WO2006103995A1 - 光学活性α－アミノ酸誘導体の製造方法 - Google Patents

光学活性α－アミノ酸誘導体の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2006103995A1
WO2006103995A1 PCT/JP2006/305737 JP2006305737W WO2006103995A1 WO 2006103995 A1 WO2006103995 A1 WO 2006103995A1 JP 2006305737 W JP2006305737 W JP 2006305737W WO 2006103995 A1 WO2006103995 A1 WO 2006103995A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
optically active
amino acid
acid derivative
hydantoinase
rubamyl
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/305737
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Makoto Ueda
Hirokazu Nanba
Original Assignee
Kaneka Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kaneka Corporation filed Critical Kaneka Corporation
Publication of WO2006103995A1 publication Critical patent/WO2006103995A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an optically active ⁇ -amino acid derivative that is useful as an intermediate for pharmaceuticals and the like. More specifically, in the presence of a divalent metal ion, the racemic ⁇ -strength rubamylamino acid derivative is allowed to produce a hydantoinase whose hydrolysis activity is inhibited by the metal ion.
  • the present invention relates to a method for obtaining a hydantoin derivative and an optically active ⁇ ⁇ carbamyl amino acid derivative.
  • an extraction method requires large-scale purification equipment from protein hydrolysates.
  • the amino acid to be produced is usually a racemate, so that an expensive resolving agent, an asymmetric catalyst, etc. are required to produce an optically active substance.
  • Fermentation methods have low product concentrations and require large-scale purification equipment, as with extraction methods.
  • Non-patent Documents 1 and 2 As a method for synthesizing D-a amino acid by enzymatic synthesis, for example, a microorganism or enzyme having hydantoinase activity is used to selectively hydrolyze racemic 5-substituted hydantoin derivatives to form D Lubamil D—a Methods for producing amino acid derivatives are known (Patent Documents 1 and 2). In addition, it is generally known that there are examples in which divalent metal ions such as manganese and cobalt contribute to the improvement of enzyme activity in a hydrolysis reaction in which a hydantoinase is allowed to act on a 5-substituted hydantoin derivative to open the ring. (Non-patent documents 2 and 3).
  • Patent Documents 3 and 4 There are also known examples of adding manganese, which is a divalent metal ion, to carry out a cyclization reaction (Patent Document 5).
  • Patent Document 1 JP-A 53-44690
  • Patent Document 2 JP-A-53-91189
  • Patent Document 3 JP-A-60-180596
  • Patent Document 4 JP-A-1-124398
  • Patent Document 5 WO03Zl06689
  • Non-patent literature 1 Advances Biochemical EngmeermgZBiotechnoiogy, 41 ⁇ , 29, 1990
  • Patent Document 2 Bioscience Biotechnology Biochemistry ⁇ 58 ⁇ , 1621, 19 94
  • Non-Patent Document 3 Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2 ⁇ , 163, 1997
  • the reaction of hydantoinase is a reversible reaction, and in the method of adding a divalent metal ion, the reverse reaction is not only the target hydrolysis reaction (or cyclization reaction). Is easily expected to be promoted.
  • a method of promoting only the target hydrolysis reaction or cyclization reaction more preferably a method of promoting the target reaction and inhibiting the reverse reaction Is desired.
  • an object of the present invention is to provide a practical method for industrial production, for example, an optically active ⁇ -amino acid derivative useful as an intermediate of a pharmaceutical can be easily produced from a predetermined raw material. There is.
  • optically active 5-substituted hydantoin derivatives can be obtained by stereoselectively cyclizing racemic and strong rubamyl amino acid derivatives using hydantoinase.
  • the divalent metal ion inhibits the hydrolysis activity, which is the reverse reaction of the above cyclization reaction.
  • the cyclization reaction was greatly accelerated.
  • the present invention relates to the general formula (2):
  • R is an optionally substituted alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, has a substituent !, may be an aralkyl group having 7 to 20 carbon atoms, or is substituted.
  • a hydantoinase that inhibits the activity of hydrolyzing a 5-substituted hydantoin derivative into N-strength rubamyl amino acid by the divalent metal ion is represented by the general formula (1):
  • the present invention relates to a production method comprising stereoselectively cyclizing a high-strength rubamyl amino acid derivative represented by the formula (wherein R is as defined above).
  • the present invention also provides an optically active 5-substituted hydantoin derivative represented by the above formula (2), and
  • the present invention relates to a production method characterized by stereoselectively cyclizing a strong rubamyl amino acid derivative.
  • the present invention has the above-described configuration, and can efficiently produce an optically active 5-substituted hydantoin derivative and an optically active high-power rubamyl amino acid derivative.
  • a general hydantoinase has an activity of hydrolyzing a 5-substituted hydantoin derivative to produce a strong rubamyl amino acid derivative, and the reverse reaction of the hydrolysis reaction. It is known to have both the activity of cyclizing strong rubamyl amino acid derivatives to form 5-substituted hydantoin derivatives. In addition, it is known that the enzyme activity of the above hydrolytic reaction of hydantoinase is improved by divalent metal ions.
  • R has a substituent, and may have an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, a substituent! However, it also has an aralkyl group having 7 carbon atoms or a aralkyl group having 20 substituents! Or may represent an aryl group having 6 to 20 carbon atoms.
  • the alkyl group having 1 to 20 carbon atoms is not particularly limited, and for example, a straight chain alkyl group such as a methyl group, an ethyl group, or an n-propyl group, an isopropyl group, an isobutyl group, or a t-butyl group. And branched alkyl groups such as a neopentyl group or a t-pentyl group.
  • the aralkyl group having 7 to 20 carbon atoms which may have a substituent is not particularly limited, and examples thereof include a benzyl group, an indolylmethyl group, a 4-hydroxybenzyl group, and 3, 4-methylenedialkyl.
  • aryl group having 6 to 20 carbon atoms which may have a substituent examples include a phenol group and a 4-hydroxyphenol group.
  • the alkyl group, aryl group or aralkyl group may be unsubstituted or may have a substituent.
  • substituent examples include an amino group, a hydroxyl group, a phenol group, an aryl group, an alkanol group, an alkenyl group, an alkyl group, an alkoxyl group, and a halogen atom.
  • Hydantoinase is an enzyme having an activity of hydrolyzing a 5-substituted hydantoin derivative to produce an N-force rubamylamino acid derivative.
  • this enzyme is known to cyclize an N-strength rubamoyl amino acid derivative to produce a 5-substituted hydantoin derivative as the reverse reaction of the hydrolysis reaction.
  • conventional hydantoinases have improved enzyme activity in the presence of divalent metal ions such as manganese and conoleto. It has been.
  • the hydantoinase used in the present invention has a property that its hydrolysis activity is inhibited by a predetermined divalent metal ion. Therefore, as the hydantoinase of the present invention, for example, hydantoinase derived from animals, plants, or microorganisms and having hydrolytic activity inhibited by divalent metal ions can be used. For industrial use, hydantoinase derived from microorganisms is preferred.
  • microorganism from which hydantoinase is derived can be used as long as it is a microorganism having the ability to produce the enzyme.
  • bacteria include Aceto bacter, Achromobacter, Aerobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus ( Bacillus), Brevibacterium, Corynebacterium, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Microbacteria (Microbacterium), Micrococcus, Protaminobacter (Protaminobacter, Proteus no., Proteus no, No.
