CN1912130B

CN1912130B - 一种用于制备7-氨基头孢霉烷酸的两步酶法

Info

Publication number: CN1912130B
Application number: CN2005100899653A
Authority: CN
Inventors: 王骏; 肖游龙; 叶康坚; 曾实现; 陈军明; 曾伟基
Original assignee: BAIRUI GLOBAL Co Ltd
Current assignee: BAIRUI GLOBAL Co Ltd
Priority date: 2005-08-08
Filing date: 2005-08-08
Publication date: 2011-06-15
Anticipated expiration: 2025-08-08
Also published as: CN1912130A; EP1925663A4; EP1925663A1; US20100112633A1; US8003358B2; WO2007016861A1

Abstract

本发明提供了一种从头孢菌素C制备7-氨基头孢霉烷酸的两步酶法，其中所用的D-氨基酸氧化酶为一种经纯化的三角酵母D-氨基酸氧化酶突变体，其所具有的比活比亲本D-氨基酸氧化酶高105％。本发明的方法不需添加过氧化氢、β-内酰胺酶抑制剂、过氧化氢酶抑制剂、过氧化氢酶等现有方法中常用的试剂，而本发明的方法的产率可以达到93％以上，因而具有步骤简单、成本低、产率高的特点。

Description

一种用于制备7-氨基头孢霉烷酸的两步酶法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体而言涉及一种用于制备7-氨基头孢霉烷酸(7-aminocephalosporanic acid)的两步酶法。

背景技术

半合成头孢菌素母核7-氨基头孢霉烷酸可由化学法从头孢菌素C(cephalosporin C)制备而得。但是化学法需使用大量有毒制剂，污染环境，而且产率低、成本高。应用酶法制备精细化学品为近年来的新兴工艺，它避免使用有毒制剂，并且产率较高。酶法制备7-氨基头孢霉烷酸包括两个步骤(见图1)：(1)D-氨基酸氧化酶氧化头孢菌素C生成戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸(glutaryl-7-aminocephalosporanic acid)；(2)戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶水解戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸产生7-氨基头孢霉烷酸。

目前限制大规模酶法制备7-氨基头孢霉烷酸的因素之一为D-氨基酸氧化酶和戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶的产率低、成本高。目前报导的D-氨基酸氧化酶表达水平较低(Pollegioni，L.et al.，1997，J.Biotechnol.58，115-123：800酶单位每升发酵液；Molla，G.et al.，1998，Protein Exp.Purif.14，289-294：2,300酶单位每升发酵液)。目前报导的戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶表达水平也低(Ishiye，M.和Niwa，M.，1992，Biochim.Biophys.Acta1132，233-239：129酶单位每升发酵液；杨蕴刘等，2001，中国专利申请公开号CN 1301813A：253酶单位每升发酵液；许岗和朱敏，2003，中国专利申请公开号CN 1428424A：2,500酶单位每升发酵液)。因此，低成本、大量制备该两个酶是工业化生产7-氨基头孢霉烷酸之关键。

目前限制大规模酶法制备7-氨基头孢霉烷酸的另一因素在于现有的操作工艺复杂，成本较高。例如，目前工业界使用的RocheDiagnostics公司所生产的有关产品及其工艺(CC2 Twin EnzymeProcess：D-AOD，产品号：1462865；Gl-Ac，产品号：1464213，RocheDiagnostics)操作步骤较复杂(见图1)；除上述的氧化酶和酰化酶外，尚需下列额外步骤：(1)由于Roche Diagnostics公司之D-氨基酸氧化酶不纯，故在氧化反应结束后，仍有较大量α-酮己二酸单酰-7-氨基头孢霉烷酸(α-ketoadipyl-7-ACA)不能转成戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸，因此需外加过氧化氢将之转化成戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸；(2)但由于过氧化氢一方面会使酶活性丧失，另方面会氧化头孢菌素C和戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸，令最终7-氨基头孢霉烷酸的产率降低，所以需再外加过氧化氢酶去降解残留之过氧化氢。

此外，中国专利申请公开号为CN1104255的专利文献也公开了一种制备7-氨基头孢霉烷酸的方法，在该现有技术的方法中，因使用了含氨苄青霉素抗性基因的表达载体，其发酵产物含β-内酰胺酶，会大大降低7-氨基头孢霉烷酸的产率，因此还需在制备7-氨基头孢霉烷酸的过程中添加β-内酰胺酶抑制剂；并且，其所使用的细胞体系还产生能分解过氧化氢的过氧化氢酶，因此在制备过程中不仅要加入过氧化氢还要加入过氧化氢酶抑制剂。这些使得其操作步骤较复杂、成本较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种步骤简单、成本低、产率高的用于制备7-氨基头孢霉烷酸的两步酶法。

为实现上述目的，本发明的技术方案提供了一种从头孢菌素C制备7-氨基头孢霉烷酸的方法，包括用D-氨基酸氧化酶催化头孢菌素C至戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸的第一步反应和用戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶催化戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸至7-氨基头孢霉烷酸的第二步反应，其特征在于，所述D-氨基酸氧化酶为经纯化的、具有序列号2所示氨基酸序列的三角酵母(Trigonopsis variabilis)D-氨基酸氧化酶突变体。

在上述技术方案中，优选的是，在所述第一步反应中不添加过氧化氢，进一步优选的是，所述D-氨基酸氧化酶是由具有序列号3所示DNA序列的表达载体pHS-GHA表达的，D-氨基酸氧化酶的纯化步骤包括依次通过DEAE-纤维素离子交换树脂纯化以及通过硫酸铵沉淀纯化。更优选的是，在所述第一步反应和第二步反应中，不添加选自抗坏血酸、3-氨基-1，2，3-***、过硼酸钠和叠氮化钠的β-内酰胺酶抑制剂，在所述第一步反应中不添加选自舒巴坦钠、棒酸、硼酸及其衍生物的过氧化氢酶抑制剂，在所述第二步反应中不添加过氧化氢酶。

优选的是，所述D-氨基酸氧化酶是固相化的，或所述戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶是固相化的，或者D-氨基酸氧化酶和戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶都是固相化的。

更优选的是，所述戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶为假单孢菌(Pseudomonas sp.)SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶，所述假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶是由具有序列号4所示DNA序列的表达载体pT7-kan-ACY表达的

本发明的优点在于：(1)本发明方法中的经纯化的、具有序列号2所示氨基酸序列的三角酵母(Trigonopsis variabilis)D-氨基酸氧化酶突变体，其比活比亲本D-氨基酸氧化酶高105％；(2)本发明方法中的大肠杆菌载体pHS-GHA和pT7-kan-ACY，其发酵产物中不含有β-内酰胺酶，因而不需外加β-内酰胺酶抑制剂，减低了生产成本和简化了工序；(3)本发明方法中的D-氨基酸氧化酶几乎不含过氧化氢酶，因此不需外加过氧化氢酶抑制剂，并且在反应过程中α-酮己二酸单酰-7-氨基头孢霉烷酸的生成量很低，因而不需外加过氧化氢和过氧化氢酶，减低了生产成本和简化了工序；(4)使用本发明的两步固相酶法转化头孢菌素C至7-氨基头孢霉烷酸，克分子转化率可达93％以上，较Roche Diagnostics公司之产品(克分子转化率为82％)高约12％。

附图说明

图1为现行头孢菌素C转化成7-氨基头孢霉烷酸的反应流程。

图2为表达载体pHS-GHA。

图3为表达载体pT7-kan-ACY。

图4为表达载体pRSET-lac-GI-hok/sok-kan。

图5为D-氨基酸氧化酶突变体GHA的SDS-PAGE电泳图。其中，1代表：蛋白质分子量标记(BenchMark^TM Pre-Stained ProteinLadder(Invitrogen))，单位是KDa；2代表：粗纯D-氨基酸氧化酶突变体GHA；3代表：纯化的D-氨基酸氧化酶突变体GHA。

