)(0.7 ㎎)을 얻었다.(MALDI TOF Mass calculated for [M (average)+H]+ 5236.35, found 5236.1)
Figure 112011002379669-pct00026
실시예 14 30번 위치-Cys-디시알로 당쇄 부가 엑센딘-4의 합성법
합성예 5에서 합성한 Ex-4의 30번 위치의 Gly가 Cys로 치환된 39 잔기의 펩티드 12.0 ㎎과 브로모아세틸화한 디시알로 당쇄(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 36 ㎎을 100 mM 인산나트륨완충액 pH 7.4, 5 mM 트리스카르복시에틸포스핀 1 mL 중, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그대로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8 ㎖/min, ;B액 35→50% 20 min linear gradient]로 정제하여, Ex-4의 30번 위치의 Gly가 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 Ex-4 펩티드(30 Cys Ex-4-disialo)를 10.6 ㎎ 얻었다. (M:C271H422N58O123S MALDI TOF Mass calculated for [M+H]+ 6493.63, found 6494.33)
실시예 15 26번 위치-Cys-디시알로 당쇄 부가 BIM51077의 합성법
합성예 6에서 합성한 BIM51077의 26번 위치의 Lys가 Cys로 치환된 30잔기의 펩티드(2.4 ㎎, 0.72 μmol) 및 구아니딘(216 ㎎)을 증류수(240 μL)에 용해하고, 순차 TCEP수용액(100 mM, 100 μL), 브로모아세틸화한 디시알로 당쇄(a)(10 ㎎/mL, 100 μL, 4.26 μmol) 및 500 mM의 인산나트륨완충액(pH 7.4, 100 μL)을 첨가하였다. 37℃에서 2시간 반응시켰다. 그대로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, BIM51077의 26번 위치의 Lys가 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 BIM51077 펩티드(26 Cys BIM51077-disialo)를 1.9 ㎎ 얻었다.(MALDI TOF Mass calculated for [M(average)+H]+ 5578.72, found 5578.74)
실시예 16 30번 위치-Cys-M5 당쇄 부가 엑센딘-4의 합성법
합성예 5에서 합성한 Ex-4의 30번 위치의 Gly가 Cys로 치환된 39 잔기의 펩티드 1.2 ㎎과 실시예 12에서 합성한 브로모아세틸화한 M5 당쇄(b) 3.9 ㎎을 35 mM 인산나트륨완충액 pH 7.4, 1 mM 트리스카르복시에틸포스핀 0.17 mL 중, 37℃에서 3시간 반응시켰다. 그대로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→50% 20 min linear gradient]로 정제하여, Ex-4의 30번 위치의 Gly가 고만노오스형 M5 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 Ex-4 펩티드(30 Cys Ex-4-M5)를 0.5 ㎎ 얻었다. (M:C233H362N54O97S MALDI TOF Mass calculated for [M (average)+H]+ 5504.74, found 5506.85)
이하의 표 5는, 실시예 1~16에서 얻어진 당쇄 부가 GLP-1 펩티드의 MS 스펙트럼 데이터(MALDI-TOF mass)이다.
Figure 112011002379669-pct00027
비교예 1
고상합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(100 μmol)을 넣고, DCM, DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 mmol), TBTU(0.25 mmol), N-에틸모르폴린(0.25 mmol)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하여, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 mmol)와 MSNT(0.50 mmol), N-메틸이미다졸(0.375 mmol)을 DCM(2 ㎖)에 용해시켜서, 고상합성용 칼럼에 넣고, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장을 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 NMP(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45MHCTU·HOBT/NMP(0.4 mmol)를 첨가한 후에, 고상합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9MDIPEA/NMP(0.8 mmol)를 고상합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 mmol)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하여, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 74).
DCM 및 DMF를 사용해서 세정한 후, 31 잔기의 펩티드 5 μmol 상당의 수지를 에펜도르 튜브로 옮겼다.
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상합성용 칼럼에 덜어, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하고, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC(Cadenza column C18 100×10 ㎜ 전개용매 A:0.1% TFA수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=95:5→5:95 15분 유속 3.0 ㎖/min)로 정제하여, GLP-1을 얻었다.