  • Domonas for Pseudomonas (Sartina), Serratia, Serratia, Xanthomonas Genus (Xanthomonas), Aeromonas, Flavobataterium (Fla vobacterium), or a microorganism belonging to the genus Rhi zobium.
  • actinomycetes microorganisms belonging to the genus Actinomyces, Mycobacterium, Nocardia, Streptomyces, Actinoplanes or Rhodococcus Can be mentioned.
  • Examples of the fungi include microorganisms belonging to the genus Aspergillus, Paecilomyces, Penicillium, and the like.
  • yeast examples include microorganisms belonging to the genus Candida, the genus Phichia, the genus Rhodo torula or the genus Torulopsis.
  • enzymes derived from microorganisms belonging to the genus Agrobacterium, Bacillus, Pseudomonas or Rhizobium can be mentioned. More preferably, Agrobacterium sp. KNK712 (FERM BP—1900), Bacillus sp. KNK2 45 (FERM BP— 4863), Pseudomonas putida NBRC12 996, Pseudomonas sp. (Pseudomonas sp.) KNK003A (FERM BP— 3181) or Rhizobium sp. KNK1415 (FERM BP— 44) Is mentioned.
  • Agrobacterium sp. KNK712 (FERM BP— 1900), Bacillus sp. KNK245 (FERM BP— 486 3), Pseudomonas sp. KNK003A (FERM BP-3 181) and Rhizobium sp. KNK1415 (FERM BP-441 9) are registered with the Patent Product Deposit Center (IPOD: 305- 8566 Deposited at Tsukuba Sakai Higashi, 1-chome, 1-chome, 1-center, 6), Ibaraki, Japan.
  • Rhizobium sp. KNK1415 (FERM BP- 4419): September 22, 1993.
  • NBRC12996 The above-mentioned Pseudomonas putida NBRC12996 is an independent administrative agency, National Institute of Technology and Evaluation, Biotechnology Headquarters, Biogenetic Resource Division (NBRC: 292-0818, Chiba Prefecture Kisarazu Kazusa Kamashisa 2-5-8) It is stored and can be obtained from the same institution.
  • Any transformant obtained in this manner that produces a high yield of D-form selective hydantoinase can be used as long as the hydrolysis activity is inhibited by a divalent metal ion.
  • Escherichia coli HB 101 pTH 104
  • FERM BP— 4864 containing a hydantoinase gene derived from Bacillus sp. K NK245 (FERM BP-4863) described in WO96Z20275.
  • the production of hydantoinase by these transformants, or the production of hydantoinase by a strain exhibiting the above-mentioned hydantoinase activity, for example, can be performed by culturing using a normal nutrient medium described in WO96 / 20275.
  • treatment for enzyme induction can be performed.
  • Escherichia coli HB 101 (pTHl 04) (FERM BP—486 4) is a patent biological deposit center (IPOD: 305) -8566 Deposited at Tsukuba Sakai Higashi, 1-chome, 1-chome, 1st, Central 6), Ibaraki, Japan (Deposit date: November 2, 1994).
  • the hydantoinase produced by the above-mentioned microorganism can be used not only as the enzyme itself, but also as a form of a microorganism having the enzyme activity or a processed product thereof.
  • the treated product of microorganisms means, for example, a crude extract, cultured cells, freeze-dried cells, acetone-dried cells, or a crushed product of these cells.
  • the hydantoinase or a processed product thereof may be used as the enzyme itself or as a fixed enzyme obtained by fixing it with a known means in the form of cells.
  • the immobilization may be carried out by a cross-linking method, a covalent bonding method, a physical adsorption method, a comprehensive method, etc., which are well known to those skilled in the art.
  • racemic N-strength rubamyl amino acid derivative (1) is stereoselectively cyclized with hydantoinase to synthesize an optically active 5-substituted hydantoin derivative (2) and an optically active N-force rubamyl amino acid derivative (3). How to do will be described.
  • the enzyme reaction of the present invention can be carried out by the following method.
  • a racemic N-type rubamyl amino acid derivative represented by the general formula (1) is used as a substrate, and the reaction is carried out in an aqueous medium in the presence of the above-mentioned hydantoinase and a divalent metal ion.
  • the concentration of the divalent metal ion is 0. OlmM or more, 1M or less, preferably 0. ImM or more, 1OmM or less, and the substrate concentration is 0.1% or more, 90% (wZv) or less, preferably 1% or less.
  • the reaction is performed in a dissolved or suspended state at 60% (wZv) or less.
  • the reaction temperature is adjusted to an appropriate temperature of 10 ° C or higher and 80 ° C or lower, preferably 20 ° C or higher and 60 ° C or lower, and is kept at pH 4 or higher, 9 or lower, preferably pH 5 or higher, 8 or lower for a while. It may be left still or stirred. Further, the substrate may be added continuously.
  • the reaction can be carried out batchwise or continuously.
  • the reaction of the present invention may be performed using an immobilized enzyme, a membrane reactor, or the like.
  • divalent metal ion examples include, but are not limited to, ions such as vanadium, chromium, manganese, iron, conoleto, nickel, copper, zinc, molybdenum, magnesium, or calcium. Cobalt, zinc, manganese or nickel ions are preferable, and cobalt or zinc ions are more preferable. These metal ions can be used alone or in combination of two or more metal ions.
  • aqueous medium examples include water, a buffer solution, an aqueous medium containing a water-soluble organic solvent such as ethanol, or an organic solvent that is difficult to dissolve in water, such as ethyl acetate, butylacetate, toluene,
  • a suitable solvent such as a two-layer system with an aqueous medium containing an organic solvent such as black mouth form and n-xane can be used.
  • antioxidants, surfactants, coenzymes, metals, etc. can be added as necessary.
  • optically active form of the racemic N-force rubamyl amino acid derivative is cyclized by the stereoselective hydantoinase of the present invention to produce an optically active 5-substituted hydantoin derivative.
  • an optically active N-force rubamyl amino acid derivative having the opposite steric structure remains. Isolation of the obtained optically active 5-substituted hydantoin derivative and optically active N-force rubamyl amino acid derivative can be performed by a conventional separation method such as extraction, concentration, crystallization, or column chromatography. Or they can be separated and purified by their combination.
  • optically active 5-substituted hydantoin derivative and optically active N-carbamylamino acid derivative can be obtained by known chemical methods (for example, acid / alkali treatment) or enzymatic methods (for example, decarbamylase). Can be easily derived to the corresponding optically active amino acid by the weak ruby moisturizing treatment.
  • the racemic N-force rubamyl amino acid derivative is exemplified.
  • a conductor may be used.
  • an optically active N-force rubamyl amino acid derivative is used, the optical purity of, for example, the remaining optically active N-force rubamyl amino acid derivative or the optically active 5-substituted hydantoin derivative produced by the hydantoinase of the present invention. Can be improved.
  • Escherichia coli HB101 pTH104 (FERM BP-4864), a recombinant E. coli with D-selective hydantoinase activity, sterilized in a 500 ml Sakaguchi flask (tryptone 16 g, yeast extract 10 g, chloride) 5 g of sodium, 11 deionized water, 400 ppm of manganese chloride, pH 7.0 before sterilization, and filter sterilized ampicillin sodium added separately at a final concentration of lOO ppm) and shaken at 37 ° C for 24 hours. Cultured aerobically.
  • the resulting culture is collected by centrifuging from 1 ml of the culture broth, suspended in 5 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), disrupted by sonication, and centrifuged to centrifuge the cells. The insoluble matter was removed, and a crude enzyme solution of D-form selective hydantoinase was obtained.
  • 4 ml of 50 mM sodium carbonate Z sodium hydrogen carbonate buffer (pH 8.7) containing 30 mM D-5-isobutylhydantoin and various metal salts shown in Table 1 was mixed. After standing at 40 ° C for 15 minutes, the reaction was stopped by adding 1 ml of 5N sulfuric acid. Table 1 shows the results of analyzing the amount of D—N—force rubamoyl leucine produced using high performance liquid chromatography (HPLC).
  • Table 2 shows the results of analysis of the amount of D—N-force rubermoyl (4-hydroxyphenyl) glycine produced using HPLC.
  • the obtained crude enzyme solution 0.1 ml contains 30 mM D—N—forced rubermoyl leucine and cobalt chloride or zinc sulfate at the concentrations shown in Table 3 50 mM 2— [4 (2- Hydroxy et hyl) 1 -piperazinyllethanesulfonic acid ( 4 ml of HEPES) -NaOH buffer (pH 7.0) was added and mixed. After standing at 40 ° C for 15 minutes, 4 ml of acetonitrile was added to stop the reaction. Table 3 shows the results of analysis of the amount of D-5 isoptylhydantoin produced in the same manner as in Reference Example 1.
  • Example 2 D-5- (4-hydroxyphenyl) hydantoin using hydantoinase Culture medium used in Example 1 11. Bacteria were collected by centrifugation at 7 ml force, and 10 mM Tris —Suspend in 5 ml of hydrochloric acid buffer (pH 8.5) and crush the cells by ultrasound. Then, remove the insoluble matter derived from the cells by centrifugation and remove the crude enzyme solution of D-form selective hydantoinase. Got.
  • Example 2 The crude enzyme solution used in Example 1 was mixed with 0.05 ml of 1M HEPES-NaOH buffer (6.8) containing 10% (wZv) DL-N-strong rubermoyl leucine and ImM cobalt chloride (6.8). . After stirring at 40 ° C for 3 hours, the yield and optical purity of the produced D-5 isoptylhydantoin and the remaining LN strength rubermoyl leucine were analyzed using HPLC, and as a comparative example, Table 5 shows the results when no force was added.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　本発明は、ラセミ体Ｎ－カルバモイルアミノ酸誘導体をヒダントイナーゼによって立体選択的に環化させて、光学活性な５－置換ヒダントイン誘導体及び光学活性なＮ－カルバモイルアミノ酸誘導体を製造する方法であって、該環化反応を、二価の金属イオンの存在下、該金属イオンによって５－置換ヒダントイン誘導体からＮ－カルバモイルアミノ酸誘導体への加水分解（逆反応）が阻害されるヒダントイナーゼを用いて行うことを特徴とする方法である。 　本発明の方法によれば、光学活性５－置換ヒダントイン誘導体、ならびに光学活性Ｎ－カルバミルアミノ酸誘導体を簡便な方法で製造することができる。さらに、これら化合物は、医薬品等の中間体として有用な光学活性α－アミノ酸誘導体に容易に導くことができる。                                                                               

Description

明 細 書
光学活性 a 一アミノ酸誘導体の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、医薬品等の中間体として有用な、光学活性 α アミノ酸誘導体の製造 法に関する。より詳細には、二価の金属イオンの存在下、ラセミ体 Ν—力ルバミルアミ ノ酸誘導体に、該金属イオンにより加水分解活性が阻害されるヒダントイナーゼを作 用させること〖こより光学活性な 5—置換ヒダントイン誘導体及び光学活性な Ν カル バミルアミノ酸誘導体を得る方法に関する。
背景技術
[0002] 光学活性アミノ酸の製造方法としては、抽出法、化学合成法、発酵法、酵素的合成 法など種々の方法が知られている。抽出法では蛋白質加水分解物からの大規模な 精製設備が必要となる。化学合成法では、製造されるアミノ酸は通常ラセミ体である ため、光学活性体を製造するためには、高価な分割剤、不斉触媒等を必要とする。 発酵法では、生成物濃度が低ぐまた、抽出法同様大規模な精製設備を必要とする 。酵素的合成法は安価な生体触媒を利用することにより、これらの問題点を回避して 、より低コストで効率のよい製造方法を提供可能である。
[0003] 酵素的合成法による D— a アミノ酸の合成方法としては、例えば、ヒダントイナー ゼ活性を有する微生物もしくは酵素を用いてラセミ体 5—置換ヒダントイン誘導体を D 体選択的に加水分解して N 力ルバミル D— a アミノ酸誘導体を製造する方法 が知られている（特許文献 1及び 2)。また、 5 置換ヒダントイン誘導体にヒダントイナ ーゼを作用させて開環する加水分解反応において、マンガン、コバルト等の二価の 金属イオンが酵素活性の向上に寄与する例があることも一般に知られている（非特許 文献 2、及び 3)。
[0004] 一方、ラセミ体 N—力ルバミルアミノ酸誘導体にヒダントイナーゼを作用させて環化 し、光学活性 5—置換ヒダントイン誘導体を製造する方法もまた公知であり（特許文献 3及び 4)、効率的に環化反応を行うために二価の金属イオンであるマンガンを添カロ する例も知られて!/ゝる（特許文献 5)。 特許文献 1：特開昭 53—44690
特許文献 2：特開昭 53 - 91189
特許文献 3 :特開昭 60— 180596
特許文献 4：特開平 1— 124398
特許文献 5 :WO03Zl06689
非特干文献 1： Advances Biochemical EngmeermgZBiotechnoiogy、 41卷、 29頁、 1990年
