WO2007016861A1

WO2007016861A1 - Procédé enzymatique en deux étapes pour préparer un acide 7-aminocéphalosporanique

Info

Publication number: WO2007016861A1
Application number: PCT/CN2006/001940
Authority: WO
Inventors: Jun Wang; Waikei Tsang; Hongkin Yap; Junmin Chen; Yaulung Siu; Supyin Tsang
Original assignee: Bioright Worldwide Company Limited
Priority date: 2005-08-08
Filing date: 2006-08-02
Publication date: 2007-02-15
Also published as: CN1912130A; EP1925663A4; EP1925663A1; US20100112633A1; CN1912130B; US8003358B2

Description

一种用于制备 7-氨基头孢霉垸酸的两步酶法技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体而言涉及一种用于制备 7-氨基头孢霉烷酸 ( 7-aminocephalosporanic acid ) 的两步酶法。背景技术

半合成头孢菌素母核 7-氨基头孢霉烷酸可由化学法从头孢菌素 C ( cephalosporin C ) 制备而得。但是化学法需使用大量有毒制剂，污染环境，而且产率低、成本高。应用酶法制备精细化学品为近年来的新兴工艺，它避免使用有毒制剂，并且产率较高。酶法制备 7-氨基头孢霉烷酸包括两个步骤（见图 1 ) ： ( 1 ) D-氨基酸氧化酶氧化头孢菌素 C 生成戊二酰 - 7- 氨基头孢霉垸酸 ( glutaryl-7-aminocephalosporanic acid ) ； ( 2 ) 戊二酰 -7 -氨基头孢霉烷酸酰化酶水解戊二酰- 7-氨基头孢霉烷酸产生 7-氨基头孢霉烷酸。

目前限制大规模酶法制备 7-氨基头孢霉烷酸的因素之一为 D-氨基酸氧化酶和戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸酰化酶的产率低、成本高。目前报导的 D-氨基酸氧化酶表达水平较低（Pol l egioni, L. et al . , 1997, J. Biotechnol. 58， 115-123 : 800酶单位每升发酵液； Molla， G. et al . , 1998， Protein Exp. Purif. 14, 289-294 : 2， 300酶单位每升发酵液）。目前报导的戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸酰化酶表达 7j平也低 ( Ishiye, M.和 Niwa， M.， 1992, Biochim. Biophys. Acta 1132, 233-239 : 129 酶单位每升发酵液；杨蕴刘等， 2001，中国专利申请公开号 CN 1301813A : 253 酶单位每升发酵液；许岗和朱敏， 2003, 中国专利申请公开号 CN 1428424A : 2， 500酶单位每升发酵液）。因此，低成本、大量制备该两个酶是工业化生产 7-氨基头孢霉烷酸之关键。

目前限制大规模酶法制备 7-氨基头孢霉烷酸的另一因素在于现有的操作工艺复杂，成本较高。例如，目前工业界使用的 Roche Diagnostics 公司所生产的有关产品及其工艺（ CC2 Twin Enzyme Process: D-A0D, 产品号： 1462865； Gl- Ac，产品号： 1464213, Roche Diagnostics ) 操作步骤较复杂（见图 1 ) ；除上述的氧化酶和酰化酶夕卜，尚需下列额外步骤：（1 ) 由于 Roche Diagnostics公司之 D-氨基酸氧化酶不纯，故在氧化反应结束后，仍有较大量 α -酮己二酸单酰 -7- 氨基头孢霉垸酸（ a - ketoadipyl- 7- ACA) 不能转成戊二酰- 7-氨基头孢霉烷酸，因此需外加过氧化氢将之转化成戊二酰 -7-氨基头抱霉烷酸；（2 ) 但由于过氧化氢一方面会使酶活性丧失，另方面会氧化头孢菌素 C和戊二酰- 7-氨基头孢霉烷酸，令最终 7-氨基头孢霉垸酸的产率降低，所以需再外加过氧化氢酶去降解残留之过氧化氢。

此外，中国专利申请公开号为 CN1104255 的专利文献也公开了一种制备 7-氨基头孢霉垸酸的方法，在该现有技术的方法中，因使用了含氨苄青霉素抗性基因的表达载体，其发酵产物含 β -内酰胺酶，会大大降低 7-氨基头孢霉烷酸的产率，因此还需在制备 7-氨基头孢霉烷酸的过程中添加 β -内酰胺酶抑制剂；并且，其所使用的细胞体系还产生能分解过氧化氢的过氧化氢酶，因此在制备过程中不仅要加入过氧化氢还要加入过氧化氢酶抑制剂。这些使得其操作步骤较复杂、成本较高。发明内容

本发明的目的在于提供一种步骤简单、成本低、产率高的用于制备 7-氨基头孢霉烷酸的两步酶法。

为实现上述目的，本发明的技术方案提供了一种从头孢菌素 C制备 7-氨基头孢霉烷酸的方法，包括用 D-氨基酸氧化酶催化头孢菌素 C 至戊二酰- 7-氨基头孢霉烷酸的第一步反应和用戊二酰 -7-氨基头孢霉垸酸酰化酶催化戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸至 7-氨基头孢霉烷酸的第二步反应，其特征在于，所述 D-氨基酸氧化酶为经纯化的、具有序列号 2所示氨基酸序列的三角酵母（Trigonopsis variabilis ) D-氨基酸氧化酶突变体。

在上述技术方案中，优选的是，在所述第一步反应中不添加过氧化氢，进一步优选的是，所述 D-氨棊酸氧化酶是由具有序列号 3 所示 DNA序列的表达载体 pHS- GHA表达的， D-氨基酸氧化酶的纯化步骤包括依次通过 DEAE-纤维素离子交换树脂纯化以及通过硫酸铵沉淀纯化。更优选的是，在所述第一步反应和第二步反应中，不添加选自抗坏血酸、 3-氨基- 1， 2， 3-***、过硼酸钠和叠氮化钠的 β -内酰胺酶抑制剂，在所述第一步反应中不添加选自舒巴坦钠、棒酸、硼酸及其衍生物的过氧化氢酶抑制剂，在所述第二步反应中不添加过氧化氢酶。

