JPH1095713A - 皮膚タルミ改善作用の評価方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 被検体を含有する動物細胞埋包コラーゲ
ンゲルの強度を測定することにより当該被検体の皮膚タ
ルミ改善作用を評価する方法。 【効果】 簡便、安全かつ正確に皮膚タルミ改善物質を
評価することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、被検体の皮膚タル
ミ改善作用の評価方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】老化における典型的な顔面の形態変化で
あるシワやタルミを予防・改善するのに有効な物質を発
見あるいは製造することは、社会における重要な課題の
一つである。このうち、シワ改善物質としてはレチノイ
ン酸等数種の物質が知られているが、タルミ改善物質に
ついては全く知られていない。

【０００３】その原因の一つとしてタルミ改善物質の評
価方法として唯一知られているin vivo評価法は、費
用、時間、手間等がかかり、評価能率の点で非常に問題
があることが挙げられる。このような事情から、簡便、
安全かつ正確に皮膚タルミ改善物質を評価する方法の開
発が望まれている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
はin vitroで簡便かつ正確に皮膚のタルミ改善作用を評
価できる方法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者は真皮結
合組織に多量に存在するコラーゲンに着目し、真皮結合
組織のモデルとして知られているコラーゲン埋包培養に
おけるゲル強度と皮膚のタルミとの関係について検討し
てきたところ、当該ゲル強度を向上させる物質は皮膚の
タルミを改善させる作用を有することを見出し、本発明
を完成させるに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、被検体を含有する動
物細胞埋包コラーゲンゲルの強度を測定することを特徴
とする当該被検体の皮膚タルミ改善作用の評価方法を提
供するものである。

【０００７】

【発明の実施の形態】皮膚は表皮、真皮、皮下組織の３
層に主に分けられ、それらのうち真皮は皮膚の構造を維
持する上で極めて重要であり、コラーゲンやエラスチン
といった線維により強固かつ柔軟に造られ、真皮結合組
織を形成している。これらコラーゲンやエラスチンとい
った結合組織の線維を構成するタンパク質は、線維芽細
胞により合成／分解されている。線維芽細胞はこれらコ
ラーゲン等の線維と相互作用することにより結合組織の
状態をコントロールしている。

【０００８】通常の線維芽細胞培養条件下、線維芽細胞
をコラーゲンゲル中に埋包して培養するとコラーゲンゲ
ルは収縮し、ゲル強度を増す。線維芽細胞の存在しない
コラーゲンのみのゲルや、リンパ球など浮遊性の細胞を
埋包したゲルでは収縮は全く起こらず、ゲル強度にも変
化はない。コラーゲンゲル埋包培養は一般に真皮結合組
織のモデルとされている（Review: E. Bell et al. J.
Invest. Dermatol.,８１，２ｓ（１９８３）等）。当該
コラーゲンゲル埋包培養を利用したデータとしては、老
齢者由来の線維芽細胞埋包コラーゲンゲルと若年者由来
の線維芽細胞埋包コラーゲンゲルとを対比し、老齢者の
場合は若年者の場合に比べてゲルの収縮が低下している
ことが知られている（M. Yamato, et al. Mech. Ageing
Dev.,６７，１４９（１９９３））。

【０００９】しかしながら、かかる細胞埋包コラーゲン
ゲルの強度と皮膚のタルミとの関係について検討した報
告はなく、これらの間に相関性があることを見出したの
は本発明者がはじめてである。

【００１０】本発明に使用される動物細胞としては、コ
ラーゲンゲルを収縮させる作用のある細胞であれば正常
又はトランスフォームされたものでも、皮膚弛緩症等の
患部由来のものでも、正常組織由来のものでも、いかな
る組織のものでもいずれも利用できるが、正常の皮膚線
維芽細胞、肺線維芽細胞、歯肉線維芽細胞、軟骨細胞、
肝細胞、血管内皮細胞等がより好ましい。更には皮膚線
維芽細胞、肺線維芽細胞がより好ましい。

【００１１】細胞由来の動物としては哺乳類が好まし
く、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモッ
ト、イヌ、ウシ、サル、ニワトリ、ウマ等が挙げられる
が、この中でヒト、マウス、ラット、ウサギがより好ま
しい。これらの細胞は初代培養のものでも継代を繰り返
したあとのin vitro老化させた細胞であってもよく、ま
た、胎児由来のものであっても老齢者由来のものであっ
てもよい。これらの細胞は組織より公知の方法により採
取して用いてもよく、又は市販品を購入して用いてもよ
い。

【００１２】本発明に使用されるコラーゲンとしては、
動物由来のコラーゲンであればいずれでもよいが、動物
としては哺乳類が好ましく、ヒト、マウス、ラット、ウ
サギ、モルモット、ウシ等由来のコラーゲンがより好ま
しい。これらのコラーゲンは組織より公知の方法により
採取して用いてもよく、又は市販品（例えば新田ゼラチ
ン社製、typeI-A）を購入して用いてもよい。

【００１３】本発明に使用されるコラーゲンゲルは公知
の方法に準じて作製できる。コラーゲンゲル作製時のコ
ラーゲンの濃度は特に制限されないが、０．１〜５．０
mg／mlが好ましく、０．５〜３．０mg／mlがより好まし
い。この際埋包される動物細胞の密度は特に制限されな
いが、１，０００〜５，０００，０００cells／mlが好
ましく、５，０００〜５００，０００cells／mlがより
好ましい。作製されるコラーゲンの形状はいずれの形状
でもよいが、円形の培養プレートで作製した円柱型が好
ましい。

【００１４】被検体はコラーゲンゲル作製時のコラーゲ
ン溶液中に添加すればよい。

【００１５】本発明のコラーゲンゲルの強度の測定法は
応力緩和試験、切断試験、クリープ試験、引っ張り試験
等いずれでもよいが、応力緩和試験、クリープ試験がよ
り好ましい。また、動的粘弾性試験を行ってもよい。本
発明において、コラーゲンゲルの作製時から強度の測定
時までの培養期間は特に制限されないが、１日〜６０日
がより好ましい。

【００１６】被検体添加コラーゲンゲルの強度を被検体
無添加の場合と対比することにより、当該被検体のタル
ミ改善作用が評価できる。すなわち、被検体無添加の場
合に比べて被検体添加の場合のゲル強度が上昇していれ
ば、その被検体には皮膚のタルミを改善する作用がある
と評価できる。

【００１７】

【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではな
い。

【００１８】実施例１ コラーゲンゲルの応力緩和試験によるゲル形成強度の評
価 コラーゲンゲルは文献「J. Cell Science,１０２，３１
５（１９９２）」又は「J. Invest. Dermatol.９３，７
９２（１９８９）」に準じた方法で作製した。すなわ
ち、氷冷下コラーゲン溶液（新田ゼラチン社製、typeI-
A（３．０mg／ml，pH＝３））にＤＭＥＭ（Dulbecco's
Modified Bagle Medium low glucose）濃縮溶液、中和
液（２５０mM ＨＥＰＥＳ含有０．０５Ｍ ＮａＯＨ水
溶液）、ＦＣＳ（５％、Fatal Calf Serum）、精製水を
加えて十分に攪拌し、中和した後、最後にヒト皮膚線維
芽細胞（ヒト***、１歳、由来）の懸濁液を加えて、十
分に攪拌し、気泡を取り除いた後、１２穴プレートに各
穴３mlずつ注入し、直ちに３７℃でゲル化させた。この
際の細胞密度を１万個／ml、５万個／ml、１５万個／ml
の３種の濃度として比較検討した。またコラーゲン濃度
は１．５mg／mlに調製した。２４時間後ゲルの周囲を剥
離し、培地を加えて培養し、１０日培養後に測定を行っ
た。

【００１９】ゲルの形成強度試験は物性測定機器（Rheo
meter 2002DD、不動工業社製）を用いて応力緩和時間を
測定した。アダプターは、収縮したゲルの直径（最小８
mm程度）を考慮し直径５mmのものを使用した。応力は５
ｇ、応力緩和測定時間は９０秒とした。ゲルを短時間
（数秒間）キムワイプ（ワイパーＳ２００）に触れさせ
て余分な水分を除き、直ちに測定を開始した。測定は温
度２０〜２２℃、湿度３５〜４５％の条件下で行った。
結果を表１に示す。

【００２０】

【表１】

【００２１】表１より、細胞密度が高くなるにつれコラ
ーゲンゲルの緩和時間は増大し、ゲル強度が増加してい
ることがわかる。また、緩和率は細胞密度が高くなるに
つれ低下することからもゲル強度が増加していることが
明らかである。

【００２２】実施例２ コラーゲンゲル形成強度試験とタルミの相関性 老齢者由来と若齢者由来の皮膚線維芽細胞についてコラ
ーゲンゲル形成強度について評価した。実施例１と同様
氷冷下コラーゲン溶液に中和液、ＤＭＥＭ濃縮溶液、Ｆ
ＣＳ、精製水を加えて、十分に攪拌中和した後、最後に
ヒト皮膚線維芽細胞（老齢者由来：６４歳から７５歳、
ｎ＝５、若齢者由来０歳から２０歳、ｎ＝５）の懸濁液
を加えて十分に攪拌し、気泡を取り除いた後、１２穴プ
レートに各穴３mlずつ注入し、直ちに３７℃でゲル化さ
せた。この際の細胞密度は５万個／mlとし、また、コラ
ーゲン濃度は１．５mg／mlに調製した。２４時間後ゲル
の周囲を剥離し、培地を加えて培養し、１０日培養後に
測定を行った。ゲルの形成強度試験は実施例１と同様に
測定した。結果を表２に示す。

【００２３】

【表２】

【００２４】表２より、若齢者由来のものより老齢者由
来の細胞の方がコラーゲンゲルの緩和時間は減少し、ゲ
ル強度が低下していることがわかる。また、緩和率は若
齢者由来のものより老齢者由来の方が増加することから
もゲル強度が低下していることが明らかである。

【００２５】更に、１０歳代から７０歳以上までのヒト
（ｎ＝２００）の顔面部のタルミスコアをパネラー５人
により評価した。タルミスコアは以下の基準でつけた。
結果を表３に示す。

【００２６】 スコア０：全く弛んでいない スコア１：微かに弛んでいる感じがする スコア２：やや弛んでいる スコア３：弛んでいる スコア４：非常に弛んでいる

【００２７】

【表３】

【００２８】表３より明らかなように、若齢者よりも老
齢者の方がタルミの程度が高いことがわかる。表２及び
表３よりコラーゲンゲルの強度と皮膚のタルミには負の
相関性、すなわちゲル強度の低下とタルミの程度に相関
が得られていることは明らかである。

【００２９】実施例３ コラーゲンゲルの形成強度試験による被験物質の評価 実施例１と同様氷冷下コラーゲン溶液に中和液、ＤＭＥ
Ｍ濃縮溶液、ＦＣＳ、精製水を加えて十分に攪拌中和し
た後、最終濃度０．０１％（乾燥固形換算重量％）の被
験物質（各種植物エキス及びコントロールとしてその抽
出溶媒であるエタノール、ブチレングリコール）を加
え、最後にヒト皮膚線維芽細胞の懸濁液を加えて、十分
に攪拌し、気泡を取り除いた後、１２穴プレートに各穴
３mlずつ注入し、直ちに３７℃でゲル化させた。この際
の細胞密度は５万個／mlとし、また、コラーゲン濃度は
１．５mg／mlに調製した。２４時間後ゲルの周囲を剥離
し、培地を加えて培養し、１０日培養後に測定を行っ
た。ゲルの形成強度試験は実施例１と同様に測定した。
結果を表４に示す。

【００３０】

【表４】

【００３１】表４より明らかなように、種々の植物エキ
スによりコラーゲンゲルの緩和時間は増大し、ゲル強度
が増加していることがわかる。また、緩和率が種々のエ
キスを加えることにより低下することからもゲル強度が
増加していることが明らかである。

【００３２】一方、上記被検物質について皮膚に長期間
の塗布を行い、皮膚のタルミ改善作用を市販の皮膚粘弾
性測定機（Custometer ＳＥＭ４７４（Courage & Khaz
aka)）により評価したところ、表４のデータと正の相関
性が確認された。

【００３３】

【発明の効果】本発明によれば、簡便、安全かつ正確に
皮膚タルミ改善物質を評価することができる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被検体を含有する動物細胞埋包コラーゲ
   ンゲルの強度を測定することを特徴とする当該被検体の
   皮膚タルミ改善作用の評価方法。
2. 【請求項２】 動物細胞が、皮膚線維芽細胞、肺線維芽
   細胞、歯肉線維芽細胞、軟骨細胞、肝細胞又は血管内皮
   細胞である請求項１記載の評価方法。
3. 【請求項３】 動物細胞が、皮膚線維芽細胞である請求
   項１記載の評価方法。