CN117247928A - 一种头孢菌素c酰化酶催化的酰化反应及其应用 - Google Patents
一种头孢菌素c酰化酶催化的酰化反应及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117247928A CN117247928A CN202210655751.1A CN202210655751A CN117247928A CN 117247928 A CN117247928 A CN 117247928A CN 202210655751 A CN202210655751 A CN 202210655751A CN 117247928 A CN117247928 A CN 117247928A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cephalosporin
- acylase
- mutant
- substituted
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N cephalosporin C Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N 0.000 title claims abstract description 101
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 title description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 37
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 36
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 claims abstract description 14
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000004249 Erythorbin acid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 31
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 9
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical group CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 8
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Chemical group CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 8
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(4-chlorophenyl)-2-(4-methylphenyl)sulfonylbutane-1,4-dione Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)C(C(=O)C=1C=CC(Cl)=CC=1)CC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical group CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004474 valine Chemical group 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical group CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 3
- 239000001257 hydrogen Chemical group 0.000 claims description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical group [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical group CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 2
- -1 acetoxy, hydroxyl Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 229930182817 methionine Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims 1
- HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 7beta-aminocephalosporanic acid Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H]12 HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 0.000 abstract description 18
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 abstract 1
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 44
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 44
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 28
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 11
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 9
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 9
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 9
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NNQIJOYQWYKBOW-JWKOBGCHSA-N deacetoxycephalosporin C Chemical compound S1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 NNQIJOYQWYKBOW-JWKOBGCHSA-N 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 102100026908 D-amino-acid oxidase Human genes 0.000 description 4
- 108010003989 D-amino-acid oxidase Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- IXUSDMGLUJZNFO-BXUZGUMPSA-N (7R)-7-(4-carboxybutanamido)cephalosporanic acid Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCCC(O)=O)[C@@H]12 IXUSDMGLUJZNFO-BXUZGUMPSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229920003180 amino resin Polymers 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000012084 conversion product Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005065 mining Methods 0.000 description 2
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 4-(dimethylamino)benzaldehyde Chemical compound CN(C)C1=CC=C(C=O)C=C1 BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NVIAYEIXYQCDAN-CLZZGJSISA-N 7beta-aminodeacetoxycephalosporanic acid Chemical compound S1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](N)[C@@H]12 NVIAYEIXYQCDAN-CLZZGJSISA-N 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108030006163 Glutaryl-7-aminocephalosporanic-acid acylases Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001501882 Rhodomonas Species 0.000 description 1
- 241000228417 Sarocladium strictum Species 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000003668 acetyloxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(=O)O[*] 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 239000005010 epoxy-amino resin Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010034416 glutarylamidocephalosporanic acid acylase Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000011090 industrial biotechnology method and process Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
- C12P35/02—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin by desacylation of the substituent in the 7 position
