WO2002018944A2 - Mittel zur diagnose von tumoren - Google Patents

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    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Definitions

  • the invention relates to an agent for the diagnosis of tumors, in particular malignant tumors of the human and animal body.
  • Malignant tumors comprise a heterogeneous group of different types of tumor with regard to biological behavior (e.g. invasiveness and tendency to metastasis) and histogenetic descent. This heterogeneity is reflected in the different responses to different forms of therapy. In order to choose the appropriate therapy concept, it is therefore essential to classify tumors as precisely as possible with regard to the above-mentioned characteristics and to classify them in this classification. This happens u. a. with the help of so-called Tu mormarker. These are histological tissue changes and molecular cell components, the qualitative and quantitative representation of which gives information about the presence, type and course of malignant diseases.
  • tumor markers include, for example, defined chromosomal aberrations, the ectopic or excessive formation of different hormones and in particular also the ectopic or excessive expression of different proteins.
  • Detection of excessive gene expression at the mRNA level can be done, for example, using quantitative RT-PCR methods or Northem blot
  • RNA samples obtained from tumor material or serum are carried out using RNA samples obtained from tumor material or serum. At the protein level, this takes place e.g. B. by means of immunohistochemical Techniques, immunoprecipitation or western blot methods with the help of antibodies directed against the tumor markers.
  • the immunohistochemical representation of tumor markers in tissue sections taken from tumor material is of particular importance, since in addition to the detection of tumor markers, this method also enables the exact representation of the dimensions of the removed tumor. This representation is important for determining the tumor size as a further indication of the degree of malignancy of the tumor. Above all, however, it serves the postoperative control of the completeness of a tumor extraction, which is crucial for the success of the operation.
  • the genetic instability of malignant tumors represents a major problem in tumor diagnosis.
  • the loss of cell differentiation associated with tumor progression often leads to a complete or partial loss of expression of characteristic tumor markers, so that they are used only weakly or not at all to identify the tumor in corresponding detection methods can be.
  • the invention is therefore based on the object of providing alternative possibilities for tumor diagnosis on the basis of alternative tumor markers with expression patterns which differ from those of known tumor markers.
  • this object is achieved by using DCoH as an alternative tumor marker.
  • the invention accordingly relates to the use of at least one substance which interacts with DCoH for the diagnosis of tumors.
  • the DCoH enzyme is the dimerization cofactor of the HNF-1 homeodomain proteins (HNF-1 ⁇ and HNF-1 ß). Through this mechanism, DCoH is involved in controlling gene expression, see D.B. Mendel et al., Science 254 (1991, 1762). At the same time, the protein is known as pterin-4 ⁇ -carbinolamine dehydratase PCD and is involved in tetrahydrobiopterine regeneration, see B.A. Citron et al., Proc. Natl. Acad. Be. USA 89, 1992, 11891. PCD intervenes in the biosynthesis of L-tyrosine from L-phenylalanine.
  • PCD is involved together with phenylalanine hydroxylase and is involved in the regeneration of (6R) 5,6,7,8-tetrahydrobiopterin.
  • DCoH / PCD is also found in the vertebrate egg, in the pigmented epithelium of the eye, in the skin and in the brain, see E. Pogge v. Strandmann and G.U. Ryffel, Development 121 (1995), 1217; E. Pogge v. Strandmann et al. Int. J. Dev. Biol. 42 (1998), 53.
  • DCoH / PCD has proven to be a more or less universal principle in the development of vertebrates, especially for early development. It has both catalytic and regulatory properties and is present in a larger number of cell types.
  • the invention is based on experimental studies by the inventor, which revealed that, contrary to previous assumptions, the cellular amount of DCoH is not related to the pigment status of cells. Surprisingly however, there is a connection between the degeneration of cells - regardless of the pigmentation status - and the increase in cellular DCoH content. Experiments have shown that malignant melanomas have elevated DCoH protein and mRNA levels compared to the surrounding, non-degenerate tissue and in particular also non-degenerate melanocytes.
  • DCoH is therefore suitable as an alternative tumor marker.
  • the use according to the invention of substances interacting with DCoH in tumor diagnosis expands the repertoire of tumor-specific markers available to the histopathologist.
  • This expansion of the repertoire of special tumor antigens is significant in that only staining with different antibodies allows the origin of the tumor to be determined reliably using an exclusion procedure. This is essential for the diagnosis of whether the examined tumor is a primary tumor or whether the examined tumor is a metastasis of a tumor that comes from another tissue.
  • the use according to the invention has the advantage over the prior art that, with the use of the substances mentioned, it is possible to achieve a homogeneous representation of tumors which cannot be represented at all or only in parts using other markers.
  • the tumor diagnosis includes both the identification and the visual representation of tumors.
  • the interaction between the substance and DCoH relates to all interactions of the substances or parts of the substances with DCoH (protein or mRNA) or parts of DCoH in the intact or processed tissue, intact or processed cells or molecular mixtures suitable for the detection of DCoH.
  • Substances in the sense of the invention are high or low molecular weight compounds, and mixtures containing these compounds. Proteins such as antibodies in the form of polyclonal antisera, monoclonal or recombinant antibodies and peptides or nucleic acids are particularly suitable.
  • the use according to the invention of the substances interacting with DCoH can be based on any suitable method for displaying and detecting DCoH expression. Conventional methods which provide information about the cellular protein or mRNA content of DCoH are particularly suitable for this. However, methods for detecting the enzymatic activity of DCoH can also be used.
  • the use of the substances interacting with DCoH for the diagnosis of malignant melanomas represents a preferred embodiment of the invention, because the DCoH expression is surprisingly greatly increased both in melanotic and in largely dedifferentiated, amelanotic malignant melanomas compared to non-degenerate tissue.
  • the use according to the invention thus enables a homogeneous and complete display of melanomas in tissue sections.
  • melanoma-specific tumor markers are often lost with increasing dedifferentiation, so that, in particular, severely degenerate melanomas cannot be represented or identified only inadequately.
  • the glycoprotein gp100 is specific for premelanosomes and is not or only very weakly expressed in the particularly aggressive amelanotic malignant melanomas. As a result, reliable identification and representation using the frequently used anti-gp100 monoclonal antibody HMB45 is no longer possible.
  • antibodies according to the invention are particularly expedient. In principle, all types of antibodies or mixtures of different antibodies can be used, but the use of monoclonal antibodies is particularly advantageous. The specific purification of the antibodies using conventional techniques is also advantageous for reducing background signals.
  • At least one polyclonal antiserum interacting with DCoH and / or at least one monoclonal antibody interacting with DCoH are used for the diagnosis of melanomas.
  • nucleic acid that interacts with DCoH it is also useful to use at least one nucleic acid that interacts with DCoH for the diagnosis of melanoma.
  • suitable nucleic acids are antisense nucleic acids or antisense oligonucleotides which hybridize with DCoH mRNA or parts thereof. These can be marked and detected using conventional techniques and represent an alternative to the immunohistochemical display of tumor tissue in histological sections.
  • DNA oligonucleotides which are used for the detection of DCoH as PCR primers in the context of RT-PCR reactions, is also suitable or used as probes in RNA blot processes.
  • the invention further relates to agents for diagnosing tumors which contain at least one substance which interacts with DCoH.
  • agents can consist of the substance or substances themselves or can have additional further constituents.
  • Liquid suspensions of the substances in suitably buffered medium are expedient.
  • the constituents are expediently used to stabilize the substances (e.g. Detergents, proteins, protease or nuclease inhibitors etc.) or are otherwise beneficial to the detection method.
  • the agent according to the invention is used for the diagnosis of melanoma, antibodies being particularly suitable as the substance contained in the agent.
  • the agent according to the invention contains at least one nucleic acid interacting with DCoH as substance.
  • Staining methods which in addition to the first antibody interacting with DCoH expediently contain a labeled second antibody in stabilizing buffer.
  • Other types of test kit design tailored to the respective detection method (Western blot, ELISA, etc.) are also within the scope of the invention. The components required for this are generally known to the person skilled in the art.
  • FIG. 1 relates to this.
  • FIG. 1 shows an example of a tissue section through a malignant melanoma that has been prepared differently.
  • differently prepared sections through a primary malignant melanoma / which is embedded in paraffin are shown in four different illustrations.
  • FIG. 1 shows the pedicled nodular-type tumor clearly circular in the middle of the section with many necrotic areas.
  • the section was incubated with an antibody (produced according to Pogge by Strandmann et al. 1995, produced analogously in 1998).
  • the section was treated before the incubation with the antibody by standard methods in a commercially available microwave in ProTaqsIV buffer from BIOCYC Luckenwalde once at 600 watts for 6 minutes, again at 600 watts after cooling, then at 180 watts for 5 minutes.
  • the antibody of this batch was then diluted 1: 400 in PBS pH 7.5 and the section incubated for 32 min.
  • a bridge antibody was used, which allows the detection of the bound primary antibody of the rabbit.
  • the detection of the bridge antibody was carried out by means of alkaline phosphatase bound to secondary antibodies.
  • the color reaction was carried out using the Fast Red Naphtol System using standard methods. The color is red, here gray due to the black and white rendering. Counterstaining was done with hematoxylin.
  • An enzymatic rapid detection method for an increased DCoH concentration in the serum of patients is particularly simple.
  • blood is first drawn from patients with suspected malignant melanoma and the serum is isolated therefrom by standard methods.
  • the serum can be directly processed further or temporarily stored at at least -20 ° C, preferably -70 ° C.
  • DCoH detection is based on an ELISA test (Enzyme Linked Immuno Sensitivity Assay), a conventional protein detection method.
  • ELISA test Enzyme Linked Immuno Sensitivity Assay
  • a so-called "sandwich” ELISA is preferably used. This test is based on two antibodies of monoclonal or polyclonal origin, which detect different epitopes of the DCoH protein.
  • the ELISA plate is coated with monoclonal DCoH antibodies from the mouse (the dilution depends on the respective antibody and can be tested beforehand by the person skilled in the art).
  • the incubation with the serum follows, in which the interaction of the DCoH contained in the serum with the first DCoH-specific antibody located on the plate takes place.
  • the incubation is carried out with the second specific anti-DCoH antibody (for example a rabbit polyclonal serum) and then (again according to customary washing steps) the incubation is carried out with a suitable “Zweif antibody, which is specific to the FC portion of the second anti
  • a suitable “Zweif antibody which is specific to the FC portion of the second anti
  • a - also commercially available - substrate is then placed in a suitable buffer on the ELISA plate and incubated for a defined period of time during which the substrate is reacted.
  • an HRP-coupled goat anti-rabbit second antibody can be used as the second antibody (available, for example, from Pharmacia or Santa Cruz Technologies).
  • the generated signal is measured and quantified using a suitable fluorometer.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Diagnose von Tumoren, insbesondere maligner Tumore des menschlichen und tierischen Körpers unter Verwendung mindestens einer mit DCoH interagierenden Substanz zur in vitro Diagnose.

Description

Mittel zur Diagnose von Tumoren
Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Diagnose von Tumoren, insbesondere maligner Tumore des menschlichen und tierischen Körpers.
Maligne Tumore umfassen eine hinsichtlich des biologischen Verhaltens (z. B. Invasivität und Metastasierungsneigung) und der histogenetischen Abstammung heterogene Gruppe verschiedener Tumorarten. Diese Heterogenität spiegelt sich in dem unterschiedlichen Ansprechen auf verschiedene Therapieformen wider. Zur Wahl des jeweils geeigneten Therapiekonzeptes ist es daher essentiell, Tumore hinsichtlich oben genannter Charakteristika möglichst genau zu klassifizieren und in diese Klassifizierung einzuordnen. Dies erfolgt u. a. mit Hilfe sogenannter Tu mormarker. Dies sind histologische Gewebeveränderungen und molekulare Zellbestandteile, deren qualitative und quantitative Darstellung Aufschluß über das Vorliegen, die Art und den Verlauf bösartiger Erkrankungen geben.
Bekannte Tumormarker umfassen beispielsweise definierte chromosomale Aberrationen, die ektope oder übermässige Bildung verschiedener Hormone und insbesondere auch die ektope oder übermäßige Expressionen verschiedener Proteine.
Die Detektion einer übermäßigen Genexpression auf der mRNA-Ebene kann beispielsweise mittels quantitativer RT-PCR Verfahren oder Northem-Blot-
Techniken mit aus Tumormaterial oder Serum gewonnenen RNA-Proben erfolgen. Auf Protein-Ebene erfolgt dies z. B. mittels immunhistochemischer Techniken, I munpräzipitations- oder Western-Blot Verfahren mit Hilfe von gegen die Tumormarker gerichteten Antikörpern. Dabei kommt der immunohistochemischen Darstellung von Tumormarkern in Gewebeschnitten entnommenen Tumormaterials eine besondere Bedeutung zu, da diese Methode neben der Detektion von Tumormarkern auch die genaue Darstellung der Abmessungen des entnommenen Tumors ermöglicht. Diese Darstellung ist zur Bestimmung der Tumorgröße als weiteres Indiz für den Grad der Malignität des Tumors wichtig. Vor allem dient sie jedoch der postoperativen Kontrolle der Vollständigkeit einer Tumorentnahme, die für den Operationserfolg ausschlaggebend ist.
Die genetische Instabilität maligner Tumore stellt ein großes Problem der Tumordiagnostik dar. Der mit der Tumorprogression einhergehende Verlust der Zeildifferenzierung führt oftmals zu einem vollständigen oder teilweisen Verlust der Expression charakteristischer Tumormarker, so daß diese in entsprechenden Detektionsverfahren nur schwach oder gar nicht zur Identifizierung des Tumors herangezogen werden können. Besonders problematisch ist dabei auch, daß die Zellen eines Tumors trotz ihres klonalen Ursprungs im Laufe der Tumorprogression ihre genetische Homogenität verlieren, was dazu führt, daß bei der postoperativen Kontrolle von Gewebeschnitten nur Teilbereiche des Tumors darstellbar sind. Dies birgt die Gefahr, daß eine unvollständige Tumorentnahme unerkannt bleibt oder die Tumorgröße falsch bestimmt wird.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, alternative Möglichkeiten zur Tumordiagnose auf Basis alternativer Tumormarker mit Expressionsmustern, die sich von denen bekannter Tumormarker unterscheiden, bereitzustellen. Überdies besteht in besonderem Maße ein Bedarf an der Verwendung von Substanzen und Mitteln zur Tumordiagnostik, welche geeignet sind, eine möglichst vollständige, homogene Darstellung entnommener Tumore in histologischen Gewebeschnitten zu erzielen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Nutzung von DCoH als alternativer Tumormarker gelöst. Die Erfindung betrifft demgemäß die Verwendung mindestens einer mit DCoH interagierenden Substanz zur Diagnose von Tumoren.
Das Enzym DCoH ist der Dimerisierungscofaktor der HNF-1 homeodomänen Proteine (HNF-1α und HNF-1 ß). Durch diesen Mechanismus ist DCoH an der Kontrolle der Genexpression beteiligt, siehe D.B. Mendel et al., Science 254 (1991 , 1762). Gleichzeitig ist das Protein als Pterin-4α-carbinolamindehydratase PCD bekannt und an der Tetrahydrobiopterinregenerierung beteiligt, siehe B.A. Citron et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 1992, 11891. PCD greift dabei in die Biosynthese von L-Tyrosin aus L-Phenylalanin ein. In letzterem Cyclus ist PCD zusammen mit Phenylalaninhydroxylase eingebunden und an der Regenerierung von (6R)5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin beteiligt. Unabhängig davon wird DCoH/PCD aber auch im vertebraten Ei, im pigmentierten Epithel des Auges, in der Haut und im Gehirn gefunden, siehe E. Pogge v. Strandmann und G.U. Ryffel, Development 121 (1995), 1217; E. Pogge v. Strandmann et al. Int. J. Dev. Biol. 42 (1998), 53.
Nach ersten Daten über die Reinigung und Klonierung von DCoH von D.B. Mendel et al, Science 254 (1991), 1762 wurde so wohl die Peptidsequenz als auch die dafür codierende Nukleinsäuresequenz von Human-, Maus- und Ratten-DCoH in US-A 5 403 712 und 5 620 887 erstmalig beschrieben. Bezüglich aller relevanter Strukturdaten wird auf diese Veröffentlichungen verwiesen. DCoH/PCD hat sich als mehr oder weniger universelles Prinzip in der Entwicklung von Wirbeltieren, insbesondere auch für die Frühentwicklung erwiesen. Es weist sowohl katalytische wie regulierende Eigenschaften auf und ist in einer größeren Anzahl von Zelltypen präsent. In einigen dieser Zelltypen ist es mit den nuklearen Transkriptionsfaktoren HNF-1α und HNF-1 ß verschwistert, in anderen in den Phenylalaninhydroxylase-Enzymkomplex eingebunden. Das Vorkommen von DCoH/PCD in Zelltypen in Abwesenheit von HNF-1 oder Phenylalaninhydroxylase weist darauf hin, daß das Protein auch mit davon verschiedenen zellulären Partnern zusammenwirkt.
Die Erfindung beruht auf experimentellen Studien der Erfinderin, die ergaben, daß die zelluläre Menge an DCoH entgegen bisheriger Annahmen nicht mit dem Pigmentstatus von Zellen im Zusammenhang stehen. Überraschenderweise besteht dagegen ein Zusammenhang zwischen der Entartung von Zellen - unabhängig vom Pigmentiertenstatus - und dem Anstieg des zellulären DCoH- Gehaltes. So ergaben Experimente, daß maligne Melanome gegenüber dem umgebenden, nicht entarteten Gewebe und insbesondere auch nicht entarteten Melanozyten erhöhte Spiegel an DCoH Protein und mRNA aufweisen.
Überdies ist ein Anstieg des zellulären DCoH-Gehaltes auch in Tumoren zu verzeichnen, welche von Zellen abgeleitet sind, die im Adult DCoH gar nicht oder nur im geringen Maße exprimieren. Dies ist besonders überraschend, da DCoH normalerweise strikt zelltypspezifisch exprimiert wird.
DCoH eignet sich somit als alternativer Tumormarker.
Die erfindungsgemäße Verwendung von mit DCoH interagierenden Substanzen in der Tumordiagnostik erweitert das dem Histopathologen zur Verfügung stehende Repertoire an tumorspezifischen Markern. Diese Erweiterung des Repertoires an speziellen Tumorantigenen ist insofern bedeutsam, als daß nur eine Färbung mit verschiedenen Antikörpern die sichere Bestimmung der Herkunft des Tumors nach einem Ausschlußverfahren erlaubt. Dies ist essentiell für die Diagnose, ob es sich bei dem untersuchten Tumor um einen Primärtumor handelt oder ob der untersuchte Tumor eine Metastase eines Tumors ist, welcher aus einem anderen Gewebe stammt.
Überdies weist die erfindungsgemäße Verwendung gegenüber dem Stand der Technik den Vorteil auf, daß sich mit der Verwendung der genannten Substanzen eine homogene Darstellung von Tumoren erzielen läßt, welche mittels anderer Marker gar nicht oder nur in Teilbereichen darstellbar sind.
Die Tumordiagnose umfaßt dabei sowohl die Identifizierung als auch die bildliche Darstellung von Tumoren. Die Interaktion zwischen Substanz und DCoH betrifft alle zur Detektion von DCoH geeigneten Wechselwirkungen der Substanzen oder Teile der Substanzen mit DCoH (Protein oder mRNA) oder Teilen von DCoH im intakten oder aufgearbeiteten Gewebe, intakten oder aufgearbeiteten Zellen bzw. Molekülgemischen. Substanzen im erfindungsgemäßen Sinne sind hoch- oder niedermolekulare Verbindungen, sowie diese Verbindungen enthaltende Gemische. Dabei sind insbesondere Proteine wie Antikörper in Form polyklonaler Antiseren, monoklonaler oder rekombinanter Antikörper sowie Peptide oder Nukleinsäuren geeignet. Die erfindungsgemäße Verwendung der mit DCoH interagierenden Substanzen kann auf jedem geeigneten Verfahren zur Darstellung und Detektion der DCoH Expression basieren. Herkömmliche Verfahren, die Aufschluß über den zellulären Protein oder mRNA Gehalt von DCoH geben sind dazu besonders geeignet. Anwendbar sind jedoch auch Verfahren zur Detektion der enzymatischen Aktivität von DCoH.
Die Verwendung der mit DCoH interagierenden Substanzen zur Diagnose maligner Melanome stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar, weil die DCoH-Expression überraschenderweise sowohl in melanotischen als auch in weitgehend dedifferenzierten, amelanotischen malignen Melanomen gegenüber nicht entartetem Gewebe stark erhöht ist. Die erfindungsgemäße Verwendung ermöglicht somit eine homogene und vollständige Darstellung von Melanomen in Gewebeschnitten ermöglicht.
Die Expression bekannter melanomspezifischer Tumormarker geht oftmals mit zunehmender Dedifferenzierung verloren, so daß insbesondere stark entartete Melanome nicht oder nur unzureichend darstellbar und identifizierbar sind. Dies trifft beispielsweise für die zwei häufig zur Tumordiagnose herangezogenen Melanommarker gp100 und S100 zu. Das Glykoprotein gp100 ist spezifisch für Prämelanosomen und wird in den besonders aggressiven amelanotischen malignen Melanomen nicht oder nur sehr schwach exprimiert. Als Folge davon ist eine sichere Identifizierung und Darstellung anhand des häufig verwendeten, gegen gp100 gerichteten monoklonalen Antikörpers HMB45 nicht mehr möglich.
Aus diesem Grunde wird zur Identifizierung und bildlichen Darstellung maligner Melanome zusätzlich auf die Verwendung von Antikörper gegen das Protein S100, ein saures Ca-bindendes Protein, zurückgegriffen, da dessen Expression unabhängig vom melanotischen Status erfolgt. Jedoch ermöglicht dieser Marker eine nur unbefriedigende Darstellung maligner Melanome, da dessen immunhistochemische Detektion in Gewebeschnitten entnommener Tumor- Proben oftmals nur die Darstellung von Teilbereichen des Tumors erlaubt. Die erfindungsgemäße Verwendung von mit DCoH interagierenden Substanzen weist daher gegenüber den zur Detektion dieser Marker verwendeten Substanzen den Vorteil auf, daß sich eine homogene und vollständige Darstellung insbesondere maligner Melanome erzielen läßt.
Aufgrund ihrer Eignung für eine Vielzahl analytischer Verfahren, ist die erfindungsgemäße Verwendung von Antikörpern besonders zweckmäßig. Dabei können prinzipiell alle Arten von Antikörpern oder Gemische verschiedener Antikörper verwendet werden, besonders vorteilhaft ist jedoch die Verwendung monoklonaler Antikörper. Auch die spezifische Aufreinigung der Antikörper mit Hilfe herkömmlicher Techniken ist zur Verminderung von Hintergrundsignalen vorteilhaft.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden mindestens ein mit DCoH interagierendes polyklonales Antiserum und/oder mindestens ein mit DCoH interagierender monoklonaler Antikörper zur Diagnose von Melanomen eingesetzt.
Ebenso zweckmäßig ist die Verwendung mindestens einer mit DCoH interagierenden Nukleinsäure zur Diagnose von Melanomen. Als Nukleinsäure kommen beispielsweise Antisense-Nukleinsäuren oder Antisense- Oligonukleotide, welche mit DCoH-mRNA oder Teilen davon hybridisieren in Frage. Diese können mittels herkömmlicher Techniken markiert und detektiert werden und stellen eine Alternative zur immunohistochemischen Darstellung von Tumorgewebe in histologischen Schnitten dar. Geeignet ist auch die Verwendung von DNA-Oligonukleotiden, welche zur Detektion von DCoH als PCR-Primer im Rahmen von RT-PCR-Reaktionen oder als Sonden in RNA-Blot- Verfahren eingesetzt werden.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mittel zur Diagnose von Tumoren, welche mindestens eine mit DCoH interagierende Substanz enthalten. Diese Mittel können aus der oder den Substanzen selbst bestehen oder zusätzliche weitere Bestandteile aufweisen. Zweckmäßig sind flüssige Suspensionen der Substanzen in geeignet gepufferten Medium. Die Bestandteile dienen zweckmäßigerweise zur Stabilisierung der Substanzen dienen (z. B. Detergenzien, Proteine, Protease oder Nukleaseinhibitoren etc.) oder sind in sonstiger Weise dem Detektionsverfahren zuträglich.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Mittel zur Diagnose von Melanomen eingesetzt, wobei sich Antikörper als im Mittel enthaltene Substanz besonders eignen.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Mittel als Substanz mindestens eine mit DCoH interagierende Nukleinsäure.
Besonders zweckmäßig ist die Darbietung der DCoH interagierenden Substanzen bzw. der sie enthaltende Mittel in Form handelsüblicher Kits, welche weiterhin sonstige, zur Detektion von DCoH notwendige Substanzen und/oder
Utensilien aufweisen. So sind in PCR-Kits zweckmäßig, welche neben den mit
DCoH hybridisierenden DNA-Primern Reverse Transkriptase, eine thermostabile
DNA-Polymerase, Desoxynukleotide und die benötigten Reaktionspuffer enthalten. Gleiches gilt für Kits zur Durchführung immunhistochemischer
Färbeverfahren, welche neben dem mit DCoH interagierenden Erstantikörper zweckmäßigerweise einen markierten Zweitantikörper in stabilisierendem Puffer enthalten. Andere Arten der Ausgestaltung von Testkits, abgestimmt auf das jeweilige Nachweisverfahren (Westernblot, ELISA; etc.) liegen ebenso im Bereich der Erfindung. Die dazu notwendigen Komponenten sind dem zuständigen Fachmann allgemein bekannt.
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, deren erstes durch die sich darauf beziehende Figur 1 veranschaulicht wird.
In der Figur 1 ist beispielhaft ein Gewebeschnitt durch ein malignes Melanom dargestellt, der unterschiedlich aufbereitet wurde. In der Figur 1 werden in vier verschiedenen Abbildungen unterschiedlich aufbereitete Schnitte durch ein primäres malignes Melanom gezeigt/welches in Paraffin gebettet ist.
Die linke obere Abbildung der Figur 1 zeigt den gestielten Tumor vom nodulärem Typ deutlich kreisförmig in der Mitte des Schnittes mit vielen nekrotischen Bereichen.
In der rechten oberen Abbildung der Figur 1 wurde der Schnitt mit einem Antikörper (nach Pogge von Strandmann et al. 1995 hergestellt, 1998 analog hergestellt) inkubiert. Der Schnitt wurde vor der Inkubation mit dem Antikörper nach Standardmethoden in einer handelsüblichen Mikrowelle in ProTaqsIV Puffer der Firma BIOCYC Luckenwalde einmal 6 min bei 600 Watt, nach Abkühlen erneut bei 600 Watt bis zum Kochen, dann bei 180 Watt 5 min behandelt. Der Antikörper dieser Charge wurde dann 1:400 in PBS pH 7,5 verdünnt und der Schnitt 32 min inkubiert. In dieser Abbildung wurde ein Brückenantikörper verwendet, der den Nachweis des gebundenen Primärantikörpers des Kaninchens erlaubt. Der Nachweis des Brückenantikörpers erfolgte mittels alkalischer Phosphatase an Zweitantikörper gebunden. Die Farbreaktion erfolgte mit dem Fast Red Naphtol System nach Standardmethoden. Die Färbung ist rot, hier durch die schwarz weiß Wiedergabe grau. Die Gegenfärbung erfolgte mit Hematoxylin.
In der linken unteren Abbildung der Figur 1 wurde der darauffolgende Schnitt nicht mit der DCoH spezifischen Antikörper behandelt, sondern mit handelsüblichen Antikörpern gegen S100.
In der rechten unteren Abbildung der Figur 1 wurde der darauffolgende Schnitt nicht mit der DCoH spezifischen Antikörper behandelt, sondern mit dem handelsüblichen Antikörper HMB 45.
Bei S100 und HMB 45 Färbungen handelt es sich um in der klinischen Diagnostik gebräuchliche Nachweisverfahren. Beispiel 2:
Nachweis und Quantifizierung von DCoH im Patienten-Serum
Besonders einfach ist ein enzymatisches Schnell-Nachweisverfahren einer erhöhten DCoH-Konzentration im Serum von Patienten. Hierzu wird Patienten mit Verdacht auf ein malignes Melanom zunächst Blut entnommen und daraus durch Standardmethoden das Serum isoliert. Das Serum kann direkt weiterverarbeitet oder bei mindestens -20°C, vorzugsweise -70°C zwischengelagert werden.
Die DCoH-Detektion erfolgt in diesem Beispiel auf Basis eines ELISA-Tests (Enzyme Linked Immuno Sensitivity Assay), einem herkömmlichen Protein- Nachweisverfahren. Der besseren Sensitivität halber wird vorzugsweise ein sogenannter "Sandwich"-ELISA eingesetzt. Dieser Test basiert auf zwei Antikörpern monoklonalen oder polyklonalen Ursprungs, die verschiedene Epitope des DCoH-Proteins detektieren.
Im ersten Schritt wird die ELISA-Platte mit monoklonalen DCoH-Antikörpern aus der Maus beschichtet (die Verdünnung ist abhängig von dem jeweiligen Antikörper und kann vom zuständigen Fachmann vorher ausgetestet werden). Nach einem zwischengeschalteten Blockierungsschritt der freien Bindungsstellen der ELISA-Platte (üblicherweise durch BSA oder dergleichen) und Waschschritten folgt die Inkubation mit dem Serum, bei der die Interaktion des im Serum enthaltenen DCoH's mit dem sich auf der Platte befindenden ersten DCoH-spezifischen Antikörper stattfindet. Nach weiteren Waschschritten erfolgt die Inkubation mit dem zweiten spezifischen anti-DCoH Antikörper (beispielsweise einem polyklonalen Serum aus Kaninchen) und anschließend (wiederum nach üblichen Waschschritten) die Inkubation mit einem geeigneten "Zweif-Antikörper, welcher spezifisch mit dem FC-Anteil des zweiten anti- DCoH-Antikörpers reagiert. Wichtig ist bei dieser Technik, daß erster und zweiter spezifischer anti-DCoH Antikörper aus verschiedenen Spezies stammen, um eine Bindung des "Zweif'-Antikörpers nur an den zweiten anti- DCoH Antikörper zu erhalten. Solche Spezies-spezifischen Zweitantikörper sind handelsüblich und an verschiedene Enzyme oder fluoreszierende Stoffe gekoppelt erwerblich (z. B. an Meerrettich-Peroxidase (HRP) oder intestinale Kalbsphosphatase (CIP)). Abhängig von der Art des an dem Zweitantikörper gekoppelten Enzyms wird anschließend ein - ebenfalls handelsübliches - Substrat in geeignetem Puffer auf die ELISA-Platte gegeben und über eine definierte Zeitspanne inkubiert, während der es zur Umsetzung des Substrates kommt. Als Zweitantikörper kann im vorliegenden Fall ein HRP-gekoppelter Ziege-anti-Kaninchen Zweitantikörper eingesetzt werden (erhältlich z. B. über Pharmacia oder Santa Cruz Technologies). Die Messung und Quantifizierung des generierten Signals erfolgt mittels geeigneter Fluorometer.
In gleicher Weise wird mit Serum nicht erkrankter Patienten und gegebenenfalls weiteren Negativ-Proben (BSA, etc..) verfahren. Aus dem Vergleich der absoluten und der relativen Signalstärken der Patienten Serumproben mit den Negativkontrollen kann so einfach die "steady state" Menge des im Serum enthaltenen DCoH-Proteins bestimmt werden. Ohne aufwendige Biopsien und Gewebeentnahmen kann so schnell bestimmt werden, ob ein malignes Melanom vorliegt. Insbesondere im Anschluß an die operative Therapie von äußerlich sichtbaren Melanomen können Tumorpatienten so durch zeitlich wiederholte Blutentnahmen auf mögliche - äußerlich nicht sichtbare - Metastasen hin untersucht werden.
Allgemeine Protokolle zur Durchführung des Sandwich-ELISA-Verfahrens sind dem zuständigen Fachmann bekannt. Die genauen Parameter müssen für jede spezifische Antikörper-Kombination ausgetestet werden, was Standard- Labormethoden entspricht. Geeignete Anleitungen finden sich in den einschlägigen Standard-Labor-Nachschlagewerken.
- Ansprüche -

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung mindestens einer mit DCoH interagierenden Substanz zur in vitro Diagnose von Tumoren.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die
Tumore Melanome sind.
3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz mindestens einen Antikörper enthält.
4. Verwendung mindestens eines mit DCoH-Protein interagierenden polyklonalen und/oder monoklonalen Antikörpers zur in vitro Diagnose von
Melanomen.
5. Verwendung mindestens einer mit DCoH interagierenden Nukleinsäure zur in vitro Diagnose von Melanomen.
6. Mittel zur Diagnose von Tumoren enthaltend mindestens eine mit mit DCoH interagierende Substanz.
7. Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumore Melanome sind.
8. Mittel nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz mindestens einen mit DCoH interagierenden Antikörper enthält.
9. Mittel nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz mindestens eine mit DCoH interagierende Nukleinsäure enthalten.
10. Tumordiagnosekit mit mindestens einem mit DCoH interagierenden polyklonalen und/oder monoklonalen Antikörper.
11. Tumordiagnosekit mit mindestens einer mit DCoH interagierenden
Nukleinsäure.
12. Kit nach Anspruch 10 oder 11 zur Diagnose von Melanomen.
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