图6为D-氨基酸氧化酶突变体GHA转化头孢菌素C至戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸的HPLC图谱。

图7为假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶的SDS-PAGE电泳图。其中，1代表：蛋白质分子量标(BenchMark^TMPre-Stained Protein Ladder(Invitrogen))，单位是KDa；2代表：粗纯假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶。

图8为假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶转化戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸至7-氨基头孢霉烷酸的HPLC图谱。

图9为两步固相酶转化头孢菌素C至7-氨基头孢霉烷酸的HPLC图谱。

具体实施方式

实施例1：表达载体pRSET-kan的构建

根据pRSET-A(可购自Invitrogen)的序列设计PCR引物，具体为：

上游引物VET-F：5’-CTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAG-3’；

下游引物VET-R：5’-ACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3’。

根据pET28b(可购自Novagen)的序列设计PCR引物，具体为上游引物KAN-F：5’-ATGAGCCATATTCAACGGGAAAC-3’；下游引物KAN-R：5’-TTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG-3’。

扩增去除氨苄青霉素抗性基因的pRSET-A片段的PCR条件为：50ng pRSET-A(Invitrogen)，0.4μM VET-F，0.4μM VET-R，50μMdATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM (NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5U Pfu DNA聚合酶(Promega)，用无菌水调反应体积至50μL。PCR扩增反应程序为：94℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，4分钟，循环35次；72℃，10分钟。

扩增卡那霉素抗性基因的PCR条件为：50ng pET28b(Novagen)，0.4μM KAN-F，0.4μM KAN-R，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM (NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5U Pfu DNA聚合酶(Promega)，用无菌水调反应体积至50μL。PCR扩增反应程序为：94℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，4分钟，循环35次；72℃，10分钟。

用0.8％琼脂糖电泳提纯PCR产物(去除氨苄青霉素抗性基因的pRSET-A片段的PCR产物长2,036bp；卡那霉素抗性基因的PCR产物长816bp)，连接该两片段得pRSET-kan。将pRSET-kan转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，在卡那霉素(50μg/mL)LB(1％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母浸膏)平板上于37℃培养过夜。按照Molecular Cloning-A Laboratory Manual(Sambrook，J.et al.，1989，CSHL Press)描述的方法提取质粒。

实施例2：载体pRSET-lac-kan的构建

根据pGEMT-Easy(Promega)的序列设计PCR引物，具体为：

上游引物RBS-Nde I：5’-CATATGTATATCTGTGTGAAATTG-3’(NdeI酶切位点以下划线表示，外加的核蛋白体结合位点以下间虚线表示)；

下游引物RBS-AlwNI：5’-CAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTC-3’(AlwNI酶切位点以下划线表示)。

以pGEMT-Easy(Promega)为模板，用上述引物进行PCR，扩增得到一755bp产物。PCR条件为：50ng pGEMT-Easy(Promega)，0.4μMRBS-NdeI，0.4μM RBS-AlwNI，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM (NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5U Pfu DNA聚合酶(Promega)，用无菌水调反应体积至50μL。PCR扩增反应程序为：94℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，4分钟，循环35次；72℃，10分钟。

该PCR产物(755bp)在5’端含有NdeI酶切位点和核蛋白体结合位点及在3’端含有AlwNI酶切位点。用0.8％琼脂糖电泳提纯，NdeI和AlwNI酶切后，与经NdeI和AlwNI酶切的pRSETA(Invitrogen)连接，得pRSET-lac。将pRSET-lac转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，在氨苄青霉素(100μg/mL)LB(1％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母浸膏)平板上于37℃培养过夜。按照MolecularCloning-A Laboratory Manual(Sambrook，J.et al.，1989，CSHLPress)描述的方法提取质粒。

用AlwNI和EcoRI酶切pRSET-lac和pRSET-kan，用0.8％琼脂糖电泳提纯各DNA片段并连接，得pRSET-lac-kan。将pRSET-lac-kan转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，在卡那霉素(50μg/mL)LB琼脂平板上于37℃培养过夜。按照Molecular Cloning-A LaboratoryManual(Sambrook，J.et al.，1989，CSHL Press)描述的方法提取质粒。

实施例3：载体pGEMT-Easy-GI的构建

根据已知的Thermoanaerobacterium saccharolyticum glucoseisomerase DNA序列(GenBank L09699)，设计PCR引物，具体为：上游引物(GI-NdeI)：

5’-CATATGAATAAATATTTTGAGAACGTATCTAAAATA-3’

(NdeI酶切位点以下划线表示)；

下游引物(GI-EcoRI)：5’-GATATCTTAA

TTATTCTGCAAAC-3’(EcoRI酶切位点以下划线表示，AscI酶切位点以双下划线表示)。

以Thermoanaerobacterium saccharolyticum(购自ATCC，USA)DNA为模板，用上述引物进行PCR，扩增得到一1,336bp产物。PCR条件为：50ng T.saccharolyticum DNA，0.4μM GI-NdeI，0.4μM GI-EcoRI，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM (NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5U Platinum Taq High Fidelity DNA聚合酶(Invitrogen)，用无菌水调反应体积至50μL。PCR扩增反应程序为：95℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，3分钟，循环35次；72℃，10分钟。

该PCR产物(1,336bp)在5’和3’端分别含有NdeI和EcoRI酶切位点。PCR产物经0.8％琼脂糖电泳提纯，利用TA克隆方法，与pGEMT-Easy(Promega)连接，得pGEMT-Easy-GI。将pGEMT-Easy-GI转化感受态大肠杆菌DH5α(Invitrogen)，在氨苄青霉素(100μg/mL)LB琼脂平板上于37℃培养过夜。按照Molecular Cloning-A LaboratoryManual(Sambrook，J.et al.，1989，CSHL Press)描述的方法提取质粒。实施例4：载体pRSET-lac-GI-hok/sok-kan(见图4)的构建

用NdeI和EcoRI酶切pGEMT-Easy-GI，经0.8％琼脂糖电泳提纯，与经NdeI和EcoRI酶切的pRSET-lac-kan连接，得pRSET-lac-GI-kan。将pRSET-lac-GI-kan转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，在卡那霉素(50μg/mL)LB琼脂平板上于37℃培养过夜。按照MolecularCloning-A Laboratory Manual(Sambrook，J.et al.，1989，CSHLPress)描述的方法提取质粒。

根据已知hok/sok基因片段序列(GenBank X05813)设计10条引物(见表1)。PCR基因构造根据Kikuchi，M.et al.，1999，Gene236：159-167所述，唯具体步骤有变更。PCR条件为：20ng各个引物，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM (NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5U Pfu DNA聚合酶(Promega)，用无菌水调反应体积至50μL。

PCR扩增反应程序为：95℃，4分钟；94℃，1.5分钟，50℃，1.5分钟，72℃，5分钟，循环30次；72℃，10分钟，得一PCR产物长580bp，在其5’和3’端分别含有AscI及EcoRI酶切位点。PCR产物经0.8％琼脂糖电泳提纯，AscI及EcoRI酶切后，与经AscI及EcoRI酶切的pRSET-lac-GI-kan连接，得pRSET-lac-GI-hok/sok-kan。将pRSET-lac-GI-hok/sok-kan转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，在卡那霉素(50μg/mL)LB琼脂平板上于37℃培养过夜。按照Molecular Cloning-A Laboratory Manual(Sambrook，J.et al.，1989，CSHL Press)描述的方法提取质粒，测定其DNA序列如序列号7所示。其中数个核苷酸有改动：1368(C->G)；1513(缺失了T)；1804(A->T)；1826(C->T)；2479(G->T)；2555(T->A)；3860(C->T)。

