DE4442460C1 - Verfahren zur selektiven Bestimmung des Gehalts eines Enzyms in einer biologischen Probe, insbesondere zur selektiven Bestimmung von knochenspezifischer alkalischer Phosphatase - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Bestim­ mung des Gehalts eines Enzyms in einer biologischen Probe, und insbesondere zur selektiven Bestimmung des Isoenzyms knochenspezifische alkalische Phosphatase (BAP) in einer biologischen Flüssigkeit.

Zur Bestimmung des Gehalts eines bestimmten Enzyms in einer biologischen Probe kann man so vorgehen, daß man die Enzym­ aktivität in der fraglichen Probe durch Umsetzung mit einem geeigneten Substrat bestimmt, das bei seiner enzymatischen Umwandlung z. B. eine Farbreaktion zeigt, die gemessen werden und mit der Enzymaktivität in der fraglichen Probe korre­ liert werden kann. Die Messung der Enzymaktivität erfolgt dabei in der Regel als kinetische Messung durch Messen einer Meßreihe.

Wenn die biologische Probe Bestandteile enthält, die eine direkte Bestimmung der Enzymaktivität in der genannten Probe nicht ohne weiteres möglich machen, ist es erforderlich, das zu bestimmende Enzym abzutrennen. Das gleiche gilt auch für den Fall, daß nur der Gehalt eines bestimmten Isoenzyms in einer biologischen Probe bestimmt werden soll, die gleich­ zeitig andere Isoenzymformen des gleichen Grundenzyms ent­ hält. Da die einzelnen Isoenzymformen bei ihrer Umsetzung mit einem Substrat alle die gleiche oder nahezu gleiche enzymatische Wirkung entfalten, kann bei einer Bestimmung der Enzymaktivität in der Gesamtprobe nur die Summe der Aktivität aller darin enthaltenen Isoenzyme bestimmt werden. Will man den Gehalt eines bestimmten Isoenzyms anhand seiner Enzymaktivität bestimmen, muß man es vom Rest der Original­ probe abtrennen. Um dann seinen Gehalt in der Originalprobe zu ermitteln, kann man dann entweder die Enzymaktivität des abgetrennten Isoenzyms feststellen, oder man ermittelt diesen Gehalt anhand einer Differenzmessung, indem man einmal die Enzymaktivität der gesamtem Probe mißt, und dann die restliche Enzymaktivität nach Abtrennung des zu bestim­ menden Isoenzyms. Die Ermittlung des Gehalts des gesuchten Isoenzyms durch die letztgenannte Differenzbildungsmethode hat den Nachteil, daß zwei getrennte Messungen durchgeführt werden müssen, was aufwendig ist und mit dem doppelten Risiko einer Meßwertverfälschung durch Meßfehler belastet ist. Die Bestimmung des Gehalts des gesuchten Isoenzyms in der abgetrennten Fraktion ist nur möglich, wenn bei der Abtrennung die Enzymaktivität nicht verlorengegangen ist und das abgetrennte Isoenzym in einer Form vorliegt, die eine reproduzierbare Messung seiner Enzymaktivität erlaubt.

Ein Beispiel für einen Fall, bei dem die Bestimmung bestimm­ ter Isoenzymformen für die klinischen Diagnose eine hohe Bedeutung aufweist, ist die Bestimmung der Isoenzymformen der alkalischen Phosphatase (AP). Alkalische Phophatase kommt in bis zu fünf organspezifischen Isoenzymformen vor, von denen für die klinische Diagnose die knochenspezifische alkalische Phosphatase (bone-specific alkaline phosphatase, BAP) und die leberspezifische alkalische Phosphatase (liver­ specific alkaline phosphatase, LAP) besonders wichtig sind. Mit verschiedenen physiologischen Zuständen (u. a. dem Le­ bensalter) sind dabei verschiedene Spiegel der einzelnen Isoenzyme im Serum oder Plasma eines Patienten verbunden, und die selektive Messung von knochenspezifischer alkali­ scher Phosphatase (BAP) gestattet beispielsweise Rückschlüs­ se auf bestimmte Knochenerkrankungen, die von einer Erhöhung des Gehalts an BAP im Serum oder Plasma eines Patienten begleitet sind. Derartige Erkrankungen sind beispielsweise das Paget-Syndrom oder maligne Knochentumoren. Das schwie­ rigste diagnostische Problem in der Bestimmung der BAP ist dabei deren Unterscheidung von leberspezifischer alkalischer Phosphatase (LAP). Beide Ispenzyme sind Produkte des glei­ chen Gens und unterscheiden sich aufgrund unterschiedlicher post-translationaler Veränderungen beispielsweise beim Glykosilierungsmuster relativ geringfügig (vgl. Moss, D.W. und King, E.J., Biochem. J. 84: 192-195 (1962); Seargeant, L.E. und Stinson, R.A., Nature 281: 152-154 (1979); Stinson, R.A. und Seargeant, L.E., Clin. Chim. Acta 110: 261-272 (1981); Moss, D.W., Prog. Clin. Biol. Res. 166: 79-86 (1984). Zur selektiven Messung von BAP neben LAP wurden unterschiedliche diagnostische Bestimmungsverfahren entwic­ kelt.

Eines der Verfahren beruht auf der unterschiedlichen Hitze­ desaktivierbarkeit der beiden Isoenzyme. Durch Erhitzen der Probe wird die wärmeempfindlichere LAP schrittweise inakti­ viert, und der Anteil an BAP wird aus dem beobachteten kinetischen Desaktivierungsverhalten ermittelt (MOSS, D.W. und Witbe L.G., Lin. Chim. Acta 61, 73 bis 71 (1975). Das Verfahren ist aufwendig und für die klinische Routine­ diagnose schlecht geeignet.

Ein weiteres Verfahren zur Bestimmung von BAP neben LAP beruht auf der gelelektrophoretischen Trennung der beiden Isoenzyme unter geeigneten Bedingungen (Onica, D. et al., Clinica Chimica Acta 155: 285-294 (1986); van Hoof, V.O., Clin. Chem. 34: 1857-1862 (1988); Crofton, P., Clin. Chem. 38: 663-670 (1992); Chamberlain, B.R., et al., Clinica Chimica Acta 208: 219-224 (1992)).

Ein weiteres Verfahren beruht auf der Bestimmung von BAP mit Hilfe eines Paars spezifischer monoklonaler Antikörper und ist beschrieben in der EP-A-0 381 450.

Ein weiteres in Form eines Testkits (ISO-ALP, Boehringer Mannheim) in die klinische Diagnose eingeführtes Verfahren ist das Verfahren gemäß WO 84/02720 bzw. Clin. Chim. 39/4, 648-652 (1993). Bei diesem Verfahren wird die unterschiedli­ che Fällbarkeit von BAP und LAP mit Hilfe von Lektinen, die N-Acetylglucosamin-Reste zu binden vermögen, insbesondere von Lektin aus Weizenkeimen ausgenutzt. Mit Hilfe von Lektin aus Weizenkeimen (wheat germ lectin oder agglutinin, WGA), das sich spezifisch an die Kohlenhydratreste der BAP bindet, läßt sich BAP durch Fällung selektiv von LAP trennen. Man geht bei dem beschriebenen Bestimmungsverfahren so vor, daß man zuerst auf an sich bekannte Weise die Gesamtaktivität der alkalischen Phosphatase in einer Probe ermittelt (Ver­ wendung eines p-Nitrophenylphosphatsubstrats und eines Diethanolaminpuffers und kinetische Reihenmessung gemäß der optimierten Standardmethode der Deutschen Gesellschaft für klinische Chemie (1972)), daß man anschließend die Probe mit einer Lösung des Lektins versetzt und nach einer vorgegebe­ nen Inkubationszeit die Mischung zentrifugiert. Eine neuer­ liche Bestimmung der Aktivität der alkalischen Phosphatase im nach dem Zentrifugieren erhaltenen Überstand liefert einen zweiten Wert, und aus der Differenz der beiden Werte für die Gesamtaktivität und die Restaktivität wird die in der Originalprobe vorhandene Aktivität an BAP errechnet.

Das beschriebene Verfahren geht zurück auf eine Original­ arbeit von Rosalki S.B. und Ying Foo, A., in Clin. Chem. 30/7, 1182-1186 (1984), in der die selektive Fällbarkeit der knochenspezifischen alkalischen Phosphatase (BAP) mit Hilfe des Lektins aus Weizenkeimen erstmals beschrieben ist. In der genannten Originalarbeit bzw. gemäß WO 84/02720 wird dabei so vorgegangen, daß man nach der Lektin-Fällung und dem Abzentrifugieren des gebildeten Niederschlags aus Lektin und BAP die Aktivität der alkalischen Phosphate einmal im Zentrifugationsüberstand bestimmt, und zum anderen im Zen­ trigufationspellet, das man dazu in einer Kochsalzlösung resuspendierte bzw. in einer Natriumdodecylsulfat (SDS) enthaltenden Kochsalzlösung solubilisierte. Die in den einzelnen Fraktionen erhaltenen Aktivitäten wurden mit der separat gemessenen Gesamtaktivität in der Probe verglichen. Die Autoren der genannten Veröffentlichung schlossen aus ihren Ergebnissen, daß sich durch Lektin-Fällung etwa 80% der in der Probe vorhandenen BAP fällen läßt, was sie durch eine Korrektur des für die Aktivität im Niederschlag erhal­ tenen Werts mit dem Faktor 1,25 berücksichtigten. Die ge­ nannte Arbeit enthält keinerlei Angaben zu den beim Resus­ pendieren bzw. bei der Solubilisation des Niederschlags angewandten Bedingungen.

Aufbauend auf der genannten Originalarbeit wurden von Behr, W. und Barnert, J. in Clin. Chem. 32/10, 1960-1966 (1986) die Möglichkeiten der Bestimmung von BAP unter Ausnutzung der Lektin-Fällung weiter untersucht. Die Autoren bestimmten BAP anhand der Differenz der Aktivität von AP in der Gesamt­ mischung und im Überstand nach der Lektin-Fällung. Zur Überprüfung ihrer Ergebnisse führten sie ferner Wiederfinde- Versuche durch, bei denen die Summe der Aktivität im Über­ stand und im Niederschlag mit der gemessenen Gesamtaktivität verglichen wurde. Die Autoren erhielten eine gute Überein­ stimmung der erhaltenen Meßergebnisse mit denen von alterna­ tiven Bestimmungsverfahren und erhielten auch gute Ergeb­ nisse für die Wiederfindung, kommen jedoch zu dem Schluß, daß eine Bestimmung von BAP durch Differenzmessung im oben beschriebenen Sinne das einfachste und vorteilhafteste Verfahren darstellt, da es schwierig ist, nach der Fällung und nach dem Zentrifugieren den Überstand quantitativ zu entfernen und den Niederschlag zu resuspendieren. Eine unvollständige Resuspendierung würde zu niedrige Werte für die gemessene BAP-Aktivität liefern und wird als nur schwer erkennbar angesehen. Diese Befunde erklären, warum auch in dem in Clin. Chem. 39/4, 648-652 (1993) beschriebenen Test­ kit das Verfahren der Differenzmessung zur Bestimmung von BAP angewandt wird, obwohl es die bereits eingangs erwähnten Nachteile einer Mehrfachbestimmung (erhöhter Arbeitsaufwand, Fehlermöglichkeiten) aufweist.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein für die klinische Routinediagnostik geeignetes einfaches und zuverlässiges Verfahren zur selektiven Bestimmung des Gehalts eines Enzyms, insbesondere des Gehalts an knochen­ spezifischer alkalischer Phosphatase, in einer biologischen Probe zu schaffen, das nicht als Doppelbestimmung durchge­ führt werden muß und trotzdem alle Anforderungen an die erforderliche Zuverlässigkeit und Präzision erfüllt.

Diese Aufgabe wird in allgemeinerer Form durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1 bzw. ein Verfahren zur Bestimmung von knochenspezifischer alkalischer Phosphatase gemäß Patentan­ spruch 8 gelöst.

Vorteilhafte Ausgestaltungen derartiger Verfahren ergeben sich aus den Unteransprüchen 2 bis 7 sowie den nachfolgenden detaillierten Erläuterungen zur vorliegenden Erfindung.

Ausgangspunkt der vorliegenden Erfindung ist die Bestätigung der Feststellung der Autoren Behr, W. und Barnert, J. in Clin. Chem. 32/10, 1960-1966 (1986), daß es nicht ohne weiteres möglich ist, die von den Autoren empfohlene und im Testkit gemäß Clin. Chem. 39/4, 648-652 (1993) umgesetzte aufwendige Differenzmessung durch die direkte Messung der Aktivität an alkalischer Phosphatase in der Lektin-Fällung zu ersetzen. Nach der Fällung von BAP durch Zusatz einer Lösung des Fällmittels und anschließendes Zentrifugieren wird der gebildete Niederschlag in Form eines außerordent­ lich harten und festen Pellets erhalten, das sich nach seiner Trennung vom Überstand nur mit viel Geduld wieder vollständig in eine Lösung oder Suspension überführen läßt. Wenn man versucht, das Pellet, wie in der Laborpraxis üblich, nach Zugabe der Pufferlösung mit dem Spatel auf­ zulockern und in einem Vibrationsmischer (Vortexer) zu resuspendieren, sind erhebliche Behandlungszeiten nötig, bis eine dem Anschein nach vollständige Resuspendierung/Auflö­ sung erreicht ist. Bestimmt man dann in der erhaltenen flüssigen Phase die Aktivität der alkalischen Phosphatase und vergleicht den erhaltenen Wert mit den nach anderen Verfahren erhaltenen Ergebnissen, so stellt man eine erheb­ liche Streuung der Meßwerte fest, die offensichtlich darauf zurückgehen, daß auf die beschriebene Weise keine vollstän­ dige und reproduzierbare Überführung des Fällungsnieder­ schlags/Zentrifugationspellets in die flüssige Phase möglich ist.

Die vorliegende Erfindung beruht nunmehr darauf, daß erkannt wurde, daß diese irreproduzierbaren Ergebnisse bei dem Versuch der Wiederauflösung des Niederschlags nicht dadurch vermieden werden müssen, daß man eine Differenzmessung durchführt, sondern daß es möglich ist, auf eine einfach durchführende und auch für die klinische Routinediagnostik geeignete Weise eine schnelle, zuverlässige und quantitative Überführung des Niederschlags in die flüssige Phase zu erreichen, in der dann die Messung der Aktivität der kno­ chenspezifischen alkalischen Phosphatase durch eine einfache Direktmessung zuverlässig möglich ist.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß es durch Zusatz einer Solubilisationshilfe in Form eines teilchenförmigen inerten Feststoffs (eines sandartigen oder körnigen Materi­ als) einer geeigneten Dichte, Teilchengröße und Oberflächen­ beschaffenheit möglich ist, das aus dem Niederschlag der Lektin-Fällung beim Zentrifugieren gebildete Pellet zuver­ lässig und reproduzierbar in einer Lösung eines für die Messung der Enzymaktivität geeigneten Puffers aufzulösen.

Der Zusatz eines inerten teilchenförmigen Materials (Sandes) zur Verbesserung der Resuspendierung bzw. Resolubilisierung eines Zentrifugationspellets stellte keine in der allgemei­ nen Laborpraxis übliche Arbeitsweise dar, und es war nicht möglich, in der Literatur oder in der Praxis einen Hinweis auf die Verwendung einer derartigen Solubilisationshilfe zur Auflösung von Pellets, die beim Abzentrifugieren von Nieder­ schlägen erhalten werden, zu finden. Da das Problem der Wiederauflösung/Resuspendierung von Pellets in der Labor­ praxis, insbesondere auf dem Gebiet der klinischen Chemie, Biochemie, Biotechnologie oder Biologie, immer wieder auf­ tritt und die Verwendung einer Solubilisationshilfe im Sinne der vorliegenden Erfindung in den meisten Fällen mit Vor­ teilen verbunden ist, wird in der vorliegenden Anmeldung gleichzeitig eine praktische Verfahrensführung mit erhebli­ cher allgemeiner Bedeutung ohne Beschränkung auf irgendwel­ che besonderen Materialien beschrieben. Besondere, direkt in der klinischen Routinediagnostik nutzbare Vorteile werden jedoch bei der Isoenzymbestimmung und insbesondere bei der Bestimmung von BAP erhalten, da die eingeführten aufwendigen Bestimmungsverfahren vereinfacht werden können.

Die der Probe zugesetzte Solubilisationshilfe läßt sich in allgemeiner Form als inerter, sauberer Sand beschreiben, der die Eigenschaften aufweisen muß, dichter als Wasser zu sein (Quarzglas bzw. Quarz haben Dichten zwischen 2 und 2,65 g/cm³), so daß ein schnelles Absetzen in einer wäßrigen Flüssigkeit erhalten wird, eine Teilchengröße aufzuweisen, die einerseits beim Schütteln eine intensive Bewegung der Teilchen ermöglicht, andererseits nicht zu zu leichten Teilchen führt, die ineffektiv sind und sogar in Schwebe bleiben, (eine geeignete Korngröße eines Sandes oder ähn­ lichen inerten Feststoffs liegt im Bereich von 0,1 bis 1,0 mm), inert zu sein und keine stark absorbierende oder poröse Oberfläche aufzuweisen, die eine Messung durch Adsorptionseffekte stören könnte.

Diese Anforderungen sind von einer Großzahl feinteiliger inerter fester körniger oder sandartiger Materialien zu erfüllen. Gibt man ein Probenröhren mit einem Lösungspuffer und der beschriebenen Solubilisationshilfe in einen Vibra­ tionsmischer (Vortexer), können auch sehr feste Pellets schnell und problemlos vollständig und reproduzierbar in die Flüssigphase überführt werden. Die unlöslich inerte Solubi­ lisationshilfe sinkt schnell und von selbst auf den Boden des Teströhrchens, und es kommt somit zu keiner Vermischung und keiner Veränderung der Konzentration oder des Volumens der zu vermessenden Probe. Insbesondere kommt es auch zu keiner Trübung der Testlösung, die bei der späteren Messung der optischen Dichte nach Umsetzung der BAP mit dem Substrat der Enzymreaktion stören könnte.

Zur Bestimmung der Enzymaktivität der durch Lektin-Fällung abgetrennten BAP kann ein Aliquot der beim Auflösen des Pellets nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Flüssigkeit vermessen werden. Durch Vergleich des für die Enzymaktivität erhaltenen Meßwerts mit den Werten einer Standardkurve ist eine direkte Auswertung des Meßergebnisses ohne Notwendigkeit einer kinetische Messung der Enzymaktivi­ tät und ohne Messung der gesamten Enzymaktivität in der Ausgangsprobe möglich. Die Standardkurve wird unter Ver­ wendung von Standardproben erstellt, die dem Reagentiensatz beigegeben werden.

Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung anhand ihrer Anwendung auf die Bestimmung von knochenspezifischer alkali­ scher Phosphatase (BAP) unter Bezugnahme auf Figuren und unter vergleichender Bewertung der erhaltenen Meßergebnisse noch näher erläutert.

Es zeigen:

Fig. 1 eine typische Standardkurve des erfindungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 2 eine graphische Darstellung mit den Ergebnisse eines Intraassayvergleichs mit 20 Patientenseren;

Fig. 3 eine graphische Darstellung der nach dem erfin­ dungsgemäßen Verfahren gemessenen BAP-Werte bei verschiedenen Kollektiven von Testpersonen;

Fig. 4 eine Korrelation der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Meßwerte mit denen des kom­ merziellen ISO-ALP-Assays; und

Fig. 5 eine Korrelation der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Meßwerte mit denen des kom­ merziellen Tandem-R Ostase-Assays.

Anwendungsbeispiel Testverfahren zur Bestimmung von BAP in einem humanen Serum

Komponenten des erfindungsgemäßen Assays zur BAP-Bestimmung:
Fällungsreagenz:

Fällungsreagenz: 0,5 mg/ml Lektin aus Weizenkeimen (WGA) in 100 mM Tris Puffer (Lektin von Sigma Katalog-Nr.: L 9640)

Solubilisationshilfe: feinkörniger Feststoff (Quarzsand, Sand o. ä.) mit einer Korngröße im Bereich von 0,1 bis 1,0 mm. Erforderlichenfalls wird ein Ausgangsmaterial durch Absieben auf eine geeignete Korngröße gebracht. Zu kleine Körner stören, da sie als Schwebteilchen in der nach Auflö­ sung des Pellets erhaltenen flüssigen Phase schwimmen wür­ den, größere Körner sind aufgrund ihrer schlechteren Beweglichkeit beim Lösen der Niederschläge weniger effektiv. Vor der Verwendung wird der Sand mit sauberem Wasser (destilliertes oder entionisiertes Wasser, durch Revers­ osmose gereinigtes Wasser) gewaschen und getrocknet. Pro Teströhrchen können Mengen im Bereich von etwa 10 bis 30 mg eingesetzt werden, wobei die Menge nicht kritisch ist.

Lösungspuffer: 1 M Diethanolaminpuffer

Standards: humane knochenspezifische alkalische Phosphatase (Calzyme Katalog-Nr.: 124A0001) in 1 M Diethanolaminpuffer. Die Enzymaktivität wird nach einer Standardmethode bei 37°C bestimmt (optimierte Standardmethode der Deutschen Gesell­ schaft für klinische Chemie, 1972). Durch Verdünnen werden Standards mit einem Gehalt an BAP von 37,5; 75; 150; 300; 600 und 1200 mU/ml hergestellt.

Substratlösung zur Bestimmung der Enzymaktivität: 1 mg/ml p- Nitrophenylphosphat in 1 M Diethanolaminpuffer.

A: Probenvorbereitung

• 1. Es werden 50 µl einer Probe (Serum oder Plasma, wobei - wie dem Fachmann bekannt ist - bei der BAP-Bestimmung kein EDTA-Plasma verwendet werden darf) in ein Teströhrchen (Rundbodenröhrchen 5 ml) pipettiert.
• 2. Anschließend werden 200 µl Fällungsreagenz (Lektin) pipettiert.
• 3. Die Reaktionsmischung wird kurz geschüttelt und dann 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
• 4. Nach der vorgesehenen Inkubationszeit werden die Röhrchen 10 Minuten bei 2000 × g zentrifugiert, und die Überstände werden dekantiert.
• 5. Auf das im Röhrchen verbliebene Pellet werden ca. 20 mg Solubilisationshilfe (entsprechend einem gestrichen vollen kleinen Spatellöffel) und 250 µl Lösungspuffer gegeben.
• 6. Anschließend werden die Röhrchen geschüttelt, und zwar entweder einzeln für 1 bis 2 Sekunden auf einem Vibrations­ mischer (Vortexer) oder alle Röhrchen gemeinsam im Ständer auf einem Orbitalschüttler für ca. 5 Minuten.

B: Probenmessung

• 1. 20 µl Standard- oder vorbereitete Probe (wie unter A beschrieben gewonnen) werden jeweils in eine Kavität einer Mikrotiterplatte pipettiert.
• 2. Jeder Kavität werden 150 µl Substratlösung zugegeben, und es wird 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
• 3. Anschließend wird die Reaktion mit jeweils 100 µl Stopp­ lösung (2M NaOH) gestoppt und bei 405 nm in einem Platten­ photometer gemessen.

Eine Standardkurve, wie sie bei der beschriebenen Vorgehens­ weise für die Standardreagentien erhalten wird, ist in Fig. 1 gezeigt. Der für die Probe ermittelte Wert für die opti­ sche Dichte kann auf der Standardkurve aufgesucht werden und direkt als Enzymaktivität (mU BAP/ml) abgelesen werden.

Zur Überprüfung der Zuverlässigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden auf die beschriebene Weise erhaltene Werte Auswertungstests unterzogen.

Präzision

Die bei der Bestimmung der Präzision des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 2 darge­ stellt. Dabei wurde auf der x-Achse die BAP-Konzentration und auf der y-Achse der dazugehörende Variationskoeffizient (VK) aufgetragen. Der VK wurde in einem Intraassayvergleich ermittelt, wobei die gleichen Proben 20mal in einem Assay­ lauf getestet wurden. Die Assaypräzision liegt für alle BAP- Werte unter 10%.

Häufigkeitsverteilung

Die Häufigkeitsverteilung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ermittelten BAP-Werte für verschiedene Kollektive ist in Fig. 3 dargestellt. Gesunde Erwachsene (Alter <20 Jahre; n = 99), Schwangere (n = 7) und Patienten mit Leber­ erkrankungen (n = 6) zeigen keine signifikanten Unterschiede der Meßergebnisse. Die erhaltenen Meßwerte liegen alle im Normalbereich unter 80 mU/ml. Erwartungsgemäß zeigen jedoch Kinder während der Wachstumsphase (bis 15 Jahre; n = 27) deutlich erhöhte BAP-Werte.

Korrelation

Zur Bewertung der Zuverlässigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Meßergebnisse für 40 Seren mit Meßwerten vergli­ chen, die für die gleichen Seren unter Verwendung beste­ hender Verfahren zur Bestimmung von knochenspezifischer alkalischer Phosphatase erhalten wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 sowie in den Fig. 4 und 5 dargestellt.

In Tabelle 1 betreffen die Spalten a und b die Ergebnisse von Bestimmungen nach Verfahren des Standes der Technik, die nachfolgend noch genauer erläutert werden. Unter c werden die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ermittelten Werte angeführt. Die Meßergebnisse für a und c sind in mU/ml angegeben, und die für b in mg/l.

Die Vergleichsverfahren a und b waren:

• a) Bestimmungsverfahrenunter Verwendung des kommerziell erhältlichen Testkits ISO-ALP der Firma Boehringer Mannheim (Kat.-Nr.: 1065769), der auch Grundlage der Veröffentlichung in Clin. Chem. 39/4, 648-652 (1993) ist.
• b) Immunologisches Bestimmungsverfahren von BAP unter Ver­ wendung von zwei monoklonalen Antikörpern, von denen einer auf einer Festphase immobilisiert ist und der andere als Tracer eingesetzt wird. Der Test ist kommerziell unter dem Namen Tandem-R Ostase von der Firma Hybritech (Kat. -Nr.: 3040) erhältlich.

In den Fig. 4 und 5 sind die Korrelationen des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens zu den Verfahren des Standes der Technik graphisch dargestellt. Sie zeigen eine gute Überein­ stimmung mit Korrelationsfaktoren von r = 0,938 (Fig. 4) und r = 0,90 (Fig. 5).

Vergleichsversuch

Die Wichtigkeit der Verwendung einer Solubilisationshilfe zeigte sich bei dem Versuch, ein Verfahren, das dem erfin­ dungsgemäßen Verfahren entspricht, ohne Zusatz der Solubili­ sationshilfe durchzuführen. 35 Seren wurden mit und ohne Zusatz der Solubilisationshilfe vermessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Den Ergebnissen ist sofort zu entnehmen, daß eine direkte Messung der Enzym­ aktivität der mit Lektin-Fällung ausgefällten BAP nur unter Verwendung der Solubilisationshilfe möglich ist. Ohne Solu­ bilisationshilfe wird auch bei längerem Schütteln nur eine teilweise und von Probe zu Probe unterschiedliche Auflösung erhalten (35 bis 100% der mit Solubilisationshilfe erhalte­ nen Werte). Diese Ergebnisse zeigen, daß die scheinbar einfache praktische Maßnahme des Zusatzes einer feinkörnigen inerten Solubilisationshilfe einen hohen Einfluß auf die erhaltenen Meßergebnisse ausübt und letztlich erst eine direkte Messung der Enzymaktivität der ausgefällten BAP durch Wiederauflösung eines Pellets möglich macht.

Es ist dem Fachmann sofort klar, daß die Vorteile des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens nicht nur bei der Bestimmung von knochenspezifischer alkalischer Phosphatase genutzt werden können, sondern in allen Fällen, in denen eine direkte Bestimmung in einer durch Fällung aus einer Reaktionslösung und Zentrifugieren als schwer lösliches Pellet erhaltenen festen Phase wünschenswert ist und gegenüber der üblichen Bestimmung durch Differenzmessung Vorteile bietet. Denkbare Anwendungsgebiete sind Enzymbestimmungen, insbesondere selektive Isoenzymbestimmungen, andere mögliche Anwendungs­ gebiete ergeben sich für den mit einer speziellen Problem­ stellung befaßten Fachmann jedoch ohne weiteres von selbst.

Tabelle 1

Tabelle 2

Claims (8)

1. Verfahren zur selektiven Bestimmung des Gehalts eines Enzyms in einer biologischen Probe, bei dem man (i) das zu bestimmende Enzym durch Umsetzung mit einem Lektin fällt, (ii) den Lektin-Enzym-Niederschlag dadurch von der flüssigen Phase trennt, daß man zentrifugiert und eine erste flüssige Phase als Überstand von dem im Zentrifugationspellet gewon­ nenen Lektin-Enzym-Niederschlag abtrennt, (iii) anschließend das Zentrifugationspellet durch Resuspendieren oder Resolu­ bilisieren in eine zweite flüssige Phase überführt und dann (iv) den im Niederschlag gebundenen und/oder den im Über­ stand vorhandenen Enzymgehalt in den flüssigen Phasen auf an sich bekannte Weise bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man das Zentrifugationspellet dadurch in die zweite flüssige Phase überführt, daß man es in Gegenwart einer zugesetzten Solubilisationshilfe in Form eines teilchenförmigen inerten Feststoffs unter kurzzeitigem Schütteln in einer Lösung eines geeigneten Puffers auflöst.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zu bestimmende Enzym ein selektiv mit Lektin fällbares Isoenzym ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das zu bestimmende Isoenzym knochenspezifische alkalische Phosphatase (BAP) ist, die in einer biologischen Flüssigkeit bestimmt wird, die weitere organspezifische Isoenzymformen der alkalischen Phosphatase (AP) enthält, wobei man die knochenspezifische alkalische Phosphatase (BAP) selektiv mittels Lektin aus Weizenkeimen (WGA; Weizenkeimlektin) ausfällt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als teilchenförmigen inerten Fest­ stoff einen körnigen Sand mit Teilchen mit Durchmessern im Bereich von 0,1 bis 1 mm verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man gewaschenen Quarzsand oder einen anderen Sand verwendet, der durch Mahlen eines Glases oder eines anderen oxidkerami­ schen Materials mit einer Dichte von mehr als 1,5 g/cm² sowie gegebenenfalls Siebklassieren und Waschen erhalten wurde.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das kurzzeitige Schütteln als ein Schütteln einzelner Teströhrchen für einen Zeitraum von 1 bis 10 s auf einem Vibrationsmischer durchführt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das kurzzeitige Schütteln als Schüt­ teln eines Gestells mit einem Satz Teströhrchen für einen Zeitraum von 2 bis 7 min auf einem Orbitalschüttler durch­ führt.

8. Verfahren zur Bestimmung knochenspezifischer alkali­ scher Phosphatase (BAP) in einer biologischen Flüssigkeit, die zusätzlich andere Isoenzymformen der alkalischen Phos­ phatase (AP) enthält, bei dem man

• - eine Probe der biologischen Flüssigkeit mit einer Lösung von Lektin aus Weizenkeimen versetzt,
• - die erhaltene flüssige Mischung zur Abscheidung des gebildeten Niederschlags unten Bildung eines Pellets zen­ trifugiert,
• - die überstehende flüssige Phase von dem Pellet ab­ trennt,
• - dem Pellet eine pufferhaltige wäßrige Lösung sowie eine Solubilisationshilfe in Form eines sandartigen inerten Fest­ stoffs zusetzt,
• - die erhaltenen heterogene Mischung zur Resuspendierung oder Auflösung des Pellets kurzzeitig schüttelt, und zur Bestimmung des Gehalts an knochenspezifischer alkalischer Phosphatase (BAP) in der biologischen Probe die meßbare Phosphataseaktivität in der durch Auflösung des Pel­ lets erhaltenen flüssigen Phase bestimmt und den erhaltenen Meßwert unter Berücksichtigung der während der Bestimmung gewählten Verdünnungsparameter anhand einer Standard-Eich­ kurve auswertet.