优选的是，所述 D-氨基酸氧化酶是固相化的，或所述戊二酰- 7- 氨基头孢霉烷酸酰化酶是固相化的，或者 D-氨基酸氧化酶和戊二酰 - 7 -氨基头孢霉烷酸酰化酶都是固相化的。

更优选的是，所述戊二酰- 7-氨基头孢霉烷酸酰化酶为假单孢菌 ( Pseudomonas sp. ) SE83 戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸酰化酶，所述假单孢菌 SE83 戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸酰化酶是由具有序列号 4 所示 DNA序列的表达载体 pT7- kan- ACY表达的

本发明的优点在于：（1 ) 本发明方法中的经纯化的、具有序列号 2所示氨基酸序列的三角酵母 ( Trigonopsis variabi lis ) D-氨基酸氧化酶突变体，其比活比亲本 D-氨基酸氧化酶高 105%; ( 2 )本发明方法中的大肠杆菌载体 pHS- GHA和 pT7- kan- ACY，其发酵产物中不含有 β -内酰胺酶，因而不需外加 β -内酰胺酶抑制剂，减低了生产成本和简化了工序；（3 ) 本发明方法中的！) -氨基酸氧化酶几乎不含过氧化氢酶，因此不需外加过氧化氢酶抑制剂，并且在反应过程中 α - 酮己二酸单酰 -7-氨基头孢霉烷酸的生成量很低，因而不需外加过氧化氢和过氧化氢酶，减低了生产成本和简化了工序；（4) 使用本发明的两步固相酶法转化头抱菌素 C至 7-氨基头孢霉烷酸，克分子转化率可达 93%以上，较 Roche Diagnostics公司之产品（克分子转化率为 82%)髙约 12%。

附图说明

图 1为现行头孢菌素 C转化成 7-氨基头孢霉烷酸的反应流程。图 2为表达载体 pHS- GHA。

图 3为表达载体 pT7- kan- ACY。

图 4为表达载体 pRSET- lac- GI- hok/sok- kan。

图 5为 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA的 SDS- PAGE电泳图。其中， 1 代表：蛋白质分子量标记（BenchMark™ Pre-Stained Protein Ladder (Invitrogen) ) ，单位是 KDa; 2代表：粗纯 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA; 3代表：纯化的 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA。

图 6为 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA转化头孢菌素 C至戊二酰- 7- 氨基头孢霉烷酸的 HPLC图谱。

图 7 为假单孢菌 SE83 戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸酰化酶的 SDS- PAGE电泳图。其中， 1代表：蛋白质分子量标记（BenchMark™ Pre-Stained Protein Ladder (Invitrogen) ) ，单位是 KDa; 2代表：粗纯假单孢菌 SE83戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸酰化酶。

图 8为假单孢菌 SE83戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸酰化酶转化戊二酰- 7-氨基头孢霉烷酸至 7-氨基头孢霉烷酸的 HPLC图谱。

图 9为两步固相酶转化头孢菌素 C至 7-氨基头抱霉烷酸的 HPLC 图谱。具体实施方式

实施例 1 : 表达载体 pRSET- kan的构建

根据 pRSET-A (可购自 Invitrogen) 的序列设计 PCR引物，具体为：

上游弓 I物 VET- F: 5， - CTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAG - 3，；下游弓 I物 VET- R: 5， - ACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3， ₀

根据 pET28b (可购自 Novagen) 的序列设计 PCR引物，具体为上游引物 KAN - F: 5， - ATGAGCCATATTCAACGGGAAAC- 3，；

下游引物 KAN- R: 5， -TTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG-3 ' 。

扩增去除氨苄青霉素抗性基因的 pRSET- A片段的 PCR条件为： 50 ng pRSET-A ( Invitrogen) ， 0. 4 μΜ VET-F, 0. 4 μΜ VET-R, 50 μΜ dATP, 50 μΜ dTTP, 50 μΜ dCTP, 50 μΜ dGTP, 20 mM Tris-HCl ( pH 8. 8 ) , 10 mM KC1 , 10 mM (NH₄) ₂S0₄, 2 mM MgS0₄， 0. 1% Triton X— 100， 2.5U Pfu DNA 聚合酶（Promega) ，用无菌水调反应体积至 50 μί。

PCR扩增反应程序为： 94°C， 5分钟； 94°C， 1分钟， 5Q°C， 1分钟， 72°C, 4分钟，循环 35次； 72° C， 10分钟。

扩增卡那霉素抗性基因的 PCR条件为： 50 ng pET28b(Novagen)， 0.4 μΜ KAN-F, 0.4 μΜ KAN-R, 50 μΜ dATP, 50 μΜ dTTP, 50 μΜ dCTP, 50 μΜάθΤΡ, 20 mM Tris~HCl (pH8.8) ， 10mMKCl， 10 mM (NH₄) ₂S0₄， 2 mM MgS0₄, 0.1% Triton X- 100， 2.5 U Pfu DNA聚合酶 (Promega) , 用无菌水调反应体积至 50 L。 PCR扩增反应程序为： 94° C， 5分钟； 94° C, 1分钟， 50° (， 1分钟， 72° C， 4分钟，循环 35次； 72° C， 10 分钟。

用 0.8%琼脂糖电泳提纯 PCR产物（去除氨苄青霉素抗性基因的 pRSET- A片段的 PCR产物长 2， 036 bp; 卡那霉素抗性基因的 PCR产物长 816 bp) ，连接该两片段得 pRSET- kan。将 pRSET- kan转化感受态大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS (Novagen) ，在卡那霉素（50 g/mL) LB

(1%氯化钠， 1%蛋白胨， 0.5%酵母浸膏）平板上于 37°C培养过夜。按照 Molecular Cloning- A .Laboratory Manual ( Sambrook, J. et al.， 1989， CSHL Press) 描述的方法提取质粒。实施例 2: 载体 pRSET-lac- kan的构建

根据 pGEMT- Easy (Promega)的序列设计 PCR引物，具体为：上游引物 RBS- Ndel: 5， - CATATGTATATCTCCTTCTTGTGTGAAATTG-3，

(Ndel 酶切位点以下划线表示，外加的核蛋白体结合位点以下间虚线表示）；

下游引物 RBS- Al wNI： 5 ' -CAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTC-3，

