WO2007004708A1

WO2007004708A1 - 顕微鏡

Info

Publication number: WO2007004708A1
Application number: PCT/JP2006/313522
Authority: WO
Inventors: Tadao Sugiura; Katsuhiko Yasaka; Takashi Kawahito; Kumiko Matsui
Original assignee: National University Corporation NARA Institute of Science and Technology; Nikon Corporation
Priority date: 2005-06-30
Filing date: 2006-06-30
Publication date: 2007-01-11
Also published as: EP1895348A4; JP4895050B2; EP1895348A1; JPWO2007004708A1; US20100142038A1; US7957058B2

Abstract

　光源からの光を対物レンズを介して試料へ入射させ、当該対物レンズを介して試料を観察する顕微鏡は、光源と対物レンズとの間の光路中であって対物レンズの像側焦点面あるいはその共役面と共役な位置に配置された微小開口部と、微小開口部を介して光源からの光を試料に対してブリュースター角度で入射させるように微小開口部の位置を調整する位置調整手段と、光源と対物レンズとの間の光路中に配置されており光源からの光より直線偏光を取り出し、直線偏光の光を試料に照射する偏光素子とを有する。

Description

顕微鏡技術分野

本発明は、顕微鏡に関する。背景技術

<ブリュース夕一顕微鏡〉

ブリュース夕一角において p偏光の反射率が 0になることは 1 9世紀より知られており、この現象を利用すれば単分子膜の観察力行えることが 1 991年に Dirk Honigと Dietmar Mobius及び S.Henonと； I.Meunierによって報告されて、薄膜の反射率分布をイメージングする研究が活発化している。

これまでに、液体上の気一液界面で展開された Langmuir 単分子膜の 2次元構造の観察や Langnmir単分子膜の配向分布の観察、混合された Langmuir単分子膜の相分離の観察、基板面上に作製された LB膜の観察等、主に単分子膜の構造観察に利用されている。現在ではイメージング装置も市販されており、半導体製造工程での薄膜の評価や、 DN A検出に用いられる DN Aマイクロアレイの製品検査等で利用されている。

これらの手法では、レーザ光を界面に対して入射角がプリユース夕一角なるようにレーザビームを傾け、界面で正反射した光を正反射方向に設置した結像レンズを通して結像して像観察を行う構成になっている（例えば、アルテックアルト株式会社、 "BAMブリュース夕一角顕微鏡" 、 [online]、 [平成 17年 5月 23日検索]、インタ一ネット <URL : http://www.ksv. jp/bam_01. html > を参照。）。このようにした場合、観察レンズが薄膜試料に対して傾いた方向から観察するようになるため、一度に観察できる領域がスリット状に制限される。そ T JP2006/313522

2 こでこれらの装置では光の照射位置を試料上で 1次元方向に走査して全体の画像を得る構成となっている。

ぐ表面プラズモン顕微鏡 >

金属表面近傍の自由電子の集団的縦波振動である表面プラズモンは可視域の光を用いて励起できることが O Uo及び Kre t chmannによって実験的に証明され、金属薄膜近傍の分子を検出するのに用いられている。

表面プラズモン共鳴は、入射光と表面プラズモンとの共鳴現象（表面ブラズモンーポラリ卜ン（po l ar i ton) ) であり、入射光が持つ金属表面方向の波数べクトルと表面プラズモンの波数べクトルが一致した場合に入射光と表面プラズモンが同じ速度で縦波振動しながら進行することで起こる共鳴現象である。

金属表面のプラズモンの波数は媒質側の物質中を進行する光の波数よりも大きくなるので、表面ブラズモン共鳴を起こさせるには金属表面上でエバネッセント場となる必要がある。そのため金属膜を付けた基板の裏面より全反射角以上の角度で光を入射し（Kre tchmann配置）、金属表面上にエバネッセント場が生じる状態として入射角を微調整することで表面プラズモン共鳴を起こすことができる。表面ブラズモン共鳴が起きると入射した光のエネルギーはジュール損として金属膜中で損失するので反射光の強度が激減する。そのため入射角を変化させながら反射率を測定することで表面プラズモン共鳴現象を観察することができる (表面プラズモン ·スぺクトロスコピー）。

また表面プラズモンの波数は接している媒質の誘電率と厚さに大きく依存するので、表面プラズモン共鳴現象を観察する（表面プラズモン ·スぺクトロスコピー）ことで媒質の誘電率と厚さに関する情報を得ることができる。そのため、金属膜への物質の吸着現象の計測やタンパク質相互作用の計測等に用いられている。

さらにこの原理に基づいて金属表面の各点の反射率を計測することで金属薄膜近傍の分子の分布をイメージングする試みが、 1 9 8 8年に W. Hi cke l と W. Kno l l によって初めてなされた（表面プラズモン顕微鏡）。その後、金属膜上に形成された脂質分子膜の高解像度観察、 D N Aハイブリダィゼーシヨンの実時間観察、 D N A—タンパク質間相互作用の計測等が行われている。

しかしながら、上述のブリュース夕一顕微鏡や表面プラズモン顕微鏡は、照明光を試料に対してブリュース夕一角度や表面ブラズモン共鳴を起こすための角度等の大きな入射角度で照射する必要があるため、試料における構造や屈折率が大きく変化する部位で干渉縞が発生してしまい、また、観察像の背景は暗黒に近いため S ZB比（シグナル Zバックグラウンド比）が高く、わずかな干渉縞でも非常に目立ちやすいという問題がある。発明の開示

上記課題を解決するために本発明の第 1の態様は、

光源からの光を対物レンズを介して試料へ入射させ、当該対物レンズを介して前記試料を観察する顕微鏡において、

前記光源と前記対物レンズとの間の光路中であって前記対物レンズの像側焦点面あるいはその共役面と共役な位置に配置された微小開口部と、

前記微小開口部を介して前記光源からの光を前記試料に対してプリユース夕一角度で入射させるように前記微小開口部の位置を調整する位置調整手段と、前記光源と前記対物レンズとの間の光路中に配置されており前記光源からの光より直線偏光を取り出し、前記直線偏光の光を前記試料に照射する偏光素子とを有することを特徴とする。

また本発明の第 2の態様は、

レーザー光源からのレーザー光を対物レンズを介して試料へ入射させ、当該対物レンズを介して前記試料を観察する顕微鏡であって、

前記レーザー光源と前記対物レンズとの間の光路中に配置されており前記レ一ザ一光から直線偏光を取り出す偏光素子を有し、前記レーザー光源は、前記レーザー光の集光点が前記対物レンズの瞳と共役な位置に配置されており、かつ前記レーザー光が前記試料に対してブリュース夕一角度で入射させる位置にあることを特徴とする顕微鏡を提供する。

本発明の前記態様によれば、試料、特に培養液に浸されている細胞に対しても照明光をブリュースター角で適切に入射させ、試料の固液界面に存在する高分子化合物やタンパク質等の偏光依存性のある物質を高分解能で観察可能な顕微鏡を提供することができる。

また、本発明の第 3の態様は、

前記光源と前記対物レンズとの間の光路中であつて前記対物レンズの像側焦点面あるいはその共役面の近傍に配置されており、かつ前記光源からの光を前記試料に対して略ブリュース夕一角度で入射させる円弧形状の微小開口部と、前記光源と前記対物レンズとの間の光路中に配置されており前記光源からの光より直線偏光を取り出す偏光素子とを有し、