表1

序号	引物序列
		1	5’-ttggcgcgccttaagatatcaacaaactccgggaggcagcgtgatgcggcaacaatcacacggatttcccgtgaa-3’
2	5’-catatacctgcacgctgaccacactcactttccctgaaaataatccgctcattcagaccgttcacgggaaatccgtgtga-3’
		3	5’-ggtcagcgtgcaggtatatgggctatgatgtgcccggcgcttgaggctttctgcctcatgacgtgaaggtggtttgttgc-3’
4	5’-cgtggtggttaatgaaaattaacttactacggggctatcttctttctgccacacaacacggcaacaaaccaccttcacgt-3’
		5	5’-aattttcattaaccaccacgaggcatccctatgtctagtccacatcaggatagcctcttaccgcgctttgcgcaaggaga-3’

6	5’-tgagacacacgatcaacacacaccagacaagggaacttcgtggtagtttcatggccttcttctccttgcgcaaagcgcgg-3’
		7	5’-tgtgttgatcgtgtgtctcacactgttgatattcacttatctgacacgaaaatcgctgtgcgagattcgttacagagacg-3’
8	5’-cgcctccaggttgctacttaccggattcgtaagccatgaaagccgccacctccctgtgtccgtctctgtaacgaatctcg-3’
		9	5’-taagtagcaacctggaggcgggcgcaggcccgccttttcaggactgatgctggtctgactactgaagcgcctttataaag-3’
10	5’-cggaattcacaacatcagcaaggagaaaggggctaccggcgaaccagcagcccctttataaaggcgcttcagt-3’

实施例5：含有D-氨基酸氧化酶基因重组质粒pRSET-A-DAO的构建

根据已知三角酵母D-氨基酸氧化酶基因5’和3’端序列(Gonzalez，F.J.，Montes，J.，Martin，F.，Lopez，M.C.，Ferminan，E.，Catalan，J.，Galan，M.A.Dominguez，A.Molecular cloningof TvDAO1，a gene encoding a D-amino acid oxidase fromTrigonopsis variabilis and its expression in Saccharomycescerevisiae and Kluyveromyces lactis.Yeast 13：1399-1408；1997)设计引物如下：

5’-NdeI(引入NdeI酶切位点)：

5’-TAGGGCTGACATATGGCTAAAATCGTTGTTATTGGTGC-3’；

3’-Bgl II(引入Bgl II酶切位点)：

5’-TAGGGCTGAAGATCTCTAAAGGTTTGGACGAGTAAGAGC-3’。

以质粒pJL(杨藴刘等，中国专利申请公开号：CN 1371999A)为模板，用以上两个引物，在Pfu DNA聚合酶(Promega)的作用下，合成三角酵母D-氨基酸氧化酶基因。pJL携带有三角酵母FA10D-氨基酸氧化酶基因(Li，W.et al.，Acta Microbiologica Sinica31：251-253，1991)。PCR反应条件为：40ng pJL，0.4μM 5’-NdeI，0.4μM 3’-BglII，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM (NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5U Pfu DNA聚合酶，用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为：94℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，2分钟，循环10次；94℃，1分钟，60℃，1分钟，72℃，2分钟，循环25次72℃，10分钟。

得1,098bp长PCR产物，其5’和3’端分别具有NdeI和BglII限制性酶切位点。PCR产物经1％琼脂糖电泳提纯，NdeI及BglII酶切后，与经NdeI及BglII酶切质粒pRSET-A(Invitrogen)得到的2.9Kb的片段连接，得连接产物pRSET-A-DAO。将pRSET-A-DAO转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，在氨苄青霉素LB平板上37℃培养，按照Molecular Cloning-A Laboratory Manual，ed.By J.Sambrook，et.al.，1989，CSHL Press)描述的方法提取质粒，经DNA测序，确定三角酵母D-氨基酸氧化酶基因DNA序列如序列号5所示，其推测出的氨基酸序列如序列号6所示。

实施例6：含有D-氨基酸氧化酶突变体GHA的表达载体的构建

D-氨基酸氧化酶突变体GHA由定点突变构建。定点突变技术主要参考PCR Protocols(编者：John M.S.Bartlett and DavidStirling.Totowa，N.J.：Humana Press，2003.)一书的描述。

根据实施例5克隆的三角酵母D-氨基酸氧化酶基因之序列(序列号5)，设计引物如下：

引物A：5’-TAGGGCTGACATATGGCTAAAATCGTTGTTATTG-3’；

引物B：5’-TAGGGCTGAAGATCTCTAAAGGTTTGGACGAG-3’；

引物C1：5’-GCAGGTGCCAACTGGCTCCCGTTTTACGATGGAGGCAAG-3’；

引物D：5’-GAGCCAGTTGGCACCTGCCCAAGG-3’。

引物A和B是一对外引物。引物A包含NdeI酶切位点，并有部份碱基与D-氨基酸氧化酶基因5’端序列交迭；引物B包含BglII酶切位点，并有部份碱基与D-氨基酸氧化酶基因3’端序列交迭。引物C1和D是内引物。引物C1将亲本D-氨基酸氧化酶基因53位之苏氨酸转变成脯氨酸。引物D部分碱基与引物C1的序列交迭。

利用聚合酶链式反应，以pRSET-A-DAO为模板，用引物对A和D扩增模板片段1；用引物对B和C1扩增模板片段2。扩增反应条件为：20ng pRSET-A-DAO，20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM (NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，0.4μM引物A和0.4μM引物D(扩增模板片段1)或0.4μM引物B和0.4μM引物C1(扩增模板片段2)，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，1.5U Pfu DNA聚合酶，用无菌水调反应体积至50μl。聚合酶链式反应扩增程序为：94℃，2分钟；94℃，1分钟，53℃，1分钟，72℃，1分钟，循环30次72℃，10分钟。

扩增得到的模板片段1和模板片段2，经1％琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，用以扩增全长基因。扩增全长基因的反应条件为：20ng模板片段1，20ng模板片段2，20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM (NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，0.4μM引物A和0.4μM引物B，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，1.5U Pfu DNA聚合酶，用无菌水调反应体积至50μl。聚合酶链式反应扩增程序为：94℃，2分钟；94℃，1分钟，53℃，1分钟，72℃，2分钟，循环35次；72℃，10分钟。

全长扩增反应得到D-氨基酸氧化酶突变体GHA基因，经NdeI及BglII酶切后连接到pRSET-kan得连接产物pRSET-kan-DAOGHA，将pRSET-kan-DAOGHA转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，卡那霉素LB平板37℃培养，提取质粒，经DNA测序确定引入的突变无误，确定D-氨基酸氧化酶突变体GHA的DNA序列如序列号1所示，其推测出的氨基酸序列如序列2所示。

实施例7：载体pHS-GHA(见图2)的构建

用NdeI和BglII酶切质粒pRSET-kan-DAOGHA，得一1,074bp基因片段(内含D-氨基酸氧化酶突变体GHA基因)，经0.8％琼脂糖电泳提纯，与经NdeI和BglII酶切的pRSET-lac-GI-hok/sok-kan得到的长片断连接，得pHS-GHA。将pHS-GHA转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，得菌株BL-HS-GHA，在卡那霉素(50μg/mL)LB琼脂平板上于37℃培养过夜。按照Molecular Cloning-ALaboratory Manual(Sambrook，J.et al.，1989，CSHL Press)描述的方法提取质粒，测定其DNA序列如序列号3所示。其中数个核苷酸有改动：1390(C->G)；1535(缺失了T)；1826(A->T)；1848(C->T)；2501(G->T)；2577(T->A)；3882(C->T)。

实施例8：载体pT7-kan-ACY(见图3)的构建

根据已知的假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶DNA序列(Matsuda，A.et al.，1987，J.Bacteriol.169，5821-5826)，设计PCR引物如下：

上游引物(NdeI-ACY)：5’-CATATGAACGCTCCCGTCCCCGTCCC-3’，NdeI酶切位点以下划线表示；

下游引物(BglII-ACY)：5’-AGATCTTCAGATGGTGAAGCGGGCAC-3’，BglII酶切位点以下划线表示。

以假单孢菌SE83DNA为模板，用上述引物进行PCR，扩增得到一1,676bp产物。PCR条件为：50ng假单孢菌SE83DNA，0.4μMNdeI-ACY，0.4μM BglII-ACY，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM (NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5U Pfu DNA聚合酶(Promega)，用无菌水调反应体积至50μL。

PCR扩增反应程序为：95℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，3分钟，循环35次；72℃，10分钟。

该PCR产物(1,676bp)在5’和3’端分别含有NdeI和BglII酶切位点。PCR产物经0.8％琼脂糖电泳提纯，NdeI和BglII酶切后，与经NdeI和BglII酶切的pRSET-kan连接，得pT7-kan-ACY。将pT7-kan-ACY转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，得菌株BL-T7K-ACY，在卡那霉素(50μg/mL)LB琼脂平板上于37℃培养过夜。按照Molecular Cloning-A Laboratory Manual(Sambrook，J.et al.，1989，CSHL Press)描述的方法提取质粒，测定其DNA序列如序列号4所示。其中四个核苷酸有改动：2260(G->T)；2336(T->A)；3641(C->T)；4117(G->C。

实施例9：D-氨基酸氧化酶突变体GHA之发酵培养基及发酵工艺

从卡那霉素(50μg/mL)LB琼脂平板上挑取单菌落大肠杆菌BL-HS-GHA(见实施例7)，接种到2×5mL含卡那霉素(50μg/mL)的液体LB培养基，在37℃培养8小时(摇床转速为250转每分钟)，再接种至2×50mL种子培养基含卡那霉素(100g/mL)和氯霉素(40μg/mL)，在30℃培养16小时(摇床转速为400转每分钟)。

玉米浆1之制备：

将300g玉米浆(购自华北制药康欣有限公司)溶于300mL蒸馏水，搅拌后离心(5,000g，8分钟)，上清液即为玉米浆1。沉淀物留用。

玉米浆2之制备：

将上述沉淀物再溶于600mL蒸馏水，搅拌后离心(5,000g，8分钟)，上清液即为玉米浆2。

50mL种子培养基中各成分重量如下：

玉米浆1 4mL

玉米浆2 4mL

酵母浸膏 0.2g

硫酸铵 0.075g

磷酸氢二钠 0.25g

磷酸二氢钾 0.04g

氯化钠 0.075g

将各成分溶于50mL蒸馏水，以10N氢氧化钠调pH值至7.15，高温消毒。

种子过夜发酵后，将全部100mL之种子接种至2L发酵罐(BIOENGINEERING，Benchtop Fermentor，KLF2000)含卡那霉素(50μg/mL)。

2L发酵培养基中各成分重量如下：

玉米浆1 160mL

玉米浆2 160mL

酵母浸膏 8g

硫酸铵 3g

磷酸氢二钠 10g

磷酸二氢钾 1g

氯化钠 3g

将各成分溶于1.9L蒸馏水，以10N氢氧化钠调pH值至7.15，于2L发酵罐(BIOENGINEERING，Benchtop Fermentor，KLF2000)高温消毒。

将12.5g葡萄糖溶于50mL蒸馏水，高温消毒；将1.25g硫酸镁溶于50mL蒸馏水，高温消毒。

发酵前把已消毒的葡萄糖和硫酸镁放进2L发酵罐。

补料之制备：

将250mL玉米浆1和250mL玉米浆2混合，以10N氢氧化钠调pH值至7.25，高温消毒。

将2.25g硫酸铵，7.56g磷酸氢二钠，1.2g磷酸二氢钾，2.25g氯化钠溶于60mL蒸馏水，高温消毒。

将15g酵母浸膏溶于100mL蒸馏水，高温消毒。

将70g葡萄糖溶于140mL蒸馏水，高温消毒。

将30mL甘油混合10mL蒸馏水，高温消毒。

将20g硫酸镁溶于30mL蒸馏水，高温消毒。

将所有溶液混合，加入卡那霉素至浓度为50μg/mL，加入2mL消泡剂。

在35℃生长，在初始的6小时，pH值由6.9自然上升至7.2，开始补料(50mL/小时)。在平衡条件下(以5N氢氧化钾将pH值维持在7.2，溶氧水平pO₂不大于0.5％)，继续生长26小时。

实施例10：粗纯D-氨基酸氧化酶突变体GHA之提取

按实施例9发酵后，细菌在4℃经离心机分离(5,000g，8分钟)，弃上清液，得220g细菌(湿重)，将细菌重悬于600mL磷酸钠缓冲液(50mM，pH7.5)。用珠磨法裂解细菌，以50mL每分钟之速度把细菌重悬液送进珠磨机(DYNO-MILL TYP KDL，0.2mm直径玻璃珠，WA Bachofen)内，最后再以800mL磷酸钠缓冲液(50mM，pH7.5)把细菌残留冲洗出来。将细菌裂解液放在55℃水浴中浸泡30分钟，以高速离心(10,000g，30分钟)，取上清液，即为粗纯之D-氨基酸氧化酶突变体GHA。取样并采用SDS-PAGE检测目标蛋白的纯度和含量(见图5)。如图所示，粗纯之D-氨基酸氧化酶突变体GHA约占总可溶蛋白40％。

实施例11：D-氨基酸氧化酶突变体GHA之提纯

取按实施例10提取之粗纯D-氨基酸氧化酶突变体GHA，加入甘油至最终浓度为10％，用5N氢氧化钠调pH值至8，离心(13,000g，30分钟)，取上清液。按产品供应商所述产品制备法配备DEAE-纤维素离子交换树脂(Sigma，D-0909)。按每1mL粗纯酶混合0.5mL DEAE-纤维素离子交换树脂，在4℃搅拌5小时(100转每分钟)，用滤斗(Buchner filter funnel，120mm P1)将酶液滤去。以3份DEAE-纤维素离子交换树脂体积之40mM磷酸二氢钠缓冲液(含10％甘油)冲洗DEAE-纤维素离子交换树脂，再用2份DEAE-纤维素离子交换树脂体积之400mM磷酸二氢钠缓冲液将D-氨基酸氧化酶突变体GHA洗脱出来。按每1L洗脱之D-氨基酸氧化酶突变体GHA，加入262g硫酸铵，在室温搅拌15分钟(100转每分钟)。离心(13,000g，15分钟)，弃上清液，保留沉淀物。将沉淀物溶于10mM磷酸二氢钠缓冲液(pH7.5)。取样并采用SDS-PAGE检测目标蛋白的纯度和含量(见图5)。如图所示，提取之D-氨基酸氧化酶突变体GHA约占总可溶蛋白90％。

实施例12：D-氨基酸氧化酶突变体GHA活性的检测

检测基本按Isogai，T.et al.，1990，J.Biochem.[Tokyo]108，1063-1069所述之方法，其中具体步骤有变更。将按实施例11纯化的D-氨基酸氧化酶突变体GHA用磷酸钠缓冲液(50mM，pH7.5)稀释10倍，取2mL，与相同体积之150mM头孢菌素C钠盐混合，在37℃下反应，反应中保持搅拌(搅拌速度为450转每分钟)，并用5N氢氧化钠将pH值保持在7.5。反应开始后在不同时间(0，15，30，45分钟，见图6)抽取100μL样本，与10μL 3％过氧化氢混匀，再加入50μL 10％三氯醋酸，混匀以终止反应。离心(10,000g，3分钟)，取10μL上清液混合990μL HPLC流动相(50mM磷酸钾，pH7；5％乙腈)。用HPLC检测酶反应，条件如下：

HPLC色谱柱：Diamonsil^TM C18，250×4.6mm(迪马公司，北京)

柱温度：30℃

流速：1mL每分钟

检测：260nm

一单位D-氨基酸氧化酶活性定义为在上述条件每分钟转化一微摩尔头孢菌素C钠盐至戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸的酶量。

获得之D-氨基酸氧化酶突变体GHA总活性为95,607单位，即每升发酵液含35,410单位。

实施例13：固相D-氨基酸氧化酶突变体GHA之制备

按实施例11所述纯化D-氨基酸氧化酶突变体GHA。固相D-氨基酸氧化酶突变体GHA之制备参照载体供应商意大利Resindion S.R.L.的说明进行，其中具体步骤有变更。

载体活化：取10g Sepabeads HA湿载体，加入30mL磷酸二氢钾缓冲液(100mM，pH8)，在室温下搅拌(300转，15分钟)后，用5N氢氧化钠调pH值至8，静置。将载体过滤，用40mL磷酸钾缓冲液(20mM，pH8)搅拌洗涤5分钟，再过滤并抽干。将载体加入40mL 2％戊二醛溶液，在室温下搅拌(300转，60分钟)，静置。将载体过滤，用40mL磷酸钾缓冲液(20mM，pH8)搅拌洗涤5分钟，再过滤并抽干。重复此洗涤步骤5次，为活化湿载体。

酶固相化：按比例混合活化湿载体和纯化D-氨基酸氧化酶突变体GHA(每10g活化湿载体混合100mL纯化D-氨基酸氧化酶突变体GHA)，在室温下搅拌(300转，1分钟)后，用1N氢氧化钠调pH值至8，再搅拌18小时，静置。将载体过滤，将固相产物用40mL磷酸钾缓冲液(20mM，pH8)搅拌洗涤2分钟，再过滤。将固相产物用40mL氯化钠溶液(0.5M氯化钠溶于20mM磷酸钾缓冲液，pH8)搅拌洗涤20分钟，过滤。重复此洗涤步骤直至洗涤液中蛋白量少于0.1mg/mL。将固相产物用40mL磷酸钾缓冲液(20mM，pH8)搅拌洗涤2分钟，过滤及抽干后，得115g固相D-氨基酸氧化酶突变体GHA。固相酶活性之检测基本上与实施例12所述相同，其中所用反应液体积为200mL的75mM头孢菌素C钠盐，加入4g固相D-氨基酸氧化酶突变体GHA，测得活性为77单位/g湿载体。

实施例14：假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶的发酵培养基及发酵工艺

从卡那霉素(50μg/mL)LB琼脂平板上挑取单菌落大肠杆菌BL-T7K-ACY(见实施例8)，接种到2×5mL含卡那霉素(50μg/mL)的液体LB培养基，在37℃培养8小时(摇床转速为250转每分钟)，再接种至2×50mL种子培养基含卡那霉素(50μg/mL)，在30℃培养16小时(摇床转速为400转每分钟)。

50mL种子培养基中各成分重量如下：

酵母浸膏 0.35g

磷酸氢二纳 0.35g

磷酸二氢钾 0.35g

磷酸氢二钾 0.48g

硫酸铵 0.06g

氯化铵 0.01g

甘油 0.5mL

氯化钙 0.00055g

将各成分溶于50mL蒸馏水，高温消毒。

种子过夜发酵后，将全部100mL之种子接种至2L发酵罐(BIOENGINEERING，Benchtop Ferment or，KLF2000)含卡那霉素(50μg/mL)。

2L发酵培养基中各成分重量如下：

酵母浸膏 14g

磷酸氢二纳 14g

磷酸二氢钾 14g

磷酸氢二钾 19.2g

硫酸铵 2.4g

氯化铵 0.4g

甘油 20mL

氯化钙 0.022g

将各成分溶于2L蒸馏水，于2L发酵罐(BIOENGINEERING，Benchtop Fermentor，KLF2000)高温消毒。

将1g硫酸镁溶于20mL蒸馏水，高温消毒；将0.14g氯化锌溶于20mL蒸馏水，高温消毒。

发酵前把已消毒的硫酸镁和氯化锌放进2L发酵罐。

补料之制备：

酵母浸膏 14g

磷酸氢二纳 4.9g

磷酸二氢钾 4.9g

磷酸氢二钾 6.4g

硫酸铵 0.84g

氯化铵 0.14g

甘油 175mL

氯化钙 0.008g

将各成分溶于700mL蒸馏水，高温消毒。

将0.34g硫酸镁溶于20mL蒸馏水，高温消毒后，加进已消毒之700mL之补料。

进行补料前，将硫酸镁加入补料，加卡那霉素至最终浓度为50μg/mL，放入2mL消泡剂。

在30℃生长，在初始的4小时内，以5N氢氧化钾将pH值由6.9缓慢调升至7.2。当OD₆₀₀值达至4时，开始补料(60mL/小时)。在之后的4小时内再用5N氢氧化钾将pH值调升至7.4。当OD₆₀₀值达至8时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，Sigma)至0.1mM。以5N氢氧化钾将pH值维持在7.4，溶氧水平pO₂维持在30％，继续生长26小时。

实施例15：假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶之提纯

按实施例14发酵后，细菌在4℃经离心机分离(5,000g，8分钟)，弃上清液，得130g细菌(湿重)，将细菌重悬于400mL磷酸钠缓冲液(50mM，pH8)。用珠磨法裂解细菌，以50mL每分钟之速度把细菌重悬液送进珠磨机(DYNO-MILL TYP KDL，0.2mm直径玻璃珠，WA Bachofen)内，最后再以600mL磷酸钠缓冲液(50mM，pH8)把细菌残留冲洗出来。将细菌裂解液放在55℃水浴中浸泡15分钟，以高速离心(10,000g，30分钟)，取上清液，即为粗纯之假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶。取样并采用SDS-PAGE检测目标蛋白的纯度和含量(见图7)。如图所示，粗纯之假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶约占总可溶蛋白40％。

实施例16：假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶活性的检测

检测基本按Binder，R.et al.，1994，Appl.Environ.Microbiol.60，1805-1809所述之方法，其中具体步骤有变更。将按实施例15提取的假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶用磷酸钠缓冲液(50mM，pH8)稀释10倍，与相同体积之150mM戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸(制备方法参见Shibuya，Y.et al.，1981，Agric.Biol.Chem.45，1561-1567)混合，在37℃下反应，反应中保持搅拌(搅拌速度为450转每分钟)，并用5N氢氧化钠将pH值保持在8。反应开始后在不同时间(0，15，30，45分钟，见图8)抽取60μL样本，与30μL 10％三氯醋酸混匀以终止反应。离心(10,000g，3分钟)，取10μL上清液混合990μL HPLC流动相(50mM磷酸钾，pH7；5％乙腈)。用HPLC检测酶反应，条件和实施例12相同。

