DE69633780T3

DE69633780T3 - Verfahren zum assay von troponin i und t und komplexen von troponin i und t und auswahl von antikörpern zur verwendung in immunoassays

Info

Publication number: DE69633780T3
Application number: DE69633780T
Authority: DE
Inventors: F. Kenneth San Diego BUECHLER; H. Paul Encinitas MCPHERSON
Original assignee: Biosite Inc
Current assignee: Alere San Diego Inc
Priority date: 1995-04-18
Filing date: 1996-04-18
Publication date: 2011-05-05
Anticipated expiration: 2016-04-19
Also published as: DE69633780T2; US6939678B1; US6174686B1; ATE281648T1; US6579687B1; DE69633780D1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung betrifft einen Assay zur Bestimmung der Gegenwart oder Menge ungebundener und komplexierter Formen von herz-spezifischem Troponin I und T oder Troponin T oder der Menge von herz-spezifischem Troponin I in einer Blutprobe, wobei die ungebundenen und komplexierten Formen von herz-spezifischem Troponin I und T aus der Gruppe ausgewählt werden, die in Anspruch 1, 2 oder 3 definiert ist.
STAND DER TECHNIK
Herzinfarkt ist eine der Haupttodesursachen in den Vereinigten Staaten. Ungefähr fünf Millionen Menschen mit Brustschmerz werden jedes Jahr in den gesamten Vereinigten Staaten in Krankenhäusern untersucht. Bei weniger als 300 dieser Personen wird jedoch im Anschluss ein Herzinfarkt gefunden. Die genaue und schnelle Diagnose von Herzinfarkt ist wichtig sowohl für den Patienten, der einen Herzinfarkt erleidet, als auch das Gesundheitssystem, das die entstehenden Kosten durch schnelles Identifizieren der Personen minimieren kann, die einer Behandlung bedürfen.
Die Diagnose von Herzinfarkt wird üblicherweise in der Notaufnahme eines Krankenhauses durchgeführt. Eine Person, welche die Symptome eines Herzinfarktes aufweist, wird auf unterschiedliche Weise behandelt, abhängig von der Offensichtlichkeit des Zustandes. Im allgemeinen wird ein Elektrokardiogramm zur Beurteilung des Zustandes des Herzens herangezogen. Jedoch weisen ungefähr 50% der Patienten mit Herzinfarkt ein nicht-diagnostisches Elektrokardiogramm auf. Der Arzt ist dann mit einem Problem der Diagnose und Behandlung des Patienten konfrontiert, bei dem ein Herzinfarkt vermutet wird. Demzufolge ist die Diagnose und die Behandlung bei den Patienten mit einem vermuteten Herzinfarkt schwierig, die nicht-diagnostische Elektrokardiogramme aufweisen.
Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) hat Richtlinien zur Diagnose von Herzinfarkt festgelegt, welche besagen, dass ein Patient zwei der drei nachfolgenden Kriterien aufweisen muss: (1) das Vorhandensein von Brustschmerz oder eine Vorgeschichte einer Herzerkrankung, (2) ein diagnostische Elektrokardiogramm und (3) eine erhöhte Kreatinkinase (CK) oder Kreatinekinase MB-Isoenzym (CKMB). Somit muss sich der Arzt für die 50% Patienten, die mit einem Verdacht auf Herzinfarkt in Krankenhäusern vorgestellt werden, und die ein nicht-diagnostisches Elektrokardiogramm aufweisen, auf die Symptome Brustschmerz und eine erhöhte CK oder CKMB verlassen, um einen Herzinfarkt zu diagnostizieren.
Der Assay von CK oder CKMB wird im allgemeinen in Krankenhauslaboratorien mit Hilfe einer komplizierten Messtechnik durchgeführt. Die Untersuchungen umfassen Enzymassays und Immunassays, welche die Aktivität oder Masse der in den Blutproben vorhandenen CK oder CKMB detektieren.
Während eines Herzinfarktes sterben Herzmuskelzellen ab und setzen ihren Inhalt in den Blutstrom frei. Unter solchen zellulären Komponenten wird auch die CKMB freigesetzt. CKMB wird über einen ansonsten nominalen Wert erhöht und kann diagnostisch für einen Herzinfarkt sein. Die Spezifität von CKMB für die Diagnose eines Herzinfarktes liegt nicht bei 100%, da der Skelettmuskel eine weitere Quelle für CKMB im Körper darstellt. Da die Masse des Skelettmuskels im Körper die Masse des Herzmuskels bei weitem übersteigt, variiert aufgrund des normalen katabolischen Umsatzes der Skelettmuskelzellen die Blutkonzentration von CKMB in gesunden Personen. Im allgemeinen liegt die Konzentration von CKMB, die indikativ für einen Herzinfarkt sein kann, oberhalb von 5–7 ng/ml (Circulation 87, 1542–1550 (1993), Clin. Chem 39, 1725–1728 (1993)). Es wurde berichtet, dass die CKMB Konzentration von Personen, die eine Verletzung des Skelettmuskels aufweisen oder die trainiert haben, auf über 9 nm/ml erhöht ist (Clin. Chem. 38, 2396–2400 (1992)). Das Problem der Spezifität bei Verwendung von CKMB als Marker für Herzinfarkt hat daher die Suche nach weiteren spezifischeren Markern veranlasst, die nur aus dem geschädigten Herzmuskel freigesetzt werden.
Kürzlich wurde gezeigt, das Troponin I und Troponin T spezifischer als CKMB für die Diagnose von Herzinfarkt sind (Circulation 83, 902–912 (1991), Clin. Chem. 40, 1291–1295 (1994)). Obwohl Troponin T einige Nachteile als Marker aufweist, da es in Patienten mit Nierenerkrankung erhöht ist (Clin. Chem. 41, 312–317 (1995)), offenbaren die erfindungsgemäßen Methoden hierin die erfolgreiche Verwendung von Troponin T als diagnostischer Marker. Die Verwendung von Troponin I als diagnostischer Marker für Herzinfarkt scheint ebenfalls viele der klinischen Erfordernisse zu erfüllen (Clin. Chem. 40, 1291–1295 (1994), Clin. Chem. 41, 312–317 (1995)).
Weiterhin offenbart DE 44 05 249 eine stabilisierte wässrige Lösung, die Troponin I oder Troponin T umfasst, für die Verwendung in Immunassays sowie ein Verfahren zu deren Herstellung.
Bodor, G. S. et al. (Clin. Chem. 38, 2203–2214 (1992)) berichten über die Entwicklung eines ”Sandwich” Immunassays zur Messung von kardialem Troponin I in Serum mit Hilfe monoklonaler Antikörper zur Prognose von Herzinfarkt.
EP 0 394 819 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von Herzmuskelnekrosen durch Detektion ausschließlich von kardialem Troponin T.
Schließlich offenbart WO 94/27156 einen Assay zur Detektion oder Quantifizierung von kardialem Troponin I.
Der Troponin-Komplex im Muskel besteht aus Troponin I, C und T. Diese Troponin-Komponenten liegen in verschiedenen gewebespezifischen Isoformen vor. Troponin C liegt in zwei Isoformen vor, eine aus kardialem und langsam zuckendem (”slow-twitch”) Muskel und eine aus schnell zuckendem (”fast-twitch”) Muskel. Troponin I und T werden in verschiedenen Isoformen in langsam zuckendem, schnell zuckendem und kardialem Muskel exprimiert (Biochem. J. 171, 251–259 (1978), J. Biol. Chem. 265, 21247–21253 (1990), Hum. Genet. 88, 101–104 (1991), Circ. Res. 69, 1226–1233 (1991)). Die singulären kardialen Isoformen von Troponin I und T erlauben ihre immunologische Unterscheidung von den anderen Troponinen des Skelettmuskels. Daher wurde die Freisetzung von Troponin I und T aus dem geschädigten Herzmuskel ins Blut mit Fällen von instabiler Angina und Herzinfarkt in Beziehung gebracht. Im Stand der Technik wurden jedoch andere Formen von Troponin I und T im Blut noch nicht angesprochen.
Der Troponin-Komplex im Muskel ist eng an den kontraktilen Apparat gebunden. Annähernd 6% des Troponins T im kardialen Gewebe liegen als ungebundenes Protein im Cytoplasma vor, und man nimmt an, dass dieser Pool an Troponin T aus dem geschädigten Muskel freigesetzt wird (Am. J. Cardiol. 67, 1360–1367 (1991)).
Die Konformationen von Troponin I, T und C verändern sich nach der Bindung, wenn binäre und ternäre Komplexe gebildet werden (Biochemistry 33, 12800–12806 (1994), J. Biol. Chem. 254, 350–355 (1979), Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 16, 535–559 (1987)). Ein Verständnis der konformationalen Änderungen von Troponin I und Troponin T sowie der Heterogenität der Proteine im Blut ist kritisch für die Entwicklung genauer diagnostischer Verfahren zur Messung der Troponin I- und Troponin T-Konzentrationen. Ferner wird berichtet, dass Troponin I im Blut instabil ist (Direction Insert for Troponin I Immunoassay, Sanofi/ERIA Diagnostics Pasteur, Marnes la Coquette, Frankreich). Die Mechanismen, die für die Instabilität verantwortlich sind, wurden bislang nicht aufgeklärt. Die Erfindung spricht diese Probleme an und stellt im Zusammenhang mit dem Assay der Erfindung stabile Troponin I- und T-Zusammensetzungen bereit, welche in den Assays der Erfindung verwendbar sind.
Die Lehren der vorliegenden Erfindung stellen im Zusammenhang mit dem Assay der Erfindung Verfahren zur Selektion von Antikörpern und ihrer Verwendung für Immunassays für Troponin I und Troponin T und Komplexe dieser Proteine bereit. Diese Proteine liegen zusammen mit Troponin C sowohl im Herz- als auch im Skelettmuskel hauptsächlich als ein ternärer Komplex vor. Im Muskel ist der Troponin-Komplex an Tropomyosin gebunden, das wiederum an Actin gebunden ist, welches die dünnen Filamente umfasst. Der Zustand von Troponin I und Troponin T, ob frei oder gebunden als binäre oder ternäre Komplexe, welche aus dem Muskel freigesetzt werden, wurde bislang nicht untersucht.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Offenbart wird ein Assay zur Bestimmung der Gegenwart oder Menge ungebundener und komplexierter Formen von herz-spezifischem Troponin I und T oder Troponin T oder der Menge von herz-spezifischem Troponin I in einer Blutprobe, wobei die ungebundenen und komplexierten herz-spezifischen Formen von Troponin I und T wie in Anspruch 1, 2 oder 3 definiert sind,
wobei der Assay die Durchführung eines Immunassays mit ein oder mehr Antikörpern umfasst, die spezifisch für herz-spezifisches Troponin I und/oder T sind, wobei die Antikörper ausgewählt werden bzw. sind, um an die ungebundenen und komplexierten Formen von herz-spezifischem Troponin I und/oder T zu binden, wobei ein detektierbares Signal des Immunassays die Gegenwart oder Menge des ungebundenen und komplexierten, herz-spezifischen Troponins I und/oder T in der Probe betrifft, wie in Anspruch 1, 2 oder 3 definiert.
In Verbindung mit dem Assay der Erfindung werden Antikörper verwendet, die sensitiv gegenüber der Form von Troponin sind, und Antikörper, die insensitiv gegenüber der Form von Troponin sind. Ein ”Antikörper” bezeichnet: einen monoklonalen Antikörper, einen polyklonalen Antikörper, ein Bindungsfragment eines Antikörpers, einen rekombinanten Antikörper oder ein Rezeptorprotein, das spezifisch an ein Ziel (”target”) bindet. Wie hier verwendet, ist ein insensitiver Antikörper ein Antikörper, der zu einer Assay-Antwort führt, die weniger als innerhalb etwa eines Faktors 2 liegt (i. e 50% des Bezugswertes), und führt vorzugsweise zu einer Assay-Antwort, die innerhalb von etwa 20% für jeder Form von Troponin liegt, gemessen relativ zur Assay-Antwort für die Verwendung dieses Antikörpers in einem Assay für eine Troponin-Form oder eine Gruppe von Troponin-Formen (der Bezugswert). Demzufolge ist ein insensitiver Antikörper einer, der dazu neigt, mehr als eine Form von Troponin zu binden.
Wie hier verwendet, ist ein sensitiver Antikörper in einem Immunassay einer, der zu Assay-Antwort führt, die für eine Form oder eine Gruppe von Formen von Troponin (der Bezugswert) mindestens einen Faktor 2 (i. e. 200% des Bezugswertes) und vorzugsweise einen Faktor 5 größer ist (i. e. 500% des Bezugswertes), verglichen mit der Assay-Antwort für die anderen gemessenen Formen. Demzufolge ist ein sensitiver Antikörper einer, der dazu neigt, nur eine einzelne Form von Troponin zu binden.
Wie hier verwendet, sind die 10 Formen von Troponin:

(1) der ternäre Komplex, der oxidiertes Troponin I, Troponin T und Troponin C umfasst, wobei Troponin I und/oder Troponin T herz-spezifisch sind;
(2) der ternäre Komplex, der reduziertes Troponin I, Troponin T und Troponin C umfasst, wobei Troponin I und/oder Troponin T herz-spezifisch sind;
(3) der binäre Komplex, der oxidiertes Troponin I und Troponin T umfasst, wobei Troponin I und/oder Troponin T herz-spezifisch sind;
(4) der binäre Komplex, der reduziertes Troponin I und Troponin T umfasst, wobei Troponin I und/oder Troponin T herz-spezifisch sind;
(5) der binäre Komplex aus oxidiertem Troponin I und Troponin C, wobei Troponin I herz-spezifisch ist;
(6) der binäre Komplex aus reduziertem Troponin I und Troponin C, wobei Troponin I herz-spezifisch ist;
(7) der binäre Komplex, der Troponin T und Troponin C umfasst, wobei Troponin T herz-spezifisch ist;
(8) ungebundenes, herz-spezifisches, oxidiertes Troponin I;
(9) ungebundenes, herz-spezifisches, reduziertes Troponin I; und
(10) ungebundenes, herz-spezifisches Troponin T.

Ebenfalls offenbart in Verbindung mit dem Assay der Erfindung der Erfindung ist eine stabilisierte Zusammensetzung aus Troponin. Die stabilisierte Zusammensetzung kann eine stabilisierte Zusammensetzung aus Troponin I umfassen, wobei das Troponin I oxidiert ist, das Troponin I ungebunden sein kann oder das Troponin I in einem Komplex vorliegen kann. Die stabilisierte Zusammensetzung kann eine stabilisierte Zusammensetzung des ternären komplexes aus Troponin I, T und C umfassen.
Ebenfalls offenbart in Verbindung mit dem Assay der Erfindung ist ein Verfahren zur Verbesserung der Rückgewinnung von Troponin I oder T von einer Oberfläche, die in einem Immunassay verwendet wird, wobei das Verfahren umfasst: Inkontaktbringen mindestens eines stark basischen Peptids, Proteins oder Polymers mit einem pI-Wert größer als 8 mit der Oberfläche. Das Verfahren kann ferner einen Schritt umfassen, das ungebundene Peptid, Protein oder Polymer von der Membran zu waschen. Melittin kann das verwendete stark basische Peptid sein, Protamin kann das verwendete stark basische Protein sein.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1a stellt die Kinetik der Luftoxidation von Troponin I dar, gemessen mit Hilfe eines Immunassays.
1b stellt die Kinetik der Oxidation von Troponin I mittels Peroxid dar, gemessen mit Hilfe eines Immunassays.
2 stellt die Kinetik der Reduktion von Troponin I mittels Dithiothreitol und der Reoxidation des reduzierten Troponins I mittels Peroxid dar, gemessen mit Hilfe eines Immunassays.
3 stellt den Einfluss von Troponin C auf einen Immunassay von Troponin I in der Gegenwart oder bei Fehlen von Troponin T und von Bindungsinhibitoren dar.
4 stellt die Kinetik der Disruption des humanen kardialen ternären Troponin-Komplexes in der Gegenwart oder bei Fehlen von Bindungsinhibitoren dar, gemessen mit Hilfe eines Immunassays für Troponin I.
Die 5a–5f zeigen den Einfluss von Bindungsinhibitoren auf Troponin I-Immunassays aus Patientenproben mit bestätigtem Herzinfarkt.
VERFAHREN ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Definitionen
Wie hier verwendet, bezeichnet ein ”Antikörper” oder ein ”Rezeptorprotein” einen monoklonalen Antikörper, einen polyklonalen Antikörper, ein Bindungsfragment eines Antikörpers, einen rekombinanten Antikörper oder ein Rezeptorprotein, das spezifisch an ein Ziel (”target”) bindet. Die spezifische Bindung einer Substanz kennzeichnet die Qualität dieser Substanz, dass die Substanz nicht dazu neigt an etwas zu binden, an das es nicht spezifisch bindet. Umgekehrt hat die Substanz eine größere Affinität für etwas, was es spezifisch bindet als für etwas, was es nicht spezifisch bindet.
Wie hier verwendet, ist ein insensitiver Antikörper in einem Immunassay ein Antikörper, der für jede Form von Troponin von Interesse zu einem Wert einer Assay-Antwort führt, welcher derselbe innerhalb eines Faktors von etwa 2 ist, und vorzugsweise derselbe innerhalb von etwa 20% ist, wie die Werte einer Assay-Antwort für die anderen Formen von Interesse. Demzufolge ist ein insensitiver Antikörper einer, der eine Detektion von mehr als einer Form von Troponin in einem Immunassay zeigt.
Wie hier verwendet, ist ein sensitiver Antikörper in einem Immunassay einer, der für eine Form oder eine Gruppe von Formen von Troponin zu einem Wert einer Assay-Antwort führt, der mindestens ein Faktor etwa 2, und vorzugsweise einen Faktor von etwa Faktor 5 größer ist als die Werte einer Assay-Antwort für die andren Formen. Demnach ist ein sensitiver Antikörper einer, der eine präferenzielle Detektion einer Form oder einer Gruppe von Formen von Troponin in einem Immunassay zeigt.
Wie hier verwendet, sind die 10 Formen von Troponin:

Wie hier verwendet, ist eine ”Zone” ein Begriff, der mit der Fähigkeit korreliert, distinkte wahrnehmbare Signale zu identifizieren. Eine Zone kann daher einer geographischen Region entsprechen oder der Fähigkeit entsprechen, distinkte wahrnehmbare Signale getrennt zu identifizieren. Die wahrnehmbaren Signale können verschieden sein durch, aber nicht beschränkt auf, Variationen der folgenden Charakteristika: Wellenlänge der Fluoreszenz oder optischen Absorption oder Reflexion, Halbwertszeit von oder Transitionsenergie zwischen elektronischen Zuständen, Oxidations/Reduktions-Potentiale, colorimetrische Charakteristika oder Signaltyp (zum Beispiel Fluoreszenz vs. Radioaktivität vs. optische Absorption).
Wie hier verwendet, bezeichnet ungebundenes Troponin ein Troponin, das nicht in einem Komplex vorliegt. Ein Troponin-Komplex kann binär oder ternär sein.
Wie hier verwendet, bezeichnet ein ”Label”, ein ”Signalgenerator” oder ”Signal-generierendes Element” eine Einheit, die eine Reihe verschiedener Formen verkörpern kann: Enzyme und ihre daraus resultierenden Wirkungen auf ein Substrat, kolloidale Metallpartikel, Latex- und Silika-Partikel mit einem inkorporierten Farbstoff und Farbstoffpartikel sind Beispiele für Signalgeneratoren. Ein Enzym kann mit einem Substrat reagieren, um ein Produkt zu erzeugen, das wahrnehmbar ist, zum Beispiel durch die Fluoreszenzwellenlänge (etwa ultraviolett, sichtbar, infrarot) oder wahrnehmbar durch einen Effekt auf den pH.
Verfahren
Diese Erfindung ist auf einem Assay für Troponin I und Troponin T sowie Komplexe dieser Proteine in humanem Blut, Serum und Plasma gerichtet. Die Gegenwart von kardialem Troponin I und T im Blut, oberhalb einer nominalen Konzentration, ist diagnostisch für den geschädigten Herzmuskel. Die Lehren dieser Erfindung zeigen, dass Troponin I und T in verschieden Konformationen im Blut vorliegen, welche die selben oder andere sein können als ihre nativen Konformationen im Muskelgewebe. Diese verschiedenen Konformationen der Troponinmoleküle können unterschiedlich mit Antikörpern reagieren.
Die Verhältnisse des monomeren Troponins I und T sowie der binären und ternären Komplexe können mit dem metabolischen Zustand des Herzens zusammenhängen. Auf Grundlage der Reaktivitäten von Antikörpern für Troponin I und T sowie für die gereinigte Komplexe der Troponine können die Konzentrationen von Troponin I und T sowie ihre Komplexe nun in Blutproben von Patienten bestimmt werden, die an Herzinfarkt leiden.
Die Ausführungsformen dieser Erfindung betreffen Konformationen von Troponin I und T sowie ihrer Komplexe im Blut, Serum und Plasma sowie Antikörper, welche diese Konformationen erkennen. Besonders bevorzugt werden Antikörper, welche Troponin I und T, in den folgenden Formen erkennen: (1) Die Konformationen von Troponin I mit intramolekular oxidierten und reduzierten Cysteinen, (2) die binären Komplexe aus Troponin I und T, aus Troponin I und C, aus Tropnin T und C, und (3) der ternäre Komplex aus Troponin I, T und C. In Verbindung mit dem Assay der Erfindung werden Verfahren für die verbesserte Rückgewinnung von Troponin I und T beschrieben.
Der Fokus auf Troponin I und T zur Verwendung als Marker für Herzinfarkt basierte zum Teil auf ihrer molekularen Größe: Da die Proteine relativ klein sind, nimmt man an, dass sie schneller aus geschädigten Zellen entweichen als die größeren Proteine.
Antikörper gegen Troponin-Komplexe und gegen Troponin I und T
Der Begriff ”Antikörper oder Rezeptorproteine” wie hier verwendet bezeichnet monoklonale und polyklonale Antikörper, Bindungsfragmente von Antikörpern und Rezeptorproteine, die spezifisch an ein Ziel binden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind Rezeptorproteine, i. e Antikörper oder Bindungsfragmente, gegen Epitope von Troponin I gerichtet, die insensitiv gegenüber dem Oxidationszustand des Moleküls sind. Die Begriffe ”sensitiv” und ”insensitiv” beziehen sich hier im allgemeinen auf die Fähigkeit eines Antikörpers, bestimmte Formen von freiem Troponin oder von Troponin-Komplexen zu erkennen. Insbesondere unterscheidet ein sensitiver Antikörper, der in einem Immunassay verwendet wird, eine Form oder Formen von Troponin von einer anderen Form, und ein insensitiver Antikörper, der in einem Immunassay verwendet wird, unterscheidet eine Form oder Formen von Troponin nicht von einer anderen. Die Sensitivität oder Insensitivität eines Antikörpers zeigt sich in einem Immunassay. Um zu bestimmen, ob ein Antikörper sensitiv oder insensitiv ist, wird der Antikörper mit jeder Troponin-Form unabhängig getestet, um die Assay-Antwort für den Antikörper für jede Troponin-Form zu erhalten. Im allgemeinen führt ein bevorzugter Antikörper, der insensitiv gegenüber der Troponin-Form ist, zu einer Assay-Antwort, die für jede Form von Troponin die gleiche ist, innerhalb eines Faktors von 2, und vorzugsweise innerhalb von 20%. Ein bevorzugter Antikörper, der sensitiv gegenüber der Troponin-Form ist, führt zu einer Assay-Antwort, die für eine Form oder eine Gruppe von Formen mindestens einen Faktor 2 und vorzugsweise einen Faktor 5 größer ist, verglichen mit der (den) anderen Form (Formen). Zusätzlich können sich die Begriffe ”Troponin I und T” auf die freien, unkomplexierten Troponine oder auf die Troponine in den binären oder ternären Komplexen beziehen. Humanes kardiales Troponin I enthält zwei Cysteine an den Positionen 80 und 97 (FEBS Letters 270, 57–61 (1990)). Im Stand der Technik ist der Oxidationszustand von Troponin I während der Reinigung von Troponin I aus Geweben auf die reduzierte Form unter Verwendung verschiedener Reduktantien einschließlich Mercaptoethanol, Dithiothreitrol und dergleichen gerichtet (Can. J. Biochem. 54, 546–553 (1976), Methods Enzymol. 85, 241–263 (1982)). Nach der Reinigung lehrt der Stand der Technik ferner, Troponin I in der reduzierten Form zu erhalten, um die intermolekulare Disulfid-Bildung zu verhindern (J. Biol. Chem. 258, 2951–2954 (1983)).
Bei der Entwicklung von Immunassays für ein Zielprotein fungiert das gereinigte Zielprotein als ein Standard, mit dem die Sensitivität und Spezifität des Immunassays mit Hilfe der Antikörper beurteilt wird, welche selektiert wurden. Wie hier in Verbindung mit dem Assay der Erfindung offenbart, können die Cysteine in Troponin I schnell intramolekular oxidieren, um die Konfirmation des Proteins zu verändern. Das Ausmaß der Oxidation von Troponin I wurde bislang bzgl. seines Effekts auf den Immunassayprozess nicht angesprochen. Die hier beschriebenen Lehren zeigen, dass eine apparente Instabilität im Troponin I-Molekül mit der Dynamik der intramolekularen Oxidation oder Reduktion des Troponin I-Moleküls in Beziehung steht. Zusätzlich wird die Selektion von Antikörpern für die genaue Quantifizierung von Troponin I im Blut gelehrt.
Gereinigtes reduziertes Troponin I erfährt eine intramolekularen Oxidation der Cysteine, deren Rate nicht von der Troponin I-Konzentration abhängt. Spezielle Sorgfalt sollte bei der Präparation der oxidierten Troponin I-Form erfolgen, insbesondere in Gegenwart verschiedener Thiol-reduzierender Agenzien, da die Möglichkeit der Bildung gemischter Disulfide aus dem Protein und dem reduzierenden Thiol-Reagenz besteht. Die gemischte Disulfid-Form des Proteins kann sich weder als oxidierte noch als reduzierte Form des Moleküls verhalten, insbesondere wenn die im Immunassay verwendeten Antikörper die Region des Proteins binden, welche die Cysteine 80 und 97 umgibt.
Bei Verwendung gereinigter Präparationen von oxidiertem und reduziertem Troponin I wurden differenzielle Effekte in Immunassays bei Verwendung verschiedener, gegen Troponin I gerichteter Antikörper beobachtet. Bei einigen Antikörperpaaren war das reduzierte Troponin I in Immunassays kaum detektierbar, während bei anderen Paaren der Oxidationszustand keinen Effekt auf den Immunassayprozess hatte. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Selektion von Antikörpern gegen das Troponin I-Molekül ohne vorheriges Wissen des Oxidationszustandes von Troponin I zu Antikörpern sowie einem Immunassayprozess führen kann, der falsche Ergebnisse liefert. Diese Schlussfolgerung wird beispielhaft durch Immunassays von Troponin I aus Patienten mit Herzinfarkt veranschaulicht. Das Ausmaß der Oxidation von Troponin I in Patientenproben ist variabel und suggeriert eine mögliche Basis für die apparenten Instabilitäten von Troponin I-Assays im Stand der Technik. Das freie Troponin I ändert seinen Oxidationszustand über die Zeit von der reduzierten zur oxidierten Form (siehe Beispiel 4).
Für den Fall, dass ein Immunassay, der einen insensitiven Antikörper umfasst, verwendet werden soll, um das freie und das komplexierte Troponin zu binden, ist ein bevorzugter Antikörper einer, der insensitiv im Hinblick auf die oxidierten, die freien und die Komplex-Formen ist, da das im Blut zirkulierende Troponin I seinen Oxidationszustand und das Ausmaß der Bindung an andere Troponin Komponenten über die Zeit ändern kann. Falls etwa reduziertes freies Troponin aus dem Herz freigesetzt wird, kann es sich während der Zirkulation im Blut und bis zu dem Zeitpunkt, an dem das Troponin gemessen wird, in die oxidierte Form umwandeln. Ferner können das freie Troponin I und T im Blut aneinander binden sowie an Troponin C, um binäre und ternäre Komplexe zu bilden. Die Folge dieser Umwandlungen in die oxidierte Form von Troponin I oder in Troponin-Komplexe ist, dass bei Auswahl eine Antikörpers für einen Immunassay, welcher sensitiv im Hinblick auf die oxidierten und reduzierten Formen und die komplexierten Formen ist, der Assay einen apparenten Anstieg oder Abfall in der Troponin-Konzentration über die Zeit zeigt, abhängig davon, welche Form (frei, oxidiert oder reduziert oder komplexiert) der Antikörper besser erkennt, eher als eine tatsächliche Veränderung der Troponin-Konzentration. In einem weiteren Beispiel kann die Freisetzung von Troponin-Komplexen aus dem geschädigten Herzmuskel die Bildung freier (unkomplexierter) und binärer Formen von Troponin I und T während der Zirkulation im Blut oder bis zum Zeitpunkt, an dem Troponin gemessen wird, zur Folge haben. Die Variabilität der Assay Ergebnisse von Troponin-Konzentrationen bei Verwendung von Immunassays, die einen oder mehr sensitive Antikörper umfassen, können einen Arzt irreführen zu glauben, dass sich der Zustand eines Patienten verbessert oder verschlechtert.
Für den Fall, dass ein Immunassay, welcher mehr als einen sensitiven Antikörper umfasst, verwendet wird, um das freie und komplexierte Troponin zu messen, soll jeder sensitive Antikörper mit einer Form oder einer Gruppe von Formen von Troponin derart reagieren, dass der Antikörper eine maximale Assay-Antwort für die vorgesehene(n) Form (Formen) zeigt und eine minimale Assay-Antwort für alle anderen Formen. Bevorzugte Antikörper sind diejenigen, für welche die Assay-Antworten für die beabsichtigten Formen in etwa die selben, vorzugsweise innerhalb von 20%, für alle sensitiven Antikörper sind, und die minimalen Assay-Antworten mindestens einen Faktor 2 und vorzugsweise einen Faktor 5 geringer sind als die maximalen Assay-Antworten. Falls zum Beispiel zwei verschiedene Antikörper als Signalantikörper in einem Immunassay verwendet werden, und ein Antikörper im Hinblick auf das oxidierte und reduzierte freie Troponin I (oder das freie Troponin T) insensitiv ist und eine maximale Assay-Antwort für die freien Formen von Troponin und eine minimale Assay-Antwort für das komplexierte Troponin zeigt, dann sollte der andere Antikörper eine maximale Assay-Antwort für das komplexierte Troponin und eine minimale Assay-Antwort für die freien Troponin I und T-Formen zeigen. Auf diese Weise kann ein genauer Wert für das Gesamt-Troponin bestimmt werden. Ein Fachmann wird erkennen, dass Antikörper mit verschiedenen Affinitäten für die Troponin-Formen (das heißt, sie zeigen verschiedene Assay-Antworten) ebenfalls in Immunassays verwendet werden können, wenn jede Troponin-Form alleine oder in diskreten Zonen gemessen wird, und dass der relative systematische Fehler der Immunassays bei der Kalibrierung des Assays berücksichtigt werden kann. Ferner können sensitive und insensitive Antikörper an Festphasen angeheftet werden, um jede Troponin-Form in diskreten Zonen zu messen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind Antikörper oder Bindungsfragmente, die gegen Epitope von Troponin I oder T gerichtet sind, insensitiv im Hinblick auf freies Troponin I oder T und Troponin-Komplexe. Die Lehren hierin zeigen, dass Antikörper, die sensitiv im Hinblick auf freies Troponin I oder T und Troponinkomlexe sind, Verfahren für die Abschätzung des Ausmaßes der Bindung von Troponin I oder T in Komplexen bereitstellen. Bei Verwendung gereinigter Präparationen von Troponin I, T und C und der gereinigten Troponin-Komplexe werden die Effekte der Troponin I- oder T-Bindung in den Komplexen auf die Erkennung von Troponin durch Antikörperpaare gelehrt und mit dem dynamischen Zustand von Troponin I oder T im Blut in Beziehung gesetzt.
Das Ausmaß der Bindung von Troponin I und T an die Komponenten des Troponin-Komplexes oder an andere Proteine des kontraktilen Apparates einschließlich Tropomyosin und Actin im Blut kann ebenfalls problematisch für Immunassays sein, abhängig vom Ausmaß und der Affinität der Bindung. In ihren nativen Formen existieren die Troponin-Komplexe im Herzmuskel und im langsam und schnell zuckenden Skelettmuskel als ternärer Komplex aus Troponin I, C und T. Troponin I und T aus Skelettmuskel weisen andere Aminosäuresequenzen auf als Troponin I und T aus dem Herzmuskel. Jedoch weist Troponin C aus dem langsam zuckenden Muskel die gleiche Aminosäuresequenz auf als das Protein aus dem Herzmuskel (Nature 271, 31–35 (1978), Arch. Biochem. Biophys. 186, 411–415 (1978), FEBS Lett. 292, 5–8 (1991)). Troponin C aus dem schnell zuckenden Skelettmuskel kann, obwohl nicht identisch mit dem kardialen Troponin C, an das kardiale Troponin I binden (Biochemistry 33, 8464–8471 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 9036–1940 (1993)).
Die Freisetzung von Troponin-Komponenten, das heißt Troponin I, C und T, oder von Komponenten des kontraktilen Apparates, zum Beispiel Tropomyosin und Actin, aus dem Skelettmuskel aufgrund des normalen Umsatzes von Skelettmuskelzellen kann zu einer signifikanten Menge an Troponin und Komponenten des kontraktilen Apparates im Blut führen. Da die Masse des Skelettmuskels viel größer ist als die Masse des Herzmuskels, können die im Blut eines normalen Menschen vorliegenden Troponin-Komponenten hauptsächlich von Skelettmuskel abstammen. Die zirkulierenden Troponin-Komponenten, die hauptsächlich vom Skelettmuskel abstammen, würden kardiales Troponin I und T binden, die während eines Herzinfarktes oder von Ereignissen, die zur Erzeugung eines geschädigten Herzmuskels führen, in das Blut freigesetzt werden. Wenn die Muskelschädigung in einer Person fortschreitet, steigen vermutlich die Troponin-Komponenten im Blut an, die von Herzgewebe abstammen. Demzufolge kann die Konzentration an Troponin-Komponenten (gebunden und frei) im Blut von Personen mit Herzinfarkt differenziell sowohl vom Herz- als auch vom Skelettmuskel abstammen.
Die Form von Troponin, die aus dem Herz in das Blut freigesetzt wird, ob frei oder als binäre oder ternäre Komplexe, kann einen bestimmten Zustand des Herzens anzeigen. Die hier gelehrten Assays sorgen für die Analyse von Freisetzungsmustern, die es dem Arzt ermöglichen können, ein spezifisches Herzversagen zu diagnostizieren, zum Beispiel instabile Angina verglichen mit Herzinfarkt, oder um den Zeitpunkt zu bestimmen, an dem ein Herzinfarkt erfolgt ist.
Die klinische Bedeutung eines Immunassays, der nur das freie Troponin I oder T von einem Patienten mit Herzinfarkt misst, kann sehr signifikant sein. Da die Bindung von Troponin I und T an Troponin-Komponenten im Blut variabel ist, abhängig von den Konzentrationen der Troponin-Komponenten und von der Zeit, die seit der Freisetzung der Troponin-Komponenten aus dem Muskel vergangen ist, muss eine Analyse der gebundenen und der freien Form von Troponin I und T im Blut erwogen werden. Zum Beispiel beträgt die Bindungsaffinität von Troponin I für Toponin C in der Gegenwart von Calcium (das ebenfalls im Blut vorliegt) 1.27 × 10⁸ M¹ (Biochemistry 33, 12729–12734 (1994)). Dies impliziert, falls die Troponin C-Konzentration 100 ng/ml beträgt und die Gesamtkonzentration an Troponin I (gebunden und frei) 8 ng/ml, dass die Konzentration an freiem Troponin I mit 4.6 ng/ml berechnet wird. Falls die Konzentration von Troponin I, die indikativ für einen Herzinfarkt ist, 5 ng/ml oder mehr beträgt, wird ein Assay, der nur die freie Form von Troponin I misst, in diesem Fall 4.6 ng/ml, dem Arzt anzeigen, dass kein Herzinfarkt stattgefunden hat. Im allgemeinen wird in Notaufnahmen von Krankenhäusern, in denen Patienten mit einem vermuteten Herzinfarkt vorgestellt werden, nach einer oder zwei Stunden erneut eine Blutprobe des Patienten entnommen, falls das erste Ergebnis negativ ist. In diesem Beispiel würde der Patient, der eine Gesamtkonzentration an Troponin I von 8 ng/ml in der ersten Probe aufweist (die als positiv für einen Herzinfarkt definiert ist), aber nur eine gemessene Konzentration von 4.6 ng/ml (was als negatives Ergebnis definiert werden würde) nicht behandelt werden und würde während der Zeit, bevor eine zweite Probe analysiert würde, weiter einen geschädigten Herzmuskel entwickeln. Die Interpretation der Ergebnisse von Troponin I-Assays würde ebenfalls durch die Troponin T-Bindung an Komponenten des kontraktilen Apparates im Blut leiden. Demzufolge können Immunassays gemäß dem Stand der Technik, die das freie Troponin I und T messen, einen Herzinfarkt nicht korrekt diagnostizieren, wenn die Konzentration von Troponin I bzw. T nahe dem Scheitelpunkt (”decision point”) liegt. In einigen Fällen könnte der Anstieg oder Abfall der Konzentration von Troponin I oder T im Blut eines Patienten über die Zeit, bestimmt durch die Analyse von Blutproben, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen wurden, verwendet werden, um den dynamischen Zustand des Herzens zu diagnostizieren, zum Beispiel um zu bestimmen, ob sich das geschädigte Herz durch die Therapie verbessert oder weiter verschlechtert. In diesen Fällen könnte der Zeitverlauf der Konzentration an freiem Troponin I oder T anders sein als der der Konzentration von Gesamt-Troponin (gebunden und frei). Ein Fachmann wird erkennen, dass ansteigende Konzentrationen aller Troponin-Komponenten im Blut eine steigende Fraktion von gebundenem Troponin I und T relativ zu freiem Troponin zur Folge hat. Die Konzentration an Gesamt-Troponin (gebunden und frei) kann schneller ansteigen als die Konzentration an freiem Troponin I und T. Ein Assay, der die Gesamt-Konzentration an Troponin (gebundenes und freies Troponin I und T) misst, würde verglichen mit einem Assay, der nur das freie Troponin I oder T misst, genauer in der Beurteilung des Verlaufes einer Herzschädigung sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Antikörper oder Bindungsfragmente gegen den kardialen Troponin-Komplex gerichtet. Im speziellen werden Antikörper gegen herz-spezifische Epitope von Troponin I und T im Troponin-Komplex oder an den Troponin I/T-, I/C- und T/C-Kontaktflächen im Komplex gerichtet. Die Lehren hierin zeigen, dass Antikörper, die gegen Troponin I und T gerichtet sind, das Troponin I oder T des ternären Komplexes nur schwach binden können. Ferner zeigen die Lehren hierin, dass der Troponin-Komplex im Blut von Patienten, vorliegt, die einen Herzinfarkt erlitten haben. Weiterhin werden Methoden beschrieben, die den Fachmann lehren, die Menge des Troponin-Komplexes im Blut relativ zu freien Troponin I und T oder binären Komplexen aus Troponin I und T mit Hilfe von Antikörpern zu bestimmen, die freie Troponin-Moleküle binden.
Das Gleichgewicht zwischen den binären und ternären Troponin-Komplexen und freiem Troponin I und T verändert sich während des Immunassays aufgrund der Bindung von Antikörpern an die Troponin-Komponenten und -Komplexe. Die Veränderung in den Mol-Fraktionen in den verschiedenen Spezies während des Immunassays kann signifikant oder insignifikant sein und stellt eine Funktion der Antikörper-Konzentrationen, der Affinität der Antikörper für die Troponin-Komponenten und -Komplexe, der Assoziationskonstanten für die Troponin-Komponenten und -Komplexe und der Zeit dar, die den Antikörpern zur Bindung an Troponin gegeben wird. Diese Variablen können die wahrgenommenen Konzentrationen von Troponin I und T verändern und zu falschen Schlussfolgerungen über die Troponin-Konzentration führen. Falls zum Beispiel zwei Immunassays verschiedene Antikörperpaare zur Durchführung eines Sandwich-Immunassays verwenden und ihre Antikörper-Konzentrationen und -Affinitäten für Troponin I oder T verschieden sind, und falls ein Teil des Troponins I oder T in der Probe als binäre oder ternäre Komplexe vorliegt, kann man erwarten, dass jeder Immunassay ein unterschiedliches Ergebnis liefert. Falls weiterhin die Blutproben verschiedene Konzentrationen an Troponin C enthalten, wird der Anteil an Troponin I und T, der als binärer Komplex an Troponin C gebunden ist, jeden Immunassay differenziell stören.
Die Lehren der vorliegenden Erfindung zeigen, dass der ternäre Troponin-Komplex stabiler gegenüber Dissoziation ist als die binären Troponin-Komplexe.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind Antikörper oder Bindungsfragmente gegen Epitope gerichtet, die durch proteolytische Degradation der N-terminalen Region von Troponin I nicht verändert werden. Ferner wird berichtet, dass die Konfirmation von Troponin I durch Phosphorylierung/Dephosphorylierung beeinflusst wird (Biophys. J. 63, 986–995 (1992), Biochem. 33, 12729–12734 (1994)). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden Antikörper oder Bindungsfragmente gegen Epitope entweder von Troponin I oder von Troponin I-Komplexen gerichtet, die durch den Phosphorylierungszustand von Troponin I verändert oder nicht verändert werden. Troponin kann mit Hilfe von Verfahren phosphoryliert werden, die in J. Biol. Chem. 252, 851–857 (1977) beschrieben sind. Die phosphorylierten und dephophorylierten Präparationen von Troponin I können als Immunogene zur Generierung von Antikörpern sowie als Antigene für die Selektion von Antikörpern gegen das phosphorylierte und dephosphorylierte Troponin I verwendet werden. Der Troponin-Komplex kann mit Hilfe verschiedener Verfahren in die Proteinkomponenten dissoziiert werden einschließlich hoher Konzentrationen an Harnstoff, niedrigem pH und metall-komplexierender Agenzien, welche divalente Metallkationen binden, insbesondere Calcium und Magnesium (Methods Enzymol. 85, 241–263 (1982)). Diese Behandlungen sind im allgemeinen sehr harsch und erfordern mehrere Stunden. Demzufolge sind diese Bedingungen zur Dissoziation des Troponin-Komplexes für Immunassays nicht praktikabel, da diese innerhalb von Minuten mit Proben von Personen durchgeführt werden müssen, die einen Herzinfarkt erlitten haben können.
Die Generierung und Selektion von Antikörpern in Verbindung mit dem Assay der Erfindung, welche vorzugsweise entweder sensitiv oder insensitiv gegenüber Bindung von Troponin I oder T in binären Komplexen sind, wird erreicht, indem zunächst binäre Troponin I/T-, T/C- und I/C-Komplexe aus gereinigten Komponenten prepariert werden (J. Biol. Chem. 254, 350–355 (1979), J. Biol. Chem. 258, 2534–2542 (1983), J. Biol. Chem. 258, 2951–2954 (1983), Can. J. Biochem. Cell Biol. 63, 212–218 (1985), Biochemistry 33, 12729–12734 (1994), Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 16, 535–559 (1987)). Die Komplexe können, falls notwendig, durch chemisches Cross-linking der Proteine im Komplex mit Hilfe von Verfahren stabilisiert werden, welche Fachleuten bekannt sind. Die Generierung und die Selektion von Antikörpern, die sensitiv oder insensitiv gegenüber der Bindung von Troponin I oder T im ternären Komplex sind, können auf verschiedene Arten erreicht werden. Eine Möglichkeit ist es zum Beispiel, den ternären Komplex zu reinigen (Methods Enzymol. 85, 241–263 (1983)) oder den Komplex mit Hilfe der gereinigten Troponin-Komponenten zu rekonstruieren. Ein Fachmann wird erkennen, dass verschiedene andere Proteine des kontraktilen Apparats, die mit den binären oder ternären Troponin-Komplexen assoziiert sein können, ebenfalls aus gereinigten Komponenten konstruiert werden können, und dass der erhaltene Komplex verwendet werden kann, um Antikörper zu generieren und zu selektieren, wie in der vorliegenden Erfindung gelehrt. Der Komplex kann im Hinblick auf die Dissoziation durch chemisches Cross-linking der Komponenten stabilisiert werden. Die gereinigten Komplexe können im Anschluss zum Beispiel in Mäuse oder Kaninchen injiziert werden, um polyklonale oder monoklonale Antikörper zu generieren. Eine andere Möglichkeit ist es, freies (ungebundenes) Troponin I oder T zu reinigen, und im Anschluss das gereinigte freie Troponin I oder T zum Beispiel in Mäuse oder Kaninchen zu injizieren, um polyklonale oder monoklonale Antikörper zu generieren. Ein Fachmann wird erkennen, dass für die Produktion von Antikörpern zahlreiche Verfahren zur Verfügung stehen, wie zum Beispiel beschrieben in Antibodies. A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1998), Cold Spring Harbor, NY. Ein Fachmann wird ebenfalls anerkennen, dass Bindungsfragmente oder Fab-Fragmente, welche Antikörper nachahmen, ebenfalls ausgehend von der genetischen Information mittels verschiedener Verfahren hergestellt werden können (Antibody Engineering: A Practical Approach (Borrebaeck, C., ed.), 1995, Oxford University Press, Oxford; J. Immunol. 149, 3914–3920 (1992)). Insbesondere wird die Herstellung, das Screening und die Selektion rekombinanter Bindungsfragmente in den Beispielen 22 und 23 beschrieben.
Die generierten Antikörper werden zunächst durch Screening auf Affinität und Spezifität mit den gereinigten binären oder ternären Komplexen und durch Vergleich der Ergebnisse mit der Affinität und Spezifität der Antikörper mit den gereinigten Troponin I- und T-Molekülen bezüglich der gewünschten Eigenschaften selektiert, welche durch das Verfahren des Immunassays definiert werden.
Das Screening-Verfahren kann die Immobilisierung des gereinigten Troponins I oder T oder binärer oder ternärer Komplexe oder Peptide an herz-spezifische Sequenzen der Troponine in getrennten Wells von Mikrotiterplatten beinhalten. Die Lösung, welche einen potentiellen Antikörper oder eine Gruppe von Antikörpern enthält, wird im Anschluss in die entsprechenden Mikrotiterwells gegeben und etwa 30 Minuten bis 2 Stunden inkubiert. Falls ein Antikörper gegen das Protein von Interesse in der Lösung vorhanden ist, wird dieser an das immobilisierte Troponin binden. Beim Screening von Antikörpern zur Bindung an Kontaktflächen binärer oder ternärer Troponin-Komplexe wird zunächst ein Antikörper selektiert, der an den binären oder ternären Komplex bindet, welcher im Mikrotiterwell immobilisiert ist. Dieser Antikörper wird im Anschluss weiter hinsichtlich seiner Fähigkeit gescreent, freie Troponin-Komponenten zu binden; das heißt der potentielle Antikörper gegen die Grenzfläche sollte freies Troponin I, C oder T nicht binden, welches in Mikrotiterwells immobilisiert ist. Zusätzlich sollte ein Antikörper gegen eine Grenzfläche niemals imstande sein, einen Sandwich-Assay mit binären oder ternären Komplexen und einem Antikörper zu bilden, von dem bekannt ist, dass er eine spezifische Troponin-Komponente in dem Komplex in Gegenwart von Bindungsinhibitoren bindet, von denen man weiß, dass sie den Troponin-Komplex zerstören. Falls diese letztere Bedingung zutrifft, sollte der potentielle Grenzflächen-Antikörper im Anschluss ebenfalls nicht imstande sein, einen Sandwich-Assay mit dem Troponin-Komplex und einem Antikörper gegen eine andere Troponin-Komponente als diejenige auszubilden, die im vorangegangenen Screening in Gegenwart von Bindungsinhibitoren verwendet wurde. Falls diese Bedingung ebenfalls zutrifft, wurde ein Grenzflächen-Antikörper für einen binären Komplex selektiert. Ein zusätzlicher Immunassay muss zur Selektion eines Grenzflächen-Antikörpers für einen ternären Komplex durchgeführt werden; das heißt, falls die vorangegangenen beiden Bedingungen zutreffen, sollte der potentielle Grenzflächen-Antikörper im Anschluss ebenfalls nicht imstande sein, einen Sandwich-Assay mit dem Troponin-Komplex und einem Antikörper gegen eine andere Troponin-Komponente als diejenige auszubilden, die in den beiden vorangegangenen Screenings verwendet wurde. Die Mikrotiterwells werden im Anschluss gewaschen, und ein markierter sekundärer Antikörper (zum Beispiel ein Anti-Maus-Antikörper konjugiert an alkalische Phosphatase, falls die erzeugten Antikörper Maus-Antikörper sind) wird zu den Wells gegeben, für etwa 30 Minuten inkubiert und im Anschluss gewaschen. Ein Substrat wird zu den Wells gegeben, und eine Farbreaktion erscheint dort, wo ein Antikörper gegen Troponin vorliegt. Die Antikörper von Interesse werden anschließend hinsichtlich der Affinität und Spezifität gegenüber den herz-spezifischen Molekülen und ihrer Komplementarität in der Ausbildung von Sandwich-Komplexen mit den Antigenen weiter analysiert. Fachleute werden erkennen, dass viele Ansätze zur Produktion von Antikörpern oder Bindungsfragmenten und zum Screening und zur Selektion auf Affinität und Spezifität für die verschiedenen Troponin-Antigene unternommen werden können. Diese Ansätze verändern aber den Schutzumfang der Erfindung nicht.
Assays für Troponin-Komplexe und unkomplexiertes Troponin I und T
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ist auf einen Assay für Troponin I und Troponin T gerichtet, insbesondere Immunassays, wobei die für den Assay ausgewählten Antikörper herz-spezifische Sequenzen des ternären Komplexes, der binären Komplexe und des unkomplexierten (freien) Troponins I oder T binden, um die komplexierten (gebundenen) und freien Fraktionen von Troponin I beziehungsweise T zu messen. Die herzspezifischen Sequenzen von Troponin I und T werden beschrieben in FEBS Lett. 270, 57–61 (1990) and Genomics 21, 311–316 (1994). Ein synthetisches Peptid bestehen aus 14 Aminosäuren, das eine herz-spezifische Sequenz von Troponin I nachahmt, sowie Methoden zur Herstellung von Antikörpern gegen das Peptid werden in der Internationalen Patentanmeldung WO 94/27156 beschrieben.
Der Immunassay kann mit einem Cocktail aus Antikörpern formuliert werden, um alle Troponin-Komplexe und das freie Troponin I und T zu binden. Alternativ kann der Immunassay mit spezifischen Antikörpern formuliert werden, die Epitope von Troponin I und T in den Komplexen erkennen und ebenso das ungebundene Troponin I und T. Zusätzlich kann der Immunassay mit Antikörpern formuliert werden, die Epitope an den Grenzflächen der Proteinkomponenten in den Komplexen erkennen, und mit Antikörpern, die das ungebundene Troponin I und T binden.
Ein bevorzugter Immunassay für Troponin I oder T beinhaltet die Konjugation eines Antikörpers oder eines Cocktails aus Antikörpern mit einem Label oder einem Signalgenerator, um ein Antikörper-Konjugat (Antikörper-Konjugate) zu bilden, die zur Bindung herz-spezifischer Regionen der Troponin-Komplexe von Troponin I oder T und des ungebundenen Troponins I oder T imstande sind. Fachleute werden erkennen, dass ein Signalgenerator verschiedene Formen hat. Enzyme, kolloidale Metallpartikel, Latex- und Silicapartikel mit einem inkorporierten Farbstoff und Farbstoffpartikel sind Beispiele für Signalgeneratoren. Antikörper können in einer Vielzahl von Arten mit Hilfe hetero-bifunktioneller Reagenzien an die Signalgeneratoren konjugiert werden, wie gelehrt im Pierce Catalog and Handbook, Pierce Chemical Co., Rockford, IL und in Uniform Latex Particles von Leigh B. Bangs, Seragen Diagnostics Inc., Indianapolis, IN. Ein anderer Antikörper oder ein Cocktail von Antikörpern wird auf einer Festphase, zum Beispiel einer Membran, wie gelehrt in BioTechniques 4, 272–283 (1986), immobilisiert, und die Membran wird in eine Vorrichtung gegeben, zum Beispiel wie in den U.S. Patenten 4,727,019 und 5,458,852 beschrieben. Der immobilisierte Antikörper ist komplementär zum Antikörper-Konjugat. Der immobilisierte Antikörper und die Konjugat-Antikörper bilden Sandwich-Komplexe mit den Troponin I- oder T-Komplexen und bilden ferner Sandwich-Komplexe mit Troponin I bzw. T. Eine Plasma- oder Serumprobe, von der vermutet wird, dass sie Troponin-Komplexe oder Komponenten des geschädigten Herzmuskels enthält, wird mit dem Antikörper-Konjugat gemischt, um ein Reaktionsgemisch zu bilden, das im Anschluss inkubiert wird. Das Reaktionsgemisch wird dann an die zuvor erwähnte Vorrichtung appliziert. Die Probe fließt durch die Membran, und die Troponin-Komplexe und Komponenten, gebunden an die Antikörper-Konjugate, binden an die immobilisierten Antikörper, und überschüssiges ungebundenes Antikörper-Konjugat wird mit Hilfe von Waschpuffer weggewaschen. Das Signal wird entwickelt und entweder visuell oder mit Hilfe eines Instruments gelesen.
Ein besonders bevorzugter Immunassay für Troponin I beinhaltet die Konjugation von mindestens zwei Antikörpern mit einem Label oder einem Signalgenerator, um ein Antikörper-Konjugat zu bilden. Einer der Konjugat-Antikörper ist zur Bindung der Troponin T-Komponente der ternären Troponin-Komplexe imstande, und der andere Antikörper ist zur Bindung freier und binärer Troponin I-Moleküle in der Lage. Ein anderer Antikörper oder ein Cocktail von Antikörpern wird auf einer Festphase immobilisiert, zum Beispiel einer Membran, und die Membran wird in eine Vorrichtung gegeben, wie oben beschrieben. Der immobilisierte Antikörper ist komplementär zu den Antikörpern des Antikörper-Konjugats, um Sandwich-Komplexe entweder mit Troponin I gebunden in Troponin-Komplexen oder mit dem unkomplizierten Troponin I zu bilden. Eine Plasma- oder Serumprobe, von der vermutet wird, dass sie Troponin-Komplexe oder Komponenten aus dem geschädigten Herzmuskel enthält, wird mit dem Antikörper-Konjugat gemischt, um ein Reaktionsgemisch zu bilden, das im Anschluss inkubiert wird. Das Reaktionsgemisch wird im Anschluss an die zuvor erwähnte Vorrichtung appliziert. Die Probe fließt durch die Membran, und die Troponin-Komplexe und Komponenten, gebunden an die Antikörper-Konjugate, binden an die immobilisierten Antikörper, und überschüssiges ungebundenes Antikörper-Konjugat wird mit einem Waschpuffer entfernt. Das Signal wird entwickelt und entweder visuell oder mit Hilfe eines Instruments gelesen. In diesem Assayverfahren bindet das Antikörper-Konjugat an das Troponin I in ternären Komplexen durch den Troponin T-spezifischen Antikörper und alle freien und binären Troponin I-Moleküle durch den Troponin I-spezifischen Antikörper. Der Fänger-Antikörper oder die Antikörper auf der Festphase binden Antikörper-Konjugate, die an freies Troponin I und an ternäre Troponin I-Komplexe, welche Troponin I enthalten, gebunden sind.
Ein besonders bevorzugter Immunassay für Troponin I (oxidiert und reduziert) beinhaltet die Konjugation von mindestens zwei Antikörpern an ein Label oder einen Signalgenerator, um ein Antikörper-Konjugat zu bilden. Einer der Konjugat-Antikörper ist zur Bindung von oxidiertem Troponin I imstande, und der andere Antikörper ist zur Bindung der reduzierten Troponin I-Moleküle in der Lage. Ein anderer Antikörper oder ein Cocktail von Antikörpern wird auf einer Festphase in bis zu zwei diskreten Zonen immobilisiert, zum Beispiel einer Membran, und die Membran wird in eine Vorrichtung gegeben, wie oben beschrieben. Der immobilisierte Antikörper ist komplementär zu den Antikörpern des Antikörper-Konjugats, um Sandwich-Komplexe entweder mit dem oxidierten Troponin I oder dem reduzierten Troponin I zu bilden. Eine Plasma- oder Serumprobe, von der vermutet wird, dass sie Troponin-Komponenten aus dem geschädigten Herzmuskel enthält, wird mit dem Antikörper-Konjugat gemischt, um ein Reaktionsgemisch zu bilden, das im Anschluss inkubiert wird. Das Reaktionsgemisch wird anschließend an die zuvor erwähnte Vorrichtung appliziert. Die Probe fließt durch die Membran, und das oxidierte und reduzierte Troponin I, gebunden an die Antikörper-Konjugate, bindet an die immobilisierten Antikörper, und überschüssiges ungebundenes Antikörper-Konjugat wird mit einem Waschpuffer weggewaschen. Das Signal wird entwickelt und entweder visuell oder mit Hilfe eines Instruments gelesen. In diesem Assayverfahren binden die Antikörper-Konjugate an oxidiertes Troponin I über einen Antikörper spezifisch für oxidiertes Troponin I und an das reduzierte Troponin I über einen Antikörper spezifisch für reduziertes Troponin I. Der Fänger-Antikörper oder die Antikörper auf der Festphase binden nur Antikörper-Konjugate, die an oxidiertes und reduziertes Troponin I gebunden sind. Dieser Immunassay kann eine Anwendung in der Abschätzung der Zeit nach einem erfolgten Infarkt haben.
Ein weiterer besonders bevorzugter Immunassay für Troponin I beinhaltet die Konjugation eines Antikörpers oder eines Cocktails von Antikörpern mit einem Label oder einem Signalgenerator, um ein Antikörper-Konjugat zu bilden. Das Antikörper-Konjugat bindet entweder Troponin I, das in Troponin-Komplexen gebunden ist, oder das unkomplexierte Troponin I. Immobilisiert auf einer Festphase, zum Beispiel einer Membran, in drei diskreten Zonen werden Antikörper oder Cocktails von Antikörpern, welche den ternären Komplex, die binären Komplexe von Troponin I und das freie Troponin I binden, und die Membran wird in eine Vorrichtung gegeben wie oben beschrieben. Zum Beispiel wird ein Troponin T-Antikörper, der an das Troponin T des ternären Komplexes bindet, in einer diskreten Zone immobilisiert, ein Troponin I-Antikörper, der an die binären Troponin I-Komplexe (Troponin I/C und I/T) bindet, wird in einer anderen diskreten Zone immobilisiert, und ein Troponin I-Antikörper, der nur das unkomplexierte Troponin I bindet, wird in einer weiteren diskreten Zone immobilisiert. Die immobilisierten Antikörper sind komplementär zu den Antikörpern des Antikörper-Konjugats, um Sandwich-Komplexe mit komplexiertem oder unkomplexiertem Troponin I zu bilden, wie für jede diskrete Zone definiert. Alternativ werden auf einer Festphase, zum Beispiel einer Membran, in zwei diskreten Zonen Antikörper oder Cocktails aus Antikörpern immobilisiert, welche die Troponin I-Komplexe (binär und ternär) und das freie Troponin I binden. Zum Beispiel werden ein Troponin T-Antikörper, der das Troponin T des ternären Komplexes bindet, und ein Troponin I-Antikörper, der das Troponin I der binären Komplexe bindet, in einer diskreten Zone immobilisiert, und ein Troponin I-Antikörper, der nur das unkomplexierte Troponin I bindet, wird in der zweiten diskreten Zone immobilisiert. Die immobilisierten Antikörper sind komplementät zu den Antikörpern des Antikörper-Konjugats, um Sandwich-Komplexe mit komplexiertem und unkomplexiertem Troponin I zu bilden, wie für jede diskrete Zone definiert. Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung verwendet Antikörper auf einer Festphase zur Detektion von Troponin I-Komplexen, welche an die Grenzflächen der Bindedomänen von Troponin I/T und I/C. Eine Plasma- oder Serumprobe, von der vermutet wird, dass sie Troponin-Komplexe oder Komponenten aus dem geschädigten Herzmuskel enthält, wird mit dem Antikörper-Konjugat gemischt, um ein Reaktionsgemisch zu bilden, das inkubiert wird. Das Reaktionsgemisch wird im Anschluss an die zuvor erwähnte Vorrichtung appliziert. Die Probe fließt durch die Membran, und die Troponin-Komplexe und Komponenten, gebunden an das Antikörper-Konjugat (die Antikörper-Konjugate), binden an die entsprechenden immobilisierten Antikörper in den diskreten Zonen, und überschüssiges ungebundenes Antikörper-Konjugat wird mit einem Waschpuffer weggewaschen. Das Signal wird entwickelt und entweder visuell oder mit Hilfe eines Instruments gelesen. In diesem Assayverfahren bindet das Antikörper-Konjugat an Troponin I und an die binären und ternären Troponin I-Komplexe über den Troponin I-spezifischen Antikörper oder die Antikörper. Der Fänger-Antikörper oder die Antikörper in diskreten Zonen auf der Festphase binden die Antikörper-Konjugate, die an das unkomplexierte Troponin I oder Troponin-Komplexe, welche Troponin I enthalten, gebunden sind, wie für jede diskrete Zone definiert. Dieser Immunassay erlaubt die Quantifizierung der Fraktionen von Troponin I, nämlich der komplexierten und der nicht-komplexierten Fraktion. Die hier beschriebenen Lehren der Erfindung zeigen, dass unkomplexiertes und komplexiertes Troponin in Plasma- und Serumproben aus Patienten mit bestätigtem Herzinfarkt vorliegen. Die Bestimmung der komplexierten und unkomplexierten Troponin I-Fraktionen kann wichtige klinische Daten betreffend den Typ und das Ausmaß der Muskelschädigung, zum Beispiel bei instabiler Angina oder Herzinfarkt, oder bezüglich des Erfolgs einer Thrombolysetherapie liefern.
Ein weiterer besonders bevorzugter Immunassay misst den kardialen ternären Troponin-Komplex, die kardialen binären Troponin-Komplexe (Troponin I/T, T/C und I/C) und das freie kardiale Troponin I und T. Dieses Verfahren beinhaltet die Konjugation von Antikörpern oder eines Cocktails von Antikörpern an ein Label oder einen Signalgenerator, um ein Antikörper-Konjugat zu bilden. Die Antikörper-Konjugate binden entweder Troponin I und T gebunden in Troponinkomplexen oder das unkomplexierte Troponin T und I. Immobilisiert an einer Festphase, zum Beispiel einer Membran, in einer diskreten Zone werden Antikörper oder Cocktails von Antikörpern, welche den ternären Komplex, die binären Komplexe von Troponin I und T und das freie Troponin I und T binden, und die Membran wird in eine Vorrichtung gegeben wie oben beschrieben. Zum Beispiel werden ein Troponin I-Antikörper, der das Troponin I des ternären Komplexes bindet, bis zu drei verschiedene Antikörper, von denen jeder die Grenzflächen der Bindungsdomänen von Troponin I/T, T/C und I/C erkennt, ein Troponin I-Antikörper, der freies Troponin I bindet, und ein Troponin T-Antikörper, der freies Troponin T bindet, in einer diskreten Zone immobilisiert. Die immobilisierten Antikörper sind komplementär mit den Antikörpern des Antikörper-Konjugats, um Sandwich-Komplexe mit komplexiertem und unkomplexiertem Troponin T und I zu bilden. Eine Plasma- oder Serumprobe, von der vermutet wird, dass sie Troponin-Komplexe oder Komponenten aus dem geschädigten Herzmuskel enthält, wird mit dem Antikörper-Konjugat gemischt, um ein Reaktionsgemisch zu bilden, das im Anschluss inkubiert wird. Das Reaktionsgemisch wird dann an die zuvor erwähnte Vorrichtung appliziert. Die Probe fließt durch die Membran, und die Troponin-Komplexe und Komponenten, gebunden an das Antikörper-Konjugat (die Antikörper-Konjugate), binden an die entsprechenden immobilisierten Antikörper in der diskreten Zone, und überschüssiges ungebundenes Antikörper-Konjugat wird mit einem Waschpuffer weggewaschen. Das Signal wird entwickelt und entweder visuell oder mit Hilfe eines Instruments gelesen. In diesem Assayverfahren binden die Antikörper-Konjugate an freies Troponin I und T, an Troponin I und T der binären Komplexe und Troponin I und T des ternären Komplexes. Die Fänger-Antikörper in der diskreten Zone auf der Festphase binden die Antikörper-Konjugate, die spezifisch für freies Troponin I und T und für die Troponin-Komplexe sind. Dieser Immunassay erlaubt die Quantifizierung des ternären Troponin-Komplexes, der Troponin T/C-, I/T-, I/C-Komplexe und des freien Troponins I und T. Ein Fachmann wird erkennen, dass die Antikörper, die spezifisch für die verschiedenen Troponin-Formen sind, an einen oder mehr Signalgeneratoren konjugiert werden können, um Antikörper-Konjugate zu bilden, und dass die zuvor für die Konjugate beschriebenen Antikörper an eine Festphase in einer diskreten Zone angeheftet werden können. Die Bestimmung der Troponin-Gesamtkonzentration kann zu einem sensitiveren Immunassay hinsichtlich der Schädigung des Herzmuskels führen, der wiederum eine schnellere Diagnose von instabiler Angina oder Herzinfarkt erlaubt, und dadurch eine schnellere Verabreichung einer thrombolytischen Therapie.
Ein besonders bevorzugter Immunassay für Troponin T beinhaltet die Konjugation von mindestens zwei Antikörpern an ein Label oder einen Signalgenerator, um ein Antikörper-Konjugat zu binden. Einer der Konjugat-Antikörper ist zur Bindung der Troponin I-Komponente der Troponin-Komplexe imstande, und der andere Antikörper ist zur Bindung der freien und binären Troponin T-Moleküle in der Lage. Ein anderer Antikörper oder ein Cocktail von Antikörpern wird auf einer Festphase immobilisiert, zum Beispiel einer Membran, und die Membran wird in eine Vorrichtung gegeben wie vorher beschrieben. Der immobilisierte Antikörper ist komplementär zu den Antikörpern des Antikörper-Konjugats, um Sandwich-Komplexe entweder mit Troponin T gebunden in den Troponin-Komplexen oder dem unkomplexierten Troponin T zu bilden. Eine Plasma- oder Serumprobe, von der vermutet wird, dass sie Troponin-Komplexe oder Komponenten aus dem geschädigten Herzmuskel enthält, wird mit dem Antikörper-Konjugat gemischt, um ein Reaktionsgemisch zu bilden, das im Anschluss inkubiert wird. Das Reaktionsgemisch wird dann an die zuvor erwähnte Vorrichtung appliziert. Die Probe fließt durch die Membran, und die Troponin-Komplexe und Komponenten, gebunden an die Antikörper-Konjugate, binden an die immobilisierten Antikörper, und überschüssiges ungebundenes Antikörper-Konjugat wird mit einem Waschpuffer weggewaschen. Das Signal wird entwickelt und entweder visuell oder mit Hilfe eines Instruments gelesen. In diesem Assayformat bindet das Antikörper-Konjugat die Troponin-Komplexe über den Troponin I-spezifischen Antikörper und alle freien und binären Troponin T-Moleküle über den Troponin T-spezifischen Antikörper. Der Fänger-Antikörper oder die Antikörper auf der Festphase binden Antikörper-Konjugate, die an das freie Troponin T und an Troponin-Komplexe, die Troponin T enthalten, gebunden sind.
Ein weiterer besonders bevorzugter Immunassay für Troponin T beinhaltet die Konjugation eines Antikörpers oder eines Cocktails von Antikörpern an ein Label oder einen Signalgenerator, um ein Antikörper-Konjugat zu bilden. Das Antikörper-Konjugat bindet entweder Troponin T gebunden in Troponinkomplexen oder das unkomplexierte Troponin T. Immobilisiert auf einer Festphase, zum Beispiel einer Membran, in drei diskreten Zonen werden Antikörper oder Cocktails von Antikörpern, die den ternären Komplex, die binären Komplexe von Troponin T und das freie Troponin T binden, und die Membran wird an eine Vorrichtung gegeben wie oben beschrieben.
Zum Beispiel wird ein Troponin I-Antikörper, der das Troponin I des ternären Komplexes bindet, in einer diskreten Zone immobilisiert, ein Troponin T-Antikörper, der binäre Troponin T-Komplexe (Troponin I/T und C/T) bindet, wird in einer anderen diskreten Zone immobilisiert, und ein Troponin T-Antikörper, der nur das unkomplexierte Troponin T bindet, wird in einer weiteren diskreten Zone immobilisiert. Die immobilisierten Antikörper sind komplementär zu den Antikörpern des Antikörper-Konjugats, um Sandwich-Komplexe mit dem komplexierten oder unkomplexierten Troponin T zu bilden, wie für jede diskrete Zone definiert. Alternativ sind immobilisiert auf einer Festphase, zum Beispiel einer Membran, in zwei diskreten Zonen Antikörper oder Cocktails von Antikörpern, welche Troponin T-Komplexe (binär und ternär) und das freie Troponin T binden. Zum Beispiel sind ein Troponin I-Antikörper, der das Troponin I des ternären Komplexes bindet, und ein Troponin T-Antikörper, der das Troponin T der binären Komplexe bindet, in einer diskreten Zone immobilisiert, und ein Troponin T-Antikörper, der nur das unkomplexierte Troponin T bindet, ist in der zweiten diskreten Zone immobilisiert. Die immobilisierten Antikörper sind komplementär zu den Antikörpern des Antikörper-Konjugats, um Sandwich-Komplexe mit komplexiertem oder unkomplexiertem Troponin T zu bilden, wie für jede diskrete Zone definiert. Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung verwendet Antikörper auf einer Festphase zur Detektion von Troponin T-Komplexen, die an die Grenzflächen der Bindungsdomänen von Troponin C/T und I/T binden. Eine Plasma- oder Serumprobe, von der vermutet wird, dass sie Troponin-Komplexe oder Komponenten aus dem geschädigten Herzmuskel enthält, wird mit dem Antikörper-Konjugat gemischt, um ein Reaktionsgemisch zu bilden, das im Anschluss inkubiert wird. Das Reaktionsgemisch wird dann an die zuvor erwähnte Vorrichtung appliziert. Die Probe fließt durch die Membran, und die Troponin-Komplexe und Komponenten, gebunden an das Antikörper-Konjugat (die Antikörper-Konjugate), binden an die entsprechenden immobilisierten Antikörper in den diskreten Zonen, und überschüssiges ungebundenes Antikörper-Konjugat wird mit einem Waschpuffer weggewaschen. Das Signal wird entwickelt und entweder visuell oder mit Hilfe eines Instruments gelesen. In diesem Assayverfahren bindet das Antikörper-Konjugat Troponin T und die binären ternären Troponin T-Komplexe über den Troponin T-spezifischen Antikörper oder die Antikörper. Der Fänger-Antikörper oder die Antikörper in den diskreten Zonen auf der Festphase binden die Antikörperkonjugate, die an das unkomplexierte Troponin T oder Troponin-Komplexe, welche Troponin T enthalten, gebunden sind, wie für jede diskrete Zone definiert. Dieser Immunassay erlaubt die Quantifizierung der Fraktionen von Troponin T, nämlich der komplexierten und der unkomplexierten Fraktion. Die hier beschriebenen Lehren der Erfindung zeigen, dass unkomlexiertes und komplexiertes Troponin in Plasma- und Serumproben von Patienten mit bestätigtem Herzinfarkt vorliegen. Die Bestimmung der komplexierten und unkomplexierten Troponin T-Fraktionen kann wichtige klinische Basen betreffend den Typus und das Ausmaß der Muskelschädigung, zum Beispiel bei instabiler Angina oder bei Herzinfarkt, oder bezüglich des Erfolgs einer Thrombolysetherapie liefern.
Ein weiterer besonders bevorzugter Immunassay misst unabhängig den kardialen ternären Troponin-Komplex, die kardialen binären Troponin-Komplexe (Troponin I/T, T/C und I/C) und das freie kardiale Troponin I und T. Dieses Verfahren beinhaltet die Konjugation von Antikörpern oder eines Cocktails von Antikörpern an ein Label oder einen Signalgenerator, um ein Antikörper-Konjugat zu bilden. Die Antikörper-Konjugate binden entweder Troponin T und I gebunden in Troponin-Komplexen oder das unkomplexierte Troponin T und I. Immobilisiert auf einer Festphase, zum Beispiel einer Membran, in sechs diskreten Zonen sind Antikörper oder Cocktails von Antikörpern, die den ternären Komplex, die binären Komplexe von Troponin I und T und freies Troponin I und T binden, und die Membran wird in eine Vorrichtung gegeben wie oben beschrieben. Zum Beispiel ist ein Troponin I-Antikörper, der das Troponin I des ternären Komplexes bindet, in einer ersten diskreten Zone immobilisiert, drei verschiedene Antikörper, von denen jeder Grenzflächen der Bindungsdomänen von Troponin I/T, T/C und I/C erkennt, sind in drei diskreten Zonen immobilisiert, ein Troponin I-Antikörper, der freies Troponin I bindet, ist in einer weiteren Zone immobilisiert, und ein Troponin T-Antikörper, der freies Troponin bindet, ist in einer weiteren Zone immobilisiert. Die immobilisierten Antikörper sind komplementär zu den Antikörpern des Antikörper-Konjugats, um Sandwich-Komplexe mit komplexiertem und unkomplexiertem Troponin T und I zu bilden, wie für jede diskrete Zone definiert. Eine Plasma- oder Serumprobe, von der vermutet wird, dass sie Troponin-Komplexe oder Komponenten aus dem geschädigten Herzmuskel enthält, wird mit dem Antikörper-Konjugat gemischt, um ein Reaktionsgemisch zu bilden, dass im Anschluss inkubiert wird. Das Reaktionsgemisch wird an an die zuvor erwähnte Vorrichtung appliziert. Die Probe fließt durch die Membran, und die Troponin-Komplexe und Komponenten, gebunden an das Antikörperkonjugat (die Antikörperkonjugate), binden an die entsprechenden immobilisierten Antikörper in den diskreten Zonen, und überschüssiges ungebundenes Antikörper-Konjugat wird mit einem Waschpuffer weggewaschen. Das Signal wird entwickelt und entweder visuell oder mit Hilfe eines Instruments gelesen. In diesem Assayverfahren binden die Antikörper-Konjugate freies Troponin I und T, Troponin I und T der binären Komplexe und Troponin I und T des ternären Komplexes. Die Fänger-Antikörper in den diskreten Zonen auf der Festphase binden die Antikörper-Konjugate, die spezifisch für das freie Troponin I und T und für die Troponin-Komplexe sind. Dieser Immunassay erlaubt die Quantifizierung des ternären Troponin-Komlexes, der Troponin T/C-, I/T- und I/C-Komplexe und des freien Troponins I und T. Die hier beschriebenen Lehren der Erfindung zeigen, dass unkomplexiertes und komplexiertes Troponin in Plasma- und Serumproben von Patienten mit bestätigtem Herzinfarkt vorliegen. Die Bestimmungen der individuellen Fraktionen des ternären Troponin-Komplexes, der binären Troponin I- und T-Komplexe und des unkomplexierten Troponins I und T kann wichtige klinische Daten betreffend den Typus und das Ausmaß der Muskelschädigung, zum Beispiel bei instabiler Angina oder Herzinfarkt oder bezüglich des Erfolgs einer Thrombolysetherapie liefern.
Ein weiterer besonders bevorzugter Immunassay misst unabhängig den kardialen ternären Troponin-Komplex, die kardialen binären Troponin-Komplexe (Troponin I/T, T/C, I/C, oxidiertes I/T und oxidiertes I/C) und freies kardiales Troponin I (oxidiert und reduziert) und T. Dieses Verfahren beinhaltet die Konjugation von Antikörpern oder einem Cocktail aus Antikörpern an ein Label oder einen Signalgenerator, um ein Antikörper-Konjugat zu bilden. Die Antikörper-Konjugate binden entweder Troponin T und I gebunden in Troponin-Komplexen oder unkomplexiertes Troponin T und I. Immobilisiert auf einer Festphase, zum Beispiel einer Membran, in bis zu neun diskreten Zonen sind Antikörper oder Cocktails von Antikörpern, die den ternären Komplex, die binären Komplexe aus Troponin I und T und freies Troponin I und T binden, und die Membran wird in eine Vorrichtung gegeben, wie oben beschrieben. Zum Beispiel wird ein Troponin I-Antikörper, der das Troponin I des ternären Komplexes bindet, in einer diskreten Zone immobilisiert, fünf verschiedene Antikörper, von denen jeder die Grenzflächen der Bindungsdomänen von Troponin I/T, T/C, I/C, oxidiertes I/T und oxidiertes I/C erkennt, werden in bis zu fünf diskreten Zonen immobilisiert, ein Troponin I-Antikörper, der freies Troponin I (oxidiert und reduziert) bindet, wird in bis zu zwei Zonen immobilisiert, und ein Troponin T-Antikörper, der das freie Troponin T bindet, wird in einer weiteren Zone immobilisiert. Die immobilisierten Antikörper sind komplementär zu den Antikörpern des Antikörper-Konjugats, um Sandwich-Komplexe mit komplexiertem und unkomplexiertem Troponin T und I zu bilden, wie für jede diskrete Zone definiert. Eine Plasma- oder Serumprobe, von der vermutet wird, dass sie Troponin-Komplexe oder Komponenten aus dem geschädigten Herzmuskel enthält, wird mit dem Antikörper-Konjugat gemischt, um ein Reaktionsgemisch zu bilden, das im Anschluss inkubiert wird. Das Reaktionsgemisch wird dann an die zuvor erwähnte Vorrichtung appliziert. Die Probe fließt durch die Membran, und die Troponin-Komplexe und Komponenten, gebunden an das Antikörper-Konjugat (die Antikörper-Konjugate), binden an die entsprechenden immobilisierten Antikörper in den diskreten Zonen, und überschüssiges ungebundenes Antikörper-Konjugat wird mit einem Waschpuffer weggewaschen. Das Signal wird entwickelt und entweder visuell oder mit Hilfe eines Instruments gelesen. In diesem Assayverfahren binden die Antikörper-Konjugate freies Troponin I und T, Troponin I und T der binären Komplexe und Troponin I und T des ternären Komplexes. Die Fänger-Antikörper in den diskreten Zonen auf der Festphase binden die Antikörper-Konjugate, die spezifisch für freies Troponin I und T und die Troponin-Komplexe sind. Dieser Immunassay erlaubt die Quantifizierung des ternären Troponin-Komplexes, der Troponin T/C, I/T, I/C, oxidiertes I/T und oxidierte I/C-Komplexe und des freien Troponins I (oxidiert und reduziert) und T. Die hier beschriebenen Lehren der Erfindung zeigen, dass unkomplexiertes und komplexiertes Troponin in Plasma- und Serumproben von Patienten mit bestätigtem Herzinfarkt vorliegen. Die Bestimmungen der individuellen Fraktionen des ternären Troponin-Komplexes, der binären Troponin I- und T-Komplexe und des unkomplexierten Troponins I und T können wichtige klinische Daten bezüglich de Typus und des Ausmaßes der Muskelschädigung, zum Beispiel bei instabiler Angina oder bei Herzinfarkt, oder bezüglich des Erfolgs einer Thrombolysetherapie liefern.
Ein besonders bevorzugter Immunassay für Troponin misst die Konzentration von zwei oder mehr Formen von Troponin, zum Beispiel von freiem und komplexiertem Troponin I und/oder T, unter Verwendung von Antikörpern, welche die verschiedenen Formen von Troponin in unterschiedlichem Maß erkennen. Ein Antikörper oder ein Cocktail von Antikörpern wird an ein Label oder einen Signalgenerator konjugiert, um ein Antikörper-Konjugat zu bilden. Das Antikörper-Konjugat ist in der Lage, jede Form von Troponin zu binden, die quantifiziert werden soll. Ein bevorzugter Antikörper für das Konjugat würde ein ”insensitiver” Antikörper sein wie oben definiert. Immobilisiert auf einer Festphase, zum Beispiel einer Membran in einer Vorrichtung, in diskreten Zonen sind Antikörper oder Cocktails von Antikörpern, die komplementär zu dem (den) Antikörper(n) des Antikörper-Konjugats sind. Die essentiellen Charakteristika der immobilisierten Antikörper werden im Hinblick auf ihre Antworten im Assay definiert, und werden daher anschließend diskutiert, nachdem der Assay beschrieben wurde. Die essentiellen Merkmale des Assays können für den Fall diskudiert werden, in dem zwei Formen von Troponin quantifiziert werden. In dem Fall, in dem zwei Formen, die Formen 1 und 2, von Troponin quantifiziert werden, werden zwei diskrete Zonen verwendet. Das System wird unter Verwendung von zwei Sets von Kalibratoren in einer geeigneten Matrix, wie zum Beispiel Blut, Plasma, oder Serum, kalibriert. Vorzugsweise enthält ein Set von Kalibratoren Form 1 von Troponin in verschiedenen Konzentrationen, und das andere enthält Form 2 von. Troponin. Unabhängig wird jeder der Kalibratoren mit dem Antikörper-Konjugat gemischt, um ein Reaktionsgemisch zu erzeugen, das im Anschluss inkubiert wird. Das Reaktionsgemisch wird dann an die zuvor erwähnte Vorrichtung appliziert. Die Probe fließt durch die Membran, und das Troponin, gebunden an das Antikörper-Konjugat (die Antikörper-Konjugate), bindet an die immobilisierten Antikörper in den diskreten Zonen und überschüssiges ungebundenes Antikörper-Konjugat wird mit einem Waschpuffer weggewaschen. Das Signal in beiden Zonen 1 und 2 wird entwickelt und für jeden Kalibrator gemessen. Das einfachste und bevorzugte System würde eines sein, in dem das Assaysignal hinsichtlich der Troponin-Konzentration linear ist oder der Linearität angenähert werden kann. In diesem Fall würde das Kalibrierungsverfahren vier unabhängige Assay-Steigungen liefern, die wie folgt definiert sind:

m11: = Assay-Steigung bestimmt in Zone 1 unter Verwendung von Form 1 von Troponin als Kalibrator (Gleichung 1a)
m12: = Assay-Steigung bestimmt in Zone 1 unter Verwendung von Form 2 von Troponin als Kalibrator (Gleichung 1b)
m21: = Assay-Steigung bestimmt in Zone 2 unter Verwendung von Form 1 von Troponin als Kalibrator (Gleichung 1c)
m22: = Assay-Steigung bestimmt in Zone 2 unter Verwendung von Form 2 von Troponin als Kalibrator (Gleichung 1d)

c1: = Assay-Signal in Zone 1, entsprechend einer Troponin-Konzentration von Null (Gleichung 2a)
c2: = Assay-Signal in Zone 2, entsprechend einer Troponin-Konzentration von Null (Gleichung 2b).

Ein Fachmann wird erkennen, dass die in den Gleichungen 1 und 2 gezeigten Steigungen und Konstanten ebenfalls in einer Kalibrierung bestimmt werden könnten, in der die Kalibratorlösungen aus beiden Formen von Troponin in verschiedenen unterschiedlichen Konzentrationsverhältnissen bestehen. Eine Blut-, Plasma- oder Serumprobe, von der vermutet wird, dass sie die Formen 1 und 2 von Troponin enthält, wird im Anschluss, wie oben für die Kalibratoren beschrieben, untersucht. Der Assay führt zu zwei Signalwerten: S₁ ist das Signal, das in Zone 1 gemessen wird, und S₂ ist das Signal, das in Zone 2 gemessen wird. Die beiden Signale werden durch zwei unabhängige lineare Gleichungen beschrieben: S₁ = m₁₁[Form 1] + m₁₂[Form 2] + c₁ (Gleichung 3a) S₂ = m₂₁[Form 1] + m₂₂[Form 2] + c₂ (Gleichung 3b) wobei [Form 1] und [Form 2] die Konzentrationen von Form 1 bzw. 2 von Troponin in der Probe sind. Die Gleichungen 3 können mit Hilfe von Standardverfahren der linearen Algebra gelöst werden, um die Werte für [Form 1] und [Form 2] in der Probe zu bestimmen, falls: m₁₁m₂₂ – m₁₂m₂₁ ≠ 0 (Gleichung 4) (siehe zum Beispiel, Mathematical Methods for Physicists, Acad. Press, NY, NY). Die Gleichungen 1 und 4 definieren daher die Assay-Antworten, die für die Antikörper in Zone 1 und Zone 2 erforderlich sind, um die Konzentrationen von Form 1 und Form 2 von Troponin aus den gemessenen Signalen S₁ und S₂ zu bestimmen. Im allgemeinen steigt die Genauigkeit der Bestimmung der Konzentrationen von Form 1 und Form 2 mit einem Anstieg der Abweichung, die in Gleichung 4 gezeigt ist. Der Wert für die Abweichung, der zum Erhalt eines zufriedenstellenden Ergebnisses notwendig ist, hängt von der Präzision der Kalibrierung und des Assays sowie der benötigten Genauigkeit für die Troponin-Konzentration ab. Für die meisten Assay-Systeme ist ein bevorzugter Assay einer, bei dem der Antikörper oder Cocktail von Antikörpern in mindestens einer der Zonen dahingehend sensitiv ist, ob das Troponin in Form 1 oder Form 2 vorliegt, wobei ”sensitiv” wie im vorangegangenen Abschnitt definiert ist. Zum Beispiel sollten entweder das Verhältnis m₁₁/m₁₂ oder das Verhältnis m₂₂/m₂₁ oder beide größer als etwa 2 sein. Dieses Verfahren zur Bestimmung der Konzentrationen von zwei Formen von Troponin kann auf mehr als zwei Formen ausgedehnt werden. Falls N Formen gemessen werden sollen, müssen N diskrete Zonen verwendet werden. Eine Kalibration muss unter Verwendung von einem Minimum von N + 1 Kalibratorlösungen durchgeführt werden, welche aus den N Formen von Troponin bestehen. Eine Probe, von der vermutet wird, dass sie die N Formen von Troponin enthält, wird untersucht. Das Assaysignal in jeder der N Zonen wird gemessen; das Signal S₁ von der i-ten Zone kann wie folgt ausgedrückt werden:
wobei m_ij die Assay-Steigung bestimmt in der i-ten Zone unter Verwendung der Form j von Troponin als Kalibrator ist, und wobei [Form j] die Konzentration der Form j von Troponin in der Probe ist. Gleichung 5 definiert ein Set von N linearen Gleichungen, die gelöst werden können, um die Konzentrationen aller N Formen von Troponin mit Hilfe von Standardtechniken zu bestimmen, falls die Determinante der Matrix bestehend aus den m_ij's nicht gleich Null ist. Für die meisten Assay-Systeme ist ein bevorzugter Assay einer, in dem mindestens N – 1 der Zonen einen Antikörper oder einen Cocktail aus Antikörpern enthalten, der sensitiv für die Form ist, in der das Troponin vorliegt, i. e. das Verhältnis m_ii/m_ij größer als etwa 2 ist, wobei i ≠ j ist. Schließlich können diese Konzepte auf den Fall ausgedehnt werden, bei dem die Assay-Antwort nicht linear mit der Troponin-Konzentration ist. In diesem Fall wird das in der i-ten von N-Zonen gemessene Signal durch die Gleichung angegeben:
wobei F_ij eine Funktion von [Form j] ist, welche die Dosis-Antwort (Signal als eine Funktion von [Form j]) von Form j in Zone i beschreibt, und die in einem Kalibrierungsverfahren ähnlich dem oben Beschriebenen bestimmt wird. Gleichung 6 beschreibt ein System von N nicht-linearen Gleichungen, die gelöst werden können, um die Konzentrationen der N-Formen von Troponin zum Beispiel mit Hilfe von Näherungsverfahren (Computer) zu bestimmen, mit denen der Fachmann vertraut ist.
In einer weiteren Ausführungsform des Assays der Erfindung werden Inhibitoren, welche die Affinitätskonstanten der Assoziation der Troponin I-Komplexe oder Troponin T-Komplexe beeinflussen, vor oder bei der Bildung des Reaktionsgemisches zur Probe gegeben, sodass das freie Troponin I beziehungsweise Troponin T gemessen wird. Die Bindungsinhibitoren können die Troponin-Komplexe zerstören oder sie können den Komplex derart öffnen oder partiell aufwinden, dass einige oder alle Interaktionen zwischen den Troponin-Komponenten aufgebrochen werden, sodass die Epitope für die Bindung durch Antikörpern leichter zugänglich werden. Die Inhibitoren können aus der Gruppe von Verbindungen ausgewählt werden, welche umfasst, aber nicht beschränkt ist auf metall-komplexierende Agenzien und Peptide, die mit Troponin I oder Troponin T um die Bindung an Proteine des kontraktilen Apparats kompetitieren. Metall-komplexierende Agenzien, insbesondere diejenigen, welche Calcium und Magnesium binden, vermindern die Affinitätskonstante, zum Beispiel die der Bindung von Troponin I und Troponin C verglichen mit der Affinität in Gegenwart von Calcium um etwa einen Faktor von 10 (Biochemistry 33, 12729–12734 (1994)). Peptide, welche die Bindung von Troponin I und Troponin T an Proteine des kontraktilen Apparats beeinflussen, umfassen Mastoparan, Melittin sowie Peptidsequenzen, welche die Troponin I- und T-Sequenzen an deren Bindungsdomänen mit den Proteinen des kontraktilen Apparats nachahmen (Biochemistry 31, 11326–11334 (1992), J. Biol. Chem. 267, 15715–15723 (1992), Biochemistry 33, 8233–8239 (1994)). Weitere Peptide, die als Inhibitoren zweckmäßig sind, sind diejenigen, welche die Bindungsdomäne der Troponin-Komponenten nachahmen. Die Bindungsdomänen werden zum Beispiel beschrieben in Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 16, 535–559 (1987), und mit der Information über die Bindungsdomäne synthetisiert der Fachmann die Peptide, welche die Peptide der Proteine an den Bindungsdomänen nachahmen.
In einer weiteren Ausführungsform des Assays der Erfindung wird Troponin C vor oder bei Bildung des Reaktionsgemisches des Immunassays zur Probe gegeben, sodass das gesamte oder nahezu das gesamte Troponin I oder T in der Probe während des Verlaufs des Assays von Troponin C gebunden wird. Die Konzentration von Troponin C in der Probe sollte etwa 0.5 μg/ml bis 100 μg/ml und vorzugsweise etwa 1 bis 10 μg/ml betragen.
In einer anderen Ausführungsform des Assays der Erfindung werden Troponin C und T vor oder bei Bildung des Reaktionsgemisches der Immunoassays für Troponin I zu den Proben gegeben, um das gesamte oder nahezu das gesamte Troponin I in der Form des ternären Troponinkomplexes zu binden. Die Konzentrationen von Troponin C und T in der Probe sollten etwa 0.5 bis 100 μg/ml und vorzugsweise etwa 1 bis 10 μg/ml betragen.
In noch einer anderen Ausführungsform des Assays der Erfindung werden Troponin C und I vor oder bei Bildung des Reaktionsgemisches von Immunassays für Troponin T zu den Proben gegeben, um das gesamte oder nahezu das gesamte Troponin T in Form des ternären Troponinkomplexes zu binden. Die Konzentrationen von Troponin C und T in der Probe sollten 0.5 bis 100 μg/ml und vorzugsweise etwa 1 bis 10 μg/ml betragen.
Diese Ausführungsformen, in denen Troponinkomponenten vor oder bei Bildung des Reaktionsgemisches zur Probe gegeben werden, weisen mehrere Vorteile auf.
Erstens adsorbiert Troponin I an Glasflächen und verschiedene Membranen, was zu einer geringeren gemessenen Troponin I-Konzentration führen kann. Troponin T adsorbiert ebenfalls an Oberflächen. Wenn jedoch an Troponin C gebunden oder im ternären Komplex, können die adsorptiven Charakteristika von Troponin I und T dramatisch reduziert sein. Demzufolge kann die Rückgewinnung von Troponin I/C- oder T/C-Komplexen oder des ternären Komplexes besser sein als von Troponin I oder T. In dieser Ausführungsform werden in den Immunassays Antikörper verwendet, die Troponin I- oder T-Komplexe erkennen.
Zweitens ist, falls Antikörper erforderlich sind, die nur das komplexierte Troponin I oder T binden, der Antikörper-Selektionsprozess weniger stringent, da es nicht notwendig ist, dass die Antikörper die gleiche Affinität für das freie Troponin I oder T aufweisen.
Ein Fachmann wird die hier beschriebenen Lehren der Erfindung würdigen und wird mit diesen Lehren erkennen, dass die Zugabe von Reagenzien zu einer Vorrichtung oder zueinander, wie in den Ausführungsformen des Assays der Erfindung angegeben, viele Formen aufweist, und diese Formen im Schutzbereich der Erfindung liegen.
Stabilisation von Troponin I oder T für Kalibratorreagenzien
Es ist bekannt, dass Troponin I und T in wässrigen Formulierungen sowie in Patientenproben instabil sind. Die (apparenten) Instabilitäten der Proteine, wie hierin gelehrt, betreffen den Oxidationszustand von Troponin I, die Neigung von Troponin I und T, Komplexe mit anderen Troponinproteinen zu bilden, und die adsorptiven Charakteristika von Troponin I und T auf Oberflächen.
Die Stabilisierung von Troponin I wird durch die intramolekulare Oxidation der Cysteine durchgeführt, und das Protein wird ohne Thiol-reduzierende Agenzien gelagert, wie beispielsweise Mercaptoethanol, Dithiothreitol und dergleichen.
Die Lagerung von Troponin I in Lösungen, die hohe Konzentrationen an Thiol-Reduktanzien enthalten, erhält die Cysteine insgesamt in der reduzierten Form. Die intramolekulare Oxidation und Reduktion eines Proteins ist jedoch ein dynamischer Prozess, wobei das Protein selbst in Gegenwart der Reduktanzien für einige Zeit in der oxidierten Form vorliegt. Im Falle von Reduktanzien, wie zum Beispiel Mercaptoethanol oder N-Acetylcystein, d. h. reduzierende Moleküle mit nur einer singulären Thiol-Gruppe, bilden sich gemischte Disulfide aus dem Reduktans und dem Protein-Thiol. Die Halbwertszeit dieses gemischten Disulfids ist eine Funktion der Konzentration des Reduktans und der Rate der intramolekularen Oxidation, d. h. das gemischte Disulfid kann sowohl durch das Thiol-Reductans Reagenz als auch das andere Cystein des Proteins reduziert werden, unter der Annahme, dass beide Cysteine nicht in der Form des gemischten Disulfids vorliegen. Im Falle der Reduktion des intramolekular oxidierten Troponins I reduziert das Reduktans mit einer singulären Thiol-Gruppe das intramolekulare Cystein, um ein Cystein und ein gemischtes Disulfid des Proteins zu ergeben. Das gemischte Disulfid des Proteins wird entweder durch das Cystein des Proteins oder das Thiol-Reduktans reduziert. Dieser Prozess setzt sich fort, und eventuell wird die Konzentration des Reduktans auf ein Niveau aufgebraucht, bei dem es das Protein nicht mehr im reduzierten Zustand aufrecht erhalten kann. Sobald die Konzentration des Reduktans die Konzentration von Thiol im Troponin I erreicht, können das Cystein im Protein und das Thiol-Reduktans Reagenz gemischte Disulfide bilden, die durch das Thiol-Reduktans nicht reduziert werden. Alternativ oxidiert das Protein intramolekular, und das Thiol-Reduktans liegt nicht in ausreichender Konzentration vor, um das Cystein zu reduzieren. Das Endergebnis nach Aufbrauchen des Thiol-Reduktans ist ein Gemisch aus Troponin I, das in der intramolekular oxidierten Form vorliegt, und eines Proteins, das in der gemischten Disulfidform vorliegt. Jede dieser Formen von Troponin I weist eine andere Konformation auf.
Im Falle der Verwendung von Thiol-Reductans Reagenzien, die zwei Thiol-Gruppen besitzen, zum Beispiel Dithiothreitol oder Diethioerytritol, ist das Endergebnis nach Aufbrauchen des Thiol-Reduktans nur die oxidierte Form von Troponin I.
Daher erkennen Antikörper, die sensitiv gegenüber dem Oxidationszustand von Troponin sind, die verschiedenen Formen von Troponin I im Immunassay differentiell. Der Immunassay misst anschließend eine ungenaue Konzentration an Troponin I.
Eine bevorzugte Zusammensetzung von stabilisiertem Troponin I, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfasst eine wässrige Lösung des intramolekular oxidierten Troponins I. Eine besonders bevorzugte Zusammensetzung des stabilisierten Troponins I und T umfasst eine gepufferte Lösung des ternären Komplexes aus Troponin I, T und C in Gegenwart oder bei Fehlen von Calcium- und Magnesiumsalzen. Ein bevorzugter pH-Bereich der Lösung liegt zwischen 6 und 9, und ein Bereich der Konzentrationen der Calcium- und Magnesiumsalze, beispielsweise Calcium- und Magnesiumchlorid, liegt zwischen 0.01 mM und 10 mM. Eine besonders bevorzugte gepufferte Lösung besteht aus bis zu etwa 100% humanem Serum oder Plasma. Der ternäre Komplex kann aus den Komponenten Troponin I, T und C gebildet werden oder kann alternativ aus kardialem oder aus Skelettmuskel isoliert und gereinigt werden (Methods Enzymol. 85, 241–263 (1982)).
Verfahren zur Verbesserung der Rückgewinnung von Troponin I in Membranen
Es ist bekannt, das eine Adsorption von Troponin I und T an Oberflächen und an verschiedenen Proteine erfolgt, und dass dieses Phänomen die gemessene Troponin-Konzentration verringern kann. Insbesondere wenn Immunassays in Vorrichtungen oder Instrumenten durchgeführt werden, die einen großen Oberflächenbereich aufweisen, zum Beispiel wenn Membranen oder Latexpartikel in den Assayprozess inkorporiert werden, kann der Oberflächenbereich, der gegenüber der Probe exponiert ist, die Rückgewinnung von Troponin verhindern. Membranen aus Nylon oder Zusammensetzungen aus Glasfasern mit Größen zwischen 2 mm × 2 mm × 1 mm und 40 mm × 40 mm × 5 mm können die Rückgewinnung von Troponin I und T beeinflussen, wenn sie mit dem Assayprozess gekoppelt sind.
Die Troponin I- und T-Moleküle weisen einen hohen Grad an basischen Aminosäuren auf. Bei physiologischem pH sind die basischen Aminosäuren größtenteils positiv geladen, und diese geladenen Gruppen tragen zum Absorptionsverhalten der Proteine bei.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Assays der Erfindung werden verschiedene Komponenten zu Membranen oder Latexpartikeln gegeben, um die Rückgewinnung von Troponin I und T im Immunoassayprozess zu verbessern. Im speziellen werden vor oder bei Zugabe der Probe oder des Reaktionsgemisches Peptide oder Proteine, die ebenfalls stark basisch sind, zu Membranen oder Latexpartikeln oder Oberflächen von Vorrichtungen gegeben, die am Assayprozess beteiligt sind. Bevorzugte Verbindungen für diese Verwendung umfassen Peptide, Proteine und Polymere mit pI-Werten größer als etwa 8. Eingeschlossen in diese Gruppe sind Salmin, Lysozym, Cytochrome, Protamin, Polylysin, Polyvinylamin, Melittin und Mastoparan. Die Konzentrationen der Blockierungsreagenzien, die zu Oberflächen oder Membranen zugegeben werden, reichen von etwa 0.01 mg/ml bis 100 mg/ml und liegen typischerweise bei etwa 0.1 mg/ml bis 10 mg/ml.
EXPERIMENTELLER ABSCHNITT
Beispiel 1
Herstellung von Reagenzien für Troponin ELISA-Immunassays Herstellung von anti-Troponin Antikörper/alkalische Phosphatase-Konjugate.
Alkalische Phosphatase (Calzym, San Luis Obispo, CA) in 50 mM Kaliumphosphat, 10 mM Kaliumborat, 150 mM Natriumchorid, pH 7.0, in einer Konzentration von 10 mg/ml wurde mit SMCC (Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl]-cyclohexan-1-carboxylat, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) in einem molaren Verhältnis SMMC/Enzym von 15:1 derivatisiert. Die Derivatisierung wurde bei Raumtemperatur für 90 min durchgeführt und anschließend auf einer GH-25 Säule (Amicon Corp., Beverly, MA), die in 50 mM Kaliumphosphat, 10 mM Kaliumborat, 150 mM Natriumchlorid, pH 7.0 equilibriert wurde, chromatographisch aufgetrennt.
Die anti-Troponin Antikörper in 50 mM Kaliumphosphat, 10 mM Kaliumborat, 150 mM Natriumchlorid, pH 7.0, in einer Konzentration von 10 mg/ml wurden mit SPDP(N-Succinimidyl-3-[2-pyridyldithio]propionat, Pierce Chemical Co.) in einem molaren Verhältnis SPDP/Antikörper von 10:1 derivatisiert. Der Antikörper wurde auf 2 mg/ml verdünnt und die Dithiothretol und Taurin wurden in einer finalen Konzentration von 1 mM bzw. 20 mM zur Lösung gegeben, und die Lösung wurde anschließend bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert. Der Antikörper-SPDP wurde auf einer GH-25 Säule (Amicon Corp.), die in 50 mM Kaliumphosphat, 10 mM Kaliumborat, 150 mM Natriumchlorid, 0.1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, pH 7.0, equilibriert wurde, chromatographisch aufgetrennt.
Die SNCC-alkalische Phosphatase (in 50 mM Kaliumphosphat, 10 mM Kaliumborat, 150 mM Natriumchlorid, 5 mM Magnesiumchlorid, pH 7.0) und der Thiol-Antikörper (in 50 mM Kaliumphosphat, 10 mM Kaliumborat, 150 mM Kaliumchlorid, 0.1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, pH 7.0), beide verdünnt auf 1 mg/ml wurden in eqimolaren Mengen schnell miteinander gemischt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für drei Stunden inkubiert, und anschließend wurde N-Ethylmaleimid in einer finalen Konzentration von 2 mM zugegeben.
Herstellung von biotinylierten Troponin-Antikörpern
Biotin-XX, Succinimidyl-ester(6-((6-((Biotinoyl)amino)hexanoyl)amino)hexansäure, Succinimidyl-ester, Molecular Probes, Eugene, OR) in einer Konzentration von 40 mM in Dimethylformamid wurde langsam unter Rühren zu einer Antikörperlösung von 2 mg/ml in 50 mM Kaliumborat, 150 mM Natriumchlorid, pH 8.2, (BBS) gegeben, um ein finales molares Verhältnis von Biotin-XX/Antikörper von 20:1 zu erreichen. Die Lösung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, und anschließend wurde die Lösung bei 4°C für mindestens 12 Stunden dialysiert.
Herstellung von Avidin-HS magnetischem Latex
1 ml Estapor paramagnetische Latex-Partikel (0.94 μ, Gangs Laboratories, Carmel, IN, in einer Konzentration von 10% Feststoffen, viermal gewaschen mit deionisiertem Wasser) in Wasser wurde zu 9 ml 0.55 mg/ml Avidin-HS (Scripps Laboratories, San Diego, CA) in 50 ml Tris-Hydrochlorid, 150 mM Natriumchlorid, pH 7.5, gegeben. Die Latexlösung wurde zwei Stunden bei 45°C inkubiert. Der Latex wurde dreimal gewaschen, jedes Mal mit 10 ml BGS, und in 10 ml BBS resuspendiert.
Beispiel 2
Immunassay von humanem cardialen Troponin I und Troponin T
Es werden zwei Immunoassay-Protokolle beschrieben. Sie wurden verwendet, um Troponin I und Troponin T zu detektieren, die in humanen Serum, Plasma oder in Lösungen vorliegen, welche gereinigte Proteine enthalten.
Protokoll A
Die Probe, die Troponin I oder Troponin T enthält, wurde auf 1–10 ng/ml Troponin I oder Troponin T in einem Assaypuffer (nachfolgend als Assaypuffer bezeichnet) verdünnt, der 10 mM 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure, 650 mM Natriumchlorid, 1 mM Magnesiumchlorid, 0.1 mM Zinkchlorid, 1 mg/ml Polyvinylalkohol (10000 m. w.), 10 mg/ml Rinderserumalbumin, 1 mg/ml Natriumazid, pH 7.0, enthält. Zu 25 μl der verdünnten Probe im Well einer Mikrotiterplatte wurden 50 μl Assaypuffer gegeben, der 2.5 μg/ml anti-Troponin I oder -Troponin T-Antikörperkonjugate (Beispiel 1) und 2.5 μg/ml biotinylierten anti-Troponin I oder Troponin T polyklonalen Antikörper (Beispiel 1) enthält, um ein Reaktionsgemisch zu erzeugen. Nach 30 Minuten Inkubation des Reaktionsgemisches bei Raumtemperatur wurden 25 μl Avidin-HS beschichteter magnetischer Latex (Beispiel 1; 0.5% Latex in Assaypuffer) zum Well der Mikrotiterplatte gegeben, gefolgt von einer fünf Minuten Inkubation bei Raumtemperatur. Der magnetische Latex wurde mit Hilfe eines Mikrotiterplatten-Magneten (Perceptive Diagnostics, Cambridge, MA) pelletiert und zweimal in BBS-Tween (20 mM Borat, 150 mM Natriumchlorid, 0.1 mg/ml Natriumazid, 0.02% Polyoxyethylen-20-Sorbitan-Monolaurat (Tween-20), pH 8.2) und einmal in TBS (40 mM Tris, 150 mM Natriumchlorid, pH 7.5) gewaschen. Das Pellet wurde in ELISA-Amplifikationsreagenz (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) gemäß den Anweisungen des Herstellers resuspendiert. Nachdem die Amplifikation vollständig war, wurde der magnetische Latex pelletiert, und 80 μl des gefärbten Überstandes wurden in eine frische Mikrotiterplatte transferiert. Die Absorption bei 490 nm (OD₄₉₀) wurde mit Hilfe eines Mikrotiterplatten-Lesegeräts (Molecular Devices, Palo Alto, CA) gemessen.
Protokoll B
Die Probe, die Troponin oder Troponin T enthält, wurde in Assaypuffer wie in Protokoll A beschrieben verdünnt. Zu 80 μl der verdünnten Probe im Well einer Mikrotiterplatte wurden 40 μl Assaypuffer gegeben, der ebenfalls 30 μg/ml anti-Troponin I oder Troponin T monoklonalen Antikörper und 7.5 μg/ml biotinylierten anti-Troponin I oder Troponin T polyklonalen Antiköper (Beispiel 1) enthält, welcher komplementär zum monoklonalen Antikörper war, um das Reaktionsgemisch zu erzeugen. Aliquots (25 μl) wurden zu verschieden Zeitpunkten (2 Minuten bis 24 Stunden) entnommen und in die Wells einer Mikrotiterplatte gegeben, die 25 μl Avidin-HS beschichteten magnetischen Latex (0.5% Latex-Feststoffe in Assaypuffer) enthielten, gefolgt von einer 5 Minuten Inkubation. Der magnetische Latex wurde pelletiert und einmal in BBS-Tween und einmal in Assaypuffer gewaschen. Das Pellet wurde in 25 μl Assaypuffer resuspendiert, der ferner 5 μg/ml eines Ziege-anti-Maus-Kappa Antikörpers konjugiert an alkalische Phosphortase (Southern BioTechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) enthielt, gefolgt von einer 15 Minuten Inkubation. Der magnetische Latex wurde pelletiert, und der Rest des Assays wurde wie in Porotkoll A angegeben durchgeführt.
Beispiel 3
Selektion von anti-Troponin I Antikörpern, welche die oxidierte, die reduzierte oder sowohl die oxidierte als auch die reduzierte Form von humanem kardialen Troponin I binden
Anti-Troponin I Antikörperkonjugate (Beispiel 1) und komplementäre biotinylierte Troponin I polyklonale Antikörper (Beispiel 1) wurden hinsichtlich der Erkennung intramolekular oxidierten oder reduzierten Troponins I getestet. Die untersuchten anti-Troponin I monoklonalen Antikörper waren: Klon 2D5 und Klon 1Al2 (BiosPacific, Emeryville, CA), Klon 110 und 111 (Research Diagnostics, Inc., Flanders, NJ) und Klon TRI-7 F81 (DAKO Corporation, Carpinteria, CA). Die getesteten biotinylierten anti-Troponin I Antikörper waren affinitätsgereinigte Ziegen-polyklonale Antikörper, die als Peptid 1-, Peptid 2-, Peptid 3- oder Peptid 4-spezifisch gekennzeichnet waren (BiosPacific, Emeryville, CA). Humanes kardiales Troponin I (P. Cummins, University of Birmingham, Birmingham, Großbritannien) wurde in einer Konzentration von 1.0 μg/ml an der Luft oxidiert, wie in Beispiel 4 beschrieben, um das intramolekulare Disulfid zu bilden. Das oxidierte Troponin I wurde auf 1–10 ng/ml in Assaypuffer verdünnt, entweder ohne (oxidierte Probe) oder mit (reduzierte Probe) die Dithiotreitol (DTT) in einer Endkonzentration von 3 mM, gefolgt von einer 3 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur, um die Reduktion des Disulfids durch DTT zu ermöglichen. Die oxidierte und reduzierten Proben wurden ohne weitere Verdünnung gemäß Protokoll A aus Beispiel 2 untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt und ausgedrückt in Form des Verhältnisses der Assay-Steigung für oxidiertes Troponin I (TnI) geteilt durch die Assay-Steigung für reduziertes Troponin I. Die Assay-Steigung nimmt mit zunehmender Erkennung von Troponin I durch das Antikörperpaar zu.

Die Daten zeigen, dass Antikörper selektiert werden können, die entweder präferenziell oxidiertes oder reduziertes Troponin I binden oder die oxidiertes und reduziertes Troponin I in etwa gleich gut binden. Die Selektion der Antikörper ohne Berücksichtigung des Oxidations/Reduktions-Zustands von Troponin I kann zu einem substantiellen Fehler in der Quantifizierung der Troponin I-Konzentration führen. TABELLE 1

Anti-Troponin I monoklonaler Antikörper	Anti-Troponin I polyklonaler Antikörper	Verhältnis der Assay-Steigungen (oxidiertes TnI/reduziertes TnI)
Klon 2D5	Peptid 1-spezifisch	8.3
Klon 2D5	Peptid 3-spezifisch	10
Klon 1A12	Peptid 1-spezifisch	0.6
Klon 1A12	Peptid 3-spezifisch	1.3
Klon 1A12	Peptid 4-spezifisch	1.2
Klon TRI-7 F81	Peptid 1-spezifisch	0.5
Klon TRI-7 F81	Peptid 2-spezifisch	0.5
Klon TRI-7 F81	Peptid 3-spezifisch	0.5
Klon TRI-7 F81	Peptid 4-spezifisch	0.5
Klon 110	Peptid 4-spezifisch	0.8
Klon 111	Peptid 3-spezifisch	1.0
Klon 111	Peptid 4-spezifisch	0.4

Beispiel 4
Oxidation-Reduktion von gereinigtem humanen kardialen Troponin I
Die Kinetik der intramolekularen Oxidation und Reduktion von gereinigtem Troponin I (P. Cummins, University of Birmingham, Großbritannien) wurde mit einem Immunassay (Protocol A, Beispiel 2) mit Hilfe eines Klon 2D5 Antikörperkonjugats (Beispiel 1) und eines biotinylierten Ziege-anti-Troponin I/Peptid 1 polyklonalen Antikörpers (Beispiel 1) gemessen. Dieses Antikörperpaar bindet stark an oxidiertes Troponin I und schwach an reduziertes Troponin I, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Ergebnisse des Assays sind in Form einer Assay-Steigung [OD₄₉₀ pro ng/ml Gesamt-Troponin I (oxidiert und reduziert)] im linearen Bereich des Assays ausgedrückt. Die Assay-Steigung steigt mit der Fraktion des oxidierten Troponins I.
Oxidation von reduziertem Troponin I an der Luft
Die Rate der Oxidation von Troponin I an der Luft wurde in zwei Troponin I-Konzentrationen gemessen. Reduziertes Troponin I in einer Konzentration von 0.27 mg/ml in einem Puffer, der 20 mM Tris-HCL, 0.5 M Natriumchlorid, 60 mM 2-Mercaptoethanol, pH 7.5 enthielt, wurde entweder auf 1300 ng/ml oder 10 ng/ml in Assay Puffer verdünnt, welcher entweder kein oder 25 mM 2-Mercaptoethanol enthielt. Die Lösungen wurden bei Raumtemperatur inkubiert. Zu verschiedenen Inkubationszeiten, wie in 1a angegeben, wurden Aliquots entnommen, auf 4 und 8 ng/ml Troponin I in Assaypuffer verdünnt und sofort untersucht. Die Ergebnisse sind in 1a gezeigt, wobei die Fehlerbalken eine Standardabweichung (SD) darstellen.
Oxidation von reduziertem Troponin I mit Peroxid
Peroxid (Fisher, unstabilisiert) wurde (finale Konzentration von Peroxid 2 mM oder 20 mM) wurde unmittelbar nachdem Troponin I aus der 0.27 mg/ml Stammlösung verdünnt wurde zu einem Aliquot der 1300 ng/ml Lösung aus reduziertem Troponin I gegeben (siehe dieses Beispiel, Oxidation an der Luft). Die Lösungen wurden bei Raumtemperatur inkubiert. Zu verschiedenen Inkubationszeiten, wie in 1b angegeben, wurden Aliquots entnommen, mit Katalase (Calbiochem, La Jolla, CA; 0.01 mg/ml Endkonzentration für 5 Minuten) behandelt, um das Peroxid zu entfernen, auf 4 und 8 ng/ml Troponin I verdünnt und sofort untersucht. Die Ergebnisse sind in 1b gezeigt, wobei die Fehlerbalken 1 SD darstellen.
Reduktion von oxidiertem Troponin I mit DTT
Troponin I, das in einer Konzentration von 1000 ng/ml in Assaypuffer für 15 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert (an der Luft oxidiert) wurde, wurde auf 4 und 8 ng/ml in Assaypuffer verdünnt. DTT wurde in einer finalen Konzentration von 0, 1.5 und 3.0 mM zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur für die in 2 angegebenen Zeitspannen. Die Aliquots wurden im Anschluss auf Troponin I untersucht. Nach dem das Fliessgleichgewicht (”steady-state”) erreicht wurde (nach ungefähr 6 Stunden), wurden Aliquots (100 μl) der Proben mit den drei DTT-Konzentrationen mit 20 mM Peroxid für 15 Minuten reoxidiert, 5 Minuten mit Katalase behandelt und untersucht. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt, wobei die Fehlerbalken 1 SD darstellen.
Die Daten zeigen, dass die Ergebnisse eines Immunassays über die Zeit variieren können, falls sich der Oxidations/Reduktions-Zustand von Troponin I verändern kann. Der Oxidations/Reduktions-Zustand von Troponin I, und damit die Ergebnisse des Immunassays können durch die Verwendung von Oxidanzien und Reduktanzien reversibel verändert und über die Zeit erheblich stabilisiert werden.
Beispiel 5
Alkylierung von reduziertem Troponin I
Troponin I wurde mit Hilfe verschiedener alkylierender Reagenzien schnell alkyliert. Die Stammlösung aus reduziertem Troponin I (University of Birmingham) hatte eine Konzentration von 0.27 mg/ml in 20 mM Tris Hydrochlorid, 0.5 M Natriumchlorid, 50 mM 2-Mercaptoethanol. Es wurden drei Alkylierungsreaktionen (#1–3) durchgeführt, und es wurde eine Kontrolle (#4) hergestellt:

1. 20 μl Troponin I-Stammlösung wurden zu 20 μl 0.5 M Kaliumborat, 0.2 mM Ethylendiamintetraessigsäure, pH 8.0, gegeben, und anschließend wurden 10 μl 398 mM Iodacetamid hinzugefügt.
2. 20 μl Troponin I-Stammlösung wurden zu 20 μl 0.5 M Kaliumborat, 0.2 mM Ethylendiamidtetraessigsäure, pH 8.0, gegeben, und anschließend wurden 10 μl 398 mM Iodessigsäure hinzugefügt.
3. 20 μl Troponin I-Stammlösung wurden zu 20 μl 0.5 M Kaliumborat, 0.2 mM Ethyldiamintetraessigsäure, pH 8.0, gegeben, und anschließend wurden 12.5 μl 319 mM N Ethylmaleimid hinzugefügt.
4. 20 μl Troponin I-Stammlösung wurden zu 20 μl 0.5 M Kaliumborat 0.2 mM Ethylendiamintetraessigsäure, pH 8.0, gegeben, und anschließend wurden 10 μl 0.5 M Kaliumborat, 0.2 mM Ethylendiamidtetraessigsäure, pH 8.0, hinzugefügt.

Die Reaktionen wurden 1 h 25 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Während dieser Inkubation wurde die Troponin I-Stammlösung auf Eis gehalten. Aliquots (24 μl) jeder Lösung (1–4) wurden zu 0.9 μl 2.9 M Mercaptoethanol gegeben und bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert. Anschließend wurden die Proben in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die verbliebenen Aliquots jeder Lösung (1–4) wurden ebenfalls in flüssigem Stickstoff ohne weitere Behandlung eingefroren.
Beispiel 6
Immunassay von alkyliertem Troponin I
Frisch aufgetautes Troponin I, das mit N-Ethylmaleimid (NEM), Iodessigsäure (IHAC) oder Iodacetamid (IAM) alkyliert war (Beispiel 5) oder nicht alkyliert war (Kontrollprobe, Beispiel 5), wurde auf 1–10 ng/ml in Assaypuffer verdünnt. Ein frisch aufgetautes Aliquot der reduzierten Troponin I-Stammlösung (Beispiel 5) wurde in Assaypuffer verdünnt (Standardprobe), welche entweder kein oder 3 mM DTT enthielt. Aliquots (25 μl) aller Verdünnungen wurden entweder nach 0.5 Stunden oder 5.5 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur entnommen und mit Hilfe eines Klon 2D5 anti-Troponin I monoklonalen Antikörperkonjugats und eines biotinylierten Ziege-anti-Troponin I/Peptid 1-spezifischen polyklonalen Antikörpers (Beispiel 1) untersucht (Protokoll A, Beispiel 2). Dieses Antikörperpaar bindet stark an oxidiertes Troponin I und schwach an reduziertes Troponin I (Beispiele 3 und 4). Troponin I bleibt während der 0.5 Stunden Inkubation im Wesentlichen reduziert, ist aber nach einer 5.5 Stunden Inkubation nahezu vollständig oxidiert (durch die Luft), außer DTT ist vorhanden, um die reduzierte Form zu stabilisieren (siehe Beispiel 4). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt und in Form einer Assay-Steigung (OD₄₉₀ pro ng/ml Gesamt-Troponin I) im linearen Bereich angegeben. Eine größere Assay-Steigung zeigt eine stärkere Bindungsinteraktion zwischen den Antikörpern und Troponin I an.

Die Daten zeigen, dass das Antikörperpaar alkyliertes Troponin I ähnlich bindet wie reduziertes Troponin I, d. h. schwach im Vergleich mit oxidiertem Troponin I. Weiterhin stabilisiert eine Alkylierung das Immunoassay-Ergebnis hinsichtlich der Zeit, ähnlich dem Effekt, der bei Verwendung von Oxidanzien oder Reduktanzien beobachtet wird, um den Oxidations/Reduktions-Zustand von Troponin zu stabilisieren (Beispiel 4). Die niedrigere und stabilere Assay-Steigung der Kontrollprobe verglichen mit der Standardprobe wird durch die Gegenwart gemischter Disulfide erklärt, die zwischen den zwei Cysteinresten des Troponins I der Kontrollprobe und 2-Mercaptoethanol während der Inkubation der Kontrollprobe bei Raumtemperatur bei pH 8 gebildet werden (siehe Beispiel 5). TABELLE 2

Probe	Assay-Steigung (0.5 h Inkubation)	Assay-Steigung (5.5 h Inkubation)	Verhältnis der Assay-Steigungen (5.5 h/0.5 h)
reduziertes TnI Standard (+DDT)	0.030	0.030	1.0
reduziertes TnI Standard (+DDT)	0.058	0.210	3.6
TnI Kontrolle	0.037	0.078	2.1
TnI alkyliert mit NEM	0.023	0.026	1.1
TnI alkyliert mit IAM	0.013	0.013	1.0
TnI alkyliert mit IHAC	≤ 0.01	≤ 0.01

Beispiel 7
Einfluss von Peroxid auf einen Immunassay von kardialem Troponin I aus Patienten mit bestätigtem Herzinfarkt
Eingefrorenes humanes Serum oder Plasma, das in Heparin-Röhrchen von Patienten mit bestätigtem Herzinfarkt entnommen wurde, wurde von lokalen Krankenhäusern erhalten. Das Serum oder Plasma wurde bei Raumtemperatur aufgetaut und sofort in zwei Aliquots geteilt. Ein Aliquot wurde bei Raumtemperatur durch Zugabe von Peroxid in einer Endkonzentration von 20 mM oxidiert. Das zweite Aliquot blieb unbehandelt. Die Oxidationsreaktion wurde nach 20 Minuten durch Zugabe von Katalase in einer Endkonzentration von 0.01 mg/ml gestoppt. Zehn Minuten nach der Zugabe von Katalase wurden das oxidierte und das unbehandelte Aliquot seriell in einem Faktor von 4 in Assaypuffer verdünnt und sofort auf kardiales Troponin I mit Hilfe des 2D5 anti-Troponin I Konjugat-Antikörpers und des biotinylierten anti-Troponin I/Peptid 3-spezifischen Antikörpers (Beispiel 2, Protokoll A) untersucht. Dieses komplementäre Antikörperpaar bindet oxidiertes Troponin I stark und reduziertes Troponin I schwach (Beispiele 3). An der Luft oxidiertes (Beispiel 4), gereinigtes Troponin I (P. Cummins, University of Birmingham) verdünnt auf 2, 4 und 8 ng/ml in Assaypuffer, wurde mit den gleichen Antikörperreagenzien untersucht, um eine Standardkurve zu erstellen. Die Konzentration von Troponin I in der unverdünnte oxidierten oder unbehandelten Serum- oder Plasmaprobe (Tabelle 3) wurde aus dieser Standardkurve mit Hilfe der OD₄₉₀-Messungen berechnet, die in den linearen Bereich des Assays fielen.

Die Daten zeigen, dass die Oxidation von Serum- oder Plasmaproben aus Patienten mit bestätigtem Herzinfarkt einen wesentlichen Einfluss auf die Konzentration von kardialem Troponin I, bestimmt mittels Immunassay, haben kann. Ein Immunassay von Troponin I in Serum oder Plasma ohne Berücksichtigung des Oxidationszustands von Troponin I könnte zu einer beträchtlichen Unterschätzung der Troponin I-Konzentration führen und die Nicht-Diagnose eines Herzinfarkts zur Folge haben. TABELLE 3

Probe	Zeit zwischen Probennahme und Einfrieren (Stunden)	Troponin I-Konzentration der unbehandelten Probe im Assay (ng/ml)	Troponin I-Konzentration der mit Peroxid oxidierten Probe im Assay (ng/ml)
1 Plasma	2.0	6.3	9.4
2 Plasma	6.5	0.8	1.0
3 Serum	9.3	6.6	8.3
4 Serum	6.5	31.9	46.5
5 Plasma	6.5	31.7	49.7
6 Plasma	9.5	0.6	1.0
7 Serum	11.5	0.4	0.4
8 Plasma	5.0	4.5	5.4
9 Serum	10.5	1.6	2.3
10 Plasma oder Serum	nicht bekannt	13.6	13.2

Beispiel 8
Einfluss von Peroxid auf einen Immunassay von kardialem Troponin I in humanem Plasma nach zwei Einfrier/Auftau-Zyklen
Die Plasmaprobe Nummer 5 (Tabelle 3, Beispiel 7) wurde drei Stunden unbehandelt auf Eis gelagert, nachdem sie ursprünglich aufgetaut, anschließend erneut eingefroren und bei –70°C mehrere Tage gelagert wurde. Das Plasma wurde bei Raumtemperatur aufgetaut und in zwei Aliquots geteilt. Eines wurde mit Peroxid oxidiert, und das andere blieb unbehandelt wie in Beispiel 7 beschrieben. Die Konzentration von Troponin I im oxidierten und im unbehandelten Aliquot wurde unmittelbar durch den Immunassay bestimmt, wie in Beispiel 7 beschrieben, und betrug 53.9 ng/ml im unbehandelten Aliquot und 56.4 ng/ml im oxidierten Aliquot.
Die Daten zeigen, dass die Oxidation des Plasmas nach dem zweiten Auftauen keinen wesentlichen Einfluss auf die mittels Immunassay bestimmte Konzentration von kardialem Troponin I hat.
Beispiel 9
Immunassay von kardialem Troponin I in oxidiertem und reduziertem Plasma eines Patienten mit Herzinfarkt
Eingefrorenes humanes Plasma, das in Heparin-Röhrchen aus einem Patienten mit einem bestätigtem Herzinfarkt entnommen wurde, wurde von einem lokalen Krankenhaus erhalten. Das Plasma wurde bei Raumtemperatur aufgetaut und sofort in zwei Aliquots geteilt. Ein Aliquot wurde mit Peroxid oxidiert wie in Beispiel 7 beschrieben. Das andere Aliquat wurde durch Zugabe von DTT in einer Endkonzentration von 10 mM reduziert, gefolgt von einer 3 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur. Das oxidierte Aliquot wurde im Anschluss seriell in einem Faktor von 2 in Assaypuffer verdünnt, und das reduzierte Aliquot wurde seriell in einem Faktor von 2 in Assaypuffer mit 3 mM DTT verdünnt. Die verdünnten Aliquots wurden sofort auf Troponin I (Protokoll A, Beispiel 2) untersucht, entweder mit dem komplementären Antikörperpaar Klon 2D5 anti-Troponin I Konjugat und biotinylierter anti-Troponin/Peptid 3 polyklonaler Antikörper oder mit dem komplementären Antikörperpaar Klon TRI-7 F81 anti-Troponin I Konjugat und biotinylierter anti-Troponin I/Peptid 3 polykonaler Antikörper. Gereinigtes Troponin I (University of Birmingham), das an der Luft oxidiert wurde (Beispiel 4), wurde auf 2, 4 und 8 ng/ml in Assaypuffer verdünnt und verwendet, um die Standardkurve zu erstellen, aus der die Troponin I-Konzentration in der unverdünnten oxidierten oder reduzierten Plasmaprobe bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.

Die Daten zeigen, dass die chemische Oxidation und Reduktion von kardialem Troponin I in der Plasmaprobe die Erkennung von Troponin I durch die getesteten Antiköperpaare in einer Weise beeinflusst, die der für gereinigtes Troponin I beobachteten ähnlich ist (Beispiel 3). TABELLE 4

Monoklonales Antikörper-Konjugat	Gemessene Troponin I-Konzentration (ng/ml) in oxidiertem Plasma	Gemessene Troponin I-Konzentration (ng/ml) in reduziertem Plasma	Verhältnis der Troponin I-Konzentrationen (oxidiertes Plasma/reduziertes Plasma)
Klon 2D5	82.0	< 1	> 82
Klon TRI-7 F81	52.8	77.5	0.68

Beispiel 10
Selektion von anti-Troponin I Antikörpern, die entweder sensitiv oder insensitiv gegenüber der Bindung von Troponin C an Troponin I sind
Ein moklonaler anti-Troponin I Konjugat-Antikörper und ein komplementärer biotinylierter anti-Troponin I polyklonaler Antikörper (Beispiel 1) wurden auf ihre Erkennung von freiem Troponin I und von Troponin I, das in einem binären Komplex an Troponin C gebunden ist, untersucht. Vier Typen von Troponin I-Proben wurden bei Raumtemperatur hergestellt und auf Troponin untersucht. Dies sind: oxidiertes Troponin I mit und ohne Zugabe von Troponin C und reduziertes Troponin I mit und ohne Zugabe von Troponin C. Oxidiertes (mittels Luft, siehe Beispiel 4) humanes kardiales Troponin I (P. Cummins, University of Birmingham) wurde auf 2, 4 und 8 ng/ml in Assaypuffer verdünnt, der 2 mM Calciumchlorid enthielt. Ein Aliquot von jeder Troponin I-Konzentration wurde entweder unbehandelt gelassen oder durch Zugabe von DTT in einer Endkonzentration von 3 mM aus einer 30 mM DTT-Stammlösung in Assaypuffer reduziert, um eine Reduktionsreaktion zu erzeugen. Drei Stunden, nachdem die Reduktionsreaktion gestartet wurde, wurde jedes oxidierte und reduzierte Troponin I-Aliquot in zwei Aliquots geteilt. Zu einem Aliquot wurde humanes kardiales Troponin C (Bio-Tech International Inc., Seattle, WA) in einer Endkonzentration von 0.1 mM aus einer 1 mM Stammlösung in 20 mM Kaliumphosphat, 4 mM Kaliumborat, 150 mM Natriumchlorid, pH 7.0, gegeben, um ein Bindungsreaktionsgemisch zu erzeugen, und zu dem anderen Aliquot wurde das gleiche Volumen des obigen Puffers ohne Troponin C gegeben. Eine Stunde nach Zugabe des Troponins C wurden alle Aliquots unter Verwendung der in Tabelle 5 aufgelisteten Antikörperpaare auf Troponin I untersucht (Protokoll A, Beispiel 2). Die Ergebnisse in Tabelle 5 sind als fraktionelle Assay-Antwort ausgedrückt, die durch Dividieren der Assay-Steigung in Gegenwart von Troponin C durch die Assay Steigung bei Fehlen von Troponin C bestimmt wurde.

Die Ergebnisse in Tabelle 5 zeigen, dass einige Antikörperpaare freies Troponin I und an Troponin C gebundenes Troponin I gleich gut erkennen, während andere Antikörperpaare nur freies Troponin I erkennen. Ein Immunassay mit Antikörpern, die an Troponin C gebundenes Troponin I nicht erkennen, unerschätzt die Gesamtkonzentration an Troponin I, wenn ein Teil von Troponin I als binärer Troponin I/C-Komplex vorliegt. TABELLE 5

Anti-Troponin I Antikörper-Konjugat	Biotinylierter Anti-Troponin I polyklonaler Antikörper	Fraktionelle Assay-Antwort
Anti-Troponin I Antikörper-Konjugat	Biotinylierter Anti-Troponin I polyklonaler Antikörper	Oxidiertes Troponin I	Reduziertes Troponin I
Klon 2D5	Peptid 3-spezifisch	0.81	0.60
Klon 111	Peptid 1-spezifisch	0.83	nicht bestimmt
Klon 111	Peptid 3-spezifisch	0.47	0.52
Klon 111	Peptid 4-spezifisch	0.59	0.19
Klon 110	Peptid 4-spezifisch	0.96	0.48
Klon 1A12	Peptid 1-spezifisch	< 0.05	< 0.05
Klon 1A12	Peptid 3-spezifisch	< 0.05	< 0.05
Klon 1A12	Peptid 4-spezifisch	< 0.05	< 0.05
Klon TRI-7 F81	Peptid 1-spezifisch	0.74	0.79
Klon TRI-7 F81	Peptid 2-spezifisch	0.92	1.04
Klon TRI-7 F81	Peptid 3-spezifisch	0.94	0.97
Klon TRI-7 F81	Peptid 4-spezifisch	0.70	0.79

Beispiel 11
Einfluss von Troponin T, EDTA, Melittin und Mastoparan auf einen Troponin I-Immunassay, wobei Troponin C in großem Überschuss über Troponin I vorliegt
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) erniedrigt die Bindungsaffinität von Troponin I für Troponin T und Troponin C durch das Komplexieren von Calcium- und Magnesiumionen. Melittin erniedrigt die Affinität von Troponin I für Troponin C durch Bindung von Troponin C. Die Effektivität von EDTA und Melittin (nachfolgend als Bindungsinhibitoren bezeichnet) im Aufbrechen des binären Komplexes aus Troponin I und Troponin C in Gegenwart und bei Abwesenheit von Troponin T wurde untersucht. Oxidiertes humanes kardiales Troponin I (P. Cummins, University of Birmingham) in einer Konzentration von 1.0 μg/ml in Assaypuffer, welcher 2 mM Calciumchlorid enthielt, wurde mit Dithiothreitol in einer Endkonzentration von 3 mM drei Stunden bei Raumtemperatur reduziert. Das reduzierte Troponin I wurde auf 2 und 4 ng/ml in Assaypuffer verdünnt, der 2 mM Calciumchlorid und 3 mM Dithiotreitol enthielt. Jede Konzentration wurde in vier Aliquots geteilt, zu denen humanes kardiales Troponin C (Biotech International, Inc.) in Endkonzentrationen von 0, 0.1, 1.0 und 10.0 μg/ml aus einer Stammlösungen mit hundertfachem Überschuss in 20 mM Kaliumphosphat, 4 mM Kaliumborat, 150 mM Natriumchlorid, pH 7.0 gegeben wurde. Jedes der erhaltenen Aliquots wurde weiter in zwei Aliquots geteilt, zu denen humanes Troponin T (Scripps Labs) in einer Endkonzentration von entweder 0.0 oder 0.1 μg/ml aus einer Stammlösung mit hundertfachem Überschuss in deionisiertem Wasser gegeben wurde. Die Aliquots wurden nach der Zugabe von Troponin T eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend auf Troponin I untersucht (Protokoll B, Beispiel 2). Die zu den Wells der Mikrotiterplatte gegebene Antikörper-Lösung enthielt 30 μg/ml Klon 1A12 anti-Troponin I Antikörper und 7.5 μg/ml biotinylierten anti-Troponin I/Peptid 4-spezifischen Antikörper (Beispiel 1) entweder ohne oder mit Bindungsinhibitoren (30 mM EDTA und 0.5 mM Melittin (Sigma Chemicals, Co., Saint Louis, MO)). Aliquots der durch Zugabe der Antikörper zu den Troponin I-Proben erhaltenen Reaktionsgemische wurden nach 0.5 Stunden entnommen und weiterbehandelt wie in Protokoll B, Beispiel 2 beschrieben. Die Assay-Ergebnisse der Proben, die kein Troponin C oder T und keine Bindungsinhibitoren enthielten, wurden verwendet, um eine Standard Dosis-Wirkungskurve zu erstellen. Der Einfluss der Zugabe von Bindungsinhibitoren zum Assay auf die Standardkurve wurde untersucht und für vernächlässigbar befunden. Die fraktionelle Assay-Antwort (gezeigt in 3) für Proben, die Inhibitoren und Troponin-Komponenten enthielten, wurde durch Dividieren der Assay-Steigung für jede Probe durch die Steigung für die Standardkurve bestimmt.
Die Daten zeigen, dass in der Gegenwart von Troponin C die Troponin I-Konzentration erheblich unterschätzt wird. Die Bindungsinhibitoren kehren den Effekt von Troponin C nahezu vollständig um. Die Gegenwart von Troponin T in der Abwesenheit von Troponin C hat keinen Einfluss auf den Troponin I-Immunassay (Daten in 3 nicht gezeigt). In der Gegenwart von Troponin C und T ist die gemessene Troponin I-Konzentration dramatisch reduziert. Die Bindungsinhibitoren scheinen weniger effektiv bei der Öffnung oder partiellen Aufwindung des Troponin-Komplexes zu sein, wenn der Komplex ternär ist als wenn der Komplex binär ist. Mastoparan oder Melittin in einer Konzentration von 0.1 mM wurden ebenfalls als Bindungsinhibitoren getestet, um bei einer Troponin C-Konzentration von 10 μg/ml den I/C-Komplex zu dissoziieren (Daten nicht gezeigt). Melittin war hinsichtlich der Erhöhung der fraktionellen Assay-Antwort ebenso effektiv wie Melittin/EDTA (3), während Mastoparan in den untersuchten Konzentrationen nur ein Drittel der Effektivität von Melittin aufwies.
Beispiel 12
Einfluss von Bindungsinhibitoren auf einen Immunassay für Troponin I in Gegenwart von Troponin C oder Troponin C und T
Lösungen, die 1.0 μg/ml gereinigtes humanes kardiales Troponin I (reduziert mit DTT, Beispiel 4) und entweder 1.2 μg/ml humanes kardiales Troponin C (Bio-Tech International, Inc.) oder 1.2 μg/ml Troponin C und 3.1 μg/ml humanes kardiales Troponin T (Scripps Labs) enthielten, wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur in Assaypuffer mit 3 mN DDT inkubiert. Troponin C wurde vor der Zugabe von Troponin T zu Troponin I gegeben. Die Troponin-Lösungen wurden bezüglich der Troponin I-Konzentration auf 2, 4 und 8 ng/ml in Assaypuffer verdünnt, der 2 mM Kalziumchlorid und 0.5 mM DDT enthielt, und sofort mit und ohne Bindungsinhibitoren untersucht, wie in Beispiel 11 beschrieben. Aliquots der Reaktionsgemische aus Antikörpern und Troponin-Komponenten wurden 0.5 h und 2.2 h nach Zugabe der Antikörper entnommen. Diese Aliquots wurden weiterbehandelt wie in Protokoll B, Beispiel 2 beschrieben. Reduziertes Troponin I ohne Zugabe von Troponin C und T und ohne Bindungsinhibitoren wurde untersucht, um eine Standardkurve zu erstellen. Der Einfluss der Zugabe von Bindungsinhibitoren zum Assay auf die Standardkurve wurde untersucht und für vernachlässigbar befunden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 als fraktionelle Assay-Antwort ausgedrückt, die durch Dividieren der Assay-Steigung für jede Probe durch die Steigung der Standardkurve bestimmt wurde.

Die Daten zeigen, dass das Vorhandensein von Troponin T und C in annähernd einem zweifachen molaren Überschuss über die Troponin I-Konzentration die im Immunassay gemessene Menge an Troponin I wesentlich vermindert. Troponin C alleine hat bei den in diesem Assay verwendeten Antikörperkonzentrationen einen geringeren Effekt auf die gemessene Troponin I-Konzentration. Die Bindungsinhibitoren kehren den Effekt von Troponin C und T nach 0.5 Stunden Inkubation partiell und nach 2.2 Stunden vollständig um. TABELLE 6

Zeit nach Antikörper-Zugabe (Stunden)	Fraktionelle Assay-Antwort
	Mit Troponin C		Mit Troponin C und T
	Ohne Bindungsinhibitoren	Mit Bindungsinhibitoren	Ohne Bindungsinhibitoren	Mit Bindungsinhibitoren
0.5	0.88	0.94	0.55	0.75
2.2	1.15	1.02	0.44	1.02

Beispiel 13
Assay des gereinigten humanen kardialen ternären Troponin-Komplexes auf Troponin I
Gereinigter humaner kardialer ternärer Troponin-Komplex (Bio-Tech International, Inc.; 3 mg/ml Stammlösung in einem Puffer mit 20 mM Natriumcitrat, pH6) wurde auf Konzentrationen von 1 bis 15 ng/ml Gesamt-Troponin I in einem Assaypuffer verdünnt, der 2 mM Kalziumchlorid, aber keine 0.1 mM Zinkchlorid oder 1 mM Magnesiumchlorid enthielt (nachfolgend als metall-freier Assaypuffer bezeichnet). Die verdünnten Lösungen wurden mit und ohne Bindungsinhibitoren auf Troponin untersucht, wie in Beispiel 11 beschrieben. Aliquots dieser Reaktionsgemische aus den Antikörpern und dem Troponin-Komplex wurden zu den in 4 angegebenen Zeiten entnommen und weiterbehandelt wie in Protokoll B, Beispiel 2 beschrieben. Gereinigtes Troponin I (Bio-Tech International, Inc.) wurde untersucht und verwendet, um eine Standardkurve zu erstellen. Der Einfluss der Zugabe der Bindungsinhibitoren zum Assay auf die Standardkurve wurde untersucht und für vernachlässigbar befunden. Die in 4 gezeigte fraktionelle Assay-Antwort wurde durch Dividieren der Assay-Steigung für den Komplex (OD₄₉₀ als Funktion der Troponin I-Gesamtkonzentration) durch die Steigung der Standardkurve bestimmt.
Die Ergebnisse zeigen, dass Troponin I, das im ternären Komplex mit Troponin C und T gebunden ist, selbst nach einer sehr langen Inkubationszeit bei den in diesem Assay verwendeten Antikörper- und Troponin I-Konzentrationen nicht sehr gut von den Antikörpern erkannt wird. Insbesondere fand sich beim 30 Minuten-Zeitpunkt mit oder ohne Inhibitoren kein detektierbares Troponin I. Die Bindungsinhibitoren öffnen langsam den Komplex oder winden in partiell auf und erhöhen somit langsam die Fraktion von Troponin I, welche durch die Antikörper erkannt wird.
Beispiel 14
Einfluss von Bindungsinhibitoren auf einen Troponin I-Immunassay mit Plasma und Serum von Patienten mit bestätigtem Herzinfarkt
Gefrorenes Serum und Plasma, das in EDTA und Heparin-Röhrchen aus Patienten mit bestätigtem Herzinfarkt entnommen wurde, wurde von lokalen Krankenhäusern erhalten und bei Raumtemperatur aufgetaut. Kalziumchlorid wurde in einer Endkonzentration von 6 mM (um sämtliches EDTA zu binden) zugegeben, und die erhaltene Lösung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur und anschließend über Nacht bei 4°C inkubiert. Die inkubierten Proben wurden mit einem Faktor von 2 bis zu einem maximalen Verdünnungsfaktor von 256 in metall-freiem Assaypuffer verdünnt. Die verdünnten Proben wurden mit und ohne Bindungsinhibitoren sofort auf Troponin I untersucht, wie in Beispiel 11 beschrieben, mit der Ausnahme, dass der polyklonale Antikörper Ziege anti-Troponin I/Peptid 3-spezifisch war. Aliquots des Reaktionsgemisches, das durch Zugabe der Antikörper zu den verdünnten Proben erzeugt wurde, wurde zu den in den 5a–f angegebenen Zeiten entnommen und weiterbehandelt wie in Beispiel 2, Protokoll B beschrieben. Oxidiertes Troponin I (University of Birmingham) wurde in Konzentrationen von 2, 4 und 8 ng/ml in metall-freiem Assaypuffer untersucht, um eine Standardkurve zu erstellen. Der Einfluss der Zugabe der Bindungsinhibitoren zum Assay auf die Standardkurve wurde untersucht und für vernachlässigbar befunden. Die OD₄₉₀-Werte, die für die verdünnten Serum- oder Plasmaproben gemessen wurden, wurden als Funktion des Kehrwerts des Verdünnungsfaktors aufgetragen. Die Steigung in der linearen Region der erhaltenen Kurve (typischerweise bei einer OD₄₉₀ < 2, was einer Troponin I-Konzentration von weniger als 8 ng/ml entspricht) wurde durch die Steigung der Standardkurve dividiert, um die Troponin I-Konzentration in der unverdünnten Serum- oder Plasmaprobe zu erhalten, wie in den 5a–f gezeigt. Jede der 5a bis 5f spiegelt Immunassays mit Serum oder Plasma von verschiedenen Patienten wieder.
Die Daten zeigen, dass die gemessenen Troponin I-Konzentrationen in allen untersuchten Serum- und Plasmaproben durch Zugabe von Bindungsinhibitoren erhöht wurde. Nennenswerterweise war das Zeitprofil der gemessenen Troponin I-Konzentration in einigen Fällen biphasisch (5a–c und 5e). Die schnelle Phase war innerhalb der ersten halben Stunde des Assays abgeschlossen. Die langsame Phase stieg abhängig von der Probe für 6 bis 24 Stunden weiter an. Eine langsame Phase wurde ebenfalls für den gereinigten ternären Troponin-Komplex beobachtet (Beispiel 13). Die für die verdünnten Serum- und Plasmaproben beobachtete langsame Phase kann daher mit der Öffnung oder partiellen Aufwindung eines ternären Komplexes durch die Inhibitoren und Antikörper assoziiert werden. Die schnelle Phase zeigt einen gebundenen Komplex von Troponin I an, der einfacher geöffnet oder partiell aufgewunden werden kann als der ternäre Komplex, da die schnelle Phase beim gereinigten ternären Komplex fehlt (Beispiel 13). Demzufolge könnte die schnelle Phase mit der Öffnung oder partiellen Aufwindung binärer Komplexe von Troponin I assoziiert sein.
Beispiel 15
Immunassays, die sensitiv gegenüber freiem Troponin I, gegenüber Troponin I gebunden in einem ternären Komplex und sowohl gegenüber freiem als auch gebundenem Troponin I sind.
Drei Sets von Antikörpern wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Erkennung von freiem Troponin I und von Troponin I gebunden im ternären Komplex untersucht. Drei Antikörper-Stammlösungen, die nachfolgend als Nummer 1–3 beschrieben werden, wurden in metall-freiem Assaypuffer entweder mit oder ohne Bindungsinhibitoren (30 mM EDTA und 0.15 mM Melittin) und den folgenden Antikörpern hergestellt:

1. 30 μg/ml 1A12 anti-Troponin I und 7.5 μg/ml biotinylierter anti-Troponin I/Peptid 4-spezifisch;
2. 30 μg/ml 1A12 anti-Troponin I, 30 μg/ml 9B1 anti-Troponin T monoklonal (Biospacific), jeweils 5 μg/ml biotinylierter anti-Troponin I/Peptid 1-, 2-, 3- und 4-spezifisch;
3. 30 μg/ml 9B1 anti-Troponin T und jeweils 5 μg/ml biotinylierter anti-Troponin I/Peptid 1-, 2-, 3- und 4-spezifisch.

Der humane kardiale ternäre Troponin-Komplex (Bio-Tech International, Inc.) wurde auf 1–15 ng/ml Troponin I-Äquivalente in metall-freiem Assaypuffer verdünnt, und gereinigtes Troponin I (Bio-Tech International, Inc.) wurde auf 2, 4 und 8 ng/ml im gleichen Puffer verdünnt. Die Verdünnungen des Troponin-Komplexes und von Troponin I wurden mit den Antikörper-Lösungen #1–3 unter Verwendung von Protokoll B, Beispiel 2 sofort analysiert. Aliquots der Reaktionsgemische, die durch Zugabe der Antikörper zu den Proben des Troponin-Komplexes und von Troponin I erzeugt wurden, wurden 0.5 h und 2.5 h nach Zugabe der Antikörper entnommen und weiterbehandelt wie in Beispiel 2, Protokoll B beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt und in Form einer Assay-Steigung mit den OD₄₉₀-Eiheiten pro ng/ml Gesamt-Troponin I im linearen Bereich des Assay ausgedrückt. Eine höhere Steigung bedeutet eine bessere Bindung der Antikörper an die Troponin-Komponenten. Antikörper-Lösung #2 wurde untersucht und als negativ hinsichtlich der Kreuzreaktivität mit gereinigtem humanem kardialen Troponin T (Scripps Labs) in einer Konzentration von 1–6 ng/ml unter Verwendung des hier beschriebenen Assayprotokolls befunden (Daten nicht gezeigt).
Die Daten zeigen, dass der Immunassay unter Verwendung der Antikörper in Lösung #1 freies Troponin I erkennt, nicht aber Troponin I im ternären Komplex. Die Immunassays unter Verwendung der Antikörper in Lösung #2 erkennen freies Troponin I und Troponin I im ternären Komplex beinahe gleich gut. Somit ist Antikörper-Lösung #2 der Lösung #1 bzgl. des Assays von Gesamt-Troponin I überlegen, wenn ein Teil von Troponin I als ternärer Komplex vorliegt. Der Immunassay unter Verwendung der Antikörper in Lösung #3 erkennt den ternären Komplex gut, erkennt aber freies Troponin I nur schlecht.

Diese schlechte Erkennung von freiem Troponin I verursacht über die Zeit einen Abfall der Assay-Steigung für Antikörper-Lösung #3 in Gegenwart von Bindungsinhibitoren. Durch Verwendung aller drei Antikörper-Lösungen in Immunassays kann man die Konzentrationen von freiem Troponin I (Lösung #1), Gesamt-Troponin I (Lösung #2) und gebundenem Troponin I (Lösung #3) unabhängig abschätzen. TABELLE 7

Antikörper-Lösung	Zeit nach Antikörper-Zugabe (Stunden)	Assay-Steigung (OD₄₉₀ pro ng/ml Gesamt-Troponin I)
Antikörper-Lösung	Zeit nach Antikörper-Zugabe (Stunden)	Freies Troponin I	Ternärer Troponin-Komplex (ohne Bindungsinhibitoren)	Ternärer Troponin-Komplex (mit Bindungsinhibitoren)
#1	0.5	0.14	< 0.006	< 0.006
#1	2.5	0.14	0.003	0.021
#2	0.5	0.12	0.18	0.14
#2	2.5	0.22	0.17	0.12
#3	0.5	0.008	0.18	0.17
#3	2.5	0.008	0.17	0.08

Beispiel 16
Abschätzung von freiem Troponin I, gebundenem Troponin I und Gesamt-Troponin I in Plasma aus einem Patienten mit einem Herzinfarkt
Die drei in Beispiel 15 beschriebenen Antikörper-Lösungen wurden in Immunassays verwendet, um die Troponin I-Konzentration in Plasma von einem Patienten mit einem bestätigten Herzinfarkt zu bestimmen. Das gefrorene Plasma wurde behandelt und in metall-freiem Assaypuffer verdünnt wie in Beispiel 14 beschrieben. Das verdünnte Plasma wurde mit den Antikörper-Lösungen #1–3 (Beispiel 15) unter Verwendung von Protokoll B, Beispiel 2 sofort auf Troponin I untersucht. Aliquots wurden 0.5 h und 2.5 h nach der Zugabe der Antikörper zu den Proben wurden entnommen, um die Reaktionsgemische zu erzeugen, und weiterbehandelt wie in Beispiel 2, Protokoll B beschrieben. Es wurde entweder freies Troponin I in einer Konzentration von 1–4 ng/ml oder der Troponin-Komplex (Bio-Tech International, Inc.) in einer Konzentration von 1–8 ng/ml Troponin I in metall-freiem Assay-Puffer analysiert und verwendet, um eine Standardkurve von OD₄₉₀ als eine Funktion der Troponin I-Gesamtkonzentration für jede Antikörper-Lösung zu erstellen. Die Konzentration an Troponin I in der unverdünnten Plasmaprobe, wie in Tabelle 8 gezeigt, die mit jeder Antikörper-Lösung gemessen wurde, wurde entweder mit der Standardkurve für freies Troponin I oder für Troponin I im ternären Komplex in Abwesenheit von Bindungsinhibitoren bestimmt, wie in Tabelle 8 angegeben und in Beispiel 14 beschrieben. Das Verhältnis, das durch Dividieren der gemessenen Troponin I-Konzentration mit Bindungsinhibitoren durch die Konzentration ohne Inhibitoren bestimmt wurde, ist ebenfalls in Tabelle 8 angegeben.

Die Daten zeigen, dass die Konzentration an Troponin I, die mit Hilfe eines Immunassays unter Verwendung von Antikörper-Lösung #1 bestimmt wurde, sehr viel sensitiver gegenüber dem Vorhandensein von Bindungsinhibitoren, und damit gegenüber der Öffnung oder partiellen Aufwindung des Troponin-Komplexes ist als die, welche unter Verwendung von Lösung #2 oder #3 bestimmt wurde. Die Ergebnisse aus Beispiel 15 suggerieren, dass Antikörper-Lösung #1 hauptsächlich freies Troponin I misst, Lösung #2 sowohl freies Troponin I als auch Troponin I gebunden im ternären Komplex misst, und Lösung #3 hauptsächlich Troponin I gebunden im ternären Komplex misst. Somit weisen die Schlussfolgerungen aus Beispiel 15 zusammen mit den Ergebnissen in Tabelle 8 darauf hin, dass in der verdünnten Plasmaprobe erhebliche Mengen sowohl des freien als auch des gebundenen Troponins I vorliegen. Unter den drei in den Immunassays verwendeten Antikörper-Lösungen ergibt Lösung #2, wie erwartet, die höchste gemessene Troponin I-Konzentration; da der Immunassay unter Verwendung von Antikörper-Lösung #2 sowohl freies als auch gebundenes Troponin I misst. Demzufolge scheint Antikörper-Lösung #2 für die umfassendste Messung von Troponin I in der Plasmaprobe zu sorgen. Antikörper-Lösung #2, standardisiert mit dem gereinigten Troponin-Komplex, ergab den stabilsten Assay im Hinblick auf die Inhibitor-Zugabe und die Inkubationszeit des Assays. Der Abfall der Troponin I-Konzentration bei 2.5 h, gemessen mit Antikörper-Lösung #2, standardisiert mit freiem Troponin I, erfolgte aufgrund eines Anstiegs der Steigung der Standardkurve bei 2.5 h. TABELLE 8

Antikörper-Lösung	Zeit nach Antikörper-Zugabe (Stunden)	Standard zur Bestimmung der Troponin I-Konzentration	Troponin I-Konzentration im Plasma (ng/ml)		Verhältnis
Antikörper-Lösung	Zeit nach Antikörper-Zugabe (Stunden)	Standard zur Bestimmung der Troponin I-Konzentration	Ohne Bindungs-inhibitoren	Mit Bindungsinhibitoren	Verhältnis
#1	0.5	Troponin I	91	186	2.0
#1	2.5	Troponin I	83	251	3.0
#3	0.5	Ternärer Troponin-Komplex	134	108	0.8
#3	2.5	Ternärer Troponin-Komplex	87	65	0.74
#2	0.5	Troponin I	280	360	1.3
#2	2.5	Troponin I	172	220	1.3
#2	0.5	Ternärer Troponin-Komplex	229	299	1.3
#2	2.5	Ternärer Troponin-Komplex	223	286	1.3

Beispiel 17
Immunassay von freiem humanem kardialen Troponin T und von Troponin T im humanen kardialen ternären Komplex
Zwei Antikörper-Stammlösungen (#1 und #2) wurden wie nachfolgend beschrieben in metall-freiem Assaypuffer entweder mit oder ohne Bindungsinhibitoren (30 mM EDTA und 0.15 mM Melittin) und mit den folgenden Antikörpern hergestellt:

1. 30 μg/ml 1A12 anti-Troponin I, 30 μg/ml 9B1 anti-Troponin T und 7.5 μg/ml biotinylierter anti-Troponin T/Peptid 3-spezifisch (Biospacific);
2. 30 μg/ml 9B1 anti-Troponin T und 7.5 μg/ml biotinylierter anti-Troponin T/Peptid 3-spezififisch

₄₉₀

Die Daten zeigen, dass die Antikörper in Lösung #1 sowohl freies Troponin T als auch Troponin T gebunden im ternären Komplex gleich gut erkennen. Die Antikörper in Lösung #2 erkennen freies Troponin T gut, erkennen allerdings Troponin T im ternären Komplex nur schwach. Somit ist anzunehmen, dass Antikörper-Lösung #1 die umfassendste und genaueste Messung der Gesamtkonzentration von Troponin T in humanen Blutproben bereitstellt, in denen eine wesentliche Menge des ternären Komplexes vorliegt. TABELLE 9

Antikörper-Lösung	Zeit nach Antikörper-Zugabe zu den Troponin-Proben (Stunden)	Assay-Steigung (OD₄₉₀ pro ng/ml Troponin T)
Antikörper-Lösung		Freies Troponin T ohne Bindungs-inhibitoren	Freies Troponin T mit Bindungs-inhibitoren	Troponin-Komplex ohne Bindungs-inhibitoren	Troponin-Komplex mit Bindungs-inhibitoren
#1	0.5	0.069	0.078	0.061	0.070
#2	0.5	0.078	0.085	0.013	0.012
#3	3.0	> 0.08	> 0.08	0.018	0.023

Beispiel 18
Verwendung von Troponin C, um eine nicht-spezifische Bindung von Troponin I an Filtermembranen zu verhindern.
Oxidiertes kardiales Troponin I (luftoxidiert, Beispiel 4, University of Birmingham) in einer Endkonzentration von 100 ng/ml in humanem Serum (Hybritech, Inc., San Diego) wurde entweder mit oder ohne 100 μg/ml humanes kardiales Troponin C (Bio-Tech International, Inc.) für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zwei Filtermembranen, ein CytoSep-Filter (Ahlstrom Filtration, Mount Holly Springs, PA) und ein Glasfaserfilter (GB-100R, Micro Filtration Systems, Dublin, CA), wurden in Rechtecke von 1.5 cm × 3.0 cm geschnitten und auf einem transparenten Film (Katalog #pp2500, 3M, Austin, TX) mit einem Stück Klebeband entlang der Filter befestigt. Die Troponin I-Lösungen mit und ohne Troponin C (300 μl) wurden langsam an einem Ende auf die Oberseite der Filter appliziert, und die Lösung wanderte aufgrund der Dochtwirkung durch den Filter bis zum anderen Ende. Etwa 15 μl der Lösung wurden vom anderen Ende mit einer Plastikpipettenspitze eingesammelt. Die gesammelten Lösungen wurden um einen Faktor 20, 40 und 80 in Assaypuffer verdünnt und mit einem TRI-7 F81 anti-Troponin I-Konjugat-Antikörper und einem biotinylierten anti-Troponin I/Peptid 3-spezifischen Antikörper unter Verwendung von Protokoll A, Beispiel 2 analysiert. Aliquots der Troponin I-Lösungen mit und ohne Troponin C, die nicht durch die Filter gelaufen waren, wurden ebenfalls analysiert und zur Erstellung einer Standardkurve verwendet, aus der die Konzentration von Troponin I in der Lösung, die durch die Filter gelaufen war, bestimmt wurde. Die errechnete Konzentration wurde durch 100 ng/ml geteilt, um die Fraktion des zurückgewonnenen Troponins I zu erhalten, die in Tabelle 10 gezeigt ist. Die experimentellen Fehler, die in Tabelle 10 angegeben sind, stellen eine Standardabweichung dar.
Die Daten zeigen, dass das Vorhandensein von Troponin C hilft, die nicht-spezifische Bindung von Troponin I an die Filtermembranen zu vermindern. TABELLE 10

Filter Fraktion des zurückgewonnenen Troponins I

Ohne Troponin C Mit Troponin C

CytoSep 0.03 ± 0.03 0.15 ± 0.04

Glasfaser 0.00 ± 0.03 0.09 ± 0.04
Beispiel 19
Verwendung von Proteinen mit hohem isoelektrischen Punkt, um eine nicht-spezifische Bindung von Troponin I an Filtermembranen zu verhindern
Ein Blutfilter (CytoStep 1.5 cm × 3.0 cm) wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur in Lösungen aus deionisiertem Wasser eingeweicht, welche 1 mg/ml der in Tabelle 11 aufgelisteten Proteine enthielten. Die Filter wurden einmal mit deionisiertem Wasser gespült und 2 Stunden bei 35°C getrocknet. Oxidiertes humanes kardiales Troponin I (Bio-Tech International, Inc.) in einer Konzentration von 100 ng/ml in humanem Serum (Hybritech, Inc., San Diego, CA), das weiterhin 2 mM Kalziumchlorid enthielt, wurde durch die Filter transportiert, wie in Beispiel 18 beschrieben. Die aus den Filter zurückgewonnene Menge an Troponin I wurde unter Verwendung des TRI-7 F81 anti-Troponin I-Antikörpers und des biotinylierten anti-Troponin I/Peptid 4-spezifischen Antikörpers unter Zugabe von Bindungsinhibitoren (Beispiel 11) mittels des Assays (Protokoll B, Beispiel 2) bestimmt. Die Daten in Tabelle 11 sind ausgedrückt als die Fraktion des zurückgewonnenen Troponins I, die bestimmt wurde wie in Beispiel 18 beschrieben.
Die Ergebnisse zeigen, dass Melittin und Protaminsulfat die nicht-spezifische Bindung von Troponin I an den Blutfilter wesentlich reduzieren, während Kasein und fettfreie Trockenmilch in den getesteten Konzentrationen nur einen geringen Effekt zeigen. TABELLE 11

Protein Fraktion des zurückgewonnenen Troponins I

Ohne Zugabe 0.16

Protaminsulfat 0.77

Casein 0.16

Melittin 0.72

Fettfreie Trockenmilch 0.08
Beispiel 20
Immunassay des ternären Troponin-Komplexes unter Verwendung des TRI-7 F81 anti-Troponin I-Antikörpers und des biotinylierten anti-Troponin I/Peptid 4 Antikörpers
Der gereinigte ternäre Troponin-Komplex (Bio-Tech International, Inc.) wurde wie in Beispiel 13 beschrieben auf Troponin I untersucht, abgesehen davon, dass das im Titel angegebene Antikörperpaar im Immunassay verwendet wurde und das Aliquots des Reaktionsgemisches aus den Antikörpern und der Troponin-Probe 3 Stunden nach Zugabe der Antikörper zum Troponin entnommen wurde. Die fraktionelle Assay-Antwort betrug in Abwesenheit von Bindungsinhibitoren 0.16 und in Gegenwart von Bindungsinhibitoren 0.49.
Die Daten zeigen, dass das im Titel angegebene Antikörperpaar Troponin I im ternären Komplex schlecht erkennt. In Beispiel 10 wurde gezeigt, dass die Gegenwart von Troponin C ohne Troponin T einen geringen Einfluss auf die Erkennung von Troponin I durch das im Titel angegebene Antikörperpaar hat. Demzufolge kann dieses Antikörperpaar Troponin I, das im binären Komplex mit Troponin C vorliegt, besser binden als es Troponin I binden kann, das im ternären Komplex vorliegt.
Beispiel 21
Immunassay von Troponin I mit Plasma eines Patienten mit bestätigtem Herzinfarkt unter Verwendung des TRI-7 F81 anti-Troponin Ikonjugat-Antikörpers und des biotinylierten anti-Troponin I/Peptid 1-spezifischen Antikörpers
Gefrorenes Plasma eines Patienten mit bestätigtem Herzinfarkt wurde aufgetaut, in humanem Serum (Hybritech Incorporated, San Diego, California) verdünnt, das weiterhin 0.5 M Natriumchlorid enthielt, und mit dem im Titel angegebenen Antikörperpaar unter Verwendung von Protokoll A, Beispiel 2 auf Troponin I untersucht. Oxidiertes, gereinigtes humanes kardiales Troponin I (University of Birmingham) wurde untersucht und dazu verwendet, eine Standardkurve zu erstellen, aus der das Troponin I im Plasma bestimmt wurde.
Die unverdünnte Plasmaprobe wurde in einem –70°C-Gefrierschrank erneut eingefroren, nachdem sie für mehrere Stunden auf Eis gehalten wurde. Das gefrorene Plasma wurde bei Raumtemperatur erneut aufgetaut und unter Verwendung des gleichen Protokolls wie oben beschrieben untersucht, außer dass die Plasma- und Troponin I-Standards in Assaypuffer verdünnt wurden. Die Standards zeigten nahezu identische Assay-Steigungen, wenn sie in Serum (erster Assay) oder Assaypuffer (zweiter Assay) verdünnt worden. Die unverdünnte Plasmaprobe wurde für die in Tabelle 12 angegebenen Zeiten weiter bei 4°C inkubiert und in Assaypuffer erneut untersucht.

Die Daten zeigen einen substanziellen Anstieg in der gemessenen Troponin I-Konzentration nach einem Einfrier/Auftau-Zyklus und nach Inkubation bei 4°C. Diese Assay-Instabilität kann mit der Öffnung oder dem partiellen Aufwinden des ternären Troponin-Komplexes durch den Einfrier/Auftau-Zyklus assoziiert sein. TABELLE 12

Zeitpunkt des Assays	Gemessene Troponin I-Konzentration
Nach dem ersten Auftauen des Plasmas	284 ng/ml
2 Stunden nach dem zweiten Auftauen des Plasmas	> 800 ng/ml
19 Stunden nach dem zweiten Auftauen des Plasmas	1760 ng/ml
90 Stunden nach dem zweiten Auftauen des Plasmas	2300 ng/ml

Beispiel 22
Expression, Screening und Selektion von rekombinanten Antikörpern (Bindungsfragmenten oder Fab-Fragmenten)
Immunisierung von Mäusen
Mäuse wurden entsprechend der nachfolgenden Methode immunisiert. Jede der zehn Mäuse wurde intraperitonial unter Verwendung von 50 μg Porteinantigen (Troponin I und ternärer Troponin-Komplex), das in Freund's komplettem Adjuvans emulgiert war, am Tag 0 und am Tag 28 immunisiert. Testblutungen der Mäuse wurden durch Punktieren des retro-orbitalen Sinus erhalten. Sofern die für das biotinylierte Antigen bestimmten Titer hoch waren, wurden die Mäuse mit 50 μg Portein am Tag 70, 71 und 72 geboostet, mit anschließender Tötung und Milzentfernung am Tag 77. Falls die Antikörper-Titer nicht ausreichend waren, wurde die Mäuse mit 50 μg Antigen am Tag 56 geboosted, und eine Testblutung wurde am Tag 63 durchgeführt. Sofern ausreichende Titer erhalten wurden, wurden die Tiere mit 50 μg Antigen am Tag 98, 99 und 100 geboostet, und die Milzen wurden am Tag 5 extrahiert.
Phage Display-Antikörperbibliotheken
Mäuse mit hohen Titern an Antikörpern gegenüber dem gewünschten Proteinantigen (Troponin I oder ternärer Troponin-Komplex) wurden getötet, und Gesamt-RNA wurde aus den Milzzellen gereinigt (Anal. Biochem. 162: 156–159 (1987)). Die Gesamt-RNA (50 μg) aus dem Milzzellen wurde direkt als Template für Superscript^TM II Reverse Transcriptase (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) mit Oligo (dT)₁₂ als Primer verwendet, um cDNA für eine PCR herzustellen. Insgesamt wurden 32 PCR-Reaktionen verwendet, um die variablen Regionen der schweren Kette (”heavy chain”) mit Hilfe von Taq DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 3 μl cDNA pro Reaktion, 32 verschiedenen 5'-Oligonukleotiden und einem einzelnen 3'-Oligonukleotid zu amplifizieren. Die variablen Regionen der Kappa-Kette wurden auf ähnliche Weise unter Verwendung von 29 verschiedenen 5'-Oligonukleotiden und einem einzelnen 3'-Oligonukleotid amplifiziert. Die Oligonukleotide wurden zuvor auf Grundlage einer Zusammenstellung von Maus-Antikörpersequenzen (Sequences of Proteins of immunological interest. Vol. 2, 5th Edition, 1991, Cambridge, MA) konzipiert, um sicherzustellen, dass nahezu alle in der Milz vorliegenden variablen Antikörperregionen mit nicht mehr als zwei Veränderungen in der tatsächlichen Aminosäuresequenz amplifiziert würden, welche durch Fehlpaarungen der Oligonukleotide mit der cDNA verursacht wurden. Ein Aliquot jedes doppelsträngigen PCR-Produkts wurde ein zweites Mal unter Verwendung nur des 3'-Oligonukleotids amplifiziert, um eine einzelsträngige DNA (ssDNA) zu erzeugen. Die ssDNA-Produkte aller Amplifikationsreaktionen der Kappa-Kette wurden vereinigt, und die ss-DNA-Produkte aller Amplifikationsreaktionen der schweren Kette wurden separat vereinigt. Die ssDNA jeder der vereinigten Proben wurde unter Verwendung von High Performance Liquid Chromatography (HPLC) und einer Genpak Fax HPLC-Säule (Waters Inc., Milford, MA) gereinigt. Die gereinigte ssDNA wurde zur Durchführung der Mutagenese eines M13 Uracil-Templates verwendet, gefolgt von Standardverfahren der oligo-gerichteten Mutagenese (J. Immunol. 149: 3903–3913 (1992)). Das M13 Template enthält DNA-Sequenzen, die komplementär zu den 5'- und 3'-Enden der ssDNA sowohl der variablen Regionen der schweren Kette als auch der Kappa-Kette sind. Wenn die variablen Regionen der schweren Kette und der Kappa-Kette mit dem M13-Vektor hybridisiert (”annealed”) werden, wurde als Ergebnis ein Gemisch verschiedener Antikörpersequenzen erzeugt. Die erhaltenen Antikörper wurden als Fab-Antikörperfragmente exprimiert, welche die gesamte Kappa-Kette und die variable Region der schweren Kette verbunden mit der ersten konstanten Region der schweren Kette umfassen. Elektrokompetente Zellen (DH12S, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) wurden mittels Elektroporation mit der erhaltenen M13-DNA transformiert. Eine typische Elektroporation von 500 ng M13 Vektor in 40 μl DH12S-Zellen ergab 10⁷ bis 10⁸ verschiedene Antikörperklone. Die Klone wurden weiter amplifiziert, um eine Phage Display-Antikörperbibliothek zu erzeugen. Der M13 Vektor wurde derart konzipiert, dass die schwere Kette als Fusionsprotein mit dem Haupthüllprotein (”major coat Protein”) von M13, dem Gen VIII-Protein, exprimiert wurde. Auf jedem Phagenpartikel gibt es annähernd 2700 Kopien des Gen VIII-Proteins. Nachdem das schwere Kette/Gen VIII-Fusionsprotein in das Periplasma von E. coli sekretiert wurde, bindet die sekretierte Kappa-Kette an die schwere Kette, um ein funktionelles Fab-Antikörperfragment zu bilden. Dies führt zur Produktion von Phagen mit funktionellen Antikörpern auf der Phagenoberfläche und mit der DNA, die den Antikörper kodiert, verpackt im Phageninneren.
Screening der Phage Display-Antikörperbibliotheken
Die Phage-Display-Antikörper-Bibliothek, die aus der Elektroporation der mutagenisierten M13 DNA in E. coli erhalten wurde, besteht aus vielen verschiedenen Antikörpern, die auf Phagen-Partikeln präsentiert werden (Antikörper-Phage). Die Anzahl hochaffiner Antikörper gegenüber dem Proteinantigen ist niedrig. Das nachfolgende Screening-Verfahren wurde entwickelt, um Antikörper zu isolieren, die spezifisch für Troponin I und den ternären Troponin-Komplex sind. Antikörper-Phagen wurden mit biotinyliertem oxidiertem Troponin I (10^–9 M, 10 Biotine/Protein) oder biotinyliertem ternären Troponin-Komplex (10^–9 M, 11 Biotine/Protein) in Lösung bis zum Gleichgewicht inkubiert. Die Antikörper-Phagen, die an das biotinylierte Proteinantigen binden, wurden durch Inkubation mit magnetischem Latex isoliert, der mit Avigen beschichtet ist. Nicht-spezifische Antikörper-Phagen wurden weggewaschen, und Antikörper-Phagen, die an den Latex banden, wurden eluiert und durch Anzucht in E. coli XL1 Blue-Zellen (Stratagene, La Jolla, CA) amplifiziert. Die amplifizierten Antikörper-Phagen wurden im Anschluss einer zweiten Selektionsrunde unterworfen. Da die Inkubation von biotinyliertem Proteinantigen und Antikörper-Phagen in Lösung durchgeführt wurde, wurde die Konzentration des biotinylierten Proteinantigens eingestellt, um nur hochaffine Antikörper zu selektieren. Der oben beschriebene Prozess wurde wiederholt, bis die Antikörper-Phagen zu einem hohen Prozentanteil aus Phagen bestanden, die Troponin-Antikörper kodierten. Die Antikörper-Sequenzen waren anschließend bereit zur Subklonierung.
Antikörper-Subklonierung
Die gesamte Antikörper DNA-Sequenz wurde mit Hilfe eines 5'-Oligonukleotids, das an die Signalsequenz der Kappa-Kette bindet, die auf der 5'-Seite der schweren Kette liegt, und einem 3'-Oligonukleotid amplifiziert, das an das Ende der Sequenz der konstanten Region der schweren Kette bindet. Nach der Amplifikation wurde die DNA mit Hilfe von Agarose-Gelelektrophorese gereinigt, anschließend hybridisiert und in einen pBR322 Expressionsvektor ligiert. Die Transformation von DH10B Zellen mittels Elektroporation wurde mit dieser DNA durchgeführt, und die Zellen wurden auf Tetracyclin-Platten angezogen, um Klone zu selektieren, welche die inserierte DNA enthielten. Die Kolonien wurden in 3 ml 2YT-Medium mit 10 μg/ml Tetracyclin transferiert, und die Kulturen wurden über Nacht bei 37°C angezogen. Übernacht-Kulturen der Zellen wurden 1:100 in 50 ml 2YT-Medium mit 1% Glycerin und 10 mg/ml Tetracyclin in 250 ml Schikane-Schüttelkolben (”baffled shake flasks”) verdünnt, um zur Untersuchung ausreichend Antikörper zu erhalten. Die Kulturen wurden bei 37°C angezogen, bis die Absorption der Kultur bei 600 nm zwischen 2 und 4 lag. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Kulturen induziert, und über Nacht bei 23°C angezogen. Die Zellen wurden in einem Hochdruck-Homogenisator zerstört, und der Antikörper wurde gereinigt.
Antikörper-Charakterisierung durch Epitop-Kartierung (”epitope mapping”)
Die erzeugten Antikörper wurden bzgl. ihrer Fähigkeit zur Durchführung eines Doppel-Antikörper-, Festphasen-, nicht-kompetiven Enzym-Immunassays (”sandwich assay”) charakterisiert. Antikörper Fab-Fragmente (Fab) wurden selektiert, um distinkt verschiedene Epitope auf dem Proteinantigen zu binden, sodass die Bindung des einen Fab die Bindung des zweiten Fab nicht sterisch behinderte. Das Proteinantigen wurde unter Verwendung von Biotin-XX-NHS-Ester (Molecular Probes, Portland, OR) mit Biotin markiert. Die Biotinylierung des Proteinantigens war hinsichtlich des molaren Verhältnisses von Biotin zu Protein (im Durchschnitt 4 Biotine/Protein) ausreichend niedrig, sodass die Wahrscheinlichkeit minimal war, dass ein Epitop mit Bezug auf die native Struktur der Antikörper-Bindungsstelle wesentlich beeinträchtigt wird. Das erste Fab-Fragment wurde in den Wells einer Mikrotiter-Platte inkubiert, welche adsorbierte, affinitätsgereinigte Ziege-anti-Maus-Fab enthielten. Die Wells wurden gewaschen und eine Blockierungslösung, die ein nicht-spezifisches Maus-Fab in hohen Konzentrationen enthielt, wurde in jedes Well gegeben, um die verbliebenen anti-Fab-Bindungsstellen zu sättigen. In separatem Wells der Mikrotiter-Platte wurde das zweite Fab-Fragment bis zum Gleichgewicht mit dem biotinyliertem Proteinantigen inkubiert. Das zweite Fab lag in einem erheblichen molaren Überschuss über das biotinylierte Proteinantigen vor. Das Gemisch aus dem zweiten Fab und dem biotinyliertem Protein wurde zu den Wells der Mikrotiter-Platte gegeben, die mit dem ersten Fab beschichtet waren, und anschließend inkubiert. Ein Konjugat aus Streptavidin und alkalischer Phosphatase wurde zu dem Gemisch gegeben, um das biotinylierte Protein zu binden, um das Vorhandensein des Proteinantigens zu detektieren. Die Wells der Mikrotiter-Platte wurden gewaschen, und die Gegenwart der gebundenen alkalischen Phosphatase wurde durch Zugabe von Phenolphthalein-Monophosphat detektiert, und die Rate der Produktbildung wurde mit Hilfe eines spektrophotometrischen Mikrotiterplatten-Lesegeräts bei 560 nm bestimmt. Der Überschuss an nicht-spezifischen Maus-Fab im Gemisch verhinderte die Bindung des zweiten Fab's an das anti-Fab, das an die Wells der Mikrotiter-Platte adsorbiert war. Kontrollen wurden unter Verwendung der gleichen Fab durchgeführt wie die ersten und zweiten Fab, um zu zeigen, dass nur eine sehr geringe Bindung der alkalischen Phosphatase an das Well der Mikrotiterplatte beobachtet wurde, wenn das Epitop, das durch das zweite Fab gebunden wird, das gleiche ist als das erste. Falls die zwei verschiedenen Fab-Fragmente, die getestet werden, an verschiedene Epitope auf demselben Protein binden können, dann ist die Menge der Aktivität der alkalischen Phosphatase, die an das Well gebunden ist, wesentlich größer als die der Kontrolle. Der Vorteil dieses Assayverfahrens liegt darin, dass die Antikörper unmarkiert sind, sodass viele Antikörper schnell untersucht werden können, um zu bestimmen, ob sie distinkt verschiedene Epitope binden. Die Anzahl der distinkten Epitope wurde bestimmt, und die Antikörper wurden gemäß ihrer Epitop-Spezifität gruppiert.
Beispiel 23
Charakterisierung und Selektion von komplementären Antikörperpaaren zur Erkennung von oxidiertem und reduziertem freien Troponin I und von Troponin I, das im ternären Komplex gebunden ist
Antikörper, die gegen Troponin I gerichtet sind, wurden in einem Sandwich-Immunassay in Paaren bestehend aus einem Antikörperkonjugat-Antikörper und einem komplementären biotinyliertem Antikörper untersucht (Beispiel 1). Die getesteten Antikörper waren rekombinante anti-Troponin I Antikörper, die ursprünglich gegen freies Troponin I erzeugt wurden, die aber selektiert wurden, um sowohl freies Troponin I als auch Troponin I im ternären Komplex zu binden (Beispiel 22). Ebenfalls untersucht wurde ein Ziege-anti-Troponin I/Peptid 3-spezifischer polyklonaler Antikörper.
Gereinigter humaner kardialer ternärer Troponin-Komplex (Bio-Tech International) wurde in Assaypuffer verdünnt und mit den in Tabelle 13 dargestellten komplementären Antikörperpaaren analysiert (Protokoll A, Beispiel 2). Die Ergebnisse sind als Assay-Steigung mit OD₄₉₀-Einheiten pro ng/ml Gesamt-Troponin I im linearen Bereich des Assays ausgedrückt. Eine höhere Steigung zeigt eine bessere Bindung der Antikörper an Troponin I an.
Troponin I wurde hergestellt durch Dissoziieren der Komponenten des ternären Troponin-Komplexes unter oxidierenden (nachfolgend als dissoziierte/oxidierte Probe bezeichnet) und reduzierenden Bedingungen (nachfolgend als dissoziierte/reduzierte Probe bezeichnet). Der gereinigte humane kardiale ternäre Troponin-Komplex wurde in einer Konzentration von 4 μg/ml für 4 Stunden bei Raumtemperatur in einem Dissoziationspuffer bestehend aus 50 mM 3-(N-morpholino)-propansulfonsäure, 150 mM Natriumchlorid, 6 M Harnstoff, 10 mM EDTA und 0.05 mM Melittin, pH 7.0 inkubiert, um die dissoziierte/oxidierte Probe zu erzeugen. Die dissoziierte/oxidierte Probe wurde auf 1–30 ng/ml (Gesamtproteinkonzentration) in Assaypuffer verdünnt und mit den in Tabelle 13 dargestellten komplementären Antikörperpaaren analysiert (Protokoll A, Beispiel 2). Das gleiche Verfahren wurde verwendet, um die dissoziierte/reduzierte Probe zu erzeugen und zu analysieren, abgesehen davon, dass der Dissoziations- und der Assaypuffer ferner 1.5 mM DTT enthielten, um das intramolekulare Disulfid von Troponin I zu reduzieren.
Um zu zeigen, dass das Dissoziationsverfahren freies Troponin I im Hinblick auf Assays von freiem Troponin I nicht schädigt, wurde gereinigtes oxidiertes Troponin I (Bio-Tech International) mit Hilfe dieses Verfahrens behandelt, um die dissoziierte/oxidierte Probe zu erzeugen, und wurde im Anschluss mit zehn verschiedenen komplementären Antikörperpaaren (den Paaren 19–28 in Tabelle 13) analysiert. Die Assay-Ergebnisse (nicht gezeigt) wurden mit denen verglichen, die mit gereinigtem oxidierten Troponin I erhalten wurden, das nicht mit dem Dissoziationsverfahren behandelt wurde. Für keines der zehn getesteten Antikörperpaare wurde ein signifikanter Unterschied zwischen den Assay-Ergebnissen für das behandelte und das unbehandelte gereinigte Troponin I beobachtet.
Das Antikörperpaar (#29, Tabelle 13) bestehend aus dem biotinylierten 9B1 anti-Troponin T monoklonalen sowie dem Ziege-anti-Troponin I/Peptid 3-spezifischen polyklonalen Konjugat-Antikörper erkennt Troponin I nicht, das aus dem ternären Komplex dissoziiert ist (Beispiel 15), was konsistent mit der Assay-Steigung von 0 ist, die für dieses Antikörperpaar mit der dissoziierten/oxidierten und der dissoziierten/reduzierten Probe erhalten wurde.

Die Daten (Tabelle 13) zeigen, dass gegen Troponin I gerichtete Antikörper generiert und selektiert werden können, um einen Immunassay zu bilden, der im wesentlichen die gleiche Assay-Antwort (Steigung) für Troponin im ternären Komplex, die dissoziierte/oxidierte und die dissoziierte/reduzierte Probe liefert (zum Beispiel Antikörperpaar #17). Damit könnte ein Antikörperpaar, wie etwa #17, zur Messung der Gesamtkonzentration von Troponin in einer Probe verwendet werden, welche alle Formen von Troponin enthält, die untersucht wurden. Das zur Generierung und Selektion der Antikörper verwendete Verfahren erzeugt Antikörper, die gute Kandidaten zur Verwendung in einem Assay sind, welcher oxidiertes und reduziertes freies Troponin I und Troponin I im ternären Komplex im Blut von Patienten misst, die einen Herzinfarkt erlitten haben. TABELLE 13

Paar #	Konjugat-Antikörper	Biotinylierter Antikörper	Assay-Steigung (OD₄₉₀ pro ng/ml Troponin I)
Paar #	Konjugat-Antikörper	Biotinylierter Antikörper	Ternärer Komplex	Dissoziiert (oxidiert)	Dissoziiert (reduziert)
1	Ziege-anti-Troponin I Peptid 3-spezifisch	Rekombinant anti-Troponin I #4	0.78	0.72	1.23
2	Ziege-anti-Troponin I Peptid 3-spezifisch	Rekombinant anti-Troponin I #16	0.77	0.55	0.53
3	Ziege-anti-Troponin I Peptid 3-spezifisch	Rekombinant anti-Troponin I #19/33	1.07	0.77	0.77
4	Ziege-anti-Troponin I Peptid 3-spezifisch	Rekombinant anti-Troponin I #28/36	0.58	0.67	1.03
5	Ziege-anti-Troponin I Peptid 3-spezifisch	Rekombinant anti-Troponin I #49	0.73	0.51	0.52
6	Ziege-anti-Troponin I Peptid 3-spezifisch	Rekombinant anti-Troponin I #50	0.70	0.61	0.98
7	Ziege-anti-Troponin I Peptid 3-spezifisch	Rekombinant anti-Troponin I #51	0.89	0.66	0.69
8	Ziege-anti-Troponin I Peptid 3-spezifisch	Rekombinant anti-Troponin I #53	0.55	0.86	0.89
9	Ziege-anti-Troponin I Peptid 3-spezifisch	Rekombinant anti-Troponin I #26	0.21	.0.12	0.18
10	Ziege-anti-Troponin I Peptid 3-spezifisch	Rekombinant anti-Troponin I #27	0.54	0.38	0.46
11	Ziege-anti-Troponin I Peptid 3-spezifisch	Rekombinant anti-Troponin I #29	0.78	0.58	0.60
12	Ziege-anti-Troponin I Peptid 3-spezifisch	Rekombinant anti-Troponin I #31	0.60	0.52	0.64
13	Ziege-anti-Troponin I Peptid 3-spezifisch	Rekombinant anti-Troponin I #32	0.78	0.64	0.58
14	Ziege-anti-Troponin I Peptid 3-spezifisch	Rekombinant anti-Troponin I #54	0.23	0.54	0.45
15	Ziege-anti-Troponin I Peptid 3-spezifisch	Rekombinant anti-Troponin I #55	0.23	0.52	0.47
16	Ziege-anti-Troponin I Peptid 3-spezifisch	Rekombinant anti-Troponin I #56	0.69	0.99	1.05
17	Ziege-anti-Troponin I Peptid 3-spezifisch	Rekombinant anti-Troponin I #57	1.02	1.08	1.08
18	Ziege-anti-Troponin I Peptid 3-spezifisch	Rekombinant anti-Troponin I #58	0.39	0.90	0.95
19	Rekombinant anti-Troponin I #49	Rekombinant anti-Troponin I #4	0.48	0.52	1.06
20	Rekombinant anti-Troponin I #49	Rekombinant anti-Troponin I #28/36	0.21	0.41	0.96
21	Rekombinant anti-Troponin I #49	Ziege-anti-Troponin I Peptid 3-spezifisch	1.18	1.12	1.25
22	Rekombinant anti-Troponin I #51	Rekombinant anti-Troponin I #4	2.42	3.31	7.63
23	Rekombinant anti-Troponin I #51	Rekombinant anti-Troponin I #28/36	1.20	2.52	5.69
24	Rekombinant anti-Troponin I #50	Rekombinant anti-Troponin I #16	1.33	0.53	1.20
25	Rekombinant anti-Troponin I #50	Rekombinant anti-Troponin I #19/33	1.93	0.81	1.95
26	Rekombinant anti-Troponin I #50	Ziege-anti-Troponin I Peptid 3-spezifisch	1.92	1.52	2.12
27	Rekombinant anti-Troponin I #53	Rekombinant anti-Troponin I #16	1.58	3.33	3.49
28	Rekombinant anti-Troponin I #53	Rekombinant anti-Troponin I #33/79	1.60	3.75	4.28
29	Ziege-anti-Troponin I Peptid 3-spezifisch	9B1 anti-Troponin I monoklonal	0.47	0.00	0.00

Beispiel 24
Einfluss von Protamin und Melittin auf die nicht-spezifische Absorption von Troponin an Latexpartikel
Avidin-HS beschichteter magnetischer Latex (Beispiel 1) wurde gewaschen und als 1% Feststoff in drei verschiedenen Verdünnungsmitteln resuspendiert: Serum (Hybritech Inc., San Diego, CA), Serum mit 0.2 mg/ml Protaminchlorid und Serum mit 0.1 mM Melittin. Ein 125 μl Volumen jeder resuspendierten Latexlösung wurde mit einem 125 μl Volumen Serum gemischt, welches entweder 6 ng/ml oxidiertes gereinigtes Troponin I (Bio-rech International, Inc.) oder 18 ng/ml gereinigten ternären Troponin-Komplex enthielt, um eine Lösung aus Troponin und Latex zu erzeugen. Weiterhin wurde ein 125 μl Volumen Serum, Serum mit 0.2 mg/ml Protaminchlorid oder Serum mit 0.1 mM Melittin mit einem 125 μl Volumen Serum gemischt, das entweder 6 ng/ml oxidiertes gereinigtes Troponin I oder 18 ng/ml gereinigten ternären Komplex enthielt, um eine Lösung aus Troponin ohne Latex zu erzeugen. Die Lösungen wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Latex wurde pelletiert und die Überstände gesammelt. Die Überstände der Lösungen aus Troponin und Latex sowie der Lösungen aus Troponin ohne Latex wurde unter Verwendung des Antikörperpaars #17 (Tabelle 13) auf Troponin untersucht (Protokoll A, Beispiel 2, außer dass Serum anstelle von Assaypuffer verwendet wurde), um die Konzentration von Troponin zu bestimmen. Für jedes Verdünnungsmittel wurde die in den Überständen der Lösungen aus Troponin und Latex (Tabelle 14) zurückgewonnene Fraktion an Troponin durch Dividieren der gemessenen Troponin-Konzentration im Überstand der Lösung aus Troponin und Latex durch die gemessene Troponin-Konzentration in der Lösung aus Troponin ohne Latex bestimmt.
Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl Melittin als auch Protaminchlorid die Rückgewinnung von Troponin erhöhen, was anzeigt, dass Melittin und Protaminchlorid die nicht-spezifische Absorption von Troponin an den Latex reduzieren. TABELLE 14

Fraktion des im Überstand zurückgewonnenen Troponins

Troponin-Form Ohne Zugabe + Protaminchlorid + Melittin

Freies oxidiertes Troponin I 0.49 0.73 0.80

Troponin-Komplex 0.58 0.87 0.77
Beispiel 25
Einfluss von Protamin und Melittin auf die Assay-Antwort eines Sandwich-Immunassays für Troponin, der Latexpartikel verwendet
Avidin-HS-magnetischer Latex (Beispiel 1) wurde gewaschen und als 1% Feststoff in zwei verschiedenen Verdünnungsmitteln resuspendiert: Assaypuffer und Assaypuffer mit 0.1 mM Melittin. In dem Wells einer Mikrotiterplatte wurden 25 μl jeder resuspendierten Latexlösung mit 25 μl Assaypuffer gemischt, der gereinigtes oxidiertes Troponin I (Bio-Tech International) in verschiedenen Konzentrationen zwischen 0–16 ng/ml enthielt, um eine Lösung aus Troponin I und Latex zu erzeugen. Die Lösungen wurden bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Zu jedem Well wurden 50 μl einer Lösung bestehend aus den beiden Antikörpern des Paars #17 (Tabelle 13), jeder in einer Konzentration von 2.5 μg/ml, gegeben, um ein Reaktionsgemisch zu erzeugen. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten inkubiert, und der Latex wurde im Anschluss pellitiert, gewaschen und weiter behandelt wie in Protokoll A (Beispiel 2) beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 als Assay-Steigung mit OD₄₉₀-Einheiten pro ng/ml Troponin I ausgedrückt.
Die Daten zeigen, dass die Zugabe von Melittin zum Assay die Assay-Antwort etwa um einen Faktor zwei erhöht, und dadurch die Sensitivität des Assays gegenüber Troponin I erhöht. Die Inkorporation von Protamin (in einer Konzentration von 0.03–0.1 mg/ml) und Melittin (in einer Konzentration von 0.017–0.05 mM) zu einem Immunassay für Troponin I, der Latexpartikel verwendet, erhöhte die Assay-Antwort um Faktoren von 30% bis 400% (Daten nicht gezeigt). TABELLE 15

Additive Assay-Steigung

Keines 0.021

Melittin 0.040

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Menge ungebundener und komplexierter Formen von herzspezifischem Troponin I in einer Blutprobe, wobei die ungebundenen und komplexierten herzspezifischen Formen von Troponin I sind: (1) der ternäre Komplex, der oxidiertes Troponin I, Troponin T und Troponin C umfasst, wobei Troponin I herzspezifisch ist; (2) der ternäre Komplex, der reduziertes Troponin I, Troponin T und Troponin C umfasst, wobei Troponin I herzspezifisch ist; (3) der binäre Komplex, der oxidiertes Troponin I und Troponin T umfasst, wobei Troponin I herzspezifisch ist; (4) der binäre Komplex, der reduziertes Troponin I und Troponin T umfasst, wobei Troponin I herzspezifisch ist; (5) der binäre Komplex aus oxidiertem Troponin I und Troponin C, wobei Troponin I herzspezifisch ist; (6) der binäre Komplex aus reduziertem Troponin I und Troponin C, wobei Troponin I herzspezifisch ist; (7) ungebundenes, herzspezifisches, oxidiertes Troponin I; und (8) ungebundenes, herzspezifisches, reduziertes Troponin I; wobei das Verfahren die Durchführung eines Immunassays mit einem oder mehreren Antikörpern umfasst, die spezifisch für herzspezifisches Troponin I sind, wobei die Antikörper ausgewählt werden bzw. sind, um an die ungebundenen und komplexierten Formen von herzspezifischem Troponin I zu binden, und wobei ein detektierbares Signal des Immunassays auf die Menge des ungebundenen und komplexierten herzspezifischen Troponins I in der Probe bezogen ist.
Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Menge von ungebundenen und komplexierten Formen von herzspezifischem Troponin T in einer Blutprobe, wobei die ungebundenen und komplexierten herzspezifischen Formen von Troponin T sind: (1) der ternäre Komplex, der oxidiertes Troponin I, Troponin T und Troponin C umfasst, worin Troponin T herzspezifisch ist; (2) der ternäre Komplex, der reduziertes Troponin I, Troponin T und Troponin C umfasst, worin Troponin T herzspezifisch ist; (3) der binäre Komplex, der oxidiertes Troponin I und Troponin T umfasst, worin Troponin T herzspezifisch ist; (4) der binäre Komplex, der reduziertes Troponin I und Troponin T umfasst, worin Troponin T herzspezifisch ist; (9) der binäre Komplex, der Troponin T und Troponin C umfasst, worin Troponin T herzspezifisch ist; und (10) ungebundenes, herzspezifisches Troponin T; wobei das Verfahren die Durchführung eines Immunassays mit einem oder mehreren Antikörpern umfasst, die spezifisch für herzspezifisches Troponin T sind, wobei die Antikörper ausgewählt werden bzw. sind, um an die ungebundenen und komplexierten Formen von herzspezifischem Troponin T zu binden, und wobei ein detektierbares Signal des Immunassays auf die Gegenwart oder Menge des ungebundenen und komplexierten herzspezifischen Troponins T in der Probe bezogen ist.
Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Menge von ungebundenen und komplexierten Formen von herzspezifischem Troponin I und Troponin T in einer Blutprobe, worin die ungebundenen und komplexierten Formen von herzspezifischem Troponin I und Troponin T sind: (1) der ternäre Komplex, der oxidiertes Troponin I, Troponin T und Troponin C umfasst, wobei Troponin I und/oder Troponin T herzspezifisch sind; (2) der ternäre Komplex, der reduziertes Troponin I, Troponin T und Troponin C umfasst, wobei Troponin I und/oder Troponin T herzspezifisch sind; 3) der binäre Komplex, der oxidiertes Troponin I und Troponin T umfasst, wobei Troponin I und/oder Troponin T herzspezifisch sind; (4) der binäre Komplex, der reduziertes Troponin I und Troponin T umfasst, wobei Troponin I und/oder Troponin T herzspezifisch sind; (5) der binäre Komplex aus oxidiertem Troponin I und Troponin C, wobei Troponin I herzspezifisch ist; (6) der binäre Komplex aus reduziertem Troponin I und Troponin C, wobei Troponin I herzspezifisch ist; (7) ungebundenes, herzspezifisches, oxidiertes Troponin I; (8) ungebundenes, herzspezifisches, reduziertes Troponin I; (9) der binäre Komplex, der Troponin T und Troponin C umfasst, wobei Troponin T herzspezifisch ist; und (10) ungebundenes, herzspezifisches Troponin T, wobei das Verfahren die Durchführung eines Immunassays mit einem oder mehreren Antikörpern umfasst, die spezifisch für herzspezifisches Troponin I und Troponin T sind, wobei die Antikörper ausgewählt werden bzw. sind, um an die ungebundenen und komplexierten Formen von herzspezifischem Troponin I und Troponin T zu binden, und wobei ein detektierbares Signal des Immunassays auf die Gegenwart oder Menge von ungebundenem und komplexiertem herzspezifischen Troponin I und Troponin T in der Probe bezogen ist.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Schritt des Durchführens eines Immunassays einen Sandwich-Immunassay umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, wobei der Schritt des Durchführens eines Immunassays das Bereitstellen umfasst von: einem oder mehreren Antikörpern, die ausgewählt werden bzw. sind, um an die ungebundenen und komplexierten Formen von herzspezifischem Troponin I und/oder T zu binden, welche mit einem signalerzeugenden Element konjugiert sind; oder einem oder mehreren Festphasen-Antikörpern, die ausgewählt werden bzw. sind, um an die ungebundenen und komplexierten Formen von herzspezifischem Troponin I und/oder T zu binden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Assay ein Verfahren zur Diagnose eines myokardialen Infarkts bereitstellt, und wobei das Verfahren die Korrelation der Ergebnisse des Immunassays mit dem Vorhandensein der komplexierten herzspezifischen Form von Troponin in der Probe einschließt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Assay umfasst: (a) Bereitstellen von einem oder mehreren Antikörpern, die spezifisch an die ungebundenen und komplexierten Formen von herzspezifischem Troponin I in den Formen 1 bis 8 von Anspruch 1 binden, welche mit einem Mittel zur Erzeugung eines Signals konjugiert sind; (b) Inkontaktbringen der Probe mit dem Antikörperkonjugat aus Schritt (a), wodurch die Antikörperkonjugate an die in der Probe vorhandenen Troponin-Komplexe binden; (c) Inkontaktbringen der Probe mit einer Festphase, an die mindestens ein Fänger-Antikörper gebunden ist, der spezifisch an diejenigen Troponin-Formen bindet, die an das Antikörperkonjugat gebunden sind, oder der spezifisch an diejenigen Troponin-Formen bindet, die an das Antikörperkonjugat gebunden sind, nachdem sie an den Fänger-Antikörper gebunden haben, wodurch das detektierbare Signal von dem Antikörperkonjugat nach Bindung der Formen von Troponin, die an das Antikörperkonjugat gebunden sind oder werden, an die Festphase vorliegt; und (d) Inbezugbringen des detektierbaren Signals mit der Menge an ungebundenem und komplexiertem herzspezifischem Troponin I in der Probe.
Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei der Assay umfasst: (a) Bereitstellen von einem oder mehreren Antikörpern, die spezifisch an die ungebundenen und komplexierten Formen von herzspezifischem Troponin T in den Formen 1 bis 4, 9 und 10 von Anspruch 2 binden, welche mit einem Mittel zur Erzeugung eines Signals konjugiert sind; und/oder Bereitstellen von einem oder mehreren Antikörpern, die spezifisch an die ungebundenen und komplexierten Formen von herzspezifischem Troponin T und I in den Formen 1 bis 4, 7, 8 und 10 von Anspruch 3 binden, welche mit einem Mittel zur Erzeugung eines Signals konjugiert sind; (b) Inkontaktbringen der Probe mit dem Antikörperkonjugat aus Schritt (a), wodurch die Antikörperkonjugate an die in der Probe vorhandenen Troponin-Komplexe binden; (c) Inkontaktbringen der Probe mit einer Festphase, an die mindestens ein Fänger-Antikörper gebunden ist, der spezifisch an diejenigen Troponin-Formen bindet, die an das Antikörperkonjugat gebunden sind, oder der spezifisch an diejenigen Troponin-Formen bindet, die an das Antikörperkonjugat gebunden sind, nachdem sie an den Fänger-Antikörper gebunden haben, wodurch das detektierbare Signal von dem Antikörperkonjugat nach Bindung der Formen von Troponin, die an das Antikörperkonjugat gebunden sind oder werden, an die Festphase vorliegt; und (d) Inbezugbringen des detektierbaren Signals mit der Gegenwart oder Menge an ungebundenem und komplexiertem herzspezifischem Troponin T oder herzspezifischem Troponin T und I in der Probe.
Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei der Immunassay für jede Form ein quantitatives Ergebnis bereitstellt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei herzspezifisches Troponin I in den Formen 1 bis 8 von Anspruch 1 in einer Blutprobe detektiert wird, wobei das komplexierte herzspezifische Troponin I in einer oder mehrerer der Formen 1 bis 6 von Anspruch 1 vorliegt, wobei der Immunassay mit einem Antikörper durchgeführt wird, der spezifisch für herzspezifisches Troponin I ist und an eine oder mehrere der Formen 1 bis 6 von Anspruch 1 in der Probe bindet, wobei das detektierbare Signal die Menge des ungebundenen und komplexierten herzspezifischen Troponins I in der Blutprobe betrifft.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei herzspezifisches Troponin T in den Formen 1 bis 4, 9 und 10 von Anspruch 2 in einer Blutprobe detektiert wird, wobei das komplexierte herzspezifische Troponin T in einer oder mehreren der Formen 1 bis 4 oder 9 von Anspruch 2 vorliegt, wobei der Immunassay mit einem Antikörper durchgeführt wird, der spezifisch für herzspezifisches Troponin T ist und eine oder mehreren der Formen 1 bis 4 oder 9 von Anspruch 2 in der Probe bindet, wobei das detektierbare Signal die Gegenwart oder Menge des ungebundenen und komplexierten herzspezifischen Troponins T in der Blutprobe betrifft.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Immunassay umfasst: (a) Bildung von ein oder mehreren Antikörperkonjugaten, die einen Antikörper gekoppelt mit einem signalerzeugenden Element umfassen, wobei das (die) Antikörperkonjugat(e) in der Lage ist (sind), spezifisch an eine Region oder Regionen von ungebundenem und komplexiertem herzspezifischem Troponin I und/oder T zu binden; (b) Bildung eines Reaktionsgemisches, das die Blutprobe inkubiert mit dem (den) Antikörperkonjugat(en) umfasst; (c) Aufbringen des Reaktionsgemisches an einer Oberfläche, an die mindestens ein Fänger-Antikörper gebunden ist, welcher in der Lage ist, ungebundenes und/oder komplexiertes herzspezifisches Troponin I und/oder T in dem (den) Antikörperkonjugat(en) spezifisch zu binden, wobei der Fänger-Antikörper das Antikörperkonjugat bindet, wodurch das immobilisierte Konjugat nach Bildung eines Sandwich-Komplexes ein detektierbares Signal erzeugt; und (d) Inbezugbringen des detektierbaren Signals mit der Menge der ungebundenen und/oder komplexierten Herz-Isoform(en) von Troponin I oder der Gegenwart oder der Menge der ungebundenen und/oder komplexierten Herz-Isoform(en) von Troponin T oder der Herz-Isoform(en) von Troponin T und I in der Blutprobe.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der Assay die Gegenwart oder Menge an ungebundenem und komplexiertem herzspezifischem Troponin T in einer Blutprobe bestimmt.
Verfahren gemäß Anspruch 12 für die Bestimmung der Gegenwart oder Gesamtmenge an ungebundenem und komplexiertem herzspezifischem Troponin I und ungebundenem und komplexiertem herzspezifischem Troponin T in einer Blutprobe.
Verfahren gemäß Anspruch 12, 13 oder 14, wobei das Konjugat und/oder der Fänger-Antikörper eine Mehrzahl monoklonaler Antikörper umfasst (umfassen).
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Oberfläche mindestens eine diskrete Zone umfasst, wobei der mindestens eine Fänger-Antikörper an die mindestens eine diskrete Zone gebunden ist.
Assay nach Anspruch 16, wobei die Oberfläche mindestens zwei diskrete Zonen umfasst, einen ersten Fänger-Antikörper, der an die erste der mindestens zwei diskreten Zonen gebunden ist, wobei der erste Fänger-Antikörper in der Lage ist, das in den Formen 1, 2, 3, 4, 5 und 6 von Anspruch 1 oder in den Formen 1, 2, 3 und 4 von Anspruch 3 vorliegende herzspezifische Troponin I zu binden, und einen zweiten Fänger-Antikörper, der an die zweite der mindestens zwei diskreten Zonen gebunden ist, wobei der zweite Fänger-Antikörper in der Lage ist, das in den Formen 7 und 8 von Anspruch 1 oder in den Formen 7 und 8 von Anspruch 3 vorliegende herzspezifische Troponin I zu binden.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Oberfläche mindestens drei diskrete Zonen umfasst, einen ersten Fänger-Antikörper, der an die erste der mindestens drei diskreten Zonen gebunden ist, wobei der erste Fänger-Antikörper in der Lage ist, das in den Formen 1 und 2 von Anspruch 1 oder in den Formen 1 und 2 von Anspruch 3 vorliegende herzspezifische Troponin I zu binden, und einen zweiten Fänger-Antikörper, der an die zweite der mindestens drei diskreten Zonen gebunden ist, wobei der zweite Fänger-Antikörper in der Lage ist, das in den Formen 3, 4, 5 und 6 von Anspruch 1 oder in den Formen 3 und 4 von Anspruch 3 vorliegende herzspezifische Troponin I zu binden, und einen dritten Fänger-Antikörper, der an die dritte der mindestens drei diskreten Zonen gebunden ist, wobei der dritte Fänger-Antikörper in der Lage ist, das in den Formen 7 und 8 von Anspruch 1 oder in den Formen 7 und 8 von Anspruch 3 vorliegende herzspezifische Troponin I zu binden.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Oberfläche mindestens zwei diskrete Zonen umfasst, einen ersten Fänger-Antikörper, der an die erste der mindestens zwei diskreten Zonen gebunden ist, wobei der erste Fänger-Antikörper in der Lage ist, das in den Formen 1, 2, 3, 4 und 9 von Anspruch 2 oder in den Formen 1, 2, 3 und 4 von Anspruch 3 vorliegende herzspezifische Troponin T zu bilden, und einen zweiten Fänger-Antikörper, der an die zweite der mindestens zwei diskreten Zonen gebunden ist, wobei der zweite Fänger-Antikörper in der Lage ist, das in der Form 10 von Anspruch 2 oder in der Form 10 von Anspruch 3 vorliegende herzspezifische Troponin T zu binden.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Oberfläche mindestens drei diskrete Zonen umfasst, einen ersten Fänger-Antikörper, der an die erste der mindestens drei diskreten Zonen gebunden ist, wobei der erste Fänger-Antikörper in der Lage ist, das in den Formen 1 und 2 von Anspruch 2 oder in den Formen 1 und 2 von Anspruch 3 vorliegende herzspezifische Troponin T zu binden, und einen zweiten Fänger-Antikörper, der an die zweite der mindestens drei diskreten Zonen gebunden ist, wobei der zweite Fänger-Antikörper in der Lage ist, das in den Formen 3, 4 und 9 von Anspruch 2 oder in den Formen 3 und 4 von Anspruch 3 vorliegende herzspezifische Troponin T zu binden, und einen dritten Fänger-Antikörper, der an die dritte der mindestens drei diskreten Zonen gebunden ist, wobei der dritte Fänger-Antikörper in der Lage ist, das in der Form 10 von Anspruch 2 oder in der Form 10 von Anspruch 3 vorliegende herzspezifische Troponin T zu binden.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei ein Troponin Inhibitor vor Bildung des Reaktionsgemisches zur Probe zugegeben wird, so dass der Assay hauptsächlich herzspezifisches Troponin I und/oder T in den ungebundenen Formen 7 und 8 von Anspruch 1 und Form 10 von Anspruch 2 misst.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei der Inhibitor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Metallchelaten, Mastoparan und Melittin besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei Troponin C vor Bildung des Reaktionsgemisches zur Probe zugegeben wird, so das das gesamte oder im wesentlichen das gesamte Troponin I oder T, das in der Probe gemessen wird, während des Verlaufs des Assays von Troponin C gebunden wird.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei Troponin C und T vor Bildung des Reaktionsgemisches zur Probe zugegeben wird, so dass die gesamte oder im wesentlichen die gesamte herzspezifische Isoform von Troponin I während des Verlaufs des Assay als Form 1 und/oder 2 von Anspruch 1 und/oder als Form 1 und/oder 2 von Anspruch 3 gebunden wird.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei Troponin C und I vor Bildung des Reaktionsgemisches zur Probe zugegeben wird, so dass die gesamte oder im wesentlichen die gesamte herzspezifische Isoform von Troponin T während des Verlaufs des Assay als Form 1 und/oder 2 von Anspruch 2 und/oder als Form 1 und/oder 2 von Anspruch 3 gebunden wird.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das zu detektierende herzspezifische Troponin I in einer der Formen 7 und 8 von Anspruch 1 vorliegt, wobei die Probe zusätzlich herzspezifisches Troponin I in einer der Formen 1, 2, 3, 4, 5 und/oder 6 von Anspruch 1 und/oder Formen 1, 2, 3 und/oder 4 von Anspruch 3 umfasst, wobei der konjugierte Antikörper spezifisch an herzspezifisches Troponin I in der Form 7 und/oder 8 von Anspruch 1 bindet; der Fänger-Antikörper spezifisch an herzspezifisches Troponin I in der Form 7 und/oder 8 von Anspruch 1 bindet.
Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei das Inkontaktbringen der Probe mit dem konjugierten Antikörper dem Inkontaktbringen der Probe mit dem Fänger-Antikörper vorausgeht.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei das Inkontaktbringen der Probe mit dem Fänger-Antikörper dem Inkontaktbringen der Probe mit dem konjugierten Antikörper vorausgeht.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1, 4 bis 7 und 10, wobei das detektierbare Signal, das die Menge des ungebundenen und komplexierten herzspezifischen Troponins I in der Blutprobe betrifft, mindestens um einen Faktor zwei größer ist als ein minimales Signal, das aus der Antikörperbindung an eine gleiche Zahl von freier Troponin-I-Komponente und/oder Troponin-Komplexen, die das herzspezifische Troponin I nicht umfassen, resultiert.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6, 8 bis 9 und 11, wobei das detektierbare Signal, das die Gegenwart oder Menge des ungebundenen und komplexierten herzspezifischen Troponins T oder des herzspezifischen Troponins I und T in der Blutprobe betrifft, mindestens um einen Faktor 2 größer ist als ein minimales Signal, das aus der Antikörperbindung an eine gleiche Zahl von freien Troponin-Komponenten und/oder Troponin-Komplexen, die das herzspezifische Troponin T oder Troponin I und T nicht umfassen, resultiert.