前記円弧形状の微小開口部が、以下の条件式を満足することを特徴とする顕微鏡を提供する。

δ r≤ 0 . 0 6 X f

≤ 2 0 °

但し、

δ r ：前記円弧形状の微小開口部の半径方向の幅

f ：前記対物レンズの焦点距離

Φ ：前記円弧形状の微小開口部の中心角図面の簡単な説明

図 1は、本発明の第 1実施形態に係る倒立顕微鏡の構成を示す全体側面図である。

図 2は、本発明の第 1実施形態に係る倒立顕微鏡の構成を示す全体上面図である。

図 3 A— 3 Cは、本発明の第 1実施形態における落射照明装置の構成を示す図である。

図 4は、本発明の第 1実施形態に係る倒立顕微鏡によって、照明光をブリュースター角で照射して試料を観察する様子を示す図 1の A— A拡大断面図である。図 5は、本発明の第 1実施形態に係る倒立顕微鏡によって、表面プラズモン効果を利用して試料を観察する様子を示す図 1の A— A拡大断面図である。

図 6は、本発明の第 2実施形態に係る倒立顕微鏡の構成を示す全体側面図である。

図 7は、本発明の第 2実施形態における落射照明装置の構成を示す図である。図 8は、本発明の第 2実施形態における落射照明装置の部分拡大図である。図 9は、図 3 B，図 3 Cに示すピンホール 2 8及び微調整機構を示す図である。図 1 O A—図 1 0 Cは、本発明の実施形態に係る倒立顕微鏡 1の開口絞りュニット 2 0に備えられているスリット 2 9を示す図である。

図 1 1は、本発明の実施形態における開口絞りユニット 2 0のスリット 2 9の半径方向の幅 δ r = 0のときに、スリツ卜 2 9を半径方向へ移動させることによつて照明光束の入射角度 Θ を変化させた際の背景光と信号光の強度変化を示すグラフである。

図 1 2は、本発明の実施形態における開口絞りュニット 2 0のスリット 2 9の半径方向の幅 δ rを変化させた際の角度ばらつきの最大値 δ Θ を示すグラフである。

図 1 3 A、図 1 3 Bは、本発明の実施形態において <5 r Z f = 0 . 0 3 、 δ r / f == 0 . 0 6のときの図 1 1に相当するグラフ（スリット 2 9を半径方向に移動させて照明光束の入射角度 6> を変化させた場合の背景光と信号光の強度変化グラフ）をそれぞれ示している。

図 1 4は、本発明の実施形態において照明光の入射角度 Θ をブリュースター角度として δ r Z f を変化させた際の背景光と信号光の強度変化を示すグラフである。

図 1 5は、本発明の実施形態における開口絞りュニット 2 0のスリット 2 9の半径方向の幅（5 rを無限小と仮定し、中心角 Φ のみを大きくした際に照明光に含まれる P偏光と s偏光の強度比を示すグラフである。

図 1 6は、本発明の実施形態において図 1 1と同じ条件の試料 1 5に対して入射角度 Θ を変化させながら照明光を入射させた際の p偏光及び s偏光の強度反射率を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明の各実施形態に係る倒立顕微鏡を添付図面に基づいて説明する。 (第 1実施形態）

図 1及び図 2は、本発明の第 1実施形態に係る倒立顕微鏡の構成を示す全体側面図及び上面図である。

図 1に示すように本実施形態に係る倒立顕微鏡 1は、顕微鏡ベース 2と、顕微鏡ベース 2上方に設けられた透過照明装置 3と、接眼観察鏡筒 4と、顕微鏡べ一ス 2側方に備えられた落射照明装置 5とからなる。

顕微鏡ベース 2の上面には試料を載置するためのステージ 6が備えられている。そして顕微鏡べ一ス 2内部には、ステージ 6側から下方へ向かって順に、高開口数の液浸対物レンズ 7と、ブロック切換ユニット 8と、光路切換ユニット 9 とが備えられている。また、図 2に示すように、顕微鏡べ一ス 2における図 1と反対側の側面には、 C C Dカメラ 1 0が備えられている。

ブロック切換ユニット 8は、ビ一ムスプリッ夕 1 1と蛍光フィルタブロック 1

2とを備えており、軸 8 aを中心に回転させることでこれらを選択的に光路内へ配置することができる。なお、蛍光フィル夕ブロック 1 2は、ダイクロイツクミラ一 1 2 a、励起フィル夕 1 2 b、及び吸収フィル夕 1 2 cからなり、蛍光観察を行う際に用いられる。

また、光路切換ュニット 9は、ハーフプリズム 1 3と全反射プリズム 1 4とを備えており、軸 9 aを中心に回転させることでこれらを選択的に光路内へ配置することができる。これにより、試料 1 5からの像を C C Dカメラ 1 0及び接眼観察鏡筒 4、又は C C Dカメラ 1 0のみへ選択的に導くことができる。

図 3 A— 3 Cは、本発明の第 1実施形態における落射照明装置の構成を示す拡大図である。

図 3 Aに示すように、本実施形態における落射照明装置 5は、光源からの光を上述のブロック切換ュニット 8へ導き、対物レンズ 7を介して試料 1 5へ照射するための照明装置であって、光源として配置された水銀ランプ 1 6から順に、コレク夕レンズ 1 7と、レンズ 1 8 , 1 9と、対物レンズ 7の後側焦点面あるいはその後側焦点面と共役な面に配置された開口絞りユニット 2 0と、レンズ 2 1と、ミラー 2 2と、レンズ 2 3と、試料面に対して共役な視野絞り 2 4と、ボラライザ一ユニット 2 5と、レンズ 2 6とを有する。

開口絞りュニット 2 0は、開口絞り 2 7、微小開口部として直径の小さなピンホール 2 8及び光軸 A Xを中心とする円弧形状のスリット 2 9を有し、これらは図 3 A中上下方向ヘスライド可能に設けられており、使用者は不図示の操作ツマミでスライドさせることで選択的に切り換えて光路内へ配置することができる。なお、開口絞り 2 7は光路内へ配置された際には光軸 A X上に位置し、ピンホール 2 8及びスリット 2 9よりも開口が大きい通常の落射照明用の開口絞りである。

なお、対物レンズの像側焦点面の光軸方向位置は対物レンズの種類によつて若千異なるため、複数種類の対物レンズを切り替えて観察する場合等には、開口絞り 2 7及びスリット 2 9が各対物レンズの像側焦点面と共役関係を保つような 2006/313522

8 調整機構が必要となる。調整方法としては開口絞りュニット 2 0を光軸方向に移動させても良いが、本実施形態ではレンズ 2 6を光軸方向に移動させる方法によつて調整を行う。その場合開口絞り 2 7及びスリット 2 9はレンズ 2 6の調整巾の範囲で対物レンズの像側焦点面と共役な面の近傍に配置されていればよい。対物レンズの種類に応じてレンズ 2 6を光軸方向に移動させることにより、開口絞り 2 7及びスリット 2 9は調整誤差の範囲内で常に対物レンズの像側焦点面との共役関係を保つことができる。

斯かる開口絞りユニット 2 0には、後述する微調整機構が備えられており、光軸に対して垂直な平面内においてピンホール 2 8及びスリット 2 9と光軸との距離を微調整することができる。これにより、対物レンズ 7の後側焦点面内における位置、あるいはそのその後側焦点面と共役な面内における位置を調整することが可能となり、即ち試料 1 5に対する照明光の入射角度を調整してブリュースター角及びその近傍での照明や全反射照明を行うことが可能となる。なお、プリュ一スター角近傍での照明範囲としては、少なくともブリュース夕一角 ± 1 0 ° が望ましい。

ここで、図 3 Bに示すようにピンホール 2 8は直径の小さなピンホールであり、スリット 2 9は光軸 A Xを中心とする円弧形状のスリットである。このため、前述のようにプリユース夕一角での照明や全反射照明等を行う際には、ピンホール 2 8を選択すれば高いコントラストの観察像が得られ、スリット 2 9を選択すれば明るい観察像が得られる。

また、ピンホール 2 8及びスリット 2 9は、光軸 A Xを回転中心として回転可能に設けられている。これにより、観察される試料 1 5の像に対してコントラス卜をつける方向を変更することができる。

さらに、ピンホール 2 8及びスリット 2 9は、一定の速度で連続して回転させることも可能に設けられている。これにより、コントラス卜の方向性がない試料 1 5の像を観察することができる。特に、本実施形態では回転周期がビデオレート以下に設定されており、 C C Dカメラ 1 0においてリアルタイムでコントラス卜の方向性がない試料画像を得ることができる。

ピンホール 2 8及びスリット 2 9は、光軸を中心とする円周上に複数個備える構成、特に図 3 Cに示すようにそれぞれ 2つのピンホール 2 8及びスリット 2 9 が光軸 A Xを中心に対向して備えられる構成とすることもできる。これにより、ブリュース夕一角での照明や全反射照明等を行う際に、光軸 A Xを挟んで試料 1 5を両側から照明することとなるため、照明方向の偏りを解消することができる。ここで、図 9は上述の図 3 B、図 3 Cに示すピンホール 2 8及び前述の微調整機構を示す図であり、図 1 0 A、 1 0 Bは上述の図 3 B、図 3 Cに示すスリット 2 9及び前述の微調整機構を示す図である。なお、図 9及び図 1 0 A、 1 0 Bには、第 1， 2実施形態における後述の照明光（直線偏光）の振動方向も示されている。

図 9に示すように、ピンホール 2 8と小判形の開口 2 8 aとが光軸 A Xを挟むようにそれぞれ形成された 2枚のプレートが、互いのピンホール 2 8と開口 2 8 aとが対向するように重ねられている。そしてこの 2枚のプレートを、互いのピンホール 2 8と開口 2 8 aとを対向させたままで、かつそれぞれのピンホール 2 8と光軸 A Xとの距離が等しくなるように相対的にスライドさせることで、光軸 A Xに対して垂直な平面内においてピンホール 2 8と光軸 A Xとの距離を微調整することができる。また、この 2枚のプレートには光軸 A Xを中心に回転可能なシャツ夕板 2 8 bがさらに備えられており、これによりピンホール 2 8の個数 ( 1つ又は 2つ）を任意に選択できるようになつている。また、この 2枚のプレ —トは、光軸 A Xを中心に一体的に回転可能に設けられており、これによりピンホール 2 8の位置を光軸 A Xを中心に回転させることができる。なお、図 1 0 C に示すスリット 2 9及び微調整機構は、図 9に示す開口 2 8 a及びシャッ夕板 2 8 bに対応する開口 2 9 a及びシャツ夕板 2 9 bが備えられており、図 9の構成と同様であるため説明を省略する。ボラライザ一ユニット 2 5は、ボラライザ一（偏光素子） 3 0及び中空穴 3 1 を有し、これらは図 3 A中左右方向へスライド可能に設けられており、選択的に切り換えて光路内へ配置することができる。ボラライザ一 3 0は、照明光のうちの直線偏光のみを透過させる、いわゆる振動方向水平のボララィザ一である。以上の構成の本実施形態に係る倒立顕微鏡 1を用い、試料 1 5に照明光をプリユース夕一角で照射して行う観察（以下、 Γブリュース夕一観察」という。）、表面プラズモン共鳴の効果を利用した観察（以下、「表面プラズモン観察」という。）、全反射照明による観察等を行うことができる。これらの観察について以下に述べる。

本倒立顕微鏡 1によってブリュース夕一観察を行う場合、顕微鏡ベース 2において、ブロック切換ユニット 8中のビームスプリツ夕 1 1を光路内へ配置し、光路切換ユニット 9中の全反射プリズム 1 4を光路内へ配置する（なお、同時に接眼観察を行う場合にはプリズム 1 3を選択すればよい。）。また、落射照明装置 5 において、開口絞りユニット 2 0中のピンホール 2 8を光路内へ配置し（なお、観察像の明るさを重視する場合にはスリツト 2 9を選択すればよい。）、ボラライザ一ュニット 2 5中のポラライザ一 3 0を光路内へ配置する。

以上の設定の落射照明装置 5において、水銀ランプ 1 6から発せられた光はレンズ 1 8， 1 9を介してピンホール 2 8を通過し、さらにレンズ 2 1、ミラー 2 2、レンズ 2 3、視野絞り 2 4を介してボラライザ一 3 0へ入射する。この光のうちの直線偏光のみがボラライザ一 3 0を透過し、レンズ 2 6を介して顕微鏡べ —ス 2のビームスプリツ夕 1 1へ導かれる。そしてこの光はビームスプリッタ 1 1によって対物レンズ 7へ導かれ、図 4に示すように対物レンズ 7中を進行し、試料 1 5に対して（詳しくは後述の細胞 3 5とカバーグラス 3 6との境界面に対して) ブリュース夕一角でもって入射する（図 4中、照明光 3 7として示す。）。図 4は、本発明の第 1実施形態に係る倒立顕微鏡によって、照明光をブリュースター角で照射して試料を観察する様子を示す図 1 A— A拡大断面図である。本ブリュース夕一観察の試料 1 5には、例えば細胞が用いられ、図 4に示すように細胞 3 5を載せたカバ一グラス 3 6上に、底部に開口を備えたペトリディッシュ 3 8を配置して培養液 3 9で満たしたものを用いることで、温度や二酸化炭素濃度等の環境条件を還流装置で適切に保持しながら、数時間から数日間にわたって生きたままの細胞を観察することが可能となる。また、上述のように対物レンズ 7は高開口数の液浸対物レンズであって、カバーグラス 3 6の下側に近接して配置され、該カバ一グラス 3 6とレンズ先端との間はオイル 4 0で満たされている。ここで、細胞 3 5に対する照明光の入射角度 Θ は、落射照明装置 5におけるピンホール 2 8の位置を前述の微調整機構によって調整することで変更することができる（前述の設定の際にスリツ卜 2 9を選択している場合はスリツ卜 2 9 位置を調整する。）。これにより、本ブリュース夕一観察において、入射角度 Θ をプリユース夕一角及びその近傍に設定することができる。

前述のようにして照明された細胞 3 5からの反射光 4 1は、対物レンズ 7中を進行し、ビ一ムスプリッ夕 1 1及び全反射プリズム 1 4を介して C C Dカメラ 1 0へ導かれる。このようにして C C Dカメラ 1 0において観察画像が得られ、細胞 3 5をブリュース夕一観察することができる。なお、このブリュース夕一観察では、細胞を構成する物質或いは固液界面に存在する偏光依存性のある物質、例えば高分子化合物や夕ンパク質の界面近傍の形態を観察することができる。

ここで、細胞 3 5が蛍光染色されたものである場合には、顕微鏡ベース 2におけるビ一ムスプリッ夕 1 1を蛍光フィル夕ブロック 1 2に切り換えることで、細胞 3 5から発せられた蛍光を C C Dカメラ 1 0へ導くことができ、細胞 3 5を蛍光観察することができるようになる。即ち、ビ一ムスプリッ夕 1 1と蛍光フィルタブロック 1 2の切り換えによって、ブリュース夕一観察と、斜光照明による細胞 3 5の蛍光観察とを切り換えて同時に行うことができる。なお、この斜光照明による蛍光観察には、細胞における厚み方向へ深い箇所の観察を行うことができるという利点がある。本倒立顕微鏡 1によって表面ブラズモン観察を行う場合には、上述のブリュース夕一観察と同様に試料 15として細胞を用い、図 5に示すように細胞 35との接触面に元素記号 Au、 C r、 Ag、 A】の金合金の薄膜（本実施形態においては膜厚 50 nm程度の金薄膜） 43を形成したカバーグラス 44を使用する。また、光源の波長は、前記薄膜の主成分が金の場合では、 500 nmより長い波長域（A = 500 nm〜 l， 100 nm程度、実際には 600 nm以上で用いることが多い。）のものが用いられ、主成分が銀の場合では、 500 nmより短い波長域（λ = 380 nm〜 500 nm程度）のものが用いられる。図 5は、本発明の第 1実施形態に係る倒立顕微鏡によって、表面プラズモン共鳴の効果を利用して試料を観察する様子を示す A— A拡大断面図である。

また、顕微鏡ベース 2及び落射照明装置 5は、上述のブリュース夕一観察と同様に設定する。そして、落射照明装置 5におけるピンホール 28の位置を調整し、細胞 35に対する照明光の入射角度 Θ を、細胞 35と金薄膜 43との境界面において表面プラズモン共鳴が起こる角度（本実施形態においては全反射の起こる角度）に設定する。

以上の構成の下で照明された細胞 35からの反射光 41は、上述のブリュース夕一観察と同様に、対物レンズ 7、ビームスプリツ夕 1 1、及び全反射ミラ一 1 4を介して CCDカメラ 10へ導かれる。このようにして CCDカメラ 10において観察画像が得られ、細胞 35を表面プラズモン観察することができる。なお、この表面プラズモン観察では、細胞を構成する物質或いは固液界面に存在する偏光依存性のある物質、例えば高分子化合物やタンパク質の構造変化を観察することができる。

ここで、細胞 35が蛍光染色されたものである場合には、顕微鏡ベース 2におけるビ一ムスプリッ夕 1 1を蛍光フィル夕ブロック 12に切り換えることで、細胞 35から発せられた蛍光を CCDカメラ 10へ導くことができ、細胞 35を蛍光観察することができるようになる。即ち、ビ一ムスプリッタ 11と蛍光フィル夕ブロック 1 2の切り換えによって、表面プラズモン観察と、斜光照明（ここでは全反射照明）による細胞 3 5の蛍光観察とを切り換えて同時に行うことができる。

本倒立顕微鏡 1によって全反射照明による観察を行う場合には、顕微鏡ベース 2において、ブロック切換ユニット 8中の蛍光フィルタブロック 1 2を光路内へ配置し、落射照明装置 5を上述のブリュースター観察と同様に設定し、試料 1 5 として蛍光染色した細胞を用いる。そして、落射照明装置 5におけるピンホール 2 8の位置を調整し、試料 1 5に対する照明光の入射角度 Θ を、細胞とカバーグラスとの境界面において全反射の起こる角度に設定する。

以上の構成の下で照明された試料 1 5から発せられた蛍光は、上述のブリュースター観察と同様に、対物レンズ 7、蛍光フィル夕ブロック 1 2、及び全反射ミラ一 1 4を介して C C Dカメラ 1 0へ導かれる。このようにして C C Dカメラ 1 0において観察画像が得られ、試料 1 5の全反射照明による蛍光観察を行うことができる。

さらに、本倒立顕微鏡 1は、顕微鏡ベース 2において、ブロック切換ユニット 8中の蛍光フィル夕ブロック 1 2を光路内へ配置し、光路切換ユニット 9中の全反射ミラー 1 4を光路内へ配置し、さらに落射照明装置 5において、開口絞りュニット 2 0中の開口絞り 2 7を光路内へ配置し、ボラライザ一ュニッ卜 2 5中の中空穴 3 1を光路内へ配置する。

以上の設定の落射照明装置 5において、水銀ランプ 1 6から発せられた光は、落射照明装置 5における上記各部材を介して顕微鏡ベース 2の蛍光フィルタブロック 1 2へ導かれる。そしてこの光は蛍光フィル夕ブロック 1 2によって対物レンズ 7へ導かれ、対物レンズ 7を介して試料 1 5へ入射する。

このようにして照明された試料 1 5から発せられた蛍光は、再び対物レンズ 7、蛍光フィル夕ブロック 1 2、及び全反射ミラー 1 4を介して C C Dカメラ 1 0へ導かれる。このようにして C C Dカメラ 1 0において観察画像が得られ、試料 1 JP2006/313522

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5の通常の落射蛍光観察を行うことができる。

さらに、本倒立顕微鏡 1は、上述のように透過照明装置 3及び接眼観察鏡筒 4 を備えているため、試料 1 5を透過照明して観察することも、蛍光観察以外の上記各観察において肉眼観察を行うこともできる。

なお、本倒立顕微鏡 1では、上述のように落射照明装置 5の光源として水銀ランプ 1 6を備えている。しかしながら本発明はこれに限られず、落射照明装置 5 の光源としてレーザ一光源（レーザー光の集光点が対物レンズの瞳と共役となるように配置したレーザー光源）を用い、開口絞りユニット 2 0におけるピンホール 2 8及びスリット 2 9を省略する構成とすることもでき、これによつてより明るい観察像を得ることが可能となる。なお、レーザ一光源としては、レーザー光の射出位置を光軸に対して垂直な方向へ位置調整可能なもの（これにより前記集光点を光軸に対して垂直な方向へ位置調整できる。）、さらには、前記射出位置が光軸を中心に回転可能であるもの（これにより前記集光点を光軸を中心に回転させることができる。）や、光軸を中心とする同じ円周上に前記射出位置を複数個備えているもの（これにより前記集光点を複数個配置できる。）が望ましい。また、この構成に加え、落射照明装置 5内にスペックル除去光学系、例えばデフユ —ザ一を配置することで、画質のより良い観察像を得ることが可能となる。また、本倒立顕微鏡 1は、上述のように顕微鏡べ一ス 2及び落射照明装置 5の設定を変更することで、ブリュース夕一観察、表面プラズモン観察、及び全反射照明による観察の全てを実施できる。しかしながら本発明はこれに限られず、プリユース夕一観察のみを行う顕微鏡や、プリュ一スター観察と全反射照明による観察を行う顕微鏡等、組み合わせを限定した顕微鏡を構成することも当然可能である。

本倒立顕微鏡 1は、上述のように対物レンズ 7を試料 1 5の真下に近接して配置する構成であるため、高開口数の対物レンズを採用することができ、装置の高解像化を実現できる。また、試料 1 5に対して垂直なこの対物レンズ 7を介して試料の像を結ぶ構成であるため、上記従来技術において必要とされていた、 C C Dカメラで結像面の傾きを補正するための光学系も不要となる。

また本倒立顕微鏡 1は、対物レンズ 7を含む光学系や落射照明装置 5等をステ —ジ 6よりも下方に配置することでステージ 6上に自由な空間が確保されているため、ステージ 6への試料 1 5の設置を容易に行うことができ、特に細胞を生きたままで観察したい場合等に効果的である。

(第 2実施形態）

以下、本発明の第 2実施形態に係る倒立顕微鏡について、上記第 1実施形態に係る倒立顕微鏡と同様の構成である部分には同じ符号を付して説明を省略し、特徴的な部分について詳細に説明する。

図 6は、本発明の第 2実施形態に係る倒立顕微鏡の構成を示す全体側面図である。また、図 7及び図 8は、本発明の第 2実施形態における落射照明装置の構成を示す図及び部分拡大図である。

図 6に示すように、本実施形態に係る倒立顕微鏡 5 0の顕微鏡ベース 2には、ビームスプリッ夕 1 1と光路切換ュニット 9との間に、光軸を中心に回転調整可能でかつ光路内へ挿脱可能な検光子 5 1が備えられている。

また、図 6及び図 7に示すように、本実施形態における落射照明装置 5 2には、ボラライザ一ユニット 2 5とレンズ 2 6との間に、光軸を中心に回転調整可能でかつ光路内へ挿脱可能な 1 Z 4波長板 5 3が備えられている。さらに本実施形態における偏光素子 3 0は、光軸を中心に回転調整可能であって、光源 1 6からの光のうち試料への当該光源 1 6からの光の入射面に対して振動方向が 4 5度の直線偏光のみを通過させるように設定することができるようになつている。

以上の構成の下、本実施形態に係る倒立顕微鏡 5 0において、偏光素子 3 0を前述の設定とし、検光子 5 1と 1 Z 4波長板 5 3とを光路内へ配置し、これ以外の顕微鏡要素は上述した 1実施形態のブリュースター観察時の設定と同じに設定する。これにより、 45度方向に合わせた偏光素子 30を通過させた光をさらに適切な方向に回転させた 1/4波長板 53を通過させた後に対物レンズ 7に入射して試料 15に照射し、その反射光を適切な方向に回転させた検光子 51を通過させて結像して観察画像を得ることができる。

こうして、試料の一部分に着目して、そこに入射して反射する光について考えると、反射後の光は試料の複素屈折率及び屈折率の異方性、厚さ等の物理的性質によって反射光の s偏光と p偏光の反射率及びそれらめ位相差が変化する。そこで、試料で反射した後に反射光の S偏光成分と P偏光成分の位相差が 7T の整数倍になるように 1Z4波長板 54で s偏光と p偏光の位相差をつければ、反射後の光は直線偏光となり、適切な回転角に調整した検光子 51で消光することができる。この条件を満たしていないそれ以外の個所では消光されないため、検光子 51通過後の光を結像すると条件を満たした部分は暗く（消光）、それ以外の部分は明るい状態で観察される。したがって、条件を変えることで試料の別の箇所を暗くして観察することができる。

そして、消光して観察されるときの 1Z4波長板 53の回転角、検光子 51の回転角から、それぞれ s偏光と p偏光の位相差及び振幅反射率の比が求められ、これらを元にその部位の複素屈折率及び異方性を調べることができる。なお、解析手法としては楕円偏光解析で用いられる手法や、文献（S.Henon and Meunier, 'Microscopy at the Brewster angke: Direct observation of first-order phase translat ion in monolayers, Rev. Sci. Instru. Vol.62, pp.936-939 (1991) . ) で用いられる手法が挙げられる。

したがって本実施形態に係る倒立顕微鏡 50は、上記第 1実施形態に係る倒立顕微鏡で実施可能な各観察に加えて、試料の複素屈折率や異方性等を調べるための偏光解析に用いることもできる。

以上の各実施形態によれば、試料、特に培養液に浸されている細胞に対しても照明光をプリユース夕一角で適切に入射させ、試料の固液界面に存在する高分子 TJP2006/313522

17 化合物やタンパク質等の偏光依存性のある物質を高分解能で観察することができる倒立顕微鏡を実現できる。

次に、本発明において最も特徴的な開口絞りュニット 20に微小開口部として備えられている円弧形状のスリット 2 9について説明する。

本実施形態に係る倒立顕微鏡 1の開口絞りュニッ卜 2 0に備えられているスリツ卜 2 9は、以下の設計条件に基づいて設計されている。

はじめに、スリット 2 9を用いてブリュースター観察を行う場合を想定する。図 1 0 Aに示されているスリット 2 9において、円弧の半径を R、半径方向の幅を δ r、円弧の中心角を Φ とすれば、円弧の半径 Rは、試料 1 5に照射される照明光束の入射角度 Θ が次式（A) で決まるブリュース夕一角となるような値に設定することが望ましい。

(A) Θ B = a t a n (n sZn c g)

但し、

n s ：試料媒質の屈折率

n c g ：カバーグラス 3 6の屈折率

この式（A) より円弧の半径 Rは、次式（B) で求められる。

(B) R= s i n (Θ Β) Xn-oilx f

但し、

n-oil ：対物レンズ 7の浸液（オイル 40) の屈折率（いわゆる乾燥系対物レンズの場合は n-oil二 1)

f ：対物レンズ 7の焦点距離

さらに、試料 1 5には、培養液 3 9中の微小細胞構造（3 5) がカバーグラス 3 6に張り付いているものを想定する。

このとき、 n s = l . 33、 n c g= 1. 5 1とすれば、ブリュース夕一角 Θ Bは、上記式（A) より 0 B = 4 1. 3° となる。このとき、円弧の半径 Rは、 n - oil= l . 5 1とすれば、上記式（B) より RZ f = 0. 9 9 7となる。 6313522

18 また、式（B) を変形し、 RZ f -n- oilX s i n (Θ ) とすれば、 R/ f はまた対物レンズの NAを表す。したがって式（B) から、本発明の照明が実現できる対物レンズの N Aを導き出すことができ、上記数値例の場合、 NA≥ 1の液浸対物レンズを用いればよいことがわかる。

ここで、微小細胞構造（35) の屈折率を n c e 1 1 = 1. 35とすれば、背景光即ち試料媒質からの反射光と、信号光即ち微小細胞構造（35) からの反射光とは、それぞれフレネルの反射係数の式及び単層薄膜の反射係数の式を用いて求めることができる。