特許文献 2 : Bioscience Biotechnology Biochemistry^ 58卷、 1621頁、 19 94年
非特許文献 3 Journal of Molecular Catalysis B : Enzymatic, 2卷、 163頁、 1997年
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] しかしながら、ヒダントイナーゼの反応は可逆反応であることは周知であり、上記の 二価の金属イオンを添加する方法では、目的とする加水分解反応 (又は環化反応） だけでなぐその逆反応までもが促進されることが容易に予想される。 目的の光学活 性体を効率よく製造するためには、目的の加水分解反応もしくは環化反応のみを促 進する方法、更に好ましくは、目的の反応を促進し、且つ、逆反応を阻害する方法が 望まれる。
[0006] 上記に鑑み、本発明の目的は、例えば医薬品の中間体として有用な光学活性 α アミノ酸誘導体を、所定の原料から簡便に製造でき、工業的生産に対して実用的 な方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者等は上記に鑑み、鋭意検討を行った結果、ヒダントイナーゼを使用してラ セミ体 Ν 力ルバミルアミノ酸誘導体を立体選択的に環化して光学活性な 5—置換ヒ ダントイン誘導体及び光学活性な Ν 力ルバモイルアミノ酸誘導体を得る反応を行う 場合にお 1、て、二価の金属イオンにより上記環化反応の逆反応である加水分解活性 が阻害されるにもかかわらず、逆に上記環化反応が大幅に促進されることを見出した [0008] 本発明の対象の一部として、例えば以下のものを挙げることができる。
[0009] すなわち本発明は、一般式 (2)：
[0010] [化 10]
Figure imgf000004_0001
[0011] (式中、 Rは置換基を有していてもよい炭素数 1から 20のアルキル基、置換基を有し て!、てもよ 、炭素数 7から 20のァラルキル基、又は置換基を有して!/、てもよ 、炭素数 6から 20のァリール基を表し、 *は不斉炭素原子を表す。）で表される光学活性 5— 置換ヒダントイン誘導体、及び、一般式 (3)：
[0012] [化 11]
Figure imgf000004_0002
[0013] (式中、 R及び *は前記と同じ)で表される光学活性 N—力ルバミルアミノ酸誘導体の 製造方法であって、
二価の金属イオンの存在下、当該二価の金属イオンによって 5—置換ヒダントイン誘 導体を N—力ルバミルアミノ酸に加水分解する活性が阻害されるヒダントイナーゼを 用いて、一般式（1) :
[0014] [化 12]
Figure imgf000005_0001
[0015] (式中、 Rは前記と同じ)で表される Ν—力ルバミルアミノ酸誘導体を立体選択的に環 化することを特徴とする製造方法に関する。
[0016] また、本発明は、前記式 (2)で表される光学活性 5—置換ヒダントイン誘導体、及び
、前記式（3)で表される光学活性 Ν—力ルバミルアミノ酸誘導体の製造方法であって コバルトイオン又は亜鉛イオンの存在下、ヒダントイナーゼを用いて前記式（1)： で表される Ν—力ルバミルアミノ酸誘導体を立体選択的に環化することを特徴とする 製造方法に関する。
発明の効果
[0017] 本発明は上述の構成からなり、光学活性な 5—置換ヒダントイン誘導体及び光学活 性な Ν—力ルバミルアミノ酸誘導体を効率よく製造することができる。
発明を実施するための最良の形態
[0018] 上述のように、一般的なヒダントイナーゼは、 5—置換ヒダントイン誘導体を加水分 解して Ν—力ルバミルアミノ酸誘導体を生成する活性、および、その加水分解反応の 逆反応として、 Ν—力ルバミルアミノ酸誘導体を環化して 5—置換ヒダントイン誘導体 を生成する活性の両者を有することが知られている。また、ヒダントイナーゼの上記加 水分解反応の酵素活性は、二価の金属イオンによって向上する例が知られて 、る。
[0019] 一方、本発明者による検討の結果、実施例の D体選択的ヒダントイナーゼは、所定 の二価の金属イオンによって上記加水分解反応の活性が阻害される性質を有するこ とがわかった (後述の参考例 1、 2参照)。
[0020] 一般に、加水分解酵素について、特定の化合物により加水分解活性が阻害される のであれば、逆反応も同化合物によって阻害されることが予想される。しかしながら、 本発明者による更なる検討の結果、意外にも、実施例の D体選択的ヒダントイナーゼ は、二価の金属イオンによって環化反応が促進されることがわ力つた (後述の実施例
1〜3参照)。
[0021] 以下、本発明を詳細に説明する。
[0022] 1.ラセミ体 N—力ルバミルアミノ酸誘導体
本発明に用いるラセミ体 N—力ルバミルアミノ酸誘導体（1)において、 Rは置換基を 有して 、てもよ 、炭素数 1から 20のアルキル基、置換基を有して!/、てもよ 、炭素数 7 力も 20のァラルキル基、又は置換基を有して!/、てもよ 、炭素数 6から 20のァリール基 を表す。
[0023] 炭素数 1から 20のアルキル基としては、特に限定されず、例えばメチル基、ェチル 基、または、 n—プロピル基等の直鎖アルキル基、もしくはイソプロピル基、イソブチル 基、 t—ブチル基、ネオペンチル基、または、 t—ペンチル基等の分枝アルキル基が 挙げられる。置換基を有していてもよい炭素数 7〜20のァラルキル基としては、特に 限定されず、例えば、ベンジル基、インドリルメチル基、 4ーヒドロキシベンジル基、又 は、 3, 4—メチレンジォキシベンジル基等が挙げられる。置換基を有していてもよい 炭素数 6〜20のァリール基としては、フエ-ル基、または 4ーヒドロキシフエ-ル基な どが挙げられる。上記アルキル基、ァリール基、または、ァラルキル基は無置換であ つてもよく、また置換基を有していてもよい。置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基 、フエ-ル基、ァリール基、アルカノィル基、ァルケ-ル基、アルキ-ル基、アルコキシ ル基、ハロゲン原子等が挙げられる。
[0024] 2.ヒダントイナーゼの取得
ヒダントイナーゼは、 5—置換ヒダントイン誘導体を加水分解して N—力ルバミルアミ ノ酸誘導体を生成する活性を有する酵素である。本酵素は、一般に、加水分解反応 の逆反応として、 N—力ルバモイルアミノ酸誘導体を環化して 5—置換ヒダントイン誘 導体を生成することが知られている。また、 5—置換ヒダントイン誘導体に作用させて 開環する加水分解反応において、従来のヒダントイナーゼは、マンガン、コノ レト等 の二価の金属イオンの存在下で酵素活性が向上する例があることが知られている。
[0025] 一方、本発明で用いるヒダントイナーゼは、所定の二価の金属イオンにより加水分 解活性が阻害される性質を有する。したがって、本発明のヒダントイナーゼとしては、 例えば動物、植物、または微生物由来のヒダントイナーゼであって、かつ、二価の金 属イオンにより加水分解活性が阻害されるものを使用することができる。工業的な利 用には微生物由来のヒダントイナーゼが好ましい。
[0026] ヒダントイナーゼの由来となる微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生 物であればいずれも利用できる力 例えば、以下の公知の、当該酵素の生産能力を 有する微生物を挙げることができる。すなわち、細菌としてはァセトパクター属 (Aceto bacter)、ァクロモノくクター属 (Achromobacter)、了エロパクター属 (Aerobacter)、ァグ ロバクテリゥム属（Agrobacterium)、アルカリゲネス属 (Alcaligenes)、ァルスロパクター 属（Arthrobacter)、バチルス属（Bacillus)、ブレビバタテリゥム属（Brevibacterium)、コ リネノ クテリゥム属 (Corynebacterium)、ェンテロノくクター属 (Enterobacter)、ェノレウイ ニァ属 (Erwinia)、ェシエリヒア属（Escherichia)、クレブシェラ属（Klebsiella)、ミクロバ クテリゥム属 (Microbacterium)、ミクロコッカス属 (Micrococcus)、プロタミノバクター属 (Protaminobacter 、プロアウス J¾ (Proteusノ、、ノュ. ~~ドモナス為 (Pseudomonasノ、サル チナ属（Sartina)、セラチア属（Serratia)、キサントモナス属（Xanthomonas)、ァエロモ ナス属（Aeromonas)、フラボバタテリゥム属（Flavobacterium)、またはリゾビゥム属（Rhi zobium)などに属する微生物が挙げられる。
