CN1301813A - 含有戊二酰－7－氨基头孢烷酸酰化酶基因的工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明测定了来源于Pseudomonas sp.130菌株的GL—7ACA酰化酶基因全序列及其所编码的酶蛋白,并提供含有该基因的重组质粒pMR24及构建E.cOli MMR204基因工程宿主菌,克服了原有宿主菌的β－内酰胺酶对CPC及其衍生物有破坏性的缺点。该宿主菌可一般地应用于以处理CPC及其衍生物(如GL—7ACA或7ACA)为目的基因工程菌的构建。本发明建立了一株具有工业应用前景的以GL—7ACA为中间体生产7ACA的GL—7ACA酰化酶基因工程菌。

Description

含有戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因的工程菌

本发明涉及头孢菌素酰化酶，更具体地说是涉及假单胞菌Pseudomonassp.130菌株的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶(Glutaryl-7-Amino-Cephalosporin Acid Acylase,GL-7ACA Acylase,GL-7ACA酰化酶)基因的全序列及其所编码的酶蛋白，该基因克隆在大肠杆菌中的稳定表达以及为适应作头孢菌素转化而构建的工程宿主菌E.coliMMR204的构建。

7-ACA(7-氨基头孢烷酸)以往主要通过头孢菌素C(Cephalosporin C,CPC)的化学裂解进行生产，但其工艺条件较为苛刻，而且存在环境污染的问题。这就促使人们不断探索用生物转化方法来生产7-ACA的途径。长期来，对头孢菌素酰化酶的研究受到生物学家和药学家的重视，研究结果逐渐显示出其重要的工业价值。头孢菌素酰化酶主要催化CPC及其它的衍生物分子中的酰基侧链的裂解反应，根据酶反应底物的性质，这类酶又分成二种类型：(1)使CPC的7-位氨基己二酰侧链直接酰化，一步生成7-ACA，这种酶被称作为CPC酰化酶；(2)以戊二酰-7ACA(Glutaryl-7-Amino-Cephalosporin Acid,GL-7ACA)为主要底物进行水解反应得到7-ACA，此类酶称为GL-7ACA酰化酶。利用头孢菌素酰化酶对CPC进行直接酶促转化生成7-ACA的一步法已有报导，但是，CPC酰化酶的转化活力极低，尚难于进入工业应用阶段。80年代以来，一些研究结果表明CPC可被多种生物来源的D-氨基酸氧化酶(DAO)氧化脱氨基，并进一步进行脱羧反应生成GL-7ACA。后者的7-位侧链可被GL-7ACA酰化酶(ACY)所水解得到7-ACA。DAO和GL-7ACA ACY催化作用下由CPC生成7-ACA的两步酶法工艺已渐趋成熟。有关GL-7ACA酰化酶产酶菌株的分离、鉴定、酶学性质及其在生物转化中的应用及近年来对酶基因的深入研究也有不少报导。Matsuda等对Pseudomonas SE 83菌株中为头孢菌素酰化酶Ⅰ和Ⅱ编码基因作了全顺序测定(Matsuda等J.Bacteriology 169:4821,1987)。Aramori等分析了Pseudomonas A-14菌株的GL-7ACA酰化酶的基因序列(J.Fermentation and Bioengineering 72:232-243,1991)。此外也有PseudomonasGK 16(Matsuda等J.Bacteriology 163:1222-1228,1985)和C427(Ishii Y et al.J.Ferment.Bioeng.,1994,77:591)中GL-7ACA酰化酶基因的部分DNA序列报导。中国专利“一步两酶法制造7-氨基头孢烷酸(CN 1104255A,1995年)”已对CPC的酶促转化作了描述，但在构建GL-7ACA酰化酶基因工程菌的过程中发现包含有acy基因片断的重组质粒pMR10在大肠杆菌A-56(E.coli A-56)宿主菌中不能稳定保存。同时，大肠杆菌宿主细胞的染色体上存在ampC基因，该基因所编码的β-内酰胺酶(头孢菌素酶)对CPC分子中β-内酰胺环的酰胺键具有极强的水解活力；虽然在用整体细胞进行一步两酶法制造7ACA的工艺时，可以通过加入β-内酰胺酶抑制剂苏巴坦纳(Salbactam)来克服β-内酰胺酶的破坏活性以提高7-ACA的生成产率，但由于生产成本和产品质量，添加抑制剂不是理想的措施。

本发明的目的是：1．对GL-7ACA酰化酶基因重组质粒的宿主菌进行改造，提供新的基因工程宿主菌，以克服头孢菌素酶(β-内酰胺酶)对CPC及其衍生物的破坏。该宿主菌可一般的应用于以处理CPC及其衍生物(如GL-7ACA和7ACA)为目的的基因工程菌的构建。2．测定来源于Pseudomonas sp.130菌株的GL-7ACA酰化酶基因全序列及其所编码的酶蛋白。3．对上述Pseudomonas sp.130菌株所携带GL-7ACA酰化酶基因重组质粒pMR10进行改造，提供新的重组质粒，以克服不稳定性的缺点。1．pMR 24重组质粒的构建：

本发明提供一种新的重组质粒pMR24，它是一双链环状DNA，长度为8010bp，其主要基因型为acy,amp,par．

原有来源于Pseudomonas 130菌株的GL-7ACA酰化酶基因重组质粒pMR10(杨蕴刘等，生物工程学报7:94-107 1991 8:15-22 1992)在E.coliA56宿主中不能稳定保存，无选择压力条件下传代，质粒即会从宿主中丢失。当E.coli A56(pMR10)在不加氨苄青霉素的培养基中经一次转接传代(相当10个世代)大部份子代菌落已检测不出质粒的存在。决定重组质粒稳定性的一个因素是亲代细胞发生***时，质粒DNA分子细胞的分配过程中分配基因(par)具有一定作用。为提高pMR10质粒在E.coli A56宿主中的稳定性，按图1程序将par基因重组到pMR10质粒中acy基因下游。首先，pMR10质粒以限制内切酶HpaI酶解，并用小牛肠磷酸酯酶(CIP)处理(Sambrook等Molecular Cloning 1986)，除去5′端的磷酸基团以防止酶解的质粒分子自身连接。由HpaⅠ酶切产生的片段平头末端中pEC302为par基团的供体质粒，该质粒DNA经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，经凝胶电泳和电洗脱回收0.45kb的par基因片段，为使该片段能与上述HpaⅠ酶解的pMR10进行平头连接，用DNA聚合酶将0.45Kb par基因片段的粘性末端补平，所获得的HpaI酶解的pMR 10与补平的0.45Kb par基因片段适量混合并用T4DNA连接酶进行连接。该连接混合物用以转化E.coli A56感受态细胞，涂布在加50ug/ml氨苄青霉素的LB平板上，对出现的单菌落进行分离、纯化以及质粒DNA的快速抽提和酶切鉴定(Sambcook等Molecular cloning,1986)获得重组质粒pMR24。

pMR24和pMR10在E.coli A56中的稳定性的比较：重组质粒pMR 10和pMR 24均带有抗性选择标记amp(氨苄青霉素抗性)，因此，在含有50μg/ml氨苄青霉素的肉汤培养液中能正常生长，当所用培养基不含抗生素时，由于质粒不稳定性，传代过程中，一部分细胞会失去质粒，这部分细胞也就丧失了在含抗生素培养基上的生长能力，其所占比例即代表了质粒的稳定性程度。对无药培养液中传代的菌落进行单菌落分离。然后将单菌落同时点种到含药和不含药的两种平板上，如果两种平板上都长出菌落，说明该细胞仍带有质粒；如果所点种的菌只在无药的平板上出现菌落，而在含药的平板上无生长，则表示该菌已发生质粒的丢失。据此，对重组质粒pMR24和pMR10的稳定性进行了检测。同时，也比较了培养物的产酰化酶的能力。结果如表1所示。从表1可见带酰化酶基因的pMR10质粒在E.coli A56中相当不稳定，在不含抗生素的培养液中经10个世代***繁殖，具有抗性的菌落已减少到总数的37％，20个世代后，仅保存为4％。而带有pMR24的E.coli A56菌株的稳定性增加，经20个世代繁殖抗生菌落数仍保留88％。由此可见，par基因明显改善了携带酰化酶基因重组质粒的稳定性。而且产酰化酶的稳定性相对提高。(表1)