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
- C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
- C12Y305/01093—Glutaryl-7-aminocephalosporanic-acid acylase (3.5.1.93)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了来源于Roseomonasrosea的头孢菌素C酰化酶及其突变体在头孢类药物母核的合成中的应用。本发明公开的头孢菌素C酰化酶突变体是在所述野生型酰化酶的L158、L160、G163、R260、Y268、M280、F294、V300、H306、E317、C389、H414、A418发生一至多种替代突变。本发明获得的酰化酶可催化头孢菌素C合成7‑氨基头孢烷酸的反应,在生物酶法催化头孢类药物中间体的合成中具有良好工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物催化技术领域,涉及一种利用头孢菌素C酰化酶突变体及其在催化合成头孢菌素母核中的应用。
背景技术
7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid,7-ACA)是一种非常重要的抗生素合成中间体,可以用来进行多种头孢类抗生素的合成,具有重要的医用价值。
目前,7-ACA由顶头孢霉的发酵产物CPC裂解而成,主要包括以下两种方法:传统工艺主要以化学法由CPC经羧基保护,酰胺键断裂与脱保护等多步工艺裂解生产7-ACA。化学裂解法得到了深入的研究,已经实现工业化生产。但是化学裂解法工艺复杂,需要大量有机溶剂,环境污染大。随着7-ACA巨大市场需求的带动以及人们对环境保护的逐步重视,目前化学裂解法逐渐被环境友好的生物酶催化法所取代。生物酶催化CPC生产7-ACA自20世纪60年代晚期得到深入发展,主要包括两步酶法和一步酶法,两步酶法利用D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAO)和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶(GL-7-ACA acylase,GAC)进行分步催化,首先DAO催化CPC合成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(glutaryl-7-aminocephalosporanicacid,GL-7-ACA),随后生成7-ACA。工艺虽趋于成熟,但仍存在酶解路线长、氧化条件控制难度大、副产物多、产率低于化学裂解法等缺点。一步酶法是利用CPC酰化酶直接催化CPC合成7-ACA,不必进行GL-7-ACA转换的中间过程,反应效率相当于化学法,,但是仍然存在CPC酰化酶对底物CPC特异性不高、酶活力较低、酶提取不易和酶的固定化有待进一步改善等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何利用生物催化方法高效制备头孢菌素母核7-ACA。
为解决以上技术问题,本发明首先提供了一种酰化酶突变体,其中野生型的酰化酶来源于Roseomonasrosea,命名为E745,所述头孢菌素C酰化酶突变体是在所述野生型序列(SEQ ID NO:1)上进行第L158、L160、G163、R260、Y268、M280、F294、V300、H306、E317、C389、H414、A418位进行替代突变得到的蛋白质。
上述方法中,所述突变头孢菌素C酰化酶可为对E745进行如下六种的任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种、或全部突变得到的蛋白质:
(1)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第158位的亮氨酸突变为丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸替代;
(2)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第160位的亮氨酸突变为半胱氨酸;
(3)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第163位的甘氨酸突变为谷氨酰胺、苏氨酸;
(4)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第260位的精氨酸突变为亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸;
(5)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第268位的酪氨酸突变为丙氨酸;
(6)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第280位的甲硫氨酸突变为精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸;
(7)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第300位的缬氨酸突变为亮氨酸;
(8)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第306位的组氨酸突变为丙氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸;
(9)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第317位的谷氨酸突变为苏氨酸;
(10)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第389位的半胱氨酸突变为异亮氨酸、丝氨酸;
(11)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第414位的组氨酸突变为苯丙氨酸、缬氨酸;
(12)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第418位的丙氨酸突变为缬氨酸、谷氨酰胺。
(13)优选地,其为如相组合突变的突变体:L159G/V300L、L160C/V300L、L158S/A418V、L158Q/A418V、G163T/A418V、C389S/A418V、V300L/C389I、L160C/C389S、C389S/A418Q、L160C/C389I/A418V、L158S/C389I/A418Q。
本发明相应提供上述头孢菌素C酰化酶突变体的编码核酸分子,其表达盒,含有所述编码基因或其表达盒的重组载体、含有所述基因或所述表达盒或所述重组载体的重组微生物。
其中,所述核酸分子可以是DNA,如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可以是RNA,如mRNA或hnRNA等。
所述的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述突变头孢菌素C酰化酶的DNA,该DNA不但可包括启动突变头孢菌素C酰化酶编码基因转录的启动子,还可包括突变头孢菌素C酰化酶转录的终止子。更进一步的,所述表达盒还可包括增强子序列。
所述的核酸分子的重组载体可为携带有所述突变头孢菌素C酰化酶编码基因的细菌质粒(如在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体,具体如pET-28a等)、噬菌体、酵母质粒(如YEp系列载体等)或逆转录病毒包装质粒。
所述重组载体为将所述核酸分子***表达载体中得到的载体。
所述的含有编码所述突变头孢菌素C酰化酶的核酸分子的重组微生物可为携带有头孢菌素或所述头孢菌素突变蛋白质编码基因的酵母、细菌、藻或真菌,如大肠杆菌等。
本发明还提供了另一种制备头孢菌素母核的方法,所述方法包括:以头孢菌素类似为底物,利用所述头孢菌素C酰化酶突变体,或所述头孢菌素C酰化酶突变体的重组细胞或所述重组细胞的裂解产物进行催化反应,得到头孢菌素母核。
具体地,一种制备化合物II的方法,其特征在于,包括以化合物I为底物,权利要求1至2任一项所述的头孢菌素C酰化酶突变体的作为催化剂相接触进行催化反应,得到化合物II:
其中R为乙酰氧基、羟基、氢。
优选地,本发明的酰化酶采用固定化酶的方式,例如以以环氧树脂,氨基树脂,大孔吸附树脂为载体,与酰化酶进行固定化,获得具有高转化活性的固定化酶。
上述方法中,所述重组细胞可通过向生物细胞中导入能表达所述头孢菌素C酰化酶突变体的重组载体获得。
所述生物细胞可为微生物。所述微生物可为大肠杆菌,也可以是其他菌。在本发明的一个实施例中,所述微生物为大肠杆菌BL21(DE3)。
所述反应的温度可为10~40℃,具体可为20℃;所述反应的pH 6.5~9.5的磷酸盐缓冲液中进行的,具体为8.0。一般可为0.5-24小时,具体可为1小时。所述重组细胞的裂解产物可由裂解所述重组细胞得到。
本发明通过半理性的设计,构建突变体库,获得了效果大为改善的突变体,所得突变体可以催化头孢菌素衍生物产生头孢菌素母核,在生物催化制备头孢菌素母核中具有较好的工业应用前景。
附图说明
图1是本发明中酰化酶催化头孢菌素C水解反应路线图。
图2是本发明中7-ACA和CPC含量的标准曲线图。
图3是本发明中7-ACA和CPC的HPLC检测结果。
图4是本发明中CPC酰化酶E744用于底物饱和突变体库构建相关残基位点。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1.酰化酶序列挖掘及酶活表征
1.1酰化酶序列挖掘
经NCBI检索,获取了来源于Roseomonasrosea酰化酶,其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示(命名为E745)。
1.2头孢菌素C酰化酶的诱导表达
将含有SEQ ID NO.1氨基酸序列的核酸序列转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌液均匀的涂布在卡那霉素抗性(浓度为50μg/mL)的LB平板上,37℃恒温条件下培养14h后长出单菌落,即为含有头孢菌素C酰化酶核酸序列的转化子。
将上述转化子转接到含5mL的LB培养基(卡那霉素浓度为50μg/mL)的试管中,37℃、220rpm振荡培养过夜,即为种子液;然后按1%的接种量接种到100mL的TB培养基(卡那霉素浓度为50μg/mL)中,37℃,220rpm振荡培养3h,当菌液的OD600值达到0.6-0.8添加终浓度为0.1mM的IPTG,25℃,220rpm继续振荡培养16h;4℃,4000rpm,离心10min收集菌体。磷酸盐缓冲液(50mM,pH8.0)洗菌,离心,随后加入磷酸盐缓冲液(10mL/g菌)重悬可得到菌悬液。使用超声破碎15min后,离心60min(4℃,12000rpm),取上清获得粗酶液。
1.3酰化酶蛋白纯化
使用Ni+柱纯化:使用缓冲液A(100mM磷酸钾盐,500mMNaCl,30mM咪唑,pH 8.0)预平衡后,将1.2收集到的野生型粗酶液过滤加入Ni+柱,使用缓冲液B(100mM磷酸钾盐,500mM氯化钠,250mM咪唑,pH 8.0)洗脱并收集目的蛋白,经超滤浓缩、脱盐获得纯化蛋白,于4℃冷藏。
通过Bradford法对纯化后得到的目的蛋白浓度进行测定。使用SDS-PAGE凝胶电泳对目的蛋白进行分析。
1.4.头孢菌素C酰化酶催化CPC生成7-ACA
反应体系(1mL):40mM CPC,0.1mg酰化酶,补加磷酸缓冲液至1mL。反应条件:37℃1000rpm 30min,取100μL样品,加入9倍体积的甲醇终止并稀释反应体系,HPLC检测酶活。通过HPLC分析CPC转化7-ACA产物。
检测条件:色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18(4.6*150mm 4um);流动相配为96%磷酸盐缓冲液(pH7.0,50mM)添加4%甲醇(v/v);流速0.8mL/min;检测波长为254nm,柱温箱恒定为25℃。
酶活定义:每分钟催化CPC产生1微摩尔(μmol)7-ACA所需要的酶量定义为1U。
表1.酰化酶酶活测试
实施例2.酰化酶突变体库构建及高通量筛选
2.1突变库构建
以酰化酶E745为模板,通过SWISS-MODEL进行建模,建模后蛋白与底物分子CPC进行docking对接并分析其作用位点,根据对接的结果,E745氨基酸序列中位点L158、L160、G163、H414、A418、M280与底物CPC结合起决定作用,作为口袋附近氨基酸,影响CPC测量的结合。位点R260、Y268、F294、V300、H306、E317、C389对稳定底物结合口袋有重要作用。因此构建了以上所述氨基酸残基位点的单点饱和突变体文库。
用上述所选的相应引物进行单位点饱和突变,设计相应的引物如表2所示。
表2.引物序列表
具体构建方法如下:
1、第一轮PCR
以质粒E745为模板,将表2中引物L158-F1、L1598-F2、L158-F3、L158-F4按12:6:1:1比例混合,取2μL上述的混合液作为上游引物,取表2中L158-G163-R作为下游引物,扩增基因片段L1。位点L160、G163扩增方法与上述基因片段L1相同。位点R260、Y268、M280、F294、V300、H306、E317以R260-E317-R作为下游引物,C389、H414、A418以C389-A418-R作为下游引物进行基因片段扩增。
第一次轮PCR程序:94℃保温2min,(98℃保温15s,55℃保温30s,72℃保温30s)×28个循环,72℃保温5min。
2、第二轮PCR
分别取2μL第一轮PCR产物L1,L2,L3,L4等为引物,以质粒E745为模板,进行第二轮PCR,构建L158、L160、G16、R260、Y268、M280、F294、V300、H306、E317、C389、H414、A418单位点饱和突变库。第二轮PCR程序:94℃保温2min,(98℃保温15s,60℃保温30s,72℃保温5min)×28个循环,72℃保温10min。
3、基因突变体工程菌株构建
将获得的第二轮PCR产物进行如下操作:向第二轮PCR的产物中加入1μL的Dpn I用于消化质粒模板,37℃恒温条件下处理3h。取2μL酶消化后的第二轮PCR产物并经电转化进大肠杆菌BL21(DE3)中,将电转后的大肠杆菌BL21(DE3)菌液均匀的涂布在卡那霉素抗性(浓度为50μg/mL)的LB平板上,37℃恒温条件下培养14h后长出单菌落,即为酰化酶E745的基因突变体工程菌株。
2.2酰化酶突变体库高通量筛选及活力测定
将突变体库中的单菌落分别接种于96深孔板中,添加300μL(含卡那霉素50μg/mL)的LB培养基中,37℃培养8-12h,同时设置阴性对照组(pET-28a的空载体),然后将200μL种子液接种于的800μL TB培养基(含IPTG 0.1mM和卡那霉素50μg/mL)中。25℃表达16h,离心收集细胞菌体,置于-80℃冷冻1h,室温融化30min。加入200μL(0.1M pH8.0,含1mg/mL溶菌酶)的磷酸钾缓冲液,重悬菌体,37℃孵育1h。向细胞破碎液中加入200μL底物CPC(20mM),37℃的条件下反应4-6h。取40μL反应液至新的96孔板中,加入200μL终止反应液(20%冰醋酸:0.05M NaOH=2:1),离心10min(4℃,5000rpm)。取200μL上清,加入40μL显色剂(0.5%p-DAB溶于甲醇),室温反应10min后,检测415nm下的吸光度。
表3.随机突变菌株相对活力测试
实施例3.酰化酶组合突变体的构建
基于实施例2筛选到活性的高突变体,以及区域影响较大的突变,构建如下的突变体:L159G/V300L、L160C/V300L、L158S/A418V、L158Q/A418V、G163T/A418V、C389S/A418V、V300L/C389I、L160C/C389S、C389S/A418Q、L160C/C389I/A418V、L158S/C389I/A418Q为构建突变体设计引物,见表4。
表4.定点突变的引物
具体构建方法如下:
1)PCR
分别以质粒L158G和L160C为模板,取表4中V300L-F和V300L-R作为上、下游引物,扩增突变体L159G/V300L、L160C/V300L;分别以质粒L158S、L158Q、G163T、C389S为模板,取表4中A418V-F和A418V-R作为上、下游引物,扩增突变体L158S/A418V、L158Q/A418V、G163T/A418V、C389S/A418V;以质粒L160C为模板,取表4中C389S-F和C389S-R作为上、下游引物,扩增突变体L160C/C389S;以质粒V300L为模板,取表4中C389I-F和C389I-R、作为上、下游引物,扩增突变体V300L/C389I;以质粒C389S为模板,取表4中A418Q-F和A418Q-R作为上、下游引物,扩增突变体C389S/A418Q;以质粒L160C为模板,分别取表4中C389I-F和A418V-R作为上、下游引物,扩增突变体L160C/C389I/A418V;以质粒L158S为模板,分别取表4中C389I-F和A418Q-R作为上、下游引物,扩增突变体L158S/C389I/A418Q。
PCR程序:94℃保温2min,(98℃保温15s,55℃保温30s,72℃保温5min)×28个循环,72℃保温10min。
2)基因突变体工程菌株构建
将获得的PCR产物进行如下操作:向PCR的产物中加入1μL的Dpn I用于消化质粒模板,37℃恒温条件下处理3h。取2μL酶消化后的PCR产物并经电转化进大肠杆菌BL21(DE3)中,将电转后的大肠杆菌BL21(DE3)菌液均匀的涂布在卡那霉素抗性(浓度为50μg/mL)的LB平板上,37℃恒温条件下培养14h后长出单菌落,即为酰化酶SEQ ID NO.1的基因突变体菌株。
实施例4.头孢菌素C酰化酶全细胞催化7-ACA合成
4.1细胞培养
分别挑取实施例3中所构建的突变体的单克隆转接到含5mL的LB培养基(卡那霉素浓度为50μg/mL)的试管中,37℃、220rpm振荡培养过夜,即为种子液;按1%的接种量接种到100mL的TB培养基(卡那霉素浓度为50μg/mL)中,37℃、220rpm振荡培养3h,当菌液的OD600值达到0.6-0.8加入IPTG(0.1mM),25℃,220rpm继续振荡培养16h;4℃,4000rpm,离心10min收集菌体。磷酸盐缓冲液(50mM pH 8.0)清洗菌体,离心后称湿菌重,随后加入磷酸盐缓冲液(10mL/g菌)重悬可得到菌悬液。
4.2全细胞反应
通过HPLC分析CPC转化产物,从而测定4.1中获得的全细胞的转化率的测定。反应为1mL体系,4.1中所得全细胞取800μL用于反应,添加底物CPC(40mM),37℃,1000rpm,反应30min。取100μL样品,使用甲醇稀释十倍后用HPLC测定转化率。
HPLC检测条件:所选用色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(4.6*150mm 4um),流动相配比为:96%磷酸盐缓冲液(pH7.0,50mM),4%甲醇(v/v),流速0.8mL/min,检测波长为254nm,柱温箱恒定为25℃。
表5.组合突变体全细胞对CPC的转化率
4.3粗酶液催化CPC合成7-ACA
按照实施例1的方式制备粗酶液,对获得突变体的粗酶液进行转化率验证。
反应体系(1mL):底物CPC(40mM),0.1ml酰化酶粗酶液,补加磷酸缓冲液至1mL。反应条件:37℃,1000rpm,30min,取100μL样品,使用甲醇稀释十倍后用HPLC测定转化率。
检测条件:色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18(4.6*150mm 4um);流动相配为96%磷酸盐缓冲液(pH7.0,50mM)添加4%甲醇(v/v);流速0.8mL/min;检测波长为254nm,柱温箱恒定为25℃。
表6组合突变体粗酶对CPC的转化率
实施例5头孢菌素C酰化酶突变体全细胞催化DAOC合成7-ADCA
DAOC是CPC的类似物,其结构差别在于母核六元环侧链取代基,其中,DAOC为氢(-H),而CPC为乙酰氧基(-OCOCH3)。
通过HPLC分析DAOC转化产物,获得全细胞转化率。其反应为1mL体系,取800μL 3.1所得全细胞用于反应,加入底物DAOC(1mg/mL),37℃,1000rpm,反应30min。取100μL样品,使用乙腈稀释十倍后用HPLC测定转化率。
液相检测条件:色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18(4.6*150mm 4um);流动相配为95%甲酸铵,5%乙腈,流速1ml/min,检测波长254nm,柱温箱恒定为25℃。
表7头孢菌素C酰化酶突变体对DAOC的转化率.
实施例7头孢菌素C酰化酶的固定化
(1)环氧树脂、大孔吸附树脂固定酰化酶突变体(以L158S/C389I/A418Q为例)
载体平衡:用固定化缓冲液,按照载体/缓冲液1:5(质量/体积比)的比例反复清洗3次,清洗完成后抽干。
载体和酰化酶比例调节:用固定化缓冲液溶解酶,载体和酶缓冲液的比例为1:4(质量/体积比),该比例可进一步的在1:1到1:4之间进行优化。
将含酶的缓冲液和载体加入到反应器中,25℃、800rpm转速下反应3h,之后停止搅拌静置2h。
固定化后过滤收集固定化酶,使用280nm吸收波长测定上清液中蛋白含量,计算固定化率及产率。用蒸馏水清洗,重复3次。随后使用HPLC检测环氧树脂固定化酶的反应活性。
(2)氨基树脂固定化酶处理
载体平衡:固定化缓冲液,按照载体/磷酸盐缓冲溶液(50mM,pH8.0)1:5(质量/体积比)的比例反复清洗3次,清洗完过滤抽干。
用固定化缓冲液配置2%戊二醛溶液,将载体和戊二醛缓冲液以比例1:4(质量/体积比)加入,22℃,180rpm条件下搅拌1h。后用缓冲液清洗载体3遍,然后抽滤备用,存放到4℃冰箱中。
(3)固定化酶活力测试
反应条件(总体系4ml):固定化酰化酶(400mg)加入反应瓶中,投入底物CPC(40mM),补加缓冲液至4ml,,37℃,1000rpm,反应30min。取100μL样品,使用甲醇稀释十倍后用HPLC测定转化率。
检测条件:色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18(4.6*150mm 4um);流动相配为96%磷酸盐缓冲液(pH7.0,50mM)添加4%甲醇(v/v);流速0.8mL/min;检测波长为254nm,柱温箱恒定为25℃。检测转化率可以达到65%。
<110>中国科学院天津工业生物技术研究所
<120>一种头孢菌素C酰化酶催化的酰化反应及其应用
<160>1
<170>PatentIn version 3.5
<210> 1
<211>768
<212> PRT
<213>玫瑰红单胞菌(Roseomonasrosea)
<400>1
MPVFDAQTLRDALPPMEGTLRVPGLAGPVEVLRDTHGIPHIRAGATPDAWFALGFVHAQDRLFQMELTRRRALGRAAEWLGAGAAEADILVRRLGMEAACRRDHAALGEAARAMLDSYAAGVNAFVASGAPLPVEYGLLEARPEPWEGWHSIAVMRRLGLLMGSVWFKLWRAAALPVVGAGNLGKLRYDDGGRDLLCIPPGVEAARFEADLAALAPAIRALLESLGGDASDAAGGGSNNWAVGPSRSGTGRPVLAGDPHRVFEIPNMYAQHHVACDAFDMIGLTVPGVPGFPHFAQNGRVAYCVTHAFMDIHDVFLERFDAEGARVLQAGEWVPVRRREESVAVRGGAARHFEVLETPNGPVIAGDARGGTALSLRSVQFAETDLSFDCLPRMTGAESVEGLFEATRGWGLIDHNLVAADTAGHIGHLVRARVPRRTRESGWLPMPGWTGEHAWQGWIAHDDMPRAIDPEEGMIVTANNRVVADDHPDYLCTDCHPPYRAARILERLREMPDFRPEDAAGLHGDTLSPNAALLKARLTAMPPAEGAAEALRQRLLAWDGRMEAGATAPTEYVALRRALTRILAERSGLSGTGAHPWLAVAPGVAPMNQLWWTLPNLLRRDDASLLDGWSWEEAIGAALREAAGAPAAEWGEAHRPRFVHPLSGLFPEAAPMLDPPALPIGGDNDTVLANGLLAAVGPAAGYGALARYVFDVGNWDNSRWAVFHGVSGQPGSPHYTDQHAEWAAARMVPMLYGWDAVRAAARSTQQLVP 768
Claims (10)
1.头孢菌素C酰化酶突变体,其特征在于:选自下组至少一个氨基酸被另一个氨基酸替代得到:SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中的L158、L160、G163、R260、Y268、M280、F294、V300、H306、E317、C389、H414、A418。
2.根据权利要求1所述的头孢菌素C酰化酶突变体,其特征在于:
L158为丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸所取代;
L160为半胱氨酸所取代;
G163为谷氨酰胺、苏氨酸所取代;
R260为亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸所取代;
Y268为丙氨酸所取代;
M280为精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸所取代;
V300为亮氨酸所取代;
H306为丙氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸所取代;
E317为苏氨酸所取代;
C389为异亮氨酸、丝氨酸所取代;
H414为苯丙氨酸、缬氨酸所取代;
A418为缬氨酸、谷氨酰胺所取代;
优选地,其为如相组合突变的突变体:L159G/V300L、L160C/V300L、L158S/A418V、L158Q/A418V、G163T/A418V、C389S/A418V、V300L/C389I、L160C/C389S、C389S/A418Q、L160C/C389I/A418V、L158S/C389I/A418Q。
3.根据权利要求1至3任一项所述头孢菌素C酰化酶突变体的相关的生物材料,为下述(1)至(4)中任一种:
(1)编码权利要求1或2中所述头孢菌素突变体的核酸分子
(2)含有(1)所述核酸分子的表达盒;
(3)含有(1)所述核酸分子的重组载体、或含有(2)所述表达盒载体;
(4)含有(1)所述核酸分子的重组微生物、或含有(2)所述表达盒的重组微生物、或含有(3)所述重组载体的重组微生物。
4.一种制备化合物II的方法,其特征在于,包括以化合物I为底物,权利要求1至2任一项所述的头孢菌素C酰化酶突变体的作为催化剂相接触进行催化反应,得到化合物II:
I
II
其中R为乙酰氧基、羟基、氢。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:所述重组细胞通过向生物细胞中导入能表达权利要求1至2任一项所述的头孢菌素C酰化酶突变体的重组载体实现。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:所述权利要求1至2任一项所述的头孢菌素C酰化酶突变体通过重组细胞表达获得,具体是通过向生物细胞中导入能表达如权利要求1至2任一项所述的头孢菌素C酰化酶突变体的重组载体实现。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:权利要求1至2任一项所述的头孢菌素C酰化酶突变体以全细胞、粗酶液、粗酶粉、固定化酶或纯酶的形式发生催化作用。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:所述的全细胞为含有编码权利要求1至2任一项所述的头孢菌素C酰化酶突变体的核酸分子的重组微生物,优选是酵母、细菌、藻或真菌,如大肠杆菌等;
更进一步优选,所述的大肠杆菌为BL21(DE3)。
9.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:以所述酰化酶作为生物酶催化底物生成相应的产物的反应是在浓度为40 mmol/L~60 mmol/L,pH 6.5~9.5的磷酸盐缓冲液中进行的。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于:所述催化反应的温度可为20~40 ℃;所述催化反应的时间可为0.5~28 h。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210655751.1A CN117247928A (zh) | 2022-06-10 | 2022-06-10 | 一种头孢菌素c酰化酶催化的酰化反应及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210655751.1A CN117247928A (zh) | 2022-06-10 | 2022-06-10 | 一种头孢菌素c酰化酶催化的酰化反应及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117247928A true CN117247928A (zh) | 2023-12-19 |
Family
ID=89126988
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210655751.1A Pending CN117247928A (zh) | 2022-06-10 | 2022-06-10 | 一种头孢菌素c酰化酶催化的酰化反应及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117247928A (zh) |
-
2022
- 2022-06-10 CN CN202210655751.1A patent/CN117247928A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109055327B (zh) | 醛酮还原酶突变体及其应用 | |
CN112877307B (zh) | 一种氨基酸脱氢酶突变体及其应用 | |
CN109055324B (zh) | 一种改进的酮还原酶及其应用 | |
CN111172142B (zh) | 一种热稳定性高的头孢菌素c酰化酶突变体 | |
CN109072215B (zh) | 一种头孢菌素c酰化酶突变体及其应用 | |
CN112980906B (zh) | 一种用于制备β-烟酰胺单核苷酸的酶组合物及其应用 | |
CN112852913B (zh) | 脱乙酰氧头孢菌素C合成酶突变体及其在β-内酰胺抗生素母核合成中的应用 | |
CN116240187B (zh) | 脯氨酰羟化酶α1亚基突变体、编码基因及其在催化脯氨酸羟基化中的应用 | |
CN110129305B (zh) | 一种用于制备7-aca的头孢菌素c酰化酶突变体 | |
CN115433721B (zh) | 一种羰基还原酶突变体及其应用 | |
CN115896050A (zh) | 7α-羟基类固醇脱氢酶末端改造组合点突变及高效合成熊去氧胆酸中间体 | |
CN117247928A (zh) | 一种头孢菌素c酰化酶催化的酰化反应及其应用 | |
US11760988B2 (en) | L-aspartate alpha-decarboxylase mutant and application thereof | |
CN117247926A (zh) | 一种头孢菌素c酰化酶突变体及其应用 | |
CN117247927A (zh) | 一种头孢菌素c酰化酶的人工合成及其突变体应用 | |
CN117247925A (zh) | 头孢菌素c酰化酶突变体及其在头孢菌素母核合成中的应用 | |
EP2802661B1 (en) | Mutated cephalosporin hydroxylase and its application in deacetylcephalosporanic acid synthesis | |
CN112852912B (zh) | 一种合成7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸的方法 | |
CN116478940A (zh) | 扩环酶突变体及其在合成g-7-adca中的应用 | |
CN117603930B (zh) | 一种表达突变型西罗血红素合酶的重组菌 | |
CN116497010A (zh) | G-7-adca合成酶及其在制备头孢烷酸类化合物中的应用 | |
CN114958877B (zh) | 去乙酰氧基头孢菌素c合成酶突变体及其编码基因与应用 | |
CN109280651B (zh) | 一种乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1及其在大肠杆菌中高效表达的发酵方法 | |
CN117947137A (zh) | 用于合成头孢克洛的青霉素酰胺酶 | |
CN115491361A (zh) | 扩环酶及其突变体在生产g-7-adca中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |