JP3160879B2 - 光学活性アミノ酸誘導体の製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酵素を用いた光学
活性Ｎ−置換−Ｌ−アミノ酸、光学活性Ｎ−置換−Ｄ−
アミノ酸エステル及び光学活性Ｄ−アミノ酸の新規製法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】光学活性Ｎ−置換−Ｌ−アミノ酸、とり
わけＮ上の置換基がアセチル基であり、アミノ酸がアラ
ニン又はメチオニン等である化合物は、腎性高血圧等の
治療剤として理想的特性を有するフェネチルアミン誘導
体（ドパミン前駆物質）及びその他各種医薬品の合成中
間体として有用な化合物である（特公昭５７−４８１０
３号）。

【０００３】従来、これらの光学活性Ｎ−置換−Ｌ−ア
ミノ酸の製法は種々知られているが、とりわけ光学活性
Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンの製法としては、化学的
方法ではＮ−アセチル−ＤＬ−メチオニンをα−フェネ
チルアミン等の分割剤を用いて分割する方法（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ ＣｈｅｍｉｃａｌＳ
ｏｃｉｅｔｙ，Ｖｏｌ．７３，４６０４（１９５１）
等）、Ｌ−メチオニンを無水酢酸、アセチルクロリド等
でアセチル化する方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．９８，３
００（１９３２）等）が知られており、生化学的方法で
はＮ−アセチル−ＤＬ−メチオニンを、Ｄ−アミノアシ
ラーゼの作用を利用して分割する方法（米国特許第５２
０６１６２号）及びＮ−アセチル−ＤＬ−メチオニンア
ルキルエステルをプロテアーゼ、リパーゼ、エステラー
ゼ等加水分解酵素存在下でＬ体を選択的に不斉加水分解
して分割する方法が知られている（特公昭５８−４９１
６０号）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ラセミ型Ｎ−置換−Ｄ
Ｌ−アミノ酸エステルのうち、例えば、ラセミ型Ｎ−ア
セチル−ＤＬ−メチオニンアルキルエステルを不斉加水
分解して光学活性Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンを得る
方法は、ＤＬ−メチオニンが非常に安価且つ入手容易で
あることより有用な方法である。しかし、本加水分解反
応においては、基質濃度数ミリモルから数十ミリモルの
低濃度の場合は緩衝液の作用でｐＨ低下が起こらない
が、生産に耐えうる数モルの基質濃度の場合は生成する
カルボン酸の影響で、反応にともなってｐＨが低下す
る。このｐＨ低下によって、反応速度は著しく低下し反
応効率が落ちる。効率良く反応を進めるために通常ｐＨ
コントロールが行われており、例えば、特公昭５８−４
９１６０号記載の方法では、ｐＨコントロール試薬とし
て水酸化ナトリウムが使用されている。しかしこの反応
条件下では、Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニンアルキルエ
ステルが水酸化ナトリウムにより化学的加水分解され
て、反応終了液中にＮ−アセチル−Ｄ−メチオニンが副
生するため、得られる光学活性Ｎ−アセチル−Ｌ−メチ
オニンの収率は低く光学純度も低いという難点があっ
た。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、ラセミ型Ｎ−置換−ＤＬ−アミノ酸エス
テルから、目的とする光学活性Ｎ−置換−Ｌ−アミノ酸
を効率良く取得する方法を見出し、又併せて光学活性Ｎ
−置換−Ｄ−アミノ酸エステルも効率良く取得できるこ
とを見出し本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明はラセミ型Ｎ−置換−Ｄ
Ｌ−アミノ酸エステルに、当該選択されたラセミ体中の
Ｌ型光学活性体を優先的に加水分解して、光学活性Ｎ−
置換−Ｌ−アミノ酸に変換する能力を有する酵素、微生
物の培養物又はその処理物を、ｐＨコントロール試薬と
して弱塩基の存在下に作用させた後、残存する未反応の
光学活性Ｎ−置換−Ｄ−アミノ酸エステルを分離・採取
するか、或いは、生成した前記光学活性Ｎ−置換−Ｌ−
アミノ酸を反応液から分離・採取することを特徴とする
光学活性Ｎ−置換−Ｌ−アミノ酸及び／又は光学活性Ｎ
−置換−Ｄ−アミノ酸エステルの製法である。

【０００７】本発明のラセミ型Ｎ−置換−ＤＬ−アミノ
酸エステルにおいて、Ｎ上の置換基としては、該置換基
が本反応系において影響を受けないアミノ基の置換基と
なり得るものであればよく、例えば、アシル基が挙げら
れる。又アミノ酸としては、アミノ基とカルボキシル基
を同一分子内にもつ化合物であればよく、α−アミノ酸
が挙げられる。