                    表1稳定性和酶活性相对百分数

菌株	生长世代	质粒稳定性		GL-7ACA酰化酶活力
								被测菌落数	抗性菌落数	U/L	酶活保留％
E.coliA56(pMR24)	传代前对照	100	100	253	100
							10	100	86	236	93.3
	20	100	88	226	89.2
							30	100	61	176	69.5
E.coliA56(pMR10)	传代前对照	100	100	184	100
							10	100	37	73	39.7
	20	100	4	5	2.7
							30	100	3	2.5	1.4

2.来源于Pseudomonas sp.130菌株的GL-7ACA酰化酶基因的全序列及其所编码的酶蛋白：

来源于Pseudomonas sp.130菌株的GL-7ACA酰化酶基因acy为双链DNA，长度为2482bp(见SEQID NO:1)。

(1)亚克隆及DNA序列测定

采用亚克隆与合成引物两种方法，测序所用为Amersham公司的测序试剂盒。

从pMR24出发，以pBluescript SKⅡ(Stratagene公司)为载体构建的acy基因片段的亚克隆流程图见图2，序列的测定见表2，SEQ ID NO:3-10给出了所用引物的序列。

                  表2亚克隆及其所测的序列和测序时所用的引物

质粒	构建	测序	引物
				Pblue3	PBluescript SKⅡ/BamHI+B2→B1 (α)	BamHⅠ2→BamHⅠ1	M13,KS
Pblue4	PBluescript SKⅡ/BamHI+B1→B2(α)	BamHⅠ1→BamHⅠ2	M13,KS,α
				Pblue7	PBluescript SKⅡ/BamHI+B3→B2(β)	BamHⅠ2→XhoⅠ	M13,KS,β1
Pblue8	PBluescript SKⅡ/BamHⅠ+B2→B3(β)
				Pblue15	PBlue8/XhoⅠ B2→XhoⅠ(f)	XhoⅠ→BamHⅠ2	Reverse,SK
Pblue16	PBlue7/XhoⅠ B3→XhoⅠ(f)	XhoⅠ→MluⅠ	Reverse,SK,β4
				Pbluel8	PBlue8/Mlu,EcoRV,Klenow B2→MluⅠ(f)	MluⅠ→XhoⅠ	Reverse,SK,β3
Pblue19	PBlue7/Mlu,EcoRV,Klenow B3→MluⅠ(f)	MluⅠ→stop codon	Reverse,SK

(2)GL-7ACA酰化酶N端及C端氨基酸序列的测定及与同类酰化酶的氨基酸序列比较

一种来源于假单孢菌Pseudomonas sp.130菌株的GL-7ACA 酰化酶由α、β两个亚基组成，酶蛋白的信号肽由33个氨基酸(MetLeuArgValLeuHisArgAlaAlaSerAlaLeuValMetAlaThrValIleGlyLeuAlaProAlaValAlaPheAlaLeuAlaGluProThrSer)或40个氨基酸(MetLeuArgValLeuHisArgAlaAlaSerAalaLeuValMetAlaThrValIleGlyLeuAlaProAlaValAlaPheAlaLeuAlaGluProThrSerThrProGlnAlaProIleAla)组成，连接肽由10个氨基酸(GlyAspProProAspLeuAlaAspGlnGly)组成，为对本发明提供的Pseudomonas sp.130 GL-7ACA酰化酶基因acy编码的酶蛋白的DNA测序的结果进行验证，对酶蛋白的α亚基的N端，C端及β亚基的N端氨基酸序列进行测序。测序结果表明本发明提供的Pseudomonassp.130 GL-7ACA酰化酶核酸序列和氨基酸序列(见SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2)与美国专利US05457032中所提供的核酸序列和氨基酸序列完全相同。与文献报道的来源于Pseudomonas sp.GK-16和C427的GL-7-ACA酰化酶氨基酸序列高度同源(序列比较见图3和图4)，从氨基酸序列比较可以看出GK-16,C427和本发明中的酰化酶构成了具有GL-7ACA水解活力的酰化酶家族。

酶学研究的结果表明，本发明的酰化酶的酶活(13U/mg蛋白)高于GK-16及其他类似酰化酶的酶活(＜10U/mg蛋白)，本发明的酰化酶的KM值(0.5mM)较高于GK-16酰化酶(0.16mM)，但低于其他类似酰化酶(＞1mM)。因此，本发明酶的结构与催化特性与已发表的来自GK-16及C427的酰化酶相似但是有区别的。3．构建E.coli MMR 204基因工程宿主菌

采用体外定区域***突变及体内重组技术构建基因工程宿主菌E.coliMMR204，其主要基因型为ampC∷KAPA,ompT,recA，所用菌、噬菌体和质粒见表3，构建流程程序(见图5、图6)详细描述如下：

(1)质粒的pZJ2,pZJ3的获得(图6)

以质粒pJAC-4上的ampC基因为模板，两对寡聚核苷酸NdeⅠ5’和EcoRⅠ3′,EcoRⅠ5′和BamHⅠ3′为引物，利用PCR技术，扩增得到ampC5′NdeⅠ/EcoRⅠ片段和ampC3’EcoRⅠ/BamHⅠ片段，再分别用EcoRⅠ酶切并连接，经凝胶电泳分离纯化，即可得到具有EcoRⅠ位点的ampC片段。将ampC EcoRⅠ片段与载体pGEM-T连接，转化入DH10B，在LB Amp平板上，选择lacZ的菌落，即可得到片段***方向相反的重组质粒pZJ2和pZJ3。

                     表3菌株、噬菌体和质粒

菌株、噬菌体和质粒	有关基因型	来源
			DH10B	F- mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBL)Φ80d lacZ ΔM15ΔlacX74endA1 recA1 deoRΔ(ara,leu)7697 araD 139 galm galk nupG rpsL	BRL公司
JC7623	recB,recC,sbcB	Winans
			AKK241	ampCp1,zie2241∷Tn10	I.R.Booth
BL21	F- ompT hsd sR(rR -mB -)	J.Sambrook
			SP946	recA,srl∷Tn10	G.P.Zhao
MMR200	JC7623 ampC∷KAPA	本工作
			MMR202	AKK241 ampC∷KAPA	本工作
MMR203	BL21 ampC∷KAPA	本工作
			MMR204	MMR203 ampC∷KAPA	本工作
Plclg		R.L.Somerville
			PJAC-4	ampC,kan	Bengtake Jaurin
PUC4-KAPA	KAPA	美国Pharmacia公司
			PGEM-T	LacZ	美国Promega公司
pZJ2	ampC EcoRⅠ与lacZ同向，pGEM-T载体	本工作
			pZJ3	ampC EcoRⅠ与lacZ反向，pGEM-T载体	本工作
pZJ4	ampC∷KAPA,KAPA与ampC同向，pZJ2载体	本工作
			pZJ5	ampC∷KAPA,KAPA与ampC反向，pZJ2载体	本工作

(2)质粒pZJ4,pZJ5的获得(图6)

利用EcoRⅠ酶切凝胶电泳分离与电洗脱，获得含那霉素抗性基因的EcoRⅠ酶切DNA片段KAPA，将卡那霉素抗性基因KAPA***经EcoRⅠ酶切的pZJ2，转化入DH10B，涂布于含卡那霉素的LB平板上，于37℃培养24小时，将得到的抗性菌落质粒DNA用EcoRⅠ进行酶切检查。得到片段***方向相反的重组质粒pZJ4和pZJ5。

