ES2325835T3 - Agente inmunoterapeutico util para el tratamiento combinado de la tuberculosis en asociacion con otros farmacos. - Google Patents
Agente inmunoterapeutico util para el tratamiento combinado de la tuberculosis en asociacion con otros farmacos. Download PDFInfo
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
La presente invención se refiere a un agente inmunoterápico basado en fragmentos de pared celular de una cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis, a un procedimiento para obtenerlo, a formulaciones farmacéuticas que lo contienen, y a su uso para la preparación de un medicamento para el tratamiento combinado de la tuberculosis en asociación con otros fármacos.
Description
Agente inmunoterápico útil para el tratamiento
combinado de la tuberculosis en asociación con otros fármacos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para preparar un agente inmunoterápico, que es usado
para el tratamiento combinado de la tuberculosis en asociación con
otros fármacos. La invención se refiere también al agente
inmunoterápico obtenido con el procedimiento mencionado, el cual
está basado en fragmentos de pared celular de una cepa virulenta de
Mycobacterium tuberculosis-complex.
La tuberculosis es una enfermedad infecciosa
crónica ocasionada por los bacilos Mycobacterium
tuberculosis-complex (MTB-C), que incluyen
actualmente a las especies M. tuberculosis, M. bovis,
M. microti y M. africanum.
Según la Organización Mundial de la Salud, en el
mundo se registran anualmente 8.000.000 de nuevos casos de personas
que manifiestan la enfermedad y mueren unos 3.000.000 de personas.
Se considera que en el mundo existen 2.000.000.000 de personas
infectadas.
La vacuna actual que se emplea en el tratamiento
preventivo contra la tuberculosis está basada en bacterias de la
cepa denominada BCG (Bacilo de Calmette-Guerin), una
variante atenuada de M. bovis.
Según
WO-A-03018053, dicha vacuna
constituye el mejor método disponible actualmente para inducir
inmunoprotección frente a la tuberculosis, aunque la seguridad y la
eficacia de la misma en su aplicación en humanos es objeto de
controversia en algunos países, ya que no protege bien a los adultos
contra la tuberculosis pulmonar.
Por otra parte en
WO-A-03004520 se comenta como hecho
conocido que el tratamiento más efectivo para combatir la
tuberculosis en personas infectadas, tanto las que no han
desarrollado todavía la enfermedad como las que ya la han
desarrollado, es la administración de varios fármacos, entre ellos
la isoniacida, durante un período de tiempo que se prolonga varios
meses.
Dicho tipo de tratamiento prolongado podría
favorecer el desarrollo de microorganismos resistentes a dichos
fármacos en el caso de no realizar el tratamiento hasta el final y,
además, los citados fármacos actúan solamente en el momento en que
el bacilo tiene un metabolismo activo, es decir cuando está en fase
de crecimiento, pero no cuando está en una fase no activa. Esto
representa un inconveniente significativo, ya que en el proceso de
la infección de la tuberculosis conviven bacilos en fase de
metabolismo activo y en fase no activa.
Un intento para resolver los problemas
planteados, según se describe en la patente US4724144, consiste en
el uso de un agente inmunoterápico basado en células muertas de
M. vaccae como adyuvante del tratamiento de la tuberculosis
junto con la administración de otros fármacos, por ejemplo,
rifampicina e isoniacida.
Sin embargo, en la patente US6001361 se describe
que dicho agente adyuvante no se ha empleado para vacunar
masivamente a las personas contra la tuberculosis, y que hay poca
información sobre su eficacia.
La solicitud PCT
WO-A-00/21983 describe extractos que
contienen polipéptidos del citosol así como también componentes de
M. tuberculosis de pared celular y de membrana celular, los
cuales están libres de pared celular insoluble.
La patente rusa
RU-C1-2153354 describe una vacuna
contra la tuberculosis, que contiene una mezcla de extracto TRITON®
de paredes celulares mycobacterium a partir del bacilo
Calmette-Guérin y polioxidonio de agente
inmunomodulador no específico.
En Sinha et al., Comp. Funct. Genom.,
2002, 3, 470-483 se describen fracciones de
membranas celular de una cepa virulenta de M. tuberculosis,
pero no para fragmentos de pared celular.
La solicitud
US-A-2002/127700 describe un agente
farmacéutico para el tratamiento de una infección causada por una
especie micobacteriana, que comprende un extracto celular de
MTB-C, en particular fracciones sobrenadantes, pero
no fracciones de pared celular insolubles.
Existe pues la necesidad de disponer de un
agente inmunoterápico para el tratamiento de la tuberculosis que
actúe como coadyuvante de estos fármacos, y que no favorezca el
desarrollo de microorganismos resistentes y que sea capaz de
generar respuesta inmunológica incluso contra los bacilos que se
hallan en fase no activa.
Los autores de la presente invención han
descubierto un procedimiento que permite preparar un nuevo agente
inmunoterápico útil para el tratamiento combinado de la tuberculosis
en asociación con otros fármacos. Este agente inmunoterápico
comprende fragmentos de pared celular de una cepa virulenta de
MTB-C, capaz de aumentar la eficacia de los
fármacos asociados al generar una respuesta inmunológica efectiva
contra los bacilos que no están en fase de metabolismo activo, lo
que además reduce el riesgo de aparición de resistencia.
Es objeto de la presente invención un
procedimiento para la obtención de un agente inmunoterápico que
comprende fragmentos de pared celular de una cepa virulenta de
MTB-C, que resulta útil en el tratamiento combinado
de la tuberculosis en asociación con otros fármacos.
También forman parte del objeto de la presente
invención el agente inmunoterápico obtenible según el procedimiento
anterior y el uso del mismo para la preparación de un medicamento
para el tratamiento combinado de la tuberculosis en asociación con
otros fármacos.
Otro objeto adicional son las composiciones
farmacéuticas que contienen dicho agente inmunoterápico.
Los autores de la presente invención han
descubierto un procedimiento para la obtención de un agente
inmunoterápico que comprende fragmentos de pared celular de una
cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis-complex
(MTB-C), dicho procedimiento caracterizado porque
comprende las siguientes etapas:
- -
- el cultivo de la cepa virulenta MTB-C durante un período de tiempo igual o superior a tres semanas y, posteriormente,
- -
- la homogeneización del cultivo de células en presencia de un tensioactivo no iónico
- -
- seleccionado del grupo que comprende alquilfenoles etoxilados y ésteres de sorbitán etoxilados.
La cepa virulenta puede ser cualquier cepa
virulenta de MTB-C, ya que el bacilo de la
tuberculosis es muy estable y no se ha descrito la aparición de
mutaciones en compuestos inmunogénicos. Una de las cepas mas
utilizadas por los investigadores en este campo, considerada como
cepa virulenta de referencia, es la denominada H37Rv que, por
ejemplo, puede ser libremente adquirida en la National Collection of
Type Cultures (NCTC), Londres, Gran Bretaña (número de depósito
NC007416).
La cepa virulenta se puede cultivar por
inoculación en medios de cultivo bien conocidos por el experto en
la materia. Puede tratarse de un medio sólido, como por ejemplo el
agar Middlebrook tipo 7H10 o tipo 7H11, o de un medio líquido, por
ejemplo el medio de cultivo Sauton o el medio de cultivo
Proskauer-Beck.
A los efectos de la presente invención, el
cultivo debe efectuarse durante un período de tiempo igual o
superior a tres semanas, preferiblemente comprendido entre 3 y 4
semanas. La temperatura del cultivo se mantiene, preferiblemente,
entre 34ºC y 38ºC.
Una vez finalizado el cultivo, si éste se ha
realizado en fase sólida, se procede al rascado de las placas para
obtener las colonias, evitando la extracción de medio (agar) al
mismo tiempo. Si el cultivo se ha realizado en fase líquida, se
procede a la concentración y lavado de las células empleando
técnicas convencionales conocidas por el experto en la materia,
como por ejemplo, la centrifugación.
La homogeneización de las células se lleva a
cabo en un medio tamponado a un pH neutro, siendo importante a los
efectos de la presente invención que dicha homogeneización se
efectúe en presencia de un tensioactivo no iónico que favorece la
obtención de partículas de pared celular finamente divididas y
emulsiona, al menos en parte, fracciones lipídicas indeseadas.
Mediante este proceso de homogeneización se
rompen las células de MTB-C y se obtienen fragmentos
pequeños de pared celular.
La homogeneización puede llevarse a cabo
mediante sonicación por ultrasonidos, o mediante la utilización de
pequeñas bolas de aproximadamente 1 mm de diámetro, por ejemplo, de
sílice o de sílice-zirconio, conjuntamente con un
homogeneizador mecánico. Un homogeneizador mecánico que se puede
utilizar, por ejemplo, es el modelo BEADBEATER de la empresa
Biospec.
El medio tamponado está constituido, por
ejemplo, por tampón PBS (solución salina de tampón fosfato).
El tipo de tensioactivo no iónico utilizado no
resulta crítico, aunque preferiblemente se selecciona entre el
grupo de los alquilfenoles etoxilados y los ésteres de sorbitán
etoxilados. De manera más preferible el tensioactivo no iónico se
selecciona entre los octilfenoles etoxilados. Más preferiblemente se
emplean octilfenoles etoxilados con 7-8 moles de
óxido de etileno, que se encuentran en el mercado bajo el nombre de,
por ejemplo, TRITON X-114. El contenido en
tensioactivo no iónico en la etapa de homogeneización está
comprendido entre el 1 y el 5% en peso respecto del total del
homogeneizado.
La masa homogeneizada, que contiene ya los
fragmentos de pared celular deseados, se somete a un tratamiento
convencional con el fin de separar dichos fragmentos de las células
no fragmentadas y los componentes solubilizados.
Por ejemplo, después de haber separado por
decantación las bolas de sílice o de
sílice-zirconio, caso de haberlas utilizado, el
producto resultante de la homogeneización se centrifuga suavemente a
una velocidad inferior a 5.000 rpm para eliminar como sedimento las
células no fragmentadas.
A continuación, el sobrenadante resultante se
centrifuga a una velocidad de centrifugación más elevada, por
ejemplo superior a 15.000 rpm, para eliminar los elementos
solubilizados, que se concentran en el líquido sobrenadante,
mientras que los fragmentos de pared celular se concentran en el
sedimento. Empleando técnicas habituales conocidas por el experto
en la materia, como son el lavado con tampón PBS y centrifugación,
este proceso puede repetirse varias veces hasta la obtención de un
sobrenadante completamente transparente, que se rechaza.
El sedimento obtenido, que contiene los
fragmentos de pared celular, se dispersa en tampón PBS y se somete
a un proceso químico, por ejemplo mediante tratamiento con formol, o
físico, por ejemplo mediante tratamiento en autoclave o
pasteurización, que asegure la total inactivación de las células de
MTB-C que hubieran podido permanecer viables tras
el proceso de fragmentación y de purificación.
Finalmente, la dispersión de fragmentos de pared
celular en tampón PBS se distribuye en viales y se liofiliza a una
temperatura comprendida entre -15ºC y -25ºC y con un vacío
comprendido entre 0,1 y 0,5 mbar.
Se obtienen viales que contienen fragmentos de
pared celular de MTB-C que constituyen el agente
inmunoterápico de la invención, y se conservan a -70ºC.
A partir del agente inmunoterápico de la
invención pueden prepararse composiciones farmacéuticas, también
objeto de la invención, que pueden formularse en forma de emulsión
tipo aceite en agua (O/W) o en forma de liposomas. Resultan
preferidas las composiciones farmacéuticas en forma de
liposomas.
La formación de liposomas puede efectuarse
empleando técnicas convencionales, bien conocidas por el experto.
Por ejemplo, los liposomas pueden formarse mezclando en un medio
acuoso los fragmentos de pared celular liofilizados y los lípidos
auxiliares para la formación de liposomas, y sometiendo la mezcla a
un procedimiento estándar de homogeneización, por ejemplo, mediante
el uso de un agitador de alta velocidad.
Los lípidos auxiliares para fabricar liposomas
son ampliamente conocidos por el experto en la materia. En general,
se incluyen fosfolípidos, con carga neta neutra y/o negativa, y
esteroles.
Los fosfolípidos empleados pueden ser, por
ejemplo: la fosfatidilcolina, la fosfatidilserina y el
fosfatidilinositol.
Habitualmente, el componente mayoritario de los
liposomas es la fosfatidilcolina, que puede ser sintetizada o
aislada de fuentes naturales. Un producto comercial frecuentemente
usado es la lecitina de soja.
Los esteroles que se emplean en la preparación
de liposomas pueden ser, entre otros, el colesterol y las sales
biliares.
Preferiblemente, los liposomas se forman
empleando una mezcla de lecitina de soja y colato sódico.
Opcionalmente los liposomas pueden contener
aditivos que mejoren su estabilidad, por ejemplo: la vitamina E,
que actúa de antioxidante de los lípidos.