【０００８】アシル基としては、脂肪族アシル基又は芳
香族アシル基が挙げられ、脂肪族アシル基としては、低
級アルカノイル基が挙げられる。このような低級アルカ
ノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、イソ
プロピオニル基、ブタノイル基、イソブタノイル基等の
炭素数が２〜６の直鎖又は分岐鎖アルカノイル基が挙げ
られる。

【０００９】又、α−アミノ酸としては、アラニン、シ
ステイン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイ
シン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオ
ニン、トリプトファン、チロシン、バリン等が挙げら
れ、エステルとしては、アルキルエステルもしくは活性
エステルが挙げられる。

【００１０】アルキルエステルとしては、低級アルキル
エステルが挙げられ、このような低級アルキル基として
は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル
基、ブチル基、イソブチル基等の炭素数が１〜６の直鎖
又は分岐鎖アルキル基が挙げられ、活性エステルとして
は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ−ヒドロキシフ
タルイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、もし
くはｐ−ニトロフェノールとのエステル等の活性エステ
ルが挙げられる。

【００１１】このうち、Ｎ上の置換基が低級アルカノイ
ル基、アミノ酸がアラニン又はメチオニン、エステルが
低級アルキルエステルのものが好ましいが、とりわけＮ
上の置換基がアセチル基であり、アミノ酸がメチオニン
のものが好ましい。

【００１２】又、ｐＨコントロール試薬としての弱塩基
は、ラセミ型Ｎ−置換−ＤＬ−アミノ酸エステルを化学
的に加水分解せず、Ｎ−置換−Ｄ−アミノ酸を副生し得
ない弱塩基であればよい。

【００１３】好ましい弱塩基の例としては、炭酸アルカ
リ金属（例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等）、
炭酸アルカリ土類金属（例えば、炭酸マグネシウム、炭
酸カルシウム等）、重炭酸アルカリ金属（例えば、重炭
酸ナトリウム、重炭酸カリウム等）、酢酸アルカリ金属
（例えば、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等）、クエン
酸アルカリ金属（例えば、クエン酸ナトリウム等）、ク
エン酸アルカリ土類金属（例えば、クエン酸マグネシウ
ム、クエン酸カルシウム等）、燐酸アルカリ土類金属
（例えば、燐酸マグネシウム、燐酸カルシウム等）、燐
酸水素アルカリ金属（例えば、燐酸水素二ナトリウム、
燐酸水素二カリウム等）、燐酸アルカリ金属（例えば、
燐酸一カリウム、燐酸一ナトリウム等）又はアンモニア
等が挙げられる。これらのうち、炭酸アルカリ金属、重
炭酸アルカリ金属、燐酸水素アルカリ金属塩、クエン酸
アルカリ金属又はアンモニアが好ましい。

【００１４】本発明における酵素としては、例えば、プ
ロテアーゼ、リパーゼ又はエステラーゼと呼ばれる一群
の酵素が使用できる。これらの酵素は微生物由来のもの
であっても、動物細胞由来のものであっても、更には、
植物細胞由来のものであってもよい。又、これらの加水
分解酵素を含有する微生物菌体、動物細胞或いは植物細
胞から公知方法により抽出したものであってもよく、市
販のものであってもよい。具体的には、例えば、リパー
ゼ−Ａ［アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来、天野製薬製］、リパーゼ−Ｎ
［リゾプス ニビウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕ
ｓ）由来、天野製薬製］、プロレザー［バシラス スピ
ーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）由来、天野製薬
製］、リパーゼ−ＣＥ［フミコラ ラヌギノサ（Ｈｕｍ
ｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）由来、天野製薬
製］、ニューラーゼ［リゾプス ニビウス（Ｒｈｉｚｏ
ｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）由来、天野製薬製］、パパイン
Ｗ−４０［カリカ パパヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙ
ａ）由来、天野製薬製］、パンクレアチン［ホグ パン
クレアス（ｈｏｇ ｐａｎｃｒｅａｓ）由来、天野製薬
製］、プロテアーゼ−Ａ（アスペルギルス オリゼ（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来、天野製薬
製］、プロテアーゼ−Ｎ［バシラス サブチリス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来、天野製薬製］、
プロテアーゼ−Ｐ［アスペルギルスメレウス（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ）由来、天野製薬
製］、プロテアーゼ−Ｍ［アスペルギルス オリゼ（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来、天野製薬
製］、リパーゼＡ−５［リゾプス ヤポニカス（Ｒｈｉ
ｚｏｐｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）由来、ナガセ生化学
工業製］、ＸＰ−４１５［リゾプス デレマー（Ｒｈｉ
ｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍｅｒ）由来、ナガセ生化学工業
製］、デナザイム−ＡＰ［アスペルギルス オリゼ（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来、ナガセ生
化学工業製］、エスペラーゼ−８．０ＳＬ［バシラス
スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）由来、ノボ
・ノルディクス社製］、ニュートラーゼ−０．５Ｌ［バ
シラス サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）由来、ノボ・ノルディクス社製］、サビナーゼ−
８．０Ｌ［バシラス スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ．）由来、ノボ・ノルディクス社製］、アルカラ
ーゼ−２．５Ｌ［バシラス リケニフォルミス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来、ノボ
・ノルディクス社製］、リパーゼ タイプＩＩ［ポルシ
ン パンクレアス（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａ
ｓ）由来、シグマ社製］、リパーゼ［ポルシン パンク
レアス（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｓ）由来、和
光純薬社製］、リパーゼ［ポルシン パンクレアス（Ｐ
ｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｓ）由来、片山化学社
製］、リパーゼ［リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属）由
来、片山化学社製］又はニューラーゼ［リゾプス ニビ
ウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）由来、天野製
薬製］が挙げられるが、とりわけプロレザー、プロテア
ーゼ−Ｐ、プロテアーゼ−Ｍ、ビオプラーゼＡＬ−１
５、サビナーゼ−８．０Ｌ又はアルカミル−１．５／５
０ＬタイプＢが好ましい。

【００１５】本発明における微生物としては、上記の如
きラセミ型Ｎ−置換−ＤＬ−アミノ酸エステルに、当該
選択されたラセミ体中のＬ型光学活性体を優先的に加水
分解して光学活性Ｎ−置換−Ｌ−アミノ酸に変換する能
力を有するものであればよく、アスペルギルス（Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）
属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属又はフミコラ（Ｈ
ｕｍｉｃｏｌａ）属に属する微生物が挙げられる。

【００１６】かかる微生物の具体例としては、アスペル
ギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅ
ｒ）、リゾプス ニビウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖ
ｅｕｓ）、バシラス スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ．）、フミコラ ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ
ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、カリカ パパヤ（Ｃａｒｉ
ｃａ ｐａｐａｙａ）、アスペルギルス オリゼ（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、バシラス サブ
チリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、アス
ペルギルス メレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅ
ｌｌｅｕｓ）、リゾプス ヤポニカス（Ｒｈｉｚｏｐｕ
ｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、リゾプス デレマー（Ｒｈ
ｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍｅｒ）又はバシラス リケニ
フォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒ
ｍｉｓ）が挙げられる。

【００１７】これら微生物は、本発明に必要な能力を有
するものである限り、どのような菌株であってもよく紫
外線照射や変異剤処理等の人為的処理により得られる変
異株であってもよく、これら微生物から組換えＤＮＡ
法、細胞融合法などの遺伝子工学的もしくは、生物工学
的手法により誘導されるものであってもよい。例えば、
遺伝子工学的手法に従い、上記加水分解酵素を生産する
微生物の染色体断片から、目的酵素の遺伝子を単離し、
これを適当なプラスミドベクターに挿入した組換えプラ
スミドを調製した後、この組換えプラスミドで適当な宿
主微生物を形質転換することにより、酵素の生産能を有
する微生物又は酵素生産能がさらに向上した微生物を得
ることができる。又、この組換えプラスミドで、必要に
応じて他の優れた性質（例えば培養が容易など）を有す
る宿主微生物を形質転換してもよい。

【００１８】本発明における培養物としては、例えば前
記微生物の培養液又は生菌体などが挙げられ、又、当該
培養物の処理物としては、例えば培養液の処理物（培養
上清等）もしくは菌体処理物があげられる。

【００１９】又、微生物の培養物又はその処理物として
は、プロテアーゼ、リパーゼ又はエステラーゼと呼ばれ
る一群の酵素を含むものであればよい。

【００２０】上記培養物（培養液、菌体など）は、例え
ば、上記微生物を通常この分野において用いられる培
地、例えば、慣用の炭素源、窒素源及び無機塩類含有培
地中、常温ないし加温下（好ましくは約２０〜４０
℃）、かつ好気的条件下、ｐＨ４〜９で培養し、必要と
あれば、このように得られた培養液から常法により菌体
を分離・採取して得ることができる。

【００２１】微生物の菌体処理物としては、前記培養物
を種々の物理化学的方法、例えば、超音波、フレンチプ
レス、浸透圧、凍結融解、凍結乾燥、アルミナ破壊、溶
菌酵素、界面活性剤又は有機溶媒などの手段で処理した
菌体のほか、前記培養物（培養液、菌体など）又はその
処理物（培養上清、菌体処理物など）から、公知の方法
により調製された部分精製酵素或いは精製酵素であっ
て、ラセミ型Ｎ−置換−ＤＬ−アミノ酸エステルのうち
Ｌ型光学活性体を優先的に加水分解して光学活性Ｎ−置
換−Ｌ−アミノ酸に変換する能力を有するものが挙げら
れる。

【００２２】このような部分精製酵素又は精製酵素とし
ては、市販されている前記と同様のものを使用すること
ができる。

【００２３】即ち、本発明の反応においては、ラセミ型
Ｎ−置換−ＤＬ−アミノ酸エステルのうちＬ型光学活性
体を優先的に加水分解して光学活性Ｎ−置換−Ｌ−アミ
ノ酸に変換する能力を有する酵素であればいずれのもの
を使用することができる。

【００２４】さらに、本発明の酵素、微生物菌体又は菌
体処理物は、例えば、ポリアクリルアミド法、含硫多糖
ゲル法（カラギーナンゲル法等）、アルギン酸ゲル法又
は寒天ゲル法等により固定化して使用することもでき
る。

【００２５】

【発明の実施の形態】本発明にかかる不斉加水分解反応
は、適当な溶媒中、ラセミ型Ｎ−置換−ＤＬ−アミノ酸
エステルに酵素、微生物の培養物又はその処理物を接触
させることにより実施することができる。

【００２６】反応温度は特に制限はなく、エステルの種
類及び脱離法に応じて適宜選択すればよいが、常温ない
し加温下、好ましくは約０〜７０℃、とりわけ好ましく
は約０〜５０℃で好適に進行する。また反応は、ｐＨコ
ントロール試薬として弱塩基を添加することにより光学
活性Ｎ−置換−Ｄ−アミノ酸エステル及び本加水分解反
応における使用される酵素、微生物の培養物又はその処
理物に悪影響を及ぼさない程度の中性条件下で実施する
のがよいが、ｐＨ約６〜約８とりわけｐＨ約６．５〜約
７．５で実施するのが好ましい。上記ｐＨコントロール
試薬は、固体のままあるいは水溶液に調製して用いても
よく、水溶液としては１〜８０％、とりわけ１０〜５０
％とするのが好ましい。

【００２７】反応基質となるラセミ型Ｎ−置換−ＤＬ−
アミノ酸エステルの仕込み濃度（ｗ／ｖ）は、１０〜４
０％が好ましい。又、原料化合物が難溶性の場合は溶媒
に懸濁して使用することができ、さらに溶解補助剤とし
て少量のジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシ
ド、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、アセトン、
ジオキサン、メタノール又はエタノール等の極性有機溶
媒の使用も可能である。その際、反応基質は最初に一括
して添加してもよく、あるいは反応中数回に分割して添
加してもよい。又、反応は水溶液中、水溶液と有機溶媒
の二相系中等で実施することができる。かかる有機溶媒
としては、反応基質となるラセミ型Ｎ−置換−ＤＬ−ア
ミノ酸エステルを溶解し、かつ水と混和しない有機溶媒
であれば、いずれも用いることができる。このような有
機溶媒としては、例えばトルエン、キシレン、四塩化炭
素、ベンゼン、トリクロロエタン、クロロホルム、ｎ−
ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、シクロヘキサ
ン、イソオクタン、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチル
エーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、イソプロピルエ
ーテル等が挙げられ、とりわけトルエン、四塩化炭素、
ベンゼン、トリクロロエタン、ｎ−ヘキサン、ｔ−ブチ
ルメチルエーテルなどが好ましい。

【００２８】又、原料化合物であるラセミ型Ｎ−置換−
ＤＬ−アミノ酸エステルとしては、Ｄ型光学活性体及び
Ｌ型光学活性体を等量含むものだけでなくこれら光学活
性体を共に含むものであればいずれも用いることができ
る。

【００２９】本発明において生菌体を用いる場合、反応
液中に界面活性剤を添加しておけば反応時間の短縮をは
かることができる。この目的に用いられる界面活性剤と
しては、例えば、臭化セチルピリジニウム、臭化セチル
トリメチルアンモニウム、又はｐ−イソオクチルフェニ
ルエーテル（米国、ロームアンドハース社製、商品名ト
リトンＸ−１００）等が挙げられ、反応液に対し約０．
０００１〜約０．１％程度使用するのが好ましい。

【００３０】光学活性Ｎ−置換−Ｄ−アミノ酸エステル
及び／又は光学活性Ｎ−置換−Ｌ−アミノ酸の反応液か
らの分離・採取は、常法に従って実施することができ
る。即ち、例えば、加水分解反応を水−有機溶媒二相系
で実施した場合には、光学活性Ｎ−置換−Ｄ−アミノ酸
エステルは、有機溶媒中に残存し減圧濃縮することによ
り得ることができる。又、水層に移行した光学活性Ｎ−
置換−Ｌ−アミノ酸を塩酸等で酸性とし、更に塩折を行
う。添加する塩は水に溶解すればいかなる塩でも良い
が、好ましくは硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム等が
使用される。添加する塩濃度は水溶液に対して３０〜６
０％が好ましい。

【００３１】塩析を行った水溶液に有機溶媒を添加し抽
出した後、濃縮晶析、遠心分離によって再結晶すること
なく高収率かつ高光学純度の光学活性Ｎ−置換−Ｌ−ア
ミノ酸を単離することができる。抽出に使用する溶媒は
水と二相に分離し、Ｎ−置換−Ｌ−アミノ酸を溶解する
溶媒であれば良く、好ましくは酢酸エチル、クロロホル
ム等が挙げられる。

【００３２】又、酵素、微生物の培養物又はその処理物
が、ラセミ型Ｎ−置換−ＤＬ−アミノ酸エステルのＬ型
光学活性体を不斉分解する能力を有するか否かの検定
は、上記の反応方法に準じて、例えば、以下のように容
易に実施できる。すなわち、ラセミ型Ｎ−アセチル−Ｄ
Ｌ−メチオニンメチルエステルを含む水溶液に、検定す
べき酵素、微生物の培養物又はその処理物を添加し、３
０℃で４時間静置し、反応終了液を、光学活性カラム
（例えば、住化分析センター製、ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ
ＯＡ−５０００）を用いる高速液体クロマトグラフィ
ーで分析・定量し、生成するＮ−アセチル−Ｌ−メチオ
ニンの光学純度が高い場合、Ｌ型光学活性体のエステル
を選択的に加水分解する能力を有するものと判定され
る。

【００３３】かくして得られた光学活性Ｎ−置換−Ｌ−
アミノ酸及び／又は光学活性Ｎ−置換−Ｄ−アミノ酸エ
ステルは公知方法、例えば、特公昭５７−４８１０３号
又は特公平７−８８５３号に開示の方法に従って一般式
〔Ｉ〕

【００３４】

【化２】

【００３５】（式中、ＲはＮ−置換−アミノ酸のカルボ
キシル基から水酸基を除いた基を表す。）で示される光
学活性フェネチルアミン誘導体に変換することができ、
更に所望により生成物をその薬理的に許容し得る塩とす
ることができる。

【００３６】上記方法において、一般式〔Ｉ〕には２種
の光学活性体が存在するが、本発明はそのいずれの光学
活性体及びその混合物をも含むものである。しかしなが
ら、一般式〔Ｉ〕を医薬として使用する場合は、Ｎ−置
換−Ｌ−アミノ酸を用いて得られる化合物がとりわけ好
ましい。

【００３７】一方、光学活性Ｎ−置換−Ｄ−アミノ酸エ
ステルは、公知の方法、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４
３，４５９３（１９７８）に従って、水酸化ナトリウム
等強塩基水溶液の存在下で加水分解して、一旦光学活性
Ｎ−置換−Ｄ−アミノ酸にした後、塩酸等強酸水溶液に
て加水分解して光学活性Ｄ−アミノ酸へと変換すること
ができる。

【００３８】ところで、光学活性Ｎ−置換−Ｄ−アミノ
酸エステルを水酸化ナトリウム水溶液等の強塩基環境下
にて加熱し加水分解反応を行なうと、更にラセミ化が起
こることが判明している。即ちこの方法では、一旦、反
応液をアルカリ性にした後に酸性にするため非効率的で
あることから、簡便かつ効率的に光学活性Ｄ−アミノ酸
を製造する方法がかねてより望まれていた。

【００３９】しかしながら、光学活性Ｎ−置換−Ｄ−ア
ミノ酸エステルは、塩基を用いることなく酸のみで加水
分解することにより光学活性Ｄ−アミノ酸を得ることも
可能である。

【００４０】本加水分解に用いる酸としては、光学活性
Ｎ−置換−Ｄ−アミノ酸エステルのエステルを加水分解
して光学活性Ｎ−置換−Ｄ−アミノ酸に誘導した後、Ｎ
上の置換基を加水分解して光学活性Ｄ−アミノ酸を合成
するするものであると共に、基質である光学活性Ｎ−置
換−Ｄ−アミノ酸エステルをラセミ化し得ない酸であれ
ばよい。このような酸としては１〜４規定の塩酸、臭化
水素酸、硫酸等を挙げることができるが、これらのうち
塩酸が好ましく、とりわけ２規定塩酸が好ましい。

【００４１】反応は有機溶媒の存在下に行ってもよく、
その反応温度としては約８０〜１４０℃が好ましい。反
応時間は随時光学活性カラムで反応の進行をモニターす
ればよく、約２〜１２時間で終結する。反応基質となる
光学活性Ｎ−置換−Ｄ−アミノ酸エステルの仕込み濃度
（ｗ／ｖ）は、１〜５０％が好ましい。又、原料化合物
が難溶性の場合は溶媒に懸濁して使用することができ
る。

【００４２】又、光学活性Ｄ−アミノ酸の反応液からの
分離・採取は、常法に従って実施することができる。即
ち、例えば、反応残査を約０〜４０℃に設定後、水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水溶液を
滴下し水溶液のｐＨを中性にあわせた後、０〜５℃で晶
折する。析出物をろ過することで、光学活性Ｄ−アミノ
酸を取得することができる。

【００４３】つぎに、実施例をあげて本発明を更に詳し
く説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

【００４４】なお、本明細書中「％」はいずれも「重量
／容量（ｇ／ｄｌ）」を意味するものとする。又、本実
施例において、光学活性体の定量は、ＳＵＭＩＣＨＩＲ
ＡＬＯＡ−５０００（住化分析センター製）を用いる高
速液体クロマトグラフィーにより行った。

【００４５】

【実施例】

実施例１ ０．１Ｍリン酸緩衝液（ＫＨ₂ＰＯ₄−ＮａＯＨ，ｐＨ
７．５）１００ｍｌにプロレザー（バチルスサブチルス
由来、天野製薬製）２００ｍｇを溶かし４０℃で撹拌し
た。Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニンメチルエステル４
０ｇを撹拌下仕込み、そのまま撹拌反応を行った。酵素
反応中に炭酸水素ナトリウムを徐々に添加し、ｐＨ６．
５〜７．０に調節した。反応の進行はサンプル１００μ
ｌを採取し、２ｍＭ硫酸銅溶液１．９ｍｌで希釈した
後、クロロホルム２．０ｍｌで抽出した後、クロロホル
ム層のＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンメチルエステルの
残量をＨＰＬＣ法（ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＤ，４．６
ｍｍ×２５０ｍｍ，ダイセル化学工業製）で定量した。
３時間経過後、光学活性Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン
メチルエステルの消失を確認後反応を終了した。酵素を
除去するために反応液に活性炭２ｇを添加後、３０分撹
拌し、ろ紙にてろ過を行った。ろ液をクロロホルム５０
ｍｌで３回洗浄し、未反応の光学活性Ｎ−アセチル−Ｄ
−メチオニンメチルエステルを抽出除去した。一方、水
層を塩酸酸性とし、硫酸アンモニウム６０ｇを添加し、
酢酸エチル２００ｍｌで抽出した後、酢酸エチル層を硫
酸マグネシウムで脱水後ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、
氷冷下１時間晶析した後、結晶をろ取した。得られた結
晶は、４０℃で１６時間送風乾燥を行った。その結果、
ＨＰＬＣでの光学純度が１００％ｅ．ｅ．を示す光学活
性Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンの結晶が収率４５．４
％で得られた。得られた結晶の比旋光度及び光学純度等
は以下の通りであった。使用した酵素、Ｎ−アセチル−
Ｌ−メチオニンメチルエステルが消失した反応時間、結
晶取得収率及び反応終了液中のＮ−アセチル−Ｄ−メチ
オニン生成量を下記第１表に示す。

【００４６】結晶取得量：１６．９ｇ、化学純度：１０
０％、光学純度：１００％ｅ．ｅ．、 旋光度：〔α〕^D ₂₀＝−２１．４゜（Ｃ＝４，Ｈ₂Ｏ） なお、未反応の光学活性Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニン
メチルエステルのクロロホルム抽出液を濃縮して光学活
性Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニンメチルエステル１９．
０ｇを回収した。

【００４７】実施例２〜３ プロレザーに代わる酵素を用いて酵素量１００ｍｇ、Ｎ
−アセチル−ＤＬ−メチオニンメチルエステル２０ｇで
実施例１と同様に処理し、反応終了後のＮ−アセチル−
Ｄ−メチオニンの生成量を調べた。使用した酵素、Ｎ−
アセチル−Ｌ−メチオニンメチルエステルが消失した反
応時間、結晶取得収率及び反応終了液中のＮ−アセチル
−Ｄ−メチオニン生成量を下記第１表に示す。

【００４８】比較例２〜３（実施例２〜３の対照実験） 炭酸水素ナトリウムに代わるｐＨコントロール試薬とし
て５規定水酸化ナトリウム水溶液を用いて実施例２〜３
と同様に処理し、反応終了後のＮ−アセチル−Ｄ−メチ
オニンの生成量を調べた。使用した酵素、Ｎ−アセチル
−Ｌ−メチオニンメチルエステルが消失した反応時間、
結晶取得収率及び反応終了液中のＮ−アセチル−Ｄ−メ
チオニン生成量を下記第１表に示す。

【００４９】

【表１】

【００５０】実施例４〜６ 炭酸水素ナトリウムに代わるｐＨコントロール試薬（弱
塩基）を用いて、酵素量１００ｍｇ、Ｎ−アセチル−Ｄ
Ｌ−メチオニンメチルエステル２０ｇで実施例１と同様
に処理し、反応終了後のＮ−アセチル−Ｄ−メチオニン
の生成量を調べた。使用したｐＨコントロール試薬、Ｎ
−アセチル−Ｌ−メチオニンメチルエステルが消失した
反応時間、結晶取得収率及び反応終了液中のＮ−アセチ
ル−Ｄ−メチオニン生成量を下記第２表に示す。

【００５１】比較例４〜６ 弱塩基に代わるｐＨコントロール試薬として水酸化ナト
リウム水溶液を用いて実施例４〜６と同様に処理し、反
応終了後のＮ−アセチル−Ｄ−メチオニンの生成量を調
べた。使用したｐＨコントロール試薬、Ｎ−アセチル−
Ｌ−メチオニンメチルエステルが消失した反応時間、結
晶取得収率及び反応終了液中のＮ−アセチル−Ｄ−メチ
オニン生成量を下記第２表に示す。

【００５２】比較例７ ｐＨコントロール試薬非存在下で実施例４〜６と同様に
処理し、反応終了後のＮ−アセチル−Ｄ−メチオニンの
生成量を調べた。使用した酵素、Ｎ−アセチル−Ｌ−メ
チオニンメチルエステルが消失した反応時間、結晶取得
収率及び反応終了液中のＮ−アセチル−Ｄ−メチオニン
生成量を下記第２表に示す。

【００５３】

【表２】

【００５４】実施例７ Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニンメチルエステル１９ｇを
２規定塩酸水溶液２００ｍｌに溶解し、４時間加熱還流
した。反応終了後反応液を約５０ｍｌまで濃縮し、１０
規定水酸化ナトリウム水溶液を加えｐＨ６に調整し、析
出物をろ取してＤ−メチオニン１０．５ｇを得た。

【００５５】

【発明の効果】本発明によれば、ｐＨコントロール試薬
として弱塩基の存在下、Ｌ型光学活性体を優先的に加水
分解する能力を有する酵素を利用することによって、従
来既知の強塩基存在下における反応に較べ、化学的加水
分解によるＮ−置換−Ｄ−アミノ酸の副生を抑えること
ができる。従って、腎性高血圧等の治療剤として理想的
特性を有するフェネチルアミン誘導体（ドパミン前駆物
質）及びその他各種医薬品の合成中間体として有用な光
学活性Ｎ−置換−Ｌ−アミノ酸及び／又は光学活性Ｎ−
置換−Ｄ−アミノ酸エステル、とりわけＮ上の置換基が
低級アルカノイル基であり、アミノ酸がアラニン又はメ
チオニン等である化合物を、ラセミ型Ｎ−置換−ＤＬ−
アミノ酸エステルから高収率で工業的有利に製造するこ
とができる。

【００５６】更に本発明によれば、光学活性Ｎ−置換−
Ｄ−アミノ酸エステルを酸のみで加水分解して光学活性
Ｄ−アミノ酸へ導くことができる。即ち、本発明は、当
該加水分解反応を塩基を用いることなく実施することが
できるため、ラセミ化を防止して高純度かつ高収率で光
学活性Ｄ−アミノ酸を得ることができると共に、操作性
も改善された工業的に有利なＤ−アミノ酸の製法であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:125） (56)参考文献 特開 平６−22789（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−287（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−46885（ＪＰ，Ａ) 特公 昭57−48103（ＪＰ，Ｂ２) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 13/00 - 13/24 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ラセミ型Ｎ−置換−ＤＬ−アミノ酸エス
   テルに、当該選択されたラセミ体中のＬ型光学活性体を
   優先的に加水分解して、光学活性Ｎ−置換−Ｌ−アミノ
   酸に変換する能力を有するバシラス属、バチルス サブ
   チルス又はアスペルギウス メレウスに由来する酵素、
   微生物の培養物又はその処理物を、ｐＨコントロール試
   薬として弱塩基の存在下に作用させた後、残存する未反
   応の光学活性Ｎ−置換−Ｄ−アミノ酸エステルを分離・
   採取するか、或いは、生成した前記光学活性Ｎ−置換−
   Ｌ−アミノ酸を反応液から分離・採取することを特徴と
   する光学活性Ｎ−置換−Ｌ−アミノ酸及び／又は光学活
   性Ｎ−置換−Ｄ−アミノ酸エステルの製法。
2. 【請求項２】 ラセミ型Ｎ−置換−ＤＬ−アミノ酸エス
   テルに、当該選択されたラセミ体中のＬ型光学活性体を
   優先的に加水分解した後、生成した光学活性Ｎ−置換−
   Ｌ−アミノ酸を、反応液から分離・採取する請求項１記
   載の製法。
3. 【請求項３】 ラセミ型Ｎ−置換−ＤＬ−アミノ酸エス
   テルに、当該選択されたラセミ体中のＬ型光学活性体を
   優先的に加水分解した後、残存する未反応の光学活性Ｎ
   −置換−Ｄ−アミノ酸エステルを分離・採取する請求項
   １記載の製法。
4. 【請求項４】 酵素がプロテアーゼであるか、或いは、
   微生物の培養物又はその処理物がプロテアーゼを含むも
   のである請求項１記載の製法。
5. 【請求項５】 ラセミ型Ｎ−置換−ＤＬ−アミノ酸エス
   テルに、当該選択されたラセミ体中のＬ型光学活性体を
   優先的に加水分解して、光学活性Ｎ−置換−Ｌ−アミノ
   酸に変換する能力を有する酵素を用いることを特徴とす
   る請求項１又は４記載の製法。
6. 【請求項６】 ラセミ型Ｎ−置換−ＤＬ−アミノ酸エス
   テルに、当該選択されたラセミ体中のＬ型光学活性体を
   優先的に加水分解して、光学活性Ｎ−置換−Ｌ−アミノ
   酸に変換する能力を有するバシラス属、バチルス サブ
   チルス又はアスペルギウス メレウスに由来する酵素、
   微生物の培養物又はその処理物を作用させる反応を中性
   条件下で行うことを特徴とする請求項１記載の製法。
7. 【請求項７】 ｐＨコントロール試薬が炭酸アルカリ金
   属、重炭酸アルカリ金属、燐酸アルカリ金属、クエン酸
   アルカリ金属又はアンモニアである請求項１又は６記載
   の製法。
8. 【請求項８】 ｐＨ６〜８で実施する請求項１、６又は
   ７記載の製法。
9. 【請求項９】 ラセミ型Ｎ−置換−ＤＬ−アミノ酸エス
   テルがラセミ型Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニンアルキ
   ルエステルである請求項１〜８のいずれか１項に記載の
   製法。
10. 【請求項１０】 ラセミ型Ｎ−置換−ＤＬ−アミノ酸エ
    ステルがラセミ型Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニンメチ
    ルエステルである請求項１〜８のいずれか１項に記載の
    製法。
11. 【請求項１１】 請求項１記載の製法により光学活性Ｎ
    −置換−Ｌ−アミノ酸を得、次いで、得られた光学活性
    Ｎ−置換−Ｌ−アミノ酸を公知の方法に従って一般式
    〔Ｉ〕 【化１】 （式中、ＲはＮ−置換−アミノ酸のカルボキシル基から
    水酸基を除いた基を表す。）で示される光学活性フェネ
    チルアミン誘導体とし、所望により生成物をその薬理的
    に許容し得る塩とすることを特徴とする光学活性フェネ
    チルアミン誘導体又はその薬理的に許容し得る塩の製
    法。
12. 【請求項１２】 請求項１記載の製法により光学活性Ｎ
    −置換−Ｄ−アミノ酸エステルを得、次いで得られた光
    学活性Ｎ−置換−Ｄ−アミノ酸エステルを公知の方法に
    従って光学活性Ｄ−アミノ酸とすることを特徴とするＤ
    −アミノ酸の製法。