図 1 1は、スリット 29の半径方向の幅 δ r = 0のときに、スリット 29を半径方向へ移動させることによって照明光束の入射角度 Θ を変化させた際の背景光と信号光の強度変化を示すグラフである。なお、図中の「t」は微小細胞構造 (35) の厚さを表している。

この図 1 1より、ブリュース夕一角 0 B = 41. 3° 近傍において背景光の強度は約 1 0— ⁸〜； L 0— ⁷、信号光の強度は 10一⁵〜 10一⁴であることから、 SZ B比が約 1 0³程度の良好なコントラスト像が得られることがわかる。

ここで、実際の倒立顕微鏡 1においてスリット 29の半径方向の幅 δ rが δ r 0であると、照明光が遮断されてしまうこととなるため、半径方向の幅 δ r は 0でない有限の値となる。このような半径方向の幅 δ rは、その値を大きく設定すればするほど照明光が明るくなるため明るい観察像を得ることができる。そしてまた、半径方向の幅 δ rの値を大きく設定すればするほど照明光のコヒーレンスを低下させることができるため、観察像の背景に生じる干渉縞ノイズを低減することができる。

しかしながら、スリット 29の半径方向の幅 δ rをさらに大きくしていけば、照明光束には、入射角度 Θ で試料 1 5に入射する照明光に、入射角度が Θ からずれた光が含まれることとなり、その結果、観察像のコントラストが低下してしまうという問題がある。このため、半径方向の幅（5 rを過度に大きく設定することはできず、上限値が存在することとなる。

なお、前述の「入射角度が 0 からずれた光」の角度のずれを、本明細書では「角度ばらつき」という。

図 1 2は、スリット 29の半径方向の幅 δ rを変化させた際の角度ばらつきの最大値（5 Θ を示すグラフである。なお、照明光の入射角度 Θ はブリュースター角をとし、図中の横軸は（5 rを対物レンズ 7の焦点距離 f で規格化している。

この図 12より、角度ばらつきの最大値 δ Θ は、 <5 rZf に略比例して増大することがわかり、 5 rZf = 0. 03のとき角度ばらつきの最大値（56 は約 0. 75° 、 <5 r/f = 0. 06のとき角度ばらつきの最大値 δ S は約 1. 5° となる。

このように、スリット 29の半径方向の幅 δ rがある有限の値であれば、背景光及び信号光は、図 12で求めた角度ばらつきの最大値 δ Θ の範囲で図 1 1のグラフを積分した値となる。

例えば、図 1 3 Α、図 1 3 Βには、 S r/ f O. 03、 δ r / f = 0. 06 のときの図 1 1に相当するグラフ（スリット 29を半径方向に移動させて照明光束の入射角度 Θ を変化させた場合の背景光と信号光の強度変化グラフ）をそれぞれ示している。

図 1 3 A及び図 1 3 Bより、スリット 29の半径方向の幅 δ rが大きくなると、図 1 1においてブリュース夕一角近傍で見られた背景光及び信号光の落ち込み力一ブが次第に緩くなり、これらの強度の差も小さくなることがわかる。そして、半径方向の幅 <5 rがさらに大きくなれば、背景光の強度と信号光の強度とが逆転するような半径方向の幅（5 rの上限値が存在することが予想される。したがって、信号光の強度よりも背景光の強度が大きくなると信号（観察像）が背景に埋もれて検出することができなくなってしまうため、これらの強度が逆転する半径方向の幅 δ rの値が上限値となる。 6313522

20 図 1 4は、照明光の入射角度 Θ をブリュース夕一角度 SBとして δ rZf を変化させた際の背景光と信号光の強度変化を示すグラフである。

この図 14より、背景光と信号光の強度は、 3 rZf = 0. 06近傍で逆転していることがわかる。したがつてこの値が好ましいスリット 29の半径方向の幅 δ rの上限値となり、次の条件式（1) が導かれる。

(1) 0<(5 r≤0. 06 X f

但し、

δ X ：スリット 29の半径方向の幅

f ：対物レンズ 7の焦点距離

また、さらに好ましくは、半径方向の幅 <5 rの範囲を条件式（1 ' ) とすることによって、信号光の強度が背景光の強度の約 2倍となり、より良好なコントラス卜の観察像を得ることができる。

( ) 0<(5 r≤0. 03 X f

但し、

δ r ：スリット 29の半径方向の幅 δ r

f ：対物レンズ 7の焦点距離

また、スリット 29の半径方向の幅 δ rの下限値は、 δ r≠ 0を満足する任意の値を設定することが可能である。これは、半径方向の幅 <5 rを小さく設定すればするほど観察像が暗くなるが、より感度の良い撮像素子を用いることで信号光の検出自体は可能となるためである。

しかしながら、このとき観察像のコントラストは高くなり SZB比は図 1 1で述べた約 10³に近づくものの、この一方では照明光のコヒーレンスが高くなり、試料 1 5における構造や屈折率が大きく変化する部位で干渉縞が発生してしまい、これによつて SZN比が低下してしまうという問題が生じてしまう。

した力つて、観察像におけるコントラストと干渉縞ノイズとはトレードオフの関係にあるため、スリット 29の半径方向の幅 δ rの値は、顕微鏡の構成やその用途に応じて、条件式（1) から条件式（1' ) を満足する範囲内で最適な値を選択することが最も好ましい。

次に、スリット 29の円弧の中心角 Φについては、当該中心角 Φを大きく設定すればするほど照明光である直線偏光（p偏光）に s偏光が含まれることとなり、この結果、背景が明るくなり試料 15の観察像のコントラストが低下してしまうことから、 p偏光と s偏光の強度比を計算することによって中心角 Φ の最大値を求めることができる。

図 1 5は、スリット 29の半径方向の幅 δ rを無限小と仮定し、中心角 Φ のみを大きくした際に照明光に含まれる P偏光と s偏光の強度比を示すグラフである。

また、図 16は、上記図 1 1と同じ条件の試料 15に対して入射角度 Θ を変化させながら照明光を入射させた際の P偏光及び s偏光の強度反射率を示すグラフである。なお、 p偏光については、上述のように半径方向の幅 δ rを有限の値に設定すればプリユース夕一角近傍において落ち込みカーブが大幅に緩くなることがわかっているため、 6 r/ f = 0. 03、及び 5 =0. 06の場合も計算している。

図 16より、スリット 29の半径方向の幅 <5 rが <5 r/f = 0. 03、 δ r /f = 0. 06を満足するとき、ブリュース夕一角 0 B (=41. 3。）における P偏光の強度反射率は約 10— ⁵〜10— ⁴であり、 s偏光の強度反射率は約 10 —²であることがわかる。そしてこのことから、 s偏光の強度反射率が p偏光の強度反射率よりも大きくならない条件として、試料 15にブリュース夕一角で入射する照明光において P偏光には s偏光の少なくとも約 100倍の強度が必要であることがわかる。

したがって図 15より、 p偏光と s偏光の強度比が 100となるスリット 29 の中心角（円弧の角度） Φは約 20° であることから、次の条件式（2〉に示すようにこの値が中心角 Φの上限値となる。 JP2006/313522

22

(2) 0<φ≤20°

但し、

φ ：スリット 29の中心角

また、さらに好ましくは、次の条件式（2' ) を満足することで，試料 1 5の観察像のコントラストをより向上することができる。

(2 ' ) 0< ≤ 10。

但し、

Φ ：スリット 29の中心角

なお、上述の条件式（1)又は条件式（1 ' ) と、条件式（2)又は条件式（2 ' ) を満足するスリット 29によって、ブリュースター観察のみでなく表面ブラズモン観察や全反射蛍光観察を行う際にも良好な観察像を得ることができる。

以上、本実施形態に係る倒立顕微鏡 1の開口絞りュニット 20に備えられているスリット 29は、上述の設計条件（条件式（1) 及び条件式（2)) を満足するように設計されている。これにより本実施形態に係る倒立顕微鏡 1は、ブリュ一スター観察、表面プラズモン観察、及び全反射蛍光観察に際して、干渉縞の発生を抑えコントラストの高い良好な観察像をることができる。なお、条件式 (1 ' ) 及び条件式（2'' ) を満足するようにスリット 29を設計すれば、上記各観察に際して干渉縞の発生をより良好に抑えコントラストがより高い観察像を得ることができる。

ここで、本実施形態に係る倒立顕微鏡 1の開口絞りュニッ卜 20に備えられているスリット 29は、上述の構成に限られるものでないため、以下にその態様を説明する。

本実施形態に係る倒立顕微鏡 1の開口絞りュニッ卜 20に備えられているスリツ卜 29は、図 10 Βに示すように上記条件式（ 1 ) 及び条件式（ 2 ) を満足する複数の円弧形状のスリットを光軸 ΑΧから等距離に配置し、さらに各スリッ卜のそれぞれに偏光板（ボラライザ一）を配置し、その偏光方向が各スリットの 313522

23 略中心部分と光軸 A Xを結ぶ直線に対して平行（p偏光）な構成とすることもできる。このとき偏光板の配置はスリツ卜の直前もしくは直後のいずれでも良いが、各スリツ卜を通過する光をそれぞれ正しい偏光方向に変換するためには、偏光板をスリットのごく近傍に配置することが望ましい。

そして斯かる構成において、各スリッ卜を 1つのモジュールとして一方向へ移動して照明角度を変更することで、様々な屈折率を有する試料のブリュース夕一観察、表面プラズモン観察、及び全反射蛍光観察等を実施する場合には、円弧形状である各スリッ卜の曲率による誤差が大きくなつてしまうため、各スリッ卜の中心角 Φ の合計が 2 5 ° 以内となるように設計すれば、複数のスリットが全体として条件式（1 ) を略満足することとなるためより好ましい。特に、各スリツ卜の中心角 φ の合計が 1 3 ° 以内となるように設計すれば、複数のスリットが全体として条件式（1 ' ) を略満足することとなるためさらに好ましい。

またさらに、前述のように複数のスリットを 1つのモジュールとして一方向へ移動する構成とした場合には各スリツ卜の中心角の合計に制約が生じるため、複数のスリツトをそれぞれ別のモジュールとして各スリツ卜を半径方向へ移動する構成とすることもできる。特に、操作性の観点から、複数のスリットは連動して移動可能であることが好ましい。

またこの他には、円弧の半径 Rが異なるスリットを備えたスリット板を予め複数枚用意しておき、観察条件にあわせてこのスリット板を夕一レツトゃスライド等によって切り替える構成とすることもできる。この場合、スリットの中心角 Φ の合計が 3 6 0 ° となるようにスリッ卜を設置することもできる。

また、本実施形態に係る倒立顕微鏡 1において、開口絞りュニット 2 0のスリッ卜 2 9と偏光素子（ボラライザ一 3 0 ) とを光軸 A Xを中心に高速回転させる構成とすることによって、上述したようなスリッ卜を半径方向へ移動させる構成において生じていたスリッ卜の中心角 Φの制約を解消することができる。

より具体的には、半径方向の幅 δ rが条件式（1 ) 又は条件式（1 ' ) を満足する 1つ又は複数のスリットをモー夕等の回転機構で高速回転させることで、試料側から見れば開口が円周全体にわたって設けられていることと同等の状態で観察を行うことができる。なおこのとき、スリットと偏光素子の回転速度は同じである必要があるため、スリットと偏光素子を同期して回転させる構成、又はスリットと偏光素子を 1つのモジュールとして回転させる構成とすることが好ましい。 ―

なお、以上のように本実施形態に係る倒立顕微鏡 1では開口絞りュニッ卜 2 0 に備えられた微小開口部として円弧形状のスリツトを示している力、この微小開口部の形状はこれに限られず、上記条件式（1 ) 及び条件式（2 ) を満足する円弧形状内に含まれるものであれば、例えば矩形ゃ楕円形等であってもよい。また、本実施形態に係る倒立顕微鏡 1において、照明光が s偏光となるようにボラライザ一 3 0の向きを 9 0 ° 回転する、又はボラライザ一 3 0自体を切り替えることによって、本倒立顕微鏡 1を s偏光による多重千渉顕微鏡として使用することもできる。或いは、ボラライザ一 3 0の向きを 4 5 ° 回転して偏光方向を Ρ偏光と s偏光の中間に設定することによって、ブリュースター観察による観察像や表面プラズモン観察による観察像と、多重干渉観察による観察像とを重ね合わせて観察する構成とすることもできる。スリット 2 9が図 1 0 Βに示すように複数の円弧形状のスリットからなる場合には、各スリットのそれぞれに配置する偏光板を、その偏光方向が対応するスリットの略中心部分と光軸 Α Χを結ぶ直線に対して垂直（s偏光）あるいは 4 5 ° となるように配置する。偏光板を 1つのュニッ卜として挿脱切り替え可能な構成とすることにより、スリット 2 9が複数の円弧形状スリツトで構成される場合においても Ρ偏光、 s偏光及び中間の設定による観察像を切り替えて観察することが可能となる。

また、本実施形態に係る倒立顕微鏡 1において、落射照明装置 5に回転拡散板を配置することによって、さらなる干渉縞低減効果を実現することもできる。この場合、照明光は回転拡散板を通過した後で、ボラライザ一 3 0によって直線偏光に変換されることが好ましい。特に、試料 1 5に対して入射角度 Θ で照射される照明光の角度ばらつきを小さく抑えるためには、回転拡散板をスリット 2 9 の手前（開口絞りュニット 2 0の水銀ランプ 1 6側近傍）に配置することが好ましい。一方、角度ばらつきよりも干渉縞低減効果を優先する場合には、回転拡散板をスリット 2 9の後ろ（開口絞りユニット 2 0のボラライザ一 3 0側近傍〉に配置することが好ましい。

さらには、本実施形態に係る倒立顕微鏡 1において、水銀ランプ 1 6からの照明光を光路長の異なる光ファイバを束ねたマルチバンドルファイバを経由させる構成とすることによって、前述の回転拡散板と同様の効果を実現することもでさる。