Los liposomas obtenidos presentan una
distribución de tamaño de partícula en la que el 99,9% son más
pequeños que 1 micra.
Los liposomas se pueden someter a liofilización
para obtener de este modo el agente inmunoterápico objeto de la
invención en forma de liposomas liofilizados.
Forma parte también del objeto de la invención
el uso del agente inmunoterápico para la preparación de un
medicamento para el tratamiento combinado de la tuberculosis en
asociación con otros fármacos.
De manera preferible, sin que ello descarte
otras vías de administración, el agente inmunoterápico objeto de la
invención se administra por vía parenteral.
De entre los fármacos antituberculosos
conocidos, resultan preferidos para el tratamiento combinado con el
agente terapéutico de la invención la isoniacida y la
rifampicina.
La asociación del agente inmunoterápico de la
invención con los fármacos antituberculosos para el tratamiento
combinado de la enfermedad puede llevarse a cabo de manera
simultánea o de manera secuencial, es decir mediante la
administración simultánea de los fármacos y del agente
inmunoterápico, o mediante la administración previa de los fármacos
seguida de la administración del agente inmunoterápico.
Sorprendentemente, se ha encontrado que el
tratamiento combinado de la tuberculosis, mediante la administración
del agente inmunoterápico de la invención asociado con fármacos
para el tratamiento de la tuberculosis, aumenta la eficacia de
dichos fármacos al generar una respuesta inmunológica contra los
bacilos que no están en fase de metabolismo activo, lo que además
reduce el riesgo de desarrollo de resistencia.
Los ejemplos que siguen a continuación se
exponen a efectos de proporcionar al experto en la materia una
explicación detallada de realizaciones concretas dentro de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se inoculan unas 80-100 placas
de agar Middlebrook del tipo 7H11 con un cultivo de H37Rv
suministrado por la National Collection of Type Cultures (NCTC),
Londres, Gran Bretaña (número de depósito NC007416). La
concentración de unidades formadoras de colonias inoculada en cada
placa es de 10^{5}-10^{6} UFC. Las placas se
incuban durante 21 días (3 semanas) a una temperatura comprendida
entre 34ºC y 38ºC.
Después del período de incubación, se extraen
las colonias de las placas de agar mediante una espátula, con la
precaución de no extraer medio de cultivo. Se obtienen entre 15 y 18
g de extracto crudo.
El extracto crudo se dispersa en aproximadamente
20 mL de tampón PBS que contiene un 4% en peso de TRITON
X-114. Se añaden unos 35 mL de bolas de
sílice-zirconio de 1 mm de diámetro y se procede a
la homogeneización mecánica con el homogeneizador BEADBEATER, de la
empresa Biospec.
El proceso de homogeneización se continúa hasta
que en la tinción de una muestra con la técnica de
Ziehl-Neelsen se detecten menos de 5 bacilos
enteros después de observar 100 campos a 1000 aumentos.
El producto resultante de la homogeneización se
separa de las bolas de sílice-zirconio por
decantación. Éstas se lavan con la solución tampón PBS conteniendo
un 4% en peso de TRITON X-114, y las aguas de lavado
se reúnen con el producto, obteniéndose un volumen total de unos
80-100 mL.
A continuación, el producto resultante de la
homogeneización más las aguas de lavado se centrifuga a 3.000 rpm
durante 30 minutos en una centrífuga refrigerada a 4ºC, para
eliminar las células no fragmentadas en el sedimento.
Se conserva el sobrenadante.
A continuación, dicho sobrenadante se centrifuga
a 15.100 rpm (equivalente a 27.000 g) durante 60 minutos a 4ºC,
obteniéndose un sedimento blanquecino, que contiene los fragmentos
de pared celular
Se conserva el sedimento, y se elimina el
sobrenadante amarillento.
El sedimento se lava primero con tampón PBS (3 x
3 mL), se redispersa en 3 mL de dicha solución tampón, se enrasa a
20 mL con tampón PBS y se vuelve a centrifugar a 15.100 rpm durante
60 minutos a 4ºC.
Se rechaza el sobrenadante obtenido.
Se repite nuevamente la operación de lavado y
centrifugado, de forma que el sobrenadante obtenido es completamente
transparente y se rechaza.
El sedimento, que contiene los fragmentos de
pared celular, se lava con tampón PBS (3x3 mL) y se redispersa en
12 mL de tampón PBS.
Después del proceso de centrifugación y lavado,
se reúne la dispersión de los fragmentos de pared celular en tampón
PBS en un recipiente y se pasteuriza por tratamiento a 65ºC durante
1 hora.
A continuación se enfría rápidamente la mezcla
en un baño de hielo, y se distribuye la dispersión de fragmentos de
pared celular en criotubos a razón de 1 mL por criotubo.
La dispersión de fragmentos de pared celular
contenida en los criotubos se congela a -70ºC y se somete a un
proceso de liofilización a una temperatura comprendida entre -15 y
-22ºC y a un vacío comprendido entre 0,180 y 0,400 mbar.
Se obtienen entre 1 y 1,5 g de agente
inmunoterápico.
\newpage
Ejemplo
2
Se pesan entre 740 y 770 mg del producto
obtenido en el Ejemplo 1 en un vaso de precipitados al que se le
añaden 20 mL de una dispersión de lecitina de soja calidad
farmacéutica en etanol (1 kg de lecitina en 1 litro de etanol
absoluto), y 7 mL de una disolución de colato sódico de calidad
farmacéutica en agua (200 g de colato sódico en 1 litro de agua
bidestilada).
Se ajusta el pH a un valor comprendido entre 7,7
y 8 con una disolución de HCl 0,997 N.
Se preparan los liposomas mediante
homogeneización con un agitador de alta velocidad.
La dispersión de liposomas así obtenida se
diluye al 10% con agua bidestilada y se ajusta el pH a un valor
comprendido entre 7,1 y 7,3 con una disolución de HCl 0,0997 N.
Se distribuye la dispersión de liposomas en
criotubos a razón de 0,5 mL por tubo y se congela a -80ºC.
Posteriormente se liofiliza y se obtiene el
agente inmunoterápico, objeto de la invención, en forma de
liposomas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
En el modelo de infección se utilizan ratones
hembra de 6 a 8 semanas de edad de los tipos BALB/c, 129/Sv,
C57BL/6 y DBA/2, libres de patógenos específicos.
Una cepa virulenta de Mycobacterium
tuberculosis se cultiva en medio Proskauer-Beck
hasta una fase media logarítmica, y se conserva en alícuotas de 1
mL a -70ºC hasta su utilización.
Los ratones se infectan por aerosol mediante su
ubicación en un aparato Middelbrook de infección por aerosol que
proporciona un inóculo aproximado de 10-50 bacilos
viables en los pulmones.
La concentración bacilar, es decir, el número de
bacilos viables, se determina incubando diluciones seriadas de
homogeneizados de pulmón izquierdo y bazo en agar Middelbrook 7H11.
La homogeneización del pulmón izquierdo y del bazo se llevan a cabo
en presencia de 1 mL de tampón PBS.
Se dividieron los ratones infectados del tipo
BALB/c en tres grupos:
- -
- Tratados solamente con isoniacida a razón de 25 mg/kg y día durante 5 días a la semana durante 6 semanas (Control),
- -
- Tratados con isoniacida a razón de 25 mg/kg y día durante 5 días a la semana durante 6 semanas y además con una dosis intranasal de 180 \mug de agente inmunoterápico liposomado, objeto de la invención, y
- -
- Tratados con isoniacida a razón de 25 mg/kg y día durante 5 días a la semana durante 6 semanas y además con una dosis intraperitoneal 180 \mug de agente inmunoterápico liposomado, objeto de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
El tratamiento con el antibiótico isoniacida se
inició en la semana 9 y se continuó hasta la semana 15.
La dosis del agente inmunoterápico liposomado,
objeto de la invención, se administró en la semana 13.
A la semana 15, los animales fueron sacrificados
y se determinaron las concentraciones bacilares en el pulmón
izquierdo y en el bazo de los mismos.
Las concentraciones bacilares, determinadas
según el método descrito en la introducción al apartado C, fueron
significativamente menores en los pulmones de los animales
vacunados, mientras que en el bazo, los resultados comparados con
el grupo Control, no fueron estadísticamente diferentes.
\newpage
Los resultados, expresados en UFC/mL, se
muestran en la Tabla 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede observar que los ratones tratados por
vía intranasal y por vía intraperitoneal con el agente inmunogénico
liposomado, objeto de la invención, simultáneamente con el
tratamiento con isoniacida, presentan un número de bacilos en los
pulmones considerablemente inferior al de los ratones que solamente
han sido tratados con el antibiótico isoniacida.
Teniendo en cuenta, que el número de bacilos
determinado incluye a los que están en fase activa y a los que
están en fase no activa, el tratamiento con el agente inmunogénico
liposomado permitiría una reducción en el tiempo de tratamiento con
el antibiótico, ya que se reduce considerablemente el número de
bacilos que pueden pasar a una fase activa en el transcurso del
tiempo.
Se dividieron los ratones infectados del tipo
129/Sv en dos grupos:
- -
- Tratados con isoniacida a razón de 25 mg/kg y día durante 5 días a la semana durante cuatro semanas y rifampicina a razón de 10 mg/kg y día durante 5 días a la semana durante cuatro semanas (Control), y
- -
- Tratados además con tres dosis de 180 \mug de agente inmunoterápico liposomado, objeto de la invención, inoculadas subcutáneamente después del tratamiento con rifampicina e isoniacida
\vskip1.000000\baselineskip
El tratamiento con el antibiótico isoniacida se
inició en la semana 9 y se prolongó durante 4 semanas. En la semana
13 se inició el tratamiento con rifampicina, que finalizó en la
semana 17.
En las semanas 17, 19 y 21 se administraron tres
dosis de agente inmunoterápico liposomado, objeto de la
invención.
En la semana 22, los animales fueron
sacrificados y se determinaron las concentraciones bacilares en el
pulmón izquierdo y en el bazo de mismos.
La concentración bacilar fue significativamente
menor en los pulmones de los animales vacunados, en comparación con
el grupo Control, mientras que en el bazo no se encontraron
diferencias significativas entre los ratones del grupo Control y
los que fueron tratados además con el agente inmunoterápico
liposomado.
\newpage
Los resultados, expresados en log_{10} UFC/mL,
se muestran en la Tabla 2:
Se puede observar que los ratones tratados por
vía subcutánea con el agente inmunogénico liposomado, objeto de la
invención, posterior a un tratamiento con los antibióticos
isoniacida y rifampicina, presentan un número de bacilos en los
pulmones considerablemente inferior al de los ratones que solamente
han sido tratados con los antibióticos.
La misma conclusión del apartado I) se puede
aplicar en este caso.
Se dividieron los ratones infectados del tipo
C57BL/6 en dos grupos:
- -
- Tratados solamente con isoniacida a razón de 25 mg/kg y día durante 5 días a la semana durante 8 semanas (Control), y
- -
- Tratados además con tres dosis de 180 \mug de agente inmunoterápico liposomado, objeto de la invención, inoculadas intranasalmente
En la semana 9 se inició el tratamiento con el
antibiótico isoniacida, que se prolongó hasta la semana 17.
Las dosis de agente inmunoterápico liposomado se
administraron en las semanas 13, 15 y 17.
Los ratones se sacrificaron en las semanas 15 y
28 y se determinaron las concentraciones bacilares en el pulmón
izquierdo y en el bazo de mismos.
La concentración bacilar fue significativamente
menor en los pulmones de los animales vacunados, después de la
administración de una o tres dosis (correspondientes a las semanas
15 y 28 respectivamente), en comparación con el grupo Control.
Los resultados obtenidos para los pulmones
después de una dosis de agente inmunoterápico (semana 15) y después
de 3 dosis (semana 28), expresados en log_{10} UFC/mL, se muestran
en la Tabla 3:
Se puede observar que los ratones tratados con
una sola dosis del agente inmunogénico liposomado por vía
intranasal, simultáneamente a un tratamiento con el antibiótico
isoniacida, presentan un número de bacilos en los pulmones
considerablemente inferior al de los ratones que solamente han sido
tratados con el antibiótico.
La misma conclusión del apartado I) se puede
aplicar en este caso.
En el caso del bazo, la concentración bacilar
fue significativamente menor en los animales vacunados después de
la administración de las 3 dosis (correspondiente a la semana 28),
en comparación con el grupo Control.
Los resultados obtenidos para el bazo,
expresados en log_{10} UFC/mL, se muestran en la Tabla 4:
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede observar que los ratones tratados por
vía intranasal con tres dosis del agente inmunogénico liposomado,
objeto de la invención, simultáneamente a un tratamiento con el
antibiótico isoniacida, presentan un número de bacilos en los
pulmones considerablemente inferior al de los ratones que solamente
han sido tratados con el antibiótico.
La misma conclusión del apartado I) se puede
aplicar en este caso.