합성예 1 올리고히알루론산 당쇄의 합성
히알루론산(시세이도사제, 평균 분자량 120만) 500 ㎎에 pH 4의 초산완충액 100 ㎖를 첨가하고 녹을 때까지 잘 교반하였다. 히알루로니다아제(CALBIOCHEM사제, Bovine Testes 유래)를 2.5 kU 첨가하여, 37℃에서 2일간 반응시켰다. 이 용액을 농축 후, 재차 45 ㎖의 초산완충액(pH 4)에 녹이고, 히알루로니다아제(CALBIOCHEM사제, Bovine Testes 유래)를 4.5 kU 첨가하여, 37℃에서 추가적으로 2일간 반응시켰다. 반응액을 분자량 분획 3 kDa, 1 kDa 한외여과막(밀리포어사제)을 사용하여 분획하고, 동결건조하여 분자량 1~3 kDa의 히알루론산 분획 268.4 ㎎을 얻었다.
얻어진 분자량 1~3 kDa 히알루론산 분획에는 복수 종류의 올리고히알루론산이 포함되어 있기 때문에, 이것을 분리하기 위해 HPLC로 분취를 행하였다. 분자량 1~3 kDa의 올리고히알루론산 분획을 소량의 물에 용해시켜 HPLC[칼럼: Shodex Asahipak NH2P-90 20F 9 ㎛, ø20.0×300 ㎜, 이동상:180 mM NaH2P04 aq]로 수회로 나눠 정제하고, 용출 피크별로 분획하였다. 얻어진 분획을 겔여과로 탈염하고, 동결건조하여 올리고히알루론산(4당~18당)을 얻었다. 이하에 각 올리고히알루론산의 수량을 나타낸다.
올리고히알루론산 4당 22.5 ㎎(tR=10.0 min)
올리고히알루론산 6당 51.1 ㎎(tR=11.8 min)
올리고히알루론산 8당 52.7 ㎎(tR=14.0 min)
올리고히알루론산 10당 27.0 ㎎(tR=17.0 min)
올리고히알루론산 12당 9.6 ㎎(tR=21.4 min)
올리고히알루론산 14당 7.8 ㎎(tR=27.6 min)
올리고히알루론산 16당 4.1 ㎎(tR=36.0 min)
올리고히알루론산 18당 2.0 ㎎(tR=47.4 min)
합성예 2 GLP-1의 30번 위치가 Cys로 치환된 펩티드의 합성법
고상합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μmol)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 mmol), TBTU(0.25 mmol) 및 N-에틸모르폴린(0.25 mmol)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하여, HMPB-PEGA resin을 얻고, 고상합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 mmol), MSNT(0.50 mmol) 및 N-메틸이미다졸(0.375 mmol)을 DCM(2 ㎖)에 용해시켜서, 고상합성용 칼럼에 넣고, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 mmol)를 첨가한 후에, 고상합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 mmol)를 고상합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하여, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 mmol)을 사용해서 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하여, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 75).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상합성용 칼럼에 덜어, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하고, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 30번 위치의 Ala가 Cys로 치환된 31 잔기 펩티드가 얻어졌다(서열번호 76).
합성예 3 GLP-1의 36번 위치가 Cys로 치환된 펩티드의 합성법
고상합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μmol)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 mmol), TBTU(0.25 mmol) 및 N-에틸모르폴린(0.25 mmol)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하여, HMPB-PEGA resin을 얻고, 고상합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 mmol), MSNT(0.50 mmol) 및 N-메틸이미다졸(0.375 mmol)을 DCM(2 ㎖)에 용해시켜서, 고상합성용 칼럼에 넣고, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 mmol)를 첨가한 후에, 고상합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 mmol)를 고상합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하여, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 mmol)을 사용해서 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용해서, 고상 수지에 Gly-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 77).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상합성용 칼럼에 덜어, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하고, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 36번 위치의 Arg가 Cys로 치환된 31 잔기 펩티드가 얻어졌다(서열번호 78).
합성예 4 GLP-1의 34번 위치가 Arg로 치환된 펩티드의 합성법
고상합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μmol)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 mmol), TBTU(0.25 mmol) 및 N-에틸모르폴린(0.25 mmol)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하여, HMPB-PEGA resin을 얻고, 고상합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 mmol), MSNT(0.50 mmol) 및 N-메틸이미다졸(0.375 mmol)을 DCM(2 ㎖)에 용해시켜서, 고상합성용 칼럼에 넣고, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 mmol)를 첨가한 후에, 고상합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 mmol)를 고상합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하여, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 mmol)을 사용해서 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하여, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 79).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상합성용 칼럼에 덜어, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하고, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 34번 위치의 Lys가 Arg로 치환된 31 잔기 펩티드가 얻어졌다(서열번호 80).
합성예 5 엑센딘-4의 30번 위치가 Cys로 치환된 펩티드의 합성법
고상합성용 칼럼에 Rink-Amido-PEGA resin(머크사제)(100 μmol)을 DMF로 세정 후, 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산(0.5 mmol)을 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(2.5 mmol)에 용해시켜, 고상합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(2.5 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Pro, Fmoc-Pro, Fmoc-Pro, Fmoc-Ala, Fmoc-Gly, Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Pro, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fomc-Leu, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Val, Fmoc-Ala, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Met, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Gly, Fmoc-His(Trt)를 사용하여, 고상 수지에 Ser(tBu)-Pro-Pro-Pro-Ala-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Pro-Cys(Trt)-Gly-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Ile-Phe-Leu-Arg(Pbf)-Val-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-His(Trt)의 39 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 81).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상합성용 칼럼에 덜어, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하고, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, Ex-4의 30번 위치의 Gly가 Cys로 치환된 39 잔기의 펩티드가 얻어졌다.(MALDI TOF Mass calculated for [M+H]+ 4230.60, found 4231.27)(서열번호 82)
합성예 6 BIM51077의 26번 위치가 Cys로 치환된 펩티드의 합성법
고상합성용 칼럼에 Rink-Amido-PEGA resin(머크사제)(100 μmol)을 DMF로 세정 후, 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산(0.5 mmol)을 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(2.5 mmol)에 용해시켜, 고상합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(2.5 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Aminoisobutyric Acid(Aib), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Aib, Fmoc-His(Trt)를 사용하여, 고상 수지 상에 Arg(Pbf)-Aib-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Aib-His(Trt)의 30 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 83).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상합성용 칼럼에 덜어, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하고, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18,5 ㎛), ø20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA수, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, BIM51077의 26번 위치의 Lys가 Cys로 치환된 30 잔기의 펩티드 12 ㎎이 얻어졌다.(MALDI TOF Mass calculated for [M(average)+H]+ 3315.69, found 3314.72)(서열번호 84)
이상의 각 실시예에 있어서 제조된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는, 이하의 GLP-1의 서열:
His7-Ala8-Glu9-Gly10-Thr11-Phe12-Thr13-Ser14-Asp15-Val16-Ser17-Ser18-Tyr19-Leu20-Glu21-Gly22-Gln23-Ala24-Ala25-Lys26-Glu27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp31-Leu32-Val33-Lys34-Gly35-Arg36-Gly37(서열번호 2)에 있어서:
(b1) 26번 위치의 Lys 및 34번 위치의 Lys가 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 1)(서열번호 54);
(b2) 18번 위치의 Ser 및 36번 위치의 Arg가 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 2)(서열번호 55);
(b3) 22번 위치의 Gly 및 30번 위치의 Ala가 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 3)(서열번호 56);
(b4) 22번 위치의 Gly 및 36번 위치의 Arg가 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 4)(서열번호 57);
(b5) 30번 위치의 Ala 및 36번 위치의 Arg가 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 5)(서열번호 58);
(b6) 30번 위치의 Ala가 히알루론산 4당(HA-4) 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 6)(서열번호 59);
(b7) 30번 위치의 Ala가 히알루론산 8당(HA-8) 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 7)(서열번호 60);
(b8) 36번 위치의 Arg가 히알루론산 4당(HA-4) 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 8)(서열번호 61);
(b9) 36번 위치의 Arg가 히알루론산 8당(HA-8) 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 9)(서열번호 62);
(b10) 30번 위치의 Ala가 히알루론산 16당(HA-16) 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 10)(서열번호 63);
(b11) 36번 위치의 Arg가 히알루론산 16당(HA-16) 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 11)(서열번호 64);
(b12) 36번 위치의 Arg가 고만노오스형 당쇄(M5) 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 12)(서열번호 65);
(b13) 26번 위치의 Lys에, 링커를 매개로 아시알로 당쇄 부가 Asn이 결합한 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 13)(서열번호 66);이다.
또한,
(b14) 이하의 엑센딘-4의 서열:
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2(서열번호 50)에 있어서:
30번 위치의 Gly가 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 14)(서열번호 67)이다.
또한,
(b15) 이하의 BIM51077의 서열:
His-R2-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-R2-Arg-NH2[식 중, R2는 α-메틸알라닌을 나타낸다.](서열번호 52)에 있어서:
26번 위치의 Lys가 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 15)(서열번호 68)이다.
또한,
(b16) 상기 엑센딘-4의 서열(서열번호 50)에 있어서, 30번 위치의 Gly가 고만노오스형 당쇄(M5) 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드(실시예 16)이다.
실시예 1~15 중 몇 가지의 예에 대해서 이하의 시험예 1 및/또는 2를 행하였다.
시험예 1 (디펩티딜펩티다아제 IV(DPP-IV)에 대한 내성 시험)
0.5 ㎖의 에펜도르 튜브 중에 실시예에서 제조한 당쇄 부가 GLP-1 펩티드 또는 비교예 1에서 제조한 GLP-1을 17.7 nmol과 DPP-IV(Dipeptidyl Peptidase IV from porcine kidney, SIGMA사제) 2.2 mU를 첨가하고, 각각 100 mM 인산나트륨완충액 전량으로 100 μL가 되도록 조제하여, 37℃에서 반응시켰다. 반응액 10 μL를, 사전에 별도의 에펜도르 튜브에 준비한 10% 트리플루오로초산 15 μL와 혼화시키고, HPLC에 20 μL 인젝션하여, 원료의 소실을 모니터하였다(HPLC 조건: 칼럼: SHISEIDO CAPCELPAK C18 UG120, ø4.6×250 ㎜, 전개용매 A:0.1% TFA수용액 B:0.09% TFA 아세토니트릴/물=90/10, 그라디언트 A/B=65/30→30/60 20분 유속 0.7 ㎖/min). DPP-IV에 대한 내성의 지표가 되는 반감기(t1/2)를, 당쇄가 부가되어 있지 않은 비교예 1의 GLP-1의 반감기(t1/2)를 기준(=1)으로 하여, 각 실시예의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드에 대해서 평가한 값의 대표적인 것을 표 6에 나타낸다.
Figure 112011002379669-pct00028
각 실시예의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드는, 비교예 1의 GLP-1의 2.1배~128배의 DPP-IV 내성을 나타내었다.
시험예 2 경구 내당능 시험(OGTT: Oral Glucose Tolerance Test)
실시예에서 제조한 당쇄 부가 GLP-1 펩티드 또는 비교예 1에서 제조한 GLP-1의 PBS용액을, 하룻밤 절식시킨 C57BL/6JJcl 마우스(10주령, 수컷)에 10 ㎖/㎏의 투여량으로 복강 내에 투여하였다. 30분 후에 글루코오스용액을 1 ㎎/g의 투여량으로 경구투여하였다. 글루코오스 투여 전, 글루코오스 투여 30분 후, 60분 후, 120분 후에 안와 채혈을 행하여, 아큐체크 아비바(로슈다이어그노스틱스사)를 사용하여 혈당치를 측정하였다. 대표적인 결과를 도 1~도 4에 나타낸다. 이하의 도면 중, 예를 들면, GLP-1의 26번 위치와 34번 위치의 아미노산이 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 GLP-1 펩티드인 「26, 34 Cys GLP-1-disialo」를 필요에 따라 「C26, C34」로 기재하는 경우가 있다. 다른 당쇄 및 아미노산 부위에 관해서도 마찬가지이다.
다음으로, 18, 36 Cys GLP-1-disialo에 대해서 투여량을 1/10(0.9 nmol/㎏)로 하고, GLP-1에 대해서 투여량을 9 nmol/㎏으로 해서, OGTT를 행하여, 비교하였다. 결과를 도 5에 나타낸다.
투여량 0.9 nmol/㎏의 18, 36 Cys GLP-1-disialo의 혈당치 상승 억제작용은 투여량 9 nmol/㎏의 GLP-1과 거의 동등하였다. 18, 36 Cys GLP-1-disialo의 혈당치 상승 억제작용은 GLP-1에 비해 10배 정도 증대되어 있었다.
서열표 프리텍스트
서열번호 1은 일반식(1)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 2는 GLP-1(7-37)이다.