以上より本実施形態によれば、照明光を試料に対して大きな入射角度で照射する構成の顕微鏡であって、干渉縞の発生を良好に抑えた顕微鏡を実現することができる。

Claims

26 請求の範囲

1 . 光源からの光を対物レンズを介して試料へ入射させ、当該対物レンズを介して前記試料を観察する顕微鏡において、

前記微小開口部を介して前記光源からの光を前記試料に対してプリユース夕一角度で入射させるように前記微小開口部の位置を調整する位置調整手段と、前記光源と前記対物レンズとの間の光路中に配置されており前記光源からの光より直線偏光を取り出し、前記直線偏光の光を前記試料に照射する偏光素子とを有することを特徴とする顕微鏡。

2 . 前記位置調整手段は、前記光源からの光を、ブリュースター角度を含む所定角度範囲内で入射させるベく前記微小開口部を光軸に対して垂直な方向へ位置調整することを特徴とする請求項 1に記載の顕微鏡。

3 . 前記位置調整手段は、前記光源からの光を、ブリュース夕一角度を含む所定角度範囲内で入射させるベく前記微小開口部を光軸に対して回転方向に位置調整することを特徴とする請求項 1に記載の顕微鏡。

4 . 前記偏光素子は、前記直線偏光の光として P偏光あるいは S偏光に切換えることを特徴とする請求項 1に記載の顕微鏡。

5 . 前記位置調整手段は、前記試料に対して前記光源からの光を全反射角度で入射させるベく前記微小開口部を光軸に対して垂直な方向へ位置調整でき、前記光源からの光を前記試料に対して前記ブリュースター角度又は前記全反 27 射角度を切り換えて入射させて観察を行うことを特徴とする請求項 2に記載の顕微鏡。

6 . 前記微小開口部よりも開口の大きな落射照明用の開口絞りと、

前記微小開口部と前記開口絞りとを光路内へ切り換えて前記開口絞りを光軸上に配置する切換手段とを有することを特徴とする請求項 1に記載の顕微鏡。

7 . 前記位置調整手段は、前記試料と接する面に金属の薄膜が形成されているカバ一グラスを用いた際に前記試料と前記金属の薄膜との間で表面プラズモン共鳴が生じる角度で前記光源からの光を前記試料に対して入射させるベく、前記微小開口部を光軸に対して垂直な方向へ位置調整することを特徴とする請求項 2に記載の顕微鏡。

8 . 前記微小開口部は、ピンホール又は光軸を中心とする円弧状のスリットであることを特徴とする請求項 1に記載の顕微鏡。

9 . 前記微小開口部は、光軸を中心とする同一円周上に複数個設けられていることを特徴とする請求項 1に記載の顕微鏡。

1 0 . 前記微小開口部は、光軸を中心に回転可能に設けられていることを特徴とする請求項 1に記載の顕微鏡。

1 1 . レーザ一光源からのレーザー光を対物レンズを介して試料へ入射させ、当該対物レンズを介して前記試料を観察する顕微鏡であって、

前記レーザ一光源と前記対物レンズとの間の光路中に配置されており前記レ一ザ一光から直線偏光を取り出す偏光素子を有し、前記レーザー光源は、前記レーザ一光の集光点が前記対物レンズの瞳と共役な位置に配置されており、かつ前記レーザ一光が前記試料に対してブリュースター角度で入射させる位置にあることを特徴とする顕微鏡。

1 2 . 前記レーザ一光源は、前記レーザー光をブリュースター角度で入射させるべく、前記レーザ一光の集光点を光軸に対して垂直な方向へ位置調整することが可能であることを特徴とする請求項 1 1に記載の顕微鏡。

1 3 . 前記レーザー光源は、前記試料に対して前記レーザー光を全反射角度で入射させるベく、前記レ一ザ一光の射出位置を光軸に対して垂直な方向へ位置調整することが可能であり、

前記レーザー光を前記試料に対して前記ブリュース夕一角度又は前記全反射角度を切り換えて入射させて観察を行うことを特徴とする請求項 1 2に記載の顕微鏡。

1 4 . 前記レーザー光源は、前記試料と接する面に金属の薄膜が形成されているカバーグラスを用いた際に前記試料と前記金属の薄膜との間で表面ブラズモン共鳴が生じる角度で前記レーザー光を前記試料に対して入射させるベく、前記レーザー光の射出位置を光軸に対して垂直な方向へ位置調整することが可能であることを特徴とする請求項 1 2又は 1 3に記載の顕微鏡。 .

1 5 . 前記レーザー光源は、光軸を中心とする同一円周上に前記レーザー光の射出位置を複数個備えていることを特徴とする請求項 1 1に記載の顕微鏡。

1 6 . 前記レーザー光源は、前記レーザ一光の射出位置を光軸を中心に回転可能であることを特徴とする請求項 1 1に記載の顕微鏡。 29

1 7 . さらに、前記偏光素子と前記対物レンズとの間の光路中に配置された 1 / 4波長板と、検光子とを、光軸を中心に回転可能でかつ光路内へ挿脱可能に有し、

前記 1 4波長板と前記検光子とを光路内へ配置し、かつ前記偏光素子が前記光源からの光のうち前記試料への前記光源からの光の入射面に対して振動方向が 4 5度の直線偏光のみを通過させるように設定することで、前記試料の偏光解祈に用いることもできることを特徴とする請求項 1に記載の顕微鏡。

1 8 . 光源からの光を対物レンズを介して試料へ入射させ、当該対物レンズを介して前記試料を観察する顕微鏡において、

前記光源と前記対物レンズとの間の光路中であって前記対物レンズの像側焦点面あるいはその共役面の近傍に配置されており、かつ前記光源からの光を前記試料に対して略ブリュース夕一角度で入射させる円弧形状の微小開口部と、前記光源と前記対物レンズとの間の光路中に配置されており前記光源からの光より直線偏光を取り出す偏光素子とを有し、

前記円弧形状の微小開口部が、以下の条件式を満足することを特徴とする顕微鏡。

δ τ≤0 . 0 6 X f

φ≤ 2 0 °

但し、

δ r ：前記円弧形状の微小開口部の半径方向の幅

f ：前記対物レンズの焦点距離

Φ ：前記円弧形状の微小開口部の中心角

1 9 . 前記円弧形状の微小開口部よりも開口の大きな落射照明用の開口絞りと、前記円弧形状の微小開口部と前記開口絞りとを光路内へ切り換えて前記開口絞りを光軸上に配置する切換手段とを有することを特徴とする請求項 1 8に記載の顕微鏡。

2 0 . 光軸を中心とする略同一円周上に複数の前記円弧形状の微小開口部を有し、

複数の前記円弧形状の微小開口部のそれぞれに偏光板を備え、前記偏光板はそれぞれ対応する微小開口部の略中心と光軸とを結ぶ直線に対して、平行又は垂直又は 4 5 ° であることを特徴とする請求項 1 8に記載の顕微鏡。

2 1 . 複数の前記円弧形状の微小開口部は、それぞれ独立に半径方向へ移動可能に設けられていることを特徴とする請求項 2 0に記載の顕微鏡。

2 2 . 前記円弧形状の微小開口部、又は、複数の前記円弧形状の微小開口部と前記偏光板は、光軸を中心として高速回転可能に設けられていることを特徴とする請求項 1 8に記載の顕微鏡。 '

2 3 . 前記光源と前記対物レンズとの間の光路中に、回転拡散板を備えていることを特徴とする請求項 1 8に記載の顕微鏡。