(3)JC7623 ampC∷KAPA的获得

取pZJ5 DNA，加入限制性内切酶ScaⅠ，酶切二个半小时，然后取线性DNA转化JC7623，选择卡那霉素抗性转化子，并筛选氨苄青霉素敏感转化子，对氨苄青霉素敏感而抗卡那霉素的转化子即为所需的JC7623ampC∷KAPA，定名为MMR200。

(4)MMR200菌株中ampC∷KAPA突变的遗传学与生物化学的鉴定(菌株MMR201与MMR202的获得及其鉴定)

采用标准的P1转导方法(Jeffrey H.Miller,A shout Course in BacteriaGenefics,A laboratory manual and handbook for Escherichia coli and relatedbacteria)将MMR20的P1裂解液转导高表达ampC基因的大肠杆菌突变株AKK241(24μ/mg干重，表4)100％卡那霉素抗性的转导子的头孢菌素酶活力却下降至几乎无法测到的低水平(＜7×10^-4μ/mg干重，表4)。因为AKK241的染色体基因ampCp1与zje2241∷Tn10连锁，因此将卡那霉素抗性的转导子进一步在LB四环素平板上进行进一步的筛选，得到的四环素抗性菌株定名为MMR201，四环素敏感的菌株定名为MM202，其中敏感菌株的比例为1％左右。该结果说明KAPA与zje2241∷Tn10连锁。而四环素敏感的MM202更可以用于进一步的改造。

(5)BL21 ampC∷KAPA获得

利用蛋白酶OmpT突变使表达在周质空间的外源蛋白较为稳定，用MMR202的P1裂解液转导BL21(ompT缺陷)，选择卡那霉素抗性转导子，定名为MMR203。

(6)将MMR203改造为recA菌株

由于recA缺陷可保证质粒的稳定传代及克隆基因的稳定表达，用SP946的P1裂解液转导MMR203，选择四环素抗性转导子，然后利用紫外超敏感性筛选与srl∷Tn10紧密连锁的recA缺失突变转导子，定名为MMR204。

(7)ampC∷KAPAβ-内酰胺酶活力的测定

将染色体上整合有基因ampC∷KAPA的菌株与原菌株的β-内酰胺酶活力进行比较(表4)。AKK241为ampCp1上升突变株，有极高的β-内酰胺酶活力。改造后其β-内酰胺酶活力在较苛刻的条件下仍无法测出。A56-3为我们原先采用的宿主菌，有一定的β-内酰胺酶活力。BL21的β-内酰胺酶活力较低，但在菌液浓缩10倍的条件下仍能测出酶活，改造后的β-内酰胺酶活力也无法测得。表5的数据是三个平行实验的平均值。

                 表4  一些E.coli菌株的β-内酰胺酶活力

菌株	有关基因型	β-内酰胺酶活力(μ/mg干重)
			AKK241	ampCp1,zje2241∷Tn10	23.89+/-0.87
A56-3	F’trp recA ampC+	1.03+/-0.09
			BL21	ampC+	0.090+/-0.001
MMR202	AKK241 ampC∷KAPA	＜7×10-4
			MMR203	BL21 ampC∷KAPA	＜4×10-4
MMR204	MMR203recA srl∷Tn10	＜4×10-4

4．原工程菌A_56-3/pMR24和新建工程菌MMR204/pMR24应用于GL-7ACA到7ACA的转化过程中对β-内酰胺环的破坏程度的比较

新建工程菌MMR204/PMR24由北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，1997年6月23日，保藏编号为CGMCC NO.0309。

将原工程菌A_56-3/pMR24和新建工程菌MMR204/pMR24分别应用于GL-7ACA到7ACA的转化，比较它们对β-内酰胺环的破坏程度(见表5，底物GL-7ACA浓度为0.133223mg/ml)。

表5原工程菌A_56-3/pMR24和新建工程菌MMR204/pMR24应用于

GL-7ACA到7ACA的转化过程中对β-内酰胺环的破坏程度

工程菌	反应后7ACA(mg/ml)	反应后GL-7ACA(mg/ml)	β-内酰胺环的破坏(％)
				A56-3/pMR24	0.043778	0.028234	32.3
MMR204/pMR24	0.055199	0.038581	12.2

从表5的数据可以看出，改造后的工程菌对β-内酰胺环的破坏性大大降低，已可应用于大规模的生产之中。

应用体外重组技术构建某一基因的突变克隆，然后通过体内重组将突变整合入染色体以构建该基因突变的新生物体的方法被称为“反向遗传学”，即为本发明所采取的方法。随着分子生物与生物工程研究工作的发展，该方法必将日益显示其巨大的潜力而得到广泛的注意。本发明成功地运用了上述技术构建了E.coli MMR204菌株，并在功能方面进行了菌株改造前后β-内酰胺酶活力的比较，从表4的数据可以看出，凡带有ampC∷KAPA突变的E.coli P1转导子，不论其亲株β-内酰胺酶活力的高低，均完全失去合成该酶的能力。同时，在MMR204作为宿主菌直接应用于从GL-7ACA到7ACA的转化过程中，发现GL-7ACA与7ACA的β-内酰胺结构始终保持稳定。因此，该宿主菌可一般地应用于一切以处理CPC及其衍生物(如GL-7ACA或7ACA)为目的基因工程菌的构建，即作为一种不产生头孢菌素酶(即ampC缺陷)，能保持质粒稳定传代、保证克隆基因稳定表达(recA缺陷)的，周质空间蛋白酶缺陷(ompT缺陷)的，便于进行转化的有广泛用途的宿主菌。

本发明优点：本发明戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因及其工程菌，提供了一种新的重组质粒pMR24，克服了原有重组质粒pMR10的不稳定性；测定了一种不同于已发表的Pseudomonas sp.GK-16和C427酰化酶的、来源于Pseudomonas sp.130菌株的GL-7-ACA酰化酶基因全序列及其所编码的酶蛋白；并提供了一种新的基因工程宿主菌MMR204，克服了原有宿主菌的β-内酰胺酶对CPC及其衍生物有破坏性的缺点，该宿主菌可一般的应用于以处理CPC及其衍生物(如GL-7ACA和7ACA)为目的的基因工程菌的构建。本发明建立了一株具有工业应用前景的以GL-7ACA为中间体生产7ACA的GL-7ACA酰化酶基因工程菌。

本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

附图说明

图1．重组质粒pMR24的构建。

图2．acy基因片段的亚克隆流程图

B1=BamHⅠ1,B2=BamHⅠ2,B3=BamHⅠ3,Ev=EcoRⅤ,M=MluⅠ,P=PstⅠ,S=SalⅠ,X=XhoⅠ。

图3．Pseudomonas sp.130 GL-7-ACA与Pseudomonas sp.GK-16酰化酶氨基酸序列的比较。

图4．Pseudomonas sp.130 GL-7-ACA与Pseudomonas sp.C427酰化酶氨基酸序列的比较。

图5．E.coli MMR204菌株的构建流程程序

pZJ2：ampC EcoRⅠ与lacZ同向，pGEM-T载体

pZJ3：ampC EcoRⅠ与lacZ反向，pGEM-T载体

pZJ4：ampC∷KAPA,KAPA与ampC同向，pZJ2载体

pZJ5：ampC∷KAPA,KAPA与ampC反向，pZJ2载体

MMR202：AKK241 ampC∷KAPA

MMR203：BL241 ampC∷KAPA

MMR204：MMR203 recA srl∷Tn10

引物NdeⅠ5′：设计5′端含有NdeⅠ单酶切位点的引5′ACCAGACCATATGTTCAAA

引物EcoRⅠ3′：设计3′端含有EcoRⅠ单酶切位点的引物5′CCCAGGCGGAATTCTTTTC

引物EcoRⅠ5′：设计5′端含有EcoRⅠ单酶切位点的引物5′AAAAGAATTCCGCCTGGGG

引物BamHⅠ3′：设计3′端含有BamHⅠ单酶切位点的引物5′CCCAGGCGGAATTCTTTTC

ampC 5′NdeⅠ/EcoRⅠ：以NdeⅠ5′和EcoRⅠ3′为引物,pJAC-4为模板，通过PCR扩增后得到的基因片段

ampC 3′EcoRⅠ/BamHⅠ：以EcoRⅠ5′和BamHⅠ3′为引物,pJAC-4为模板，通过PCR扩增后得到的基因片段

ampC EcoRⅠ：中间含有一EcoRⅠ单酶切位点的ampC基因片段

图6．含有ampC∷KAPA突变的重组质粒pZJ5的构建流程图。

实施例1 GL-7ACA酰化酶基因质粒与par基因片段的重组

本实施例中涉及的分子生物学方法均参考“Molecular Cloning--A LaboratoryManual”ed.by J.Sambcook,E.F.Fritsch and T.Maniatis,1989.CSHL Press.

步骤1：par基因片段分离：

提取pEC302质粒DNA,经CsCl密度梯度超离心纯化后，用BamHⅠ和EcoRⅠ完全双酶切，在0.6％低熔点琼脂糖凝胶上，电泳回收0.5Kb的par基因片段。

步骤2：平端par基因片段的制备

取2g步骤1得到的0.5Kb par基因片段与2.5ul dNTP(2mM)混合于50ul切口缓冲液中，加入2.5u大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段，20℃保温30分钟，1ul 0.5 M EDTA终止反应，在50ul的苯酚、氯仿(体积比1∶1)，50ul氯仿各抽滤一次。再用三倍体积的无水乙醇沉淀回收平端par基因片段。

步骤3：经HpaⅠ消化的pMR10 DNA的脱磷

pMR10质粒上，酰化酶基因下游的HpaⅠ切点可作为par基因片段的***点，由于HpaⅠ是平端酶切，因此，可和平端的par基因片段连接，为减少自身连接，需脱去其5′端p以提高与par基因片段的连接效率。为此，取5ug HpaⅠ消化的pMR10 DNA，溶于50ul专用缓冲液中，加入0.05U牛肠磷酸酯酶，混匀，37℃反应1小时，用300ul终止液(10mM Tris,1mM EDTA,200mM NaCl,0.5％SDS)使反应停止，以步骤2方法纯化并回收脱磷的HpaⅠ消化pMR 10DNA。

步骤4：线性pMR 10DNA与par基因片段的重组

分别由步骤2和步骤3得到的脱磷HpaⅠ pMR 10DNA 300ng(10ul)与平端par基因片段150ng(3ul)混合，经无水乙醇沉淀，溶解于10ul连接缓冲液中，加入1ul T4 DNA连接酶，15℃反应16小时。

步骤5：带par基因重组质粒pMR24的筛选

步骤4的连接酶混合液用于转化E.coli A56感受态细胞并在含50ug/ml氨苄青霉素的肉汤培养基(蛋白胨：1％，酵母粉：0.5％,NaCl:1％,pH:7.0)平板上获得转化子。进一步对12个转化菌落进行质粒DNA的快速抽提和酶切电泳鉴定，确定四株转化菌的质粒DNA中带有0.5Kb的外源par基因片段，该重组质粒定名为pMR24。

实施例2 重组质粒pMR24在宿主菌E.coli A56中的稳定性分析(结果见表1)：

步骤1:E.coli A56(pMR24)的连续传代

由实施例1，步骤5得到的E.coli A56(pMR24)接种到3ml肉汤培养基(成分见实施例1，步骤5)的10×150mm的试管中，置于100转/分钟摇床上37℃培养8-12小时。取该培养液30 ul转接到上述新鲜肉汤培养基试管中，同法培养并将一次传接的生长期估算为细菌繁殖10个世代。作为对照菌株E.coli A56(pMR10)同法进行培养。

步骤2：重组质粒稳定性检测

经过步骤1中三次转接传代后，分别对E.coli A56(pMR10)和E.

coli A56(pMR24)的培养药进行10^-6,10^-7,10^-8稀释，取0.1ml稀释菌液涂布到肉汤培养基平板上，以得到的单菌落，进一步用无菌牙签将单菌落同时点种到含Amp(50ug/ml)肉汤培养基平板和无药肉汤培养基平板上，37℃培养过夜，记录Amp平板上的抗性菌落数。

步骤3：GL-7ACA酰化酶活力测定

E.coli A56(pMR 10)和E.coli A56(pMR 24)在经步骤1的传代过程中，取培养液0.5ml,4000转/分离心10分钟，弃上清液，菌体用0.5ml磷酸缓冲液(0.1M,pH7.0)悬浮后，加入50mg/ml GL-7ACA 0.5mL,37℃水浴保温30分钟，用3ml[20％冰醋酸，0.05N NaOH(2∶1)]终止液终止反应，并加入0.5ml 0.5％对甲氨基苯甲醛使反应产物7ACA显色。再次离心15分钟，上清液于415nm处测光吸收值。1u GL-7ACA酰化酶活力的定义：在特定条件下(37℃,0.1M pH7.0磷酸缓冲液)每分钟能转化GL-7ACA而生成1ug7-ACA的酶量。

即：酶活力(U/ml)=K×OD 415nm/(t×D)

K:7-ACA标准曲线斜率

t：酶反应时间

D：反应***中加入菌液的体积

实施例3 GL-7ACA酰化酶N端氨基酸序列的测定(序列见SEQ IDNO:2)

(Hermann S and Gebhard VJ(1987).Anal Biochem.166:368-379)

步骤1：电印迹步骤

(1) 将Hyperbond膜浸泡在甲醇中约1min，然后将膜移至含20ug/mlDTT和10％甲醇的10mM CAPS转膜缓冲液中，保存到被使用前。

(2)纯化后的GL-7-ACA酰化酶样品参照Hermann等(1987)的方法进行TSDS-PAGE电泳(凝胶厚0.5mm)，并将电泳后的凝胶小心拨下，放入含20

ug/ml DTT的重蒸水中漂洗，然后将凝胶浸泡于含20ug/ml DTT和10％甲醇的10mM CAPS转膜缓冲液中约10min(每隔5min更换一次缓冲液)。

(3)将凝胶和Hyperbond膜按“夹心饼”的方式固定，并放入转膜装置中。在4℃下，恒压50V电转移1h。

(4)将Hyperbond膜从转膜装置中取出，并放入含20ug/ml DTT的重蒸水中漂洗。

(5)将已转移过样品的Hyperbond膜放入用甲醇/水/乙酸=5/4/1溶解的2mg/ml考马氏亮蓝R-250溶液中染色30min，然后在甲醇/水/乙酸=5/4/1的溶液中脱色，直到背景为白色为止。

步骤2：氨基酸序列分析

将准备测序的蛋白亚基从Hyperbond膜上切割下来，并放入BeckmanLF-3200蛋白多肽顺序仪上测定N端氨基酸序列。

实施例4 GL-7-ACA酰化酶α亚基C端序列的测定(序列见SEQ IDNO:2)

(1)对纯化的GL-7-ACA酰化酶进行SDS-PAGE电泳。

(2)从电泳装置上取下凝胶，置于0.25MKCl溶液中(4℃)，可以清晰的看到凝胶上分开的α与β亚基，用手术刀切下α亚基，并切成碎片。

(3)将碎片放入电洗脱装置中，恒定电流8-10mA，洗脱8小时左右，取出含α亚基的洗脱液于eppendorf管中。

(4)加入4倍洗脱液体积的丙酮(-20℃)于上述eppendorf管中，冰浴15分钟，12000转离心10分钟，弃上清，沉淀用蒸馏水溶解，并用蒸馏水透析三次。

(5)透析液用TEABI procise-491型蛋白质C端测序仪测定C端序列。

实施例5 GL-7ACA酰化酶工程宿主菌MMR204的构建(见图5、图6)

本实施例中，质粒抽提、酶切、连接、转化及PCR方法，均根据

J.Sambrook et al,Molecular Cloning。

P1噬菌体转导方法，根据Jeffrey H.Miller,A shout Course in BacteriaGenetics,A laboratory manual and handbook for Escherichia coli and relatedbacteria.内切酶为Promega公司产品。

培养基和抗菌素用量：LB培养基，R培养基，R半固体培养基，均同Jeffrey H.Miller,A shout Course in Bacteria Genetics,A laboratory manual andhandbook for Escherichia coli and related bacteria.

