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Die
Erfindung bezieht sich auf den Nachweis und die Bestimmung von Erythrocytopathien
und Hämoglobinopathien.
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Der
Nachweis von zirkulierenden fetalen Zellen in mütterlichen Blutproben ist ein
wichtiges Gebiet der labormäßigen Unterstützung der
geburtshilflichen Betreuung von Frauen. Obwohl die Konzentration
von fetalen Erythrocyten, die man während der Schwangerschaft im
mütterlichen
Blutkreislauf findet, meistens sehr gering und in vielen Fällen ohne
eindeutige klinische Bedeutung ist, kann es aufgrund von mehreren
Ursachen einschließlich
fetalem oder mütterlichem
Trauma und Plazentadefekten zu erheblichen Blutungen kommen (1).
Die Quantifizierung von fetalen roten Blutkörperchen (RBCs) wird am häufigsten
verwendet, um den Grad der fetomaternalen Blutung (FMH) abzuschätzen, und
zwar entweder in Fällen
von Trauma mit vermuteter Plazentaverletzung oder in der Situation
einer RhD-Unverträglichkeit
zwischen dem Fetus und der Mutter, um eine hämolytische Erkrankung des Neugeborenen (HDN)
während
der Schwangerschaft zu verhindern (2, 3). Die geburtshilfliche Betreuung
von Frauen beinhaltet die Verhinderung einer Immunisierung der Mutter
gegen ein fremdes fetales Zellantigen und die Überwachung der mütterlichen
Antikörperkonzentration.
Um eine Immunantwort zu verhindern, wird der Mutter eine Immunprophylaxe
auf der Basis von polyklonalen Anti-RhD-Antikörpern in einer Dosis verabreicht,
die der geschätzten
Zahl von im mütterlichen
Blutkreislauf vorhandenen fetalen RBCs proportional ist (4, 5).
Es ist daher wichtig, in der Lage zu sein, die relative Menge dieser
Zellen wenigstens halbwegs quantifizieren zu können.
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Die
meisten klinischen Labors führen FMH-Schätzungen
auf der Basis von Variationen des auf Objektträgern basierenden mikroskopischen Zählverfahrens
der Säureelution
durch, das ursprünglich
als Kleihauer-Betke-Test beschrieben wurde (6). Obwohl sich dieser
Assay als klinisch nützlich
beim Nachweis großer
Episoden von FMH, die eine mütterliche
Behandlung mit mehr als der Standarddosis von Rh-Immunglobulin erfordern,
erwiesen hat, ist er mühsam
und leidet unter Subjektivität
und Ungenauigkeit (7, 8). Neben der Erfahrung der Labortechniker
bei der Interpretation der Ergebnisse hat der Test die Tendenz,
die Größe von fetomaternalen
Blutungen zu überschätzen, da
maternale HbF-haltige RBCs oder F-Zellen innerhalb der Population
der fetalen Zellen gezählt
werden (9).
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Mehrere
alternative und genauere Screeningverfahren zum Nachweis von FMH
mit Hilfe der Durchflusscytometrie wurden vorgeschlagen und beschrieben.
Die ersten Berichte, die die Machbarkeit der Verwendung von Durchflusscytometrie
für die Zählung fetaler
Zellen untersuchten, beruhten auf dem Nachweis des humanen D-Antigens
auf der Zelloberfläche
von RBCs (10, 11, 12, 13). Diese Ansätze bewiesen alle eine größere Empfindlichkeit
und Genauigkeit als manuelle Verfahren. Die Verwendung von Anti-RhD
ist jedoch nur auf die klinischen Situationen mit Rh- oder D-Antigen-Unverträglichkeit
anwendbar und kann nicht in allen Fällen von mütterlichem Trauma und vermutetem
FMH verwendet werden. Vor kurzem wurden mehrere andere Verfahren zum
durchflusscytometrischen Nachweis von fetalen Zellen in maternalem
peripherem Blut beschrieben. Die Verfahren unterscheiden sich in
ihren Mitteln der Verwendung verschiedener zellulären Fixierungs- und
Permeabilisierungsschritte, gewöhnlich
in Kombination mit dem intrazellulären Nachweis von fetalem Hämoglobin(HbF)-Antigen unter Verwendung von
Anti-HbF-Antikörpern.
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Da
eine Erhöhung
der Expression von fetalem Hämoglobin
(HbF) in peripheren roten Blutzellen ebenfalls ein häufiges Merkmal
bei Hämoglobinopathien
sind, die genetische Störungen
des Hämoglobins
umfassen, wie Sichelzellanämie
und β-Thalassämie (14,
15, 16, 17), findet ein Verfahren zum Nachweis von HbF in Blutzellen
ebenfalls Verwendung bei der Diagnose von anderen Hämoglobinopathien
als solchen, die mit FHM zusammenhängen.
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Die
Erfindung gibt ein Verfahren zur Unterscheidung zwischen Untergruppen
von roten Blutzellen in einer Probe an, das das In-Kontakt-Bringen
der Probe mit wenigstens einem ersten Markerreagens, das gegenüber Hämoglobin
F der roten Blutzelle reaktiv ist, und wenigstens einem zweiten
Markerreagens, das gegenüber
einer Carboanhydrase einer roten Blutzelle reaktiv ist, und die
Bestimmung der Reaktivität
der Markerreagenzien gegenüber
den Zellen umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform gibt die Erfindung
ein Verfahren zur Unterscheidung zwischen und/oder Quantifizierung
von verschiedenen Untergruppen von Erythrocyten in einer Probe an, das
die Verwendung der wenigstens zwei Marker, die gegenüber wenigstens
zwei Untergruppen von roten Blutzellen reaktiv sind, umfasst. Zum
Diagnostizieren oder Bewerten von FMH unterscheidet die Erfindung zwischen
Untergruppen von roten Blutzellen in einer Probe und umfasst dabei
das kombinierte Testen auf eine Determinante von im Wesentlichen
fetalen Zellen mit einer Determinante von im Wesentlichen adulten
Zellen. Selbstverständlich
können
die verschiedenen Untergruppen insofern miteinander überlappen,
als einige Zellen in jeder Untergruppe zwei der Marker tragen, die
in dem gewählten
Verfahren verwendet werden. Das Verfahren ist am nützlichsten zur
Unterscheidung zwischen Untergruppen von reifen Erythrocyten, d.h.
solchen, die über
die Phase der kernhaltigen RBC oder die unreife Reticulocytenphase
hinaus gereift sind. In einer Ausführungsform gibt die Erfindung
ein Verfahren zur Unterscheidung zwischen und/oder Quantifizierung
von fetalen roten Blutzellen (RBCs) in maternalem Blut an, das die
Verwendung der wenigstens zwei Marker, die gegenüber verschiedenen Untergruppen
von roten Blutzellen reaktiv sind, umfasst. In einer anderen Ausführungsform
gibt die Erfindung ein Verfahren zur Unterscheidung zwischen und/oder
Quantifizierung von adulten HbF-haltigen RBCs in Blut an, das die
Verwendung der wenigstens zwei Marker, die gegenüber verschiedenen Untergruppen
von roten Blutzellen reaktiv sind, umfasst. Trotz der vor kurzem
berichteten Ergebnisse des Nachweises von fetalen HbF-haltigen Zellen
in verschiedenen mütterlichen
Blutproben bietet die Verwendung eines einzigen Parameters keine genaue
und zuverlässige
Quantifizierung von fetalen RBCs und maternalen F-Zellen. Ein Ansatz
mit zwei oder mehr Markern hat mehrere Vorteile. Obwohl die Verwendung
von HbF-Antigen als einziger Marker eine breite Anwendung des Nachweises
von fetalen roten Blutzellen auf viele klinische Situationen erlaubt,
beinhaltet die Verwendung von Anti-HbF für sich allein die Möglichkeit
einer Überschätzung des Anteils
von echten fetalen Zellen in einer gegebenen HbF-Population. Die
Verwendung des intrazellulären Zellmarkers
Carboanhydrase (CA) für
adulte RBCs (18) in Kombination mit HbF sollte zum Beispiel die eindeutige
Unterscheidung fetaler roter Blutzellen von möglichen störenden maternalen F-Zellen,
die einen niedrigeren zellulären
HbF-Gehalt haben und positiv in Bezug auf den CA-Marker reagieren,
ermöglichen.