一单位戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶活性定义为在上述条件每分钟转化一微摩尔戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸至7-氨基头孢霉烷酸的酶量。

获得之假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶总活性为24,882单位，即每升发酵液含9,570酶单位。

实施例17：固相假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶之制备

按实施例15所述制备假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶。固相假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶之制备参照载体供应商德国Rhm公司的说明进行，其中具体步骤有变更。取10g Eupergit C250L湿载体混合100mL假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶，在室温下搅拌(300转，72小时)，静置。过滤，用100mL蒸馏水在室温下搅拌洗涤(300转，2分钟)，用3号砂芯漏斗抽干，重复此洗涤步骤直至过滤液中蛋白量少于0.1mg/mL，得80g固相假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶。固相酶活性之检测基本上与实施例16所述相同，其中所用反应液体积为200mL 75mM戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸，加入6g固相假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶，测得活性为50单位/g湿载体。

实施例18：两步固相酶转化头孢菌素C至7-氨基头孢霉烷酸

制备1L 75mM头孢菌素C钠盐水溶液，加入40g按实施例13制备之固相D-氨基酸氧化酶突变体GHA，在室温搅拌(250转每分钟，供氧量为0.3m3每小时)1小时，用3M氨水(NH₄OH)调pH值为7.5。过滤反应液，加入50g按实施例17制备之固相假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶，在室温搅拌(250转每分钟)1小时，用3M氨水调pH值为8。用HPLC检测反应产物7-氨基头孢霉烷酸，条件和实施例16相同。HPLC图谱见图9。如图9所示，整个转化过程为120分钟，在反应开始60分钟后，绝大部分头孢菌素C被D-氨基酸氧化酶突变体GHA转化成戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸(见图9，GL-7-ACA，60分钟峰)。反应继续进行60分钟后，绝大部分戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸被假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶转化成7-氨基头孢霉烷酸(见图9，7-ACA，120分钟峰)。根据HPLC数据计算，由头孢菌素C转化成戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸之产率为97.96％；由戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸转化成7-氨基头孢霉烷酸之产率为95.78％。由头孢菌素C经两步酶法转化成7-氨基头孢霉烷酸之总产率为93.83％。

本发明不受上述具体文字描述的限制。本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变，这些改变均在本发明的范围之内。

序列表

<110>百瑞全球有限公司

<120>一种用于制备7-氨基头孢霉烷酸的两步酶法

<130>FI-050351-59

<160>7

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1071

<212>DNA

<213>Trigonopsis variabilis

<400>1

atggctaaaa tcgttgttat tggtgccggt gttgccggtt taactacagc tcttcaactt 60

cttcgtaaag gacatgaggt tacaattgtg tccgagttta cgcccggtga tcttagtatc 120

ggatatacct cgccttgggc aggtgccaac tggctcccgt tttacgatgg aggcaagtta 180

gccgactacg atgccgtctc ttatcctatc ttgcgagagc tggctcgaag cagccccgag 240

gctggaattc gactcatcaa ccaacgctcc catgttctca agcgtgatct tcctaaactg 300

gaaggtgcca tgtcggccat ctgtcaacgc aacccctggt tcaaaaacac agtcgattct 360

ttcgagatta tcgaggacag gtccaggatt gtccacgatg atgtggctta tctagtcgaa 420

tttgcttccg tttgtatcca caccggagtc tacttgaact ggctgatgtc ccaatgctta 480

tcgctcggcg ccacggtggt taaacgtcga gtgaaccata tcaaggatgc caattttcta 540

cactcctcag gatcacgccc cgacgtgatt gtcaactgta gtggtctctt tgcccggttc 600

ttgggaggcg tcgaggacaa gaagatgtac cctattcgag gacaagtcgt ccttgttcga 660

aactctcttc cttttatggc ctccttttcc agcactcctg aaaaagaaaa tgaagacgaa 720

gctctatata tcatgacccg attcgatggt acttctatca ttggcggttg tttccaatcc 780

aacaactggt catccgaacc cgatccttct ctcacccatc gaatcctgtc tagagccctc 840

gaccgattcc cggaactgac caaagatggc cctcttgaca ttgtgcgcga atgcgttggc 900

caccgtcctg gtagagaggg cggtccccga gtagaattag agaagatccc cggcgttggc 960

tttgttgtcc ataactatgg tgccgccggt gctggttacc agtcctctta cggcatggct 1020

gatgaagctg tttcttacgt cgaaagagct cttactcgtc caaaccttta g 1071

<210>2

<211>356

<212>PRT

<213>Trigonopsis variabilis

<400>2

Met Ala Lys Ile Val Val Ile Gly Ala Gly Val Ala Gly Leu Thr Thr

1 5 10 15

Ala Leu Gln Leu Leu Arg Lys Gly His Glu Val Thr Ile Val Ser Glu

20 25 30

Phe Thr Pro Gly Asp Leu Ser Ile Gly Tyr Thr Ser Pro Trp Ala Gly

35 40 45

Ala Asn Trp Leu Pro Phe Tyr Asp Gly Gly Lys Leu Ala Asp Tyr Asp

50 55 60

Ala Val Ser Tyr Pro Ile Leu Arg Glu Leu Ala Arg Ser Ser Pro Glu

65 70 75 80

Ala Gly Ile Arg Leu Ile Asn Gln Arg Ser His Val Leu Lys Arg Asp

85 90 95

Leu Pro Lys Leu Glu Gly Ala Met Ser Ala Ile Cys Gln Arg Asn Pro

100 105 110

Trp Phe Lys Asn Thr Val Asp Ser Phe Glu Ile Ile Glu Asp Arg Ser

115 120 125

Arg Ile Val His Asp Asp Val Ala Tyr Leu Val Glu Phe Ala Ser Val

130 135 140

Cys Ile His Thr Gly Val Tyr Leu Asn Trp Leu Met Ser Gln Cys Leu

145 150 155 160

Ser Leu Gly Ala Thr Val Val Lys Arg Arg Val Asn His Ile Lys Asp

165 170 175

Ala Asn Phe Leu His Ser Ser Gly Ser Arg Pro Asp Val Ile Val Asn

180 185 190

Cys Ser Gly Leu Phe Ala Arg Phe Leu Gly Gly Val Glu Asp Lys Lys

195 200 205

Met Tyr Pro Ile Arg Gly Gln Val Val Leu Val Arg Asn Ser Leu Pro

210 215 220

Phe Met Ala Ser Phe Ser Ser Thr Pro Glu Lys Glu Asn Glu Asp Glu

225 230 235 240

Ala Leu Tyr Ile Met Thr Arg Phe Asp Gly Thr Ser Ile Ile Gly Gly

245 250 255

Cys Phe Gln Ser Asn Asn Trp Ser Ser Glu Pro Asp Pro Ser Leu Thr

260 265 270

His Arg Ile Leu Ser Arg Ala Leu Asp Arg Phe Pro Glu Leu Thr Lys

275 280 285

Asp Gly Pro Leu Asp Ile Val Arg Glu Cys Val Gly His Arg Pro Gly

290 295 300

Arg Glu Gly Gly Pro Arg Val Glu Leu Glu Lys Ile Pro Gly Val Gly

305 310 315 320

Phe Val Val His Asn Tyr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Tyr Gln Ser Ser

325 330 335

Tyr Gly Met Ala Asp Glu Ala Val Ser Tyr Val Glu Arg Ala Leu Thr

340 345 350

Arg Pro Asn Leu

355

<210>3

<211>4723

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>表达载体pHS-GHA

<400>3

catatggcta aaatcgttgt tattggtgcc ggtgttgccg gtttaactac agctcttcaa 60

cttcttcgta aaggacatga ggttacaatt gtgtccgagt ttacgcccgg tgatcttagt 120

atcggatata cctcgccttg ggcaggtgcc aactggctcc cgttttacga tggaggcaag 180

ttagccgact acgatgccgt ctcttatcct atcttgcgag agctggctcg aagcagcccc 240

gaggctggaa ttcgactcat caaccaacgc tcccatgttc tcaagcgtga tcttcctaaa 300

ctggaaggtg ccatgtcggc catctgtcaa cgcaacccct ggttcaaaaa cacagtcgat 360

tctttcgaga ttatcgagga caggtccagg attgtccacg atgatgtggc ttatctagtc 420

gaatttgctt ccgtttgtat ccacaccgga gtctacttga actggctgat gtcccaatgc 480

ttatcgctcg gcgccacggt ggttaaacgt cgagtgaacc atatcaagga tgccaatttt 540

ctacactcct caggatcacg ccccgacgtg attgtcaact gtagtggtct ctttgcccgg 600

ttcttgggag gcgtcgagga caagaagatg taccctattc gaggacaagt cgtccttgtt 660

cgaaactctc ttccttttat ggcctccttt tccagcactc ctgaaaaaga aaatgaagac 720

gaagctctat atatcatgac ccgattcgat ggtacttcta tcattggcgg ttgtttccaa 780

tccaacaact ggtcatccga acccgatcct tctctcaccc atcgaatcct gtctagagcc 840

ctcgaccgat tcccggaact gaccaaagat ggccctcttg acattgtgcg cgaatgcgtt 900

ggccaccgtc ctggtagaga gggcggtccc cgagtagaat tagagaagat ccccggcgtt 960

ggctttgttg tccataacta tggtgccgcc ggtgctggtt accagtcctc ttacggcatg 1020

gctgatgaag ctgtttctta cgtcgaaaga gctcttactc gtccaaacct ttagagatct 1080

tttcttaggt cacatagcag gaatggatgc ttttgcaaaa ggctttaaag ttgcttacaa 1140

gcttgtgaaa gatggcgtat ttgacaagtt catcgaagaa agatacgcaa gctacaaaga 1200

aggcattggc gctgatattg taagcggtaa agctgacttc aagagccttg aaaagtatgc 1260

attagagcac agccagattg taaacaaatc aggcagacaa gagctattag aatcaatcct 1320

aaatcagtat ttgtttgcag aataaggcgc gccttaagat atcaacaaac tccgggaggc 1380

agcgtgatgg ggcaacaatc acacggattt cccgtgaacg gtctgaatga gcggattatt 1440

ttcagggaaa gtgagtgtgg tcagcgtgca ggtatatggg ctatgatgtg cccggcgctt 1500

gaggctttct gcctcatgac gtgaaggtgg tttgtgccgt gttgtgtggc agaaagaaga 1560

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ctgatgctgg tctgactact gaagcgcctt tataaagggg ctgctggttc gccggtagcc 1920

cctttctcct tgctgatgtt gtgaattcga agcttgatcc ggctgctaac aaagcccgaa 1980

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tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg 2160

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cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc 2280

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tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg 2400

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tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt 2520

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agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtcatatt 2760

caacgggaaa cgtcttgctc taggccgcga ttaaattcca acatggatgc tgatttatat 2820

gggtataaat gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta tcgattgtat 2880

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gttacagatg agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc 3000

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acagcattcc aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg 3120

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gattttgatg acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga aatgcataaa 3300

cttttgccat tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact tgataacctt 3360

atttttgacg aggggaaatt aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac 3420

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aaacggcttt ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat 3540

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gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 3660

atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 3720

atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 3780

aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 3840

aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag 3900

ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 3960

ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 4020

tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 4080

ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 4140

acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 4200

gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 4260

cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 4320

aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 4380

atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga 4440

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tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt 4620

tagctcactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt 4680

ggaattgtga gcggataaca atttcacaca agaaggagat ata 4723

<210>4

<211>4414

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>表达载体pT7-kan-ACY

<400>4

catatgaacg ctcccgtccc cgtcccgcgc gtcgccgatt tcacctgcga gaagaagcct 60

gcgagcggct cgcgcggcat ggtcgtcacc aaccacccgc tcgcctcggc agccggcgcg 120

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acggtggccg agccgatgat ggtcggcatc ctcggcgggg gcctgagcca tatccggctc 240

gccgacgggc gtcatgtcgt gatcgacaat ctctcgaccg cgccgggcaa ggcgacggcc 300

gagatgtacg agtgcctgtc cgacgagatc ggcaagcagc gcgacacgcg cgaccgccag 360

aacgtggtcg gagccaaggc ggtcgcggtt cccggcgcgc tcaagggctg gtgcgaggcg 420

ctcgcccgct tcggcacgct gccgctcgcc gaggttctcc agccggcgat cgggctggcg 480

gagcgcggct tcgtggtcac gccctatctc tcgaactgca tcaccgacaa cgcgggcgat 540

ctcgcccgcg accccggcct cgcggcgatg ctgctgccgg gcggaaagcc gctccagccg 600

ggcatgcggc tcgtccagtc cgactatgcc gcgagcctca aactgatcgc ggctgagggg 660

ccggacgcgc tctatggcgg caagctcggc cgggcgctga ccgattacat ggcggccaat 720

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tatgccgacg agcgccgcgc gctcattgag atggagcagg cgaagagctg gacggccggg 1080

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gtcgtcagcg cgacgcagac gatcaacggg ctgttcggcg cctgcgtgca gattccgggc 1200

accggcatga tcgccaacaa ctacatgtac aacttcgatc cgcatcccgg ccgggcgctc 1260

tcgatcgcgc cgggaaagag ggtcttcacc tcgatggcgc cgatgatggc gttgaaggag 1320

ggacggatcg cctttgcgct cggcttgcct ggcgcgctcc gcatcttccc ctcggcgctg 1380

caggcgatcg tcaacctgat cgaccaccgc atgagcctgc aggaggcggt cgaggcgcca 1440

cgcgtctgga cggagggcgg cgtgctcgaa ctcgaggaag cgatccccga ggccgtggca 1500

caagcgctga tcgcgcgcgg ccataaggtg gtgcgctcgc cccgcgtggc cggtggcatg 1560

aacgccatcg ccttcaatcc ggacggtacc ttgaccggtg ccgcctgctg gcgcgccgac 1620

ggcacacccg tcgccatctc cggcgggctc gcccgtgccg gtgcccgctt caccatctga 1680

agatctgcag ctggtaccat ggaattcgaa gcttgatccg gctgctaaca aagcccgaaa 1740

ggaagctgag ttggctgctg ccaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc 1800

taaacgggtc ttgaggggtt ttttgctgaa aggaggaact atatccggat ctggcgtaat 1860

agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg 1920

gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 1980

gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 2040

acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 2100

agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 2160

ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 2220

ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 2280

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tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 3480

tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 3540

aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 3600

aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt 3660

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ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg 4260

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tctcgatccc gcgaaattaa tacgactcac tatagggaga ccacaacggt ttccctctag 4380

aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tata 4414

<210>5

<211>1071

<212>DNA

<213>Trigonopsis variabilis

<400>5

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gccgactacg atgccgtctc ttatcctatc ttgcgagagc tggctcgaag cagccccgag 240

gctggaattc gactcatcaa ccaacgctcc catgttctca agcgtgatct tcctaaactg 300

gaaggtgcca tgtcggccat ctgtcaacgc aacccctggt tcaaaaacac agtcgattct 360

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tcgctcggcg ccacggtggt taaacgtcga gtgaaccata tcaaggatgc caattttcta 540

cactcctcag gatcacgccc cgacgtgatt gtcaactgta gtggtctctt tgcccggttc 600

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aactctcttc cttttatggc ctccttttcc agcactcctg aaaaagaaaa tgaagacgaa 720

