DE10042827A1 - Mittel zur Diagnose von Tumoren - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Diagnose von Tumoren, insbesondere maligner Tumore des menschlichen und tierischen Körpers unter Verwendung mindestens einer mit DCoH interagierenden Substanz zur in vitro Diagnose.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Diagnose von Tumoren, insbesondere maligner Tumore des menschlichen und tierischen Körpers.

Maligne Tumore umfassen eine hinsichtlich des biologischen Verhaltens (z. B. Invasivität und Metastasierungsneigung) und der histogenetischen Abstammung heterogene Gruppe verschiedener Tumorarten. Diese Heterogenität spiegelt sich in dem unterschiedlichen Ansprechen auf verschiedene Therapieformen wider. Zur Wahl des jeweils geeigneten Therapiekonzeptes ist es daher essentiell, Tumore hinsichtlich oben genannter Charakteristika möglichst genau zu klassifizieren und in diese Klassifizierung einzuordnen. Dies erfolgt u. a. mit Hilfe sogenannter Tumormarker. Dies sind histologische Gewebeveränderungen und molekulare Zellbestandteile, deren qualitative und quantitative Darstellung Aufschluß über das Vorliegen, die Art und den Verlauf bösartiger Erkrankungen geben.

Bekannte Tumormarker umfassen beispielsweise definierte chromosomale Aberrationen, die ektope oder übermässige Bildung verschiedener Hormone und insbesondere auch die ektope oder übermäßige Expressionen verschiedener Proteine.

Die Detektion einer übermäßigen Genexpression auf der mRNA-Ebene kann beispielsweise mittels quantitativer RT-PCR Verfahren oder Northern-Blot- Techniken mit aus Tumormaterial oder Serum gewonnenen RNA-Proben erfolgen. Auf Protein-Ebene erfolgt dies z. B. mittels immunhistochemischer Techniken, Immunpräzipitations- oder Western-Blot Verfahren mit Hilfe von gegen die Tumormarker gerichteten Antikörpern. Dabei kommt der immunohistochemischen Darstellung von Tumormarkern in Gewebeschnitten entnommenen Tumormaterials eine besondere Bedeutung zu, da diese Methode neben der Detektion von Tumormarkern auch die genaue Darstellung der Abmessungen des entnommenen Tumors ermöglicht. Diese Darstellung ist zur Bestimmung der Tumorgröße als weiteres Indiz für den Grad der Malignität des Tumors wichtig. Vor allem dient sie jedoch der postoperativen Kontrolle der Vollständigkeit einer Tumorentnahme, die für den Operationserfolg ausschlaggebend ist.

Die genetische Instabilität maligner Tumore stellt ein großes Problem der Tumordiagnostik dar. Der mit der Tumorprogression einhergehende Verlust der Zelldifferenzierung führt oftmals zu einem vollständigen oder teilweisen Verlust der Expression charakteristischer Tumormarker, so daß diese in entsprechenden Detektionsverfahren nur schwach oder gar nicht zur Identifizierung des Tumors herangezogen werden können. Besonders problematisch ist dabei auch, daß die Zellen eines Tumors trotz ihres klonalen Ursprungs im Laufe der Tumorprogression ihre genetische Homogenität verlieren, was dazu führt, daß bei der postoperativen Kontrolle von Gewebeschnitten nur Teilbereiche des Tumors darstellbar sind. Dies birgt die Gefahr, daß eine unvollständige Tumorentnahme unerkannt bleibt oder die Tumorgröße falsch bestimmt wird.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, alternative Möglichkeiten zur Tumordiagnose auf Basis alternativer Tumormarker mit Expressionsmustern, die sich von denen bekannter Tumormarker unterscheiden, bereitzustellen. Überdies besteht in besonderem Maße ein Bedarf an der Verwendung von Substanzen und Mitteln zur Tumordiagnostik, welche geeignet sind, eine möglichst vollständige, homogene Darstellung entnommener Tumore in histologischen Gewebeschnitten zu erzielen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Nutzung von DCoH als alternativer Tumormarker gelöst.

Die Erfindung betrifft demgemäß die Verwendung mindestens einer mit DCoH interagierenden Substanz zur Diagnose von Tumoren.

Das Enzym DCoH ist der Dimerisierungscofaktor der HNF-1 homeodomänen Proteine (HNF-1α und HNF-1β). Durch diesen Mechanismus ist DCoH an der Kontrolle der Genexpression beteiligt, siehe D. B. Mendel et al., Science 254 (1991, 1762). Gleichzeitig ist das Protein als Pterin-4α-carbinolamindehydratase PCD bekannt und an der Tetrahydrobiopterinregenerierung beteiligt, siehe B. A. Citron et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, 11891. PCD greift dabei in die Biosynthese von L-Tyrosin aus L-Phenylalanin ein. In letzterem Cyclus ist PCD zusammen mit Phenylalaninhydroxylase eingebunden und an der Regenerierung von (6R)5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin beteiligt. Unabhängig davon wird DCoH/PCD aber auch im vertebraten Ei, im pigmentierten Epithel des Auges, in der Haut und im Gehirn gefunden, siehe E. Pogge v. Strandmann und G. U. Ryffel, Development 121 (1995), 1217; E. Pogge v. Strandmann et al. Int. J. Dev. Biol. 42 (1998), 53.

Nach ersten Daten über die Reinigung und Klonierung von DCoH von D. B. Mendel et al. Science 254 (1991), 1762 wurde so wohl die Peptidsequenz als auch die dafür codierende Nukleinsäuresequenz von Human-, Maus- und Ratten-DCoH in US-A 5 403 712 und 5 620 887 erstmalig beschrieben. Bezüglich aller relevanter Strukturdaten wird auf diese Veröffentlichungen verwiesen. DCoH/PCD hat sich als mehr oder weniger universelles Prinzip in der Entwicklung von Wirbeltieren, insbesondere auch für die Frühentwicklung erwiesen. Es weist sowohl katalytische wie regulierende Eigenschaften auf und ist in einer größeren Anzahl von Zelltypen präsent. In einigen dieser Zelltypen ist es mit den nuklearen Transkriptionsfaktoren HNF-1α und HNF-1β verschwistert, in anderen in den Phenylalaninhydroxylase-Enzymkomplex eingebunden. Das Vorkommen von DCoH/PCD in Zelltypen in Abwesenheit von HNF-1 oder Phenylalaninhydroxylase weist darauf hin, daß das Protein auch mit davon verschiedenen zellulären Partnern zusammenwirkt.

Die Erfindung beruht auf experimentellen Studien der Erfinderin, die ergaben, daß die zelluläre Menge an DCoH entgegen bisheriger Annahmen nicht mit dem Pigmentstatus von Zellen im Zusammenhang stehen. Überraschenderweise besteht dagegen ein Zusammenhang zwischen der Entartung von Zellen - unabhängig vom Pigmentiertenstatus - und dem Anstieg des zellulären DCoH- Gehaltes. So ergaben Experimente, daß maligne Melanome gegenüber dem umgebenden, nicht entarteten Gewebe und insbesondere auch nicht entarteten Melanozyten erhöhte Spiegel an DCoH Protein und mRNA aufweisen.

Überdies ist ein Anstieg des zellulären DCoH-Gehaltes auch in Tumoren zu verzeichnen, welche von Zellen abgeleitet sind, die im Adult DCoH gar nicht oder nur im geringen Maße exprimieren. Dies ist besonders überraschend, da DCoH normalerweise strikt zelltypspezifisch exprimiert wird.

DCoH eignet sich somit als alternativer Tumormarker.

Die erfindungsgemäße Verwendung von mit DCoH interagierenden Substanzen in der Tumordiagnostik erweitert das dem Histopathologen zur Verfügung stehende Repertoire an tumorspezifischen Markern. Diese Erweiterung des Repertoires an speziellen Tumorantigenen ist insofern bedeutsam, als daß nur eine Färbung mit verschiedenen Antikörpern die sichere Bestimmung der Herkunft des Tumors nach einem Ausschlußverfahren erlaubt. Dies ist essentiell für die Diagnose, ob es sich bei dem untersuchten Tumor um einen Primärtumor handelt oder ob der untersuchte Tumor eine Metastase eines Tumors ist, welcher aus einem anderen Gewebe stammt.

Überdies weist die erfindungsgemäße Verwendung gegenüber dem Stand der Technik den Vorteil auf, daß sich mit der Verwendung der genannten Substanzen eine homogene Darstellung von Tumoren erzielen läßt, welche mittels anderer Marker gar nicht oder nur in Teilbereichen darstellbar sind.

Die Tumordiagnose umfaßt dabei sowohl die Identifizierung als auch die bildliche Darstellung von Tumoren. Die Interaktion zwischen Substanz und DCoH betrifft alle zur Detektion von DCoH geeigneten Wechselwirkungen der Substanzen oder Teile der Substanzen mit DCoH (Protein oder mRNA) oder Teilen von DCoH im intakten oder aufgearbeiteten Gewebe, intakten oder aufgearbeiteten Zellen bzw. Molekülgemischen. Substanzen im erfindungsgemäßen Sinne sind hoch- oder niedermolekulare Verbindungen, sowie diese Verbindungen enthaltende Gemische. Dabei sind insbesondere Proteine wie Antikörper in Form polyklonaler Antiseren, monoklonaler oder rekombinanter Antikörper sowie Peptide oder Nukleinsäuren geeignet. Die erfindungsgemäße Verwendung der mit DCoH interagierenden Substanzen kann auf jedem geeigneten Verfahren zur Darstellung und Detektion der DCoH Expression basieren. Herkömmliche Verfahren, die Aufschluß über den zellulären Protein oder mRNA Gehalt von DCoH geben sind dazu besonders geeignet. Anwendbar sind jedoch auch Verfahren zur Detektion der enzymatischen Aktivität von DCoH.

Die Verwendung der mit DCoH interagierenden Substanzen zur Diagnose maligner Melanome stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar, weil die DCoH-Expression überraschenderweise sowohl in melanotischen als auch in weitgehend dedifferenzierten, amelanotischen malignen Melanomen gegenüber nicht entartetem Gewebe stark erhöht ist. Die erfindungsgemäße Verwendung ermöglicht somit eine homogene und vollständige Darstellung von Melanomen in Gewebeschnitten ermöglicht.

Die Expression bekannter melanomspezifischer Tumormarker geht oftmals mit zunehmender Dedifferenzierung verloren, so daß insbesondere stark entartete Melanome nicht oder nur unzureichend darstellbar und identifizierbar sind. Dies trifft beispielsweise für die zwei häufig zur Tumordiagnose herangezogenen Melanommarker gp100 und S100 zu. Das Glykoprotein gp100 ist spezifisch für Prämelanosomen und wird in den besonders aggressiven amelanotischen malignen Melanomen nicht oder nur sehr schwach exprimiert. Als Folge davon ist eine sichere Identifizierung und Darstellung anhand des häufig verwendeten, gegen gp100 gerichteten monoklonalen Antikörpers HMB45 nicht mehr möglich.

Aus diesem Grunde wird zur Identifizierung und bildlichen Darstellung maligner Melanome zusätzlich auf die Verwendung von Antikörper gegen das Protein S100, ein saures Ca-bindendes Protein, zurückgegriffen, da dessen Expression unabhängig vom melanotischen Status erfolgt. Jedoch ermöglicht dieser Marker eine nur unbefriedigende Darstellung maligner Melanome, da dessen immunhistochemische Detektion in Gewebeschnitten entnommener Tumor- Proben oftmals nur die Darstellung von Teilbereichen des Tumors erlaubt.

Die erfindungsgemäße Verwendung von mit DCoH interagierenden Substanzen weist daher gegenüber den zur Detektion dieser Marker verwendeten Substanzen den Vorteil auf, daß sich eine homogene und vollständige Darstellung insbesondere maligner Melanome erzielen läßt.

Aufgrund ihrer Eignung für eine Vielzahl analytischer Verfahren, ist die erfindungsgemäße Verwendung von Antikörpern besonders zweckmäßig. Dabei können prinzipiell alle Arten von Antikörpern oder Gemische verschiedener Antikörper verwendet werden, besonders vorteilhaft ist jedoch die Verwendung monoklonaler Antikörper. Auch die spezifische Aufreinigung der Antikörper mit Hilfe herkömmlicher Techniken ist zur Verminderung von Hintergrundsignalen vorteilhaft.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden mindestens ein mit DCoH interagierendes polyklonales Antiserum und/oder mindestens ein mit DCoH interagierender monoklonaler Antikörper zur Diagnose von Melanomen eingesetzt.

Ebenso zweckmäßig ist die Verwendung mindestens einer mit DCoH interagierenden Nukleinsäure zur Diagnose von Melanomen. Als Nukleinsäure kommen beispielsweise Antisense-Nukleinsäuren oder Antisense- Oligonukleotide, welche mit DCOH-mRNA oder Teilen davon hybridisieren in Frage. Diese können mittels herkömmlicher Techniken markiert und detektiert werden und stellen eine Alternative zur immunohistochemischen Darstellung von Tumorgewebe in histologischen Schnitten dar. Geeignet ist auch die Verwendung von DNA-Oligonukleotiden, welche zur Detektion von DCoH als PCR-Primer im Rahmen von RT-PCR-Reaktionen oder als Sonden in RNA-Blot- Verfahren eingesetzt werden.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mittel zur Diagnose von Tumoren, welche mindestens eine mit DCoH interagierende Substanz enthalten. Diese Mittel können aus der oder den Substanzen selbst bestehen oder zusätzliche weitere Bestandteile aufweisen. Zweckmäßig sind flüssige Suspensionen der Substanzen in geeignet gepufferten Medium. Die Bestandteile dienen zweckmäßigerweise zur Stabilisierung der Substanzen dienen (z. B. Detergenzien, Proteine, Protease oder Nukleaseinhibitoren etc.) oder sind in sonstiger Weise dem Detektionsverfahren zuträglich.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Mittel zur Diagnose von Melanomen eingesetzt, wobei sich Antikörper als im Mittel enthaltene Substanz besonders eignen.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Mittel als Substanz mindestens eine mit DCoH interagierende Nukleinsäure.

Besonders zweckmäßig ist die Darbietung der DCoH interagierenden Substanzen bzw. der sie enthaltende Mittel in Form handelsüblicher Kits, welche weiterhin sonstige, zur Detektion von DCoH notwendige Substanzen und/oder Utensilien aufweisen. So sind in PCR-Kits zweckmäßig, welche neben den DCoH hybridisierenden DNA-Primern Reverse Transkriptase, eine thermostabile DNA-Polymerase, Desoxynukleotide und die benötigten Reaktionspuffer enthalten. Gleiches gilt für Kits zur Durchführung immunhistochemischer Färbeverfahren, welche neben dem mit DCoH interagierenden Erstantikörper zweckmäßigerweise einen markierten Zweitantikörper in stabilisierendem Puffer enthalten.

Die Erfindung soll nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert werden, welches durch die sich darauf beziehende Fig. 1 veranschaulicht wird.

In der Fig. 1 ist beispielhaft ein Gewebeschnitt durch ein malignes Melanom dargestellt, der unterschiedlich aufbereitet wurde.

In der Fig. 1 werden in vier verschiedenen Abbildungen unterschiedlich aufbereitete Schnitte durch ein primäres malignes Melanom gezeigt, welches in Paraffin gebettet ist.

Die linke obere Abbildung der Fig. 1 zeigt den gestielten Tumor vom nodulärem Typ deutlich kreisförmig in der Mitte des Schnittes mit vielen nekrotischen Bereichen.

In der rechten oberen Abbildung der Fig. 1 wurde der Schnitt mit einem Antikörper (nach Pogge von Strandmann et al. 1995 hergestellt, 1998 analog hergestellt) inkubiert. Der Schnitt wurde vor der Inkubation mit dem Antikörper nach Standardmethoden in einer handelsüblichen Mikrowelle in ProTaqsIV Puffer der Firma BIOCYG Luckenwalde einmal 6 min bei 600 Watt, nach Abkühlen erneut bei 600 Watt bis zum Kochen, dann bei 180 Watt 5 min behandelt. Der Antikörper dieser Charge wurde dann 1 : 400 in PBS pH 7,5 verdünnt und der Schnitt 32 min inkubiert. In dieser Abbildung wurde ein Brückenantikörper verwendet, der den Nachweis des gebundenen Primärantikörpers des Kaninchens erlaubt. Der Nachweis des Brückenantikörpers erfolgte mittels alkalischer Phosphatase an Zweitantikörper gebunden. Die Farbreaktion erfolgte mit dem Fast Red Naphtol System nach Standardmethoden. Die Färbung ist rot, hier durch die schwarz/weiß Wiedergabe grau. Die Gegenfärbung erfolgte mit Hematoxylin.

In der linken unteren Abbildung der Fig. 1 wurde der darauffolgende Schnitt nicht mit der DCoH spezifischen Antikörper behandelt, sondern mit handelsüblichen Antikörpern gegen S100.

In der rechten unteren Abbildung der Fig. 1 wurde der darauffolgende Schnitt nicht mit der DCoH spezifischen Antikörper behandelt, sondern mit dem handelsüblichen Antikörper HMB 45.

Bei S100 und HMB 45 Färbungen handelt es sich um in der klinischen Diagnostik gebräuchliche Nachweisverfahren.

Claims (12)

1. Verwendung mindestens einer mit DCoH interagierenden Substanz zur in vitro Diagnose von Tumoren.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumore Melanome sind.

3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz mindestens einen Antikörper enthält.

4. Verwendung mindestens eines mit DCoH-Protein interagierenden polyklonalen und/oder monoklonalen Antikörpers zur in vitro Diagnose von Melanomen.

5. Verwendung mindestens einer mit DCoH interagierenden Nukleinsäure zur in vitro Diagnose von Melanomen.

6. Mittel zur Diagnose von Tumoren enthaltend mindestens eine mit mit DCoH interagierende Substanz.

7. Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumore Melanome sind.

8. Mittel nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz mindestens einen mit DCoH interagierenden Antikörper enthält.

9. Mittel nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz mindestens eine mit DCoH interagierende Nukleinsäure enthalten.

10. Tumordiagnosekit mit mindestens einem mit DCoH interagierenden polyklonalen und/oder monoklonalen Antikörper.

11. Tumordiagnosekit mit mindestens einer mit DCoH interagierenden Nukleinsäure.

12. Kit nach Anspruch 10 oder 11 zur Diagnose von Melanomen.