氨苄青霉素100-200ug/ml；卡那霉素50-100ug/ml；四环素50ug/ml；链霉素50ug/ml；

步骤一：运用体外重组技术得到含有ampC∷KAPA突变的重组质粒pZJ5

1．质粒的pZJ2,pZJ3的获得(图6)

(1)以质粒pJAC-4上的ampC基因为模板，两对寡聚核苷酸NdeⅠ5′和EcoRⅠ3′,EcoRⅠ5′和BamHⅠ3′为引物，利用PCR技术，扩增得到ampC5′NdeⅠ/EcoRⅠ片段和ampC3’EcoRⅠ/BamHⅠ片段，再分别用EcoRⅠ酶切并连接，经凝胶电泳分离纯化，即可得到具有EcoRⅠ位点的ampC片段。该片段可能会出三种情况：二个ampC5′NdeⅠ/EcoRⅠ的连接产物Ⅰ；二个ampC  3′EcoRⅠ/BamHⅠ的连接产物Ⅱ；ampC5′NdeⅠ/EcoRⅠ和ampC3′EcoRⅠ/BamHⅠ的连接产物Ⅲ，因两个片段ampC5′和ampC3′长度相近，凝胶电泳无法分离三种连接片段。

(2)将(1)中所得片段与载体pGEM-T连接，转化入DH10B，在LB Amp平板上，选择lacZ的菌落。这些菌落所携带的重组质粒可能会有三种类型。pGEM-T与片段Ⅰ连接形成的质粒上有一个EcoRⅠ位点，无BamHⅠ位点；pGEM-T与片段Ⅱ连接形成的质粒上有一个EcoRⅠ位点，有两个BamHⅠ位点；pGEM-T与片段Ⅲ连接形成的质粒上有一个EcoRⅠ位点，有一个BamHⅠ位点。因此，对菌落DNA分别进行EcoRⅠ,BamHⅠ酶切，就可区分三种类型，获得所需的pGEM-T与片段Ⅲ的连接产物。

(3)将pGEM-T与片段Ⅲ重组质粒进行进一步的酶切检查，以确定连接产物ampC EcoRI的连接方向。因为质粒pGEM-T在lacZα结构基因上，位于***的外源DNA5′端的多酶切位点接头顺序上有一个PstⅠ位点，而ampC EcoRI片段的靠近BamHⅠ端亦有一个PstⅠ位点，所以可根据PstⅠ酶切片段的大小，得到连接后ampC EcoRⅠ相对lacZα基因同向的质粒pZJ2，反向的质粒pZJ3。

2．质粒pZJ4,pZJ5的获得(图6)

利用EcoRⅠ酶切凝胶电泳分离与电洗脱，获得含那霉素抗性基因的EcoRⅠ酶切DNA片段KAPA,将卡那霉素抗性基因KAPA***经EcoRⅠ酶切的pZJ2，转化入DH10B，涂布于含卡那霉素的LB平板上，于37℃培养24小时，将得到的抗性菌落质粒DNA用EcoRⅠ进行酶切检查。再将所得到的KAPA***后的新质粒进行进一步的酶切检查，以确定KAPA***的方向。因为在靠近KAPA始端处有一个XhoⅠ切点，ampC EcoRⅠ上靠近NdeⅠ端亦有一个XhoⅠ切点，而载体pGEM-T上无XhoⅠ切点，所以可根据XhoⅠ酶切片段的大小，判断出KAPA***的方向。

步骤二：运用体内重组技术将突变ampC∷KAPA整合入大肠杆菌染色体上的ampC基因位点，构建含ampC∷KAPA突变的菌株

1．JC7623 ampC∷KAPA的获得

取20μg pZJ5 DNA，加入20u ScaⅠ，酶切二个半小时，然后取10μg线性DNA转化JC7623，选择卡那霉素抗性转化子，并筛选氨苄青霉素敏感转化子，对氨苄青霉素敏感而抗卡那霉素的转化子即为所需的JC7623ampC∷KAPA，定名为MMR200。

2．MMR200菌株中ampC∷KAPA突变的遗传学与生物化学的鉴定(菌

株MMR201与MMR 202的获得及其鉴定)

采用标准的P1转导方法(Jeffrey H.Miller,A shout Course in BacteriaGenefics,A laboratory manual and handbook for Escherichia coil and relatedbacteria)将MMR200的P1裂解液转导高表达ampC基因的大肠杆菌突变株AKK241(24μ/mg干重，表4)100％卡那霉素抗性的转导子的头孢菌素酶活力却下降至几乎无法测到的低水平((7×10^-4μ/mg干重，表4)。因为AKK241的染色体基因ampCp1与zje2241∷Tn10连锁。因此将卡那霉素抗性的转导子进一步在LB四环素平板上进行进一步的筛选，得到的四环素抗性菌株定名为MMR201，四环素敏感的菌株定名为M202，其中敏感菌株的比例为1％左右。该结果说明KAPA与zje2241∷Tn10连锁。而四环素每感的MM202更可以用于进一步的改造。

步骤三：最后再经若干步的改造获得符合工程菌需要的菌株MMR204

1．BL21ampC∷KAPA获得

利用MMR202的P1裂解液转导BL21(ompT)，选择卡那霉素抗性转导子，定名为MMR203。

2．将MMR203改造为recA菌株

用SP946的P1裂解液转导MMR203，选择四环素抗性转导子，然后利用紫外超敏感性筛选与srl∷Tn10紧密连锁的recA缺失突变转导子，定名为MMR204。

实施例6β-内酰胺酶活力的测定(数据见表4)

1．被测菌液的配制：从LB平板上挑取一单菌落，接种于加有相应抗生素的LB培养液中，37℃振摇培养过夜，适当稀释(称OD稀释倍数)后于OD₆₀₀测菌浓度。(使OD值处于0.4-0.8之间)；

2．配制1mg/ml CPC-Na水溶液；

3．将被测菌液沉淀后悬浮于PH=7.6的磷酸缓冲液中(视酶活高低适当浓缩或稀释，称浓缩倍数或稀释倍数)和CPC-Na溶液在恒温水浴35℃中预热10分钟，然后各取等体积数混合保温，分别于不同时间取出1ml混合液加入4ml终止液中(20％醋酸∶0.05N NaOH=2∶1)，以菌液保温后先加终止液，后加底物为对照。反应液和对照液离心后取上清液，以缓冲液为空白，260nm测光密度。

4．比酶活的计算：比酶活(u/mg)=0.5ml菌液的酶活/0.5ml菌液含干菌量

         =[ΔOD₂₆₀×酶活系数×10×60min×稀释倍数(or÷浓缩倍

         数)]/(OD₆₀₀×干菌系数×OD稀释倍数×0.5ml×保温时间)

酶活系数=0.1227(CPC-Na为底物)

干菌系数=0.91(适合于OD₆₀₀在0.4-0.8之间)

实施例7  原工程菌A_56-3/pMR24和新建工程菌MMR204/pMR24应用于GL-7ACA到7ACA的转化过程中对β-内酰胺环的破坏程度的比较(数据见表5)

1．工程菌的制备：从LB平板上挑取一单菌落，接种于装有60ml LB溶液的500ml三角摇瓶中，于37℃振摇培养12小时后，以1％的接种量转接于装有60ml LB溶液的500ml三角摇瓶中，于37℃振摇培养40小时，离心。

2．用PH7.6的磷酸缓冲液配制0.133223mg/ml GL-7ACA溶液。

3．将离心后的工程菌与GL-7ACA溶液混匀后于28℃水浴保温60分钟，在此过程中，不断用1N NaOH调整PH值，使其维持在7.6左右。

4．将反应液离心后，取上清，用蒸馏水稀释100倍，用高压液相法测定GL-7ACA和7ACA的浓度。

                          序列表(1)一般信息(Ⅰ)申请人：中国科学院上海植物生理研究所(Ⅱ)发明名称：含有戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因的工程菌(Ⅲ)序列数：10(2)SEQ ID NO:1信息(Ⅰ)序列特征：