Se han realizado ensayos con ratones DBA/2, de
acuerdo con un diseño factorial 2^{2}, en las condiciones que se
muestran en la tabla 5:
\vskip1.000000\baselineskip
En el ensayo 1, los ratones infectados se
mantuvieron sin ningún tipo de tratamiento.
En el ensayo 2, los ratones infectados fueron
tratados solamente con el antibiótico isoniacida a razón de 25
mg/kg y día durante 5 días a la semana durante 4 semanas y
rifampicina a razón de 10 mg/kg y día durante 5 días a la semana
durante 4 semanas, a partir de la semana 9 posterior a la
infección.
En el ensayo 3, los ratones infectados fueron
tratados solamente con tres dosis de 180 \mug de agente
inmunoterápico liposomado administradas subcutáneamente en las
semanas 9, 11 y 15 posteriores a la infección.
En el ensayo 4, el tratamiento con el
antibiótico isoniacida se inició en la semana 9 y se prolongó
durante 4 semanas. En la semana 13 se inició el tratamiento con
rifampicina, que finalizó en la semana 17. En las semanas 17, 19 y
21 se administraron tres dosis de agente inmunoterápico liposomado,
objeto de la invención.
\newpage
En la semana 22, todos los animales fueron
sacrificados y se determinaron las concentraciones bacilares en el
pulmón izquierdo. Los resultados obtenidos para el pulmón, se
expresan en log_{10} UFC/mL, se muestran en la Tabla 6:
Se puede observar que el tratamiento combinado
de los antibióticos isoniacida y rifampicina con el agente
inmunoterápico liposomado, objeto de la invención, conduce a una
reducción del número de bacilos considerablemente mayor que el uso
de cualquiera de los dos factores (antibióticos y agente
inmunoterápico liposomado) por sí solos.
Teniendo en cuenta, que el número de bacilos
determinado incluye a los que están en fase activa y a los que
están en fase no activa, el tratamiento combinado del agente
inmunogénico liposomado en asociación con otros fármacos permitiría
una reducción en el tiempo de tratamiento con dichos fármacos, ya
que se reduce considerablemente el número de bacilos que pueden
pasar a una fase activa en el transcurso del tiempo.
Claims (11)
1. Un procedimiento para la obtención de un
agente inmunoterápico que comprende fragmentos de pared celular de
una cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis-complex
(MTB-C), comprendiendo las siguientes etapas:
- -
- cultivar la cepa virulenta MTB-C durante un período de tiempo igual o superior a tres semanas y, posteriormente,
- -
- homogeneizar el cultivo de células en presencia de un tensioactivo no iónico seleccionado del grupo que comprende alquilfenoles etoxilados y ésteres de sorbitán etoxilados.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1
caracterizado porque el período de tiempo de cultivo está
comprendido entre 3 y 4 semanas.
3. Un procedimiento según las reivindicaciones 1
o 2 caracterizado porque el tensioactivo no iónico se
selecciona entre los octilfenoles etoxilados.
4. Un procedimiento según la reivindicación 3
caracterizado porque el tensioactivo no iónico es un
octilfenol etoxilado con 7-8 moles de óxido de
etileno.
5. Un procedimiento según las reivindicaciones 1
a 4 caracterizado porque la homogeneización se efectúa en un
medio tamponado a pH neutro.
6. Un procedimiento según las reivindicaciones 1
a 5 caracterizado porque comprende además las siguientes
etapas:
- -
- separar mediante centrifugación las células no fragmentadas y los componentes solubilizados,
- -
- someter a tratamiento químico o físico la fracción de fragmentos de pared celular para inactivar cualquier célula de cepa virulenta que contenga, y
- -
- desecar el agente inmunoterápico obtenido mediante liofilización.
7. Un agente inmunoterápico que contiene
fragmentos de pared celular de una cepa virulenta de
Mycobacterium tuberculosis-complex (MTB-C)
obtenible mediante un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6.
8. Una composición farmacéutica que comprende el
agente inmunoterápico de la reivindicación 7.
9. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 8 caracterizada porque comprende el agente
inmunoterápico en forma de liposomas.
10. El uso del agente inmunoterápico de la
reivindicación 7 para la preparación de un medicamento para el
tratamiento combinado de la tuberculosis en asociación con otros
fármacos.
11. El uso según la reivindicación 10
caracterizado porque los fármacos son la isoniacida y/o la
rifampicina.
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