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gatgaagctg tttcttacgt cgaaagagct cttactcgtc caaaccttta g 1071

<210>6

<211>356

<212>PRT

<213>Trigonopsis variabilis

<400>6

Met Ala Lys Ile Val Val Ile Gly Ala Gly Val Ala Gly Leu Thr Thr

1 5 10 15

Ala Leu Gln Leu Leu Arg Lys Gly His Glu Val Thr Ile Val Ser Glu

20 25 30

Phe Thr Pro Gly Asp Leu Ser Ile Gly Tyr Thr Ser Pro Trp Ala Gly

35 40 45

Ala Asn Trp Leu Thr Phe Tyr Asp Gly Gly Lys Leu Ala Asp Tyr Asp

50 55 60

Ala Val Ser Tyr Pro Ile Leu Arg Glu Leu Ala Arg Ser Ser Pro Glu

65 70 75 80

Ala Gly Ile Arg Leu Ile Asn Gln Arg Ser His Val Leu Lys Arg Asp

85 90 95

Leu Pro Lys Leu Glu Gly Ala Met Ser Ala Ile Cys Gln Arg Asn Pro

100 105 110

Trp Phe Lys Asn Thr Val Asp Ser Phe Glu Ile Ile Glu Asp Arg Ser

115 120 125

Arg Ile Val His Asp Asp Val Ala Tyr Leu Val Glu Phe Ala Ser Val

130 135 140

Cys Ile His Thr Gly Val Tyr Leu Asn Trp Leu Met Ser Gln Cys Leu

145 150 155 160

Ser Leu Gly Ala Thr Val Val Lys Arg Arg Val Asn His Ile Lys Asp

165 170 175

Ala Asn Phe Leu His Ser Ser Gly Ser Arg Pro Asp Val Ile Val Asn

180 185 190

Cys Ser Gly Leu Phe Ala Arg Phe Leu Gly Gly Val Glu Asp Lys Lys

195 200 205

Met Tyr Pro Ile Arg Gly Gln Val Val Leu Val Arg Asn Ser Leu Pro

210 215 220

Phe Met Ala Ser Phe Ser Ser Thr Pro Glu Lys Glu Asn Glu Asp Glu

225 230 235 240

Ala Leu Tyr Ile Met Thr Arg Phe Asp Gly Thr Ser Ile Ile Gly Gly

245 250 255

Cys Phe Gln Ser Asn Asn Trp Ser Ser Glu Pro Asp Pro Ser Leu Thr

260 265 270

His Arg Ile Leu Ser Arg Ala Leu Asp Arg Phe Pro Glu Leu Thr Lys

275 280 285

Asp Gly Pro Leu Asp Ile Val Arg Glu Cys Val Gly His Arg Pro Gly

290 295 300

Arg Glu Gly Gly Pro Arg Val Glu Leu Glu Lys Ile Pro Gly Val Gly

305 310 315 320

Phe Val Val His Asn Tyr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Tyr Gln Ser Ser

325 330 335

Tyr Gly Met Ala Asp Glu Ala Val Ser Tyr Val Glu Arg Ala Leu Thr

340 345 350

Arg Pro Asn Leu

355

<210>7

<211>4701

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>载体pRSET-lac-GI-hok/sok-kan

<400>7

catatgaata aatattttga gaacgtatct aaaataaaat atgaaggacc aaaatcaaat 60

aatccttatt cctttaaatt ttacaatcca gaggaagtaa tcgatggcaa gacgatggag 120

gagcatctcc gcttttctat agcttattgg cacactttta ctgctgatgg aacagatcaa 180

tttggcaagg ctactatgca aagaccatgg aaccactaca cagatcctat ggatatagcg 240

aaagcaaggg tagaagcagc atttgagttt tttgataaga taaatgcacc tttcttctgc 300

ttccatgata gggatattgc ccctgaagga gatactctta gagagacaaa caaaaactta 360

gatacaatag ttgctatgat aaaggattac ttaaagacca gcaagacaaa agttttgttt 420

ggtaccgcaa atcttttctc caatccgaga tttgtacatg gtgcatcaac atcctgcaat 480

gctgacgttt ttgcatattc tgcagcgcaa gtcaaaaaag cccttgagat tactaaggag 540

cttggcccgg aaaactacgt attttggggt ggaagagaag ggtacgagac gcttctcaat 600

acagatatgg agttagagct tgataacttt gcaagatttt tgcacatggc tgttgactat 660

gcaaaggaaa tcggctttga aggtcagttc ttgattgagc cgaagccaaa ggagcctaca 720

aaacatcaat acgactttga cgtggcaaat gtattggcat tcttgagaaa atacgacctt 780

gacaaatatt tcaaagtaaa tatcgaagca aaccatgcga cattggcatt ccacgacttc 840

caacatgagc taagatacgc cagaataaac ggtgtattag gatcaattga cgcaaatcaa 900

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gcaaaagtaa gacgtgcttc atttgagcca gaagatcttt tcttaggtca catagcagga 1080

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gacaagttca tcgaagaaag atacgcaagc tacaaagaag gcattggcgc tgatattgta 1200

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caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac 2340

cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt 2400

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ttaacgctta caatttaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt 2640

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cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg 3240

gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa tgcataaact tttgccattc tcaccggatt 3300

cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa 3360

taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc 3420

tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa acggcttttt caaaaatatg 3480

gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt gatgctcgat gagtttttct 3540

aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat 3600

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gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac 4500

cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact 4560

ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc 4620

aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat 4680

ttcacacaag aaggagatat a 4701

Claims

1.一种从头孢菌素C制备7-氨基头孢霉烷酸的方法，包括用D-氨基酸氧化酶催化头孢菌素C至戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸的第一步反应和用戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶催化戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸至7-氨基头孢霉烷酸的第二步反应，其特征在于，所述D-氨基酸氧化酶为经纯化的、其氨基酸序列为序列号2所示氨基酸序列的三角酵母(Trigonopsis variabilis)D-氨基酸氧化酶突变体。

2.根据权利要求1所述的方法，所述第一步反应中不添加过氧化氢。

3.根据权利要求2所述的方法，所述D-氨基酸氧化酶是由其DNA序列为序列号3所示DNA序列的表达载体pHS-GHA表达的。

4.根据权利要求3所述的方法，所述D-氨基酸氧化酶的纯化包括依次通过DEAE-纤维素离子交换树脂纯化以及通过硫酸铵沉淀纯化。

5.根据权利要求4所述的方法，所述第一步反应和第二步反应都不添加选自抗坏血酸、3-氨基-1，2，3-***、过硼酸钠和叠氮化钠的β-内酰胺酶抑制剂。

6.根据权利要求5所述的方法，所述第一步反应中不添加选自舒巴坦钠、棒酸、硼酸及其衍生物的过氧化氢酶抑制剂。

7.根据权利要求6所述的方法，所述第二步反应中不添加过氧化氢酶。

8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，所述D-氨基酸氧化酶是固相化的，或者所述戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶是固相化的。

9.根据权利要求8所述的方法，所述戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶为假单孢菌(Pseudomonas sp.)SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶。

10.根据权利要求9所述的方法，所述假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶是由其DNA序列为序列号4所示DNA序列的表达载体pT7-kan-ACY表达的。