[0027] 放線菌としてはァクチノミセス属（Actinomyces)、ミコバタテリゥム属（Mycobacterium )、ノカルディア属（Nocardia)、ストレプトミセス属（Streptomyces)、ァクチノプラネス属 (Actinoplanes)、またはロドコッカス属（Rhodococcus)などに属する微生物が挙げられ る。
[0028] かびとしては、ァスペルギルス属（Aspergillus)、パェシ口ミセス属（Paecilomyces)、 またはぺ-シリウム属（Penicillium)などに属する微生物が挙げられる。
[0029] 酵母としては、キャンディダ属（Candida)、ピヒア属（Phichia)、ロードトルラ属（Rhodo torula)又はトルロプシス属（Torulopsis)などに属する微生物が挙げられる。
[0030] 好ましくは、ァグロバタテリゥム属（Agrobacterium)、バチルス属（Bacillus)、シユード モナス属（Pseudomonas)又はリゾビゥム属（Rhizobium)に属する微生物由来の酵素 が挙げられる。さらに好ましくは、ァグロバタテリゥム スピーシーズ (Agrobacterium s p.) KNK712 (FERM BP— 1900)、バチルス スピーシーズ（Bacillus sp.) KNK2 45 (FERM BP— 4863)、シユードモナス プチダ（Pseudomonas putida) NBRC12 996、シユードモナス スピーシーズ（Pseudomonas sp.)KNK003A(FERM BP— 3181)又はリゾビゥム スピーシーズ（Rhizobium sp.)KNK1415 (FERM BP— 44 19)由来の酵素が挙げられる。
[0031] 上記、ァグロバタテリゥム スピーシーズ (Agrobacterium sp.)KNK712 (FERM BP— 1900)、バチルス スピーシーズ（Bacillus sp.)KNK245 (FERM BP— 486 3)、シユードモナス スピーシーズ（Pseudomonas sp.)KNK003A(FERM BP— 3 181)及びリゾビゥム スピーシーズ（Rhizobium sp.)KNK1415 (FERM BP— 441 9)は、それぞれ前記の受託番号にて、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生 物寄託センター（IPOD：〒 305-8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中 央第 6)に寄託されている。
[寄託日]
Agrobacterium sp. KNK712 (FERM BP— 1900) : 1988年 5月 31日
Bacillus sp. KNK245 (FERM BP— 4863): 1994年 11月 2日
Pseudomonas sp. KNK003A (FERM BP— 3181) : 1990年 12月 1日
Rhizobium sp. KNK1415 (FERM BP- 4419) : 1993年 9月 22日。
[0032] 前記、シユードモナス プチダ（Pseudomonas putida) NBRC12996は、独立行政 法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門 (NBRC : 〒292-0818 千葉県木更津巿かずさ鎌足 2-5-8)に保存されており、同機関より入手 することができる。
[0033] ヒダントイナーゼを効率良く高生産する高活性菌を得るためには、周知のとおり、形 質転換微生物を作成することが有効である。作成方法としては、例えば WO96Z20 275記載のように、ヒダントイナーゼ活性を示す菌株カもヒダントイナーゼ遺伝子をク ローニングした後、適当なベクターとの糸且換えプラスミドを作成して、これを用いて適 当な宿主菌を形質転換することで得られる。なお、組換え DNA技術については当該 分野において周知である。
[0034] このようにして得られた D体選択的ヒダントイナーゼを高生産する形質転換体として は、二価の金属イオンにより加水分解活性が阻害されるものであればいずれも使用 できるが、例として WO96Z20275記載の、バチルス スピーシーズ（Bacillus sp.)K NK245 (FERM BP— 4863)由来のヒダントイナーゼ遺伝子を含有するェシエリヒ ァ コリ（Escherichia coli) HB 101 (pTH 104) (FERM BP— 4864)を挙げることが できる。これら形質転換体によるヒダントイナーゼの生産、あるいは、前述のヒダントイ ナーゼ活性を示す菌株によるヒダントイナーゼの生産は、例えば、 WO96/20275 記載の、通常の栄養培地を用いて培養を行えば良ぐ必用に応じて、酵素誘導のた めの処理を行うこともできる。
[0035] 上記、ェシエリヒア コリ（Escherichia coli) HB 101 (pTHl 04) (FERM BP— 486 4)は、当該受託番号にて、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セン ター (IPOD：〒 305-8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)に寄 託されている（寄託日： 1994年 11月 2日）。
[0036] 本発明において、前述の微生物によって生産されたヒダントイナーゼは、酵素自体 として用いることができるほか、本酵素活性を有する微生物もしくはその処理物の形 態としても用いることができる。ここで、微生物の処理物とは、例えば、粗抽出液、培 養菌体、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、またはそれらの菌体の破砕物を意味す る。更にヒダントイナーゼまたはそれらの処理物は、酵素自体、あるいは菌体のまま公 知の手段で固定ィ匕して得た固定ィ匕酵素として用いてもよい。固定ィ匕は当業者に周知 の方法である架橋法、共有結合法、物理的吸着法、包括法などで行ってもよい。
[0037] 3.ヒダントイナーゼによる光学活件 5 置橼ヒダントイン謙導体、および光学活件 N 力ルバミルアミノ酸誘導体の合成方法
次にラセミ体 N 力ルバミルアミノ酸誘導体（1)をヒダントイナーゼによって立体選 択的に環化し、光学活性な 5 置換ヒダントイン誘導体 (2)および光学活性な N—力 ルバミルアミノ酸誘導体 (3)を合成する方法について説明する。本発明の酵素反応 は以下の方法で行うことができる。
[0038] 基質として前記一般式（ 1 )で表されるラセミ体 N 力ルバミルアミノ酸誘導体を用 、 、前述のヒダントイナーゼ及び二価の金属イオンの存在下、水性媒体中で反応を行う 。二価の金属イオンの濃度は 0. OlmM以上、 1M以下、好ましくは 0. ImM以上、 1 OmM以下、基質の仕込み濃度は 0. 1%以上、 90% (wZv)以下、好ましくは 1%以 上、 60% (wZv)以下で溶解または懸濁した状態で反応を行う。反応温度は 10°C以 上、 80°C以下、好ましくは 20°C以上、 60°C以下の適当な温度で調節し、 pH4以上、 9以下、好ましくは pH5以上、 8以下に保ちつつ暫時静置または攪拌すればよい。ま た、基質を連続的に添加してもよい。反応は、バッチ法または連続方式で行い得る。 本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行ってもよい。
[0039] 二価の金属イオンとしては、特に限定されないが、バナジウム、クロム、マンガン、鉄 、コノ レト、ニッケル、銅、亜鉛、モリブデン、マグネシウム、またはカルシウム等のィォ ンが挙げられる。好ましくはコバルト、亜鉛、マンガンまたはニッケルのイオンが挙げら れ、更に好ましくは、コバルト、または亜鉛のイオンが挙げられる。これらの金属イオン は単独で用いてもょ 、し、 2種類以上の金属イオンを組み合わせて用いてもょ 、。
[0040] 水性媒体としては、水、緩衝液、これらにエタノールのような水溶性有機溶媒を含 む水性媒体、あるいは、水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸ェチル、酢酸ブ チル、トルエン、クロ口ホルム、 n キサンなどの有機溶媒を含む水性媒体との 2層 系などの適当な溶媒を用いることができる。さらに必用に応じて、抗酸化剤、界面活 性剤、補酵素、金属などを添加することもできる。