서열번호 3은 GLP-1(7-36)NH2이다.
서열번호 4는 (a1)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 5는 (a2)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 6은 (a3)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 7은 (a4)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 8은 (a5)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 9는 (a6)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 10은 (a7)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 11은 (a8)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 12는 (a9)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 13은 (a10)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 14는 (a11)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 15는 (a12)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 16은 (a13)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 17은 (a14)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 18은 (a15)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 19는 (a16)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 20은 (a17)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 21은 (a18)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 22는 (a19)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 23은 (a20)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 24는 (a21)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 25는 (a22)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 26은 (a23)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 27은 (a24)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 28은 (a25)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 29는 (a26)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 30은 (a27)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 31은 (a28)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 32는 (a29)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 33은 (a30)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 34는 (a31)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 35는 (a32)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 36은 (a33)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 37은 (a34)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 38은 (a35)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 39는 (a36)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 40은 (a37)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 41은 (a38)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 42는 (a39)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 43은 (a40)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 44는 (a41)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 45는 (a42)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 46은 (a43)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 47은 (a44)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 48은 (a45)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 49는 (a46)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 50은 엑센딘-4이다.
서열번호 51은 일반식(2)로 표시되는 당쇄 부가 엑센딘-4이다.
서열번호 52는 BIM51077이다.
서열번호 53은 일반식(3)으로 표시되는 당쇄 부가 BIM51077이다.
서열번호 54는 (b1)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 55는 (b2)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 56은 (b3)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 57은 (b4)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 58은 (b5)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 59는 (b6)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 60은 (b7)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 61은 (b8)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 62는 (b9)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 63은 (b10)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 64는 (b11)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 65는 (b12)로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 66은 (b13)으로 표시되는 당쇄 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 67은 (b14)으로 표시되는 당쇄 부가 엑센딘-4이다.
서열번호 68은 (b15)으로 표시되는 당쇄 부가 BIM51077이다.
서열번호 69는 실시예 1에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 70은 실시예 2에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 71은 실시예 3에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 72는 실시예 4에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 73은 실시예 5에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 74는 비교예 1에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 75는 합성예 2에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 76은 합성예 2에 있어서 합성된 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 77은 합성예 3에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 78은 합성예 3에 있어서 합성된 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 79는 합성예 4에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 80은 합성예 4에 있어서 합성된 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 81은 합성예 5에 있어서 합성된 보호기를 갖는 39 잔기 펩티드이다.
서열번호 82는 합성예 5에 있어서 합성된 39 잔기 펩티드이다.
서열번호 83은 합성예 6에 있어서 합성된 보호기를 갖는 30 잔기 펩티드이다.
서열번호 84는 합성예 6에 있어서 합성된 30 잔기 펩티드이다.
본 발명은 GLP-1과 비교하여, 혈중 안정성이 증대되고, 바람직하게는 혈당치 억제활성이 증대된, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 제공한다. 본 발명은, 특히 의약품의 분야에 있어서 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> Otsuka Chemical Co., Ltd. <120> glycosylated GLP-1 peptide <130> OCKP0806P1F <150> JP2008-157583 <151> 2008-06-17 <150> JP2008-326609 <151> 2008-12-22 <160> 84 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> glycosylated GLP-1 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa18: Ser, glycosylated Cys or glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa19: Tyr, glycosylated Cys or glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa22: Gly, glycosylated Cys or glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa26: Lys, glycosylated Cys or glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa30: Ala, glycosylated Cys or glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa34: Lys, glycosylated Cys or glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa36: Arg, glycosylated Cys or glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa37: Gly, -NH2, Gly-glycosylated Cys or Gly-glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> When Xaa18 is Ser, Xaa19 is Tyr, Xaa22 is Gly, Xaa26 is Lys, Xaa30 is Ala, Xaa34 is Lys and Xaa36 is Arg, Xaa37 is Gly-glycosylated Cys or Gly-glycosylated Asn. <400> 1 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Xaa Xaa Leu Glu Xaa 1 5 10 15 Gln Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Xaa Trp Leu Val Xaa Gly Xaa Xaa 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> human <220> <223> GLP-1(7-37)OH <400> 2 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> GLP-1(7-36)NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 3 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a1) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <400> 4 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 5 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a2) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <400> 5 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 6 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a3) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <400> 6 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 7 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a4) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> <400> 7 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a5) <220> <221> CARBOHYD <222> (28)..(28) <223> <400> 8 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a6) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <400> 9 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 10 <211> 32 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a7) <220> <221> CARBOHYD <222> (32)..(32) <223> <400> 10 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Cys 20 25 30 <210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a8) <220> <221> CARBOHYD <222> (13)..(13) <223> <400> 11 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Cys Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a9) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <400> 12 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Asn Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 13 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a11) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <400> 13 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asn 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 14 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a11) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <400> 14 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Asn Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 15 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a12) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> <400> 15 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Asn Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 16 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a13) <220> <221> CARBOHYD <222> (28)..(28) <223> <400> 16 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Asn Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 17 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a14) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <400> 17 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Asn Gly 20 25 30 <210> 18 <211> 32 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a15) <220> <221> CARBOHYD <222> (32)..(32) <223> <400> 18 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Asn 20 25 30 <210> 19 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a16) <220> <221> CARBOHYD <222> (13)..(13) <223> <400> 19 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Asn Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 20 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a17) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 20 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 21 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a18) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 21 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 22 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a19) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 22 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 23 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a20) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 23 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 24 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a21) <220> <221> CARBOHYD <222> (28)..(28) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 24 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg 20 25 30 <210> 25 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a22) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 25 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys 20 25 30 <210> 26 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a23) <220> <221> CARBOHYD <222> (13)..(13) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 26 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Cys Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 27 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a24) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 27 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Asn Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 28 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a25) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 28 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asn 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 29 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a26) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 29 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Asn Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 30 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a27) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 30 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Asn Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 31 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a28) <220> <221> CARBOHYD <222> (28)..(28) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 31 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Asn Gly Arg 20 25 30 <210> 32 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a29) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 32 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Asn 20 25 30 <210> 33 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a30) <220> <221> CARBOHYD <222> (13)..(13) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 33 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Asn Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 34 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a31) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <400> 34 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 35 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a32) <220> <221> CARBOHYD <222> (28)..(28) <223> <400> 35 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 36 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a33) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <400> 36 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 37 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a34) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> <400> 37 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 38 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a35) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <400> 38 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 39 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a36) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (28)..(28) <223> <400> 39 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 40 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a37) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <400> 40 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 41 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a38) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <400> 41 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Asn Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Asn Gly 20 25 30 <210> 42 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a39) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> <400> 42 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asn 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Asn Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 43 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a40) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <400> 43 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asn 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Asn Gly 20 25 30 <210> 44 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a41) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (28)..(28) <223> <400> 44 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Asn Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Asn Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 45 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a42) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <400> 45 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Asn Trp Leu Val Lys Gly Asn Gly 20 25 30 <210> 46 <211> 32 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a43) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (32)..(32) <223> <400> 46 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Cys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Cys 20 25 30 <210> 47 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a44) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <400> 47 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Cys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 48 <211> 32 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a45) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (32)..(32) <223> <400> 48 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Asn Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Asn Gly Asn 20 25 30 <210> 49 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a46) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 49 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Asn Tyr Leu Glu Asn 1 5 10 15 Gln Ala Ala Asn Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 50 <211> 39 <212> PRT <213> Heloderma <220> <223> Exendin-4 <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 50 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 51 <211> 39 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> glycosylated Exendin-4 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa12: Lys, glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa14: Met, glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa16: Glu, glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa20: Arg, glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa24: Glu, glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa28: Asn, glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa30: Gly, glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <220> <223> At least one of Xaa12, Xaa14, Xaa16, Xaa20, Xaa24, Xaa28 and Xaa30 is glycosylated Cys or glycosylated Asn. <400> 51 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Xaa Gln Xaa Glu Xaa 1 5 10 15 Glu Ala Val Xaa Leu Phe Ile Xaa Trp Leu Lys Xaa Gly Xaa Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 52 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> BIM51077 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa8: Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa35: Aib <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 52 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30 <210> 53 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> glycosylated BIM51077 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa8: Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa18: Ser, glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa20: Leu, glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa22: Gly, glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa26: Lys, glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa30: Ala, glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa34: Lys, glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa35: Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa36: Arg, glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <220> <223> At least one of Xaa18, Xaa20, Xaa22, Xaa26, Xaa30, Xaa34 and Xaa36 is glycosylated Cys or glycosylated Asn. <400> 53 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Xaa Tyr Xaa Glu Xaa 1 5 10 15 Gln Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Xaa Trp Leu Val Xaa Xaa Xaa 20 25 30 <210> 54 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b1) (Example 1) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (28)..