WO2003023060A2 - Verfahren und kit zur diagnostik oder behandlungskontrolle von brustkrebs - Google Patents

Verfahren und kit zur diagnostik oder behandlungskontrolle von brustkrebs Download PDF

Info

Publication number
WO2003023060A2
WO2003023060A2 PCT/EP2002/009999 EP0209999W WO03023060A2 WO 2003023060 A2 WO2003023060 A2 WO 2003023060A2 EP 0209999 W EP0209999 W EP 0209999W WO 03023060 A2 WO03023060 A2 WO 03023060A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
claudin
dna
oligonucleotides
cdna
Prior art date
Application number
PCT/EP2002/009999
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2003023060A3 (de
Inventor
Alf-Andreas Krehan
Pia Steffens
Bertha Gutierrez
Stefanie WASCHÜTZA
Original Assignee
Adnagen Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10143776A external-priority patent/DE10143776A1/de
Priority claimed from PCT/EP2002/005489 external-priority patent/WO2003023057A2/de
Application filed by Adnagen Ag filed Critical Adnagen Ag
Priority to EP02774579A priority Critical patent/EP1409746A2/de
Priority to US10/488,828 priority patent/US20050014208A1/en
Publication of WO2003023060A2 publication Critical patent/WO2003023060A2/de
Publication of WO2003023060A3 publication Critical patent/WO2003023060A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to a method and a kit for the diagnosis or treatment control of breast cancer in a human.
  • tumor markers at the protein level (immunologically or enzymatically) are determined quantitatively in the blood or in other body fluids in cancer patients.
  • tumor diagnostics or treatment control / aftercare since increased tumor marker values are also caused by non-tumor diseases (e.g. inflammation of the gastrointestinal tract). Tracts, cirrhosis of the liver, viral infections), heavy smoking or can be caused by pregnancy.
  • non-tumor diseases e.g. inflammation of the gastrointestinal tract.
  • the object of the present invention is to provide a method and a kit with which a diagnosis or treatment control of breast cancer is possible in a simple, safe and repeatable manner.
  • RNAs of the markers described are normally not expressed in the blood of healthy people, there is a direct correlation between a positive RT-PCR detection of these tumor markers and circulating tumor cells in the blood, which can lead to metastasis. Since individual markers can be expressed differently in a therapy-dependent manner and breast cancer has a pronounced heterogeneity in the expression pattern of breast cancer cells, it is advantageous to investigate a combination of tumor markers in order to detect all tumor cells circulating in the blood. In this way, tumor cells can also be recognized when the expression of a particular marker in a patient or in a disease stage is relatively low, which could otherwise lead to a supposedly negative result. However, the use of further markers usually comes up against limits if mononuclear blood cells have a background expression ("illegitimate transcription") which hinder an exact analysis.
  • GA733.2 PDGF- ⁇ , Her-2 / new, Claudin-7; GA733.2, MUCl, CEA;
  • GA733.2 PDGF- ⁇ , Claudin-7; respectively.
  • the primers given in the table below can be used for the amplification of sections of the markers.
  • an increase in specificity can be achieved by enriching the tumor cells with respect to blood cells and at the same time an increase in the sensitivity of tumor cell detection (detection rate from 1 tumor cell to 10 7 mononuclear blood cells).
  • the tumor cells are isolated using specific antibodies or an antibody mixture of mononuclear blood cells. separates. The separation can be carried out by means of magnetic particles (dynamic) to which the antibodies are bound. This is described in more detail below.
  • Eukaryotic cells have a large number of different molecules on their cell surface.
  • the combination of the expressed surface molecules differs according to the origin and the function of the individual cell, so that cell type-specific patterns arise.
  • Antibodies are used to recognize these cell type-specific patterns.
  • Antibodies bind to their antigen with high specificity, here to selected surface molecules. This property is used to recognize and differentiate cells by means of specific antibody binding based on their cell type-specific patterns.
  • the expression of special surface proteins distinguishes tumor cells from untransformed cells of this cell type. Since this special pattern of surface antigens in tumor cells also differs from the typical blood cell patterns, tumor cells in the blood can be distinguished. To identify tumor cells, antibodies that specifically recognize these special surface proteins are used as tools. The specific antibody binding is used for various analysis and separation methods.
  • Antibodies are coupled with fluorescent dyes for flow cytometric analysis. Scattered cells are individually guided past a light source (laser) in a constant liquid flow. When the cells are illuminated, the fluorescent dyes bound to the antibodies are excited and emit light of specific wavelengths. The emitted light is detected and the measured signal is stored digitally. The light signal can be assigned to individual cells.
  • Cell is recognized in this way and can now be separated from other cells.
  • the cells are separated into tiny drops for separation. After detection of the antibody-labeled cell, the corresponding drop is directed into a collecting container.
  • Antibodies are coupled to pseudomagnetic particles for magnetic separation. After the pseudomagnetic particles have been introduced into a magnetic field, the particles migrate in the magnetic field. When moving in this magnetic field, cells to which these coupled antibodies are bound are entrained and separated from other cells.
  • pseudomagnetic particles are consequently attached to the one have a defined number of chemically activated sites on their surface, antibodies are covalently coupled.
  • the specificity of the separation is determined via the specificity of the antibodies.
  • a blood sample containing tumor cells is mixed with antibody-coupled magnetic particles; then particles and blood are moved relative to each other. Those (tumor) cells that are recognized by the solid-phase-bound antibodies and thus firmly bound follow the movement of the particles. This makes it possible, when a magnetic field is applied, to pull the particles with the cells attached to them out of the blood (eg on the wall of the separation vessel).
  • the blood thus depleted of tumor cells can be exchanged for other solutions, the cells separated via magnetic particles remaining on site until the magnetic field is switched off / removed and are available for further applications.
  • specific antibody mixtures can be used for the detection of the tumor cells, which are either optimized generally for tumor cells or also specifically for breast cancer cell detection.
  • a combination of the antibodies MOC-31 (Novocastra) and Ber-EP-4 (DAKO) is suitable for the detection of tumor cells in the blood.
  • a detection that is specifically aimed at breast cancer cells can be achieved by a further optimized antibody mixture according to the following table:
  • Antibody mixtures of this type show an increased sensitivity in comparison to the separately used antibodies in cell recognition and cell separation, regardless of the method used.
  • FIGS. 2A to 2C a tumor marker detection using light cycler
  • FIGS. 4 to 8 show further examples for the detection of breast cancer cells by means of several tumor markers.
  • RNA processing was carried out from 1 ml of EDTA whole blood using the QIAamp RNA Blood Mini Kit (from Qiagen, Hilden). Contamination with genomic DNA was caused by an additional DNA digestion on the column using RNase-free DNase Set, from Quiagen, Hilden) avoided.
  • RNA processing from 1 ml of EDTA whole blood was verified photometrically using the quotient 260: 280 nm.
  • 1 ⁇ l of the batch can be analyzed by electrophoretic separation on an RNA 6000 chip using the Agilent Bioanalyzer 2100.
  • oligo (dT) 15 primers from Promega, Mannheim
  • the cDNA synthesis was carried out using the Sensiscript TM reverse transcriptase kit (from Qiagen, Hilden) in a 20 ⁇ l reaction mixture according to Table 1 at 37 ° C. for 1 hour with subsequent inactivation of the reverse transcriptase for 5 minutes at 95 ° C and then cooling on ice.
  • a pair of primers was used for each tumor marker, as shown in Table 3 below.
  • the PCR was carried out under the PCR conditions given in Table 5 and with the marker-specific melting temperatures and number of cycles given in Table 6.
  • FIG. 1 1 ⁇ l of the PCR product thus generated was separated in an Agilent Bioanalyzer 2100 on a DNA chip (500) and the separation result was documented electronically.
  • track 1 shows a 100 kb conductor and tracks 2-13 the results of the corresponding samples.
  • lane 5 shows a PCR product for the tumor marker stanniocalcin
  • lane 9 shows a PCR product for the tumor marker EGF-R
  • lane 13 shows a PCR product for the tumor marker CEA
  • all samples with biological material show lanes 4 , 5, 8, 9, 12, 13 PCR products for the internal control contain ⁇ -actin.
  • Lanes 2, 3, 6, 7, 10, 11 contain no biological material, so that there are no corresponding PCR products.
  • the so-called cDNA control is an approach without RNA
  • the so-called PCR control is an approach without cDNA
  • the negative control is an approach with RNA from a healthy control person in FIG. 1.
  • CEA stands for carcinoembryonic antigen
  • STC for stanniocalcin
  • EGF-R epidermal growth factor receptor
  • this tumor marker detection can also be carried out using a light cycler (from Röche, Basel).
  • the reverse transcription of the mRNA is carried out as described above.
  • the PCR was then carried out using the Light Cycler-DNA Master Sybr Green I Kit (Röche, Basel) according to the manufacturer's instructions under the conditions optimized for each tumor marker.
  • Table 3 The oligonucleotides given in Table 3 were used as primers.
  • Table 7 and Table 8 show the approach for the PCR and the PCR conditions in the light cycler.
  • FIGS. 2A to 2C The result of this PCR and evaluation by light cycler technology is shown in FIGS. 2A to 2C. posed.
  • the control curve is denoted by 2, while the curve which was recorded for the sample is denoted by 1.
  • the melting curve of the PCR products is analyzed by Sybr Green I detection.
  • the respective graph in FIGS. 2A to 2C represents the measured fluorescence as a function of the temperature.
  • the fluorescence peaks occurring in the control batches are due to primer dimers.
  • 2A shows the melting curve analysis of the Stanniocalcin PCR product.
  • the melting point of the main product is 89.2 ° C. and the melting point of the by-product is 85.3 ° C. Such fluorescence peaks cannot be seen in the control sample.
  • 2B shows the melting curve analysis of the EGFR-PCR product with a melting point at 84.6 ° C.
  • 2C shows the melting curve analysis of the CEA-PCR product with a melting point at 89.06 ° C.
  • agarose gel electrophoresis can of course also be used, in which, for example, 25 ⁇ l of the PCR product shown above are separated using a 2.5% agarose gel and the DNA bands are subsequently stained and visible with ethidium bromide be made. Documentation can be carried out, for example, with the help of the DUO Store System from Intas.
  • a fragment analysis using the ABI Prism 310 Genetic Analyzer can also be used for the evaluation.
  • a PCR with fluorescence-labeled primers is carried out and then, for example, 1 ⁇ l of the respective PCR product is used in a dilution of 1:50.
  • RNA isolated as a detection basis and the cDNA synthesized from it Central to the quality of the RNA isolated as a detection basis and the cDNA synthesized from it is the enrichment of the cell fraction used for this purpose from the blood sample used. Four different methods are available for this:
  • Erythrocyte lysis buffer ("QIAmp Blood Kit", Qiagen; Hilden) lysed on ice for 20 minutes. After removing the plasma / lysate from the pelleted cells and resuspension, centrifugation is carried out again at 3000 x g for 20 minutes. After removing the supernatant, the pelleted leukocyte fraction is available for the RNA preparation.
  • Hypaque gradients (Pharmacia, Uppsala, Sweden) separated and then washed twice with PBS / 1% FCS.
  • the mononuclear cells from the fraction enriched under b) are labeled with fluorescence-labeled mononuclear antibodies against tumor-specific
  • RNA can then be isolated as described above.
  • the isolated fraction of the mononuclear blood cells isolated by one of the above methods can also be isolated in trizole
  • RNA-containing aqueous phase is precipitated in isopropanol at -80 ° C. After washing twice in 80% ethanol, the pellet is on the
  • RNA isolation of the RNA is then followed by reverse transcription and mRNA detection as described above.
  • the expression of special surface proteins distinguishes tumor cells from untransformed cells of this cell type. Since this special pattern of surface antigens in tumor cells also differs from the typical blood cell patterns, tumor cells in the blood can be distinguished. To identify tumor cells, antibodies that specifically recognize these special surface proteins are used as tools. The specific antibody binding is made usable for the method according to the invention. Antibodies are covalently coupled to pseudomagnetic particles that have a defined number of chemically activated sites on their surface. The specificity of the separation is determined via the specificity of the antibodies. A blood sample containing tumor cells is coupled with antibody
  • tumor cells are generally recorded with high specificity. This is due to the selective expression of certain surface proteins that differentiate cancer cells from other cells.
  • the tracks la to 4a, 1b to 4b and 1c to 4c then show the detection of RNA after RNA preparation and RT-PCR with tumor marker-specific primers as described above for samples with a volume of 1 ⁇ l each. 3 was determined by means of electrophoretic separation in an Agilent TM bioanalyser 2100 according to the manufacturer's instructions.
  • FIGS. 3A and 3B When using magnetic particles labeled only with an antibody, as shown in FIGS. 3A and 3B, positive detection was only possible with a content of 1000 cells. When using an antibody mixture as in FIG. 3C, detection was already provided with only 100 cells and thus by a factor of 10 more sensitive.
  • FIG. 4 shows the detection of breast cancer cells by the simultaneous detection of the tumor cell markers GA733.2, MUCl, Her-2 and Claudin-7.
  • Breast tumor cells were inoculated into a sample, various Zeil lines, Zeil line 1 and Zeil line 2 being introduced. Before the markers were determined, the tumor cells were enriched by means of antibody-coupled magnetic particles, the antibodies BerEp4, HMTV.2, GP1.4 being used.
  • FIG. 4 shows that a reliable detection down to two cells per 5 ml can be detected for both cell lines by such a combination of the tumor markers to be detected. There was no unspecific reaction.
  • FIG. 5 also shows the detection of breast tumor cells, the combinations of the markers GA733.2, PDGF- ⁇ , Her-2 and Claudin-7 (FIG. 5A) or GA733.2, MUCl and CEA were detected. Again, a very sensitive detection down to two cells per 5 ml sample takes place, while in a control blood sample no unspecific detection reactions occurred.
  • FIG. 6 shows the use of the marker combination GA733.2, PDGF- ⁇ and Claudin-7 (FIG. 6A) or GA733.2, PDGF- ⁇ and Claudin-7 (FIG. 6B) for a first cell line ( Fig. 6A) and a second cell line (Fig. 6B) shown.
  • a highly specific detection takes place without unspecific reactions, with cell line 2 being able to be detected better than cell line 1.
  • FIG. 7 again shows detection using the combination of markers GA733.2, MUCl and Claudin-7 , There is highly specific detection for cell line 2 down to two cells per 5 ml for each of the markers and in particular for the combination of the markers without non-specific detection reactions.
  • the diagnostic kit according to the invention and the method according to the invention also make it possible to subsequently continue to use the sorted and separated cells as desired.
  • these can be inserted into a suitable cell culture medium and cultivated in situ.
  • chromosome analyzes Since the cells are intact after separation, the properties of the cell membrane and cell preserved core. This opens up the possibility of microscopically examining the expression of further surface markers or of carrying out chromosome analyzes.
  • the sorted cells are applied to slides. Additional surface markers can be detected cytochemically or using fluorescence microscopy. Genetic analyzes can also be carried out, such as chromosome analyzes using FISH (Flurorescence in situ hybridization) or karyogram preparation.
  • FISH Fluorescence in situ hybridization

