WO2005042013A1 - Agente immunoterápico útil para el tratamento combinado de la tuberculosis en associación con otros fármacos - Google Patents

Agente immunoterápico útil para el tratamento combinado de la tuberculosis en associación con otros fármacos Download PDF

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WO2005042013A1
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tuberculosis
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Pere Joan Cardona Iglesias
Isabel Amat Riera
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Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing an immunotherapeutic agent useful for the combined treatment of tuberculosis in association with other drugs, based on cell wall fragments of a virulent strain of Mycobacterium tuberculosis-complex, and in the immunotherapeutic agent obtainable by said procedure.
  • Tuberculosis is a chronic infectious disease caused by the bacilli Mycobacterium tuberculosis-comp ex. (MTB-C), which currently include the species M. tuberculosis, M. bovis, M. microti and M. africanum.
  • MTB-C Mycobacterium tuberculosis-comp ex.
  • BCG Bacillus Calmette-
  • Said type of prolonged treatment could favor the development of microorganisms resistant to said drugs in the case of not performing the treatment until the end and, in addition, the said drugs act only at the moment when the bacillus has an active metabolism, that is when It is in the growth phase, but not when it is in a non-active phase.
  • An attempt to solve the problems raised, as described in US4724144, is the use of an immunotherapeutic agent based on dead cells. of M.vaccae as an adjunct to the treatment of tuberculosis together with the administration of other drugs, for example, rifampicin and isoniazid.
  • the authors of the present invention have discovered a method that allows preparing a new immunotherapeutic agent useful for the combined treatment of tuberculosis in association with other drugs, comprising cell wall fragments of a virulent strain of MTB-C, capable of increasing the efficacy of the associated drugs by generating an effective immune response against bacilli that are not in the active metabolism phase, which also reduces the risk of resistance.
  • the object of the present invention is a method for obtaining an immunotherapeutic agent comprising cell wall fragments of a virulent strain of MTB-C, which is useful in the combined treatment of tuberculosis in association with other drugs. Also part of the object of the present invention are the immunotherapeutic agent obtainable according to the above procedure and the use thereof for the preparation of a medicament for the combined treatment of tuberculosis in association with other drugs. Another additional object is the pharmaceutical compositions containing said immunotherapeutic agent.
  • an immunotherapeutic agent comprising cell wall fragments of a virulent strain of Mycobacterium tuberculosis-corc ⁇ lex (MTB-C), said method characterized in that it comprises the following stages: - the culture of the virulent strain MTB-C for a period of time equal to or greater than three weeks and, subsequently, - the homogenization of cell culture in the presence of a non-ionic surfactant.
  • the virulent strain can be any virulent strain of MTB-C, since the bacillus of tuberculosis is very stable and the appearance of mutations in immunogenic compounds has not been described.
  • H37Rv One of the strains most used by researchers in this field, considered as a virulent reference strain, is called H37Rv which, for example, can be freely acquired in the National Collection of Type Cultures (NCTC), London, Great Britain (number of deposit NC007416).
  • the virulent strain can be grown by inoculation in culture media well known to the person skilled in the art. It may be a solid medium, such as Middlebrook type 7H10 or type 7H11 agar, or a liquid medium, for example Sauton culture medium or Proskauer-Beck culture medium.
  • the culture should be carried out for a period of time equal to or greater than three weeks, preferably between 3 and 4 weeks.
  • the temperature of the culture is preferably maintained between 34 ° C and 38 ° C.
  • the plates are scratched to obtain the colonies, avoiding the extraction of medium (agar) at the same time.
  • the culture has been carried out in the liquid phase, the cells are concentrated and washed using conventional techniques known to those skilled in the art, such as centrifugation.
  • the homogenization of the cells is carried out in a buffer medium at a neutral pH, it being important for the purposes of the present invention that said homogenization be carried out in the presence of a non-ionic surfactant that favors obtaining finely divided cell wall particles and emulsifies, at least in part, unwanted lipid fractions.
  • Homogenization can be carried out by sonication by ultrasound, or by using small balls of approximately 1 mm in diameter, for example, of silica or silica-zirconium, together with a mechanical homogenizer.
  • a mechanical homogenizer that can be used, for example, is the BEADBEATER model of Biospec.
  • the buffered medium is constituted, for example, by PBS buffer (phosphate buffer saline).
  • the type of nonionic surfactant used is not critical, although it is preferably selected from the group of ethoxylated alkylphenols and ethoxylated sorbitan esters.
  • the nonionic surfactant is selected from the ethoxylated octylphenols. More preferably, ethoxylated octylphenols with 7-8 moles of ethylene oxide are used, which are commercially available under the name of, for example, TRITON X-114.
  • the non-ionic surfactant content in the homogenization stage is between 1 and 5% by weight with respect to the total homogenate.
  • the homogenized mass which already contains the desired cell wall fragments, is subjected to a conventional treatment in order to separate said fragments from the non-fragmented cells and the solubilized components.
  • the product resulting from the homogenization is gently centrifuged at a speed of less than 5,000 rpm to remove the non-fragmented cells as sediment.
  • the resulting supernatant is centrifuged at a higher centrifugation rate, for example greater than 15,000 rpm, to remove the solubilized elements, which are concentrated in the supernatant liquid, while the cell wall fragments are concentrated in the sediment.
  • a higher centrifugation rate for example greater than 15,000 rpm
  • the sediment obtained which contains the cell wall fragments, is dispersed in PBS buffer and is subjected to a chemical process, for example by treatment with formalin, or physical, for example by autoclaving or pasteurization treatment, which ensures total inactivation of MTB-C cells that could have remained viable after the fragmentation and purification process.
  • a chemical process for example by treatment with formalin, or physical, for example by autoclaving or pasteurization treatment, which ensures total inactivation of MTB-C cells that could have remained viable after the fragmentation and purification process.
  • the dispersion of cell wall fragments in PBS buffer is distributed in vials and lyophilized at a temperature between -15 ° C and -25 ° C and with a vacuum between 0.1 and 0.5 mbar.
  • Vials containing MTB-C cell wall fragments that constitute the immunotherapeutic agent of the invention are obtained and stored at -70 ° C.
  • compositions can also be prepared from the immunotherapeutic agent of the invention, also object of the invention, which can be formulated in the form of an oil-in-water (O / W) emulsion or in the form of liposomes.
  • Pharmaceutical compositions in the form of liposomes are preferred.
  • Liposome formation can be performed using conventional techniques, well known to the expert. For example, liposomes can be formed by mixing lyophilized cell wall fragments and auxiliary lipids for the formation of liposomes in an aqueous medium, and subjecting the mixture to a standard homogenization procedure, for example, by using a high stirrer. speed. Auxiliary lipids for manufacturing liposomes are widely known to those skilled in the art.
  • phospholipids with neutral and / or negative net charge, and sterols are included.
  • the phospholipids used can be, for example: phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylinositol.
  • the major component of liposomes is phosphatidylcholine, which can be synthesized or isolated from natural sources.
  • a frequently used commercial product is soy lecithin.
  • the sterols used in the preparation of liposomes can be, among others, cholesterol and bile salts.
  • liposomes are formed using a mixture of soy lecithin and sodium cholate.
  • liposomes may contain additives that improve their stability, for example: vitamin E, which acts as an antioxidant for lipids.
  • the liposomes obtained have a size distribution in which 99.9% are smaller than 1 meter.
  • the liposomes can be subjected to lyophilization to thereby obtain the immunotherapeutic agent object of the invention in the form of lyophilized liposomes.
  • the use of the immunotherapeutic agent for the preparation of a medicament for the combined treatment of tuberculosis in association with other drugs is also part of the object of the invention.
  • the immunotherapeutic agent object of the invention is administered parenterally.
  • isoniazid and rifampicin are preferred for the combined treatment with the therapeutic agent of the invention.
  • the association of the immunotherapeutic agent of the invention with the antituberculosis drugs for the combined treatment of the disease can be carried out simultaneously or sequentially, that is to say by simultaneously administering the drugs and the immunotherapeutic agent, or by prior administration. of the drugs followed by the administration of the immunotherapeutic agent.
  • Example 1 - - Obtaining the immunotherapeutic agent About 80-100 Middlebrook agar plates of type 7H11 are inoculated with an H37Rv culture supplied by the National Collection of Type Cultures (NCTC), London, Great Britain (deposit number NC007416).
  • the concentration of colony forming units inoculated on each plate is 10 5 -10 6 CFU.
  • the plates are incubated for 21 days (3 weeks) at a temperature between 34 ° C and 38 ° C. After the incubation period, the colonies of the agar plates are removed using a spatula, being careful not to remove medium of cultivation Between 15 and 18 g of crude extract are obtained.
  • the crude extract is dispersed in approximately 20 mL of PBS buffer containing 4% by weight of TRITON X-114. About 35 mL of 1mm diameter silica-zirconium balls are added and mechanical homogenization is carried out with the BEADBEATER homogenizer, from Biospec.
  • the homogenization process is continued until the staining of a sample with the Ziehl-Neelsen technique detects less than 5 whole bacilli after observing 100 fields at 1000 magnifications.
  • the product resulting from the homogenization is separated from the silica-zirconium balls by decantation. These are washed with the PBS buffer solution containing 4% by weight of TRITON X-114, and the wash waters are combined with the product, obtaining a total volume of about 80-100 mL.
  • the product resulting from the homogenization plus the wash waters is centrifuged at 3,000 rpm for 30 minutes in a centrifuge refrigerated at 4 ° C, to remove the non-fragmented cells in the sediment.
  • the supernatant is preserved. Then, said supernatant is centrifuged at 15,100 rpm (equivalent to 27,000 g) for 60 minutes at 4 ° C, obtaining an off-white sediment, containing the cell wall fragments. The sediment is preserved, and the yellowish supernatant is removed. The sediment is first washed with PBS buffer (3 x 3 mL), redispersed in 3 mL of said buffer solution, flush to 20 mL with PBS buffer and centrifuged again at 15,100 rpm for 60 minutes at 4 ° C. reject the supernatant obtained. The washing and centrifuging operation is repeated again, so that the supernatant obtained is completely transparent and rejected.
  • PBS buffer 3 x 3 mL
  • the sediment which contains the cell wall fragments, is washed with PBS buffer (3x3 mL) and redispersed in 12 mL of PBS buffer. After the centrifugation and washing process, the dispersion of the cell wall fragments in PBS buffer in a container is combined and pasteurized by treatment at 65 ° C for 1 hour. The mixture is then cooled rapidly in an ice bath, and the dispersion of cell wall fragments in cryotubes is distributed at a rate of 1 mL per cryotube.
  • the dispersion of cell wall fragments contained in the cryotubes is frozen at -70 ° C and subjected to a lyophilization process at a temperature between -15 and -22 ° C and at a vacuum between 0.188 and 0.400 mbar. Between 1 and 1.5 g of immunotherapeutic agent are obtained.
  • Example 2 Obtaining liposomes of the immunotherapeutic agent Weigh between 740 and 770 mg of the product obtained in Example 1 in a beaker to which 20 mL of a pharmaceutical grade soy lecithin dispersion in ethanol (1 kg) is added of lecithin in 1 liter of absolute ethanol), and 7 mL of a solution of pharmaceutical grade sodium coolant in water (200 g of sodium cholate in 1 liter of double distilled water). The pH is adjusted to a value between 7.7 and 8 with a solution of HC1 0.997 N.
  • the liposomes are prepared by homogenization with a high speed stirrer.
  • the liposome dispersion thus obtained is diluted to 10% with double-distilled water and the pH is adjusted to a value between 7.1 and 7.3 with a solution of HC1 0.0997 N.
  • the liposome dispersion in cryotubes is distributed to 0.5 mL per tube and frozen at -80 ° C.
  • the immunotherapeutic agent, object of the invention is obtained in the form of liposomes.
  • Example 3. Effectiveness of the immunotherapeutic agent as an adjuvant to drug treatment
  • Female mice 6 to 8 weeks of age of the BALB / c, 129 / Sv, C57BL / 6 and DBA / 2 types are used. of specific pathogens.
  • a virulent strain of Mycobacterium tuberculosis is grown in medium
  • Proskauer-Beck until a logarithmic middle phase, and is stored in 1 mL aliquots at -70 ° C until use.
  • Mice are infected by aerosol by placing them in a Middelbrook aerosol infection apparatus that provides an approximate inoculum of 10-50 viable bacilli in the lungs.
  • Bacillary concentration that is, the number of viable bacilli, is determined by incubating serial dilutions of homogenates of the left lung and spleen in Middelbrook 7H11 agar. Homogenization of the left lung and spleen are carried out in the presence of 1 mL of PBS buffer.
  • the dose of the liposome immunotherapeutic agent, object of the invention was administered at week 13.
  • the animals were sacrificed and the conce Bacillary injections in the left lung and in the spleen.
  • Bacillary concentrations, determined according to the method described in the introduction to section C, were significantly lower in the lungs of vaccinated animals, while in the spleen, the results compared to the Control group were not statistically different.
  • the results, expressed in CFU / mL, are shown in Table 1: Table 1
  • mice treated intranasally and intraperitoneally with the liposome immunogenic agent, object of the invention, simultaneously with the treatment with isoniazid have a bacillus number in the lungs considerably lower than in mice that have only been treated with the isoniazid antibiotic.
  • the number of bacilli determined includes those in the active phase and those in the non-active phase
  • treatment with the liposome immunogenic agent would allow a reduction in the time of treatment with the antibiotic, since it is reduced considerably the number of bacilli that can pass into an active phase over time.
  • mice treated subcutaneously with the liposome immunogenic agent, object of the invention after a treatment with the antibiotics isoniazid and rifampicin, have a bacillus number in the lungs considerably lower than in mice that have only been treated with antibiotics
  • the same conclusion in section I) can be applied in this case.
  • mice treated with a single dose of the liposome immunogenic agent intranasally, simultaneously with a treatment with the isoniazid antibiotic have a significantly lower number of bacilli in the lungs than mice that have only been treated with the antibiotic. .
  • the same conclusion in section I) can be applied in this case.
  • the bacillary concentration was significantly lower in the vaccinated animals after the administration of the 3 doses (corresponding to week 28), compared to the Control group.
  • Table 4 Table 4
  • mice treated intranasally with three doses of the liposome immunogenic agent, object of the invention, simultaneously with a treatment with the isoniazid antibiotic have a bacillus number in the lungs considerably lower than in mice that have only been treated with the antibiotic.
  • the same conclusion in section I) can be applied in this case.
  • infected mice were maintained without any treatment.
  • infected mice were treated only with the isoniazid antibiotic at a rate of 25 mg / kg and day for 5 days a week for 4 weeks and rifampicin at a rate of 10 mg / kg and day for 5 days a week for 4 weeks, from week 9 after infection.
  • infected mice were only treated with three 180 ⁇ g doses of liposome immunotherapeutic agent administered subcutaneously at weeks 9, 11 and 15 after infection.
  • treatment with the isoniazid antibiotic started at week 9 and lasted for 4 weeks.
  • treatment with rifampin was started, which ended at week 17.
  • three doses of liposome immunotherapeutic agent were administered, object of the invention.
  • all animals were sacrificed and bacillary concentrations in the left lung were determined. The results obtained for the lung, are expressed in log 10 CFU / mL, are shown in Table 6: Table 6
  • the combined treatment of the antibiotics isoniazid and rifampicin with the liposome immunotherapeutic agent, object of the invention leads to a considerably greater reduction in the number of bacilli than the use of any of the two factors (antibiotics and liposome immunotherapeutic agent) by themselves.
  • the number of bacilli determined includes those in the active phase and those in the non-active phase
  • the combined treatment of the liposome immunogenic agent in association with other drugs would allow a reduction in the treatment time with said drugs , since the number of bacilli that can pass into an active phase over time is considerably reduced.

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Abstract

La presente invención se refiere a un agente inmunoterápico basado en fragmentos de pared celular de una cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis, a un procedimiento para obtenerlo, a formulaciones farmacéuticas que lo contienen, y a su uso para la preparación de un medicamento para el tratamiento combinado de la tuberculosis en asociación con otros fármacos.

Description

AGENTE ΓNMUNOTERÁPICO ÚTIL PARA EL TRATAMIENTO COMBINADO DE LA TUBERCULOSIS EN ASOCIACIÓN CON OTROS FÁRMACOS
Campo de la técnica La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar un agente inmunoterápico útil para el tratamiento combinado de la tuberculosis en asociación con otros fármacos, basado en fragmentos de pared celular de una cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis-complex, y en el agente inmunoterápico obtenible mediante dicho procedimiento.
Estado de la técnica anterior La tuberculosis es una enfermedad infecciosa crónica ocasionada por los bacilos Mycobacterium tuberculosis-comp ex. (MTB-C), que incluyen actualmente a las especies M. tuberculosis, M. bovis, M. microti y M. africanum. Según la Organización Mundial de la Salud, en el mundo se registran anualmente 8.000.000 de nuevos casos de personas que manifiestan la enfermedad y mueren unos 3.000.000 de personas. Se considera que en el mundo existen
2.000.000.000 de personas infectadas. La vacuna actual que se emplea en el tratamiento preventivo contra la tuberculosis está basada en bacterias de la cepa denominada BCG (Bacilo de Calmette-
Guerin), una variante atenuada de M. bovis. Según WO-A-03018053, dicha vacuna constituye el mejor método disponible actualmente para inducir inmunoprotección frente a la tuberculosis, aunque la seguridad y la eficacia de la misma en su aplicación en humanos es objeto de controversia en algunos países, ya que no protege bien a los adultos contra la tuberculosis pulmonar. Por otra parte en WO-A-03004520 se comenta como hecho conocido que el tratamiento más efectivo para combatir la tuberculosis en personas infectadas, tanto las que no han desarrollado todavía la enfermedad como las que ya la han desarrollado, es la administración de varios fármacos, entre ellos la isoniacida, durante un período de tiempo que se prolonga varios meses. Dicho tipo de tratamiento prolongado podría favorecer el desarrollo de microorganismos resistentes a dichos fármacos en el caso de no realizar el tratamiento hasta el final y, además, los citados fármacos actúan solamente en el momento en que el bacilo tiene un metabolismo activo, es decir cuando está en fase de crecimiento, pero no cuando está en una fase no activa. Esto representa un inconveniente significativo, ya que en el proceso de la infección de la tuberculosis conviven bacilos en fase de metabolismo activo y en fase no activa. Un intento para resolver los problemas planteados, según se describe en la patente US4724144, consiste en el uso de un agente inmunoterápico basado en células muertas. de M.vaccae como adyuvante del tratamiento de la tuberculosis junto con la administración de otros fármacos, por ejemplo, rifampicina e isoniacida. Sin embargo, en la patente US6001361 se describe que dicho agente adyuvante no se ha empleado para vacunar masivamente a las personas contra la tuberculosis, y que hay poca información sobre su eficacia. Existe pues la necesidad de disponer de un agente inmunoterápico para el tratamiento de la tuberculosis que actúe como coadyuvante de los fármacos que no favorezca el desarrollo de microorganismos resistentes y que sea capaz de generar respuesta inmunológica incluso contra los bacilos que se hallan en fase no activa. Los autores de la presente invención han descubierto un procedimiento que permite preparar un nuevo agente inmunoterápico útil para el tratamiento combinado de la tuberculosis en asociación con otros fármacos, que comprende fragmentos de pared celular de una cepa virulenta de MTB-C, capaz de aumentar la eficacia de los fármacos asociados al generar una respuesta inmunológica efectiva contra los bacilos que no están en fase de metabolismo activo, lo que además reduce el riesgo de aparición de resistencia.
Objeto de la invención Es objeto de la presente invención un procedimiento para la obtención de un agente inmunoterápico que comprende fragmentos de pared celular de una cepa virulenta de MTB-C, que resulta útil en el tratamiento combinado de la tuberculosis en asociación con otros fármacos. También forman parte del objeto de la presente invención el agente inmunoterápico obtenible según el procedimiento anterior y el uso del mismo para la preparación de un medicamento para el tratamiento combinado de la tuberculosis en asociación con otros fármacos. Otro objeto adicional son las composiciones farmacéuticas que contienen dicho agente inmunoterápico.
Descripción detallada de la invención Los autores de la presente invención han descubierto un procedimiento para la obtención de un agente inmunoterápico que comprende fragmentos de pared celular de una cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis-corcφlex (MTB-C), dicho procedimiento caracterizado porque comprende las siguientes etapas: - el cultivo de la cepa virulenta MTB-C durante un período de tiempo igual o superior a tres semanas y, posteriormente, - la homogeneización del cultivo de células en presencia de un tensioactivo no iónico. La cepa virulenta puede ser cualquier cepa virulenta de MTB-C, ya que el bacilo de la tuberculosis es muy estable y no se ha descrito la aparición de mutaciones en compuestos inmunogénicos. Una de las cepas mas utilizadas por los investigadores en este campo, considerada como cepa virulenta de referencia, es la denominada H37Rv que, por ejemplo, puede ser libremente adquirida en la National Collection of Type Cultures (NCTC), Londres, Gran Bretaña (número de depósito NC007416). La cepa virulenta se puede cultivar por inoculación en medios de cultivo bien conocidos por el experto en la materia. Puede tratarse de un medio sólido, como por ejemplo el agar Middlebrook tipo 7H10 o tipo 7H11, o de un medio líquido, por ejemplo el medio de cultivo Sauton o el medio de cultivo Proskauer-Beck. A los efectos de la presente invención, el cultivo debe efectuarse durante un período de tiempo igual o superior a tres semanas, preferiblemente comprendido entre 3 y 4 semanas. La temperatura del cultivo se mantiene, preferiblemente, entre 34° C y 38° C. Una vez finalizado el cultivo, si éste se ha realizado en fase sólida, se procede al rascado de las placas para obtener las colonias, evitando la extracción de medio (agar) al mismo tiempo. Si el cultivo se ha realizado en fase líquida, se procede a la concentración y lavado de las células empleando técnicas convencionales conocidas por el experto en la materia, como por ejemplo, la centrifugación. La homogeneización de las células se lleva a cabo en un medio tamponado a un pH neutro, siendo importante a los efectos de la presente invención que dicha homogeneización se efectúe en presencia de un tensioactivo no iónico que favorece la obtención de partículas de pared celular finamente divididas y emulsiona, al menos en parte, fracciones lipídicas indeseadas. Mediante este proceso de homogeneización se rompen las células de MTB-C y se obtienen fragmentos pequeños de pared celular. La homogeneización puede llevarse a cabo mediante sonicación por ultrasonidos, o mediante la utilización de pequeñas bolas de aproximadamente 1 mm de diámetro, por ejemplo, de sílice o de sílice-zirconio, conjuntamente con un homogeneizador mecánico. Un homogeneizador mecánico que se puede utilizar, por ejemplo, es el modelo BEADBEATER de la empresa Biospec. El medio tamponado está constituido, por ejemplo, por tampón PBS (solución salina de tampón fosfato). El tipo de tensioactivo no iónico utilizado no resulta crítico, aunque preferiblemente se selecciona entre el grupo de los alquilfenoles etoxilados y los esteres de sorbitán etoxilados. De manera más preferible el tensioactivo no iónico se selecciona entre los octilfenoles etoxilados. Más preferiblemente se emplean octilfenoles etoxilados con 7-8 moles de óxido de etileno, que se encuentran en el mercado bajo el nombre de, por ejemplo, TRITÓN X-114. El contenido en tensioactivo no iónico en la etapa de homogeneización está comprendido entre el 1 y el 5 % en peso respecto del total del homogeneizado. La masa homogeneizada, que contiene ya los fragmentos de pared celular deseados, se somete a un tratamiento convencional con el fin de separar dichos fragmentos de las células no fragmentadas y los componentes solubilizados. Por ejemplo, después de haber separado por decantación las bolas de sílice o de sílice-zirconio, caso de haberlas utilizado, el producto resultante de la homogeneización se centrifuga suavemente a una velocidad inferior a 5.000 rpm para eliminar como sedimento las células no fragmentadas. A continuación, el sobrenadante resultante se centrifuga a una velocidad de centrifugación más elevada, por ejemplo superior a 15.000 rpm, para eliminar los elementos solubilizados, que se concentran en el líquido sobrenadante, mientras que los fragmentos de pared celular se concentran en el sedimento. Empleando técnicas habituales conocidas por el experto en la materia, como son el lavado con tampón PBS y centrifugación, este proceso puede repetirse varias veces hasta la obtención de un sobrenadante completamente transparente, que se rechaza. El sedimento obtenido, que contiene los fragmentos de pared celular, se dispersa en tampón PBS y se somete a un proceso químico, por ejemplo mediante tratamiento con formol, o físico, por ejemplo mediante tratamiento en autoclave o pasteurización, que asegure la total inactivación de las células de MTB-C que hubieran podido permanecer viables tras el proceso de fragmentación y de purificación. Finalmente, la dispersión de fragmentos de pared celular en tampón PBS se distribuye en viales y se liofiliza a una temperatura comprendida entre -15° C y -25° C y con un vacío comprendido entre 0,1 y 0,5 mbar. Se obtienen viales que contienen fragmentos de pared celular de MTB-C que constituyen el agente inmunoterápico de la invención, y se conservan a —70° C. A partir del agente inmunoterápico de la invención pueden prepararse composiciones farmacéuticas, también objeto de la invención, que pueden formularse en forma de emulsión tipo aceite en agua (O/W) o en forma de liposomas. Resultan preferidas las composiciones farmacéuticas en forma de liposomas. La formación de liposomas puede efectuarse empleando técnicas convencionales, bien conocidas por el experto. Por ejemplo, los liposomas pueden formarse mezclando en un medio acuoso los fragmentos de pared celular liofilizados y los lípidos auxiliares para la formación de liposomas, y sometiendo la mezcla a un procedimiento estándar de homogeneización, por ejemplo, mediante el uso de un agitador de alta velocidad. Los lípidos auxiliares para fabricar liposomas son ampliamente conocidos por el experto en la materia. En general, se incluyen fosfolípidos, con carga neta neutra y/o negativa, y esteróles. Los fosfolípidos empleados pueden ser, por ejemplo: la fosfatidilcolina, la fosfatidilserina y el fosfatidilinositol. Habitualmente, el componente mayoritario de los liposomas es la fosfatidilcolina, que puede ser sintetizada o aislada de fuentes naturales. Un producto comercial frecuentemente usado es la lecitina de soja. Los esteróles que se emplean en la preparación de liposomas pueden ser, entre otros, el colesterol y las sales biliares. Preferiblemente, los liposomas se forman empleando una mezcla de lecitina de soja y colato sódico. Opcionalmente los liposomas pueden contener aditivos que mejoren su estabilidad, por ejemplo: la vitamina E, que actúa de antioxidante de los lípidos. Los liposomas obtenidos presentan una distribución de tamaño en la que el 99,9 % son más pequeños que 1 miera. Los liposomas se pueden someter a liofilización para obtener de este modo el agente inmunoterápico objeto de la invención en forma de liposomas liofilizados. Forma parte también del objeto de la invención el uso del agente inmunoterápico para la preparación de un medicamento para el tratamiento combinado de la tuberculosis en asociación con otros fármacos. De manera preferible, sin que ello descarte otras vías de administración, el agente inmunoterápico objeto de la invención se administra por vía parenteral. De entre los fármacos antituberculosos conocidos, resultan preferidos para el tratamiento combinado con el agente terapéutico de la invención la isoniacida y la rifampicina. La asociación del agente inmunoterápico de la invención con los fármacos antituberculosos para el tratamiento combinado de la enfermedad puede llevarse a cabo de manera simultánea o de manera secuencial, es decir mediante la admimstración simultánea de los fármacos y del agente inmunoterápico, o mediante la admimstración previa de los fármacos seguida de la administración del agente inmunoterápico. Sorprendentemente, se ha encontrado que el tratamiento combinado de la tuberculosis, mediante la administración del agente inmunoterápico de la invención asociado con fármacos para el tratamiento de la tuberculosis, aumenta la eficacia de dichos fármacos al generar una respuesta inmunológica contra los bacilos que no están en fase de metabolismo activo, lo que además reduce el riesgo de desarrollo de resistencia. Los ejemplos que siguen a continuación se expone a efectos de proporcionar al experto en la materia una explicación detallada de realizaciones concretas dentro de la invención. Ejemplo 1.- - Obtención del agente inmunoterápico Se inoculan unas 80 - 100 placas de agar Middlebrook del tipo 7H11 con un cultivo de H37Rv suministrado por la National Collection of Type Cultures (NCTC), Londres, Gran Bretaña (número de depósito NC007416). La concentración de unidades formadoras de colonias inoculada en cada placa es de 105-106 UFC. Las placas se incuban durante 21 días (3 semanas) a una temperatura comprendida entre 34° C y 38° C. Después del período de incubación, se extraen las colonias de las placas de agar mediante una espátula, con la precaución de no extraer medio de cultivo. Se obtienen entre 15 y 18 g de extracto crudo. El extracto crudo se dispersa en aproximadamente 20 mL de tampón PBS que contiene un 4 % en peso de TRITÓN X-114. Se añaden unos 35 mL de bolas de sílice-zirconio de 1 mm de diámetro y se procede a la homogeneización mecánica con el homogeneizador BEADBEATER, de la empresa Biospec. El proceso de homogeneización se continúa hasta que en la tinción de una muestra con la técnica de Ziehl-Neelsen se detecten menos de 5 bacilos enteros después de observar 100 campos a 1000 aumentos. El producto resultante de la homogeneización se separa de las bolas de sílice-zirconio por decantación. Éstas se lavan con la solución tampón PBS conteniendo un 4 % en peso de TRITÓN X-114, y las aguas de lavado se reúnen con el producto, obteniéndose un volumen total de unos 80-100 mL. A continuación, el producto resultante de la homogeneización más las aguas de lavado se centrifuga a 3.000 rpm durante 30 minutos en una centrífuga refrigerada a 4° C, para eliminar las células no fragmentadas en el sedimento. Se conserva el sobrenadante. A continuación, dicho sobrenadante se centrifuga a 15.100 rpm (equivalente a 27.000 g) durante 60 minutos a 4° C, obteniéndose un sedimento blanquecino, que contiene los fragmentos de pared celular Se conserva el sedimento, y se elimina el sobrenadante amarillento. El sedimento se lava primero con tampón PBS (3 x 3 mL), se redispersa en 3 mL de dicha solución tampón, se enrasa a 20 mL con tampón PBS y se vuelve a centrifugar a 15.100 rpm durante 60 minutos a 4° C. Se rechaza el sobrenadante obtenido. Se repite nuevamente la operación de lavado y centrifugado, de forma que el sobrenadante obtenido es completamente transparente y se rechaza. El sedimento, que contiene los fragmentos de pared celular, se lava con tampón PBS (3x3 mL) y se redispersa en 12 mL de tampón PBS. Después del proceso de centrifugación y lavado, se reúne la dispersión de los fragmentos de pared celular en tampón PBS en un recipiente y se pasteuriza por tratamiento a 65° C durante 1 hora. A continuación se enfría rápidamente la mezcla en un baño de hielo, y se distribuye la dispersión de fragmentos de pared celular en criotubos a razón de 1 mL por criotubo. La dispersión de fragmentos de pared celular contenida en los criotubos se congela a -70° C y se somete a un proceso de liofilización a una temperatura comprendida entre -15 y -22° C y a un vacío comprendido entre 0,180 y 0,400 mbar. Se obtienen entre 1 y 1,5 g de agente inmunoterápico.
Ejemplo 2.- Obtención de liposomas del agente inmunoterápico Se pesan entre 740 y 770 mg del producto obtenido en el Ejemplo 1 en un vaso de precipitados al que se le añaden 20 mL de una dispersión de lecitina de soja calidad farmacéutica en etanol (1 kg de lecitina en 1 litro de etanol absoluto), y 7 mL de una disolución de colato sódico de calidad farmacéutica en agua (200 g de colato sódico en 1 litro de agua bidestilada). Se ajusta el pH a un valor comprendido entre 7,7 y 8 con una disolución de HC1 0,997 N. Se preparan los liposomas mediante homogeneización con un agitador de alta velocidad. La dispersión de liposomas así obtenida se diluye al 10 % con agua bidestilada y se ajusta el pH a un valor comprendido entre 7,1 y 7,3 con una disolución de HC1 0,0997 N. Se distribuye la dispersión de liposomas en criotubos a razón de 0,5 mL por tubo y se congela a -80° C. Posteriormente se liofiliza y se obtiene el agente inmunoterápico, objeto de la invención, en forma de liposomas. Ejemplo 3.- Efectividad del agente inmunoterápico como adyuvante del tratamiento con fármacos En el modelo de infección se utilizan ratones hembra de 6 a 8 semanas de edad de los tipos BALB/c, 129/Sv, C57BL/6 y DBA/2, libres de patógenos específicos. Una cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis se cultiva en medio
Proskauer-Beck hasta una fase media logarítmica, y se conserva en alícuotas de 1 mL a -70° C hasta su utilización. Los ratones se infectan por aerosol mediante su ubicación en un aparato Middelbrook de infección por aerosol que proporciona un inoculo aproximado de 10-50 bacilos viables en los pulmones. La concentración bacilar, es decir, el número de bacilos viables, se determina incubando diluciones seriadas de homogeneizados de pulmón izquierdo y bazo en agar Middelbrook 7H11. La homogeneización del pulmón izquierdo y del bazo se llevan a cabo en presencia de 1 mL de tampón PBS.
I) Tratamiento con una dosis de agente inmunoterápico liposomado simultáneamente con isoniacida Se dividieron los ratones infectados del tipo BALB/c en tres grupos: - Tratados solamente con isoniacida a razón de 25 mg /kg y día durante 5 días a la semana durante 6 semanas (Control), - Tratados con isoniacida a razón de 25 mg /kg y día durante 5 días a la semana durante 6 semanas y además con una dosis intranasal de 180 μg de agente inmunoterápico liposomado, objeto de la invención, y - Tratados con isoniacida a razón de 25 mg /kg y día durante 5 días a la semana durante 6 semanas y además con una dosis intraperitoneal 180 μg de agente inmunoterápico liposomado, objeto de la invención El tratamiento con el antibiótico isoniacida se inició en la semana 9 y se continuó hasta la semana 15. La dosis del agente inmunoterápico liposomado, objeto de la invención, se administró en la semana 13. A la semana 15, los animales fueron sacrificados y se determinaron las concentraciones bacilares en el pulmón izquierdo y en el bazo de mismos. Las concentraciones bacilares, determinadas según el método descrito en la introducción al apartado C, fueron significativamente menores en los pulmones de los animales vacunados, mientras que en el bazo, los resultados comparados con el grupo Control, no fueron estadísticamente diferentes. Los resultados, expresados en UFC/mL, se muestran en la Tabla 1 : Tabla 1
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Se puede observar que los ratones tratados por vía intranasal y por vía intraperitoneal con el agente inmunogénico liposomado, objeto de la invención, simultáneamente con el tratamiento con isoniacida, presentan un número de bacilos en los pulmones considerablemente inferior al de los ratones que solamente han sido tratados con el antibiótico isoniacida. Teniendo en cuenta, que el número de bacilos determinado incluye a los que están en fase activa y a los que están en fase no activa, el tratamiento con el agente inmunogénico liposomado permitiría una reducción en el tiempo de tratamiento con el antibiótico, ya que se reduce considerablemente el número de bacilos que pueden pasar a una fase activa en el transcurso del tiempo.
II) Tratamiento con tres dosis de agente inmunoterápico liposomado posterior a un tratamiento de rifampicina e isoniacida Se dividieron los ratones infectados del tipo 129/Sv en dos grupos: - Tratados con isoniacida a razón de 25 mg/kg y día durante 5 días a la semana durante cuatro semanas y rifampicina a razón de 10 mg/kg y día durante 5 días a la semana durante cuatro semanas (Control), y - Tratados además con tres dosis de 180 μg de agente inmunoterápico liposomádo, objeto de la invención, inoculadas subcutáneamente después del tratamiento con rifampicina e isoniacida El tratamiento con el antibiótico isoniacida se inició en la semana 9 y se prolongó durante 4 semanas. En la semana 13 se inició el tratamiento con rifampicina, que finalizó en la semana 17. En las semanas 17, 19 y 21 se administraron tres dosis de agente inmunoterápico liposomado, objeto de la invención. En la semana 22, los animales fueron sacrificados y se determinaron las concentraciones bacilares en el pulmón izquierdo y en el bazo de mismos. La concentración bacilar fue significativamente menor en los pulmones de los animales vacunados, en comparación con el grupo Control, mientras que en el bazo no se encontraron diferencias significativas entre los ratones del grupo Control y los que fueron tratados además con el agente inmunoterápico liposomado. Los resultados, expresados en log10 UFC/mL, se muestran en la Tabla 2: Tabla 2
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Se puede observar que los ratones tratados por vía subcutánea con el agente inmunogénico liposomado, objeto de la invención, posterior a un tratamiento con los antibióticos isoniacida y rifampicina, presentan un número de bacilos en los pulmones considerablemente inferior al de los ratones que solamente han sido tratados con los antibióticos. La misma conclusión del apartado I) se puede aplicar en este caso.
III) Tratamiento con tres dosis de agente inmunoterápico liposomado simultáneamente con isoniacida Se dividieron los ratones infectados del tipo C57BL/6 en dos grupos: - Tratados solamente con isoniacida a razón de 25 mg /kg y día durante 5 días a la semana durante 8 semanas (Control), y - Tratados además con tres dosis de 180 μg de agente inmunoterápico liposomado, objeto de la invención, inoculadas intranasalmente En la semana 9 se inició el tratamiento con el antibiótico isoniacida, que se prolongó hasta la semana 17. Las dosis de agente inmunoterápico liposomado se administraron en las semanas 13, 15 y 17. Los ratones se sacrificaron en las semanas 15 y 28 y se determinaron las concentraciones bacilares en el pulmón izquierdo y en el bazo de mismos. La concentración bacilar fue significativamente menor en los pulmones de los animales vacunados, después de la administración de una o tres dosis (correspondientes a las semanas 15 y 28 respectivamente), en comparación con el grupo Control. Los resultados obtenidos para los pulmones después de una dosis de agente inmunoterápico (semana 15) y después de 3 dosis (semana 28), expresados en logio UFC/mL, se muestran en la Tabla 3 : Tabla 3
Figure imgf000013_0001
Se puede observar que los ratones tratados con una sola dosis del agente inmunogénico liposomado por vía intranasal, simultáneamente a un tratamiento con el antibiótico isoniacida, presentan un número de bacilos en los pulmones considerablemente inferior al de los ratones que solamente han sido tratados con el antibiótico. La misma conclusión del apartado I) se puede aplicar en este caso. En el caso del bazo, la concentración bacilar fue significativamente menor en los animales vacunados después de la admimstración de las 3 dosis (correspondiente a la semana 28), en comparación con el grupo Control. Los resultados obtenidos para el bazo, expresados en log10 UFC/mL, se muestran en la Tabla 4: Tabla 4
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Se puede observar que los ratones tratados por vía intranasal con tres dosis del agente inmunogénico liposomado, objeto de la invención, simultáneamente a un tratamiento con el antibiótico isoniacida, presentan un número de bacilos en los pulmones considerablemente inferior al de los ratones que solamente han sido tratados con el antibiótico. La misma conclusión del apartado I) se puede aplicar en este caso.
IV) Estudio comparativo para estudiar el efecto de los antibióticos, del agente inmunoterápico liposomado y de la interacción entre ambos Se han realizado ensayos con ratones DBA/2, de acuerdo con un diseño factorial 2 , en las condiciones que se muestran en la tabla 5: Tabla 5
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. En el ensayo 1, los ratones infectados se mantuvieron sin ningún tipo de tratamiento. En el ensayo 2, los ratones infectados fueron tratados solamente con el antibiótico isoniacida a razón de 25 mg/kg y día durante 5 días a la semana durante 4 semanas y rifampicina a razón de 10 mg/kg y día durante 5 días a la semana durante 4 semanas, a partir de la semana 9 posterior a la infección. En el ensayo 3, los ratones infectados fueron tratados solamente con tres dosis de 180 μg de agente inmunoterápico liposomado administradas subcutáneamente en las semanas 9, 11 y 15 posteriores a la infección. En el ensayo 4, el tratamiento con el antibiótico isoniacida se inició en la semana 9 y se prolongó durante 4 semanas. En la semana 13 se inició el tratamiento con rifampicina, que finalizó en la semana 17.En las semanas 17, 19 y 21 se administraron tres dosis de agente inmunoterápico liposomado, objeto de la invención. En la semana 22, todos los animales fueron sacrificados y se determinaron las concentraciones bacilares en el pulmón izquierdo. Los resultados obtenidos para el pulmón, se expresan en log10 UFC/mL, se muestran en la Tabla 6: Tabla 6
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Se puede observar que el tratamiento combinado de los antibióticos isoniacida y rifampicina con el agente inmunoterápico liposomado, objeto de la invención, conduce a una reducción del número de bacilos considerablemente mayor que el uso de cualquiera de los dos factores (antibióticos y agente inmunoterápico liposomado) por sí solos. Teniendo en cuenta, que el número de bacilos determinado incluye a los que están en fase activa y a los que están en fase no activa, el tratamiento combinado del agente inmunogénico liposomado en asociación con otros fármacos permitiría una reducción en el tiempo de tratamiento con dichos fármacos, ya que se reduce considerablemente el número de bacilos que pueden pasar a una fase activa en el transcurso del tiempo.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Un procedimiento para la obtención de un agente inmunoterápico que comprende fragmentos de pared celular de una cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis-complex (MTB-C), dicho procedimiento caracterizado porque comprende las siguientes etapas: cultivar la cepa virulenta MTB-C durante un período de tiempo igual o superior a tres semanas y, posteriormente, - homogeneizar el cultivo de células en presencia de un tensioactivo no iónico.
2.- Un procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porqué el período de tiempo de cultivo está comprendido entre 3 y 4 semanas.
3.- Un procedimiento según las reivindicaciones 1 o 2 caracterizado porque el tensioactivo no iónico se selecciona entre el grupo de los alquilfenoles etoxilados y los esteres de sorbitán etoxilados.
4.- Un procedimiento según la reivindicación 3 caracterizado porque el tensioactivo no iónico se selecciona entre los octilfenoles etoxilados.
5.- Un procedimiento según la reivindicación 4 caracterizado porque el tensioactivo no iónico se selecciona entre los octilfenoles etoxilados con 7-8 moles de óxido de etileno.
6.- Un procedimiento según las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque la homogeneización se efectúa en un medio tamponado a pH neutro.
7.- Un procedimiento según las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque comprende además las siguientes etapas: - separar mediante centrifugación las células no fragmentadas y los componentes solubilizados, someter a tratamiento químico o físico la fracción de fragmentos de pared celular para inactivar las eventuales células de cepa virulenta que eventualmente* contenga, y - desecar el agente inmunoterápico obtenido mediante liofilización.
8.- Un agente inmunoterápico obtenible mediante un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9.- Una composición farmacéutica que comprende el agente inmunoterápico de la reivindicación 8.
10.- Una composición farmacéutica según la reivindicación 9 que comprende el agente inmunoterápico en forma de liposomas.
11.- El uso del agente inmunoterápico de la reivindicación 8 para la preparación de un medicamento para el tratamiento combinado de la tuberculosis en asociación con otros fármacos.
12.- El uso según la reivindicación 11 caracterizado porque los fármacos son la isoniacida y/o la rifampicina.
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