(28) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <400> 54 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 55 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b2) (Example 2) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <400> 55 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 56 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b3) (Example 3) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <400> 56 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 57 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b4) (Example 4) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <400> 57 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 58 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b5) (Example 5) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <400> 58 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 59 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b6) (Example 6) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> Cys glycosylated by hyaluronan tetra saccharides <400> 59 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 60 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b7) (Example 7) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> Cys glycosylated by hyaluronan octa saccharides <400> 60 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 61 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b8) (Example 8) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> Cys glycosylated by hyaluronan tetra saccharides <400> 61 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 62 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b9) (Example 9) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> Cys glycosylated by hyaluronan octa saccharides <400> 62 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 63 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b10) (Example 10) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> Cys glycosylated by hyaluronan hexa-deca saccharides <400> 63 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 64 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b11) (Example 11) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> Cys glycosylated by hyaluronan hexa-deca saccharides <400> 64 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 65 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b12) (Example 12) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> Cys glycosylated by high mannose-type heptaoligosaccharide <400> 65 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 66 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b13) (Example 13) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> Lys glycosylated by asialo oligosaccharide <400> 66 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 67 <211> 39 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b14) (Example 14) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 67 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Cys Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 68 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b15) (Example 15) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Aib <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 68 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30 <210> 69 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 1) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 69 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 70 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 2) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Cys having blocking group Trt <400> 70 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 71 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 3) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 71 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 72 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 4) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Cys having blocking group Trt <400> 72 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 73 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 5) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Cys having blocking group Trt <400> 73 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 74 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Comparative Example 1) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 74 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 75 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Synthetic Example 2) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 75 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 76 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence (Synthetic Example 2) <400> 76 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 77 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Synthetic Example 3) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Cys having blocking group Trt <400> 77 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 78 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence (Synthetic Example 3) <400> 78 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 79 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Synthetic Example 4) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Arg having blocking group Pbf <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 79 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 80 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence (Synthetic Example 4) <400> 80 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 81 <211> 39 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Synthetic Example 5) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Arg having blocking group Pbf <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc 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Gly Cys Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 83 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Synthetic Example 6) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa8: Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa35: Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 83 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30 <210> 84 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence (Synthetic Example 6) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa8: Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa35: Aib <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 84 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30

Claims (40)

  1. 서열번호 2로 나타내는 GLP-1(7-37) 또는 서열번호 3으로 나타내는 GLP-1(7-36)NH2에 있어서, 18, 22, 26, 30, 34 및 36번 위치로부터 선택되는 2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드로서,
    상기 당쇄가 모두 독립적으로
    Figure 112015111860535-pct00038

    [식 중, R1 및 R2는 동일 또는 상이하고,
    Figure 112015111860535-pct00039

    를 나타낸다. Ac는 아세틸기를 나타낸다.]
    으로 표시되는 당쇄이고,
    당쇄 부가 아미노산은 당쇄 부가 Cys인,
    당쇄 부가 GLP-1 펩티드.
  2. 제1항의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당쇄 부가 아미노산에 있어서, 당쇄와 아미노산이 링커를 매개로 하지 않고 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드.
  3. 제1항의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당쇄에 있어서 당쇄를 구성하는 각 당의 종류, 결합순서, 및 당간 결합양식이 90% 이상 균일한, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드.
  4. 제1항의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드로서, GLP-1과 비교하여 증대된 혈중 안정성을 갖는, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드.
  5. 제1항의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드로서, GLP-1과 비교하여 10배 이상의 OGTT(Oral Glucose Tolerance Test)에 있어서의 혈당치 억제활성을 갖는, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드.
  6. 제1항의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드로서, GLP-1과 비교하여 30배 이상의 DPP-IV 내성을 갖는, 당쇄 부가 GLP-1 펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 당쇄 부가 GLP-1 펩티드를 유효성분으로서 포함하는 의약조성물로서, 당뇨병, 비만, 및 과민성장증후군으로부터 선택되는 질환의 치료 또는 예방을 위한 의약조성물.
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