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und ein Kit zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Brustkrebs bei einem Menschen. Dieses Verfahren basiert darauf, dass in einer Blutprobe des Menschen das Vorhandensein oder Fehlen von mindestens zwei verschiedenen mRNS erfasst wird, die für verschiedene der Tumormarkerproteine EGF-R, CEA, Stanniocalcin, CK20, MAGE-3, GA733.2, MUC1, Her-2/neu, Claudin-7 und/oder PDGF- beta kodieren und daraus auf das Vorhandensein von Mammakarzinomzellen in der Blutprobe und damit auf mögliche Metastasierung geschlossen wird.

Description

Verfahren und Kit zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Brustkrebs
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Ver- fahren und ein Kit zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Brustkrebs bei einem Menschen.
Bei der Krebsnachsorge ist es von Relevanz, ein Rezidiv maligner Tumore anhand des Auftretens metastasie- render Tumorzellen im Blut frühzeitig nachweisen zu können. Bei den derzeit angewandten Untersuchungsmethoden werden bei Krebspatienten sogenannte „Tumor- marker" auf Proteinebene (immunologisch bzw. enzyma- tisch) quantitativ im Blut oder in anderen Körper- flüssigkeiten ermittelt.
Diese Nachweisverfahren sind für die Tumordiagnostik bzw. Behandlungskontrolle/Nachsorge nur bedingt geeignet, da erhöhte Tumormarkerwerte auch durch nicht- Tumorerkrankungen (z.B. Entzündungen des Magen-Darm- Traktes, Leberzirrhose, Virusinfekte) , starkes Rauchen oder durch eine Schwangerschaft hervorgerufen werden können.
Brustkrebs ist die häufigste Diagnose, wenn eine Tumorerkrankung bei Frauen festgestellt wird (26,4% aller Neuerkrankungen) . Trotz massiver Bemühungen, die in Früherkennung, Behandlung und Nachsorge aufgewendet werden, rangiert diese Erkrankung immer noch an erster Stelle krebsbedingter Todesursachen bei der Frau. Die Erkrankungszahlen in den westlichen Industrieländern nehmen in den vergangenen Jahren trotz verstärkter Bemühungen um die Früherkennung weiter zu. Problematisch ist die hohe Metastasierungsrate nach Erstbehandlung, die in der Mehrzahl der Fälle bereits nach 1-3 Jahren zum Tod der Patientin führt. Hauptgrund hierfür ist die Streuung von Tumorzellen in frühen Stadien der Tumorentwicklung. Neben der Ersterkennung eines Mammakarzinoms ist daher insbe- sondere der frühest mögliche Nachweis metastasieren- der Zellen für eine erfolgreiche Behandlung von entscheidender Bedeutung. Ebenso kann im klinischen Stadium I ein definitiver Negativnachweis hilfreich sein, wenn zu entscheiden ist, ob die Patientin mit einer Chemotherapie oder einer Operation belastet werden muß .
Die derzeit verwendeten diagnostischen Methoden sind ungenau, wenn es um die Beurteilung der malignen Po- tenz von Resttumoren nach durchgeführter Chemotherapie in den metastasierenden Stadien geht. Einige klinische Studien weisen auf eine prognostische Bedeutung von disseminierten Tumorzellen hin. Dennoch sind zahlreiche methodische Aspekte kritisch und bisher nicht hinreichend standardisiert. Somit müssen weiterhin Nachweise für eine okkulte - oder restliche - Metastasierung gefunden werden, die eine rechtzeitige Einordnung in die vielfältigen primär kurativen therapeutischen Optionen zulassen.
Dem Bestreben nach Verbesserung der Heilungschancen wird heute einerseits über Suche und Verwendung neuer Tumormarker, andererseits über Sensitivitätssteige- rung bei den verwendeten Methoden nachgekommen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren und ein Kit zur Verfügung zu stellen, mit dem auf einfache, sichere und wiederholbare Weise eine Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Brustkrebs möglich ist.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Patentanspruch 1 sowie das Kit nach Patentanspruch 30 und den Mikroarray nach Patentanspruch 50 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen des Verfahrens, des Kits und des Mikroarrays werden in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen gegeben.
Erfindungsgemäß wird mittels des erfindungsgemäßen Kits bzw. des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer Blutprobe eines Menschen das Vorhandensein oder Fehlen von mRNS der Tumormarkerproteine EGF-R, CEA, CK20, MAGE-3, GA733.2, MUC-1 £ GA15.3, Her-2/neu, Claudin-7, PDGF-ß und/oder Stanniocalcin erfaßt.
Da im Blut Gesunder die RNAs der beschriebenen Marker normalerweise nicht exprimiert vorliegen, zeigt sich eine direkte Korrelation zwischen einem positiven RT- PCR-Nachweis dieser Tumormarker und zirkulierenden Tumorzellen im Blut, die zu einer Metastasierung füh- ren können. Da einzelne Marker in therapieabhängiger Weise unterschiedlich exprimiert werden können und Brustkrebs eine ausgeprägte Heterogenität im Expressionsmuster von Brustkrebszellen aufweist, ist es vorteilhaft, eine Kombination von Tumormarkern zu untersuchen, um alle im Blut zirkulierende Tumorzellen zu erfassen. Hierdurch lassen sich Tumorzellen auch dann erkennen, wenn die Expression eines bestimmten Markers bei ei- nem Patienten bzw. in einem Krankheitsstadium relativ gering ist, was sonst zu einem vermeintlich negativen Ergebnis führen könnte. Die Verwendung weiterer Marker stößt jedoch meist deswegen auf Grenzen, wenn mo- nonukleäre Blutzellen eine Hintergrundexpression ("illegitime Transkription") aufweisen, die eine exakte Analyse behindern.
Für die Erkennung von Brustkrebszellen wird daher erfindungsgemäß die folgende Kombination aus Markern vorgeschlagen:
Zwei der Marker aus den folgenden Gruppen
GA733.2 und MUCl; Her-2/neu und Claudin-7;
CK20, MAGE-3 und MUC 1; bzw. Stanniocalcin, EGFR und CEA
oder
die folgenden Kombinationen
GA733.2, MUCl, Her-2/neu, Claudin-7;
GA733.2, PDGF-ß, Her-2/neu, Claudin-7; GA733.2, MUCl, CEA;
GA733.2, PDGF-ß, Claudin-7; bzw. GA733.2, MUCl und Claudin-7
Für die Amplifikation von Abschnitten der Marker können die in der nachfolgenden Tabelle angegebenen Primer verwendet werden.
Marker für Mammakarzinom
Figure imgf000006_0001
Im folgenden werden die Bezeichnungen der Marker erläutert :
Figure imgf000007_0001
Bei der Anwendung von RT-PCR-Systemen zum Nachweis von Tumorzellen ist aufgrund der sehr hohen Amplifi- kationsrate die Spezifität ein kritischer Punkt. Geringste Kontaminationen, etwa durch Fremd-RNA oder illegitime Transkription, können hierbei das Ergebnis verfälschen.
Durch die Verwendung der Immunzytochemie mit monoklo- nalen Antikörpern gegen Tumorzellantigene kann eine Steigerung der Spezifität durch Anreicherung der Tumorzellen gegenüber Blutzellen und gleichzeitig eine Steigerung der Sensitivität des Tumorzell-Nachweises erzielt werden (Nachweisquote von 1 Tumorzelle auf 107 mononukleären Blutzellen) . Die Tumorzellen werden dabei mittels spezifischer Antikörper bzw. einer Antikörpermischung von mononukleären Blutzellen ge- trennt. Die Trennung kann mittels Magnetpartikel (Dy- nal) , an die die Antikörper gebunden werden, erfolgen. Dies wird im folgenden detaillierter beschrieben.
Eukaryontische Zellen tragen eine Vielzahl unterschiedlicher Moleküle an Ihrer Zelloberfläche. Entsprechend des Ursprungs und der Funktion der einzelnen Zelle unterscheidet sich die Kombination der ex- primierten Oberflächenmoleküle, so daß zelltyp- spezifische Muster entstehen. Zur Erkennung dieser zelltyp-spezifischen Muster werden Antikörper genutzt. Antikörper binden mit hoher Spezifität an ihr Antigen, hier an ausgewählte Oberflächenmoleküle. Diese Eigenschaft wird genutzt, um Zellen mittels spezifischer Antikörperbindung anhand ihrer Zelltyp- spezifischen Muster zu erkennen und voneinander zu unterscheiden .
Die Expression spezieller Oberflächenproteine unterscheidet Tumorzellen von nichttransformierten Zellen dieses Zelltyps. Da sich dieses spezielle Muster der Oberflächen-Antigene bei Tumorzellen auch von den Blutzell-typischen Mustern unterscheidet, können Tu- morzellen im Blut unterschieden werden. Um TumorZellen zu identifizieren, werden Antikörper, die diese speziellen Oberflächenproteine spezifisch erkennen, als Werkzeuge genutzt. Die spezifische Antikörperbindung wird für verschiedene Analyse- und Separations- Methoden nutzbar gemacht.
Aufgrund der intensiven Bindung von speziell dafür selektionierten Immunglobulinen ist neben der Erkennung von Zellen über deren Oberflächenepitope auch eine Separierung der erkannten Zellen von nicht erkannten möglich. 1. Trennprinzip beruhend auf Flüssigphase; z.B. Durchflußzytometrie :
Für die durchflußzytometrische Analyse werden Antikörper mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt. Vereinzelte Zellen werden in einem konstanten Flüssigkeitsstrom einzeln an einer Lichtquelle (Laser) vorbeigeleitet. Bei Beleuchtung der Zellen werden die an den Antikörpern gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe angeregt und strahlen Licht bestimmter Wellenlängen ab. Das abgestrahlte Licht wird detektiert und das gemessene Signal digitalisiert gespeichert. Das Lichtsignal kann einzelnen Zellen zugeordnet werden. Die Antikörper-markierte