[0041] カゝくして、ラセミ体 N—力ルバミルアミノ酸誘導体は、本発明の立体選択的ヒダントイ ナーゼにより一方の光学活性体のみが環化され、光学活性な 5—置換ヒダントイン誘 導体が生成し、逆の立体を有する光学活性な N—力ルバミルアミノ酸誘導体が残存 する。得られた光学活性な 5—置換ヒダントイン誘導体、及び光学活性な N—力ルバ ミルアミノ酸誘導体の単離は、通常の分離方法、例えば、抽出、濃縮、晶析、または カラムクロマトグラフィーなどの分離方法や、それらの組み合わせにより分離、精製す ることがでさる。
[0042] さらに、得られた光学活性な 5—置換ヒダントイン誘導体、及び光学活性な N—カル ノ ミルアミノ酸誘導体は、公知の化学的方法 (例えば酸 ·アルカリ処理)あるいは酵素 的方法 (例えばデカルバミラーゼ等による脱力ルバモイルイ匕処理）により、容易に対 応する光学活性なアミノ酸に誘導することができる。
[0043] 以上の説明では、本発明の N—力ルバミルアミノ酸誘導体の例示としてラセミ体 N —力ルバミルアミノ酸誘導体を例示した力 光学活性体の N—力ルバミルアミノ酸誘 導体を用いてもよい。光学活性体の N—力ルバミルアミノ酸誘導体を用いた場合、本 発明のヒダントイナーゼによって、例えば、残存する光学活性な N—力ルバミルアミノ 酸誘導体、もしくは生成する光学活性な 5—置換ヒダントイン誘導体の光学純度を向 上させることができる。
実施例
[0044] 以下に本発明の具体的な実施例を示す。しかし、本発明はこれらの実施例により限 定されるものではない。
[0045] (参者例 1 )ヒダントイナーゼを用いた D— N—力ルバモイルロイシンの合成
D体選択的ヒダントイナーゼ活性を有する組換え大腸菌であるェシエリヒア コリ（Es cherichia coli) HB101 (pTH104) (FERM BP— 4864)を 500ml坂口フラスコ内 で滅菌した 50mlの培地（トリプトン 16g、イーストエキス 10g、塩化ナトリウム 5g、脱ィ オン水 11、塩化マンガン 400ppm、滅菌前 pH7. 0、ろ過滅菌したアンピシリンナトリ ゥムを終濃度 lOOppmで別途添加する）に接種して、 37°Cで 24時間振とうして好気 的に培養した。得られた培養液 lmlカゝら遠心分離により菌体を集菌し、 10mM Tris —塩酸緩衝液 (pH8. 5) 5mlに懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離 により菌体由来の不溶物を除去して、 D体選択的ヒダントイナーゼの粗酵素液を取得 した。得られた粗酵素液 0. lmlに 30mM D— 5—イソブチルヒダントイン及び表 1に 示す各種金属塩を含む 50mM 炭酸ナトリゥム Z炭酸水素ナトリゥム緩衝液 (pH8. 7) 4mlをカ卩えて混合した。 40°Cにて 15分間静置した後、 5N 硫酸 lmlをカ卩えて反 応を停止した。高速液体クロマトグラフィー (HPLC)を用いて D—N—力ルバモイル ロイシンの生成量を分析した結果を表 1に示す。
[HPLC分析条件]
カラム： COSMOSIL 5C18— AR (4. 6mm X 250mm、ナカライテスタ社製）、 溶離液： 10mM燐酸カリウム緩衝液 (pH2) Zァセトニトリル = 5Zl、流速： lmlZ分 、カラム温度： 30°C、測定波長： 210nm
[0046] [表 1] 添加金属塩 属 ;辰 D—N—力ルバモイルロイシン 相対活性
(mM) 生成量（U mol) (%) なし - 5.1 100.0 塩化コバルト 0.1 3.7 72.6
1 1.9 38.0 硫酸亜鈴 0.1 1.1 21.0
1 0.4 7.5
[0047] 表 1に示すように、 D— 5 イソブチルヒダントインの加水分解による D— N 力ルバ モイルロイシンの生成反応は、実施例の D体選択的ヒダントイナーゼの場合、所定の 金属イオン（例えばコバルトおよび Zまたは亜鉛を含む二価の金属イオン）によって 阻害された。
[0048] (参者例 2)ヒダントイナーゼを用いた D— N 力ルバモイル（4 ヒドロキシフエニル )グリシンの合成
参考例 1で得られた培養液 lmlから遠心分離により菌体魏菌し、 10mM Tris —塩酸緩衝液 (pH8. 5) 5mlに懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離 により菌体由来の不溶物を除去して、 D体選択的ヒダントイナーゼの粗酵素液を取得 した。得られた粗酵素液 0. 1mlに 30mM DL— 5— (4 ヒドロキシフエ-ル）ヒダン トイン及び表 2に示す濃度の塩ィ匕コノ レトを含む 50mM 炭酸ナトリウム Z炭酸水素 ナトリウム緩衝液 (PH8. 7) 4mlを加えて混合した。 40°Cにて 15分間静置した後、 5 N 硫酸 lmlをカ卩えて反応を停止した。 HPLCを用いて D— N—力ルバモイル (4—ヒ ドロキシフエニル)グリシンの生成量を分析した結果を表 2に示す。
[HPLC分析条件]
カラム： COSMOSIL 5C18— AR (4. 6mm X 250mm、ナカライテスタ社製）、 溶離液： 10mM燐酸カリウム緩衝液 (pH2) Zァセトニトリル = 19Zl、流速： lmlZ 分、カラム温度： 30°C、測定波長： 210nm
[0049] [表 2] 添加金属塩 金属塩濃度 D— N—(4—ヒドロキシフエニル）グリシン 相対活性
(mM) 生成量（/i mol) (%) なし - 9.1 100.0 塩化コバルト 0.1 2.8 31.4
1 1.0 10.9
[0050] 表 2に示すように、 DL— 5— (4 ヒドロキシフエ-ル）ヒダントインの加水分解による D— N 力ルバモイル（4 ヒドロキシフエ-ル）グリシンの生成反応は、実施例の D体 選択的ヒダントイナーゼの場合、所定の金属イオン (例えばコバルトを含む二価の金 属イオン）によって阻害された。
[0051] (実施例 1)ヒダントイナーゼを用いた D— 5 イソプチルヒダントインの合成
参考例 1で得られた培養液 5ml力も遠心分離により菌体を集菌し、 10mM Tris— 塩酸緩衝液 (pH8. 5) 5mlに懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離に より菌体由来の不溶物を除去して、 D体選択的ヒダントイナーゼの粗酵素液を取得し た。得られた粗酵素液 0. 1mlに 30mM D—N—力ルバモイルロイシン及び表 3に 示す濃度の塩化コバルトまたは硫酸亜鉛を含む 50mM 2— [4 (2- Hydroxy et hyl) 1 -piperazinyllethanesulfonic acid (HEPES)—NaOH緩衝液 (pH7. 0) 4mlを加えて混合した。 40°Cにて 15分間静置した後、ァセトニトリル 4mlをカ卩えて 反応を停止した。参考例 1と同様の方法で D— 5 イソプチルヒダントインの生成量を 分析した結果を表 3に示す。
[0052] [表 3] 添加金属塩 < &>辰 ' D— 5—イソプチルヒダントイン 相対活性
(mM) 生成量 mol) (%) なし - 7.9 100.0 塩化コバルト 0.1 15.6 198.2
1 15.7 200.0 硫酸亜鈴 1 8.5 108.1
[0053] 表 3に示すように、 D—N—力ルバモイルロイシンの環化反応による D— 5 イソブ チルヒダントインの生成は、実施例の D体選択的ヒダントイナーゼの場合、所定の金 属イオン (例えばコバルトまたは亜鉛を含む二価の金属イオン）によって促進された。
[0054] (実施例 2)ヒダントイナーゼを用いた D— 5—（4ーヒドロキシフエニル）ヒダントインの 実施例 1で用いた培養液 11. 7ml力も遠心分離により菌体を集菌し、 10mM Tr is—塩酸緩衝液 (pH8. 5) 5mlに懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分 離により菌体由来の不溶物を除去して、 D体選択的ヒダントイナーゼの粗酵素液を取 得した。得られた粗酵素液 0. 1mlに 30mM D—N—力ルバモイル（4ーヒドロキシフ ェ -ル）グリシン及び表 4に示す濃度の塩化コバルトを含む 50mM HEPES -NaO H緩衝液 (pH7. 0) 4mlをカ卩えて混合した。 40°Cにて 15分間静置した後、ァセトニト リル 4mlをカ卩えて反応を停止した。参考例 2と同様の方法で D— 5—（4ーヒドロキシフ ェニル)ヒダントインの生成量を分析した結果を表 4に示す。
[表 4] 添加金属塩 金属塩濃度 D— 5- -(4ーヒドロキシフエニル）ヒダントイン 相対活性
(mM) 生成量（ii mol) (%) なし - 10.0 100.0 塩化コバルト 0.1 12.7 126.9
1 13.4 134.6