(AlwNI酶切位点以下划线表示）。

以 pGEMT- Easy (Promega)为模板，用上述引物进行 PCR，扩增得到一 755bp 产物。 PCR 条件为： 50 ng pGEMT- Easy (Promega)， 0.4 μΜ RBS- Ndel, 0.4 μΜ RBS-AlwNI, 50 μΜ dATP, 50 μΜ dTTP, 50 μΜ dCTP, 50 μΜ dGTP, 20 mM Tris- HC1 (pH 8.8)， 10 mM KC1, 10 mM (腿 ₄)₂S0₄， 2 mM MgS0₄， 0.1% Triton X - 100， 2.5 U Pfu DNA聚合酶（Promega)，用无菌水调反应体积至 50 μΙ_α PCR扩增反应程序为： 94°C， 5分钟； 94°C, 1分钟， 50 ， 1分钟， 72°C， 4分钟，循环 35次； Ί2Χ, 10分钟。该 PCR产物（755bp)在 5' 端含有 Ndel酶切位点和核蛋白体结合位点及在 3' 端含有 AlwNI酶切位点。用 0.8%琼脂糖电泳提纯， Ndel和 AlwNI酶切后，与经 Ndel和 AlwNI酶切的 pRSETA(Invitrogen)连接，得 pRSET- lac 。将 pRSET-lac 转化感受态大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS(Novagen), 在氨苄青霉素（100 g/mL) LB (1%氯化钠， 1°/。蛋白胨， 0.5%酵母浸膏）平板上于 37°C 培养过夜。按照 Molecular Cloning - A Laboratory Manual (Sambrook, J. et al.， 1989， CSHL Press)描述的方法提取质粒。

用 AlwNI和 EcoRI酶切 pRSET- lac和 pRSET- kan，用 0.8%琼脂糖电泳提纯各 DNA片段并连接，得 pRSET- lac- kan。将 pRSET- lac- kan转化感受态大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS(Novagen)，在卡那霉素（50 g/mL) LB 琼脂平板上于 37°C培养过夜。按照 Molecular Cloning- A Laboratory Manual (Sambrook, J. et al.， 1989, CSHL Press)描述的方法提取质粒。实施例 3: 载体 pGEMT- Easy- GI的构建

根据已知的 Thermoanaerobac terium sa c charoly ticum glucose isomerase DNA序列（GenBank L09699) , 设计 PGR引物，具体为：上游引物（GI- Ndel):

5， -CATATGAATAAATATTTTGAGAACGTATCTAAAATA-3 ,

(Ndel酶切位点以下划线表示）；

下游引物（GI- EcoRI)： 5， - GATATCTTAAGGCGCGCCTTATTCTGCAAAC- 3，

(EcoRI酶切位点以下划线表示， Ascl酶切位点以双下划线表示）。

以 Thermoanaerobac terium saccharoly ticum (贝勾自 ATCC， USA) DNA为模板，用上述引物进行 PCR，扩增得到一 1, 336bp产物。 PCR条件为： 50 ng T. saccharolyticumM , 0.4 μΜ GI— Ndel, 0.4 μΜ GI - EcoRI, 50 μΜ dATP, 50 μΜ dTTP, 50 μΜ dCTP, 50 μΜ dGTP, 20 mM Tris- HC1 (pH8.8)， lOmMKCl, 10 mM (NH₄) ₂S0₄， 2mMMgS0₄, 0.1% Triton X-100, 2.5 U Platinum Taq High Fidelity DNA 聚合酶（Invitrogen)，用无菌水调反应体积至 50 PCR扩增反应程序为： 95°C， 5分钟； 94°C， 1分钟， 50°C, 1分钟， 72°C, 3分钟，循环 35次； 72°C, 10分钟。该 PCR产物（l，336bp)在 5' 和 3' 端分别含有 Ndel和 EcoRI酶切位点。 PCR 产物经 0.8%琼脂糖电泳提纯，利用 TA 克隆方法，与 pGEMT-Easy(Promega)连接，得 pGEMT- Easy- GI。将 pGEMT- Easy- GI转化感受态大肠杆菌 DH5a (Invitrogen) , 在氨苄青霉素（100 ^g/ml) LB 琼脂平板上于 37°C培养过夜。按照 Molecular Cloning- A Laboratory Manual (Sambrook, J. et al.， 1989, CSHL Press)描述的方法提取质粒。实施例 4: 载体 pRSET- lac- GI- hok/sok- kan (见图 4) 的构建

用 Ndel和 EcoRI酶切 pGEMT- Easy- GI，经 0.8%琼脂糖电泳提纯，与经 Ndel和 EcoRI酶切的 pRSET- lac- kan连接，得 pRSET- lac- GI- kan。将 pRSET- lac- GI- kan转化感受态大肠杆菌 BL21 (DE3) pLysS (Novagen)，在卡那霉素（50 g/mL) LB琼脂平板上于 37°C培养过夜。按照 Molecular Cloning - A Laboratory Manual (Sambrook, J. et al.， 1989， CSHL Press)描述的方法提取质粒。

根据已知 hok/sok基因片段序列（GenBank X05813)设计 10条引物 (见表 1)。 PCR 基因构造根据 Kikuchi, M. et al. , 1999, Gene 236:159- 167所述，唯具体步骤有变更。 PCR条件为： 20 ng各个引物， 50 Μ dATP, 50 μΜ dTTP, 50 瘦 dCTP， 50 Μ dGTP, 20 mM Tris-HCl (pH 8.8) , lOmMKCl, lOmM (N¾)₂S0₄, 2mMMgS0₄, 0.1% Triton X-100, 2.5U Pfu DNA聚合酶（Promega), 用无菌水调反应体积至 50 μί。

PCR扩增反应程序为： 95°C， 4分钟； 94°C， 1.5 分钟， 50°C， 1.5 分钟， 72。C， 5分钟，循环 30次； 72°C， 10分钟，得一 PCR产物长 580 bp，在其 5' 和 3，端分别含有 Ascl及 EcoRI酶切位点。 PCR产物经 0.8% 琼脂糖电泳提纯， Ascl及 EcoRI酶切后，与经 Ascl及 EcoRI 酶切的 pRSET-lac-GI-kan 连接，得 pRSET- lac- GI- hok/s。k- kan 。将 pRSET- lac- GI- hok/sok- kan 转化感受态大肠杆菌 BL21 (DE3) pLysS (Novagen) , 在卡那霉素（50 g/mL) LB 琼脂平板上于 37°C 培养过夜。按照 Molecular Cloning - A Laboratory Manual (Sambrook, J. et al.， 1989, CSHL Press)描述的方法提取质粒，测定其 DNA序列如序列号 7所示。其中数个核苷酸有改动： 1368(C -〉 G); 1513 (缺失了 T); 1804 (A->T)； 1826 (C->T)； 2479 (G->T)； 2555 (T -〉 A); 3860 (C->T)。表 1

实施例 5: 含有 D-氨基酸氧化酶基因重组质粒 pRSET- A-DAO的构建根据已知三角酵母 D-氨基酸氧化酶基因 5' 和 3' 端序列 (Gonzalez, F. J. , Montes, J. , Martin, F.， Lopez, M. C.， Ferminan E.， Catalan, J. , Galan, M. A. Dominguez, A. Molecular cloning of TvDAOl, a gene encoding a D - amino acid oxidase from

Trigonopsis variabilis and its expression in Sa c ch aromyc es cerevisiae and Kluyveromyces lac t is. Yeast 13: 1399-1408;

1997) 设计引物如下：

5' - Ndel (引入 Ndel 酶切位点）：

5' -TAGGGCTGACATATGGCTAAAATCGTTGTTATTGGTGC-3-' ；

3， -Bglll (引入 Bglll酶切位点）：

5' - TAGGGCTGAAGATCTCTAAAGGTTTGGACGAGTAAGAGC - 3，。

以质粒 PJL (杨藴刘等，中国专利申请公开号： CN 1371999A) 为模板，用以上两个引物，在 PfuDNA聚合酶（Promega) 的作用下，合成三角酵母 D-氨基酸氧化酶基因。 pJL携带有三角酵母 FA10 D-氨基酸氧化酶基因 ( Li, W. et al. , Acta Microbiologica Sinica 31:251-253, 1991) ₀ PCR反应条件为： 40 ng pJL, 0.4 μΜ 5， -Ndel, 0.4 μΜ 3' -Bglll, 50 μΜ dATP, 50 μΜ dTTP, 50 Μ dCTP, 50 Μ dGTP, 20 mM Tris-HCl (pH 8.8) , 10 mM KC1, 10 mM (NH₄) ₂S0₄, 2 mM MgS0₄， 0.1% Triton X- 100， 2.5 U Pfu DNA 聚合酶，用无菌水调反应体积至 50 μΐ。 PCR扩增反应程序为： 94°C， 5分钟； 94°C， 1分钟， 50°C， 1分钟， 72°C， 2分钟，循环 10次； 94°C， 1分钟， 60°C， 1分钟， 72° C, 2分钟，循环 25次； 72°C， 10分钟。

得 1,098 bp长 PCR产物，其 5' 和 3，端分别具有 Ndel和 Bglll 限制性酶切位点。 PCR产物经 1%琼脂糖电泳提纯， Ndel及 Bglll酶切后，与经 Ndel 及 Bglll 酶切质粒 pRSET- A (Invitrogen) 得到的 2.9 Kb 的片段连接，得连接产物 pRSET- A- DA0。将 pRSET- A- DAO 转化感受态大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS (Novagen) ，在氨苄青霉素 LB平板上 37°C培养，按照 Molecular Cloning- A Laboratory Manual, ed. By J. Sambrook, et. al. , 1989， CSHL Press) 描述的方法提取质粒，经 DNA测序，确定三角酵母 D-氨基酸氧化酶基因 DNA序列如序列号 5所示，其推测出的氨基酸序列如序列号 6所示。实施例 6: 含有 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA的表达载体的构建

D-氨基酸氧化酶突变体 GHA 由定点突变构建。定点突变技术主要参考 PCR Protocols (编者： John M. S.Bartlett and David

Stirling. Totowa, N. J.： Humana Press, 2003. ) 一书的描述。

根据实施例 5克隆的三角酵母 D-氨基酸氧化酶基因之序列（序列号 5) ，设计引物如下：

引物 A: 5， -TAGGGCTGACATATGGCTAAAATCGTTGTTATTG -3，；

引物 B: 5， -TAGGGCTGAAGATCTCTAAAGGTTTGGACGAG -3，；

引物 C1: 5' -GCAGGTGCCAACTGGCTCCCGTTTTACGATGGAGGCAAG-3' ；引物 D: 5， -GAGCCAGTTGGCACCTGCCCAAGG-3 ' 。

引物 A和 B是一对外引物。引物 A包含 Ndel酶切位点，并有部份碱基与 D-氨基酸氧化酶基因 5' 端序列交迭；引物 B包含 Bglll 酶切位点，并有部份碱基与 D-氨基酸氧化酶基因 3' 端序列交迭。引物 C1和 D是内引物。引物 C1将亲本 D-氨基酸氧化酶基因 53位之苏氨酸转变成脯氨酸。引物 D部分碱基与引物 C1的序列交迭。

利用聚合酶链式反应，以 pRSET- A- DA0 为模板，用引物对 A和 D扩增模板片段 1; 用引物对 B和 C1扩增模板片段 2。扩增反应条件为： 20 ng pRSET-A-DAO, 20 mM Tris - HC1 (pH 8.8) ， 10 mM KC1, 10 mM (NH₄)₂S0₄, 2 mM MgS0₄, 0.1% Triton X— 100， 0.4 μΜ 引物 A 和 0.4 μΜ 引物 D (扩增模板片段 1) 或 0.4 μΜ 引物 Β和 0.4 μΜ 引物 C1 (扩增模板片段 2) ， 50 μΜ dATP, 50 μΜ dTTP, 50 μΜ dCTP, 50 μΜ dGTP, 1.5 U Pfu DNA聚合酶，用无菌水调反应体积至 50 μ1。聚合酶链式反应扩增程序为： 94°C， 2分钟; 94°C， 1分钟， 53°C， 1 分钟， 72°C， 1分钟，循环 30次； 72°C， 10分钟。

扩增得到的模板片段 1和模板片段 2，经 1%琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，用以扩增全长基因。扩增全长基因的反应条件为： 20ng模板片段 1， 20 ng模板片段 2， 20mMTris-HCl (pH 8.8) ， lOmMKCl, 10 mM (匪 ₄)₂S0₄， 2 mM MgS0₄， 0.1% Triton X- 100， 0.4 μΜ 引物 A 和 0.4 μΜ引物 Β， 50 μΜ dATP, 50 μΜ dTTP, 50 μΜ dCTP, 50 μΜ dGTP， 1.5 U Pfu DNA 聚合酶，用无菌水调反应体积至 50 μ1。聚合酶链式反应扩增程序为： 94° C, 2分钟; 94° C, 1分钟， 53° C, 1分钟， 72° C, 2分钟，循环 35次； 72° C， 10分钟。

全长扩增反应得到 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA 基因，经 Ndel 及 Bglll酶切后连接到 pRSET- kan得连接产物 pRSET- kan- DA0GHA, 将 pRSET-kan- DA0GHA转化感受态大肠杆菌 BL21 (DE3) pLysS , 卡那霉素 LB平板 37° C培养，提取质粒，经 DNA测序确定引入的突变无误，确定 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA的 DNA序列如序列号 1所示，其推测出的氨基酸序列如序列 2所示。实施例 7: 载体 pHS- GHA (见图 2) 的构建

用 Ndel和 Bgl ll酶切质粒 RSET-kan-DAOGHA,得一 1, 074bp基因片段（内含 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA基因），经 0. 8%琼脂糖电泳提纯，与经 Ndel和 Bgl ll酶切的 pRSET- lac- GI- hok/sok- kan得到的长片断连接，得 pHS- GHA。将 pHS- GHA 转化感受态大肠杆菌 BL21 (DE3) pLysS ( Novagen) ，得菌株 BL- HS- GHA, 在卡那霉素（50 g/mL ) LB琼脂平板上于 37° C培养过夜。按照 Molecular Cloning- A Laboratory Manual ( Sambrook, J. et al.， 1989, CSHL Press ) 描述的方法提取质粒，测定其 DNA序列如序列号 3所示。其中数个核苷酸有改动： 1390 (d) ; 1535 (缺失了 T) ; 1826 (A->T) _; 1848 (C->T)； 2501 (G->T)； 2577 (T->A)； 3882 (C -〉 T)。实施例 8 : 载体 pT7- kan-ACY (见图 3 ) 的构建

根据已知的假单孢菌 SE83 戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸酰化酶 DNA 序列 ( Matsuda, A. et al.， 1987， J. Bacteriol. 169, 5821-5826 ) ，设计 PCR引物如下：

上游引物（Ndel- ACY)： 5， -CATATGAACGCTCCCGTCCCCGTCCC-3 ' , Ndel 酶切位点以下划线表示；

下游引物（Bglll- ACY) ： 5， -AGATCTTCAGATGGTGAAGCGGGCAC-3，， Bglll酶切位点以下划线表示。

以假单孢菌 SE83 DNA为模板，用上述引物进行 PCR, 扩增得到一 1, 676bp产物。 PCR条件为： 50 ng假单孢菌 SE83 DNA， 0.4 μΜ Ndel-ACY, 0.4 μΜ Bglll-ACY, 50 μΜ dATP, 50 μΜ dTTP, 50 μΜ dCTP, 50 μΜάΰΤΡ, 20 mMTris-HCl (pH8.8) ， 10 mMKCl, 10 mM (腿 ₄) ₂S0₄， 2 mMMgS0₄， 0· 1% Triton X- 100， 2.5 U Pfu DNA聚合酶（Promega) ，用无菌水调反应体积至 50 μί。

PCR扩增反应程序为： 95°C， 5 分钟； 94°C， 1 分钟， 50°C， 1 分钟， 72^DC， 3分钟，循环 35次； 72° (：， 10分钟。

该 PCR产物（l，676bp) 在 5' 和： T 端分别含有 Ndel和 Bglll 酶切位点。 PCR产物经 0.8%琼脂糖电泳提纯， Ndel和 Bglll酶切后，与经 del 和 Bglll 酶切的 pRSET-kan连接，得 pT7- kan- ACY。将 pT7- kan- ACY转化感受态大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS (Novagen) ，得菌株 BL- T7K- ACY，在卡那霉素（50 μg/mL LB 琼脂平板上于 37°C 培养过夜。按照 Molecular Cloning- A Laboratory Manual ( Sambrook, J. et al. , 1989， CSHL Press) 描述的方法提取质粒，测定其 DNA 序列如序列号 4 所示。其中四个核苷酸有改动： 2260(G->T) ; 2336 (T->A)； 3641 (C_〉T)； 4117 (G -〉 C。实施例 9: D-氨基酸氧化酶突变体 GHA之发酵培养基及发酵工艺

从卡那霉素（50 H D LB 琼脂平板上挑取单菌落大肠杆菌 BL-HS-GHA (见实施例 7) ，接种到 2X5 _mL含卡那霉素 (50 g/mL) 的液体 LB培养基，在 37°C培养 8小时（摇床转速为 250转每分钟），再接种至 2X50 mL种子培养基含卡那霉素（100 g/mL)和氯霉素（40 H/mL ，在 30°C培养 16小时（摇床转速为 400转每分钟）。

玉米浆 1之制备：

将 300 g玉米浆（购自华北制药康欣有限公司）溶于 300 mL蒸馏水，搅拌后离心（5，000 g， 8分钟），上清液即为玉米浆 1。沉淀物留用。

玉米浆 2之制备：

将上述沉淀物再溶于 600 mL蒸馏水，搅拌后离心（5, 000 g， 8 分钟），上清液即为玉米浆 2。 50 mL种子培养基中各成分重量如下

玉米浆 1 4 mL

玉米浆 2 4 mL

0.2 g

硫酸铵 0.075 g

磷酸氢二钠 0.25 g

磷酸二氢钾 0.04 g

氯化钠 0.075 g

将各成分溶于 50 mL蒸熘水，以 10 N氢氧化钠调 pH值至 7.15，高温消毒。

种子过夜发酵后，将全部 100 mL 之种子接种至 2 L 发酵罐 (BIOENGINEERING, Benchtop Fermentor, KLF2000)含卡那霉素 (50 g/mU 。

2L发酵培养基中各成分重量如下：

玉米浆 1 160 mL

玉米浆 2 160 mL

8 g

硫酸铵 3 g

磷酸氢二钠 10 g

磷酸二氢钾 1 g

氯化钠 3 g

将各成分溶于 1.9 L蒸馏水，以 10 N氢氧化钠调 pH值至 7.15, 于 2 L发酵罐 (BIOENGINEERING, Benchtop Fermentor, KLF2000) 将 12.5 g葡萄糖溶于 50 mL蒸馏水，高温消毒；将 1.25 g硫酸镁溶于 50 mL蒸馏水，高温消毒。

发酵前把已消毒的葡萄糖和硫酸镁放进 2 L发酵罐。

补料之制备：

将 250 mL玉米浆 1和 250 mL玉米浆 2混合，以 10 N氢氧化钠调 pH值至 7.25，高温消毒。将 2.25 g硫酸铵， 7.56 g磷酸氢二钠， 1.2 g磷酸二氢钾， 2.25 g氯化钠溶于 60 mL蒸馏水，高温消毒。

将 15 g酵母浸膏溶于 100 mL蒸馏水，高温消毒。

将 70 g葡萄糖溶于 140 mL蒸馏水，高温消毒。

将 30 mL甘油混合 10 mL蒸馏水，高温消毒。

将 20 g硫酸镁溶于 30 mL蒸馏水，高温消毒。

将所有溶液混合，加入卡那霉素至浓度为 50 μ_§ , 加入 2 mL 消泡剂。

在 35°C生长，在初始的 6小时， pH值由 6.9 自然上升至 7.2，开始补料（50 mL/小时）。在平衡条件下（以 5 N氢氧化钾将 pH值维持在 7.2，溶氧水平 p0₂不大于 0.5%) ，继续生长 26小时。实施例 10: 粗纯 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA之提取

按实施例 9发酵后，细菌在 4°C经离心机分离（5,000 g， 8分钟），弃上清液，得 220 g细菌（湿重），将细菌重悬于 600 mL磷酸钠缓冲液（50 mM， pH7.5) 。用珠磨法裂解细菌，以 50 mL每分钟之速度把细菌重悬液送进珠磨机（DYNO- MILL TYP KDL, 0.2 mm直径玻璃珠， WA Bachofen) 内，最后再以 800 mL磷酸钠缓冲液（50 mM, pH7.5) 把细菌残留冲洗出来。将细菌裂解液放在 55°C 水浴中浸泡 30分钟，以高速离心（ 10,000 g， 30分钟），取上清液，即为粗纯之 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA。取样并采用 SDS- PAGE检测目标蛋白的纯度和含量（见图 5) 。如图所示，粗纯之 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA约占总可溶蛋白 40%。实施例 11: D-氨基酸氧化酶突变体 GHA之提纯

取按实施例 10提取之粗纯 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA，加入甘油至最终浓度为 10%，用 5N氢氧化钠调 pH值至 8，离心（13，000 g， 30分钟），取上清液。按产品供应商所述产品制备法配备 DEAE-纤维素离子交换树脂（Sigma, D-0909)。按每 ImL粗纯酶混合 0.5raL DEAE- 纤维素离子交换树脂，在 4°C搅拌 5小时（100转每分钟），用滤斗 ( Buchner filter funnel , 120 mm PI ) 将酶液滤去。以 3份 DEAE- 纤维素离子交换树脂体积之 40 mM磷酸二氢钠缓冲液（含 10%甘油）冲洗 DEAE-纤维素离子交换树脂，再用 2份 DEAE-纤维素离子交换树脂体积之 400 mM磷酸二氢钠缓冲液将 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA洗脱出来。按每 1L洗脱之 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA, 加入 262 g硫酸铵，在室温搅拌 15分钟（100转每分钟）。离心（ 13, 000 g， 15 分钟），弃上清液，保留沉淀物。将沉淀物溶于 10 mM磷酸二氢钠缓冲液（pH7. 5 )。取样并采用 SDS- PAGE检测目标蛋白的纯度和含量（见图 5 ) 。如图所示，提取之 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA约占总可溶蛋白 90% 实施例 12 : D-氨基酸氧化酶突变体 GHA活性的检测

检测基本按 Isogai, T, et al. , 1990, J. Biochem. [Tokyo] 108 1063- 1069所述之方法，其中具体步骤有变更。将按实施例 11纯化的 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA用磷酸钠缓冲液（50 mM, pH7. 5 ) 稀释 10倍，取 2 mL，与相同体积之 150 mM头孢菌素 C钠盐混合，在 37° C下反应，反应中保持搅拌（搅拌速度为 450转每分钟），并用 5N氢氧化钠将 pH值保持在 7. 5。反应开始后在不同时间（0， 15， 30， 45分钟，见图 6 ) 抽取 100 样本，与 10 μΐ 3%过氧化氢混匀，再加入 50 μΐ 10%三氯醋酸，混匀以终止反应。离心（ 10, 000g, 3分钟），取 10 μΐ上清液混合 990 μΐ HPLC流动相（50 mM磷酸钾， pH7 ; 5% 乙腈）。用 HPLC检测酶反应，条件如下：

HPLC色谱柱: Diamonsil™ C18， 250 X 4. 6 mm (迪马公司，北京）柱温度： 30° C

流速： 1 raL每分钟

检测： 260 匪

一单位 D-氨基酸氧化酶活性定义为在上述条件每分钟转化一微摩尔头孢菌素 C钠盐至戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸的酶量。

获得之 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA总活性为 95， 607单位，即每升发酵液含 35， 410单位。实施例 13 : 固相 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA之制备

按实施例 11所述纯化 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA。固相 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA之制备参照载体供应商意大利 Res indion S. R. L. 的说明进行，其中具体步骤有变更。

载体活化：取 10g Sepabeads HA湿载体，加入 30 mL磷酸二氢钾缓冲液（100 mM， pH8 ) ，在室温下搅拌（300转， 15分钟）后，用 5 N氢氧化钠调 pH值至 8，静置。将载体过滤，用 40 mL磷酸钾缓冲液（20 mM， pH8 ) 搅拌洗涤 5分钟，再过滤并抽干。将载体加入 40 niL 2%戊二醛溶液，在室温下搅拌（300转， 60分钟），静置。将载体过滤，用 40 mL磷酸钾缓冲液（20 _mM， pH8 ) 搅拌洗涤 5分钟，再过滤并抽干。重复此洗涤步骤 5次，为活化湿载体。

酶固相化：按比例混合活化湿载体和纯化 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA (每 10 g活化湿载体混合 100 mL纯化 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA ) ，在室温下搅拌（300 转， 1 分钟）后，用 1N氢氧化钠调 pH 值至 8 , 再搅拌 18 小时，静置。将载体过滤，将固相产物用 40 mL 磷酸钾缓冲液（20 mM， pH8 ) 搅拌洗涤 2分钟，再过滤。将固相产物用 40 mL氯化钠溶液（0. 5 M氯化钠溶于 20 mM磷酸钾缓冲液， pH8 ) 搅拌洗涤 20分钟，过滤。重复此洗涤步骤直至洗涤液中蛋白量少于 0. 1 mg/mL。将固相产物用 40 mL磷酸钾缓冲液（20 mM, pH8 ) 搅拌洗涤 2分钟，过滤及抽干后，得 115 g固相 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA。固相酶活性之检测基本上与实施例 12所述相同，其中所用反应液体积为 200 mL的 75 mM头孢菌素 C钠盐，加入 4g固相 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA，测得活性为 77单位 /g湿载体。实施例 14: 假单孢菌 SE83戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸酰化酶的发酵培养基及发酵工艺

从卡那霉素（50 g/mL ) LB 琼脂平板上挑取单菌落大肠杆菌 BL-T7K-ACY (见实施例 8 ) , 接种到 2 X 5mL含卡那霉素（50 g/mL) 的液体 LB培养基，在 37° C培养 8小时（摇床转速为 250转每分钟），再接种至 2X50 mL 种子培养基含卡那霉素（50 g/mL) ，在 30°C 培养 16小时（摇床转速为 400转每分钟）。

50 mL种子培养基中各成分重量如下：

0.35 g

磷酸氢二纳 0.35 g

磷酸二氢钾 0.35 g

磷酸氢二钾 0.48 g

硫酸铵 0.06 g

氯化铵 0.01 g

甘油 0.5 mL

氯化钙 0.00055 g

将各成分溶于 50mL蒸馏水，高温消毒。

种子过夜发酵后，将全部 lOOmL 之种子接种至 2L 发酵罐 (BIOENGINEERING, Benchtop Fermentor, KLF2000)含卡那霉素 (50 g/mU 。

2L发酵培养基中各成分重量如下：

14 g

二纳 14 g

磷酸二氢钾 14 g

磷酸氢二钾 19.2 g

硫酸铵 2.4 g

氯化铵 0.4 g

甘油 20 mL

氯化钙 0.022 g

将各成分溶于 2 L蒸熘水，于 2 L发酵罐（BIOENGINEERING, Benchtop Fermentor, KLF2000) 高温消毒。

将 1 g硫酸镁溶于 20 mL蒸馏水，高温消毒；将 0.14 _g氯化锌溶于 20 mL蒸熘水，高温消毒。

发酵前把已消毒的硫酸镁和氯化锌放进 2 L发酵罐。

补料之制备：酵母浸膏 14 g

磷酸氢二纳 4.9 g

磷酸二氢钾 4.9 g

磷酸氢二钾 6.4 g

硫酸铵 0.84 g

氯化铵 0.14 g

甘油 175 mL

氯化钙 0.008 g

将各成分溶于 700 mL蒸馏水，高温消毒。

将 0.34 g硫酸镁溶于 20 mL蒸馏水，高温消毒后，加进已消毒之 700 mL之补料。

进行补料前，将硫酸锾加入补料，加卡那霉素至最终浓度为 50 g/mL，放入 2 mL消泡剂。

在 30°C生长，在初始的 4小时内，以 5 N氢氧化钾将 pH值由 6.9缓慢调升至 7.2。当 0D₆。。值达至 4时，开始补料（60mL/小时）。在之后的 4小时内再用 5N氢氧化钾将 pH值调升至 7.4。当 0D₆。。值达至 8时，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG， Sigma) 至 0.1 mM。以 5N 氢氧化钾将 pH值维持在 7.4, 溶氧水平 p0₂维持在 30%，继续生长 26 小时。实施例 15: 假单孢菌 SE83戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸酰化酶之提纯按实施例 14 发酵后，细菌在 4 C 经离心机分离（5,000 g， 8 分钟），弃上清液，得 130 g细菌（湿重），将细菌重悬于 400 mL 磷酸钠缓冲液（50mM， pH8) 。用珠磨法裂解细菌，以 50 mL每分钟之速度把细菌重悬液送进珠磨机（DYNO MILL TYP KDL， 0.2 mm直径玻璃珠， WA Bachofen) 内，最后再以 600 mL磷酸钠缓冲液（50 mM， pH8) 把细菌残留冲洗出来。将细菌裂解液放在 55^QC水浴中浸泡 15 分钟，以高速离心（10， 000 g， 30 分钟），取上清液，即为粗纯之假单孢菌 SE83 戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸酰化酶。取样并采用 SDS- PAGE检测目标蛋白的纯度和含量（见图 7) 。如图所示，粗纯之假单孢菌 SE83 戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸酰化酶约占总可溶蛋白

实施例 16 : 假单孢菌 SE83戊二酰 -7-氨基头孢霉垸酸酰化酶活性的检测

检测基本按 Binder, R. et al .， 1994, Appl . Environ. Microbi ol . 60, 1805- 1809 所述之方法，其中具体步骤有变更。将按实施例 15提取的假单孢菌 SE83戊二酰 7-氨基头孢霉垸酸酰化酶用磷酸钠缓冲液（50 mM， pH8 ) 稀释 10 倍，与相同体积之 150 mM 戊二酰 - 7-氨基头抱霉垸酸（制备方法参见 Sh ibuya, Y. et al . , 1981 , Agri c. Bi ol . Chem. 45， 1561-1567 ) 混合，在 37° C下反应，反应中保持搅拌（搅拌速度为 450转每分钟），并用 5 N氢氧化钠将 pH 值保持在 8。反应开始后在不同时间（0， 15， 30， 45分钟，见图 8 ) 抽取 60 L样本，与 30 μΐ 10%三氯醋酸混勾以终止反应。离心（ 10, 000 g， 3分钟），取 10 μΐ^上清液混合 990 μΐ HPLC流动相（50 mM磷酸钾， pH7 ; 5%乙腈）。用 HPLC检测酶反应，条件和实施例 12相同。

一单位戊二酰 -7-氨基头孢霉垸酸酰化酶活性定义为在上述条件每分钟转化一微摩尔戊二酰- 7-氨基头孢霉烷酸至 7-氨基头孢霉烷酸的酶量。

获得之假单孢菌 SE83 戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸酰化酶总活性为 24， 882单位，即每升发酵液含 9， 570酶单位。实施例 17 : 固相假单孢菌 SE83戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸酰化酶之制备

按实施例 15所述制备假单孢菌 SE83戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸酰化酶。固相假单孢菌 SE83戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸酰化酶之制备参照载体供应商德国 RShm公司的说明进行，其中具体步骤有变更。取 10 g Eupergit C250L湿载体混合 100 mL假单孢菌 SE83戊二酰 -7 - 氨基头孢霉垸酸酰化酶，在室温下搅拌（300转， 72小时），静置。过滤，用 100 mL蒸馏水在室温下搅拌洗涤（300转， 2分钟），用 3 号砂芯漏斗抽干，重复此洗涤步骤直至过滤液中蛋白量少于 0. 1 mg/mL，得 8Q g固相假单孢菌 SE83戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸酰化酶。固相酶活性之检测基本上与实施例 16所述相同，其中所用反应液体积为 200 mL 75 mM戊二酰 -7-氨基头孢霉垸酸，加入 6 g固相假单抱菌 SE83戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸酰化酶，测得活性为 50单位 /g湿载体。实施例 18 : 两步固相酶转化头孢菌素 C至 7-氨基头孢霉烷酸

制备 1L 75mM头孢菌素 C钠盐水溶液，加入 40g按实施例 13制备之固相 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA，在室温搅拌（250转每分钟，供氧量为 0. 3m3每小时） 1小时，用 3M氨水（N 0H)调 pH值为 7. 5。过滤反应液，加入 50g按实施例 17制备之固相假单孢菌 SE83戊二酰 - 7 -氨基头孢霉烷酸酰化酶，在室温搅拌（250转每分钟） 1小时，用 3M 氨水调 pH值为 8。用 HPLC检测反应产物 7-氨基头孢霉烷酸，条件和实施例 16相同。 HPLC图谱见图 9。如图 9所示，整个转化过程为 120分钟，在反应开始 60分钟后，绝大部分头孢菌素 C被 D-氨基酸氧化酶突变体 GHA 转化成戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸（见图 9， GL-7-ACA, 60分钟峰）。反应继续进行 60分钟后，绝大部分戊二酰 -7 -氨基头孢霉烷酸被假单孢菌 SE83戊二酰 -7-氨基头孢霉垸酸酰化酶转化成 7-氨基头孢霉烷酸（见图 9 , 7-ACA, 120分钟峰）。根据 HPLC数据计算，由头孢菌素 C转化成戊二酰 -7-氨基头孢霉垸酸之产率为 97. 96%；由戊二酰- 7-氨基头孢霉烷酸转化成 7-氨基头孢霉烷酸之产率为 95. 78% 由头孢菌素 C经两步酶法转化成 7-氨基头孢霉烷酸之总产率为 93. 83%。本发明不受上述具体文字描述的限制。本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变，这些改变均在本发明的范围之内。

Claims

权利要求书

1. 一种从头孢菌素 C 制备 7-氨基头孢霉烷酸的方法，包括用 D-氨基酸氧化酶催化头孢菌素 C至戊二酰 -7-氨基头孢霉垸酸的第一步反应和用戊二酰- 7-氨基头抱霉烷酸酰化酶催化戊二酰 -7-氨基头孢霉烷酸至 7-氨基头孢霉垸酸的第二步反应，其特征在于，所述 D - 氨基酸氧化酶为经纯化的、具有序列号 2所示氨基酸序列的三角酵母

( Trigonopsis variabi lis ) D -氨基酸氧化酶突变体。

2. 根据权利要求 1所述的方法，所述第一步反应中不添加过氧化氢。

3. 根据权利要求 2所述的方法，所述 D-氨基酸氧化酶是由具有序列号 3所示 DNA序列的表达载体 pHS- GHA表达的。

4. 根据权利要求 3所述的方法，所述 D-氨基酸氧化酶的纯化包括依次通过 DEAE-纤维素离子交换树脂纯化以及通过硫酸铵沉淀纯化。

5. 根据权利要求 4所述的方法，所述第一步反应和第二步反应都不添加选自抗坏血酸、 3-氨基- 1， 2， 3-***、过硼酸钠和叠氮化钠的 β -内酰胺酶抑制剂。

6：根据权利要求 5所述的方法，所述第一步反应中不添加选自舒巴坦钠、棒酸、硼酸及其衍生物的过氧化氢酶抑制剂。

7. 根据权利要求 6所述的方法，所述第二步反应中不添加过氧化氢酶。

8. 根据权利要求 1-7中任意一项所述的方法，所述 D-氨基酸氧化酶是固相化的，或者所逑戊二酰 -7-氨棊头孢霉烷酸酰化酶是固相化的。

9. 根据权利要求 8所述的方法，所述戊二酰- 7-氨基头孢霉烷酸酰化酶为假单孢菌（Pseudomonas sp. ) SE83 戊二酰 -7-氨基头孢霉垸酸酰化酶。

10. 根据权利要求 9所述的方法，所述假单孢菌 SE83戊二酰 -7- 氨基头抱霉烷酸酰化酶是由具有序列号 4所示赚序列的表达载体 pT7- kan- ACY表达的。