(A)长度：2482个碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓朴结构：线性(Ⅱ)分子类型：脱氧核糖核酸(基因)(Ⅲ)来源

(A)菌种：假单孢菌(Pseudomonas)

(B)菌株：sp.130(Ⅳ)特征

(A)名称：信号肽

(B)位置：104-202或104-223

(C)其它信息：戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶/信号肽(Ⅳ)特征

(A)名称：成熟亚基-多肽

(B)位置：203-667或224-667

(C)其它信息：戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶/Alpha-亚基(Ⅳ)特征

(A)名称：空间肽-多肽

(B)位置：668-697

(C)其它信息：戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶/空间肽(Ⅳ)特征

(A)名称：成熟亚基-多肽

(B)位置：698-2263

(C)其它信息：戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶/Beta-亚基(Ⅴ)序列描述：SEQ ID NO:1:1    G GAT CCG TGG TTC GTA CGC GCC GCC TAC AAG TGG TGA TCT AGG GGA ACG TTC CGG GGG   5859  CGT CGC TGC AAC GGC GCT TCC GGA TCT GGG TGA GAG GGG AAA TCC ATG CTG AGA GTT CTG  118

                                                             Met Leu Arg Val Leu

                                                               1               5119  CAC CGG GCG GCG TCC GCC TTG GTT ATG GCG ACT GTG ATC GGC CTT GCG CCC GCC GTC GCC  178

 His Arg Ala Ala Ser Ala Leu Val Met Ala Thr Val Ile Gly Leu Ala Pro Ala Val Ala

                  10                  15                  20                  25179  TTT GCC CTG GCC GAG CCG ACC TCG ACG CCG CAG GCG CCG ATT GCG GCC TAT AAA CCG AGA  238

 Phe Ala Leu Ala Glu Pro Thr Ser Thr Pro Gln Ala Pro Ile Ala Ala Tyr Lys Pro Arg

                  30                  35                  40                  45239  AGC AAT GAG ATC CTG TGG GAC GGC TAC GGC GTC CCG CAC ATC TAC GGC GTC GAC GCG CCC  298

 Ser Asn Glu Ile Leu Trp Asp Gly Tyr Gly Val Pro His Ile Tyr Gly Val Asp Ala Pro

                  50                  55                  60                  65299  TCA GCC TTC TAC GGC TAT GGC TGG GCC CAG GCG CGC AGC CAC GGC GAC AAT ATC CTG CGC  358

 Ser Ala Phe Tyr Gly Tyr Gly Trp Ala Gln Ala Arg Ser His Gly Asp Asn Ile Leu Arg

                  70                  75                  80                  85359  CTG TAT GGA GAA GCG CGG GGC AAG GGG GCC GAA TAC TGG GGC CCG GAT TAC GAA CAG ACG  418

 Leu Tyr Gly Glu Ala Arg Gly Lys Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Pro Asp Tyr Glu Gln Thr

                  90                  95                 100                 105419  ACC GTC TGG CTG CTG ACC AAC GGC GTG CCG GAG CGC GCT CAG CAG TGG TAT GCG CAG CAG  478

 Thr Val Trp Leu Leu Thr Asn Gly Val Pro Glu Arg Ala Gln Gln Trp Tyr Ala Gln Gln

                 110                 115                 120                 125479  TCG CCT GAT TTC CGC GCC AAC CTC GAC GCC TTC GCG GCG GGC ATC AAC GCC TAT GCG CAG  538

 Ser Pro Asp Phe Arg Ala Asn Leu Asp Ala Phe Ala Ala Gly Ile Asn Ala Tyr Ala Gln

                 130                 135                 140                 145539  CAG AAC CCC GAC GAC ATC TCG CCC GAC GTG CGG CAG GTG CTG CCG GTT TCC GGC GCC GAC  598

 Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Asp Val Arg Gln Val Leu Pro Val Ser Gly Ala Asp

                 150                 155                 160                 165599  GTG GTG GCC CAC GCC CAC CGC CTG ATG AAC TTC CTC TAT GTC GCG TCG CCC GGC CGC ACC  658

 Val Val Ala His Ala His Arg Leu Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala Ser Pro Gly Arg Thr

                 170                 175                 180                 185659  CTG GGC GAG GGC GAC CCG CCG GAC CTG GCC GAT CAA GGA TCC AAC TCC TGG GCG GTG GCG  718

 Leu Gly Glu Gly Asp Pro Pro Asp Leu Ala Asp Gln Gly Ser Asn Ser Trp Ala Val Ala

                 190                 195                 200                 205719  CCG GGA AAG ACG GCG AAC GGG AAC GCC CTG CTG CTG CAG AAC CCG CAC CTG TCC TGG ACG  778

 Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu Leu Leu Gln Asn Pro His Leu Ser Trp Thr

                 210                 215                 220                 225779  ACG GAC TAC TTC ACC TAC TAC GAG GCG CAT CTC GTC ACG CCG GAC TTC GAA ATC TAT GGC  838

 Thr Asp Tyr Phe Thr Tyr Tyr Glu Ala His Leu Val Thr Pro Asp Phe Glu Ile Tyr Gly

                 230                 235                 240                 245839  GCG ACC CAG ATC GGC CTG CCG GTC ATC CGC TTC GCC TTC AAC CAG CGG ATG GGC ATC ACC  898

 Ala Thr Gln Ile Gly Leu Pro Val Ile Arg Phe Ala Phe Asn Gln Arg Met Gly Ile Thr

                 250                 255                 260                 265899  AAT ACC GTC AAC GGC ATG GTG GGG GCC ACC AAC TAT CGG CTG ACG CTT CAG GAC GGC GCC  958

 Asn Thr Val Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg Leu Thr Leu Gln Asp Gly Gly

                 270                 275                 280                 285959  TAT CTG TAT GAC GGT CAG GTG CGG CCG TTC GAG CGG CGT CAG GCC TCG TAT CGC CTG CGT 1018

 Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro Phe Glu Arg Arg Gln Ala Ser Tyr Arg Leu Arg

                             290                 295                  300                  3051019  CAG GCG GAC GGG ACG ACG GTC GAC AAG CCG TTG GAG ATC CGC TCC AGC GTC CAT GGC CCG   1078

  Gln Ala Asp Gly Thr Thr Val Asp Lys Pro Leu Glu Ile Arg Ser Ser Val His Gly Pro

                  310                 315                 320                 3251079  GTC TTC GAG CGC GCG GAC GGC ACG GCC GTC GCC GTT CGG GTC GCC GGT CTG GAC CGG CCG   1138

  Val Phe Glu Arg Ala Asp Gly Thr Ala Val Ala Val Arg Val Ala Gly Leu Asp Arg Pro

                  330                 335                 340                 3451139  GGC ATG CTC GAG CAG TAT TTC GAC ATG ATC ACG GCG GAC AGC TTC GAC GAC TAC GAA GCC   1198

  Gly Met Leu Glu Gln Tyr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp Ser Phe Asp Asp Tyr Glu Ala

                  350                 355                 360                 3651199  GCT TTG GCG CGG ATG CAG GTG CCG ACC TTC AAC ATC GTC TAC GCC GAC CGC GAA GC4 ACC   1258

  Ala Leu Ala Arg Met Gln Val Pro Thr Phe Asn Ile Val Tyr Ala Asp Arg Glu Gly Thr

                  370                 375                 380                 3851259  ATC AAC TAC AGC TTC AAC GGC GTG GCG CCC AAA CGG GCC GAG CGC GAC ATC GCC TTC TGG   1318

  Ile Asn Tyr Ser Phe Asn Gly Val Ala Pro Lys Arg Ala Glu Gly Asp Ile Ala Phe Trp

                  390                 395                 400                 4051319  CAG GGG CTC GTG CCG GGC GAT TCC TCG CGT TAC CTG TGG ACC GAG ACA CAC CCG CTG GAC   1378

  Gln Gly Leu Val Pro Gly Asp Ser Ser Arg Tyr Leu Trp Thr Glu Thr His Pro Leu Asp

                  410                 415                 420                 4251379  GAT CTG CCG CCC GTC ACC AAT CCG CCG GGC GGC TTC GTG CAG AAC TCC AAT GAT CCG CCG   1438

  Asp Leu Pro Arg Val Thr Asn Pro Pro Gly Gly Phe Val Gln Asn Ser Asn Asp Pro Pro

                  430                 435                 440                 4451439  TGG ACG CCG ACC TGG CCC GTC ACC TAC ACG CCC AAG GAC TTC CCC TCC TAT CTG GCG CCC   1498

  Trp Thr Pro Thr Trp Pro Val Thr Tyr Thr Pro Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Leu Ala Pro

                  450                 455                 460                 4651499  CAG ACG CCG CAT TCC CTG CGT GCG CAA CAA AGC GTG CGT CTG ATG TCC GAG AAC GAC GAC   1558

  Gln Thr Pro His Ser Leu Arg Ala Gln Gln Ser Val Arg Leu Met Ser Glu Asn Asp Asp

                  470                 475                 480                 4851559  CTG ACG CTG GAG CGC TTC ATG GCG CTG CAG TTG AGC CAT CGC GCC GTC ATG GCC GAC CGC   1618

  Leu Thr Leu Glu Arg Phe Met Ala Leu Gln Leu Ser His Arg Ala Val Met Ala Asp Arg

                  490                 495                 500                 5051619  ACC TTG CCG GAC CTG ATC CCG GCC GCC CTG ATC GAC CCC GAT CCC GAG GTC CAG GCG GCG   1678

  Thr Leu Pro Asp Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ile Asp Pro Asp Pro Glu Val Gln Ala Ala

                  510                 515                 520                 5251679  GCG CGC CTG CTG GCG GCG TGG GAT CGC GAG TTC ACC AGC GAC AGC CGC GCC GCC CTG CTG   1738

  Ala Arg Leu Leu Ala Ala Trp Asp Arg Glu Phe Thr Ser Asp Ser Arg Ala Ala Leu Leu

                  530                 535                 540                 5451739  TTC GAG GAA TGG GCG CGT CTG TTC GCC GGC CAG AAT TTC GCA CGC CAG GCC GGC TTC GCC   1798

  Phe Glu Glu Trp Ala Arg Leu Phe Ala Gly Gln Asn Phe Ala Gly Gln Ala Gly Phe Ala

                  550                 555                 560                 5651799  ACG CCC TGG TCG CTG GAT AAG CCG GTC AGC ACG CCT TAC GGC GTC CGC GAC CCC AAG GCC   1858

  Thr Pro Trp Ser Leu Asp Lys Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly Val Arg Asp Pro Lys Ala

                  570                 575                 580                 5851859  GCC GTC GAT CAA CTG CGG ACC GCC ATC GCC AAC ACC AAG CGC AAA TAC GGC GCG ATC GAC   1918

  Ala Val Asp Gln Leu Arg Thr Ala Ile Ala Asn Thr Lys Arg Lys Tyr Gly Ala Ile Asp

                  590                 595                 600                 6051919  CGG CCG TTC GGC GAC GCC TCG CGC ATG ATC CTG AAC GAC GTG AAT GTT CCG GGC GCC GCC   1978

  Arg Pro Phe Gly Asp Ala Ser Arg Met Ile Leu Asn Asp Val Asn Val Pro Gly Ala Ala

                  610                 615                 620                 6251979  GGC TAC GGC AAC CTG GGT TCC TTC CGG GTC TTC ACC TGG TCC GAT CCT GAC GAA AAC GGG   2038

  Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Ser Phe Arg Val Phe Thr Trp Ser Asp Pro Asp Glu Asn Gly

                  630                 635                 640                 6452039  GTT CGC ACG CCC GTC CAC GGC GAG ACG TGG GTG GCG ATG ATC GAG TTC TCC ACG CCG GTG   2098

  Val Arg Thr Pro Val His Gly Glu Thr Trp Val Ala Met Ile Glu Phe Ser Thr Pro Val

                  650                 655                 660                 6652099  CGG GCC TAT GGC CTG ATG AGC TAC GGC AAC TCT CGC CAG CCG GGC ACG ACG CAC TAC AGC   2158

   Arg Ala Tyr Gly Leu Met Ser Tyr Gly Asn Ser Arg Gln Pro Gly Thr Thr His Tyr Ser

                   670                 675                 680                 6852159   GAT CAG ATC GAA CGC GTG TCG CGC GCC GAC TTC CGC GAA CTG TTG CTG CGG CGA GAG CAG   2218

   Asp Gln Ile Glu Arg Val Ser Arg Ala Asp Phe Arg Glu Leu Leu Leu Arg Arg Glu Gln

                   690                 695                 700                 7052219   GTC GAG CCC GCC GTC CAG GAA CGC ACG CCC TTC AAC TTC AAG CCA TGA AAG CCC TGA CCA   2278

   Val Glu Ala Ala Val Gln Glu Arg Thr Pro Phe Asn Phe Lys Pro

                   710                 715                 7202279   TGA CAC GAC GGA TTG GGT ATT CGG CGG GCG CGG CGT CTC TGG CGC TGA TGG TCG CCG CCT   23382339   CTG GAG CGG CGG CGG GCG AGC CGG CCT TCA CTT CGG TTC AGG TCG AGG GCT TTT CGG TTC   23982399   CGG GCG CTC TGT CGA ACG CCT GGG CCG ACT TCG ACA ACG ACG GCG ACC TGG ACC TGG CCG   24582459   TCT CCT GGA AGA GCG GCG AAG CTT                                                      2482(3)SEQ ID NO:2信息(Ⅰ)序列特征：

(A)长度：720个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性(Ⅱ)分子类型：蛋白质(Ⅲ)序列描述：SEQ ID NO:2:Met Leu Arg Val Leu His Arg Ala Ala Ser Ala Leu Val Met Ala Thr Val Ile Gly Leu

              5                  10                  15                  20Ala Pro Ala Val Ala Phe Ala Leu Ala Glu Pro Thr Ser Thr Pro Gln Ala Pro Ile Ala

             25                  30                  35                  40Ala Tyr Lys Pro Arg Ser Asn Glu Ile Leu Trp Asp Gly Tyr Gly Val Pro His Ile Tyr

             45                  50                  55                  60Gly Val Asp Ala Pro Ser Ala Phe Tyr Gly Tyr Gly Trp Ala Gln Ala Arg Ser His Gly

             65                  70                  75                  80Asp Asn Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Glu Ala Arg Gly Lys Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Pro

             85                  90                  95                 100Asp Tyr Glu Gln Thr Thr Val Trp Leu Leu Thr Asn Gly Val Pro Glu Arg Ala Gln Gln

            105                 110                 115                 120Trp Tyr Ala Gln Gln Ser Pro Asp Phe Arg Ala Asn Leu Asp Ala Phe Ala Ala Gly Ile

            125                 130                 135                 140Asn Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Asp Val Arg Gln Val Leu Pro

            145                 150                 155                 160Val Ser Gly Ala Asp Val Val Ala His Ala His Arg Leu Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala

            165                 170                 175                 180Ser Pro Gly Arg Thr Leu Gly Glu Gly Asp Pro Pro Asp Leu Ala Asp Gln Gly Ser Asn

            185                 190                 195                 200Ser Trp Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu Leu Leu Gln Asn Pro

            205                 210                 215                 220His Leu Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Phe Thr Tyr Tyr Glu Ala His Leu Val Thr Pro Asp

            225                 230                 235                 240Phe Glu Ile Tyr Gly Ala Thr Gln Ile Gly Leu Pro Val Ile Arg Phe Ala Phe Asn Gln

            245                 250                 255                 260Arg Met Gly Ile Thr Asn Thr Val Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg Leu Thr