[0056] 表 4に示すように、 D— N—力ルバモイル（4ーヒドロキシフエ-ル）グリシンの環化反 応による D— 5— (4—ヒドロキシフエ-ル）ヒダントインの生成は、実施例の D体選択 的ヒダントイナーゼの場合、所定の金属イオン (例えばコバルトを含む二価の金属ィ オン）によって促進された。
[0057] ( 施例 3)ヒダントイナーゼ 用いた D— 5 イソプチルヒダントインの合成
実施例 1で用いた粗酵素液 0. 05mlに 10% (wZv) DL—N—力ルバモイルロイシ ン及び ImM 塩化コバルトを含む 1M HEPES— NaOH緩衝液（6. 8) 1. 5mlを 加えて混合した。 40°Cにて 3時間攪拌した後、生成した D— 5 イソプチルヒダントイ ン及び残存した L N 力ルバモイルロイシンの収率と光学純度を HPLCを用 、て 分析した結果、及び比較例として塩ィ匕コノ レトを添加しな力 た場合の結果を表 5に 示す。
[HPLC分析条件 (光学純度) ]
カラム： Chirobiotic T(4. 6mm X 250mm、 ASTEC社製）を 2本連結、 0. 01% ( V/ v) Triethylamine acetate Η6. 8) Ζ methanol = 9/ 1、流速： 0. 7mレ分 、カラム温度： 35°C、測定波長： 210nm
[0058] [表 5] 添加金属塩 D— 5—イソブチルヒダントイン L—N—力ルバモイルロイシン 生成量 (mol%) 光学純 J i<¼e.e.) 残存量 (mol¾) 光学純度（¾e.e.) なし 26.7 95.2 74.8 45.2 塩化コバルト 43.7 _ 95.9 57.6 70.1
[0059] 表 5に示すように、 DL— N 力ルバモイルロイシンに対して実施例の D体選択的ヒ ダントイナーゼを作用させた場合、所定の金属イオン (例えばコバルトを含む二価の 金属イオン）により D体選択的な環化反応が促進された結果、光学活性な D— 5—ィ ソブチルヒダントインが生成し、逆の光学活性体である L— N—力ルバモイルロイシン が残存した。

Claims

請求の範囲 一般式 (2)
[化 1]
Figure imgf000016_0001
(式中、 Rは置換基を有していてもよい炭素数 1から 20のアルキル基、置換基を有し て!、てもよ 、炭素数 7から 20のァラルキル基、又は置換基を有して!/、てもよ 、炭素数 6から 20のァリール基を表し、 *は不斉炭素原子を表す。）で表される光学活性 5— 置換ヒダントイン誘導体、及び、一般式 (3)：
[化 2]
Figure imgf000016_0002
(式中、 R及び *は前記と同じ)で表される光学活性 N—力ルバミルアミノ酸誘導体の 製造方法であって、
二価の金属イオンの存在下、当該二価の金属イオンによって 5—置換ヒダントイン誘 導体を N—力ルバミルアミノ酸に加水分解する活性が阻害されるヒダントイナーゼを 用いて、一般式（1) :
[化 3]
Figure imgf000017_0001
(式中、 Rは前記と同じ)で表される N—力ルバミルアミノ酸誘導体を立体選択的に環 化することを特徴とする製造方法。
[2] 二価の金属イオンがコバルト、亜鉛、マンガン、及びニッケル力 選択される少なくと も 1種の金属イオンである請求項 1記載の製造方法。
[3] 二価の金属イオンがコバルトイオン、または亜鉛イオンである請求項 1記載の製造方 法。
[4] 一般式 (2) :
[化 4]
Figure imgf000017_0002
(式中、 Rは置換基を有していてもよい炭素数 1から 20のアルキル基、置換基を有し て!、てもよ 、炭素数 7から 20のァラルキル基、又は置換基を有して!/、てもよ 、炭素数 6から 20のァリール基を表し、 *は不斉炭素原子を表す。）で表される光学活性 5— 置換ヒダントイン誘導体、及び、一般式 (3)：
[化 5]
Figure imgf000017_0003
(式中、 R及び *は前記と同じ)で表される光学活性 N—力ルバミルアミノ酸誘導体の 製造方法であって、
コバルトイオン又は亜鉛イオンの存在下、ヒダントイナーゼを用いて一般式（1)： [化 6]
Figure imgf000018_0001
(式中、 Rは前記と同じ)で表される N—力ルバミルアミノ酸誘導体を立体選択的に環 化することを特徴とする製造方法。
[5] ヒダントイナーゼがバチルス属に属する微生物由来である請求項 1から 4のいずれか に記載の製造方法。
[6] ヒダントイナーゼがバチルス スピーシーズ（Bacillus sp.)KNK245 (FERM BP— 4
863)由来である請求項 1から 4のいずれかに記載の製造方法。
[7] ヒダントイナーゼがェシエリヒア コリ（Escherichia coli) HB101 (pTH104) (FERM
BP— 4864)由来である請求項 1から 4のいずれかに記載の製造方法。
[8] Rが置換基を有して 、てもよ 、フエ-ル基、置換基を有して 、てもよ 、ベンジル基、 又は置換基を有して 、てもよ 、炭素数 1から 4のアルキル基の!/、ずれかである請求項
1から 7のいずれかに記載の製造方法。
[9] R力 ヒドロキシフエ-ル基、又はイソブチル基である請求項 1から 7のいずれか記 載の製造方法。
[10] 得られる光学活性な 5 置換ヒダントイン誘導体力 ¾体である請求項 1から 9のいずれ か記載の製造方法。
[11] 得られる光学活性な N—力ルバミルアミノ酸誘導体力 体である請求項 1から 10のい ずれか記載の製造方法。
[12] 請求項 1から 11のいずれかに記載の製造方法によって得られる、光学活性な N—力 ルバミルアミノ酸誘導体及び Z又は光学活性な 5—置換ヒダントイン誘導体から、対 応する光学活性 α—アミノ酸誘導体を生成する光学活性 α—アミノ酸誘導体の製造 方法。
以下の一般式 (1) :
[化 7]
Figure imgf000019_0001
(式中、 Rは置換基を有していてもよい炭素数 1から 20のアルキル基、置換基を有し て!、てもよ 、炭素数 7から 20のァラルキル基、又は置換基を有して!/、てもよ 、炭素数 6から 20のァリール基を表す)で表される N—力ルバミルアミノ酸誘導体を立体選択 的に環化して一般式 (2) :
Figure imgf000019_0002
(式中、 Rは前記と同じ、 *は不斉炭素を表す)で表される光学活性な 5 ントイン誘導体、及び一般式 (3)：
[化 9]
Figure imgf000019_0003
(式中、 R及び *は前記と同じ)で表される光学活性な N—力ルバミルアミノ酸誘導体 を生成する活性を有するヒダントイナーゼであって、
二価の金属イオンにより、上記環化反応が促進され、かつ 5—置換ヒダントイン誘導 体から N—力ルバミルアミノ酸誘導体への加水分解反応が阻害される性質を有する ことを特徴とするヒダントイナーゼ。
PCT/JP2006/305737 2005-03-25 2006-03-22 光学活性α－アミノ酸誘導体の製造方法 WO2006103995A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005088303 2005-03-25
JP2005-088303 2005-03-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006103995A1 true WO2006103995A1 (ja) 2006-10-05

Family

ID=37053254

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/305737 WO2006103995A1 (ja) 2005-03-25 2006-03-22 光学活性α－アミノ酸誘導体の製造方法

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2006103995A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9499521B2 (en) 2014-12-11 2016-11-22 President And Fellows Of Harvard College Inhibitors of cellular necrosis and related methods

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60180596A (ja) * 1984-02-02 1985-09-14 スクラーボ・エセ・ピ・ア Ｌ‐α‐アミノ酸の製法
WO1996020275A1 (fr) * 1994-12-28 1996-07-04 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha PROCEDE DE FABRICATION DE L'ACIDE D-N-CARBAMYLE-α-AMINE
JP2003061692A (ja) * 2001-06-22 2003-03-04 Degussa Ag 活性化されたｒｅｃ−ヒダントイナーゼの製造方法、該方法で得られるｒｅｃ−ヒダントイナーゼ、これをコードする核酸、それを有するプラスミド、ベクター及び微生物、ハイブリダイズする核酸、その製造のためのプライマー並びにｒｅｃ−ヒダントイナーゼ及び核酸の使用
JP2003277343A (ja) * 2002-03-20 2003-10-02 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 新規Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸及びその製造方法
WO2003106689A1 (ja) * 2002-06-05 2003-12-24 鐘淵化学工業株式会社 光学活性α−メチルシステイン誘導体の製造方法
WO2004022766A1 (ja) * 2002-09-06 2004-03-18 Kaneka Corporation Ｌ−αーメチルシステイン誘導体の製造方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60180596A (ja) * 1984-02-02 1985-09-14 スクラーボ・エセ・ピ・ア Ｌ‐α‐アミノ酸の製法
WO1996020275A1 (fr) * 1994-12-28 1996-07-04 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha PROCEDE DE FABRICATION DE L'ACIDE D-N-CARBAMYLE-α-AMINE
JP2003061692A (ja) * 2001-06-22 2003-03-04 Degussa Ag 活性化されたｒｅｃ−ヒダントイナーゼの製造方法、該方法で得られるｒｅｃ−ヒダントイナーゼ、これをコードする核酸、それを有するプラスミド、ベクター及び微生物、ハイブリダイズする核酸、その製造のためのプライマー並びにｒｅｃ−ヒダントイナーゼ及び核酸の使用
JP2003277343A (ja) * 2002-03-20 2003-10-02 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 新規Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸及びその製造方法
WO2003106689A1 (ja) * 2002-06-05 2003-12-24 鐘淵化学工業株式会社 光学活性α−メチルシステイン誘導体の製造方法
WO2004022766A1 (ja) * 2002-09-06 2004-03-18 Kaneka Corporation Ｌ−αーメチルシステイン誘導体の製造方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9499521B2 (en) 2014-12-11 2016-11-22 President And Fellows Of Harvard College Inhibitors of cellular necrosis and related methods
US9944628B2 (en) 2014-12-11 2018-04-17 President And Fellows Of Harvard College Inhibitors of cellular necrosis and related methods
US10508102B2 (en) 2014-12-11 2019-12-17 President And Fellows Of Harvard College Inhibitors of cellular necrosis and related methods

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7098019B2 (en) DNA for encoding D-hydantoin hydrolases, DNA for encoding N-carbamyl-D-amino acid hydrolases, recombinant DNA containing the genes, cells transformed with the recombinant DNA, methods for producing proteins utilizing the transformed cells and methods for producing D-amino acids
JP2720140B2 (ja) フェニル基を有する光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造法
JP3218133B2 (ja) フェニル基を有する光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造法
EP1624052B1 (en) Process for the production of beta-amino acids with the use of acylase
AU613963B2 (en) Process for preparation of organic chemicals
JPS6230758B2 (ja)
MXPA06000367A (es) Metodos para la sisntesis estereoselectiva y enriquecimiento enantiomerico de beta-aminoacidos.
WO2006103995A1 (ja) 光学活性α－アミノ酸誘導体の製造方法
JP3941184B2 (ja) 光学活性１−アシロキシ−３−クロロ−２−プロパノール、及び光学活性３−クロロ−１，２−プロパンジオールの製造法
US6869788B2 (en) DNA encoding novel D-aminoacylase and process for producing D-amino acid by using the same
JP3160879B2 (ja) 光学活性アミノ酸誘導体の製法
WO1998020152A1 (fr) Procede pour produire des derives optiquement actifs du 3-quinuclidinol
JPH0440899A (ja) α―ヒドロキシ―４―メチルチオブチルアミドの生物学的製造法
JPH0822228B2 (ja) アミノ酸アミド加水分解酵素及びその使用
US5036004A (en) Process for producing L-serine
JP4192331B2 (ja) 光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸誘導体の製造方法
JP5096911B2 (ja) ５−置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組換えｄｎａ、形質転換された細胞、および、光学活性ｎ−カルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸の製造方法
JPS61274690A (ja) Ｄ−α−アミノ酸の製造方法
JPH1080297A (ja) Ｄ−アミノ酸の製法
JPWO2004009829A1 (ja) メチオニンの製造法
JP2002034593A (ja) 光学活性α−アミノ酸の製造方法
EP0997531B1 (en) Process for producing alkali metal s,s-ethylenediamine-n,n&#39;-disuccinates
US20060172393A1 (en) Process for producing optically active alpha -methylcysteine derivative
JP3090761B2 (ja) 光学活性乳酸の製造法
EP2130925A1 (en) Method for production of optically active amino acid

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: RU

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 06729704

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP