WO1998040045A1

WO1998040045A1 - Procede d'evaluation d'agents de revitalisation et procede de production de preparations externes pour la peau

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Publication number: WO1998040045A1
Application number: PCT/JP1998/000896
Authority: WO
Inventors: Yasutomo Nishimori; Katsuo Matsumoto; Yukiko Kenjo
Original assignee: Pola Chemical Industries Inc.
Priority date: 1997-03-11
Filing date: 1998-03-04
Publication date: 1998-09-17
Also published as: CA2283795A1; EP0992232A1; EP0992232A4; TW550086B; US6340677B1; AU744809B2; CA2283795C; MY132814A; AU6119998A; JP3408258B2; KR20000076136A

Description

明細書皮膚状態改善剤の評価方法及び皮膚外用剤の製造方法技術分野本発明は、シヮゃ肌荒れ等の好ましくない皮膚状態を改善したりその悪化を抑制するための皮膚状態改善剤およびこれを含有する皮膚状態改善用の皮膚外用剤

(以下、単に「皮膚外用剤」ということもある）を適切に評価するための評価方法、並びに、皮膚状態改善作用を十分に有する皮虜外用剤の製造方法に関する。

美しいきれいな皮膚は誰しも求めて止まないものであるが、又、皮膚の状態は種々の要因によって変化するものでもある。例えば、シヮの形成状況は、年齢に従って、或いは手入れや光などの損傷によって変化する。しかしながら、「シヮとは何か」、「何故シヮが出来るのか」と言った基本的な問題についてさえ、定説が無いのが現状である。また、「エラスチンの構造変化がシヮの原因である」とか、「コラーゲンの量の減少がシヮの原因である」とか諸説が提唱されているが、これらの説と反する現象が観察されたりしており、シヮの形成に代表される皮膚の状態の変化を完全に矛盾無く説明できるに至っていない。

—方、これまでに、上記シヮ等の望ましくない皮膚の状態を改善したり、あるいはこの様な皮膚状態が悪化するのを抑制したりすることを目的とした皮膚状態改善剤やこれを含有する皮潸外用剤が数多く開発されているが、これらを評価する際には、前記皮膚状態改善剤等を塗布した皮膚表面の変化を官能的に評価する方法にもっぱら頼らざるを得なかった。つまり、各種薬物や製剤のうちから、上記の様な皮膚状態の改善やその悪化の抑制を効果的に行えるものをスクリ一ニングするための、普遍的な評価基準が存在せず、このために、皮膚状態改善剤やこれを含有する皮膚外用剤等に適切な評価を与えることができなかった。

この様に、皮廣状態の改善や皮膚状態の悪化の抑制のための手段を探索する上で、皮膚の状態の変化を正しく鑑別すること、特に定量的に鑑別することは非常に重要でありながら、まだこの様な識別手段は得られていないのが現状である。そこで、皮膚状態改善剤等を適切に評価するために皮膚状態の変化を正しく鑑別する手段の開発が望まれていた。発明の開示本発明はこの様な状況下行われたものであり、皮膚状態の改善や皮膚状態の悪化抑制のための皮膚状態改善剤およびこれを含有する皮膚状態改善用の皮膚外用剤を適切に評価する方法を提供することを課題とする。また、本発明は、皮膚状態改善剤を含有する皮膚外用剤の製造方法において、皮膚状態改善作用を十分に有する皮膚外用剤の製造方法を提供することを課題とする。

なお、本明細書において「皮膚状態改善剤」の用語は、皮膚状態の改善作用や皮膚状態の悪化抑制作用を有する皮膚状態改善のための有効成分のみからなる薬剤を示すものとして用いられる。本発明者等は、上記課題を解決するために、シヮ等の皮膚の状態の変化を適切に鑑別する手段を求めて、実際のシヮの形成過程の克明な組織観察を行い、鋭意研究を重ねた結果、シヮ、肌荒れ等で皮膚の状態が悪いとき程、真皮のコラーゲン線維束の構造が秩序だっておらず明確でないことを見いだし、つまり、真皮のコラーゲン線維束の秩序の度合いを指標とすることにより、シヮの形成'シヮの改善等の皮膚の状態及びその変化を鑑別しうることを見いだし、本発明を完成させるに至った。なお、皮膚表面形態と真皮の形態が相関性良く互いに影響しあつていること、取り分け、皮膚表面のシヮと同様に真皮にもシヮに対応する溝が形成されていることは、これまでに全く知られていなかった事象である。

すなわち本発明は、状態の悪い皮膚部位を少なくとも 1箇所有する動物を用いて皮膚状態改善剤またはこれを含有する皮膚外用剤を評価する方法であって、前記皮膚部位に皮膚状態改善剤またはこれを含有する皮膚外用剤を塗布した際の、塗布前後における前記皮膚部位の真皮コラーゲン線維束の秩序度合、の変化量を指標とする方法を提供する。

本発明の評価方法によれば、真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを大きく改善することができる皮膚状態改善剤またはこれを含有する皮膚外用剤程、皮膚状態改善作用に優れると評価される。

本発明の評価方法に用いる動物は、状態の悪い皮膚部位を少なくとも 1箇所有するが、この皮膚の悪い状態として、具体的には、シヮゃ肌荒れ等が挙げられる。また、本発明に用いる、状態の悪い皮膚部位を少なくとも 1箇所有する動物として、具体的には、長期間紫外線を照射されたマウスや背部剃毛皮膚に陰イオン界面活性剤を塗布されたモルモット等を挙げることができる。

また、本発明の評価方法において、真皮コラーゲン線維束の秩序度合いは、具体的には、前記皮膚部位の少なくとも一部を採取し作製した真皮標本を 1 0 0〜 1 0 0 0 0倍で顕微鏡写真撮影し、得られた写真を下記基準で判定することにより測定することができる。

(判定基準） .

0 ：観察領域全域でコラーゲン線維束構造が認められない。

1 ：過半領域でコラーゲン線維束構造の崩壊又は異常構造'への変移が認められる。

2 ：一部にコラーゲン線維束構造の崩壊又は変性が認められるが、全体的にはほぼ正常な構造が認められる。

3 ：全面に亘り正常なコラーゲン線維束構造が認められ、崩壊 ·変性はほぼ認められない。

ここで、本発明の評価方法において真皮コラーゲン線維束の秩序度合いに関して、上記判定基準を用いた場合には、前記皮膚状態改善剤等の塗布前の評点に比ベて、塗布後の評点が大きい皮膚状態改善剤等程、皮膚状態改善作用に優れると評価される。

さらに本発明は、皮膚状態改善剤を含有する皮膚外用剤の製造方法であって、状態の悪い皮膚部位を少なくとも 1箇所有する動物を準備し、前記皮膚部位に皮膚外用剤を 0 . 0 1 g / 1 0 c m² · 1回の量で 1日 1回 8週間連続して塗布し、塗布前後における前記皮膚部位の真皮コラーゲン線維束の秩序度合いについて、前記皮膚部位の少なくとも一部を採取し作製した真皮標本を 1 0 0〜 1 0 0 0 0 倍で顕微鏡写真撮影し、得られた写真を上記と同様の判定基準で判定することにより測定した際の、塗布後の真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを塗布前の真皮コラーゲン線維束の秩序度合 L、で除した値が 1 . . 5以上となるように皮膚状態改善剤の含有量を調整することを含む皮膚外用剤の製造方法を提供するものである。上記本発明の製造方法が適用される皮膚外用剤として、具体的には、シヮ改善化粧料、肌荒れ改善化粧料等が挙げられる。図面の簡単な説明図 1は、マウス光老化モデルにおける皮膚表面形態の変化を表す電子顕微鏡写真（5 0倍）である。 Aは紫外線照射前の写真、 Bは照射開始後 2週間の写真、 Cは照射開始後 5週間の写真、 Dは照射開始後 1 0週間の写真である。

図 2は、マウス光老化モデルにおける真皮表面形態の変化を表す電子顕微鏡写真（5 0倍）である。 Eは紫外線照射前の写真、 Fは照射開始後 2週間の写真、 Gは照射開始後 5週間の写真、 Hは照射開始後 1 0週間の写真である。

図 3は、マウス光老化モデルにおける真皮コラーゲン線維束の構造変化を表す電子顕微鏡写真（5 0 0倍）である。 Iは紫外線照射前の写真、 Jは照射開始後 2週間の写真、 Kは照射開始後 5週間の写真、 Lは照射開始後 1 0週間の写真でのる。

図 4は、マウス光老化モデルにおける真皮コラーゲン線維束の構造変化を表す電子顕微鏡写真（2 5 0 0倍）である。 Mは紫外線照射前の写真、 Nは照射開始後 2週間の写真、 0は照射開始後 5週間の写真、 Pは照射開始後 1 0週間の写真である。

図 5は、マウス光老化モデルの真皮コラーゲン線維束構造の経時変化を、図 4 に示すのと同様の電子顕微鏡写真を一定の基準で評価して得られる評点と紫外線照射時間の関係で示す図である。秦は、マウス光老化モデルのプロットを、〇は、非照射コントロールマウスのプロットをそれぞれ表す。

図 6は、マウス光老化モデルの、画像解析により定量した皮膚表面のシヮの量 (シヮの面積％) と紫外線照射時間の関係を示す図である。 ·は、マウス光老化モデルのプロットを、〇は、非照射コントロールマウスのプロットをそれぞれ表す。 /JP98/0

- 5 - 図 7は、マウス光老化モデルのシヮ改善過程における皮膚表面形態を表す電子顕微鏡写真（5 0倍）である。 Qはエタノール投与マウスの写真、 Rはデキサメタゾン投与マウスの写真である。

図 8は、マウス光老化モデルのシヮ改善過程における真皮表面形態を表す電子顕微鏡写真（5 0倍）である。 Sはエタノール投与マウスの写真、 Tはデキサメタゾン投与マウスの写真である。

図 9は、マウス光老化モデルのシヮ改善過程における真皮コラ一ゲン線維束の構造を表す電子顕微鏡写真（5 0 0倍）である。 Uはエタノール投与マウスの写真、 Vはデキサメタゾン投与マウスの写真である。

図 1 0は、マウス光老化モデルのシヮ改善過程における真皮コラーゲン線維束の構造を表す電子顕微鏡写真（2 5 0 0倍）である。 Wはエタノール投与マウスの写真、 Xはデキサメタゾン投与マウスの写真である。発明を実施するための最良の形態以下、本発明を詳細に説明する。

( 1 ) 本発明の評価方法

本発明者等は、上述のように、真皮のコラーゲン線維束の秩序の度合いを指標とすることにより皮膚の状態及びその変化を鑑別しうることを見いだした。本発明の評価方法は、この技術を利用して、予め作成した或いは用意した状態の悪い皮膚部位を少なくとも 1箇所有する動物の前記皮膚部位に皮膚状態改善剤等の検体を塗布し、それによる皮膚状態の変化を、真皮のコラーゲン線維束の秩序の度合いの変化を指標として追跡することにより、前記検体の皮膚状態の改善作用を定量的に測定するものである。

ここで、上記状態の悪い皮膚部位を少なくとも 1箇所有する動物の皮膚の悪い状態を目的に合わせて選択すれば、この選択された皮膚の悪い状態、例えば、シヮゃ肌荒れ等を改善するのに適切な皮膚状態改善剤や皮膚外用剤を評価 ·スクリ一二ングすることが出来る。

この様な状態の悪い皮膚部位を少なくとも 1箇所有する動物としては、既に実験動物として確立している、紫外線長期照射マウス（以下、「マウス光老化モデル」ということもある）や剃毛皮膚をラウリル硫酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤を含む化学物質で処理したモルモット（以下「モルモット損傷皮膚モデル」ということもある）、感作性物質で感作後に惹起させて炎症を起こした動物等のモデル動物を使用することも可能であるし、肌荒れやシヮで悩んでいる人をパネラーに使用することも可能である。

しかしながら人を用いる場合には、バイオプシー等の作業が伴うので、上記モデル動物等を用いるのが好ましい。また、これら動物のうちでも、本発明で用いる状態の悪い皮膚部位を少なくとも 1箇所有する動物として好ましいものは、上記マウス光老化モデルやモルモット損傷皮膚モデルである。さらに、モルモット損傷皮膚モデルのうちでは、背部剃毛皮膚を陰ィォン界面活性剤で処理されたモルモッ卜が本発明の評価方法に好ましく用いられる。なお、本発明の評価方法においては、マウス光老化モデルはシヮを、モルモット損傷皮膚モデルは肌荒れを、それぞれ改善するのに適切な皮膚状態改善剤や皮膚外用剤を評価，スクリーニングするのに好適に用いられる。 '

また、本発明の評価方法において、上記動物の状態の悪い皮膚部位に皮膚状態改善剤またはこれを含有する皮膚外用剤を塗布する方法については、定量的な塗布が行える方法であれば特に制限されない。また、塗布の際に前記皮膚状態改善剤等を適当な希釈剤で希釈して用いることも可能である。

本発明の評価方法において真皮のコラーゲン線維束の秩序の度合いを測定するにあたって必要とされる真皮は、測定対象部位の皮膚を採取しこれを常法に従つて処理することによって得ることが出来る。この様な皮膚から真皮標本を得る方法としては、例えば、上記採集された皮膚を N a O H等で処理する N a O H法が例示できる。真皮のコラーゲン線維束は、この様にして得られる真皮標本を電子顕微鏡などで観察することにより見ることが出来る。さらに、この真皮コラーゲン線維束の秩序度合いの測定は、例えば、この電子顕微鏡の像を画像解析したり、適当な判定基準に従って肉眼観察によりスコア一を付すことにより行うことがでさる。

電子顕微鏡の像から肉眼観察により真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを測定する方法として、具体的には、上記真皮標本の電子顕微鏡像を 1 0 0〜 1 0 0 0 0倍程度、好ましくは 5 0 0 ~ 2 5 0 0倍程度の倍率で写真撮影し、得られた写真を、例えば、以下に示す判定基準で判定することにより測定する方法が挙げられる。

(判定基準）

1 ：過半領域でコラーゲン線維束構造の崩壊又は異常構造への変移が認められる。

2 ：—部にコラーゲン線維束構造の崩壊又は変性が認められるが、全体的にはほぼ正常な構造が認められる。

なお、判定基準は上記に制限されず、基準をより詳細に分類すること等も可能であるが、判定に費やす時間や判定の普遍性等を考慮すれば、本発明においては上記基準を標準的に用いることが適当であると考えられる。 '

本発明の評価方法においては、この様にして真皮コラーゲン線維束の秩序度合いが測定されるが、前記皮膚状態改善剤等の塗布前の真皮コラーゲン線維束の秩序度合いに比べて、塗布後の真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを大きく改善できる皮膚状態改善剤等程、皮膚状態改善作用に優れると評価される。また、例えば、上記判定基準を用いた場合には、前記皮膚状態改善剤等の塗布前の評点に比ベて、塗布後の評点が大きい皮膚状態改善剤等程、皮膚状態改善作用に優れると評価される。さらに、この場合には、塗布前後の評点の差や比を求めて、これを皮膚状態改善作用の評価に用いることも可能である。

また、本発明の評価方法においては、真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを測定するために皮膚が採取されるので、皮膚状態改善剤等を塗布する前後での真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを、実際に全く同じ皮膚部位において測定することはできないが、この方法における皮膚採取量は微量であり、前記塗布前と塗布後において極近辺の皮膚を採取することにより、実質的に塗布の前後で同じ皮膚部位に対して測定が行われたものと考えることができる。

さらに本発明の評価方法において、状態の悪い皮膚部位を少なくとも 1箇所有する動物として、上記モデル動物のような全く同様に皮膚状態が悪い動物を何匹か用いる場合には、皮膚状態改善剤等の検体を塗布しなレ、個体の真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを測定してこれを塗布前の値として、また、これとは別の個体に検体を塗布した後に真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを測定してこれを塗布後の値として、塗布前後の真皮コラーゲン線維束の秩序度合いの変化量を求めて検体評価の指標に用いることも可能である。

また、本発明の評価方法は、皮膚状態改善作用を有する経皮投与以外の薬剤の評価にも応用できるものである。以下に、マウス光老化モデルをシヮモデルとして用いた際の、シヮ改善剤の評価 ·スクリ一二ング例、及びモルモット損傷皮膚モデルを肌荒れモデルとして用いた際の、肌荒れ改善剤の評.価 ·スクリ一ニング例について述べる。

1 ) マウス光老化モデルを用いたシヮ改善剤の評価

まず、マウス光老化モデルを作製し、作製時におけるマウスの皮膚状態の変化と真皮コラーゲン線維束の秩序度合いの変化の関係を調べた。 a ) マウス光老化モデルにおける皮膚状態の変化と真皮コラーゲン線維束の秩序度合いの変化の関係

6匹ずつ 5群のへアレスマウス（S k h ： H R— 1、雌性、 8週齢）を準備し、その内の 1群については、以下の紫外線照射を行わずに 8週齢の時点、すなわち紫外線照射前の状態で、各マウスから皮膚及び皮膚表面形態レプリカを採取した。残りの 4群については、各マウスに紫外線 B (東芝 S Eランプ、 6 0 m J Z c m

²) を 1日 1回、週 5回の割合で照射しながら飼育した。

上記 4群の內の 1群については、照射開始から 1週間後に紫外線照射をやめ、その時点で各マウスから皮膚及び皮膚表面形態レプリカを採取した。同様にして、別の 1群については照射開始から 2週間後に、さらに別の 1群については 5週間後に、それぞれ紫外線照射をやめてその時点で各マウスから皮膚及び皮膚表面形態レプリカを採取した。さらに、最後の 1群については照射開始から 1 0週間後まで紫外線照射を続け、得られたマウスをマウス光老化モデルとした。なお、得られたマウス光老化モデルは、合計で 3 J / c m ²の紫外線を照射されたマウスである。また、得られたマウス光老化モデルからも皮膚及び皮膚表面形態レプリカをそれぞれ採取した。

上記の様にして各群のマウスから採取した皮膚について、その表面形態を走査電子顕微鏡により 5 0倍で写真撮影した後、前記皮膚から N a O H法により真皮標本を作製し、得られた真皮標本の表面形態を 5 0倍で、コラーゲン線維束構造を 5 0 0倍および 2 5 0 0倍で、それぞれ走査電子顕微鏡により写真撮影した。図 1に、上記マウス群のうち紫外線照射 1週間のマウス群を除く、各マウス群 6匹のうちの代表的な個体の皮膚表面形態の倍率 5 0倍での電子顕微鏡写真（A ：紫外線照射前、 B ：照射開始後 2週間、 C ：照射開始後 5週間、 D ：照射開始後 1 0週間）を、図 2にその真皮表面形態の倍率 5 0倍での電子顕微鏡写真（E ：紫外線照射前、 F ：照射開始後 2週間、 G ：照射開始後 5週間、 H ：照射開始後 1 0週間）を、図 3にその真皮コラーゲン線維束構造の倍率 5 0 0倍での電子顕微鏡写真（ I ：紫外線照射前、 J ：照射開始後 2週間、 K：照射開始後 5週間、 L ：照射開始後 1 0週間）を、図 4にその真皮コラーゲン線維東構造の倍率 2 5 0 0倍での電子顕微鏡写真（M：紫外線照射前、 N：照射開始後 2週間、 0 ：照射開始後 5週間、 P ：照射開始後 1 0週間）を、それぞれ示す。

これらの図より、シヮが形成される際、それに対応するように真皮の表面にも溝が形成されており、皮膚表面の形態の変化は真皮の表面の形態の変化に対応していること、更に真皮表面の変化は真皮に於けるコラ一ゲン線維束の構造の変化、即ち、コラーゲン線維束が明確でなくなる等のコラーゲン線維束の秩序の低下を反映していることが判る。

また、上記紫外線照射前、照射開始後 1週間、照射開始後 2週間、照射開始後 5週間、照射開始後 1 0週間（=マウス光老化モデル）の各マウス群における、真皮コラーゲン線維束構造の倍率 2 5 0 0倍での電子顕微鏡写真をもとに、各群マウスの真皮コラーゲン線維束構造のそれぞれについて、上述した判定基準に従つて 0〜 3のスコア一を付した。得られた結果から、紫外線照射の各段階における各群 6匹のマウスのスコア一の平均値と標準偏差を算出した。ここで、照射開始後 1 0週間群、すなわちマウス光老化モデル群におけるスコア一平均値は、 0 . 8 2であった。各群の平均値を図 5に秦プロットとして、前記標準偏差と共に示す。なお、図 5に示される〇プロットは、上記とは別に、 5匹ずつ 5群のへァレスマウス（S k h ： H R - 1、雌性、 8週齢）を紫外線照射を行わずに飼育した (以下、これにより得られたマウスを「非照射コントロールマウス」という）際の、上記同様の方法で評価されたマウスの真皮コラーゲン線維束構造についてのスコア一平均値を表すものである。図 5において、横軸は紫外線照射時間を、縦軸は上記の方法で評価されたマウスの真皮コラーゲン線維束構造についてのスコァーを示す。

さらに、上記マウス光老化モデル作製時におけるマウス皮膚表面の構造変化の様子を、次の方法で測定されるシヮの量の変化によって調べた。すなわち、上記紫外線照射時間の異なる各マゥス群より採取した皮膚表面レプリカに、入射角 2 0度でキセノンランプによる光照射を行い、出来たシヮの陰影を画像解析により定量することで、シヮの量を測定した。ここで、シヮの量は'、皮膚の全面積に対するシヮ面積の百分率（％) で表される。この様に測定されたシヮの量の各群 6 匹のマウスの平均値と標準偏差を算出した。得られた平均値を図 6に ·プロットとして、前記標準偏差と共に示す。なお、図 6に示される〇プロットは、非照射コントロールマウスの、上記同様の方法で測定されたシヮの量の平均値を表すものである。また、図 6において、横軸は紫外線照射時間を、縦軸は上記の方法で測定されたシヮの量を示す。

図 5および図 6より、マウス光老化モデル作製時における、皮膚表面でのシヮの量の変化と、真皮でのコラーゲン線維束の秩序の度合いの変化はよく対応していることがわかる。また、上記で得られたシヮの量の平均値と真皮コラーゲン線維束の秩序の度合いを評価したスコア一の平均値との相関係数を算出したところ、 0 . 9 1であり、シヮの量が真皮コラーゲン線維束の秩序の度合いを評価したスコア一値で定量出来ることが判明した。次に、この様にして得られるマウス光老化モデルをシヮモデルとして用いて、紫外線照射により生じたシヮ等を有する状態の悪い皮膚が、皮膚状態改善剤または皮虜外用剤によりどの様に変化するかを調べ、さらに、本発明の評価方法によりシヮ改善剤の評価を行った。 b ) シヮ改善剤の評価 ·スクリ一ニング

上記と同様にして作製したマウス光老化モデル（紫外線照射 1 0週間のマウス）に、デキサメタゾンを 0 . 0 5 %のエタノール溶液として、ローション剤の剤形で塗布した後の、マウスの皮膚状態と真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを上記同様の方法で調べ、デキサメタゾンのシヮ改善剤としての評価を行った。

すなわち、マウス光老化モデルの 1群 5匹の各マウス被験部位には、 0 . 0 5 %デキサメタゾンエタノール溶液を、もう 1群 5匹の各マウス被験部位にはコントロールとしてエタノールのみを、それぞれ 0 . 0 5 m lづっ 1日 / 1回の割合で、 8週間連日塗布した。塗布終了後、各マウスの皮膚を採取しその表面形態を走査電子顕微鏡により写真撮影した。さらに、前記採取された皮膚から上記同様に真皮標本を作製し、その表面形態とコラーゲン線維束構造を走査電子顕微鏡により写真撮影した。

各群 5匹のうちの代表的な個体のそれぞれについて、図 Ίに皮膚表面形態の倍率 5 0倍での電子顕微鏡写真（Q ：エタノール投与マウス、 R ：デキサメタゾン投与マウス）を、図 8に真皮表面形態の倍率 5 0倍での電子顕微鏡写真（S ：ェタノ一ル投与マウス、 T ：デキサメタゾン投与マウス）を、図 9に真皮コラーゲン線維束構造の倍率 5 0 0倍での電子顕微鏡写真（U：エタノール投与マウス、 V：デキサメタゾン投与マウス）を、図 1 0に貪皮コラーゲン線維束構造の倍率 2 5 0 0倍での電子顕微鏡写真（W：エタノール投与マウス、 X：デキサメタゾン投与マウス）を、それぞれ示す。

上記図 1〜4およびこれらの図より、デキサメタゾン投与マウスはエタノール投与マウスに比べ皮廣表面形態において皮膚状態の優れた改善が認められると同時に、真皮に於けるコラーゲン線維束の秩序の度合いについても同様の改善が認められる。

さらに、上記で得られた真皮コラーゲン線維束構造の倍率 2 5 0 0倍での電子顕微鏡写真をもとに、エタノール投与群およびデキサメタゾン投与群のそれぞれのマウスの真皮コラーゲン線維束の秩序度合、について、上述した判定基準に従つて 0〜 3のスコア一を付した。結果は、エタノール投与群については 5匹の平均値で 0 . 7 8であり、デキサメタゾン投与群については 5匹の平均値で 1 . 7 1であった。

これらの値を、本発明の評価方法に従って、上記 a ) で求めたマウス光老化モデルの皮膚状態改善剤塗布前の真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを示すスコア一値と比較すると、皮膚状態の改善度合いはデキサメタゾン投与群については 1 .

7 1 / 0 . 8 2 = 2 . 0 9で、また、エタノール投与群については 0 . 7 8 Z 0 .

8 2 = 0 . 9 5となる。あるいは、デキサメタゾン投与における皮膚状態の改善度合いは、ローション基剤であるエタノールの影響を勘案すると、デキサメタゾン投与群のスコア一平均値/エタノール投与群のスコア一平均値で 1 . 7 1 0 .

7 8 = 2 . 2 8として算出さ.れる。

この様に、デキサメタゾンローションの塗布前に比べて塗布後で真皮コラーゲン線維束の秩序度合いが著しく向上していることから、本発明の評価方法によれば、デキサメタゾンは優れたシヮ改善作用を有し、これを含有するローションは、シヮ改善用として有用な皮膚外用剤と判定される。

この様に、皮膚表面形態の走査顕微鏡写真からデキサメタゾンローションのシヮ改善作用が認められるのと同様に、本発明の評価方法によっても、デキサメタゾンローションはシヮ改善用として有用な皮膚外用剤と判定される。

2 ) モルモット損傷皮膚モデルを用いた肌荒れ改善剤の評価

a ) 肌荒れモデルの作製

ハートレー系白色種モルモット（体重2 5 0〜3 0 0 8 ) 3匹の背部をそれぞれ剃毛し、ラウリル硫酸ナトリゥムを 1 %含有するヮセリンを 4 8時間閉塞経皮投与して、投与終了から 2日間おいたモルモットを肌荒れモデルとした。このモルモット肌荒れモデル 3匹の背部皮膚をそれぞれ採取して真皮標本を作製し、電子顕微鏡写真を撮影して、真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを上記同様にスコァ一判定し、 3匹の平均値を算出したところ、結果は 0 . 8 9であった。 b) 肌荒れ改善剤の評価 ·スクリ一二ング

上記と同様にして作製したモルモッ卜の肌荒れモデル 3匹の背部皮膚に、ポリメタクリロイルフォスファチジルコリンを 0. 5 %含有するエタノール溶液を、 8週間連日塗布したところ、真皮コラーゲン線維束の秩序度合いのスコア一は 2. 1 1 (3匹の平均値）に上がった。この値を、本発明の評価方法に従って、上記 a) で求めたモルモット肌荒れモデルの前記エタノール溶液塗布前の真皮コラ一ゲン線維束の秩序度合いを示すスコァー値と比較すると、皮膚状態の改善度合ヽは、 2. 1 1 /0. 89 = 2. 37となる。この様に、ポリメタクリロイルフォスファチジルコリン含有エタノール溶液の塗布前に比べて塗布後で真皮コラーゲン線維束の秩序度合いが著しく向上していることから、本発明の評価方法によれば、ポリメタクリロイルフォスファチジルコリンは優れた肌荒れ改善剤と判定さまた、上記ポリメタクリロイルフォスファチジルコリン含有エタノール溶液の塗布前後におけるモルモット肌荒れモデルの皮膚表面形態の違いを肉眼で観察しても、塗布後に肌荒れはよく回復していた。

(2)本発明の皮膚外用剤の製造方法

本発明の皮膚外用剤の製造方法は、皮膚状態改善剤を含有する皮膚外用剤の製造方法に関するものであり、状態の悪い皮膚部位を少なくとも 1箇所有する動物を準備し、前記皮膚部位に皮膚外用剤を 0. 01 gZl 0 cm² · 1回の量で 1日 1回 8週間連続して塗布し、塗布前後における前記皮膚部位の真皮コラーゲン線維束の秩序度合いについて、前記皮膚部位の少なくとも一部を採取し作製した真皮標本を 100〜 10000倍、好ましくは、 500〜 2500倍で顕微鏡写真撮影し、得られた写真を下記基準で判定することにより測定した際の、塗布後の真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを塗布前の真皮コラーゲン線維束の秩序度合いで除した値が 1. 5以上となるように皮膚状態改善剤の含有量を調整する工程を含むことを特徴とする。

(判定基準）

0 ：観察領域全域でコラーゲン線維束構造が認められない。 1 ：過半領域でコラーゲン線維束構造の崩壊又は異常構造への変移が認められる。

3 ：全面に亘り正常なコラーゲン線維束構造が認められ、崩壊，変性はほぼ認められない。

本発明の皮膚外用剤の製造方法は、上記皮膚状態改善剤の含有量を調整するェ程を含むことを除いては、通常の皮膚外用剤の製造方法と同様とすることができる。例えば、上記の様にして皮膚状態改善剤の含有量を調整しながら、製造しようとする皮膚外用剤の剤形に応じた成分組成を決定した後、前記剤形の皮膚外用剤が通常採る製造方法のうちから適当な方法を適宜選択し、それに従って製造する方法等を挙げることができる。

この様な本発明の製造方法により得られる皮膚外用剤は、上記皮膚状態改善剤の含有量を調整する際に用いた状態の悪い皮膚部位を少なく'とも 1箇所有する動物の皮膚状態の悪化の原因となった皮膚異常又はそれと近似の皮膚異常を改善する作用に優れる。例えば、状態の悪い皮膚部位を少なくとも 1箇所有する動物として上記（1 ) で詳述したマウス光老化モデルを用いれば、このモデルはシヮモデルの代表的なモデルであるので、皮膚外用剤としては、シヮ改善作用に優れる皮膚外用剤が得られ、肌荒れモデルとして代表的なモルモット損傷皮膚モデルを用いれば、肌荒改善作用に優れた皮膚外用剤が得られる。

また、本発明の製造方法が適用される皮膚外用剤としては、化粧料や、抗炎症剤、抗真菌剤などの皮膚外用医薬などが例示でき、これらの内では、化粧料が好ましく、さらに、化粧料の内では、上記製造方法において優れた動物モデルを用いることが可能な、シヮ改善化粧料と肌荒れ改善化粧料が好ましい。実施例以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。下記の表 1に示す処方に従って剤形がクリームの化粧料を作製した。即ち、 B 成分を混練りし、 A成分で希釈した後、 8 0 °Cに温調し、これに予め 8 0 °Cに温調した C成分を徐々に加え乳化し、攪拌冷却しクリームを得た。尚、処方の数値は重量部を表す。

次いで、得られた 4種類の化粧料を、上述のマウス光老化モデルと同様にして 1 0週間の紫外線照射を行うことにより作製されたマウス光老化モデルの被験皮虜部位に、 0 . 0 1 g / 1 0 c m ² · 1回の量で 1日 1回 8週間連続して塗布した際の、化粧料の塗布前後における前記皮膚部位の真皮コラーゲン線維束の秩序度合いの変化を調べた。ここで、真皮コラーゲン線維束の秩序の度合いは、前記皮膚部位の一部を採取し作製した真皮標本を 2 5 0 0倍で顕微鏡写真撮影し、得られた写真を上述したのと同様の判定基準で 0〜 3のいずれかに判定することにより測定した。この方法で測定された塗布後の真皮コラーゲン線維束の秩序の度合いを塗布前の真皮コラーゲン線維束の秩序の度合いで除した値を評価に用いた。結果をコラーゲン線維束改善度として表 1に示す。

また、シヮに悩むパネラー 4 0名を任意に 1 0名ずつ 1〜4の 4グループに分けて、上記で得られた化粧料 1〜 4のうちグループ番号に対応する番号の化粧料を、通常の方法で 2ヶ月間連続使用してもらった。使用期間終了後、シヮの改善状況をアンケート調査した。この結果も表 1に併せて記す。

これらの結果より、本発明の評価方法による評価結果は、従来のパネラー等を用いた評価方法による評価結果によく対応していることがわかる。

また、上記で得られたコラーゲン線維束改善度の測定結果を本発明の製造方法に応用することが可能である。すなわち、表 1の化粧料 1にデキサメタゾンを配合してシヮ改善用の皮膚外用剤を製造する際には、デキサメタゾン配合量を概ね表 1の化粧料 3に示す配合量以上にして製造すればよいことがわかる。同様にべクロメタゾンについては、表 1の化粧料 4の配合量で十分であり、さらに少量の配合量による検討も可能であることがわかる。配合量（重量部）

成分

ノレ祉 ί 1 化粧料 2 化粧料 3 ィ科 4

rr

マイクロクリスタリノヮ7クス 0 0

流動ハ°ラフィン 10 10

A

A ジメチコン丄 1 Π

υ

デキサメタゾン

べクロメタゾン 0. 05

^n o o i

トリク'リセ ljンシ'イソステ了レ-ト c 0 5 5 o

B 70¾マルチト-ル水溶液 . 10 10 10 10

1,3-ブタンジオール 5 5 5 5

¹ミ o on

メチルパラベン 0. 3 0. 3 0. 3 0. 3

C 水 54. 7 54. 7 54. 7 54. 7 ラーゲン線維束改善度 1. 21 1. 35 1. 52 2. 03 良い 0 2 4 6

シヮの改善普通 10 8 6 4

(人数） 0 0 0 0

産業上の利用性本発明によれば、シヮ、肌荒れ等の皮膚状態の改善や皮膚状態の悪化抑制のための皮膚状態改善剤やこれを含有する皮膚外用剤を適切に評価する手段を提供できる。また、本発明によれば、皮膚状態改善剤を含有する皮膚外用剤の製造方法において、皮膚状態改善作用を十分に有する皮膚外用剤の製造方法を提供することが可能である。

Claims

請求の範囲

1 . 状態の悪い皮膚部位を少なくとも 1箇所有する動物を用いて皮膚状態改善剤またはこれを含有する皮膚外用剤を評価する方法であって、前記皮膚部位に皮膚状態改善剤またはこれを含有する皮膚外用剤を塗布した際の、塗布前後における前記皮膚部位の真皮コラーゲン線維束の秩序度合、の変化量を指標とする方法。

2 . 皮膚の悪い状態がシヮ又は肌荒れである請求項 1記載の方法。

3 . 前記動物が長期間紫外線を照射されたマウス又は背部剃毛皮膚に陰ィォン界面活性剤を塗布されたモルモットである請求項 1又は 2記載の方法。

4 . 前記真皮コラーゲン線維束の秩序度合いが、前記皮膚部位の少なくとも —部を採取し作製した真皮標本を 1 0 0〜 1 0 0 0 0倍で顕微鏡写真撮影し、得られた写真を下記基準で判定することにより測定される請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の方法。 '

(判定基準）

1 ：過半領域でコラーゲン線維束構造の崩壊又は異常構造への変移が認められ

5 . 皮虜状態改善剤を含有する皮膚外用剤の製造方法であって、状態の悪い皮膚部位を少なくとも 1箇所有する動物を準備し、前記皮膚部位に皮膚外用剤を 0 . 0 1 β 1 0 c m ² · 1回の量で 1日 1回 8週間連続して塗布し、塗布前後における前記皮膚部位の真皮コラーゲン線維束の秩序度合いにつ、て、前記皮膚部位の少なくとも一部を採取し作製した真皮標本を 1 0 0〜 1 0 0 0 0倍で顕微鏡写真撮影し、得られた写真を下記基準で判定することにより測定した際の、塗布後の真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを塗布前の真皮コラーゲン線維束の秩序度合いで除した値が 1 . 5以上となるように皮膚状態改善剤の含有量を調整することを含む皮膚外用剤の製造方法。

(判定基準）

2 ：—部にコラーゲン線維束構造の崩壊又は変性が認められるが、全体的にはほぼ正常な構造が認められる

3 ：全面に亘り正常なコラーゲン線維束構造が認められ、崩壊 '変性はほぼ認められない。

6 . 皮膚外用剤がシヮ改善化粧料である請求項 5記載の製造方法。

7 . 皮膚外用剤が肌荒れ改善化粧料である請求項 5記載の製造方法。