            265                 270                 275                 280Leu Gln Asp Gly Gly Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro Phe Glu Arg Arg Gln Ala

            285                 290                 295                 300Ser Tyr Arg Leu Arg Gln Ala Asp Gly Thr Thr Val Asp Lys Pro Leu Glu Ile Arg Ser

            305                 310                 315                 320Ser Val His Gly Pro Val Phe Glu Arg Ala Asp Gly Thr Ala Val Ala Val Arg Val Ala

            325                 330                 335                 340Gly Leu Asp Arg Pro Gly Met Leu Glu Gln Tyr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp Ser Phe

            345                 350                 355                 360Asp Asp Tyr Glu Ala Ala Leu Ala Arg Met Gln Val Pro Thr Phe Asn Ile Val Tyr Ala

            365                 370                 375                 380Asp Arg Glu Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Phe Asn Gly Val Ala Pro Lys Arg Ala Glu Gly

            385                 390                 395                 400Asp Ile Ala Phe Trp Gln Gly Leu Val Pro Gly Asp Ser Ser Arg Tyr Leu Trp Thr Glu

            405                 410                 415                 420Thr His Pro Leu Asp Asp Leu Pro Arg Val Thr Asn ProPro Gly Gly Phe Val Gln Asn

            425                 430                 435                 440Ser Asn Asp Pro Pro Trp Thr Pro Thr Trp Pro Val Thr Tyr Thr Pro Lys Asp Phe Pro

            445                 450                 455                 460Ser Tyr Leu Ala Pro Gln Thr Pro His Ser Leu Arg Ala Gln Gln Ser Val Arg Leu Met

            465                 470                 475                 480Ser Glu Asn Asp Asp Leu Thr Leu Glu Arg Phe Met Ala Leu Gln Leu Ser His Arg Ala

            485                 490                 495                 500Val Met Ala Asp Arg Thr Leu Pro Asp Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ile Asp Pro Asp Pro

            505                 510                 515                 520Glu Val Gln Ala Ala Ala Arg Leu Leu Ala Ala Trp Asp Arg Glu Phe Thr Ser Asp Ser

            525                 530                 535                 540Arg Ala Ala Leu Leu Phe Glu Glu Trp Ala Arg Leu Phe Ala Gly Gln Asn Phe Ala Gly

            545                 550                 555                 560Gln Ala Gly Phe Ala Thr Pro Trp Ser Leu Asp Lys Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly Val

            565                 570                 575                 580Arg Asp Pro Lys Ala Ala Val Asp Gln Leu Arg Thr Ala Ile Ala Asn Thr Lys Arg Lys

            585                 590                 595                 600Tyr Gly Ala Ile Asp Arg Pro Phe Gly Asp Ala Ser Arg Met Ile Leu Asn Asp Val Asn

            605                 610                 615                 620Val Pro Gly Ala Ala Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Ser Phe Arg Val Phe Thr Trp Ser Asp

            625                 630                 635                 640Pro Asp Glu Asn Gly Val Arg Thr Pro Val His Gly Glu Thr Trp Val Ala Met Ile Glu

            645                 650                 655                 660Phe Ser Thr Pro Val Arg Ala Tyr Gly Leu Met Ser Tyr Gly Asn Ser Arg Gln Pro Gly

            665                 670                 675                 680Thr Thr His Tyr Ser Asp Gln Ile Glu Arg Val Ser Arg Ala Asp Phe Arg Glu Leu Leu

            685                 690                 695                 700Leu Arg Arg Glu Gln Val Glu Ala Ala Val Gln Glu Arg Thr Pro Phe Asn Phe Lys Pro

            705                 710                 715                 720(4)SEQ ID NO:3信息(Ⅰ)序列特征：

(A)长度：17

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性(Ⅱ)分子类型：核酸(Ⅲ)特征：

(A)名称：M13

(B)其它信息：测序引物(Ⅳ)序列描述：SEQ ID NO:3:

GTA AAA CGA CGG CCA GT(5)SEQ ID NO:4信息(Ⅰ)序列特征

(A)长度：16

(B)类型：核苷酸

(C)

(D)拓朴结构：线性(Ⅱ)分子类型：核酸(Ⅲ)特征：

(A)名称：Reverse

(B)其它信息：测序引物(Ⅳ)序列描述：SEQ ID NO:4:

AAC AGC TAT GAC CAT G(6)SEQ ID NO:5信息(Ⅰ)序列特征

(A)长度：17

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性(Ⅱ)分子类型：核酸(Ⅲ)特征：

(A)名称：KS

(B)其它信息：测序引物(Ⅳ)序列描述：SEQ ID NO:5:

CGA GGT CGA CGG TAT CG(7)SEQ ID NO:6信息(Ⅰ)序列特征

(A)长度：17

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性(Ⅱ)分子类型：核酸(Ⅲ)特征：

(A)名称：SK

(B)其它信息：测序引物(Ⅳ)序列描述：SEQ ID NO:6:

TCT AGA ACT AGT GGA TC(8)SEQ ID NO:7信息(Ⅰ)序列特征

(A)长度：18

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性(Ⅱ)分子类型：核酸(Ⅲ)特征：

(A)名称：ALPHA

(B)其它信息：测序引物(Ⅳ)序列描述：SEQ ID NO:7:

GCG CTG GCC GAG CCG ACC(9)SEQ ID NO:8信息(Ⅰ)序列特征

(A)长度：17

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性(Ⅱ)分子类型：核酸(Ⅲ)特征：

(A)名称：BETA1

(B)其它信息：测序引物(Ⅳ)序列描述：SEQ ID NO:8:

CTTCAGGACGCCGGCTA(10)SEQ ID NO:9信息(Ⅰ)序列特征

(A)长度：17

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性(Ⅱ)分子类型：核酸(Ⅲ)特征：

(A)名称：BETA3

(B)其它信息：测序引物(Ⅳ)序列描述：SEQ ID NO:9:

GTG CGG TCG GCC ATG AC(11)SEQ ID NO:10信息(Ⅰ)序列特征

(A)长度：17

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性(Ⅱ)分子类型：核酸(Ⅲ)特征：

(A)名称：BETA4

(B)其它信息：测序引物(Ⅳ)序列描述：SEQ ID NO:10:

GTG AGT TCA CCA GCG AC

Claims (6)

1．一种保藏登记号为CGMCC NO.0309的含有SEQ ID NO:1的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因的工程菌MMR204/pMR24，其特征在于该工程菌是由工程宿主菌MMR204携带含有戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因的重组质粒pMR24构成。

2．如权利要求1所述的工程菌MMR204/pMR24，其特征在于所述重组质粒pMR24含有的主要基因型为acy,amp,par，它是由将分配基因par重组到质粒pMR10中acy基因的下游而得到。

3．如权利要求1所述的工程菌MMR204/pMR24，其特征在于所述工程宿主菌MMR204含有的主要基因型为ampC∷KAPA,ompT,recA。

4．如权利要求1所述的工程菌MMR204/pMR24的构建方法，其特征在于包括：

(1)、工程宿主菌MMR204的构建：首先运用体外重组技术得到含有ampC∷KAPA突变的重组质粒pZJ5，其次运用体内重组技术将上述突变整合入大肠杆菌染色体上的ampC基因位点，构建含ampC∷KAPA突变的菌株，最后再经改造，将能使表达在周质空间的外源蛋白较为稳定的蛋白酶OmpT突变和可保证质粒稳定传代及克隆基因稳定表达的recA缺陷引入宿主菌，获得基因工程宿主菌MMR204；

(2)、将MMR204与上述重组质粒pMR24构建成MMR204/pMR24。

5．如权利要求1所述的工程菌MMR204/pMR24的应用，其特征在于该工程菌包含的所述宿主菌MMR204可应用于以处理CPC及其衍生物为目的的基因工程菌的构建。

6．如权利要求5所述的工程菌MMR204/pMR24的应用，其特征在于所述CPC衍生物是GL-7ACA和7ACA。

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