Kleine Populationen von adulten Erythrocyten, die HbF enthalten,
finden sich in Individuen jeden Alters; diese Zellen wurden F-Zellen
genannt. Bei Menschen mit Sichelzellanämie sind diese Zellen funktionell
sehr wichtig, da sie Sauerstoff transportieren und freisetzen können.
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Es
wird ein Verfahren zur Unterscheidung zwischen Untergruppen von
roten Blutzellen in einer Probe angegeben, das das In-Kontakt-Bringen
der Probe mit wenigstens einem ersten Markerreagens, das gegenüber Hämoglobin
F der roten Blutzelle reaktiv ist, und wenigstens einem zweiten
Markerreagens, das gegenüber
einer Carboanhydrase einer roten Blutzelle reaktiv ist, und die
Bestimmung der Reaktivität
der Markerreagenzien gegenüber
den Zellen umfasst. Geeignete Zelloberflächenkomponenten, die weiterhin
nachgewiesen werden sollen, sind zum Beispiel: CD71, ein Typ-II-Membran-Glycoprotein von
90–95
kDa, das als Homodimer auf den meisten sich teilenden Zellen einschließlich RBCs
vorliegt. Das Protein spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufnahme
von Eisen durch die Bindung und Endocytose von Transferrin, dem
hauptsächlichen
eisentragenden Protein; GpA, ein Zelloberflächen-Sialoglycoprotein von
41 kDa, das ausschließlich
auf humanen Erythroidzellen und ihren Vorläufern exprimiert wird. Das
GpA-Protein ist klinisch wichtig bei der Klassifizierung von akuten
Leukämien;
d.h. eine glycosylierte Lewis-Antigen-Struktur, die auf adulten
T- und B-Lymphocyten
und fetalen Lymphocyten und RBCs während der ersten 8 Monate der
Entwicklung exprimiert wird. Bei einigen Anwendungen, wie dem durchflusscytometrischen
Nachweis, ist bevorzugt, dass wenigstens eine der nachzuweisenden
Komponenten eine intrazelluläre
Komponente umfasst. Geeignete intrazelluläre Komponenten sind zum Beispiel:
HbE, ein intrazelluläres
Hämoglobinprotein, das
aus 4 Proteinuntereinheiten von ungefähr 140 Aminosäuren besteht.
Das embryonale Hämoglobintetramer
besteht weiterhin aus verschiedenen Polypeptidketten, ε und ζ oder ε und α. Die Expression von
HbE ist bei embryonalen roten Blutzellen am deutlichsten ausgeprägt. CA,
Carboanhydrasen (Carbonatdehydratase; Carbonathydrolyase), bilden eine
große
Familie von Genen, die Zink-Metalloenzyme von großer physiologischer
Bedeutung codieren. Als Katalysatoren für die reversible Hydratation
von Kohlendioxid nehmen diese Enzyme an einer Vielzahl von biologischen
Prozessen teil, einschließlich Atmung,
Kalzifizierung, Säure-Base-Gleichgewicht, Knochenresorption
und die Bildung von Kammerwasser, Liquor, Speichel und Magensäure. CAs
werden von Vertretern von 3 unabhängigen CA-Genfamilien codiert,
und zwar α-CA, β-CA und γ-CA. Gene in
der α-Carboanhydrase-Familie
codieren entweder aktive Carboanhydrase-Isozyme oder "akatalytische" (d.h. ohne CO2-Hydratationsaktivität), mit Carboanhydrase verwandte
Proteine. Alpha-Carboanhydrasen zeigen eine ausgedehnte Vielfalt
in der Gewebeverteilung und in ihren mutmaßlichen oder festgestellten
biologischen Funktionen. Einige der α-CAs werden in fast allen Geweben
exprimiert (z.B. CA 2), während
einige eine eingeschränktere
Expression zeigen, wie CA 1 in Erythrocyten. Erythrocyten-Carboanhydrase
hat 2 Isoenzyme mit verschiedenen Aminosäuresequenzen und spezifischen
Aktivitäten. B
und C waren die ursprünglichen
Bezeichnungen für diese
2 Hauptformen, die später
CA I (oder A) bzw. CA II (oder B) genannt wurden. In Zellen können Carboanhydrasen
im Cytoplasma, in Mitochondrien oder in sekretorischen Granula vorliegen
oder sich mit Membranen assoziieren.
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Eine
solche nachzuweisende intrazelluläre Komponente kann die ganze
Komponente an sich sein oder kann zum Beispiel der intracystolische
Bestandteil eines Proteins oder Rezeptors sein, der ansonsten aus
der Zellmembran ragt oder sich durch diese hindurch erstreckt. Für den intrazellulären Nachweis
von intrazellulären
Komponenten ist eine Fixierung und Permeabilisierung der roten Blutzellen erforderlich,
und dies verleiht den zu identifizierenden Erythrocyten vorteilhafterweise
Steifigkeit und Stabilität;
der Nachweis von intrazellulären
Antigenen in fixierten Erythrocyten ermöglicht also ein geringeres
Hintergrundrauschen als der Nachweis von extrazellulären Antigenen
nur in nichtfixierten Zellen. Ein bevorzugtes Verfahren ist die
Verwendung einer Kombination von zwei intrazellulä ren Komponenten (Zielproteinen
oder -antigenen) zur Unterscheidung zwischen verschiedenen Populationen
roter Blutzellen von zum Beispiel fetalem, parentalem oder adultem
Ursprung.
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Die
Erfindung gibt ein Verfahren an, bei dem die erste Komponente aus
Hämoglobin
F besteht. Hämoglobin
(Hb) ist ein intrazelluläres
Protein, das aus 4 Protein-Untereinheiten und ungefähr 140 Aminosäuren besteht.
Das fetale Hämoglobintetramer besteht
weiterhin aus verschiedenen Polypeptidketten, γ und ζ oder γ und α. Die Expression von HbF ist insofern
im Wesentlichen fetal, als sie bei fetalen roten Blutzellen am stärksten ausgeprägt ist,
sie ist jedoch in geringen Konzentrationen auch in adulten roten
Blutzellen vorhanden. HbF ist spezifisch für rote Blutzellen. Wegen der
genauen Diskriminierung zwischen den Zellpopulationen mit HbF und
einem anderen intrazellulären
Protein gibt die Erfindung ein Verfahren zur fast echten Quantifizierung
der echten fetalen Zellen an, wobei mögliche störende adulte F-Zellen nicht
eingeschlossen sind oder mitgezählt werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform gibt die Erfindung
ein Verfahren an, bei dem die zweite Komponente aus Carboanhydrase
B besteht. Carboanhydrase ist ein Protein oder Metalloenzym mit
einer katalytischen Aktivität
für CO2. Die Expression von CA erfolgt im Wesentlichen
oder vorwiegend in adulten Zellen. Besonders bevorzugt (und hier
in der ausführlichen
Beschreibung näher
erläutert)
ist ein Verfahren, bei dem die erste Komponente aus Hämoglobin
F besteht und die zweite Komponente aus Carboanhydrase besteht,
wobei die Carboanhydrase insbesondere vom Typ I ist.
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Ein
Markerreagens, das in einem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet wird,
kann jede Art von Bindungsmolekül
umfassen, wie von Phagen abgeleitete Bindungsmoleküle (zuweilen
auch Phagen-Antikörper
genannt), aber bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem wenigstens eines
der Markerreagentien einen Antikörper
umfasst. Ein Antikörper
im Format eines vollständigen
Ab oder Fab, Fv, aFv, vom Kamel abgeleiteten Einzelketten- oder
anderen Proteinstruktur ist ein Protein, das eine so genannte leichte
Kette und/oder eine schwere Kette umfasst, Ketten, die jeweils oder
in Kombination für
die spezifische Bindung des Zielantigens verantwortlich sind. Ein
besonders nützlicher
Anti-HbF-Antikörper ist
spezifisch für
die γ-Protein-Untereinheit
von Hämoglobin F.
Antikörper,
die gegen das i-Antigen erzeugt wurden, sind meistens spezifisch
für dieses
Oberflächenprotein
in der glycosylierten Form. Der monoklonale Antikörper CD71
ist gegen den Transferrin-Rezeptor gerichtet, während Anti-GpA-Antikörper ein Epitop
auf dem Glycophorin-A-Antigen erkennen. Ein weiterer nützlicher
Antikörper
ist spezifisch für
die ε-Polypeptidkette
von embryonalem Hämoglobin (HbE).
Gegen CA-Isotypen erzeugte Antikörper
sind spezifisch für
die mehreren Epitope, die auf den verschiedenen Carboanhydrasen
vorhanden sind. Wegen des leichteren Nachweises ist es selbstverständlich bevorzugt,
dass wenigstens zwei oder alle Markerreagentien einen Antikörper umfassen,
wobei jeder dieser Antikörper
gegenüber
einer eigenen antigenen Komponente einer roten Blutzelle reaktiv
ist. Nach der Fixierung und Permeabilisierung tritt der Antikörper in
die Zelle ein und bindet an das intrazellulär fixierte Zielprotein.
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Ein
anderer Typ von Markerreagens gemäß der Erfindung umfasst ein
nichtproteinartiges Molekül,
das mit hoher Spezifität
an eine Zielkomponente binden kann, wie ein Inhibitor, der an ein
Zielenzym binden kann. Zum Beispiel kann ein Sulfonamid-Inhibitor über die
Koordination einer primären
Sulfonamidgruppe an das Zinkion des aktiven Zentrums mit Carboanhydrase
komplexiert werden (19). Der Nachweis eines solchen Markerreagens,
das an ein Ziel gebunden ist, wird am leichtesten erreicht, indem man
einen markierten Inhibitor, z.B. ein fluoreszierendes Derivat des
Inhibitors, verwendet. Ein geeignetes Markerreagens zum Nachweis
eines Zielproteins gemäß der Erfindung
ist ein fluoreszierendes inhibitorisches Molekül, das bei einer niedrigen
Konzentration, wie im nanomolaren Bereich, Zellen markiert, und
zwar mit einer kurzen Beladungszeit, z.B. innerhalb von 10 Minuten.
Außerdem
sollte die Wirksamkeit eines solchen Inhibitors von dem fluoreszierenden
Marker im Wesentlichen nicht verändert
werden. Ein besonders gut geeignetes Markerreagens zur praktischen
Durchführung
der vorliegenden Erfindung umfasst Bodipy-558/568-modifiziertes
Acetazolamid, einen fluoreszierenden Inhibitor von CA (20). Dieses
modifizierte Acetazolamid wurde verwendet, um CA in lebenden Osteoklasten
zu lokalisieren und kann von Molecular Probes oder ähnlichen
Firmen erhalten werden. In einer Ausführungsform gibt die Erfindung
ein Verfahren zur Unterscheidung fetaler Zellen von maternalem Blut
an, wobei ein Antikörper gegen
HbF als erstes Markerreagens und ein fluoreszierender CA-Inhibitor
als zweites Markerreagens verwendet wird.
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung werden fetale Zellen durch die Verwendung eines Markerreagens
identifiziert, das an eine intrazelluläre Komponente binden kann,
wobei die Komponente eine Nucleinsäure ist. Der hier verwendete Ausdruck
Nucleinsäure
bezieht sich auf DNA oder RNA. Nucleinsäuresonden sind zum Beispiel
geeignet, um die Anwesenheit einer spezifischen Nucleinsäuresequenz
in einer Zelle nachzuweisen. Eine Vielzahl von Verfahren zur spezifischen
DNA- und RNA-Messung unter Verwendung von Nucleinsäure-Hybridisierungstechniken
sind wohlbekannt. Zum Beispiel beinhaltet ein Verfahren zur Bewertung
der Anwesenheit einer bestimmten Nucleinsäure in einer Probe die Verwendung
von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungs(FISH)-Technik. Dazu wird
eine Probe mit einer fluoreszenzmarkierten Sonde in Kontakt gebracht,
die eine Nucleinsäuresequenz
aufweist, die zu der interessierenden RNA- oder DNA-Sequenz komplementär ist. Anschließend kann
die Hybridisierung einer Sonde mit einer Nucleinsäure durch
ein Fluoreszenznachweissystem, zum Beispiel durch Fluoreszenzmikroskopie
oder Durchflusscytometrie, gemessen werden. Ein schnelles und empfindliches FISH-Verfahren
wurde entwickelt, um RNA- oder DNA-Gehalte von einzelnen Zellen
mittels Durchflusscytometrie zu sondieren. Fixierte Zellen in Suspension
wurden mit am 5'-Ende
Fluorochrommarkierten Oligodesoxynucleotiden, die zu definierten
Bereichen der interessierenden Nucleinsäure komplementär sind,
hybridisiert und mittels Durchflusscytometrie analysiert (21). Die
vorliegende Erfindung kann zum Beispiel durchgeführt werden, indem man einen HbF-Antikörper als
ersten Reagensmarker und eine am 5'-Ende Fluorescein-konjugierte Oligodesoxynucleotidsonde,
die zu einem Stück
Carboanhydrase-mRNA komplementär
ist, als zweites Markerreagens verwendet. Oligonucleotide, die mit
einem anderen Fluorochrom, wie Cumarin, Rhodamin, Phycoerythrin,
Texasrot und dergleichen, markiert sind, können ebenfalls verwendet werden.
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Wie
gesagt, können
Markerreagentien, bei denen es sich um Antikörper oder andere Bindungsmoleküle handelt,
am leichtesten nachgewiesen werden, wenn sie markiert sind. Geeignet
ist der Nachweis über
einen Marker, der ein Fluorochrom umfasst.
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Ein
zu verwendendes Fluorochrom kann irgendeines der bekannten Moleküle sein,
die in der Durchflusscytometrie und/oder Mikroskopie verwendet werden.
Beispiele für
Fluorochrome sind Proteinmarker, wie R-PE, APC, GFP, und chemische
Marker, wie Alexa-Farbstoffe, Cy-Farbstoffe, Tandemmarker zwischen
den genannten Farbstoffen oder andere. Die meisten der Farbstoffe
können
von Molecular Probes oder ähnlichen
Firmen bezogen werden. Bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem wenigstens zwei
der Markerreagentien ein Fluorochrom umfassen, wobei jedes der Fluorochrome
ein unterschiedliches Emissionsspektrum hat. Emissionsspektren liegen
vorzugsweise im Bereich von 350 bis 800 nm. Enzyme (Peroxidase,
Alkalische Phosphatase und andere) sind im Allgemeinen native oder
rekombinante Proteine, die auch an Antikörper oder andere Markerreagentien
gebunden (markiert) und verwendet werden können, um die Farbentwicklung
mit verschiedenen fluoreszierenden oder nichtfluoreszierenden Substraten,
wie 2-(5'-Chlor-2'-phosphoryloxyphenyl)-6-chlor-4(3H)-chinazolinon
(genannt ELF-97-Phosphat), Tetramethylbenzidin (TMB) und anderen,
die von Molecular Probes, Pierce und anderen bezogen werden können, sichtbar
zu machen.
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Bevorzugt
ist ein Verfahren, wie es hier angegeben wird, das weiterhin die
Bestimmung der Reaktivität
der Markerreagentien gegenüber
den Zellen mittels Durchflusscytometrie, d.h. durch Nachweisen der
Reaktivität
der Markerreagentien gegenüber
den Zellen durch Nachweisen der Fluoreszenz umfasst.
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Die
Erfindung stellt auch einen diagnostischen Kit bereit, der zur Differenzierung
von Untergruppen von Erythrocyten geeignet ist, wobei der Kit wenigstens
ein erstes Markerreagens, das gegenüber einer ersten Komponente
einer roten Blutzelle reaktiv ist, und ein zweites Markerreagens,
das gegenüber
einer zweiten Komponente einer roten Blutzelle reaktiv ist, umfasst,
wobei vorzugsweise die erste Komponente aus Hämoglobin F besteht und/oder wobei
die zweite Komponente aus Carboanhydrase besteht.
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Carboanhydrase
vom Typ I ist aus den oben erläuterten
Gründen
bevorzugt. Das Markerreagens ist vorzugsweise ein Antikörper, es
kann aber im Wesentlichen jedes Bindungsmolekül mit der gewünschten
Bindungsspezifität
sein, wobei der Antikörper oder
das Bindungsmolekül
gegenüber
einer unterschiedlichen, vorzugsweise intrazellulären und
antigenen Komponente einer roten Blutzelle reaktiv ist. Der Kit
kann auch das gewünschte
Fluorochrom oder mehrere unterschiedliche Fluorochrome mit einem unterschiedlichen
Emissionsspektrum umfassen.
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Die
Erfindung stellt auch ein Reagensgemisch bereit, das zur Aufnahme
in einen solchen Kit geeignet ist und für die Differenzierung von Untergruppen
von Erythrocyten geeignet ist, wobei das Reagensgemisch wenigstens
ein erstes Markerreagens, das gegenüber einer ersten Komponente
einer roten Blutzelle reaktiv ist, und ein zweites Markerreagens,
das gegenüber
einer zweiten Komponente einer roten Blutzelle reaktiv ist, umfasst,
wobei die erste Komponente vorzugsweise aus Hämoglobin F besteht und/oder
wobei die zweite Komponente aus Carboanhydrase besteht. Carboanhydrase
vom Typ I ist aus den oben erläuterten
Gründen
bevorzugt.
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In
der ausführlichen
Beschreibung berichten wir über
ein hochgradig genaues und quantitatives Verfahren zum Nachweis
von unterschiedlichen Populationen von fetalen und F-Zellen mittels
Durchflusscytometrie, das routinemäßig durchgeführt werden
kann. Die Beschreibung verdeutlicht weiterhin, dass man bei Verwendung
eines dualen Fluoreszenzparameterassays auf der Basis des kombinierten
Nachweises von fetalem Hämoglobin
(HbF) und Carboanhydrase (CA) echte fetale RBCs von störenden maternalen
F-Zellen trennen kann.
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Weiterhin
kommt ein fetales Antigen oder Fetoprotein bei bestimmten Krankheiten
auch bei Erwachsenen vor. Zum Beispiel ist eine Zunahme der Expression
von fetalem Hämoglobin
(HbF) in peripheren roten Blutzellen ein häufiges Merkmal bei Hämoglobinopathien,
die genetische Störungen
von Hämoglobin
umfassen, wie Sichelzellanämie
und β-Thalassämie. Die
Erfindung gibt auch ein Verfahren zum Nachweis von HbF oder eines
anderen Fetoproteins in roten Blutzellen in Proben von einem Patienten
mit einer Krankheit wie Hämoglobinopathie an.
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Ein
Verfahren gemäß der Erfindung
findet auch Verwendung in dem Gebiet der nichtinvasiven pränatalen
Tests. Pränatale
Tests umfassen quantitative oder qualitative Diagnose oder pränatale Bewertung
einschließlich
der Bestimmung des Geschlechts des Fetus, der Bestimmung von chromosomalen, Einzelgen- oder Protein-Abnormitäten und
der Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von bestimmten Genen,
Nucleinsäuren
oder Proteinen. Bisher gibt es mehr als 300 verschiedene Störungen, die
während
der Schwangerschaft nachgewiesen werden können. Einige davon sind chromosomale Abnormitäten, wie
das Down-Syndrom; einige sind Einzelgenstörungen, wie zystische Fibrose, Tay-Sachs-Krankheit und
Sichelzellanämie.
Zur Zeit erfordert die pränatale
Diagnose von Chromosomen-Abnormitäten invasive Techniken, wie
Amniocentese und Chorionzotten-Probenentnahme, die kleine, aber
endliche Risiken eines Fetusverlusts bergen. Ein nichtinvasiver
Ansatz besteht darin, fetale Zellen mittels Durchfluss-Sortierung
und anschließende
genetische Interphasen-Analyse mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
(FISH) aus maternalem Blut zu isolieren. Ein nichtinvasives Verfahren
der pränatalen
genetischen Diagnose erfordert eine Auswahl fetaler Zellen aus dem
mütterlichen
Kreislauf, die eine effiziente Gewinnung von fetalen Zellen für die FISH-Analyse
erlaubt. Die in Frage kommende Zelle ist im Allgemeinen eine fetale
kernhaltige rote Blutzelle (NRBC). Ein geläufiges Verfahren für die Anreicherung
von NRBCs beinhaltet die anfängliche Trennung
von Blut über
einen Dichtegradienten, die Abreicherung weißer Zellen mit Hilfe einer
Panning-Technik mit einem monoklonalen CD45-Antikörper mit
anschließendem
Durchfluss-Sortieren auf der Basis von entweder einer Selektion
in Bezug auf CD71+, CD45– und
LDS-751 oder γ-Hämoglobin (22).
Wie bereits erwähnt,
ist die Unterscheidung zwischen fetalen und mütterlichen Blutzellen auf der
Basis eines einzelnen Markers oft problematisch. Die pränatale Diagnose
dieses Typs erfordert offensichtlich eine optimale Trennung fetaler
Zellen von mütterlichen
Zellen. Die derzeitige pränatale
Diagnostik wird häufig
durch eine schlechte Identifizierung der mütterlichen und fetalen Subpopulation
von Zellen in einer mütterlichen
Blutprobe behindert. In einer Ausführungsform der Erfindung wird
ein Verfahren für das
nichtinvasive pränatale
Testen eines Fetus angegeben, wobei das Verfahren die Schritte des
Identifizierens und Isolierens fetaler Zellen aus einer mütterlichen
Blutprobe gemäß der Erfindung
und das Testen der fetalen Zellen umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung gibt ein hochgradig genaues und empfindliches
Verfahren zum Identifizieren und/oder Isolieren fetaler Zellen,
die im mütterlichen
Blut zirkulieren, an, das auf einer Kombination von zwei Markerreagentien
beruht. Ein zweifarbiges durchflusscytometrisches Verfahren erlaubt
den gleichzeitigen Nachweis dieser beiden Reagentien. Die Verwendung
eines Verfahrens, wie es angegeben wird, ermöglicht das Identifizieren und
Isolieren einer Population von fetalen Zellen aus mütterlichen Zellen
mit einer hohen Empfindlichkeit und Genauigkeit. In einer bevorzugten
Ausführungsform
werden Zellen in einer mütterlichen
Blutprobe mit einem Anti-HbF-Antikörper als erstes Markerreagens
und einem gegenüber
CA reaktiven Antikörper
als zweites Markerreagens angefärbt.
Fetale RBCs werden anhand ihrer satten HbF-Färbung in Kombination mit einem
völligen
Fehlen von CA-Expression erkannt. Anschließend kann diese HbF-positive, CA-negative Population,
die fetalen Blutzellen entspricht, mittels Durchfluss-Sortieren
von mütterlichen
Zellen getrennt werden. Das Durchfluss-Sortieren kann unter Verwendung von
normaler oder Hochgeschwindigkeits-Durchflusscytometrie/Zellsortierung
durchgeführt
werden. Danach können
isolierte fetale Zellen zuerst durch in-vitro-Kultivieren expandiert
werden, oder sie können
direkt zum Beispiel auf chromosomale Abnormitäten analysiert werden.
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In
einer anderen Ausführungsform
wird ein embryonaler Zellmarker zusammen mit einem Anti-CA-Antikörper verwendet,
um eine embryonale RSC-Population zu identifizieren, die im Blutstrom
einer Schwangeren zirkuliert. Zum Beispiel kann ein solches Verfahren
verwendet werden, um embryonale Zellen, wie Erythroblasten, mittels
durchflusscytometrischen Zellsortierens zu isolieren. Die embryonalen
Zellen können
anschließend
einer pränatalen Diagnose
unterzogen werden, zum Beispiel können sie so behandelt werden,
dass die embryonalen Nucleinsäuren
und/oder Proteine für
die Identifizierung und/oder Amplifikation verfügbar werden. Ein solches Verfahren
erlaubt eine quantitative oder qualitative diagnostische oder pränatale Bewertung
in einem sehr frühen
Stadium der embryonalen Entwicklung, zum Beispiel bereits sechs
Wochen nach der Empfängnis.
Die Verwendung von antiembryonalen ε-Hb-Antikörpern als Markerreagens zum
Identifizieren von fetalen Zellen wird zuweilen bevorzugt. In einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein erstes Markerreagens, das gegenüber embryonalem
Hämoglobin
(HbE) reaktiv ist, zum Beispiel ein gegen die ε-Kette von HbE gerichteter Antikörper, vorzugsweise
mit einem zweiten Markerreagens, das gegenüber CA reaktiv ist, kombiniert,
um die seltene Population von embryonalen Zellen, die im Blutstrom
einer Schwangeren zirkulieren, nachzuweisen und/oder zu isolieren.
Weitere geeignete embryonale oder fetale Marker, die in der Erfindung
verwendet werden können,
sind durch ihr temporales Expressionsmuster gekennzeichnet. Vorzugsweise
umfasst ein solcher Marker ein intrazelluläres Protein, das in embryonalen
und/oder fetalen Zellen hochgradig exprimiert wird, während seine
Expression nach der Geburt stark reduziert oder im Wesentlichen
nicht existent ist. Dazu können
mit Apoptose zusammenhängende
Proteine, wie Survivin, Transcriptionsfaktoren, wie ein Transcriptionsfaktor der
basischen Helix-Loop-Helix(bHLH)-Familie oder ein GATA-(ähnlicher)
Transcriptionsfaktor, gehören.
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Weiterhin
findet ein in der Erfindung angegebenes Verfahren seine Anwendung
in anderen klinischen Situationen, wie der intrauterinen Transfusion (IUT).
Die IUT erlaubt es, dem Baby, während
es im Uterus ist, Bluttransfusionen und/oder Medikationen zu verabreichen.
Die Bluttransfusion durch IUT wird zum Beispiel seit den letzten
drei Jahrzehnten verwendet, um durch Rhesus-Unverträglichkeit
verursachte fetale Anämie
zu behandeln. Seit der Entwicklung von hochauflösendem Ultraschall ist die
IUT immer häufiger
und relativ sicher geworden. Die Wirksamkeit einer IUT kann bewertet
werden, indem man fetale Blutproben entnimmt und fetale Zellen anfärbt. Der
fetale Kreislauf wird gewöhnlich
durch den Nabelschnuransatz an der Plazenta hindurch bewertet, obwohl
eine freie Schleife oder der fetale Nabelschnuransatz ebenfalls
verwendet werden können.
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Durch
die Anfärbung
fetaler Zellen kann der Prozentsatz der roten Zellen des Spenders
im fetalen Kreislauf bestimmt werden. Die Verwendung eines einzigen
Markerreagens, wie eines Anti-HbF-Antikörpers, birgt die Gefahr einer Überschätzung des
Anteils an echten fetalen Zellen in einer gegebenen HbF-Population.
Wie hier beispielhaft gezeigt wird, ermöglicht ein Verfahren unter
Verwendung von zwei Markerreagentien, wie es hier angegeben wird,
eine Unterscheidung fetaler Zellen von kleinen, aber signifikanten
Populationen von adulten Zellen, die HbF enthalten, welche auch
F-Zellen genannt werden. Die Erfindung gibt also ein Verfahren an,
um genaue Daten der echten fetalen Zellhäufigkeit zu produzieren und
so die Wirksamkeit eines klinischen Verfahrens wie IUT zu überwachen.
Zum Beispiel erlaubt das angegebene Verfahren eine Quantifizierung
fetaler Zellen in einer fetalen Blutprobe und Berechnung des Prozentsatzes
an roten Zellen eines Spenders im fetalen Kreislauf. In noch einer
anderen Ausführungsform
der Erfindung findet ein Verfahren gemäß der Erfindung Verwendung
bei der Überwachung
abnormer Wanderung fetaler Zellen bei Präeklampsie und anderen mit der
Schwangerschaft zusammenhängenden
Störungen.
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Wie
in der ausführlichen
Beschreibung beispielhaft dargestellt ist, zeigt das hier angegebene duale
durchflusscytometrische Verfahren eine ausgezeichnete Linearität und Präzision sowohl
unterhalb als auch oberhalb der klinisch wichtigen fetalen Zellhäufigkeit
von 0,6%. Verdünnungsreihen
von Gemischen von Nabelschnurblut und adultem Blut mit einem Häufigkeitsbereich
fetaler Zellen von 0 bis 5% wurden analysiert. Die Präzision wurde
bewertet, indem man innerhalb eines Zeitraums von 5 Tagen 10 Replikate
an jeder Probe durchführte;
dies bewies durchgängig
einen Variationskoeffizienten (CV) von < 5%. In einer bevorzugten Ausführungsform
hat das hier angegebene Verfahren ein CV von < 10% für Blutproben mit > 0,1% fetalen Zellen,
besonders bevorzugt ein CV von < 7%,
am meisten bevorzugt ein CV von < 5%.
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Die
durchflusscytometrische Analyse ermöglicht die Analyse von mehreren
verschiedenen klinischen Proben, wie bis zu fünf oder sogar bis zu sieben
verschiedenen Testproben, in einer Stunde oder weniger und liefert
somit ein relativ unkompliziertes Verfahren, das für die klinische
Verwendung geeignet ist. Das duale durchflusscytometrische Verfahren
gemäß der Erfindung
liefert eine technisch überlegene Alternative
zu bestehenden einfarbigen durchflusscytometrischen Verfahren. Das
angegebene Verfahren ermöglicht
die Analyse einer großen
Zahl von Zellen in einer relativ kurzen Zeit im Vergleich zu anderen Nachweistechniken,
wie die visuelle Untersuchung jeder Testprobe durch Fluoreszenzmikroskopie. Auch
im Hinblick auf die Leichtigkeit der Verwendung in gewöhnlichen
klinischen Labors wird die Durchflusscytometrie jetzt gegenüber der
Mikroskopie bevorzugt.
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Zusammengenommen
hat das in der Erfindung angegebene Verfahren zur Unterscheidung zwischen
roten Blutzellen eine verbesserte Leistungsfähigkeit und ist leichter und
schneller zu verwenden als bestehende Verfahren.
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Figuren
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1
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Die
Cytogramme von 1 zeigen die Population von
kontaminierenden autofluoreszenten WBCs, die durch den DNA-färbenden
Farbstoff LDS 751 nachgewiesen und abgetrennt werden können.
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2
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Die
Cytogramme von 2 sind repräsentativ für 10% Nabelschnurblut, gemischt
mit normalem adultem Blut und angefärbt mit gegen HbF gerichtetem
monoklonalen Antikörper.
Die Verteilungen von fetalen HbF+++-Zellen, adulten HbF+-Zellen
und adulten HbF–-Zellen
sind in den verschiedenen Cytogrammen angegeben. Die störende Population
von adulten F-Zellen (HbF+) ist schwierig von den fetalen RBCs in
R10- und negativ angefärbten
adulten Zellen (HbF–)
in 4 abzutrennen, wie in 2D gezeigt
ist.
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3
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Die
Cytogramme von 3 sind repräsentativ für 5% Nabelschnurblut, gemischt
mit normalem adultem Blut und angefärbt mit gegen HbF gerichteten
Antikörpern
und erythrocytenspezifischem CA1. Die Verteilungen von fetalen HbF+++-Zellen,
fetalen HbF++/CA++-Zellen, adulten HbF+/CA++- oder F-Zellen und adulten
HbF––/CA++-Zellen
sind in den verschiedenen Quadranten des endgültigen Cytogramms angegeben. 3D zeigt die Trennung der störenden adulten
F-Zellen (R8) von den echten fetalen Zellen in R10.
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4
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Linearitätsauftragung
von Experimenten mit gemischtem Nabelschnurblut. Die Antikörper Anti-HbF
und Anti-CA werden verwendet, um den Prozentsatz an fetalen roten
Blutzellen in einem Hintergrund von normalem adultem Blut nachzuweisen. Die
Auftragung zeigt, dass der Nachweis und die Linearität zwischen
wenigstens 0,1% und 10% beimpftem Nabelschnurblut genau sind.
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5
-
Daten
einer intrauterinen Transfusion (IUT), nachgewiesen mit Anti-HbF-
und Anti-CA-Antikörpern.
A. Die Cytogramme zeigen die HbF-haltige Population roter Blutzellen
aus einer Blutprobe des Fetus. B. Die Cytogramme zeigen den Nachweis
der fetalen und adulten Populationen roter Blutzellen im Blut des
Fetus nach einer 50%-Transfusion mit dem adulten Spenderblut. C.
Die Cytogramme zeigen die CA–-haltige
Population roter Blutzellen, die in der Blutprobe des adulten Spenders
vorhanden ist.
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Ausführliche Beschreibung
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Mehrere
alternative und genauere Screeningverfahren zum Nachweis von FMH
mit Hilfe von Durchflusscytometrie wurden vorgeschlagen und beschrieben.
Die ersten Berichte, die die Machbarkeit der Verwendung von Durchflusscytometrie
für die Zählung fetaler
Zellen untersuchten, beruhten primär auf dem Nachweis des humanen
D-Antigens auf der Zelloberfläche
von RBCs (10, 11, 12, 13). Diese Ansätze bewiesen alle eine größere Empfindlichkeit
und Genauigkeit als manuelle Verfahren. Die Verwendung von Anti-RhD
ist jedoch nur auf die klinischen Situationen mit Rh- oder D-Antigen-Unverträglichkeit anwendbar
und kann nicht in allen Fällen
von mütterlichem
Trauma und vermutetem FMH verwendet werden. Vor kurzem wurden mehrere
andere Verfahren zum durchflusscytometrischen Nachweis von fetalen Zellen
in maternalem peripherem Blut beschrieben (14, 15, 16, 17). Die
Verfahren unterscheiden sich in ihren Mitteln der Verwendung verschiedener
zellulären
Fixierungs- und Permeabilisierungsschritte, in Kombination mit dem
intrazellulären
Nachweis von HbF-Antigen unter Verwendung von Anti-HbF-Antikörpern. Der
durchflusscytometrische Anti-HbF-Ansatz
hat mehrere potentielle Vorteile, und das HbF-Antigen ermöglicht eine
breite Anwendung des durchflusscytometrischen Nachweises von fetalen roten
Blutzellen auf viele klinische Situationen. Weiterhin liefert das
Anti-HbF-Verfahren
eine gute Korrelation mit dem Standard-Kleihauer-Betke-Test des Nachweises
fetaler Zellen, wenn auch mit einer viel höheren Präzision als der manuelle Säureelutionsassay.
Unsere Ergebnisse mit dem Ansatz mit einem einzigen Zellmarker,
wie HbF, zeigten jedoch an, dass dieser Einzelfarbenassay für die Zählung echter fetaler
Zellen nicht genau genug war und die Mitzählung eines geringen Prozentsatzes
von falsch positiven F-Zellen nicht ausschließen konnte. Eine kleine Population
von 2 bis 8% adulter Zellen, die eine kleine Menge an HbF enthalten,
wurde beobachtet. Die Trennung und klare Unterscheidung beider Populationen
von fetalen HbF-haltigen Zellen und störenden adulten F-Zellen mit
einem geringeren HbF-Gehalt ist sehr wichtig, um genaue Daten über die
wahre Häufigkeit
fetaler Zellen in maternalem Blut für die FMH-Bewertung oder F-Zell-Messungen zu produzieren.
-
Unsere
Ergebnisse beschreiben einen alternativen Ansatz zur durchflusscytometrischen
Quantifizierung von fetalen RBCs unter Verwendung von Antikörpern gegen
das intrazellulär
lokalisierte fetale Hämoglobin
(HbF) und Carboanhydrase (CA) und einer optimalen intrazellulären Anfärbungstechnik.
Die Methode oder das Verfahren beruht auf der Unterscheidung zwischen
fetalen und adulten roten Blutzellen unter Verwendung von spezifischen
Anti-Carboanhydrase(CA)-, poly klonalen und monoklonalen Anti-HbF-Antikörpern. Das
HbF-Antigen/Protein ist der beste Marker für den Nachweis von fetalen
roten Blutzellen, während
das CA-Antigen/Protein ein guter Marker für adulte rote Blutzellen ist
und in fetalen roten Blutzellen fast nicht vorhanden ist. Die in
dem Test verwendeten monoklonalen und polyklonalen Antikörper sind
für den
direkten und indirekten Nachweis von HbF- und CA-Markern in einer
dualen durchflusscytometrischen Analyse Fluorochrom-konjugiert.
Es wurde gezeigt, dass beide Antikörperpräparate spezifisch für HbF bzw.
CA sind, wobei die Vorschrift verwendet wurde, wie sie im Abschnitt "Materialien" beschrieben ist.
Nie wurde eine positive Zellfärbung
ohne Permeabilisierung der Zellen nachgewiesen.
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Die
vorläufigen
Ergebnisse des zweifarbigen durchflusscytometrischen Verfahrens
waren mit denjenigen von einigen früheren Berichten vergleichbar, die
Anti-HbF-Daten beschreiben.
Die F-Zell-Prozentsätze
in Vollblut von normalen Spendern, das während der Studie erhalten wurde,
waren ebenfalls mit denjenigen in früheren Berichten vergleichbar.
Unsere Ergebnisse beweisen, dass es durch Zugabe eines zweiten einzigartigen
Zellmarkers, wie Carboanhydrase, zu dem durchflusscytometrischen
HbF-Verfahren möglich
ist, unterschiedliche Populationen von roten Blutzellen zu identifizieren.
Das neue Verfahren kann zwischen echten fetalen Zellen und möglichen
falsch positiven F-Zellen unterscheiden, indem es die kleine Population
von HbF-haltigen F-Zellen von der fetalen Zellpopulation zu der
größeren Population
von CA-positiven adulten Zellen verschiebt. Die vollständige zweifarbige
Anfärbung
und Analyse von bis zu 5 Proben kann leicht innerhalb von 1,5 Stunden
nach der Blutentnahme durchgeführt
werden. Der genaue Nachweis von HbF-haltigen fetalen roten Blutzellen
im mütterlichen
Blutkreislauf hilft beim Abschätzen
des Grades der fetomaternalen Blutung (FMH) bei Frauen während der
Schwangerschaft und anschließend
bei der Handhabung einer hämolytischen
Erkrankung des Neugeborenen (HDN).
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Schließlich kann
das neue und empfindliche durchflusscytometrische Verfahren unter
Verwendung eines dualen Fluoreszenzfärbeverfahrens sowohl störende maternale
F-Zellen als auch fetale rote Blutzellpopulationen genau identifizieren
und quantifizieren. Im Einklang mit anderen Studien (14, 15, 16, 17)
stellt es eine praktikable und technisch überlegene Alternative zur Routinemessung
von fetomaternaler Blutung im Vergleich zum subjektiveren und manuellen
Kleihauer-Betke-Test dar.
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Materialien und Verfahren
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Probenahme
-
0,5
bis 1 ml Vollblut von normalen Spendern sowie Nabelschnurblut wurde
auf EDTA entnommen. Die Proben wurden gewöhnlich am selben Tag getestet
oder vor dem testen 1 Woche lang bei 4 bis 8 °C aufbewahrt.
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Antikörper und Reagentien
-
Der
monoklonale Antikörper
NaM16-2F4 (Maus-IgG1), der spezifisch für die γ-Kette von humanem HbF ist,
wurde schon früher
beschrieben (14) und von Bioatlantic (Nantes, Frankreich) bezogen. Reine
Antikörperpräparate wurden
nach Standardmarkierungsverfahren direkt mit R-Phycoerythrin (R-PE)
konjugiert. Seine PE-konjugierte IgG1-Isotyp-Kontrolle wurde gereinigt
und mit Hilfe von Standard-Markierungsverfahren markiert. Polyklonale Ziegen-Anti-Human-Carboanhydrase wurde
von AbCAM bezogen, während
der FITC-konjugierte Anti-Ziegen-Antikörper von
Sigma erhalten wurde. Der DNA-färbende
Farbstoff LDS 751 wurde von Molecular Probes bezogen und bis zur
Verwendung bei 4 °C gelagert.
Serum von neugeborenen Kälbern
wurde von Greiner bezogen. Alle anderen Reagentien waren analysenrein.
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Zellfixierung und -permeabilisierung
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10 μl Vollblut
oder Nabelschnurblut wurden in 100 μl Serum von neugeborenen Kälbern (NCS)
in PBS resuspendiert, und danach wurden die RBCs mit 100 μl 20%igem
Paraformaldehyd in PBS fixiert, 5 s lang mit dem Vortexmischer gemischt
und 30 min lang bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Nach der Fixierung
wurden die Zellen einmal mit 2 ml PBS mit Heparin gewaschen und
in 100 μl
PBS mit Heparin resuspendiert. Für
die Permeabilisierung der RBCs wurden 100 μl der fixierten Zellen gründlich mit
100 μl 0,3%igen
Natriumdodecylsulfat (SDS) in PBS mit Heparin gemischt und 3 min
lang bei RT stehen gelassen. Um das SDS zu entfernen, wurden die
Zellen zweimal mit 2 ml PBS mit Heparin gewaschen und in 1 ml derselben
Lösung
suspendiert.
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HbF- und CA-Nachweis mittels
Durchflusscytometrie
-
Für die Immunophänotypisierung
wurden dann 100 μl
der gewaschenen Zellsuspension entweder mit 50 μl Anti-HbF-PE-MoAb, verdünnt zu 40 μg/ml in PBS,
50 μl Anti-Carboanhydrase-PoAb,
verdünnt
1 in 500 und 50 μl
LDS 751 gemischt, oder 100 μl
der gewaschenen Zellsuspension wurden mit 50 μl LDS 751 und 50 μl PBS sowie
50 μl Isotyp-Kontrolle als
negative Kontrolle gemischt. Nach einer Inkubation von 15 min bei
RT im Dunkeln wurden Zellen einmal mit 2 ml PBS, das Heparin enthielt,
gewaschen. Die in 100 μl
suspendierten Zelllösungen
wurden beide mit 50 μl
Anti-Ziegen-IgG-FITC gemischt und 15 min lang bei RT inkubiert.
Die Zellen wurden gewaschen, um das sekundäre markierte Konjugat zu entfernen,
und schließlich
in 0,5 ml PBS mit Heparin resuspendiert und waren dann bereit für die Durchflusscytometrie.
Die Isotypkontrolle wurde anstelle des Anti-HbF-MoAb als negative
Kontrolle verwendet. Die Probenerfassung wurde mit einem Durchflusscytometer
des Typs Coulter Epics XL MCL (Beckman-Coulter, USA) durchgeführt. Die
HbF- und CA-Zellen wurden gezählt,
indem man den Autostop auf 50 000 oder 100 000 Ereignisse einstellte,
wobei Messungen von logFSC und logSSC sowie Fluoreszenzsignale von
logFL1, logFL2 und logFL4 als List-Mode-Dateien gespeichert wurden.
Die Datenanalyse wurde mit Software (Winlist, Verity Software, Topsham,
ME) an den List-Mode-Dateien durchgeführt. Das Lebend-Gate an LDFS-751-negativen
Zellen wurde verwendet, um mögliche
störende
zellkernhaltige weiße
Blutzellen auszuschließen.
Der positive Cutoff-Punkt
lag ungefähr
0,5% oberhalb der negativen Population von mit Isotypkontrolle angefärbten Zellen.
-
Ergebnisse
-
Ein
zweifarbiges durchflusscytometrisches Verfahren führt zum
gleichzeitigen Nachweis von zwei intrazellulären Antigenen und liefert einen zweckmäßigen und
schnellen Test, der innerhalb von 1,5 Stunden nach der Blutentnahme
beendet werden kann. Die Verwendung von Paraformaldehyd als Fixierungsreagens
und von Natriumdodecylsulfat (SDS) zum Permeabilisieren von fixierten
RBCs führte
zu einer niedrigen Hintergrundfärbung,
vernachlässigbaren
HbF-Leckage und minimalem Verklumpen der Zellen. Nach der Fixierung
und Permeabilisierung konnten beide Zellantigenmarker mit hohen Fluoreszenzsignalen
nachgewiesen werden, was zu einer eindeutigen Unterscheidung zwischen
verschiedenen gefärbten
Zellpopulationen führte.
-
Ein
wichtiger Aspekt der durchflusscytometrischen Daten der Zählung fetaler
Zellen besteht darin, mögliche
störende
adulte hämoglobinhaltige RBCs
und vorhandene autofluoreszente WBCs aus dem Bereich der Identifizierung
fetaler Zellen auszuschließen.
Die induzierten autofluoreszenten WBCs können leicht aus der fetalen
Zellpopulation ausgeschlossen werden, indem man diese zellkernhaltigen Zellen
mit einem DNA-färbenden
Farbstoff, wie LDS 751, anfärbt,
wie in 1 gezeigt ist.
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Die
ungenaue Abtrennung HbF-haltiger F-Zellen von den echten HbF-haltigen
fetalen Zellen wird in den Cytogrammen von 2 gezeigt.
Die Tatsache, dass es schwierig ist, einen genauen Bereich für die fetalen
Zellen ohne die störenden
F-Zellen festzulegen, führt
zu der Überschätzung der
wahren Population an fetalen HbF-haltigen Zellen. Insbesondere wenn
die Zahl der fetalen Zellen niedrig ist (0,4 bis 0,6%), ist die
wahre Zahl der fetalen Zellen vor einem Hintergrund von kontaminierenden
F-Zellen mit variablen Mengen an HbF nicht genau. Die durchflusscytometrischen
Ergebnisse der Kombination der beiden verschiedenen Marker roter
Blutzellen, HbF und CA, wie sie in 3 gezeigt
sind, bewiesen, dass die meisten fetalen RBCs mit einem hohen HbF-Gehalt
und ohne CA gut von störenden
adulten F-Zellen mit einem niedrigeren HbF-Gehalt, die aber hohe
Mengen an CA enthalten, getrennt werden konnten. Adulte RBCs ohne
HbF waren, wie erwartet, nur positiv in bezug auf CA. Eine weitere
kleine, aber nicht unerwartete Population von fetalen Zellen mit einem
hohen HbF-Gehalt
und geringerem CA wurde neben der fetalen Zellpopulation nachgewiesen
und ebenfalls eindeutig von den F-Zellen getrennt. Beide Populationen
von fetalen Zellen miteinander kombiniert führten zur wahren Zahl der fetalen
RBCs im Nabelschnurblut und Gemischen von Nabelschnur- und adultem
Blut.
-
Die
Linearität
und Präzision
des zweifarbigen durchflusscytometrischen Verfahrens wurde in Gemischen
von Nabelschnurblut und Vollblut von nichtschwangeren Erwachsenen
untersucht. Wie in 4 gezeigt ist, wurde eine ausgezeichnete
Linearität
des Verfahrens durch Verdünnungsreihen
von Gemischen von Nabelschnurblut und adultem Blut (n = 10) mit
einem Häufigkeitsbereich
von fetalen Zellen von 0 bis 5% beobachtet. Die Präzision des
Verfahrens wurde bestimmt, indem man eine Analyse an demselben Präparat von
Gemischen von Nabelschnur- und adultem Blut innerhalb eines Zeitraums von
5 Tagen durchführte.
Die Präzision
aller Proben führte
durchweg zu einem Variationskoeffizienten (CV) von < 5%. Daher zeigte
das neue durchflusscytometrische Verfahren eine ausgezeichnete Assayleistung,
und es wurde beobachtet, dass es sowohl oberhalb als auch unterhalb
der klinisch wichtigen Häufigkeit
fetaler Zellen von ungefähr
0,6% linear und präzise
ist. Die Linearität
der Messung wurde für Proben
bestimmt, die aus verschiedenen Verhältnissen von Nabelschnurblut
bestanden, das im Bereich von 0,0 bis 10% positiven Nabelschnurblutzellen (HbF/CA)
mit normalem adultem Blut gemischt war. Neun Monate altes Nabelschnurblut
besteht aus 85% fetalen RBCs. Das lineare Regressionsverfahren wurde
verwendet, um die bekannten erwarteten Werte gegen die beobachteten
Werte für
den Prozentsatz der doppelt markierten fetalen Zellen aufzutragen, der
durch das Doppelfluoreszenz-Cytometrieverfahren bestimmt wurde.
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5 zeigt,
dass das hier angegebene Verfahren zur Unterscheidung zwischen Untergruppen von
roten Blutzellen in einer Probe auch vorteilhafterweise verwendet
wird, um die Wirksamkeit einer intrauterinen Bluttransfusion zu überwachen.
Die Cytogramme beweisen eine eindeutige Unterscheidung zwischen
Popu lationen roter Blutzellen in einer adulten Spenderblutprobe
und in einer fetalen Blutprobe vor und nach einer Transfusion mit
dem Spenderblut.
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Unsere
Studien zeigen an, dass die Verwendung eines zweiten Antikörpers zum
Nachweis von CA, vorzugsweise in Kombination mit dem HbF-Marker
oder mit einer anderen Determinante von im Wesentlichen fetalen
Zellen, eine detailliertere Unterscheidung der verschiedenen fetalen
und adulten RSC-Populationen liefert und zu einer Verbesserung der
Fähigkeit,
die fetale RBC-Häufigkeit
zu bestimmen, führt.
-
Bibliographie
-
- 1. Sebring, E.S., Polesky, H.F. 1990. Fetomaternal hemorrhage:
incidence, risk factors, time of occurrence, and clinical effects.
Transfusion 30: 344–357.
- 2. Garratty, G., and Arndt, P.A. 1999. Applications of flow
cytofluorometry to red blood cell immunology. Cytometry (Communications
in Clinical Cytometry) 38: 259–267.
- 3. Nance, S.J., Nelson, J.M., Arndt, P.A., et al. 1989. Quantitation
of Fetomaternal hemorrhage by flow cytometry, a simple and accurate
method. Am.J. Clin.Pathol. 91: 288–292.
- 4. Lee, D., Contreras, M., Robson, S.C., Rodeck, C.H., Whittle,
M.J. 1999. Recommendations for the use of anti-D immunoglobulin
for Rh prophylaxis. Transf.Med. 9: 93–97.
- 5. Polesky, H., Sebring, E. 1981. Evaluation of methods for
detection and quantitation of fetal cells and their effect on RhIgG
usage. Am.J. Clin.Pathol. 76: 525–529.
- 6. Kleihauer, P., Braun, H., and Betke, K. 1957. Demonstration
of fetal hemoglobin in erythrocytes of a blood smear. Klin.Wochenschr.
35: 637–638.
- 7. Davis, B.H., Olsen, S., Bigelow, N.C., Chef, J.C. 1998. Detection
of fetal red cells in fetomaternal hemorrhage using a fetal hemoglobin
monoclonal antibody by flow cytometry. Immunohematology 38: 749–756.
- 8. Johnson, P.R., Tait, R.C., Austin, E.B., et al. 1995. Flow
cytometry in diagnosis and management of large fetomaternal haemorrhage.
J.Clin.Patho1. 48: 1005–1008.
- 9. Garratty, G., Arndt, P. 1994. Applications of flow cytofluorometry
to tansfusion science. Transfusion 35: 157–178.
- 10. Nelson, M., Popp, H., Horky, K., Forsyth, C., Gibson, J.
1994. Development of a flow cytometric test for the detection of
D-positive fetal cells alter foetalmaternal hemorrhage and a survey
of the prevalence in D-negative women. Immunohematology 10: 55–59.
- 11. Medearis, A.L. Hensleigh, P.A., Parks, D.R., Herzenberg,
L.A. 1984. Detection of fetal erythrocytes in maternal blood post
partum with the fluorescenceactivated cell sorter. Am.J. Obstet.
Gynecol. 148: 290–295.
- 12. Lloyd-Evans, P., Kumpel, B.M., Bromelow, I., Austin, E.,
Taylor, E. 1996. Use of a directly conjugated monoclonal anti-D
(BRAD-3) for quantification of fetomaternal hemorrhage by flow cytometry.
Transfusion 36: 432–437.
- 13. Corsetti, J.P., Cox, C., Leary, J.F., Cox, M.T., Blumberg,
N., Doherty, R.A. 1987. Comparison of quantitative acid-elution
technique and flow cytometry for detecting fetomaternal hemorrhage.
Ann. Clin.Lab. Sci. 17: 197–206.
- 14. Navenot, J.M., Merghoub, T., Ducrocq, R., Krishnamoorthy,
R., Blanchard, D. 1998. A new method for quantitative determination
of fetal hemoglobincontaining red blood cells by flow cytometry:
application to sickle cell disease. Cytometry 32: 186–190.
- 15. Nelson, M., Zarkos, K., Popp, H., Gilson, J. 1998. A flow-cytometric
equivalent of the Kleihauer test. Vox Sang. 75: 234–241.
- 16. Davis, B.H., Olsen, S., Bigelow, N.C., Chen, J.C. 1998.
Detection of fetal red cells in fetomaternal hemorrhage using a
fetal hemoglobin monoclonal antibody by flow cytometry. Transfusion
32: 749–756.
- 17. Mundee, Y., Bigelow, N.C., Davis, B.H., Porter, J.B. 2000.
Simplified flow cytometric method for fetal hemoglobin containing
red blood cells. Cytometry 42: 389–393.
- 18. Bernini, L.F., Kanhai, H.H.H., Losekoot, M., Giordano, P.,
Harteveld, C.L. 1994 Prenatal diagnosis of homozygous α-thalassemia
by an immunological method. Annals New York Academy of Sciences.
731: 193–196
19. Boriack-Sjodin, P.A., Zeitlin, S., Chen, H.H., Crenshaw, L.,
Gross, S., Dantanarayana, A., Delgado, P., May, J.A., Dean, T.,
Christianson, D.W. 1999. Structural analysis of inhibitor binding
to human carbonic anhydrase II. Protein Sci. 12: 2483–2489.
- 20. Brubaker, D.K., Mao, F., Gay, C.V. 1999. Localization of
carbonic anhydrase in living osteoclasts with bodipy 558/568-modified
acetazolamide, a thiadiazole carbonic anhydrase inhibitor. J Histochem
Cytochem 4: 545–550.
- 21. Yu, H., Ernst, L., Wagner, M., Waggoner, A. 1992. Sensitive
detection of RNAs in single cells by flow cytometry. Nucl Acids
Res 1: 83–88.
- 22. Lewis, D.E., Schober, W., Murrell, S., Nguyen, D., Scott,
J., Boinoff, J., Simpson, J.L., Bischoff, F.Z., Elias, S. 1996.
Rare event selection of fetal nucleated erythrocytes in maternal
blood by flow cytometry. Cytometry 23: 218–227