Zelle wird so erkannt und kann nun von anderen Zellen getrennt werden. Zur Trennung werden die Zellen in kleinsten Tropfen vereinzelt. Nach Erkennung der Antikörper-markierten Zelle wird der entsprechende Tropfen in ein Auffangbehältnis gelenkt.
2. Trennprinzip beruhend auf Festphase; z.B. magnetische Separation:
Für die magnetische Separation werden Antikörper an pseudomagnetische Partikel gekoppelt. Nach Einbringen der pseudomagnetischen Partikel in ein Magnetfeld wandern die Partikel im magnetischen Feld. Bei der Bewegung in diesem magnetischen Feld werden Zellen, an die diese gekoppelten Antikörper gebunden sind, mitgerissen und von anderen Zellen getrennt .
Zur Tumorzellenerkennung mittels Magnetpartikel werden folglich an pseudomagnetische Partikel, die eine definierte Anzahl an chemisch aktivierten Stellen auf ihrer Oberfläche besitzen, Antikörper kovalent gekoppelt. Über die Spezifität der Antikörper wird die Spezifität der Trennung bestimmt. Eine Tumorzellen enthaltende Blutprobe wird mit Antikörper-gekoppelte Magnetpartikel versetzt; dann werden Partikel und Blut relativ zueinander bewegt. Jene (Tumor-) Zellen, die von den Festphase-gebundenen Antikörpern erkannt und damit fest gebunden werden, folgen der Bewegung der Partikel. Hierdurch ist es möglich, bei Anlegen eines magnetischen Feldes, die Partikel mit den daran gebundenen Zellen aus dem Blut herauszuziehen (z.B. an die Wand des Trenngefäßes) . Das auf diese Weise Tumorzellen-depletierte Blut kann gegen andere Lösungen ausgetauscht werden, wobei die über Magnetpartikel separierten Zellen bis zum Abschalten/Entfernen des Magnetfeldes vor Ort verbleiben und für weitere Anwendungen zur Verfügung stehen.
Vorteilhafterweise können für die Erkennung der Tumorzellen spezifische Antikörper-Mischungen verwendet werden, die entweder allgemein auf Tumorzellen oder auch spezifisch für Brustkrebszellen-Erkennung optimiert sind. Beispielsweise eignet sich zur Erkennung von Tumorzellen im Blut eine Kombination der Antikörper MOC-31 (Fa. Novocastra) und Ber-EP-4 (Fa. DAKO) .
Eine Erkennung, die speziell auf Brustkresbzellen gerichtet ist, kann durch eine weiter optimierte Antikörpermischung gemäß der nachfolgenden Tabelle:
Figure imgf000010_0001
erzielt werden. Dies beruht auf der selektiven Expression bestimmter Oberflächenproteine, die Brustkrebszellen von anderen Krebszellen unterscheidet.
Derartige Antikörpermischungen zeigen im Vergleich zu den jeweils separat eingesetzten Antikörpern bei der Zellerkennung und Zelltrennung unabhängig von der angewandten Methode eine erhöhte Sensitivität .
Im folgenden sollen einige Beispiele erfindungsgemäßer Nachweise für Brustkrebszellen in Blutproben beschrieben werden.
Es zeigen:
Fig. 1 einen Nachweis von PCR-Produkten mit Elektrophorese;
Fign. 2A bis 2C einen Tumormarkernachweis mittels Light Cy- cler;
Fig. 3 den Nachweis einer Zelltrennung mittels An- tikörper-markierter Magnetpartikel;
Fign. 4 bis 8 zeigen weitere Beispiele für den Nachweis von Mammakarzinomzellen mittels mehrerer Tumormarker.
In einem ersten Beispiel erfolgte eine RNA-Aufar- beitung aus 1 ml EDTA-Vollblut mit dem QIAamp RNA Blood Mini Kit (Fa. Qiagen, Hilden) . Kontaminationen mit genomischer DNA wurden durch einen zusätzlichen DNA-Verdau auf der Säule mittels RNase-free DNase Set, Fa. Quiagen, Hilden) vermieden.
Die RNA-Aufarbeitung aus 1 ml EDTA-Vollblut wurde fotometrisch über den Quotienten 260 : 280 nm verifiziert. Zur Qualitäts- und Quantitätsbestimmung kann dabei 1 μl des Ansatzes durch elektrophoretische Trennung auf einem RNA 6000 Chip über den Agilent Bioanalyzer 2100 analysiert werden.
Die isolierte RNA wurde in einem entsprechenden Volumen zusammen mit Oligo (dT) 15-Primern (Fa. Promega, Mannheim) für 5 Minuten bei 65 °C denaturiert und anschließend direkt auf Eis inkubiert. Die cDNA-Synthe- se erfolgte mittels des Sensiscript™ Reverse Trans- kriptase Kit, (Fa. Qiagen, Hilden) in einem 20 μl Reaktionsansatz gemäß Tabelle 1 bei 37 °C für 1 Stunde mit nachfolgender Inaktivierung der reversen Trans- kriptase für 5 Minuten bei 95 °C und anschließender Abkühlung auf Eis.
Tabelle 1 Komponenten der cDNA-Synthese
Figure imgf000012_0001
Mit der so erzeugten cDNA wurde für jeden der gewählten Tumormarker Stanniocalcin, EGF-R, CEA sowie als interne Kontrolle für ß-Aktin eine Multiplex-PCR durchgeführt. Der PCR-Ansatz ist in der folgenden Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 PCR-Ansatz
Figure imgf000013_0001
( *enthält 15 mM MgCl2;
**HotStarTaq™ DNA Polymerase; Fa. Qiagen, Hilden ***DMSO-Zusatz bei Stanniocalcin)
Für jeden Tumormarker wurde dabei ein Primerpaar eingesetzt, das aus der nachfolgenden Tabelle 3 hervorgeht .
Tabelle 3: Liste der PCR-Primer
Figure imgf000014_0001
Die für die Tumormarkereinzelnachweise eingesetzten Primerkombinationen und -mengen sind in der folgenden Tabelle 4 aufgeführt.
Tabelle 4: Auflistung der Primermengen und Primerkombinationen
Figure imgf000015_0001
Die PCR wurde unter den in Tabelle 5 angegebenen PCR- Bedingungen und mit den in Tabelle 6 angegebenen Marker-spezifischen Schmelz-Temperaturen und Zyklenzahlen durchgeführt.
Tabelle 5: PCR-Bedingungen
Figure imgf000015_0002
Tabelle 6: Marker-spezifische Annealingtemperatur und Zyklenzahl
Figure imgf000016_0001
1 μl des so erzeugten PCR-Produktes wurde in einem Agilent Bioanalyzer 2100 auf einem DNA-Chip (500) aufgetrennt und das Trennergebnis elektronisch dokumentiert. Die Ergebnisse zeigt die Figur 1. In dieser Figur zeigt Spur 1 eine 100 kb-Leiter sowie die Spuren 2-13 die Ergebnisse der entsprechenden Proben. Wie zu erkennen ist, zeigt Spur 5 ein PCR-Produkt für den Tumormarker Stanniocalcin, .Spur 9 ein PCR-Produkt für den Tumormarker EGF-R und Spur 13 ein PCR-Produkt für den Tumormarker CEA, während sämtliche Proben mit biologischem Material Spuren 4, 5, 8, 9, 12, 13 PCR- Produkte für die interne Kontrolle ß-Aktin enthalten.
Die Spuren 2, 3, 6, 7, 10, 11 enthalten kein biologisches Material, so daß dort auch keine entsprechenden PCR-Produkte auftreten. Die sogenannte cDNA-Kontrolle ist ein Ansatz ganz ohne RNA, die sogenannte PCR- Kontrolle ist ein Ansatz ohne cDNA und die Negativ- Kontrolle ist ein Ansatz mit RNA einer gesunden Kontrollperson in Fig. 1. CEA steht für Carcinoembryonic Antigen, STC für Stanniocalcin und EGF-R für Epidermal Growth Factor Receptor in Fig. 1.
Fig. 2 zeigt die alternative Analyse mittels Fluores- , zens-basierender Echtzeit-PCR mittels interkallieren- der Fluoreszenzfarbstoffe.
Dieser Tumormarkernachweis kann alternativ zur Block- PCR auch mittels Light Cycler (Fa. Röche, Basel) erfolgen.
Die reverse Transkription der mRNA erfolgt wie oben beschrieben. Anschliessend wurde die PCR mit dem Light Cycler-DNA Master Sybr Green I Kit (Fa. Röche, Basel) nach Herstellerangaben unter den für jeden Tu- mormarker optimierten Bedingungen durchgeführt. Als
Primer wurden dabei die in Tabelle 3 angegebenen Oli- gonukleotide verwendet. Tabelle 7 und Tabelle 8 zeigen den Ansatz für die PCR bzw. die PCR-Bedingungen im Light Cycler.
Tabelle 7 PCR-Ansatz LightCycler
Figure imgf000018_0001
Tabelle 8 : PCR-Bedingungen LightCycler
Figure imgf000018_0002
Das Ergebnis dieser PCR und Auswertung durch Light Cycler Technologie ist in den Figuren 2A bis 2C dar- gestellt. In sämtlichen Figuren 2A bis 2C ist die Kontrollkurve mit 2 bezeichnet, während die Kurve, die für die Probe aufgenommen wurde, mit 1 bezeichnet ist .
Bei dieser Analyse wird die Schmelzkurve der PCR- Produkte durch Sybr Green I Detektion analysiert. Die jeweilige Graphik der Figuren 2A bis 2C stellt dabei die gemessene Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Temperatur dar. Die in den Kontrollansätzen auftretenden Fluoreszenzpeaks sind auf Primerdimere zurückzuführen.
Fig. 2A stellt dabei die Schmelzkurvenanalyse des Stanniocalcin-PCR-Produktes dar. Der Schmelzpunkt des Hauptproduktes liegt bei 89,2 °C und der Schmelzpunkt des Nebenproduktes bei 85,3 °C. Derartige Fluoreszenzpeaks sind bei der Kontrollprobe nicht zu erkennen.
Fig. 2B zeigt die Schmelzkurvenanalyse des EGFR-PCR- Produktes mit einem Schmelzpunkt bei 84,6 °C.
Fig. 2C zeigt die Schmelzkurvenanalyse des CEA-PCR- Produktes mit einem Schmelzpunkt bei 89,06 °C zeigt.
Alternativ zu den hier dargestellten Methoden können selbstverständlich auch herkömmliche Analysemethoden wie Agarose-Gelelektrophorese angewandt werden, bei denen beispielsweise 25 μl des oben dargestellten PCR-Produktes über ein 2,5 %iges Agarosegel aufgetrennt werden und die DNS-Banden anschliessend mit Ethidiumbromid angefärbt und sichtbar gemacht werden. Die Dokumentation kann beispielsweise mit Hilfe des DUO Store Systems der Fa. Intas durchgeführt werden. Auch eine Fragmentanalyse mittels ABI Prism 310 Genetic Analyser (Fa. PE Applied Biosystems, Weiterstadt) kann zur Auswertung verwendet werden. Hierzu wird eine PCR mit fluoreszenzmarkierten Primern durchgeführt und anschließend beispielsweise jeweils 1 μl des jeweiligen PCR-Produktes in einer Verdünnung von 1 : 50 eingesetzt.
Als weiterer Nachweis ist ein Nachweis mittels se- quenzspezifischer fluoreszenzmarkierter Hybridisie- rungsproben möglich, die nach jedem Zyklus der PCR die Produktentwicklung verfolgen lassen. Anhand spezieller Standards kann dann auch ein Rückschluß auf die Menge an Ausgangs-RNS gezogen werden.
Zentral für die Qualität der als Nachweisbasis isolierten RNS und der daraus synthesisierten cDNS ist die Anreicherung der hierfür verwendeten Zellfraktion aus der verwendeten Blutprobe. Hierfür stehen vier verschiedene Methoden zur Verfügung:
a) Anreicherung durch wiederholte Zentrifugation nach Erythrozytenlyse :
1 ml EDTA-Blut werden nach Zugabe von 5 Volumina
Erythrozyten-Lysepuffer ("QIAmp Blood Kit", Qiagen; Hilden) für 20 Minuten auf Eis lysiert. Nach Abnehmen des Plasmas/Lysates von den pelletierten Zellen und Resuspension erfolgt eine erneute Zen- trifugation bei 3000 x g für 20 Minuten. Nach Abnehmen des Überstandes steht die pelletierte Leukozytenfraktion für die RNA-Präparation zur Verfügung.
b) Anreicherung durch Dichtegradienten- Zentrifugation : Mittels eines über Zentrifugation erzeugten Dichtegradienten lassen sich Zellen unterschiedlicher mittlerer Volumendichte voneinander trennen. Mono- nukleare Blutzellen werden mittels eines Ficoll-
Hypaque-Gradienten (Pharmacia, Uppsala, Schweden) separiert und anschließend zweifach mit PBS/1% FCS gewaschen.
Anreicherung von Tumorzellen durch FACS- Durchflußzytometrie :
Die mononukleären Zellen aus der unter b) angereicherten Fraktion werden mit fluoreszenzmarkierten mononuklearen Antikörpern gegen tumorspezifische
Oberflächenproteine inkubiert. Die markierten Zellen werden zweifach mit PBS gewaschen und im Anschluß werden 107 Zellen in 1 ml PBS resuspendiert. Für die Isolierung der Tumorzellen wird ein FACS Vantage SE-Durchflußzytometer (Becton Dickin- son) verwendet. Über das CellQuest Programm erfolgen Datenaufnahme, Instrumentenkontrolle und Datenauswertung. Die sortierten Zellen werden in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß (gefüllt mit 1 ml PBS) über- führt. Die RNS kann dann wie oben beschrieben isoliert werden.
Alternativ kann auch die isolierte Fraktion der mononukleären Blutkörperchen, die nach einem der obigen Verfahren isoliert wurden, in Trizol-
Reagenz (Gibco BRL, NY, USA) lysiert und mittels Pipette homogenisiert werden. Nach Chloroformextraktion wird die RNA-haltige wäßrige Phase in Isopropanol bei -80 °C gefällt. Nach zweimaligem Waschen in 80 %igem Ethanol wird das Pellet an der
Luft getrocknet und anschließend in RNase-freiem Wasser resuspendiert.
An diese Isolation der RNS schließt sich dann die reverse Transkription sowie der mRNA-Nachweis wie oben beschrieben an.
d) Anreicherung von Tumorzellen durch immunomag- netische Separation.
Die Expression spezieller Oberflächenproteine unterscheidet Tumorzellen von nichttransformierten Zellen dieses Zelltyps. Da sich dieses spezielle Muster der Oberflächen-Antigene bei Tumorzellen auch von den Blutzeil-typischen Mustern unterscheidet, können Tu- morzellen im Blut unterschieden werden. Um Tumorzellen zu identifizieren, werden Antikörper, die diese speziellen Oberflächenproteine spezifisch erkennen, als Werkzeuge genutzt. Die spezifische Antikörperbindung wird für das erfindungsgemäße Verfahren nutzbar ge- macht. An pseudomagnetische Partikel, die eine definierte Anzahl an chemisch aktivierten Stellen auf ihrer Oberfläche besitzen, werden Antikörper kovalent gekoppelt. Über die Spezifität der Antikörper wird die Spezifität der Trennung bestimmt. Eine Tumorzellen enthaltende Blutprobe wird mit Antikörper gekoppelte
Magnetpartikel versetzt; als Antikörper werden in verschiedenen Beispielen zwei verschiedene Mischungen von Antikörpern verwendet; dann werden Partikel und Blut relativ zueinander bewegt, beispielsweise durch "Über- Kopf-Rotierer" in einem geschlossenen Behälter befindlicher Proben oder durch Bewegung der Partikel aufgrund von wechselnden Magnetfeldern. Jene (Tumor- ) Zellen, die von den Festphase-gebundenen Antikörpern erkannt und damit fest gebunden werden, folgen der Bewegung der Partikel. Hierdurch ist es möglich, bei Anlegen eines magnetischen Feldes, die Partikel mit den daran gebundenen Zellen aus dem Blut herauszuziehen (z. B. an die Wand des Trenngefäßes) . Das auf diese Weise Tumorzellen-depletierte Blut kann gegen andere Lösungen ausgetauscht werden, wobei die über Magnetpartikel separierten Zellen bis zum Abschalten/Entfernen des Magnetfeldes vor Ort verbleiben und für weitere Anwendungen zur Verfügung stehen.
Tabelle 9: Antikörper-Mischung 1
Figure imgf000023_0001
Mittels der Antikörpermischung in Tabelle 9 werden ganz allgemein Tumorzellen jedoch mit hoher Spezifität erfaßt. Dies beruht auf der selektiven Expression bestimmter Oberflächenproteine, die Krebszellen von anderen Zellen unterscheidet.
Durch den Einsatz der Antikörpermischung wird ganz grundsätzlich im Vergleich zu separat eingesetzten Antikörpern bei der Zelltrennung unabhängig von der angewendeten Methode eine erhöhte Sensitivität nachgewiesen. Dies zeigt sich in Fig. 3, bei der im Teilbild A mit dem Antikörper BER-EP4 belegte magnetische Partikel, in dem Teilbild B mit dem Antikörper MOC-31 belegte magnetische Partikel und in dem Teilbild C ein Mix aus Partikeln die jeweils separat mit einem Antikörper belegt sind, eingesetzt wurden.
Für jeden der Antikörper bzw. der Antikörpermischungen wurden insgesamt vier Messungen durchgeführt, bei denen 0, 10, 100 bzw. 1000 Karzinom-Zellen in 10 ml Blut inokuliert wurden. Die Spuren la bis 4a, 1b bis 4b bzw. lc bis 4c zeigen dann den Nachweis von RNA nach RNA-Präparation und RT-PCR mit Tumormarker- spezifischen Primern wie oben beschrieben für Proben von jeweils 1 μl Volumen. Die Fig. 3 wurde dabei mit- tels elektrophoretischer Trennung in einem Agilent™ Bioanalyser 2100 gemäß Herstellerangaben ermittelt.
Bei Verwendung von lediglich mit einem Antikörper markierten magnetischen Partikeln wie in den Fign. 3A und 3B wurde lediglich bei einem Gehalt von 1000 Zellen ein Nachweis positiv möglich. Bei Verwendung einer Antikörpermischung wie in Fig. 3C wurde bereits ein Nachweis bei nur 100 Zellen und damit um den Faktor 10 sensitiver erbracht.
Bei diesem Beispiel wurden experimentelle Ergebnisse gezeigt, die nicht die maximale mögliche Sensitivität darstellen, sondern beispielhaft die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erreichbare Sensitivitätserhö- hung demonstrieren sollen.
Fig. 4 zeigt den Nachweis von Brustkrebszellen durch die gleichzeitige Erfassung der Tumorzellmarker GA733.2, MUCl, Her-2 und Claudin-7. Dabei wurden Brusttumorzellen in eine Probe inokuliert, wobei verschiedene Zeil-Linien, Zeil-Linie 1 und Zeil-Linie 2 eingebracht wurden. Vor der Bestimmung der Marker erfolgte eine Anreicherung der Tumorzellen mittels Antikörper-gekoppelter Magnetpartikel, wobei die Anti- körper BerEp4, HMTV.2, GP1.4 verwendet wurden. Fig. 4 zeigt nun, daß für beide Zeil-Linien durch eine derartige Kombination der zu erfassenden Tumormarker eine sicherer Erkennung bis herab zu zwei Zellen pro 5 ml nachgewiesen werden können. Eine unspezifische Re- aktion erfolgte dabei nicht. Im folgenden sind die Bedingungen für die PCR für die verschiedenen, in Fig. 4 bis Fig. 8 dargestellten Polymerasekettenreak- tionen zum Nachweis von Tumormarkern aus Brustkrebszellen dargestellt.
Standard, Fig.
Figure imgf000025_0001
Zyklen: 35
Multiplex 1, Fig. 5A
Figure imgf000025_0002
Zyklen : 35
Multiplex 2, Fig. 5B
Figure imgf000026_0001
Zyklen: 35
Multiplex 3, Fig. 6
Figure imgf000026_0002
Zyklen : 35
Multiplex 4 , Fig . 7
Figure imgf000027_0001
Zyklen: 35
Multiplex 5, Fig. 8A
Figure imgf000027_0002
Zyklen: 40
Fig. 5 zeigt ebenfalls den Nachweis von Brusttumorzellen, wobei hier die Kombinationen aus den Markern GA733.2, PDGF-ß, Her-2 und Claudin-7 (Fig. 5A) bzw. GA733.2, MUCl und CEA erfaßt wurden. Wiederum erfolgt eine sehr sensitive Erfassung bis herab zu zwei Zellen pro 5 ml Probe, während in einer Kontroll- Blutprobe keine unspezifischen Nachweisreaktionen auftraten.
In Fig. 6 ist die Verwendung der Markerkombination GA733.2, PDGF-ß und Claudin-7 (Fig. 6A) bzw. GA733.2, PDGF-ß und Claudin-7 (Fig. 6B) für eine erste Zell- Linie (Fig. 6A) bzw. eine zweite Zell-Linie (Fig. 6B) dargestellt. Wiederum erfolgt ein hochspezifischer Nachweis ohne unspezifische Reaktionen, wobei hier die Zell-Linie 2 besser nachgewiesen werden kann als die Zell-Linie 1. In Fig. 7 ist wiederum ein Nachweis mittels der Kombination der Marker GA733.2, MUCl und Claudin-7 dargestellt. Es erfolgt ein hochspezifischer Nachweis für die Zell-Linie 2 bis herab zu zwei Zellen pro 5 ml für jeden einzelnen der Marker und insbesondere für die Kombination der Marker ohne un- spezifische Nachweisreaktionen.
Fig. 8 zeigt den Nachweis mittels der Markerkombination GA733.2, PDGF-ß und CEA für die Zell-Linie 2. Es erfolgt wiederum ein sehr spezifischer Nachweis bis herab zu zwei Zellen pro 5 ml Probe ohne unspezifische Nachweisreaktionen.
Das erfindungsgemäße Diagnose-Kit und das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es weiterhin, die sor- tierten und separierten Zellen anschließend beliebig weiter zu verwenden. Beispielsweise können diese in ein geeignetes Zellkulturmedium eingesetzt und in situ kultiviert werden.
Da die Zellen nach der Trennung intakt sind, bleiben auch die Eigenschaften der Zellmembran und des Zeil- kerns erhalten. Dies eröffnet die Möglichkeit, mikroskopisch die Expression weiterer Oberflächenmarker untersuchen oder auch Chromosomen-Analysen durchzuführen. Die sortierten Zellen werden dazu auf Objekt- träger aufgebracht. Der Nachweis weiterer Oberflächenmarker kann cytochemisch oder über Fluoreszenzmikroskopie erfolgen. Ebenso können genetische Analysen durchgeführt werden, wie beispielsweise Chromosomenanalysen mittels FISH (Flurorescence in situ hybridi- sation) oder Karyogramm-Erstellung.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Diagnostik oder Behandlungskon- trolle von Brustkrebs bei einem Menschen, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß in einer Blutprobe des Menschen das Vorhandensein oder Fehlen von mindestens zwei verschiedener mRNS erfaßt wird, die für verschiede- ne der Tumormarkerproteine EGF-R, CEA, Stanniocalcin, CK20, MAGE-3, GA733.2, MUCl, Her-2/neu, Claudin-7 und/oder PDGF-ß kodiert und daraus auf das Vorhandensein von Mammakarzinomzellen in der Blutprobe und damit auf mögliche Metastasierung geschlossen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Vorhandensein oder Fehlen von mindestens zwei verschiedener mRNS erfaßt wird, die für verschiedene der Tumormarkerproteine GA733.2 und MUCl; Her-2/neu und Claudin-7; CK20, MAGE-3 und MUCl oder Stanniocalcin, EGF-R und CEA kodieren.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Vorhandensein oder Fehlen von mindestens drei verschiedener mRNS erfaßt wird.
4. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da- durch gekennzeichnet, daß die mRNS zu den Genen der folgenden Kombinationen GA733.2, MUCl, Her-
2/neu und Claudin-7; GA733.2, PDGF-ß, Her-2/neu und Claudin-7; GA733.2, MUCl und CEA, GA733.2, PDGF-ß und Claudin-7 oder GA733.2, MUCl und Claudin-7 erfaßt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß aus der Blutprobe Tumorzellen abgetrennt bzw. angereichert werden und der Nachweis an diesen Tumorzellen erfolgt.
6. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Mammakarzinomzel- len mittels für Tumorzellen allgemein spezifischer Antikörper und/oder mittels für Mammakar- zinomzellen spezifischer Antikörper oder Mi- schungen derartiger Antikörper abgetrennt bzw. angereichert werden.
7. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Abtrennung von Mammatumorzellen verwendeten Antikörper oder Antikörperderivate Bindungsstellen aufweisen, die an Epitope eines epithelialen Antigens eines epithelialen Membranantigens und/oder des Antigens MUCl binden.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß als Antikörper MOC-31 und/oder Ber-EP4 bzw. eine Mischung aus diesen verwendet werden.
9. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Antikörper 131-11741, E29, GP1.4 und/oder HMPV.2 bzw. eine Mischung aus diesen allen verwendet werden.
10. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden
Ansprüche, dadurch" gekennzeichnet, daß die Mamm- akarzino zellen mittels an Magnetpartikel gebundener Antikörper abgetrennt bzw. angereichert werden.
11. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Mam akarzinomzellen mittels fluoreszenzaktivierter Durchflußzytometrie, Dichte- gradientenzentrifugation und/oder Zentrifugation nach Erythrozytenlyse abgetrennt bzw. angerei- chert werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zentrifugation der Blutprobe zur Pelletierung der in ihr enthaltenen Leukozyten durchgeführt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die RNS-haltigen Bestandteile der Probe mittels Lyse der darin enthaltener Erythrozyten und anschließender Pelletierung der nichtlysier- ten Leukozyten aufkonzentriert werden.
14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die RNS-haltigen Bestandteile durch mindestens eine Dichtegradienten-Zentrifugation der Blutprobe zur Abseparierung und Gewinnung der in ihr enthaltenen mononukleären Blutzellen aufkonzentriert werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die gewonnenen mononukleären Blutzellen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern markiert und mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) von der Probe abgetrennt und gewonnen werden.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die mononukleären
Zellen der gewonnenen Fraktion lysiert und die mRNS abgetrennt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich- net, daß die RNS (Gesamt-RNS oder mRNS) in herkömmlicher Weise unmittelbar aus der Vollblutprobe .isoliert wird.
18. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da- durch gekennzeichnet, daß anschließend an die
Isolation der RNS ein DNS-Verdau durchgeführt wird.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü- ehe, dadurch gekennzeichnet, daß die gewonnene mRNS in cDNS revers transkribiert wird und anschließend das Vorhandensein oder Fehlen der cDNS erfaßt wird, die dem Tumormarkerprotein zugeordnet ist.
20. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein vorbestimmter Abschnitte der cDNS durch Polymerase- Kettenreaktion ("PCR") vervielfältigt wird.
21. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vervielfältigung der cDNS eines oder mehrere Oligonukleotid-Paare verwendet werden, die die folgenden Sequenzen aufweisen:
AATCGTCAATGCCAGTGTACTTCA und TAACGCGTTGTGATCTCCTTCTGA und/oder AGTCGGGCTCTGGAGGAAAAGAAA und , GATCATAATTCCTCTGCACATAGG und/oder AGAAATGACGCAAGAGCCTATGTA und AACTTGTGTGTGTTGCTGCGGTAT und/oder TCAGCTTCTACTCTGGTGCACAAC und TGGTAGTAGTCGGTGCTGGGATCT und/oder CCCAGTGTGTCAACTGCAGCCAGT und CAGATGGGCATGTAGGAGAGGTCA und/oder GTCTTGCCGCCTTGGTAGCTTGCT und TGGACTTAGGGTAAGAGCGGGGTG und/oder ATCTCCAAGGCCTGAATAAGGTCT und CCTCAGTTCCTTTTAATTCTTCAGT und/oder CTCCAGCCTCCCCACTACCATGAA und TTGTCACCCAGCAGGCCATCGTAG und/oder AACCCATGAGGCGGAGCAGAATGA und CGTTGGCGATGCATTTTAAGCTCT und/oder TCTCTCTGCTGCTACCTGCGTCTG und GTTGGCGTTGGTGCGGTCTATGAG
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden An- sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als interne
Kontrolle die mRNS des Proteins ß-Aktin bestimmt wird.
23. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die mRNS für ß-Aktin in cDNS revers transkribiert und ein Abschnitt der cDNS mittels Polymerasekettenreaktion vervielfältigt wird.
24. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vervielfältigung der cDNS des ß-Aktin ein Oligonukleotid-Paar verwendet wird, wobei die Oligonukleotide des Paares die folgenden Sequenzen aufweisen: CTG GAG AAG AGC TAG GAG CTG CCT und ACA GGA CTC CAT GCC CAG GAA GGA.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß der vervielfältigte cDNS-Abschnitt durch geeignete Restriktionsenzyme verdaut und anhand der erzeugten cDNS- Bruchstücke das Vorhandensein oder Fehlen der mRNS eines Tumormarkerproteins bestimmt wird.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der am- plifizierten cDNS-Abschnitte eine Gelelektrophorese der PCR-Produkte durchgeführt wird.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der am- plifizierten cDNS-Abschnitte eine Fragmentanalyse durchgeführt wird.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß während des Verlaufs der Polymerasekettenreaktion die von den Produkten erzeugte Fluoreszenz erfaßt und die Produk- tentwicklung erfaßt wird (fluoreszenzbasierte
Echtzeit-PCR) .
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der mRNS oder cDNS ein Nukleotid-Mikroarray nach einem der Ansprüche 50 oder 51 verwendet wird.
30. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der am- plifizierten cDNS das PCR-Produkt auf ein Nukleotid-Mikroarray nach einem der Ansprüche 50 oder 51 aufgetragen wird.
31. Diagnose-Kit zur Diagnostik oder Behandlungskon- trolle von Brustkrebs mit mindestens zwei Paaren
Oligonukleotide (Reverseprimer, Forwardprimer) , wobei die beiden Oligonukleotide jedes Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion jeweils eines der beiden kom- plementären Stränge verschiedener gesuchter DNS-
Abschnitte geeignet sind, und wobei die gesuchten DNS-Abschnitte Teil der cDNS zu verschiedenen der Gene CK20, EGF-R, CEA, Stanniocalcin, MAGE-3, GA733.2, MUC-1, Her- 2/neu, Claudin-7 und/oder PDGF-ß ist.
32. Diagnose nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens drei Paare Oligonukleotide (Reverseprimer, Forwardprimer) enthält, wobei die beiden Oligonukleotide der jeweiligen Paare als Primer zur Amplifikation mittels Poly- merasekettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge verschiedener gesuchter DNS-Abschnitte geeignet sind, und wobei die gesuchten DNS-Abschnitt jeweils Teil der c-DNS zu verschiedenen Tumormarkerproteinen ausgewählt aus den Tumormarkerproteinen CK20, EGF-R, CEA und Stanniocalcin bzw. CK20, MAGE-3, GA733.2, MUC-1, Her-2/neu, Claudin-7 und PDGF-ß sind.
33. Diagnose-Kit nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die zwei gesuchten DNS-Abschnitte jeweils Teil der c-DNS zu jeweils zwei der Gene aus den folgenden Gruppen
GA733.2 und MUCl; Her-2/neu und Claudin-7; CK20,
MAGE-3 und MUCl oder Stanniocalcin, EGF-R und
CEA sind.
34. Diagnose-Kit nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die gesuchten DNS-Abschnitte Teil der c-DNS zu den Genen der Kombinationen GA733.2, MUCl, Her-2/neu und Claudin-7; GA733.2, PDGF-ß, Her-2/neu und Claudin-7;
GA733.2, MUCl und CEA;
GA733.2, PDGF-ß und Claudin-7 bzw. GA733.2, MUCl und Claudin-7 sind.
35. Diagnose-Kit nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens vier Paare Oligonukleotide (Reverseprimer, Forwardprimer) enthält, wobei die beiden Oligonukleotide der jeweiligen Paare als Primer zur Amplifikation mittels Poly- merasekettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge verschiedener gesuchter DNS-Abschnitte geeignet sind, und wobei die gesuchten DNS-Abschnitt jeweils Teil der c-DNS zu verschiedenen Tumormarkerproteinen ausgewählt aus den Tumormarkerproteinen CK20, EGF-R, CEA und Stanniocalcin bzw. CK20, MAGE-3, GA733.2, MUC-1, Her-2/neu, Claudin-7 und PDGF-ß sind.
36. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein weiteres Paar Oligonukleotide enthält, die jeweils als Primer zur Amplifikation zumindest eines Abschnitts eines der beiden komplementären Stränge der cDNS zu dem Protein ß-Aktin als interne Kontrolle geeignet sind.
37. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Oligonu- kleotide eines Paares paarweise die folgenden
Sequenzen aufweisen:
AATCGTCAATGCCAGTGTACTTCA und
TAACGCGTTGTGATCTCCTTCTGA und/oder AGTCGGGCTCTGGAGGAAAAGAAA und
GATCATAATTCCTCTGCACATAGG und/oder
AGAAATGACGCAAGAGCCTATGTA und
AACTTGTGTGTGTTGCTGCGGTAT und/oder
TCAGCTTCTACTCTGGTGCACAAC und TGGTAGTAGTCGGTGCTGGGATCT und/oder
CCCAGTGTGTCAACTGCAGCCAGT und
CAGATGGGCATGTAGGAGAGGTCA und/oder
GTCTTGCCGCCTTGGTAGCTTGCT und
TGGACTTAGGGTAAGAGCGGGGTG und/oder ATCTCCAAGGCCTGAATAAGGTCTund CCTCAGTTCCTTTTAATTCTTCAGT und/oder CTCCAGCCTCCCCACTACCATGAA und TTGTCACCCAGCAGGCCATCGTAG und/oder AACCCATGAGGCGGAGCAGAATGA und CGTTGGCGATGCATTTTAAGCTCT und/oder
TCTCTCTGCTGCTACCTGCGTCTG und GTTGGCGTTGGTGCGGTCTATGAG.
38. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehen- den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest jeweils eines der beiden Oligonukleotide eines Paares von Oligonukleotiden mit Fluoropho- ren markiert ist.
39. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide verschiedener Paare mit verschiedenen Fluoropho- ren markiert sind.
40. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 31 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Amplifikation der cDNS zu ß-Aktin ein Paar Oligonukleotide mit den folgenden Sequenzen enthält: CTG GAG AAG AGC TAG GAG CTG CCT und ACA GGA CTC CAT GCC CAG GAA GGA.
41. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest jeweils eines der beiden Oligonukleotide des Paares zur Amplifikation der cDNS zu ß-Aktin mit Fluoropho- ren markiert ist.
42. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 31 bis 41, dadurch gekennzeichnet, daß es die zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion erforderlichen Substanzen enthält.
43. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 31 bis 42, dadurch gekennzeichnet, daß es als zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion erforderliche Substanzen eine Pufferlösung, Magnesiumchlorid, Desoxynukleotid-Triphosphate sowie eine hitzestabile Polymerase enthält.
44. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es als hitzestabile Polymerase eine Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq-Polymerase) enthält.
45. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 31 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß es als Positivkontrolle eine DNS-Probe mit dem jeweils gesuchten DNS-Abschnitt enthält.
46. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 31 bis 45, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Anleitung zur Durchführung der Polyme- rasekettenreaktion und/oder eine Anleitung zur Durchführung einer Fragmentanalyse enthält.
47. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 31 bis 46, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Schema zur
Auswertung der erhaltenen Meßergebnisse enthält.
48. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 41 bis 47, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Mikroarray (DNS-Chip) enthält, wobei der Array eine Anzahl voneinander getrennter Zellen (Felder) aufweist und in mindestens einer Zelle des Mikroarrays ein Oligonukleotid angeordnet ist, das mit dem gesuchten DNS-Abschnitt hybridisiert.
49. Diagnosekit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer weiteren Zelle des Mikroarrays ein weiteres Oligonukleotid angeordnet ist und die Sequenz des Oligonukleotids, das in der mindestens einen Zelle angeordnet ist, sich von der Sequenz des weiteren Oligonukleotides unterscheidet.
50. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens zwei Zellen jeweils ein Oligonukleo- tid angeordnet ist, wobei die in verschiedenen
Zellen angeordneten Oligonukleotide jeweils mit verschiedenen gesuchten DNS-Abschnitten hybridisieren.
51. Mikroarray zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Brustkrebs, beispielsweise DNS-Chip, mit einer Anordnung von mehreren, voneinander getrennten Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens zwei Zellen jeweils verschiedener Oligonukleotide angeordnet sind, die mit einem
DNS-Abschnitt hybridisieren, der Teil der cDNS zu zwei verschiedene der Tumormarkerproteine EGF-R, CEA, Stanniocalcin, CK20, MAGE-3 GA733.2, MUC-1, Her-2/neu, Claudin-7 und/oder PDGF-ß ist.
52. Mikroarray nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, daß in zwei bis vier Zellen jeweils verschiedene Oligonukleotide angeordnet sind, die mit jeweils zwei bis vier verschiedenen DNS- Abschnitten, die Teil der cDNS von jeweils verschiedenen Tumormarkerproteinen ausgewählt aus den Tumormarkerproteinen CK20, EGF-R, CEA, Stan- niocalcin, CK20, MAGE-3 GA733.2, MUC-1, Her-
2/neu, Claudin-7 und/oder PDGF-ß sind, hybridisieren.
53. Mikroarray nach Anspruch 51, dadurch gekenn- zeichnet, daß in mindestens zwei Zellen jeweils verschiedene Oligonukleotide angeordnet sind, die mit mindestens zwei DNS-Abschnitten hybridisieren, die Teil der c-DNS zu den Genen aus den Gruppen GA733.2 und MUCl; Her-2/neu und Claudin-7; CK20, MAGE-3 und MUCl bzw. Stanniocalcin, EGF-R und CEA sind.
54. Mikroarray nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, daß in mehreren Zellen Oligonukleotide angeordnet sind, die mit DNS-Abschnitten hybridisieren, die Teil der c-DNS zu den Genen der Gruppen GA733.2, MUCl, Her-2/neu und Claudin-7; GA733.2, PDGF-ß, Her-2/neu und Claudin-7, GA733.2, MUCl und CEA; GA733.2, PDGF-ß und Claudin-7.
55. Verwendung eines Diagnose-Kits, eines Mikroarrays und/oder eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Diagnose von Er- krankungen oder Metastasierung oder zur Behandlungskontrolle bei Brustkrebs.
PCT/EP2002/009999 2001-09-06 2002-09-06 Verfahren und kit zur diagnostik oder behandlungskontrolle von brustkrebs WO2003023060A2 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP02774579A EP1409746A2 (de) 2001-09-06 2002-09-06 Verfahren und kit zur diagnostik oder behandlungskontrolle von brustkrebs
US10/488,828 US20050014208A1 (en) 2001-09-06 2002-09-06 Method and kit for diagnosing or controlling the treatment of breast cancer

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10143776A DE10143776A1 (de) 2001-09-06 2001-09-06 Verfahren und Kit zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Brustkrebs
DE10143776.5 2001-09-06
PCT/EP2002/005489 WO2003023057A2 (de) 2001-09-06 2002-05-17 Verfahren und diagnose-kit zur selektionierung und/oder zum qualitativen und/oder quantitativen nachweis von zellen
EPPCT/EP02/05489 2002-05-17

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2003023060A2 true WO2003023060A2 (de) 2003-03-20
WO2003023060A3 WO2003023060A3 (de) 2004-01-29

Family

ID=26010082

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2002/009999 WO2003023060A2 (de) 2001-09-06 2002-09-06 Verfahren und kit zur diagnostik oder behandlungskontrolle von brustkrebs

Country Status (2)

Country Link
EP (1) EP1409746A2 (de)
WO (1) WO2003023060A2 (de)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1693467A1 (de) * 2005-02-17 2006-08-23 Tosoh Corporation Stanniocalcin (STC1) mRNS Untersuchungsverfahren
EP1694865A1 (de) * 2003-12-12 2006-08-30 Bayer Pharmaceuticals Corporation Verfahren zur vorhersage und prognose von krebs und überwachung der krebstherapie
WO2007048978A2 (fr) * 2005-10-28 2007-05-03 Biomerieux Sa Procede de detection du cancer
FR2892730A1 (fr) * 2005-10-28 2007-05-04 Biomerieux Sa Methode pour detecter la presence ou le risque de developper un cancer
FR2899239A1 (fr) * 2006-03-31 2007-10-05 Biomerieux Sa Procede de detection du cancer
US20080138805A1 (en) * 2004-08-11 2008-06-12 Condeelis John S Isolation, Gene Expression, and Chemotherapeutic Resistance of Motile Cancer Cells
US7507528B2 (en) 2001-09-06 2009-03-24 Adnagen Ag Method and diagnosis kit for selecting and or qualitative and/or quantitative detection of cells
EP2088204A1 (de) * 2008-02-05 2009-08-12 Adnagen AG Verfahren und Kit zur Diagnose bzw. Kontrolle der Behandlung von Ovarialkarzinomen
WO2011086174A3 (en) * 2010-01-15 2011-10-06 Diagenic Asa Diagnostic gene expression platform

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994007139A1 (en) * 1992-09-14 1994-03-31 Fodstad Oystein Improved method for detection of specific target cells in specialized or mixed cell population and solutions containing mixed cell populations
DE19736691A1 (de) * 1997-08-22 1999-02-25 Michael Prof Dr Med Giesing Verfahren zur Charakterisierung und Identifizierung disseminierter und metastasierter Krebszellen
WO1999044064A1 (en) * 1998-02-27 1999-09-02 Cli Oncology, Inc. Method and compositions for differential detection of primary tumor cells and metastatic cells

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994007139A1 (en) * 1992-09-14 1994-03-31 Fodstad Oystein Improved method for detection of specific target cells in specialized or mixed cell population and solutions containing mixed cell populations
DE19736691A1 (de) * 1997-08-22 1999-02-25 Michael Prof Dr Med Giesing Verfahren zur Charakterisierung und Identifizierung disseminierter und metastasierter Krebszellen
WO1999044064A1 (en) * 1998-02-27 1999-09-02 Cli Oncology, Inc. Method and compositions for differential detection of primary tumor cells and metastatic cells

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BALZAR M ET AL: "The biology of the 17-1A antigen (Ep-CAM)" JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE, SPRINGER VERLAG, DE, Bd. 77, Nr. 10, Oktober 1999 (1999-10), Seiten 699-712, XP000925817 ISSN: 0946-2716 *
CHARPENTIER A H ET AL: "STC2 AND E2IG1, TWO NOVEL BREAST CANCER BIOMARKERS" PROCEEDINGS OF THE ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, NEW YORK, NY, US, Bd. 42, Nr. 628, März 2001 (2001-03), Seite 628 XP001119829 ISSN: 0197-016X *
CHRYSOGELOS S A ET AL: "EGF RECEPTOR EXPRESSION, REGULATION, AND FUNCTION IN BREAST CANCER" BREAST CANCER RESEARCH AND TREATMENT, NIJHOFF, BOSTON, US, Bd. 29, Nr. 1, 1994, Seiten 29-40, XP001118068 ISSN: 0167-6806 *
COLTRERA MARC D ET AL: "Expression of Platelet-derived Growth Factor B-Chain and the Platelet-derived Growth Factor Receptor beta Subunit in Human Breast Tissue and Breast Carcinoma." CANCER RESEARCH, Bd. 55, Nr. 12, 1995, Seiten 2703-2708, XP001153992 ISSN: 0008-5472 *
FUJIWARA Y ET AL: "ASSESSMENT OF STANNIOCALCIN-1 MRNA AS A MOLECULAR MARKER FOR MICROMETASTASES OF VARIOUS HUMAN CANCERS" INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY, EDITORIAL ACADEMY OF THE INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY,, GR, Bd. 16, April 2000 (2000-04), Seiten 799-804, XP002938551 ISSN: 1019-6439 *
GHOSSEIN R A ET AL: "Molecular detection of micrometastases and circulating tumor cells in solid tumors" CLINICAL CANCER RESEARCH, THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, US, Bd. 5, Nr. 8, August 1999 (1999-08), Seiten 1950-1960, XP002225510 ISSN: 1078-0432 *
HARDINGHAM J E ET AL: "IMMUNOBEAD-PCR: A TECHNIQUE FOR THE DETECTION OF CIRCULATING TUMOR CELLS USING IMMUNOMAGNETIC BEADS AND THE POLYMERASE CHAIN REACTION" CANCER RESEARCH, AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, BALTIMORE, MD, US, Bd. 53, 1. August 1993 (1993-08-01), Seiten 3455-3458, XP000605489 ISSN: 0008-5472 *
MARTIN KATHERINE J ET AL: "High-sensitivity array analysis of gene expression for the early detection of disseminated breast tumor cells in peripheral blood" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON, US, Bd. 98, Nr. 5, 27. Februar 2001 (2001-02-27), Seiten 2646-2651, XP002188522 ISSN: 0027-8424 *
NACHT MARIANA ET AL: "Combining serial analysis of gene expression and array technologies to identify genes differentially expressed in breast cancer" CANCER RESEARCH, AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, BALTIMORE, MD, US, Bd. 59, Nr. 21, 1. November 1999 (1999-11-01), Seiten 5464-5470, XP002166291 ISSN: 0008-5472 *
RACILA E ET AL: "Detection and charcterization of carcinoma cells in the blood" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON, US, Bd. 95, April 1998 (1998-04), Seiten 4589-4594, XP002132943 ISSN: 0027-8424 *
SMITH B ET AL: "DETECTION OF MELANOMA CELLS IN PERIPHERAL BLOOD BY MEANS OF REVERSE TRANSCRIPTASE AND POLYMERASE CHAIN REACTION" LANCET THE, LANCET LIMITED. LONDON, GB, Bd. 338, 16. November 1991 (1991-11-16), Seiten 1227-1229, XP002008751 ISSN: 0140-6736 *
ZHONG X Y ET AL: "EVALUATING GA733-2 MRNA AS A MARKER FOR THE DETECTION OF MICROMETASTATIC BREAST CANCER IN PERIPHERAL BLOOD AND BONE MARROW" ARCHIVES OF GYNECOLOGY AND OBSTETRICS, SPRINGER VERLAG, BERLIN, DE, Bd. 263, Nr. 1/2, 1999, Seiten 2-6, XP000929386 ISSN: 0932-0067 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7507528B2 (en) 2001-09-06 2009-03-24 Adnagen Ag Method and diagnosis kit for selecting and or qualitative and/or quantitative detection of cells
EP1694865A1 (de) * 2003-12-12 2006-08-30 Bayer Pharmaceuticals Corporation Verfahren zur vorhersage und prognose von krebs und überwachung der krebstherapie
EP1694865A4 (de) * 2003-12-12 2007-06-06 Bayer Pharmaceuticals Corp Verfahren zur vorhersage und prognose von krebs und überwachung der krebstherapie
US8298756B2 (en) * 2004-08-11 2012-10-30 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Isolation, gene expression, and chemotherapeutic resistance of motile cancer cells
US20080138805A1 (en) * 2004-08-11 2008-06-12 Condeelis John S Isolation, Gene Expression, and Chemotherapeutic Resistance of Motile Cancer Cells
EP1693467A1 (de) * 2005-02-17 2006-08-23 Tosoh Corporation Stanniocalcin (STC1) mRNS Untersuchungsverfahren
WO2007048978A2 (fr) * 2005-10-28 2007-05-03 Biomerieux Sa Procede de detection du cancer
FR2892730A1 (fr) * 2005-10-28 2007-05-04 Biomerieux Sa Methode pour detecter la presence ou le risque de developper un cancer
WO2007048978A3 (fr) * 2005-10-28 2007-09-07 Biomerieux Sa Procede de detection du cancer
FR2899239A1 (fr) * 2006-03-31 2007-10-05 Biomerieux Sa Procede de detection du cancer
WO2009098045A1 (en) * 2008-02-05 2009-08-13 Adnagen Ag Method and kit for detecting, diagnosting or controlling the treatment of ovarian cancer
EP2088204A1 (de) * 2008-02-05 2009-08-12 Adnagen AG Verfahren und Kit zur Diagnose bzw. Kontrolle der Behandlung von Ovarialkarzinomen
WO2011086174A3 (en) * 2010-01-15 2011-10-06 Diagenic Asa Diagnostic gene expression platform

Also Published As

Publication number Publication date
EP1409746A2 (de) 2004-04-21
WO2003023060A3 (de) 2004-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE10143776A1 (de) Verfahren und Kit zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Brustkrebs
EP1409727A2 (de) Verfahren und diagnose-kit zur selektionierung und/oder zum qualitativen und/oder quantitativen nachweis von zellen
DE60029092T2 (de) Verfahren zur detektion von nukleinsäuren, welche auf krebs hinweisen
DE60126592T2 (de) Verfahren, zusammensetzungen und kits zur identifizierung und überwachung von brustkrebs
US9957571B2 (en) Methods and composition to generate unique sequence DNA probes, labeling of DNA probes and the use of these probes
DE60030281T2 (de) Methoden zur verbesserung der sensitivität und spezifität von screeningverfahren für krebs und krebs-vorstufen
EP1532444B1 (de) Verfahren zum untersuchen von körperflüssikeiten auf krebszellen sowie entsprechende analysekits
DE602004004988T2 (de) Methylierungsstatus-Detektionsassays mittels methylierungsspezifischer Primerextension (MSPE)
EP1448792A1 (de) Diagnose-kit, dns-chip sowie verfahren zur diagnostik oder behandlungskontrolle bei hodenkrebs
EP1409745B1 (de) Verfahren und kit zur diagnostik oder behandlungskontrolle von darmkrebs
WO2003023060A2 (de) Verfahren und kit zur diagnostik oder behandlungskontrolle von brustkrebs
DE69725297T2 (de) Immuno-magnetische zelltrennung zur erkennung von krebsmetastasenbildung-assozierten genen
EP1529206A1 (de) Verfahren zum immunzytologischen oder molekularen nachweis von disseminierten tumorzellen aus einer körperflüssigkeit und dazu geeigneter kit
EP1664349A2 (de) Verfahren zur nichtinvasiven früherkennung von dickdarmkrebs und/oder darmkrebsvorläuferzellen
CN110747275B (zh) 肿瘤细胞标记分子及其应用
DE10037769A1 (de) Diagnose von mit CD24 assoziierten Krankheiten
DE10143775A1 (de) Verfahren und Kit zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Darmkrebs
DE10217102B4 (de) Verfahren zur Charakterisierung von Primärtumoren
DE60316464T2 (de) Neue real-time rt-pcr methode zur sensitiven detektierung mehrerer mage gen transkripte
DE10102687A1 (de) Trisomie 13-Diagnostik-Kit
DE10059776A1 (de) Trisomie 21-Diagnostik-Kit
CN110678752A (zh) 在癌症筛查、诊断、治疗和复发中利用巨细胞核酸表征的方法
DE10057894A1 (de) Diagnose-Kit, DNS-Chip sowie Verfahren zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle bei Hodenkrebs
DE102017214449A1 (de) Verfahren und Mittel zur Diagnostik von Tumoren durch Nachweis und Quantifizierung heterogen methylierter Epiallele
WO1999001573A2 (de) Verfahren und testkit zum nachweis bösartiger tumore

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): JP

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE SK TR

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002774579

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2002774579

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10488828

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP