UA111935C2 - ТРАНСГЕННА РОСЛИНА, ЯКА МІСТИТЬ ДНК, ЩО КОДУЄ ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Cry1Ab, І ДНК, ЩО КОДУЄ ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Cry1Be, ДЛЯ КЕРУВАННЯ РЕЗИСТЕНТНІСТЮ КОМАХ - Google Patents

Abstract

Даний винахід стосується способів і рослин для боротьби з кукурудзяним стебловим метеликом і/або кукурудзяною листовою совкою, де вказані рослини містять інсектицидний білок Cry1Ab і інсектицидний білок Cry 1Be, і різні комбінації інших білків, що містять дану пару білків, для затримки або попередження розвитку резистентності у комах.

Description

Рівень техніки

Люди вирощують кукурудзу для отримання продуктів харчування і енергії. Люди також обробляють багато інших сільськогосподарських культур, включаючи соєві боби і бавовники.

Щорічно мільярди доларів витрачаються на боротьбу з комахами-шкідниками, і ще мільярди доларів втрачаються за рахунок збитку, який вони наносять. Синтетичні органічні хімічні інсектициди були основними інструментами, які використовувалися для боротьби з комахами- шкідниками, але біологічні інсектициди, такі як інсектицидні білки, отримані з Васійи5

ІШигіпдіепві5 (ВІ, в деяких галузях зіграли досить важливу роль. Можливість отримання стійких до комах рослин за допомогою трансформації генів інсектицидних Ві-білків, привела до революційних перетворень в сучасному сільському господарстві, і підкреслила важливість і значення інсектицидних білків і їх генів.

Деякі Ві-білки використали для створення стійких до комах трансгенних рослин, які до теперішнього часу були успішно зареєстровані і стали промислово доступними. Вони включають СтгутАб, СтуТАс, СтуїРа і СтузВьЬ в кукурудзі, Стгу1тАс і Сту2АБ в бавовнику і СгузЗА в картоплі.

Промислово-доступні продукти, експресуючі дані білки, експресують один білок, за винятком тих випадків, коли бажаний комбінований спектр 2 інсектицидних білків (наприклад, СтуїАБ і

СтузвВь в комбінації в кукурудзі для забезпечення стійкості відповідно до лускокрилих шкідників і кореневих нематод), або коли незалежна дія білків робить їх придатною як інструмент для затримки розвитку резистентності у чутливих популяцій комах (наприклад, СтуТАс і Сту2АБ в комбінації в бавовнику для забезпечення керування резистентністю у тютюнової листовійки).

Дивись також публікацію заявки на патент США Мо 2009/0313717, яка стосується білка Сту2 плюс МірзАа, Сту1їб або СтутА для боротьби з Неїїсомегра 7е6а або аптідегаіїп. Міжнародна заявка УМО 2009/132850 стосується Стуї!Е або СтутА і МірзАа для боротьби з Зродорієега тидірегаа. Публікація заявки на патент США Мо 2008/0311096 частково стосується СтутАБб для боротьби з кукурудзяним стебловим метеликом, резистентним до СгуїЕ (ЕСВ; О5ігіпіа пибіїа|іє (Набпег)).

Тобто, деякі властивості стійких до комах трансгенних рослин, які привели до швидкого і широкого впровадження даної технології, також дали підставу вважати, що в популяціях комах

Зо буде розвиватися резистентність до інсектицидних білків, продукованих такими рослинами.

Було запропоновано декілька стратегій для того, щоб зберегти застосування Ві-ознак стійкості до комах, які включають застосування діючих білків у високій дозі в комбінації зі «сховищем» і альтернативно з спільним розміщенням інших токсинів (Месаиднеу еї аї. (1998) «ВІ. Кезімапсе

Мападетепі», Майшге Віоїтесппої., 16:144-146).

Для білків, вибраних для застосування в стеках керування резистентністю комах (ІЕМ), потрібно виявляти їх інсектицидний ефект незалежно, так, щоб резистентність, що виникла до одного білка, не додавала резистентності до іншого білка (тобто була відсутня перехресна резистентність до білків). Якщо, наприклад, популяція шкідників, вибрана за рахунок наявності резистентності до «білка А», одночасно є сприйнятливою до «білка В», то заявники стверджують, що відсутня перехресна резистентність і, що комбінація білка А і білка В буде ефективною в затримці розвитку резистентності до одного білка А.

При відсутності резистентних популяцій комах можна провести прогностичні оцінки, основані на інших характеристиках, приблизно зв'язаних з механізмом дії і можливістю розвитку перехресної резистентності. Було запропоновано використати опосередковане рецептором зв'язування для ідентифікації інсектицидних білків, для яких, ймовірно, не характерна перехресна резистентність (мап МеїІаег еї аїІ., 1999). Ключовим прогностичним показником відсутності перехресної резистентності в даному підході є той факт, що інсектицидні білки не конкурують за рецептори у сприйнятливих видів комах.

У тому випадку, коли два Ві-токсини конкурують у комах за один і той самий рецептор, і якщо рецептор мутує у цієї комахи таким чином, що один з токсинів більше не зв'язується з рецептором і в результаті більше не виявляє інсектицидної активності проти цієї комахи, то це може бути випадком, коли у комахи також буде розвиватися резистентність до другого токсину (який конкурентно зв'язаний з тим же рецептором). Тобто, комаха має перехресну резистентність до обох Ві-токсинів. Однак якщо два токсини зв'язуються з двома різними рецепторами, то це може бути показником того, що комаха не буде одночасно мати резистентність до цих двох токсинів.

Наприклад, білок Стуїба використовується для боротьби з багатьма лускокрилими комахами, включаючи кукурудзяного стеблового метелика (Нирпег) і кукурудзяну листову совку (ГАМУ; Зродоріеєга Ігидірегаа), і білок активний проти вогнівки цукрової тростини (ЗОВ; Оіаїгаєа бо засопагаїї5). Білок Стуї!Ра, продукований в трансгенних рослинах кукурудзи, що містить подію

ТС1507, відповідальний за ведучу в галузі ознаку резистентності комах в заходах для боротьби з ЕАМУ. Білок Сгу!Ра також входить до складу продуктів НегсцшехФ, Зтапоеїах "М ії У/аезігіке М,

Можливість провести дослідження, основані на зв'язуванні (конкурентному або гомологічному) з рецептором з використанням білка Стгу!Ра була обмежена, оскільки доступний звичайний метод введення мітки в білки для детектування в тестах зв'язування з рецептором приводив до інактивації інсектицидної активності білка Стуї Га.

Додаткові Сгу-токсини приводяться на веб-сайті офіційного комітету по номенклатурі У цей час відоме майже 60 основних груп «Сгу»-токсинів (Сгу!-Стуб9) з додатковими Суї- і МІР- токсинами і тому подібне. Багато з кожної нумераційної групи поділяються на підгрупи під великою літерою, і підгрупи під великою літерою поділяються на підпідгрупи, позначені малою літерою (наприклад, Сгу! має А-Ї,, і СтутА має ач).

Суть винаходу

Даний винахід частково стосується дивного відкриття того, що СтутАб ії Сту!Ве не конкурують за сайти зв'язування в мембранних препаратах клітин кишечника кукурудзяного стеблового метелика (ЕСВ; Озбігіпіа пибііаій5 (Нирпег)) або кукурудзяної листової совки (РАМУ;

Зродорієга їтидірегда). Як це буде зрозуміле фахівцям в даній галузі за допомогою даного розкриття, рослини, які продукують два ці білки (включаючи інсектицидні фрагменти повнорозмірних білків), можуть затримувати або попереджати розвиток резистентності до будь- якого одного з даних інсектицидних білків. Кукурудза і соєві боби є тільки деякими переважними рослинами. ЕСВ представляє переважний шкідник-мішень для даної пари токсинів.

Таким чином, даний винахід частково стосується застосування білка СтутАБ в комбінації з білком Сгу1Ве. Рослини (і території, засаджені такими рослинами), які продукують обидва таких білка, включені в об'єм даного винаходу.

Даний винахід також стосується потрійних стеків або «пірамід» з трьох (або більше) токсинів, в яких білки СтутАр і СгуїВе є основною парою. У деяких переважних варіантах здійснення пірамід комбінація вибраних токсинів забезпечує три сайти дії проти ЕСВ. Деякі переважні пірамідні комбінації з «трьома місцями дії» включають основну пару білків за даним винаходом плюс Сгуг2А, Стут! ї БІС-3 як третій білок для цілеспрямованої дії на ЕСВ. Такі конкретні потрійні стеки будуть, за даним винаходом, переважно і разюче забезпечувати три

Зо сайти дії проти ЕСВ. Це може допомогти знизити або елімінувати необхідність в територіях- «сховищах».

Незважаючи на те, що даний винахід розкривається в даному документі у вигляді пари токсинів СтгутАр і Сту!Ве, яких окремо або в «піраміді» з трьох або більше токсинів, які забезпечують стійкість кукурудзи до ЕСВ, очевидно, зрозуміло, що комбінації СтутАБ і Сту1Ве, описані в даному документі, також можна використати з додатковими білками для цілеспрямованого впливу на РАМУ на соєвих бобах і кукурудзі.

Також за даним винаходом можна додати додаткові токсини/гени. Наприклад, якщо СтуїЕа піддають стекінгу з парою білків за даним винаходом (СтгуіРа і Сгту!Ве обидва активні проти

ЕАМУ і ЕСВ), то додавання одного додаткового білка до даного потрійного стека, де четвертий доданий білок спрямований проти ЕСВ, буде забезпечувати три сайти дії проти ГАМУ, і три сайти дії проти ЕСВ. Такий доданий білок (четвертий білок для направленої дії проти ГАМУ) можна вибрати з групи, що складається з СтуіїРа, МірзАБ і СгуїЕ. Це буде приводити до забезпечення стека з чотирьох білків, що має три сайти дії проти двох комах (ЕСВ і ЕАУМ).

Короткий опис таблиць

Таблиця 1: приводяться приклади амінокислот з чотирьох класів амінокислот.

Короткий опис фігур

Фіг. 1: представлений графік, що показує зв'язування в процентах міченого СтутАб з ЕСВ

ВВМУ в порівнянні з Сту1Ве.

Фіг. 2: представлений графік, що показує зв'язування в процентах міченого СтгутАБб з ЕАМ/

ВВММУ в порівнянні з Сгу1 Ве.

Фіг. 3: представлений графік, що показує зв'язування в процентах міченого Сту!Ве з ЕАМ/

ВВММУ в порівнянні з Сту1т АБ.

Докладний опис винаходу

Даний винахід частково стосується дивного відкриття того, що СтутАб ії Сту!Ве не конкурують один з одним за сайти зв'язування в кишечнику кукурудзяного стеблового метелика (ЕСВ; Озігіпіа пибріїаійє (Нирпег)) або кукурудзяної листової совки (ГАМУ; Зродорієега їгидірегаа).

Таким чином, білок СтуїАбБ можна використати в комбінації з білком Стгу!Ве в трансгенній кукурудзі (і інших рослинах, наприклад, бавовнику і соєвих бобах) для затримки і попередження розвитку резистентності у ЕСВ до будь-якого одного з даних білків. Пара білків за даним бо винаходом може бути ефективною в захисті рослин (таких як рослини кукурудзи) від пошкодження ЕСВ з резистентністю до Стгу. Тобто, одним застосуванням даного винаходу є захист кукурудзи і інших економічно важливих видів сільськогосподарських культур від пошкодження і втрат урожаю, викликаного популяціями ЕСВ, в яких може розвинутися резистентність до СгутАб або Сту1Ве.

Таким чином, даний винахід стосується стека для керування резистентністю у комах (ІКМ), що включає СгутАБ і Сту1!Ве, для попередження або пригнічення розвитку резистентності ЕСВ до одного або обох даних білків.

Крім того, незважаючи на те, що даний винахід, розкритий в даному документі, стосується стека ІЕМ, що містить СтуТтАБ і Сту1їВе, для попередження резистентності ЕСВ до одного або обох даних білків, в об'ємі винаходу, розкритого в даному документі, знаходиться те, що один або обидва СгутАБ і Сту1Ве можна адаптувати, самостійно або в комбінації, для попередження резистентності РАМУ до одного або обох даних білків.

Даний винахід стосується композицій для боротьби з лускокрилими шкідниками, що містять клітини, які продукують істинний токсинвмісний білок СтутАб і істинний токсинвмісний білок

СтуіВе.

Винахід додатково включає хазяїна, трансформованого для продукції як інсектицидного білка СтутАБ, так і інсектицидного білка Сгу!Ве, де вказаний хазяїн є мікроорганізмом або рослинною клітиною. Полінуклеотид(и) за даним винаходом переважно знаходиться в генетичній конструкції під контролем не-Васійи5 (Пигіпдіепзі5 промотору(ів). Полінуклеотиди за даним винаходом можуть містити кодон, переважний для застосування в рослинах для підвищеної експресії.

Додатково передбачається, що винахід стосується способу боротьби з лускокрилими шкідниками, що включає контактування вказаних шкідників або навколишнього середовища вказаних шкідників з ефективною кількістю композиції, яка містить інсектицидний білок СтутАб і додатково містить інсектицидний білок Сту1Ве.

Варіант здійснення винаходу стосується рослини кукурудзи, що містить експресований в рослині ген, що кодує істинний токсинвмісний білок Сту1Ве, і експресований в рослині ген, що кодує істинний токсинвмісний білок Стгу1Т АБ, і насіння такої рослини.

Додатковий варіант здійснення винаходу стосується рослини кукурудзи, де експресований в

Зо рослині ген, що кодує істинний токсинвмісний білок СтуїВе, і експресований в рослині ген, що кодує істинний токсинвмісний білок СтутАб, інтрогресовані у вказану рослину кукурудзи, і насіння такої рослини.

Як описано в прикладах, досліди з конкурентним зв'язуванням з рецептором з використанням мічених радіоактивною міткою білків СтутАбБ і Стгу!Ве показують, що білок

Стуї!Ве не конкурує за зв'язування в тканинах ЕСВ або РАМУ, з якими зв'язується СтгуТАБ. Дані результати також вказують на те, що комбінація білків СтутАБ і Сту!Ве може бути ефективним засобом для пригнічення розвитку резистентності в популяціях ЕСВ і РАУМ до одного з двох даних білків. Таким чином, основуючись частково на даних, описаних в цьому документі, вважається, що спільна продукція (стекінг) білків СгутАб і Стуї!Ве може використовуватися для високоефективного стека ІКМ для ЕСВ.

До цієї пари можна додати інші білки. Наприклад, даний винахід також частково стосується потрійних стеків або «пірамід» з трьох (або більше) токсинів, в яких СтутАБ і Сту1Ве є основною парою. У деяких переважних варіантах здійснення пірамід вибрані токсини мають три окремих сайти дії проти ГАМУ. Деякі переважні пірамідні комбінації з «трьома сайтами дії» включають основну пару за даним винаходом плюс Сгу1Ра, МірзАБ, Сту1С, Сту10 або СтгутЕ як третій білок для цілеспрямованої дії на РАМУ. Дані конкретні потрійні стеки за даним винаходом будуть переважно і разюче забезпечувати три місця сайти проти БАМУ. Це допоможе знизити або елімінувати потребу в територіях-сховищах. Під виразом «окремі сайти дії» розуміється, що будь-який з даних білків не викликає перехресної резистентності в іншому.

До даного винаходу також можна додати додаткові токсини/гени. Наприклад, якщо СтуїЕа входить до складу стека з парою білків за даним винаходом (обидва Сгу1АбБ і Сгу1!Ве активні проти обох ЕАМУ і кукурудзяного стеблового метелика (ЕСВ)), то додавання одного додаткового білка до даного потрійного стека, де четвертий доданий білок направлений проти ЕСВ, буде забезпечуватися три сайти дії проти ГАМУ і три сайти дії проти ЕСВ. Даний доданий білок (четвертий білок) можна вибрати з групи, що складається з Стуг2А, Сгуті ії 0І6-3 (дивись заявку на патент США Мо 61/284278 (подану 16 грудня 2009) і заявку на патент США Мо 2010/00269223). Це буде приводити до отримання стека з чотирьох білків, що містить три сайти дії проти комах (ЕСВ і ЕАУМ).

Таким чином, однією можливістю впровадження є застосування пари білків за даним бо винаходом в комбінації з третім токсином/геном і застосування даного потрійного стека для пригнічення розвитку резистентності у ЕСВ і/або ЕАУМ до будь-якого з даних токсинів. Отже, даний винахід також частково стосується потрійних стеків або «пірамід» з трьох (або більше) токсинів. У деяких переважних варіантах здійснення пірамід вибрані токсини мають три окремі сайти дії проти ЕСВ і/або ГАМУ.

Серед можливостей впровадження за даним винаходом буде застосування двох, трьох або більше білків з білків за даним винаходом в районах з обробкою сільськогосподарських культур, де можуть розвинутися резистентні популяції ЕСВ і/або ЕАМУ.

Керівництво по застосуванню СтуїРа і Сгту!Ве (для боротьби з ЕСВ і/або ЕАУМ) дивись в заявці на патент США Мо 61/284290 (поданої 16 грудня 2009). З Сту1!Ра, активним проти ЕСВ (їі

ЕАМУ), СтулАбБ плюс СтуїВе, плюс СтуїВе за даним винаходом переважно і дивно забезпечуються три сайти дії проти ЕСВ. Це може допомогти знизити або елімінувати потребу в територіях-сховищах.

Білок СгуїРа входить до складу продуктів Негсшех?, Зтагвїах "М і Умдезігіке "М. Пару генів за даним винаходом (СтутАБ і Сту1Ве) можна об'єднати, наприклад, в продукті на основі Сту! Ра, такому як НегсшехФ, Зтапеїах"М і Умідезніке "М. Отже, пара білків за даним винаходом може бути ефективною в зниженні тиску відбору на дані і інші білки. Таким чином, пару білків за даним винаходом можна використати в комбінаціях з трьох генів для кукурудзи і інших рослин (наприклад, бавовнику і соєвих бобів).

Як вже обговорювалося вище, до даного винаходу також можна додати додаткові токсини/гени. Для цілеспрямованого впливу на ЕСВ можна використати Сгуг2А, Стуті і/або рІС- 3. Дивись, наприклад, заявку на патент США Мо 61/284278 (подану 16 грудня 2009) і заявку на патент США Мо 2010/00269223. Інформацію по комбінації СтуїЕ ї СтутлАЬ (для боротьби з ЕСВ) дивись в публікації заявки на патент США Мо 2008/0311096.

Рослини (і території, засаджені такими рослинами), які продукують будь-яку з комбінацій білків за даним винаходом, включаються в об'єм даного винаходу. Також можна додати додаткові токсини/гени, але конкретні стеки, обговорені вище, переважно і разюче забезпечують численні сайти дії проти ЕСВ і/або ГАМУ. Це може допомогти знизити або елімінувати потребу в територіях-сховищах. Таким чином, поле площею більше 10 акрів, засаджене такими рослинами, включається в об'єм винаходу.

СЕМВАМК також можна використати для отримання послідовностей будь-якого з генів і білків, які обговорюються в даному документі. Дивись Додаток А нижче. Також можна використати патенти. Наприклад, в патенті США Мо 5188960 і патенті США Мо 5827514 описані істинний токсинвмісні білки СтуїРЕ, відповідні для застосування в здійсненні винаходу. У патенті

США Мо 6218188 описані ДНК-послідовності, оптимізовані для застосування в рослинах, кодуючі істинні токсинвмісні білки Сгу! Ра, які підходять для використання в даному винаході.

Комбінації білків, описані в даному документі, можна використати для боротьби з лускокрилими шкідниками. Дорослі лускокрилі комахи і метелики харчуються, головним чином, нектаром квітів і Є основними ефекторами запилення. Майже всі личинки лускокрилих комах, тобто гусениці, харчуються на рослинах, і багато хто з них є серйозними шкідниками. Гусениці харчуються на поверхні і всередині листя, або на корінні або стеблині рослин, тим самим лишаючи рослину поживних речовин і часто руйнуючи фізичну підтримуючу структуру рослини.

Крім того, гусениці харчуються на фруктах, бавовні і зернах, що зберігаються, а також квітах, руйнуючи ці продукти, призначені для продажу, або серйозно знижують їх якість. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «лускокрилі шкідники», він стосується різних стадій розвитку шкідника, включаючи личинкові стадії.

Деякі химерні токсини за даним винаходом включають повний М-кінцевий фрагмент, відповідний істинному токсину Ві-токсину, в тій же точці після кінця фрагмента істинного токсину білок має перехід в гетерологічну послідовність протоксину. М-кінцевий, активний як інсектицид фрагмент токсину в Ві-токсині, далі стосується «істинного токсину». Перехід сегмента істинного токсину в сегмент гетерологічного протоксину знаходиться приблизно в з'єднанні токсину/протоксину, або альтернативно фрагмент нативного протоксину (що тягнеться за фрагментом істинного токсину) може зберегтися, з переходом в гетерологічний протоксин, що розташовується даунстрим.

Як приклад один химерний токсин за даним винаходом має повний фрагмент істинного токсину білка СтутАр (амінокислоти 1-601) і/або гетерологічний протоксин (приблизно амінокислоти 602 до С-кінця). В одному переважному варіанті здійснення фрагмент химерного токсину, що містить протоксин, отримують з білка-токсину СтутАб. У переважному варіанті здійснення фрагмент химерного токсину, що містить протоксин, отримують з білка-токсину

СтутАБ. 60 Фахівцям в даній галузі, очевидно зрозуміло, що Ві-токсини, навіть всередині певного класу,

такого як Сту1Ве, до деякої міри будуть варіювати в довжині і точному положенні переходу від фрагмента істинного токсину до фрагмента протоксину. Як правило, токсини СтуїВе мають довжину приблизно від 1150 до приблизно 1200 амінокислот. Звичайно перехід від фрагмента істинного токсину до фрагмента протоксину складає приблизно від 5095 до приблизно 6095 від повної довжини токсину. Химерний токсин за даним винаходом буде включати повну експансію даного М-кінцевого фрагмента істинного токсину. Таким чином, химерний токсин буде включати щонайменше приблизно 5095 від повної довжини Сту!Ве. Це буде становити щонайменше приблизно 590 амінокислот. Відносно фрагмента протоксину, то повна експансія фрагмента протоксину СтуТтАбБ буде тягнутися від кінця фрагмента істинного токсину до С-кінця молекули.

Гени і токсини. Гени і токсини, придатні для застосування за даним винаходом, включають не тільки розкриті повнорозмірні послідовності, але також фрагменти даних послідовностей, варіанти, мутанти і злиті білки, які зберігають специфічну пестицидну активність токсинів, конкретно приведених як приклад. У тому значенні, в якому в даному документі використовуються терміни «варіанти» або «варіації» генів, вони стосуються нуклеотидних послідовностей, які кодують одні і ті ж токсини, або які кодують еквівалентні токсини, що мають пестицидну активність. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «еквівалентні токсини», він стосується токсинів, що мають таку ж або по суті таку ж біологічну активність проти шкідників-мішеней, як і токсини за даним винаходом.

У тому значенні, в якому в даному документі використовується цей термін, кордони представляють приблизно 9595 (СгутАбБ'є і Сту!Ве'5), 7895 (СтутАБ'є і Сту1!Ве'5) і 4595 (Сгу1'5) ідентичність послідовностей згідно з «Кемібвіоп ої Ше Мотепсіакшге ог їе Васійи5 «пПигіпдіепвів

Резіісідза! Стгуєїа! Ргоїеіп5», М. СтісКтоге, О.К. 2еїдіег, У. РейеІбоп, Е. Зспперії, У. Мап Кіє, 0.

І етесіив, У. Вайт апа р.н. Оєап. Містобіоїоду апа Моїесшіаг Віоіоду Немієму5 (1998), Мої. 62:807- 813. Ці пороги відсікання молекулярної маси також можуть бути застосовні тільки до істинних токсинів.

Фахівцям в даній галузі, очевидно зрозуміло, що гени, що кодують активні токсини, можна ідентифікувати і отримати декількома способами. Конкретні гени або фрагменти генів, приведені як приклад, можна отримати з ізолятів, депонованих в колекції культур, як описано вище. Дані гени або їх фрагменти, або варіанти, також можна сконструювати синтетичним

Зо шляхом, наприклад, при використанні синтезатора генів. Варіації генів можна легко сконструювати з використанням звичайних способів отримання точкових мутацій. Також фрагменти даних генів можна отримати з використанням промислово доступних екзонуклеаз або ендонуклеаз, слідуючи стандартним процедурам. Наприклад, можна використати ферменти, такі як ВаЇ3!1, або сайт-направлений мутагенез для методичного відсікання нуклеотидів від кінців таких генів. Також гени, які кодують активні фрагменти, можна отримати з використанням різних рестриктаз. Протеази можна використати для безпосереднього отримання активних фрагментів даних токсинів.

Фрагменти і еквівалентні варіанти, які зберігають пестицидну активність приведених як приклад токсинів, будуть знаходитися в об'ємі даного винаходу. Також за рахунок виродженості генетичного коду широкий ряд різних ДНК-послідовностей може кодувати амінокислотні послідовності, розкриті в даному документі. Фахівцям в даній галузі добре відоме отримання таких альтернативних ДНК-послідовностей, що кодують одні і тих же або по суті одні і ті ж токсини. Такі варіантні ДНК-послідовності знаходяться в об'ємі даного винаходу. У тому значенні в якому в даному документі використовується термін «по суті одні і ті ж» послідовності, він стосується послідовностей, які мають амінокислотні заміни, делеції, додавання або інсерції, які не впливають істотно негативного чином на пестицидну активність.

Фрагменти генів, що кодують білки, які зберігають пестицидну активність, також входять в об'єм даного визначення.

Додатковим способом ідентифікації генів, що кодують токсини, і фрагментів генів, придатних для даного винаходу, є застосування олігонуклеотидних зондів. Такі зонди представляють детектовані нуклеотидні послідовності. Ці послідовності можна детектувати з використанням відповідної мітки або їх можна зробити спочатку флуоресцентними, як описано в міжнародній заявці МО 93/16094. Як добре відомо в даній галузі, якщо молекула зонда і зразок нуклеїнової кислоти гібридизуються з утворенням сильного зв'язку між двома молекулами, то розумно передбачити, що зонд і зразок мають значну гомологію. Переважно гібридизацію проводять в жорстких умовах з використанням методів, відомих в даній галузі, описаних, наприклад, КеПег

С.Н., М.М. Мапак (1987) ОМА Ргобев5, БіосКіоп Ргезв5, Мем Моїк, М.М., рр. 169-170. Деякі приклади концентрацій солей і комбінацій температури є наступними (в порядку збільшення жорсткості); 2Х 55РЕ або 552 при кімнатній температурі; 1Х 55РЕ або 55(С при 42"С; 01Х 60 ЗОРЕ або 55С при 42"С; 01Х 55РЕ або 55С при 65"С. Детектування зонда забезпечує спосіб визначення відомим шляхом того, чи мала місце гібридизація. Такий аналіз зонда забезпечує швидкий спосіб ідентифікації генів, що кодують токсини за даним винаходом. Нуклеотидні сегменти, які використовуються як зонди за винаходом, можна синтезувати з використанням

ДНК-синтезатора і стандартних методів. Такі нуклеотидні послідовності також можна використати як ПЛР-праймери для ампліфікації генів за даним винаходом.

Варіантні токсини. Деякі токсини за даним винаходом конкретно приводяться як приклад в даному документі. Оскільки дані токсини є тільки прикладами токсинів за даним винаходом, то, очевидно, зрозуміло, що даний винахід включає варіантні або еквівалентні токсини (ії нуклеотидні послідовності, що кодують еквівалентні токсини), що мають таку ж або аналогічну пестицидну активність зразкового токсину. Еквівалентні токсини повинні мати амінокислотну гомологію із зразковим токсином. Як правило, така амінокислотна гомологія буде складати більше 7595, переважно більше 9095 і найбільш переважно більше 9595. Амінокислотна гомологія буде найвищою в найважливіших областях токсину, які відповідають за біологічну активність або беруть участь у визначенні тривимірної конфігурації, яка в кінцевому результаті відповідальна за біологічну активність. У цьому відношенні прийнятні деякі амінокислотні заміни, і можна чекати, що такі заміни знаходяться в областях, які не є важливими для вияву активності, або являють собою консервативні амінокислотні заміни, які не впливають негативним чином на тривимірну конфігурацію молекули. Наприклад, амінокислоти можна розділити на наступні класи: неполярні, незаряджені полярні, основні і кислі. Консервативні заміни, за допомогою яких амінокислота одного класу замінюється іншою амінокислотою того ж типу, знаходяться в об'ємі даного винаходу, за умови, що заміна істотно не змінює біологічну активність сполуки. Нижче наводиться перелік прикладів амінокислот, що належать до кожного класу.

Таблиця 1

Приклади амінокислот в чотирьох класах амінокислот

У деяких випадках також можна провести неконсервативні заміни. Критичним чинником є те, що такі заміни не повинні істотно знижувати біологічну активність токсину.

Рекомбінантні хазяїни. Гени, що кодують токсини за даним винаходом, можна ввести в широкий ряд мікробних або рослинних хазяїв. Експресія гена токсину, прямо або

Зо опосередковано, приводить до внутрішньоклітинної продукції і збереження пестициду.

Кон'югаційне перенесення і рекомбінантне перенесення можна використати для отримання Ві- штаму, який експресує обидва токсини за даним винаходом. Також можна трансформувати інші мікроорганізми-хазяї одним або обома генами токсинів для отримання синергічного ефекту.

Відносно відповідних мікроорганізмів-хазяїв, наприклад, Рзепдотопах, то мікроби можна застосувати в положення шкідника, де вони будуть проліферувати і поглинатися. Результатом є боротьба з шкідником. Альтернативно мікроорганізм, що містить ген токсину, можна обробити в умовах, які пролонгують активність токсину і стабілізують клітину. Потім на оброблену клітину, яка зберігає токсичну активність, можна впливати середовищем шкідника-мішені.

У тому випадку, коли ген Ві-токсину вводять в мікроорганізм-хазяїн за допомогою відповідного вектора, і на вказаний хазяїн впливають середовищем в живому стані, то важливо, щоб використовувалися певні мікроорганізми-хазяїни. Вибирають мікроорганізми-хазяїни, про яких відомо, що вони проживають в «фітосфері» (філоплані, філосфері, ризосфері і/або ризоплані) однієї або більше цікавлячих культур. Дані мікроорганізми вибирають таким чином, щоб вони були здатні успішно конкурувати в певному навколишньому середовищі (культура і інші комахи-жителі) з мікроорганізмами дикого типу для забезпечення стабільної підтримки і експресії гена, що експресує поліпептид-пестицид, і бажано, забезпечення підвищеного захисту пестициду від деградації і інактивації в навколишньому середовищі.

Відома велика кількість мікроорганізмів, які проживають в філоплані (на поверхні листя рослин) і/або ризосфері (в грунті, що оточує коріння рослин) широкого ряду важливих сільськогосподарських культур. Такі мікроорганізми включають бактерії, водорості і гриби.

Особливий інтерес представляють мікроорганізми, такі як бактерії, наприклад, родів

Резепдотопах, ЄЕпміпіа, Зеїтайа, Кіервієїа, Хапіпотопаз, Бігеріотусе5, ВПі2обійт,

Аподорзейдотопав, Меїпуїорпйіив, Адгорасіепит, Асеїюбасіє!, Іасіобасіш5, АппНгобасієг,

А?;обрасівєг, І еисоповісос і АІасаіідепев; гриби, зокрема, дріжджі, наприклад, родів Засспаготусев,

Сгуріососси5, Кісумеготусев, ЗрогороІотусев, Кподоїйогиіа і Ацгеобавідішт. Особливий інтерес представляють такі види бактерій, які проживають в фітосфері, як Рзейдотопавх 5угіпдає,

Рзепдотопах Пиогезсепв5, Зеїтайа тагсезсеп5, Асеїобрасієг хуїпит, Адгобасівепійт Кштеїасіепв,

Кподорзендотопазх 5рпегоїад5, Хапіпотопах сатревзігів, Кпі2обішт пеїїоїї, АІсаїдепе5 епігорпизє і

А?7о0іобрасіег міпіапайї, і види дріжджів фітосфери, такі як Кподоїогиїа гибга, В. адішіпів, А. тагіпа,

ЕК. аигапідаса, Сгуріососсиз аїрідив, С. аіїтиепв5, С. Іаигепії, засспаготусез гозеї, 5. ргефогіепвів,

З. сегемізіає, ЗрогороІоптусез гозеи5, 5. одоги5, Кінумеготусез мегопає і Ачйгеобавзідіит роїїміапв.

Особливий інтерес представляють пігментовані мікроорганізми.

Є велика кількість способів інтродукції Ві-сена, що кодує токсин, в мікроорганізм-хазяїн в умовах, які забезпечують стабільне збереження і експресію гена. Ці способи добре відомі фахівцям в даній галузі і описані, наприклад, в патенті США Мо 5135867, який включений в даний документ для зведення.

Обробка клітин. Васійи5 (пигіпдіепзіз або рекомбінантні клітини, експресуючі Ві-токсини, можна обробити для пролонгування активності токсинів і стабілізації клітини. Пестицидна мікрокапсула, яка утвориться, містить Ві-токсин або Ві-токсини в клітинній структурі, яка стабілізована і буде захищати токсин, коли мікрокапсула піддається впливу навколишнього середовища шкідника-мішені. Відповідні клітини-хазяї можуть включати прокаріоти або еукаріоти, і звичайно обмежуються клітинами, які не продукують речовин, токсичних для вищих організмів, таких як ссавці. Однак можна використати мікроорганізми, які продукують речовини, токсичні для вищих організмів, в тому випадку, коли токсичні речовини є нестабільними, або їх вміст є досить низьким для того, щоб уникнути вияву будь-якої можливої токсичності для ссавця-хазяїна. Як хазяї особливий інтерес представляють прокаріоти і нижчі еукаріоти, такі як гриби.

При обробці звичайно клітини повинні бути інтактними і в основному знаходитися в проліферативній формі, краще не в формі спор, хоча, в деяких випадках можна використати спори.

Зо Обробку клітини мікроорганізму, наприклад, мікроорганізму, що містить ген або гени Ві- токсину, можна провести хімічним або фізичним методами, або комбінацією хімічного і/або фізичного методів, за умови, що метод не впливає негативним чином на властивості токсину і не знижує здатності клітин захищати токсин. Прикладами хімічних реагентів є галогеновані сполуки, зокрема, галогенвмісні сполуки з 17-80 атомами. Конкретніше, можна використати йод в м'яких умовах і протягом достатнього періоду часу для досягнення бажаних результатів. Інші відповідні способи включають обробку альдегідами, такими як глутаральдегід; протиінфекційними препаратами, такими як зефіран хлорид і цетилпіридиній хлорид; спиртами, такими як ізопропіловий і етиловий спирт; різними гістологічними фіксаторами, такими як йодний розчин Люголя, фіксатор Буена, різні кислоти і фіксатор Хеллі (дивись Нитавзоп,

Сгеїспеп Ї., Апіта! Тіззце Тесппідие5, УМ.Н. Егеетап апа Сотрапу, 1967) або обробку комбінацією фізичного (нагрівання) і хімічного агентів, які зберігають і пролонгують активність токсину, продукованого в клітині, коли клітину вводять в середовище хазяїна. Прикладами фізичних методів є короткохвильове опромінення, таке як гамма-опромінення, і рентгенівське опромінення, УФ-опромінення, ліофілізація і тому подібне. Способи обробки клітин мікроорганізмів розкриті в патентах США Мо 4695455 і 4695462, які включені в даний документ для зведення.

Як правило, клітини мають підвищену стабільність структури, яка підвищує стійкість до впливу умов навколишнього середовища. У тих випадках, коли пестицид знаходиться в проформі, то метод обробки клітин потрібно вибрати таким чином, щоб не інгібувати процесинг проформи в зрілу форму пестициду під дією патогену шкідника-мішені. Наприклад, формальдегід буде поперечно зшивати білки і може інгібувати процесинг проформи поліпептиду- пестициду. Спосіб обробки повинен зберігати, щонайменше, значну частину біологічної доступності або біологічної активності токсину.

Характеристики, що представляють особливий інтерес при виборі клітини-хазяїна для цілей продукції, включають простоту введення Ві-гена або Ві-генів хазяїну, доступність експресійних систем, ефективність експресії, стабільність пестициду в хазяїні і наявність додаткових генетичних властивостей. Характеристики, що представляють особливий інтерес для застосування як мікрокапсули пестициду, включають захисні властивості для пестициду, такі як товщина клітинних стінок, пігментація і внутрішньоклітинна упаковка або утворення тілець 60 включення; виживаність у водному середовищі; відсутність токсичності для ссавців;

привабливість для захоплення шкідниками; простота в індукції загибелі і фіксації без пошкодження токсину і тому подібне. Інші чинники включають простоту формуляції і поводження, економічні міркування, стабільність при зберіганні і тому подібне.

Ріст клітин. Клітина-хазяїн, що містить інсектицидний Ві-ген або Ві-гени, можна культивувати в будь-якому звичайному поживному середовищі, в якому ДНК-конструкція забезпечує виборчу перевагу, забезпечуючи селективне середовище, в якому по суті всі або всі клітини зберігають

Ві-ген. Потім можна зібрати такі клітини з використанням звичайних методів. Альтернативно клітини можна обробити до збирання.

Ві-клітини, продукуючі токсини за винаходом, можна культивувати з використанням звичайних в даній галузі середовищ і методів ферментації. Після здійснення циклу ферментації бактерії можна зібрати першим відділенням спор і кристалів Ві з культурального бульйону способами, відомими в даній галузі. Виділені спори і кристали Ві можна формулювати у вигляді змочуваного порошку, рідкого концентрату, гранул і інших препаративних форм з додаванням поверхнево-активних речовин, диспергаторів, інертних носіїв і інших компонентів для полегшення поводження з ними і їх застосування проти конкретних шкідників-мішеней. Такі препаративні форми і способи застосування відомі в даній галузі.

Препаративні форми. Формульовані гранули-приманки, що містять атрактант і спори, кристали і токсини Ві-ізолятів, або рекомбінантні мікроорганізми, що містять гени, отримані з Ві- ізолятів, розкритих в даному документі, можна вносити в грунт. Формульований продукт також можна застосовувати у вигляді покриття насінин або агента для обробки коріння, загальної обробки рослин на більш пізніх стадіях вегетаційного періоду. Для обробки рослин і грунту ВІ- клітинами можна використати змочувані порошки, гранули або дусти, які отримують змішуванням з різними інертними речовинами, такими як неорганічні мінеральні речовини (філосилікати, карбонати, сульфати, фосфати і тому подібне) або матеріали рослинного походження (такі як подрібнена серцевина кукурудзяного качана, рисове лушпиння, шкаралупа горіхів і тому подібне). Препаративні форми можуть включати ад'юванти прилипали, стабілізуючі агенти, інші пестицидні добавки або поверхнево-активні речовини. Рідкі препаративні форми можуть бути на водній або неводній основі, і їх можна застосовувати у вигляді пін, гелів, суспензій, емульгованих концентратів або тому подібного. Інгредієнти можуть

Зо включати реологічну добавку, поверхнево-активні речовини, диспергатори або полімери.

Фахівцям в даній галузі, очевидно зрозуміло, що концентрація пестициду буде варіювати в широких межах в залежності від природи конкретної формуляції, зокрема, чи є вона концентратом або призначена для безпосереднього застосування. Пестицид буде знаходитися в концентрації, що становить, щонайменше, 195 мас., або концентрація може дорівнювати 10095 мас. Сухі препаративні форми будуть містити приблизно 1-9595 мас. пестициду, в той час як рідкі препаративні форми звичайно будуть містити приблизно 1-6095 мас. твердих частинок в рідкій фазі У препаративних формах звичайно буде знаходитися приблизно від 102 до приблизно 107 клітин/мг. Такі препаративні форми будуть застосовуватися в кількостях приблизно від 50 мг (рідина або суха речовина) до 1 кг або більше на га.

Препаративні форми можна застосовувати в середовищі мешкання лускокрилого шкідника, наприклад, на листя або в грунт, обприскуванням, запиленням, поливом або тому подібне.

Трансформація рослин. Переважний рекомбінантний хазяїн для продукції інсектицидних білків за даним винаходом являє собою трансформовану рослину. Гени, що кодують Ві-білки токсини, розкриті в даному документі, можна вставити в рослинні клітини з використанням різних способів, добре відомих в даній галузі. Наприклад, є велика кількість клонуючих векторів, що містять реплікаційну систему ЕбсПпегіспіа соїї, і маркер, який дозволяє відібрати трансформовані клітини для проведення інсерції чужорідних генів у вищі рослини. Вектори включають, серед іншого, наприклад, рРВК322, серії рОсС, серії МіЗтр, рАСУС184. Отже, фрагмент ДНК, що містить послідовність, що кодує Ві-білок токсин, можна вставити у вектор у відповідному сайті рестрикції. Отриману плазміду використовують для трансформації Е. соїї.

Клітини Е. соїї культивують у відповідному поживному середовищі, потім збирають і лізують.

Плазміду виділяють. Як правило, проводять аналіз послідовності, рестрикційний аналіз, електрофорез і використовують інші біохімічні-молекулярні біологічні методи як методи аналізу.

Після кожної маніпуляції ДНК-послідовність, що використовується, можна розщепнути і приєднати до наступної ДНК-послідовності. Кожну послідовність плазміди можна клонувати в одну і ту ж або різні плазміди. Залежно від способу вставки бажаних генів в рослину, можуть бути необхідні інші ДНК-послідовності. Наприклад, якщо для трансформації рослинної клітини використовують Ті- або Кі-плазміду, то щонайменше правий кордон, але часто правий і лівий кордон Т-ДНК Ті- або Кі-плазміди, потрібно з'єднати у вигляді фланкуючої області генів, бо призначених для вставки. Застосування Т-ДНК для трансформації рослинних клітин інтенсивно досліджувалося і в достатній мірі описано в Європейському патенті 120516, ее апа СеМміп (2008), НоеКкета (1985), Егаїеу еї а. (1986) і Ап еї а). (1985), і добре відомо в даній галузі.

Після інтеграції вставленої ДНК в геном рослини вона є відносно стабільної. Звичайно вектор для трансформації містить селектований маркер, який додає трансформованим рослинним клітинам резистентність, серед іншого, до біоциду або антибіотику, такому як біалафос, канаміцин, (5418, блеоміцин або гігроміцин. Маркер, що використовується індивідуально, отже, дозволить відібрати трансформовані клітини краще, ніж клітини, які не містять вставлену ДНК.

Є велика кількість методів для інсерції ДНК в рослинну клітину-хазяїна. Такі методи включають трансформацію Т-ДНК з використанням Адгобасіегішт їштегасієп5 або Адгобасіегійт гпідодепе5 як трансформуючий агент, злиття, ін'єкцію, біологічну балістику (бомбардування мікрочастинками) або електропорацію, а також інші можливі методи. Якщо для трансформації використовують Адгобасіегіа, то ДНК, призначену для вставки, клонують в спеціальні плазміди, а саме в проміжний вектор або бінарний вектор. Проміжні вектори можна інтегрувати в Ті- або

Ві-плазміду гомологічною рекомбінацією завдяки послідовностям, які є гомологічними до послідовностей Т-ДНК. Ті- або Кі-плазміда також містить мігобласть, необхідну для перенесення Т-ДНК. Проміжні вектори не можуть реплікуватися самостійно в Адгобасіегіа.

Проміжний вектор можна перенести в Адгорасіегішт ішптеїасіепе за допомогою плазміди- хелпера (кон'югацією). Бінарні вектори можуть реплікуватися в Е. соїї і Адгобасіегіа. Вони включають селективний ген-маркер і лінкер або полілінкер, який вставлений в рамку правої і лівої приграничних областей Т-ДНК. їх можна безпосередньо трансформувати в Адгобасіегіа (Ноїбзіег5 еї аїЇ., 1978). При використанні як клітини-хазяїна АдгоБбасіегшт повинні містити плазміду, що несе міг-область. Мі--область необхідна для перенесення Т-ДНК в рослинну клітину. Можуть міститися додаткові Т-ДНК. Трансформовану таким чином бактерію використовують для трансформації рослинних клітин. Експланти рослин переважно можна культивувати з Адгобасіегіит їштетгасієп5 або Адгобасієегійт гпігодепе5 для перенесення ДНК в рослинну клітину. Потім можна регенерувати цілі рослини з інфікованого рослинного матеріалу (наприклад, шматочків листа, сегментів стеблини, коріння, а також протопластів або культивованих в суспензії клітин) у відповідному середовищі, яке може містити антибіотики або

Зо біоциди за винаходом. Потім отримані таким чином рослини можна тестувати на присутність вставленої ДНК. Відсутні особливі вимоги у відношенні плазмід у випадку методів ін'єкції і електропорації. Можна використати звичайні плазміди, наприклад, такі як похідні РОС.

Трансформовані клітини розвиваються в рослинах звичайним шляхом. Вони можуть утворити зародкові клітини і передати трансформовану ознаку(и) потомству рослин. Такі рослини можна вирощувати звичайним шляхом і схрещувати з рослинами, які мають ті ж трансформовані спадкові фактори або інші спадкові фактори. Отримані гібриди мають відповідні фенотипічні властивості.

У переважному варіанті здійснення даного винаходу рослини потрібно трансформувати генами, в яких кодон переважно оптимізований для застосування в рослинах. Дивись, наприклад, патент США Мо 5380831, який включений в даний документ для зведення.

Незважаючи на те, що в даному документі як приклад приводяться зрізані токсини, добре відомо в галузі Ві-токсинів, що токсини масою 130 КОа (повна довжина) мають М-кінцевий фрагмент, який є істинним токсином, і С-кінцевий фрагмент є «хвостом» протоксину. Таким чином, відповідні «хвости» можна використати із зрізаними/стинними токсинами за даним винаходом. Дивись, наприклад, патент США Мо 6218188 і патент США Мо 6673990. Крім того, в даній галузі відомі способи отримання синтетичних Ві-генів для застосування в рослинах (Зіємжматй апа Вигдіп, 2007). Одним необмежувальним прикладом переважної трансформованої рослини є фертильна рослина кукурудзи, що містить експресований в рослині ген, що кодує білок СтуТАБ, і додатково містить другий експресований в рослині ген, що кодує білок Сгу1Ве.

Перенесення (або інтрогресію) ознаки(ознак), що визначається СтутАБ і Сту1Ве, в інбредні лінії кукурудзи можна здійснити рекурентною селекцією, наприклад, зворотним схрещуванням.

У цьому випадку необхідну рекурентну батьківську форму спочатку схрещують з інбредним донором (нерекурентною батьківською формою), який несе відповідний ген(и) для ознак, що визначаються СтутїАбБ і Сту!Ве. Потомство даного гібрида потім зворотно схрещують з рекурентною батьківською формою з подальшою селекцією отриманого потомства на необхідну ознаку(ознаки), яка призначена для перенесення від нерекурентної батьківської форми. Після трьох, переважно, чотирьох, більш переважно п'яти і більше поколінь зворотних гібридів з рекурентною батьківською формою з селекцією на необхідну ознаку(и), потомство буде гетерозиготним відносно локусів, контролюючих ознаку(и), яка переноситься, але буде таким же бо як рекурентна батьківська форма відносно більшості або майже всіх інших генів (дивись,

наприклад, Роепітапезіерег (1995) Вгеедіпод Рівїа Стор, 4 Еа., 172-175; Еенпг (1987) Рііпсірієб5 ої Сиімаг Оємеіортепі, Мої. 1: Тнеогу апа Тесппідне, 360-376).

Стратегії керування резистентністю комах (ІЕМ). Наприклад, Коизп еї а). описують стратегії, основані на двох токсинах, так зване «нагромадження» або «стекінг» для контролю інсектицидних трансгенних культур (Те Коуаї Босієїу. РП. Тгап5. К. 5об. ГГ опа. В. (1998) 353, 1777-1786).

На веб-сайті Агентства по захисту навколишнього середовища США (ера.дом/оррборрат1/ріорезіїсідез/рір5/рі согп гетде 2006.піт) приводяться наступні вимоги для забезпечення нетрансгенних (тобто не-В) сховищ (розділ не-ВІ культури/кукурудзи) для застосування з трансгенними культурами, продукуючими один Ві-білок, активний проти шкідників-мішеней. «Специфічними структурованими вимогами для Ві-захищеної (СтутАб ії Сту1Ра) кукурудзи від кукурудзяного стеблового метелика продукти є наступними: структуровані сховища: 2095 сховищ не-лускокрилих з Ві-кукурудзою в Кукурудзяному поясі; 5095 сховищ не-лускокрилих з Ві-кукурудзою в кукурудзяному поясі

Блоки 1. Внутрішній (тобто в Ві-поле) 2. Зовнішній (тобто окремі поля в межах 1/2 милі (1/4 милі, якщо можливо) від Ві-поля для максимального довільного схрещування)

Смуги в поле

Смуги повинні мати ширину щонайменше 4 ряди (переважно 6 рядів) для зниження ефектів, зв'язаних з пересуванням личинок».

Крім того, Національна Асоціація виробників кукурудзи на їх веб-сайті (псда.сот/іпбесі- гебвівбтапсе-тападетепі-Тасі-5пееїі-БІі-согп) також приводить аналогічні вказівки у відношенні вимог для сховищ. Наприклад: «Вимоги відносно ІЕМ кукурудзяного стеблового метелика: засадити, щонайменше, 2095 територій з кукурудзою гібридами сховища; у районах з виробництвом бавовни сховище повинно складати 50905; повинні висаджуватися в межах 1/2 милі від гібридів сховища;

Зо сховище можна засівати у вигляді смуг у Ві-поле; смуги сховища повинні бути шириною щонайменше 4 ряди сховище можна обробити звичайними пестицидами тільки, якщо досягаються економічні пороги для шкідника-мішені; не можна використовувати інсектициди, що обприскуються, на основі Ві на кукурудзі сховища; відповідне сховище повинно бути засаджено у кожному господарстві з Ві-кукурудзою».

Як стверджує Коизп еї аї. (на сторінках 1780 і 1784 правого стовпчика, наприклад), «стекінг» або «накопичення» двох різних білків, де кожний ефективний проти шкідників-мішеней і з низькою або відсутністю перехресної резистентності, дозволяє використовувати менше сховище. Кои5п пропонує, що при наявності успішного стека розмір сховища менше 1095 може забезпечити порівнянне з приблизно 5095 сховищем керування резистентністю для однієї (непірамідної) ознаки. Для наявних у даний час пірамідованих продуктів Ві-кукурудзи Агентство по охороні навколишнього середовища вимагає наявності значно меншого (у загальному 595) структурованого сховища для засівання не-Ві-кукурудзою в порівнянні з продуктами з однією ознакою (у загальному 20965).

Маються різні шляхи забезпечення ефектів ІЕМ сховища, включаючи різні геометричні патерни висадження в полях (згадані вище) і суміші насінин у мішках, як додатково обговорюється Коші еї аї. (вище) і в патенті США Мо 6551962.

Усі наведені вище або аналогічні співвідношення сховищ можна використовувати для даних подвійних або потрійних стеків або пірамід. Для потрійних стеків із трьома сайтами дії проти однієї шкідника-мішені метою буде нульове сховище (або, наприклад, менше ніж 595 сховище).

Це особливо вірно для виробничих земель, наприклад, площею більше 10 акрів.

Усі патенти, заявки на патент, попередні заявки і публікації, що стосуються або цитовані в даному документі, у повному обсязі включені в даний документ для зведення в тій мірі, до якої вони не суперечать положенням даної заявки.

Якщо не зазначено або не мається на увазі інше, то в тому сенсі, в якому в даному документі використовуються терміни в однині, вони означають, «щонайменше один».

Наступні приклади ілюструють способи здійснення винаходу. Приклади не слід розглядати як такі, що обмежують винахід. Усі відсотки виражені в 95 мас., і всі співвідношення сумішей бо розчинників виражені в об'ємних співвідношеннях, якщо не зазначено інакше. Усі значення температури виражені в градусах Цельсію.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1 - Мічення "25І Сту-білків

Йодування Сгу-токсинів. Очищені зрізані Сгу-токсини йодували з використанням йодогранул або йодогену (Ріегсе). Коротко, дві йодогранули двічі промивали 500 мкл забуференого фосфатом фізіологічного розчину РВ5 (20 мМ фосфату натрію, 0,15М масі, рн 7,5) і вміщували в центрифугальну пробірку ємністю 1,5 мл за свинцевим екраном. До цього додавали 100 мкл

РВ5З. У витяжній шафі і з використанням необхідних прийомів роботи з радіоактивними речовинами 0,5 мКюрі Ма"'2»| (17,4 кюрі/мг, серія 0114, Атег5пат) додавали до розчину йодогранул у РВ5. Компоненти піддавали взаємодії протягом 5 хв. при кімнатній температурі, потім до розчину додавали 2-25 мкг високоочищеного зрізаного Сгу-білка і піддавали взаємодії ще протягом 3-5 хв. Реакцію зупиняли видаленням розчину з йодогранулами і реакційну суміш наносили на спін-колонку 7еба ємністю 0,5 мл для знесолення (Іпміїгодеп), урівноважену РВ5.

Йодогранули двічі промивали щоразу по 10 мкл РВ5 і промивний розчин також наносили на колонку для знесолення. Радіоактивний розчин елюювали через колонку для знесолення центрифугуванням при 1000х9д протягом 2 хв. У випадку Сту!Оа для введення радіоактивної мітки використовували метод з йодогеном. При використанні даного методу Стгу-токсин у 100

ММ фосфатному буфері (рН 8) спочатку очищали від полісахаридів (І Р5) пропущенням кілька разів через невелику колонку з поліміксином ємністю 0,5 мл. У пробірку з йодогеном (Ріегсе

Спет., Со) додавали 20 мкг І Ро-невмісного Сту!Оа-токсину, потім 0,5 мКюрі Ма!"25І. Реакційну суміш струшували протягом 15 хв. при 257"С. Розчин видаляли з пробірки і додавали 0,2М нерадіоактивного Ма для гасіння реакції. Білок діалізували проти РВЗ із З змінами буфера для видалення незв'язаного 7251.

Радіоактивну чистоту йодованих Стгу-білків визначали електрофорезом 505-РАСЕ, візуалізували з використанням фосфорного екрана й аналізували на гамма-лічильнику. Коротко, 2 мкл радіоактивного білка розділяли 505-РАСЕ. Після поділу гелі висушували з використанням апарата для висушування гелів ВіоКай, за інструкціями виробника. Висушені гелі візуалізували, загорнувши їх у плівку Муїаг (товщиною 12 мкм) і експонували на багаторазових фосфорних екранах Юупатісх (35х43 см.) протягом 1 год. Пластинки

Зо візуалізували з використанням приладу Моїесшцаг ЮОупатісв 5іОгт 820 рпозрпогоїтадег і візуалізовані зображення аналізували з використанням програмного забезпечення

ІтадеОиапіМ. Радіоактивну смугу разом із зонами безпосередньо вище і нижче смуги вирізували з гелю з використанням леза для бритви і визначали радіоактивність на гамма- лічильнику. Радіоактивність виявляли тільки в смузі Сту-білка й у зонах нижче смуги.

Радіоактивність не детектували вище смуги, указуючи на те, що всі радіоактивні домішки складалися з більш дрібних білкових компонентів у порівнянні з Сту-білюом. Можливо, дані компоненти являли собою продукти деградації.

Приклад 2 - Протокол готування ВВМУ

Одержання і фракціонування солюбілізованих ВВМУ. Личинки останньої стадії розвитку зЗродорієга Ігидірегаа, Озійпіа пибріїіаії5 або НеіІеоїпі5 7еа витримували без корму протягом ночі і потім зранку подрібнювали після охолодження на льоді протягом 15 хв. Витягали тканину середньої кишки з порожнини тіла, залишаючи задню кишку, приєднану до інтегументу.

Середню кишку поміщали в Ух об'єм охолодженого на льоді буфера для гомогенізації (300 мМ маніту, 5 мМ ЕГТА, 17 мМ Тріс основи, рН 7,5) з додаванням суміші інгібіторів протеаз (кінцева концентрація компонентів суміші (у мкМ) складає АЕВЗЕ (500), ЕОТА (250 мМ), бестатин (32), Е- б4 (0,35), лейпептин (0,25) і апротинін (0,075) (Зідта Р-2714), розведеної відповідно до рекомендацій виробника. Тканину гомогенізували 15 ходами скляного гомогенізатора для тканин. ВВММ готували осадженням за допомогою МоСіг по методу МоМегерегдег (1993).

Коротко, рівний об'єм 24 мМ розчину МосСі» у 300 мМ розчині маніту змішували з гомогенатом середньої кишки, перемішували протягом 5 хв. і витримували на льоді протягом 15 хв. Розчин центрифугували при 2500х9 протягом 15 хв. при 4"С. Супернатант залишали й осад суспендували у вихідному об'ємі 0,5х розведеного буфера для гомогенізації і знову центрифугували. Два супернатанти поєднували, центрифугували при 27000х9 протягом 30 хв. при 4"С з одержанням фракції ВВММУ. Осад суспендували в 10 мл буферу для гомогенізації і додавали інгібітори протеаз і знову центрифугували при 27000х9 протягом 30 хв. при 4"С для відмивання ВВММУ. Отриманий осад суспендували в буфері для збереження ВВММ (10 мМ

НЕРЕ5, 130 мМ КС, 1095 гліцерину, рН 7,4) до концентрації приблизно З мг/мл білка.

Концентрацію білка визначали з використанням методу Бредфорда (1976) з бичачим сироватковим альбуміном (ВЗА) як стандарт. Визначення активності лужної фосфатази бо проводили до заморожування проб з використанням методу Зідта, згідно з інструкціями виробника. Специфічна активність даного ферменту-маркера у фракції ВВММУ, як правило, була в 7 разів вище в порівнянні з фракцією гомогенату середньої кишки. ВВММ розливали на аліквотні порції по 250 мкл, швидко заморожували в рідкому Мі» і зберігали при -807С.

Приклад З - Спосіб оцінки зв'язування "2»І-мічених Сгу-білків з білками ВВМУ

Зв'язування /25І-мічених Сгу-білків з біллами ВВМУ. Для визначення оптимальної кількості білка ВВМУ у тестах по оцінці зв'язування будували криву насичення. 12тІ-мічений Сгу-білок (0,5

НМ) інкубували протягом 1 год. при 28"С з різними кількостями білюа ВВММ у межах 0-500 мкг/мл у буфері для зв'язування (8 мМ МаНРоО», 2 мМ КНегРО», 150 мМ Масі, 0,195 бичачого сироваткового альбуміну, рН 7,4). Загальний об'єм складав 0,5 мл. Зв'язаний з 725| Сту-білок відокремлювали від незв'язаного білка добором 150 мкл реакційної суміші в трьох паралелях з центрифугальної пробірки ємністю 1,5 мл у центрифугальну пробірку ємністю 500 мкл і центрифугуванням проб при 14000х9д протягом 6 хв. при кімнатній температурі. Супернатант обережно видаляли й осад обережно промивали три рази буфером для зв'язування, охолодженим на льоді. Дно центрифугальної пробірки, що містить осад, відрізали і поміщали в скляну культуральну пробірку розміром 13х75 мм. Визначали радіоактивність проб протягом 5 хв. на гамма-лічильнику. Зі значення радіоактивності проби віднімали фонову радісактивність (у даному випадку реакцію проводили з будь-яким білком) і будували графік залежності від концентрації білла ВВМУ. Оптимальна кількість білка, що використовували, склала 0,15 мг/мл білка ВВМУ.

Для визначення кінетики зв'язування будували криву насичення. Коротко, ВВММ (150 мкг/мл) інкубували протягом 1 год. при 287 зі зростаючими концентраціями 7"25І-міченого Сгу-токсину в межах від 0,01 до 10 нМ. Загальне зв'язування визначали добором аліквотних порцій 150 мкл кожної концентрації в трьох паралелях, центрифугуванням проби і визначенням радіоактивності, як описано вище. Аналогічним чином визначали неспецифічне зв'язування з додаванням до реакційної суміші 1000 нМ гомологічного трипсинізованого нерадіоактивного

Сту-токсину для насичення всіх неспецифічних сайтів зв'язування рецептора. Специфічне зв'язування розраховували, як різницю між загальним зв'язуванням і неспецифічним зв'язуванням.

Тести гомологічного і гетерологічного конкурентного зв'язування проводили з використанням 150 мкг/мл білка ВВММ і 0,5 нМ 725І-міченого Стгу-білка. Концентрація конкурентного неміченого

Сту-токсину, доданого в реакційну суміш, знаходилася в межах від 0,045 до 1000 нМ і його додавали одночасно з радіоактивним лігандом для гарантії реального конкурентного зв'язування. Інкубацію проводили протягом 1 год. при 28"С і визначали кількість 125|І-міченого

Сту-білка, зв'язаного з рецептором токсину, як описано вище, з вирахуванням неспецифічного зв'язування. При повній відсутності ліганду-конкурента детектували 100905 загальне зв'язування.

За результатами аналізу будували напівлогарифмічний графік залежності загального специфічного зв'язування у відсотках від концентрації доданого конкурентного ліганду.

Приклад 4 - Резюме за результатами

На Фіг. 1 показане специфічне зв'язування у відсотках "22І СтутАБ (0,5 нМ) у ВВМУ з ЕСВ з конкуренцією неміченим гомологічним СтутАб (2) і гетерологічним Стгу1Ве (г). Крива витиснення для гомологічної конкуренції з СтутАб представляє сигмоїдальну за формою криву, що показує 5095 витиснення радіоактивного ліганду приблизно при 0,5 нМ СгутАБ. Сту!Ве також витісняє 125| СтуїВе із сайту зв'язування, але для цього потрібна концентрація приблизно 40 нМ (у 80 разів вище в порівнянні з необхідною концентрацією СтутАб) для витиснення 5095 125І СтутАБ із сайту зв'язування.

На Фіг. 2 показане специфічне зв'язування у відсотках 725І СтгутАбБ (0,5 нМ) у ВВММ з ГАМУ з конкуренцією неміченим гомологічним СтуТАБ (г) і гетерологічним Сгу1Ве (г). Крива витиснення для гомологічної конкуренції з СтутАр представляє сигмоїдальну за формою криву, що показує 5095 витиснення радіоактивного ліганду приблизно при 0,3 нМ СгутАбБ. Сту1!Ве витісняє 72951

СтутАБ із сайту зв'язування на 5095 у концентрації приблизно 300 нМ або приблизно в 1000 разів вище в порівнянні з необхідною концентрацією для СтутАбБ. Помилки у вигляді рисок представляють межі значень, отриманих за даними подвійних рівнобіжних визначень.

На Фіг. З показане специфічне зв'язування у відсотках "2»І Сту1!Ве (0,5 НМ) у ВВММ з ГАМУ з конкуренцією неміченим гомологічним Сту1Ве (2) і гетерологічним СтуТтАбБ (г). Крива витиснення для гомологічної конкуренції з Сту!Ве представляє сигмоїдальну за формою криву, що показує 5095 витиснення радіоактивного ліганду приблизно при 2 нМ Сту1Ве. СтутАБ у концентрації 1000

НМ (у 2000 разів вище в порівнянні з витиснутим 7"2»І Стгу!Ве) приводить приблизно до 5095 витисненню. Мається приблизно в 500 разів нижча афінність СтутАбБ у конкуренції за зв'язування Сту!Ве. Помилки у вигляді рисок представляють межі значень, отриманих за бо даними трьох рівнобіжних визначень.

Джерела літератури

Нескеї, 0.а., санап, І..9., Вахівег, 5.М., 2Нао, 9.27., Зпеюп, А.М., Сіоціа, Е., апа Таразнпік. В.Е. (2007). Тне аїмегвіїу ої ВІ гезібїапсе депез іп зресієз ої І ерідоріега. у Іпмепебг Раїної! 95, 192-197.

Ї о, К., ВапкК5, 0., апа Адапо, М.9. (1999). Тохісіу, Біпаіпуд, апа реппеабіїйу апаїузев ої їишг

БрасшШив ІПигіпдіепвів сту! депа-епдоїюхіпе ивіпуд бгиб5п рогдег тетбгапе мевісіе5 ої зродорієга ехідна апа 5родорівга идірегаа. Аррі. Епмігоп. Містобіо!. 65, 457-464.

Раїтетг, М, ВиснКтетег, М, Маїєма, А, апа Внакаї, 5. Сувівіпе-5ресіїййс гадіоісодіпайоп ої ргоївіп5 м їй Тмогезсеїп таїІєїтіде. Апаїуїїєса! Віоспетівгу 253, 175-179. 1997. Неї Туре: Усигтпаї (Еш) затргоок, у). апа ВиззеїЇ, ОМ. (2001). Моїесшіаг Сіопіпд: А Гарогаюгу Мапиа!. Соїд бргіпд

Натбог І арогаюгу).

Зспіеп7, М. Г., Вабсоск, 9. М., апа 5югег, М. Р. Везропзе ої Стуї Е-тезізіапі апа Бизсеріїбіє

Ейигореап Согп Вогег апа РаїЇ Аппужогт Соіопіез тю СтутА.105 апа Сту12АБ2. рАЇїЇ 0830, 2008.

Іпаіапароїїз, бом/ Адгобсієпсев. ЮОеті Верог!. зпевів, у.у. апа 5іогег, М.Р. Апаїувзів ої Сту1Ас Віпаїпд юю Ргоївїн5 іп Вгизп Вогдег Метбгапе

Мевісієв ої Сот Еаглогт І агуає (НеїІеєоїнів 264). Іпіегасіїоп5 м/ййп СтуїЕ Ргоївіпз5 апа Ії5 Ітріїсайоп

Тог Везівіапсе іп Те Рівіа. САІ-0417, 1-26. 2001. Іпаіапароїї5, ом Адгозсієпсев.

Табравипік, В.Е., Гі, М.В., Ріпвоп. М., Мавзоп, Г., апа НесКеї, О0.2х. (1997). Опе депе іп діатопараск тоїй сопіег5 гезівїапсе іо ї0иг Васійи5 Іпигіпдіепвів їохіпв5. Ргос. Маї). Асад. 5сі. 0. 5.

А 94, 1640-1644.

Табразппік, В.Е., Маїмаг, Т., ім, М.В., Ріпзоп. М., ВопнакКиг, 0., Зпіп, В.5., Рак, 5.Н., Мавзоп.

Г., де Маада, В.А., апа Возсі, 0. (1996). Сто55-гевівїапсе ої Ше адіатопараскК тоїй іпаісасев анетгей іпіегасіоп5 м/п дотаїп І! ої Васіїїи5 Шитгіпдієпвів їохіп5. Аррі. Епмігоп. Містобіоі!. 62, 2839- 2844.

Табразвнпік, В.Е., НВоивп, ВА.Т., Еапе, Б.О., апа 5пейоп, А.М. (2000). Везівіапсе о ВІ юхіпв. Зсівпсе 287, 42.

Муогег5регдег, М.С. (1993). Ргерагайоп апа рапіа! сНагасієгігайноп ої атіпо асіа ігап5ропіпа

Бги5п Богаєтг тетрбгапе мевісіе5 їот Ше Іагма! тіддиї ої Ше дурзу тоїй (І утапіла аізраг). Атсп.

Іпзесі Віоспет. РНувіо! 24, 139-147.

Хи, Х., Ми, Г., апа Ми, М. (2005). Оівгирійоп ої асаднетіп депе аззосіаївд м/йй гевівіапсе їо Сту

Коо) 1 Ас Таеіа)-епдоюхіп ої Васійи5 (пПигіпдіепві5 іп Неїїсомегра аптідега. Аррі Епмігоп Місгобіо! 71, 948-954.

Люодаток А

Перелік дедьта-енлотокоинів З Споюоге оба, вебчсану ідитовано у заяви інвентарний комер явне собою достуУн в МСВІ

Назва о фнвономеро Автора жо 0 Джерело шламу Коментар

СХІАВЕ АААІУЮУ Бсвнпергеє ві ІЗ Віа ю: Ной

СА АДАІХІА БВНВлееЕ 1985 Вів сухій ВААФЮЯТ випив ві ВЕЖ Ві відажа ІВ? стій СААЗІЕВО Мазвой ві ві ЗВУ В епотовічо» сахійні ВААОЯАБИ (Лівуавнувв іа 1994ЯА Вір ц ; сх за ВЕ Кі МАГ

Став ААХЛЕБІВІ Макові ві 994 ІЗ МА

Сяхійв? ААМе бупию ев вче ВЗ

СтуРАВЕ БІО лі пюв тільки ДІ К-поспівсть : пух ще ВІ делі нти

Свій ВААОІІЗ Мепатакчоєм 3995 бі бетаговнв

Є й с тд ях ; яке к до ВЕ кагиак: НІМІ.

СУА ААУ Нав ам Сет іа Ф КогиакЕ НЕК

СУТ АНІ СААЛОКУВ тома еї ві 1995 ВЕкогвіВК: сдуїдаіо ААРБОЇЯ6 Уазеві ЕВЕР У

СстуЗАВІІ ДАМАМ яВопа сві 2002 ОВ Боно й стуїдаі4 ААРНЮЗ Кепа ві ТО о ввребиней сУ1АВІЗ ААТОВОЗУ банквеса! КО ОВ НЯТА Мові

УТА АЛАЛОЖН ЖаБіко сі ві 19855 ОВ бегінег Е715 сІ1АВІ АЛЛА Твена ев Же В іднакі

УА АлЛАВОЖВІ Овівеквеаі 1ЗЯб ВІ знаіаКкі НЕ

САМ ВААЦОЮІ Калев ві ві ІЯВУ Кока ЕН

СезАМ СААОВОЇ Нойет а 985 ВЕБейвеєі715 чий г хузих тай п М китаю МЕД»

СУ1АВБ АЛАЯЮЮ ей сі зі нов? рекея во

СА САТ. ак КВ ЗК Ве віхажа КЗ сід ААУ Обі еві 19857 Віва ІВ7 їхуїара СААЗВНИ Сак Ж в 1993 ВІ вілнмаї НОЗІ І

СТАВ АЗІЯ ТізовлоїЕ а ді Ж ОЗ клена кі ТЯ сухі 419 Му 5 Піррей Зх ВА : ятіху й й

БІНАВИ. На Ма у и Мерреї І 1оА ЇМ У 0вількв ДНК послідовність

СТАВІ АЛИСВЯОВЯ БПУунуетнек вві 1598 ВЕ Кога 593 сах іАВІЗ АКТІ Тавевві ра Ве й Межа» сСМІАМЯ АСВ МНЮ Масфес СВЦеВІ

САНЯ ААФІТБВІ Тнегіцівх Я 0 Майее СВева ВІ

СКАЗ АМСНЯ аг ді ЗО ВАН в

СІЛА ААКІЗЯ Жвае ві ЗО ОВЕАСМИ

СЕТ АБВІТ ААТЯНХ Нозпк сі ві ям ВеувВУ

СТАВІ ААОВНІЗЮ Щюріаи сі мює В:

СХАВЗ ААМЗГНН Хіт ві ві де вх

ТІ АБО АВВОЛЯВО че ві аб 0 ВСОЮВ

ТЛуТАВ АВБІВУ бжівсіока ві ці ЗУ Ве

СРОТАБОО АНУ? о яви еп а Ве АВ

СУА

А куля . щ Щи Я :

Гн ААКІЯЗКЮ Мадаєвбнєвиа іа! 3001 Веіхвинаіїв Хо векизначени восліловніть

НН Й са а 4317 « дет я їли Є ин ВМІВ певичцапеця тні ке дак | ЖЖ Кава таня раї КИ щ кипінні хо невизначена посівні сі дах дек вії, хоп Ззід ЩИТ зе и НЯ ке ААКІЯЕ Мераганйнтатоеє ві ФО Вркчрбаів ХУ меннзвазеча послідовність

Геї АВ пучоватю ; дл 4 сеесмуттутих поуецілецінях т АБОКИЖХВ реа 206 ВИ У4ВЗ недостатня посжіяовність

УК х Й

СТАС ААУ): Айавд ві ві 955 Вікар НЕК сау1ВЕа АААЙ2УЗЯ Мов Гетесй ві ві 1991 Ві хепуде

СЧчУузАСІ СААЗВОВЕ Овгаенвв вра 1950 БІВТБЕЗА еру ни з Вікревіакі ла ААУ Кеноїв 155 - сі далі Бенеівов 9 вевяди - са А ; ВЕ ване го в дз зварки зва МЕМ

МІЖ ВЕВ АААТЛУЖІ Ренеіков т995 РЕ й й Чи ге Вані МИ»

СТУІАко АлЛАВБІВО Мабвоюв ек ві НУ 1? и сіє? ААБВЯБОВО Некета ві ді 194 Віконна НО

СТАВ АС сбюунно є ві ТК ОО Віка НОЗЗ

СУТІ ААВЯЗІВЕ сіваув еч ві 1593 ЕЕКНАЛ - ками щЕ я ВіКшшак УТ».

СШЖІАСО СААВУМЮ ри 1957 гаднніак І

Маквехни Є -

САС СААНОЯ У про 1595 вик ти Кіа 5 су1деі а НІК Бу А Тірреб Нюх ЩА тізька ДН» послані

САС ААЇМНТОЕ сво сії ві БО ОБ кома ЕН

СТАЖ ААСКЮВОУ Уво ві Ві юЮ

СТАВІ ААМЧТТЯВ о Тиспу ек а ЗОРЕ ООВЕбот аву

Сів ААШВННТ бвао віді КЗ ВЕН

САН Т ААХІВНИ О Ніге ех ді ЗОЗ ВЕ кепуае НОЗЗУЄ

СТУ1Ле1В ААХВЕМІ Кан А Айзт 5 ВЖК -т29

САС АВ НВІ Овен ві ЩО ОВЕЄ:33

СКІАСО АВВЯММО Тева КН: жі ААЖБКЗОІ Каса сі ді У МТА Моя жіно АБХОЇВІВ жваве й Капе МЮ5 Вежі

КУТА БАЗУ Каввуар- зі ЗВ ВЕ

СІЯ АВКОЇЯ3Х Агапро ка ЖО0Е ОО ВЕ З46-1 ЗБ

Стхідела КІ5ІЗ22Я 0 бай Репросі ві ЗК ВЕ ТІ. БВідеуєенотв не азку З МОВІ на линчсв» 5

Сх АрЛБ БУБІТЯЯВ 0 Сповв Бебр ер ві ЗО Вітта-Я Бідсуєчеть зв'язку З Мои заливЗсни 009

СтуТАЄІт РІЄЇТЯЯТ Сива рев вва оббо ВІ тям. В Щдеутність зв'язку 8 МОДІ на пннець 2009

УТА АСЄМУТИЗ ел Мне ВЕС се АВ АДАМ Ренейов НО Щі зара РЕЯ

СТАВІ СААОІБН Аповутеоне 95 ще

СА АААЖЯІН іве к Авикоп ІОН дієву сажі! ААВКИТЯО Керр сі ві 557 ВМ Мо су ААУ Мужівів оо

СІ АВ ААСЦІЯМЮО о Таводі ю

СіАВІ АДЕЛОВВ еВ ВЮЗ ВІ ази

СІЛА ААУ Увпо ек ві зО0Х ках Ах Ме НН НИК ; ух ; или опе певен ке ААКТЯЖЮ Мадам ев: ОО ОО БНОхутваща парад ненитаачени послінаюніють котре су кита - вал з» ВЕ фшчивостюпх сівба СААЗОКВ Вп 2 Живу 1ЗКВ Нто їй хо Ж ААКЖМ дова ди ВЕ еп нкюннх сів СААоНЮУ жна 9 МеНіВ їахій ААКЕЗОЛІ Бапр ок ві ЗК

Стів ЛАКЗІОВЯ Мивалеєві зо! В квккласіво сова АВСБОВУЄ овес 2007 ер еРаніЇ бів АВБеКМ Манн ва юю Ві Ба (ЇЖІ АДАМ фХуючав сі зі 1554 ОВЕН

СУІВА СААТОЇОЯ ВіевВореї ві ТВ9Я ОН твотівон

Х х рів

СУІВАЇ АЮ Косові мою поквнатетні

СИ ААМОМОВ ізакоув ої ці оба ВРАЗ

СУхіВе) ААСЗІЕІО Рауве сві 898 ВІ РІЗ

СТІ ААОЗІХ? Вацлв ве ві Воду

Ст УЛБНОЄ Жівобона она Ю.О Бідеуємість за язку З МСЕ ма пвлаєнь 208

СІВ САС Аж ев щи

Сі ВЕ ААОЗИВО Взрпреї ді дюЮЗ

Стів Аа Желе ві 2002

Спсві СААЗОЮЄ Нопев гі ві ІоЖЕ їх сютесійве

Сей СААЗОУ: алое ді 1985 Вед МУУ

Схіс ААА2ІЗЯІ генервоп ЇЗОУ ВЕ віхата РЗК бле САЛОЇВЕЄ Узп Меннемсеві 1990 о иченоскіе ж Ію

Сас сАаезяУХ вою 1595 Бгаіажаі то спі но ААУ ТЯ иа МНЮ Н ОА

СНИ ААОВОЯЗЕ Аіхівв ер ві ню Рв сЖісай АААНЖООЯ Свев сі ві МО мово. стіс ААБВа юс ЩЕ ЩО ВМНА

Ст ААМІбБКІ пе ві 2033 ВН БОЩ-20в

СЛОВІ ААХІНКМ Єва и ВОЗ

СтісСв! МеВ Канван ев 995 ВІ дайегіяє НОВО сопе ДНК посціловність

САС АСОМ Зоввеєді . яю ОВЕЧКИ

СРС АСОМ ітд ееві ЖК ОВУ

Кеш аАХЕННИ ТНавнпазінолк Я ода: детАЗТВА недостатня послілювиоть

Вк І Бо

Стіні СААЗВОВУ Чойе ев 390 БІ відаві НІНУ хро як ї75415 зд б «се с -? . келих вЕле ро що й Раупе КО ХІск 19 й Й тізьки ДЕК онослідиВнІсть

СІВ САВА зи У АТЗ ЗА сті Б3 аААКеВОїЇУ фев І ВЕВ-РЕ-ЯК їі АНКЯМУМ бепжуніувмопв еВ юЮв ВЕКОЯ сиЖісві САЛІ ?ТОЗ Утеаек ві аі КН ТІ ксауде ЯР сін САН Вохевт ев 1900 ВІ Кевуве стуігаї лАААІЯ Бенево) ОБР БЕкепуве РІ - жк ЗДО уд Би кКетува ВІТ. суне дае й іх: нари

ЕКОН Зі Не 7 сок АТ Воценвав с ві 195а зівхи ДИК- тео дов ит їпжіКаб АЛЬЗОЗІ Зайві ві 15599 УВО

СТ БаУ ААУ Биввае сві мю ВРБСОв сіб АНХРОВЕ Бікреої ві ЗЮт ВЕ НАМ що азс й - Ві вігам сів АЛІ Бенеіши ІЗ дея

СТЕ Ай З Бенейцхй УК чн х дачі клин : зі: ВЕ дігвВі сіра АААЗІЗЯВ Сьвиоетв сі ві Ноя нин кОб346 сихіКаз лазашІЯї Геном 1595 Бфаптмаєб5і

СІК: СААВОІУ ване 15935 ВЕБТЗООУБА, - хек 5 : ТА парних

СТІК БААООВ Манн Акне 908 МАВ що

С КВІ ААКЖТВ? биюе ТОВ еюоткогі

СР ААСІОВМІ Раупеєї ді же

СР ЗАСН фіав ЗВО БЕ ВОР-КХ

Іва АСООВЮ бизвк о ві Мюк БНО сів АСЮМЯЗ) іншої ОМЯ ВЕД сті СААВОЇІІУ Батое із) ВІЕБТБОХМЗА , се САМОК БЗпехеісх ві ві 19397 0 ВЕ храм меди : кова те пе ВЕ інн нярі:

СОМ ААЮНИЗІ Ки сСваЕ ТМ як о | НОКо

СОБІ АЛОЕ гів спо ВЕВ-РЬ-ЯВ

Ст ААСЗОЗК Язет ех ві 2003

СНІ СААВОЛУ і вторет пою В БЕТА А у сичита ти пак Ві пинтівал

СОВІНВІ даАХТОВМ Косі ці урок бетегку

УТ х ВКІО сін. ові кити ; га хорея педсастунтня пешидовнихпх йо ААРНЗІЗ БИ Вв ев іа ВЕЯ: пон

Ст іві САЛЯНИЗ Сайокеєд) БЮЯ Ви Ковивкі

СВІ АААТОМ «Невує і зі І ВЕкОицакі

СВІ ДАЄ ХР ек а) 95 Векепчак: са ААНКЕМЯ Конісвка вві 1956 щАНКЕ

СО СААННЗЯ Коіувовиафуав іо ВЕБ спа АЗС бік ес ві ННЯ ОО ВЕ кит ВН

СВ? Ам Рогвг а ві Як В

ТВА ААКВА опр еї ві Мк

КК 319 ААСЮКВІВ Увові ню с ЛанЕ ААРВУМО Бруні сеї ді ОМ В викедіввних с аг САС Тони ої ві ЖЖ ВН КогивК ВМ сиві АДМІН ЄСпазцебассаї МЮУ В їчхівІЗ АВРБЗ адмніпя вові МН ЩЕ

СУЯ АСОЗЗЯМ дв жо МюЖ ОВО

Сухі ЕННИУЯЯУ 0 Слів Репооі ві Ме жав Відсутність зв їзку З МОВІ на ливснь 2009

ЄСейвій РБК бропв Бепденові МнюЗ БА Відстуєнеєть зв'язку МОВ їз знпень ЛОЮ

СВІ АААБОІМ Вінаєаі рез В вотоскнв «ММ, вправх

СО АВЖВЕОЮ «ралі ві ХНИ ВЕРБА

СМ АСТМІ Я ре сю аю о ВРОощЕ

ЖІ МЖАСБІВУХ Єва ех ГО СІВ аа ААЕЛІБО мав в ді мкИ

СХ ААБНЛОВ ЄВИ ОЇ сі ЛАСЯ Бопрое я и ВЕ ТОчюЮ?

СН ААОВЗІУКО Азот сі ві ОЗ

СІЛЬ ААСУНЮЄ Раупе ві ві Тв9Е непо хя пОслідвністе

СО ПЬЕ АВОЯВВУУ ів во 906 ОВ учаз нелосткня носліжевиіеть

СВІ ВААІНЯІ Бюпоуав 1894 ЕМ Щ7

Се олААВЮх СО ТечВй ою ВеебЗфю

ЗА Х Єзопиаех

СОБІ ААСЗНЮХ ваупевна 1998 сте ААУ Ваит еї ві юю с іЯВІ САС Аупви ее ві шві «рої А АЛИАЯЧК зо за В пинтіхоті І

СВБ ААУ Кене ді Р9чХ вЕ196

СТІ ААВННОЇ дееа МК ВЕкКоніаКЕ Кі с ке АС Раупе сі ві 1995 невостатня посліцовиість

СУЛА ЛААЯУ Персуви сі і НО ОБ Бога

СУЛА АААЯЗІІВ Уюіеє б УВневу ОБО БІ нак НОЇ . бзхааві Соя Бавакі са! ЇБОК Визеце тілька ДИНКк-поспідовність

СУЯАВЯ ААСОЯВЕІ Міг ег ві ТЗОВ ВЕ Кевуде НІЗ4О су СААНН УЗ гапр 9 дн БІЛО

СабАав СААНВМ зе Реве мюФє дЕУЙТІ

Стіл СААНЦЕЮ Ус Б Рвпр ІЗ ВьСЖ2о суда ААУ Мерої ді МЕХРО ВЕ Мопизе 66 ідузАаЗ ААСІЗУМ бвапреї в! 2

СІДАВ ААСОНВЯІ Уво сеї ві ЗИ

СТВА АЛОБІЗЯЯ Ват ві 203

СТАВІ АБВІКЯБ Тева ві МЮБ БВЕкКре

СТРАЗ АВ Алптою ві 2908 ВрІЯБ-15КИ

Села АСРОМОЮУ НЄ ві ві ох Ві Но-5о

СУА АААСІЗЯВ Уійнерах Мвнееу 1959 Векигек: НН

СТУЗАВО СААЗООІХ Юанкоскею| ОО декоєсіВКЕ НЕ

СУА ААОЗВІВІ сСвВеве в) 1555 ВЕС

СеАМ ААОЇМВЕ Бім ці МЮ ВЕВ-РНЯ

СТАВІ АЛКНОЮ Удосг ві ЯКО ВЕБ.

СУА ААРУЯАХХ Жапеек а 33 ВІ жи?

ЖАВ АЛЕЯ? Ббнуавнніуансі ві ДБ ОВО

СЕЛАВЕ АБСОБУЧЬ Мово ера КВ пОУВІ

ЇЖА АВСТЯООВ бвапк ев. щюх що

СпОАВОЕБІЗТ3О6 іднегаі Хюк ВОУо

СЕААНЬ САМЕЯУ?У Каївспьсі в щкк о ВЕСТ

СТУЗАВІІ АВМ 76 злягіа зт вихо

СУЛА АСОТІШО Хв в 2005 ОВ уже

СМ АЯ АКНЕ Янв ві ві МОВИ ВІ:

СеЗА САДЯИМІО АРогаол НН Вевнандіні БІ

Са ААСІЗИО опо ві 2

СпузАСІ ААОБОЗВХ Ввитег ві 003

Сага АВСЯОУ Низпе ев ЗО05 ВІ УВО

СТУЛАСЯ АВСТЯ959 Жпапе оса 2005

СУА АСТМУ Хе МН Б жипапепкі:

Стас САБІВЕНЬ Звієвтьсі ві Юд ВЕБВБАТ-!

Стулася САМОБЗІ5 Звісвтьсї ві зт ВвесМа Ні

СшАКО САМОЮЗОЄ бБввептес ві й шОоМщ-втТо

СУКА НЕ АВМІУНИ Кагсеса МН ВЕК А

СТУЇАВИ САМЕЗНОХ Зайві ві ю7 ВЕНІЄо

СтузАСІ САМЕЗКОЇ Заїр сі ві мю? ВЕсМВі-Вті

СрТоАЙ ААБОЗВУ СВоРе ді 195 ВЕД рам АВСЕООШУ ав еч ві Зх ВЕУВІВ

СтоАЧІ САКООВНМ Чафіеетева! 2005 ВЗ ЗАМ

ІА САМІ Явієт сі ві ЖЕО ем Вт

СтклАЯ САСТВТ3О Увієют сі ві зо ВЕ НгОО

СЛАВІ АКОВІІВа Вехвоеі ві 2903

СУА АВОМУР Ве еві 07 ВІВ сіл АЄСНОВІ вик ві юки

СлУдАВ БОКУ Жвавзк і ві Мк В Відсутність ЯЗКУ я МСВІ на пдхень 2005

СезАвІ АСІВОБЕХ ване ві 009 ВВС сСтУВА: РІВ бобзуазисува ні 2009 ВІ Візрутинтьсни язку з МОВІ на кнпонь 2009

СУА АААЗІМЬ Метомай і Ї9ЗК7 Візавп евро сСтуддви АААЛЯЯІ Зекагеєві 1987 ЩЕ шперекних

Села) САНЯ Нойесі ві роя)

СУА АААДІ Мерретов гі ві 19 0 Витепевиовів -

СезАжу АААМХЯ Попоувп вів! рве Ветентвові вини рохів

Сіла ААСЯЗВО Аа ер 1994 0 Веелевноюте схУзадІ САВА дае вев! 19995 БІТ

Студав АЛЕЯ? Овоава сві 2004 ВЕЖМ-ОЗ

СтуїАві ААЖОІО Ба ана Смик ОО ВЕ РІНОВІ

Се ЗАВО ААЮТОЯ: сревеї ві ка ЕВ пезавії ДАУВІЯТІ Каневі хво ВОеввповія й нен

Се ЗаВіа АВТ Белз ві ві ТОЖ Велепебтновпів

СВІ СААЖНЯХ ВЕК ві а Веобжон Я3К

СзУ3ваи СААООВІУ Бебтоп ек ві во ВеРОЮОВ

СТВІ ААЛАЛІУЬ БЄниемалй і ді вна Бема

СІВ АААЯНОХ Сювохат я ві ве щшЕОМа

СЯНУ ПЗУ ректост ві ві 1995 чідька ДИК зкноізовність схозичиї кота т гі ще таня В Копивхі

УВІ СААЯЗНО атіенещ 1995 винюг сЖаАН СААЄВЯВХ Мамі й БПау ТЗ Врієгасієтвм

Студій ВААЬУЮ Вепегві 15Ж8 їк івгасієтня нини Нр

СА САМ ЯВ Ветуєві ХАН ВЕ Їагасі нів кА: з дм наічфевим ові ой о щергох - соілиі

Пе 3АХОБІЮ Міейвіант с я ВХ ОВК цедостатих послі»

Став САЯЗОИЗ Спнхефнетрогостні 2 говя Ве ізгасіствів шин вх щу

ЗБ СААННІЯ Типереаднеки сб Ві Ф98Х ОВ ітасієпзів

Суха АААІІІІУ банаинно «ві УНК ЦЕ іхтаєієвцв.

Сей ВАЛОВІ денег ві ря Ве івгавіопнів повинен НО схов АН Ю5І Бету зі ці 2О0У ВЕ івтзеїєвзів

СОЄВх оавсяев Менаїзкеві са! 2005 ВеМОС-О педюктатня послідовність

Сттсв! викчяло Він еі ві мВ ФилоУтністьсв' язку з МОМ ча липень 2009

СРУВЄВІ БМОЗЛОЯ вт й Бер здох вНВІЖа бідкуєнть ягязку з МОВІ ва липень ЛО0»

СУМНІВУ РІБОТ623 нн Бкопо 2005 прик В бдкутекть с жну з КОВІ на ляпень З00Ю - " й Відсутність зв'язку З МОВІ на зве» СЮ сууві КНОЖМЮ Зп Ж Копв НВ ОО МЕ Й й

СОЗАВІ АААБТН Магув сі гі редо ротетекалевнх сад АААБТЬЯХ Мих ої ві 159 Ві дала цевяії

Стузаві 18 Рвуле гі ві 1597 тільки ДИ К-вослідевність

СУЛАЧІ АВОВоОКІ бевране ев! МН БЕ ЗОоє

СТВІ АМЛАВЕЖНЯ Бопрермніз Я Магуа 1997 БЕ РЕВКОЗ сСхУавВай АВК Сщо ві З УВТ Ця

СІУвАВІ АХА? Маха ві Пе ВЕР КА; чада ААМНМЧЯ Вега НО УТ НК їчуйАаї АВНОЮЗУУ дДава зо п оба1Е

СчхоВі ААААЗЕ Мага с ві НИ СР

Села АЗІЯ Гатоепнові ру и байегіве

ТАКА РОІгаЗ

САМ АААЙІЯО Магув а Би 1954 0 пн хів НКИ

СТУТАЮ АААМІЛЬ Магов й Бе 1994 ех впатеюєвях

ІА АВХЛЯУЮО опр ві ЗК Ор Уло

СТУТАВІ БИЗЗОЄТЕ Яви! ого Ві Вежеу квітку з РАНІ на лись ЗУ гУТАВІ АЙХТВ555 Аршине Аква 7005 й уподтеу СЕ

ГзуїАв АСІЯВНЮМХ бели ві ОХ ОВЕНО докт пече я МОВІ па вовееоні МЮ стуТАВІ гг Мапа ві з Відсьтвість З яку зві ва кеетчрйя 7 за 2

СтуТАБЕ ЗІЗ Бере лав 2005 е і ; суВаї АВАТОТЕ; бар ві ДОЖЖ ВІ Виахловкенвів слові АВЕбеЗ сво ві 207 щВТНлЗ

Са АСОЮОВЯ? Река ще ВН са АААІВУ Маг Ж Ки БЮ ОО ВЕ дновимюцввне

СУУВАВІ БІО Свепосї ві зо піВ-их Балесутність зр язку я КМ ме липень ДКР

СУБВа! АААХІІВ Миута в Ки ОО Кпдунотовив

ЄТУВНВІ САЮ5ІЯІ Ар ев 2002

СУКНІ САБУТЯІ Ай егві Мк

СТВІ АКА Яоегві рода ВЦвропевнів

Униби ста ААКОБТВІ аб ві за щЩНВЕЯ

ТлУВСЯЗ БКН5Я бле ді ВЕ УНН Відсутність зв'язку З МО на липень 2009

СО ВАСОТАМ; Авапо ві ЗО Вераневе І

Сзуввя ВІЗ і33574 Ажапо сг ці ЗИ Вк ЯільКВ ДК вослівовніст їх

СтуЯОа3 ВНОІ21575 Азвпо ві ві 2а0х Ве тільки ДНК йОСВідсВите

СВІ БВАРОЯКЯ татверо зі ЩЕ ЩЕ ВАТОВ

СВ ААООМЯЮ Берда ЮХ ВІ;

СзуУуйбві БО Т5У дров КО ВІЕБЯХ, ІМДКукнисть св язку З МЕМ вв людевь Мк сСЖЯєці ААТЯКЕЖКЬ Вега МЮЯ ЩщіяЗ Явкож ВАМУДТОВО

СтбОді ААТЯБОТ Яви ееа) що ВІ НВР. сОуВО АВСЯОМНМУ Ушеаві 2008 135 ялуВОВІ БНВО; Хіводови ек а МО ЕСОНІЯ Відсумнютьств язку 2 МОВІ ве папснь юю

СУКНІ кгавхяу ї рів ка зов 3155 Под мтя ЗВ ЯЗКК Я МВ на линань МК

СлУВІВІ БОЗБІОЯа Удпог ві ЗНУ В ха Відсукніютьсв язку з МОВ) налив ЛЗ

Стувів! сіни клЯВ Пи егцві Зп пЕВВТ ПІДсСуЄНІСТь ЗВ КУ З В вадипаень 039 що Ще Ой ши Мудеетвістю зв яаку з МІ на дицень ЗОЛО

СтуВКа! БІЯОО55Я 0 Овехайс ве ДОВ пил п па севкаа АЄМЯТО: Мовчуеза й Мбаюта 009 БИ Контає

СІВ ИКа БР?ТОЗУІ Мовоєт Ж бага 2009 0 ВЕ сапайепзих тільки ДНК послідовність «ЖВАНКе АВХУМЮХ Мавкеза ві ві щи

Ср СААЯЯЇ Креуєієк ві 1891 В дайсгіве

СУА САААТЯІІ (саме ві 953 БЕБІ

СтуУЗАВІ О0Я892О3 Без ві Мюе ВЕЗСНІМ Відсухніьов юку ММСВЕ иа двнпени ОПО 7 рання М ши Шо М ее мини й но ул митує мли В АТХ р маки тика

Стодай СО2ОММ бас ві мюе вегоЗОоЖи Ніасутність зи куку З КСВ на аниень 2005 слуВдя кувчуаяк поні чн Ада Вазаув ві век неповне посливМаНіть

АНЖЕ

СрОВВ САЛО ЗВеуєієм сі ві 993 Де раНеяє

СВІ АУДИ ЗНув Жнуєок вів! 2004 ОТ івропенвів са СААЕЖНЯ апеоу еві 1998 Вібув ічжва АЙОЗАУ?Ь. Ват ря Мох а я ей заказ Ве заропевніє стер БАК ЯВ бою ник ВК ха 4

УВІ ААВОМОУ аханс На 019980 В івревенгів Щ Я й ще ШИ слуаз СЯ би ев па ВЕТО Кидбуннсть зв'язку з СК на липень лення слух СОЯ ие ді МОЮ ВЕТО УНН Бідрутністе зв'язку З МеВ налипень Яню

А швид не ; дамс ВЕБ

СУХОЮ ААХВЯЗО Кзпивоаа ЖАВИ ЗПОХ овіячв ин рРІівВо сх) ВАХ МіО ж буда 1998 їв й й

НЕ стра а ААЄМОООВ Бе ді ЗО ВІ В Накій стуЗкаі АБВМО1765 іп ОБОВ А слубкай АСЕВЯ25? жо а 2ООК ВЕ уже

СУ Кав АСОМ жваві МЮ Ве сток ай АСООЗВТЕ Тім КО Ж ОВК Й

Стморат БРІЗВОФІ Чапві за Билсутвнит зв язку З МОВІ на липево МКК

ВЕ их Ж я дя й я г Кк

Ста ОСНО бив хи пюре Підеухнісь зи нку З МОВ ка дниень ОПО

СТЬ САСБОТВО Аванс ві ЖИ

СТУВЕВИ СВОЯ ЧОЗИ би іі кю ВЕ ТОЗВОСІ Відортнизь зи'язку З МОВІ пвоннниь ЗО0Ю

СУБ ВАСОЖНЕ М/няале і ві МНКОО БІ кзНеіае ще ; до їх одне ВЕКИгЖВК

СОБКО ААХТЯЯЯО Бізпозизй 5 Абай 2005 ові а ї : х учня : руч ПО Білсутність зв'язку З МС ий серпень 2008

Стубве! 00025005 Звеїві Зопо Ві тезВоо! пуття ку У ТК не окре т)

СХ НЕЕ АСОМ Жикаро «ві Т9ОЖ Ві каНелає нежуввкня (ОСЛуВНЄть суп аАді АААЙОВІЯ Твогте ді 95 ВЕ і«гавістьк ; сте ще ВЕ івтасівозі сі ба ККСТа тав й. Тоотака 1555 ОМЕ-єпА зільки ДНклесвідовнить

ТУКА САБПЯЮЮВ Буту ві ві ЯК Ва ізеієлвів

СУХО орочеднктя й . кох ня с дес леунтвіеря

Що Єм роЄ?Ут; Мейжіакевт в: 2005 ВеБОЮЯ невовия тнкстіДояАают

ЕЕ

СІРА АААЛІІВІ Вопоуаи ев ІЗ Бу іиаейспех

СИ А АААТІВИ Адатве ді 1959 Ві віавієнвів

СТУДІАаЗ САЮЗОЮВІ Веткегві 2003 ВІ ібкнеїспців тон ЇМ Б653Р Мавекойтістя! НУ; ВТДОЮС-У невовниа послідовність

МВА СААМИМ Осівсівуе сі Зі 1995 Ві івравезва 367

СОБІ ААСЯЛА Сибух сг а 1595 ДИ меди їз гав АЛАЛІЯЗУ КМагуз «і ді ІЧ ж РМК:

ІА АААІІІВВ Мага ві 8 БО РІВ

ЯХіїАвІ АЖАІІІ6 Мага візі 194 0 ВІ зойо РІО Я

СКЛАВ АААЇІІЗІУ Віояп о МНИсіву ОБЮюЮЖ 0 Вефйетраові

СЕК БАВІ СТАВІВ Вайру біг ді Об СВінвівувів СНІВ

СчуїтАВЕ СААБІВЯВ Вау сі ві ОСЬ пеівзувів СНІВ їлхікаВі СААЛЕМЮЬ ЯвВапо есві Не Распібає вав ворннне

СеІЯВа! ААРВОЄЄТ Ра е ві рю Респ ноє рорНнає

СВіЖСВІ ААРНОБЕЕ ра ев ідею ГаепірасіНе» ин роріщає

СОЯ ЗАЯ СААБЕВІУХ Коззо б Меіфесвахе ЗО Веіермфезан 357 схібВ3і ВААЗОІУ Мустроеї ві 595 ВЕМео

СОВА ААУ? ее АОКВВ 97 ВІ ВоКиокаспхв

СЕХЛОВа! АСБОЗБО Модевга Ж бита 2006 ОВ Ндо ДВІ

Сеул же сноО43333 ред НО тілька ДК поклівонніст»

СебіАці 132933 Раупе і ві 1906 тінекв ле Кепослідовність

Суди ЗВ? рейевов 1997 тельки ДНК вості

Стіва) ВАСОВБЯВЯ мо б А во 2005 0 гозкнепнія жа НОЮ Раупк єї ві 1997 тіл ДНК постіденоість стада и САМУ Мав в) мя ВІ села АСК Во ев ЩЮй Ві КЖ-4

СОІАВЕААКЧМЯЄ Ваште ві ОО ВеБОЯЯо

ХАІ СВІ авее ві ки и стУЛОВаЕ САГЯЛУ?Х фкаае ев ЗІ ВІ

СУЙЗАВІ АЛЕ ЮОовозан ої ві на щ ипрнив я СУ ЗАВ

СЕУЖІАВІ ААСБЕОЇ Кажан ава Ні 1998 Бгіврафрезав слава БАБУ? ОБаин с ві МКМ о Безоно

СИС САМОЮ бер Забтно 2005 0 ВРЕССІ .

СА АВ АЛСВІКОЇ Кажвікзаа НІ 1995 Вііекввенахй

Суообдві ААЙЮЧИЯ ХУорсівсномека «б з їн Поеми В.

КОВИХ з Пк

Спотаві ВАСАБІ байов ОО Девво

СОКАЛІ ААДОЮІВУ увісіесвютика ст арі0ою ЗИ Денітюв В.

СрУДЕАВІ ААОВОЗІ) Мостжапа їі ОЗХЮ ВЕЛИЧНИХ

СТУВАВІ САСВОСЕХ Гефйсісче ВІ ТОЮ Ві яаее сів Ая: САСЯАЩО Овієсіае ді ЗО пеніеців

СОВИ ВАМ Но ві КК ВЕепкуптоєікн судив МАЕ ОВвОЗНЕ Я ві МЕР Ве хоцо сла АСУ Випнні Баг ВК ВЕісрвфезва З?

СУЗОЮа! ББОЗ5955 Яви сі ві чюб ВУ Тілсуєцієть в яз а МОВ на линемь КУ

СОЗОрБІ ВАБОООЕЯ Кісвбеена: 006 ен ВОМ.

СІЗО АОСОВЯЯВ о Езпреї ві 200? ВЕВЗІ160-І

Сука БІЯО9З5КО Зав ев ЯМ ОО УхуєйеВ Бідежтвиуллаязку хо МОВ на лань МКК

СоОбаЕ АСІО6О5 Тепесві МО5 ВІ МОВ

СТОСВІ АСОМ вве ві ЮЖНЕ

АВ ВАДУ банов й МИиХиКі ню ОТ Жя.-Н5

Сай АЛІ ЯТЯІВ провкі Се ща МІ;

СУА ВАЄТЯЯОВ Шев ве ві хюв ВщВОБЮ

Студійна ВАРЛОЯИ Увенаке сі ві щЩюбБ Вит5 сі А ВАКІ2572 Уавнакев ві щмщеб Вг954В

СХ АВЕ ВАТОЮ Метоп сі ді щювБ ВеБО155

СеМАБІ БАБІ Чавмаке ві ві мне ща із А БАК таризке ее 2006 ОБРя ЛОВ ставі ААОЗВИ Бофавчюгавхона У Веуспнапенсів їх ЗоВа! ВАБЛЯВОІ Такобе ев М В статі ВАВТЯООІ такере їв КІ сов вАВОВбИЗ Текеве сі ві хкНо в

СХ АЕН Киперді НЯ База

СсОрпОЯМАЕ ААСММЯВ ВНІ ев МК ОВЕРБВОНІ "фінарний з СТУ ЗАВ ста АщІ ААКНЯМИЮ Корзаесї ві ШКО ВЕБОЗ595 Візервий з СЛУ З5АаХ по АВІ ААТІНІУ борперг а ві МКМ о ВіВО8оЮ дінйрией з Стуз5 Ані

СлЕЗЯдая ААТОНКИ Бовтнері сі ві КО ВеЕРЕТОООЄ йнарний з СтузбА

СІЯ АБААСІВТЬ Мебепвеск ві Ж ВЕ РКІЯОВІ оБюювин з Студ стУЗАСІ ААСИМТІВ Ве ВІ НИ ЕР КІЄТНО біжарвнй з студії

СтУдаАЄ АЛАКООІВІ Кораг сі і МО ВеКИОЯ бенарняй з стузхА стУдаАнІ ААТОВОМЬ Коінер? ві ді ща ВЕККіІЗ65 біняревй я етуЗх АВ

СіЗВаі ААКБЯХВХ Нарвусгві ЗІ ВЕБО4В5і гарна "о СеУВа

СУЙАЮ ААТООВІ Зсплергек ві нює шРОЮНІА евави о стузяна?

СУМІ ААТАЯНИ Бетем ег ві Мне ВІРУДИ ННІ бінаранн з слтуз5ваї схудвАВІ ААЄМНЯХ ЕН їі 20 О ВЕРБВОЦІ ссарнив СТУ ЗАВ

Сту3АВІ ААКОУЮ Кораге ві аа ВЕ Ес58оВ дінврнай з СТУЗЯАвА

Складні ААТОООСВ Холйпері ев Кв ВІРЕБОЮ Вціарони ж сту ЗЯ Ані

С ІНМНЯ ААТОВОЯ Бсвппері ек ві НЯ БІ ВВІВНІ піхарний з СТУ ДЯдай

СЕЖІЗАВІ ААСЯІВ?2 МесНепбеск ів! ОВЕН ОВ РІВ бінерний з ТУЯ АВ

СПОЗАВІ ААКОНБОЇ Кираг є ві щюр шщЕСОдаЯ нариви з Стус

СТАВІ ААУ ААТІОЮЯ мМ З КВІЗ36о пвіарнив з сууЗ4 АНІ стаїдвІ ААСУНІ? ЕЩеска мюр ВевехНеНО ННочНи З туз адс

СУ Баї ВАК Кирагкеї а КИ ОВЕС 5і біввржнй ЗСУВІ

Ст35Вао ААТІВОЗУ Вевисрі ві ві оо ВЕР З пінартий зстузЯваз

СОВА ААТОВОЇВ Зенпері єї ві мюа ДЕР5ХИННО Карнизи аваї

Стів АВі ААКОАЯ Кирагера! що зі тАві ААРОЗІ бюпоува є ві КО ОВ Піназнни УХА

СТВА ААКОУЮ Кирву ві що щ

СспОЗАЯ ВАВ Пов ЩЕ ОБУ візаві . сад ВАВ Це ві 2001 Вкаіжажві

СахаОва ВПАСУТОЯК Нові ЗК 0 Вияі-3Я

СтуУЯОСВі БО381045 во сі ноя щу Бідсутаість я язку ЗМОВІ ка липень

Сефюаі АСБІБОЯ Увааа аг ві з НЕ яХюВІ

СУТ АЗЕ ВАТУ Халахвив кі зі ЗО п АТ46І

СА ВАЗІ Уапехпизе ві і А Е

СУА ВАВ Уапиена а МюЮХ БАЗ сезАН ВАЗИ у окоувств і зар Е. 1впвінпогвух нн - Рапака запа

СТУСА ВАООМІЯ Мохажв зда о рорає пн і ропиає

Стеазваі ВАТНОЇ Уокоуата вух 7003 В. феунікогічие нн Гапека вюроааєя сейілке ВАІЗ3ОВ Токората «па збої В. іепфткгінх зпака зенмкна стій УЯВУ боро я лиця Веетопосідцх

Ж Аз ВАПОВУЯХ по а 2008 МАЯК иа ВАШУ Окирата екаї ЯН ОБРАНІ

СтулвАз ВАСТОЙ Но ві МНЯ Бе баков луловано ВАСОВЗЮ «Нікахув ев ві Зк ша

СУМАВ ВАБТЯ Затирка а Мюа Ві

СУЯ да ААУЗЯБОХ Копрепкавоїа я ВЕСАДЕОВ І сеуавла САЛІ дорекалібейу 0005 ВАВ бінарні здо Ав

СТУЙВАВІ САЇТОМО МюпевткіБену 2006 Ве47-58 бінарний з дода

СуЗВАВІ САТ ЗюватіВету 0 до06 Ве мНАЇЬ нарнй з де даЗ

СтйАВ САМЕМА ЗіопсхатіВету 9005 пе СВ дод)

СтузвАЬІ САВА олив вий Вету МюЮЄ 853173 сонну сода

Счуйоді САНОМІ бюзехапо Йету 002005 Ве ТАНАВ бінарний «З8Аа

СУХА САЇВБУН пев пі Вету 06 85 У бінзрявії зчБАВА

Ста САЇВОМХ Зона ав Путу 206 ВаУМНАЗЗе бінарннй з ВАЗ

СТЗЗАВЯ САМИМ Я допов ав Нету яю йо йінарзий 1 ЗЖА Б

СУА ві нАБЯОВОЗ ОБацвн ав! Ю5Б БЕБоно

СТУдДіаАВЕ АВИЯЯ44 0 Мель сі ві щюв ВЕК ТА-ї Що І І що Щі

СепіАІ БКОІЗЯЮЮ Зепеові ві од? ВЕУ паж вто на івнянь м

Сютоа| КІОТО дис 00309 віБМУЮО флоту КО вона

ГтуїЗАВІ ЕКОІ3476 0 Зово сг ві що? ВЕУЯі Й шо о

СтТУЗІЗАВЕКІЗБІТУВ 0 Вже ві щюЮЖ Ве Візсутність за язку з МОВ не лимєнь сзуйбіаві АСАІЧЯ Твв сі ві що щМмСх

Сука АБУУБКЕОЗ сл ев! Ж УБТІ5Е суда ААБІЗБІВ Втвфнюв р юю Вт

СЛУйОАВЕ ЕМВ 0 дит Бігови ЮЖ ВУ єои Я ВідсУНіСТЬ язку З МОСТИ ча лтилень 2009

СтеббАаЗ «НЗЯЕ3У12 Оови Реле а ві зо що») Відсутність зв'язку з МОВІ на дерен» ДНЮ

СУ ЛАВІ АМСВТЯВІ Модмота й аа 9005 0ОВ Дт

СУА АМОВІЗВО Мовоєта би ОО ябОб 0 Би впісвтюєюьих сухБУАВІ АСКЯЗТУЮ Мороста бана 8009 0 ВЕК УНН

НВ А х Іс що ее ши во ше ух ГУ зх г 37п1а нсанев «ді ОБО хр. оЯ МЖх . гу Аа Дуірала аква ше пеЗяОн Я ши

Ш | : х ІМК МимипципМициМИ мМ МІН ММИМИиМНІ ЦІ МІМИМХ

Книш ици пити Імиттипииих ана є і і МАВ о, у ші Ї ; Но ех туру я Я з ді по Носова ав ї люАвІ мірі» АСУ Галиєв в в: ШИ ся Ще шк шля Пе МНН КАК КК Мом радам мкахак т ум і лини шани шини ний во Ге а і і70 З. З й ! ла й ПУ Ас | ! БИ СН я Ві ДАН Гдежене пояХ и. шок | - ше

ММК то Мод нетт шини нижня о чин ши Тон : МА м | нн М ся ЯНА П.А) терен

ЯМівіАнВа ВЕЖА Ор пе Мо ре» віді / ОВ ши у кн й . ' Ле МІХ агент о ун нет ї

Кк ЕЕ Ес МІН Мосс шик й нки і МАМА . і ! Й | Що й. як ЩОБ ВоЗБеОЕ й наве ОАЗУ ттраких лоза Те ха ВАдЕЕНІВО | Еспсієют се ві | ря Ж грулюах МКЮ | І пе ше ши ДОА У Ши пеня СТУК ИОеКЯЗНА, й ! ! с. зх КВН, А

Є у Ї с пря ее ма ІНК В. ія у :

ТМірзАВЕ пебо бер ПААЕЕІОХІ Бейовов сів ши Манн А . с по ВІН МН | кеснутютоюю НВК МВ Т-ВІ3 де ях АлКИЖМЕв ЦеВЕеяі ОМ дкеооюхо шк НЕ вяв ним ше С СИ С В СТЕ виш

Ко кодак вишня іх Зиісираі та за Ї» пкуййкоквно Пре КІЗ ! І шк шк пиши нин | Щі | ї тенсівТквь !

ЗУ МБОТІВ Ов: ке СН іх | ! смааю ито3у памнога Ци хі ай т ай КЗ ї ї МУ: зад ема н дміиькийця м м кни АК нин ї й нин нн я щ-- техх

Е пан нн НН тику дитин нан дні бр АЛІ ес НО З с Ж ПОН с; я ни в пови мипохбнкоюцнех Я

Слотавія | УЮЗАЛУВУ ДАМОЗЯЄВ ІК юні са о ШО | Шо | коенетткння, ; гене я Ве ЕК, . реетея й ї | Е В. мире | і

І | | ква Став г ; ві ААМННМЕ Св Т2О0О ГХое Ваз 15, КВІТНЯ

УЗА пУюЮІА ІАЦ ровев сії ою | й пе !

В НК ННЯ лим екшен ження івннанно он коня ; : : : бл МЕТА ОКЕАН мар» ММА зум м ТУ 3 о МИ У МИиКкОКИНУ Ки їх ог що пн |. ій ірзАніЯ І» т ТАЛОЗЯЙ Пеайвлена еВ рев шк сс В нене,

МЕМ ооо ТМ М І інн ї у кое ДАТ вені А ОО. з зубижоно ПЕ БО. опоненти

Мрій УА 0 ЛАВИЗЬ ІЙ коокень

НМ нн шин шин ТЕМ Мо ши й

КЕ К ду соди: Над ун зд Я Е і

ТеріАВІЯ УВО ТААМКІЯ Менецеєві 15Ю5 рі х ни в й пенні шк : ши и НН : пппппгоесе с еое вс стос виш ни шен зу Е ПА зЯ лі виток її Я Е ЕН лева св о М м НОВИЙ,

ВН сего ей ща ро фідуєа НЮЄ ПМАЗН: лемиводе!

ВУНАЕ паю й | , спсікол ев ді Є Й еко | се ш

З шани ше Не МНН ШЕ пін ОН СН пинини нин нин ВВ и чо в ен они ен Рококо мон

АВ АХ Сюавахію 0005 пи ЗНО ШИНИ.

ПАЛ мі відні оф ініінн дні АКА а фін лАЛАЛАНАААЯ аоанним инишхинОмнхух фін і нн

МюзАВ МАШІ пОмієт вва ЇОЮБ о ояенжнноюю ВИ ДЇ, х Носов ній Кт ЗАП ААААААА ААА А КАА КАНА АК КАТА А

СВААТ ККАся ЛИ Я нн Ан КСВ ння ння пваю. мвАТ о есе ОЗ У ДИМ НИНІ л. ЛУК иа ми ен они ін он нн МОНОМоНи 1: т

УТА їі Я АВОКеНО І Реобапехеє 2905 оДееневнони ВЕ вияма ! ПИ

Какао АННИ нибнененя ЛЕНИНА А мл пе нена ди щиІх

ІДДКАЛАДАКАКАИК пекан БЕН ее соссаланеся ТУМАН ТК ВАНЬ з ши ЗЕ НИ АЙ Не оя 5 ЛИМОНОМ

Ливзажти 1 0000000 БЕН Хієннасвар ОСОБ. З неекнвох НЕБО, ве ШИ

НО со ОДИН КЕКВ КУ НЕД ок ДЕК у кенненнннк

В Се п уч фо ут сі ес КЕКВ ом онн ичнн оон й пен Пи бра | Ккзезекг? |Хісжеереа ОДОО0Ю ссееяемяяю МЕН

ЗИ ШИ РАМИ УК Км Гамма и Мих пот ск ' нишнн ши ще шо й що що Н І ПУ ОКО ТВА, завк з ренин зе» іш ет Ж пт Ве КимАМ Є | зааох і вконнонх : г и їн ооо оф вн зн их Ї нні Ї рентні имеумевинииНий

ІІ МОМ ММК ооо о ін а сто ПАТ Ат те ї ; рана іх Ів З шин еще нн вненевня пиши и пня нн сх ї Ї ж ши нин ПИШИ ЯК ен нн і ! і | заника ва | | . уза РщОЄ Мамаєяа: |. деки

ДАК КЕВККЕН ЕВ, КСО ооо КК КАК МНЕ овнту акне КВ ОМ ЕМИИИИусмиииМми и й г Е шк шк ши ша ши шаш ши однмкднкожжн сн ання нн пі ння ОА 2 ї ї мамі РІ ЗВ | (че сеї | злак На, ; . г ї . | : еваАяо ЯРІВ САН Улас шення нн нин нин інн інн нн Мій т і.

ВИШеНН МЕНннне ен шшшшн ж тод ех сект нн,

УОЗАКІ 5 САН Кан ке за ві об не нуунктьюю Ще щ . ШИ.

КЕ | ший ший ший ши ши іч соч ШИ ши

Кестеттекецввкит нти СИП ПИШИ нн, ну вн ня НН

ТАКЕ, нен ТМ нн МТМ МИ ОУН | У ї

ИвАТ іх рн /ломовто бинта | й «854 ЩІ і нннкненннннння ру пив пло неп ли не нунн г КДДДААдА ши чали ту МИСУ виш шин ШИНИ пененентнн Ден Кент нення ення чу | ї зав Гір ЦЧеомою ЗВ (Куввота ; КО ЕЕ ШИ Ї

ЗМІНІ Кто УА ІПМ ММ ПИ нМИМмМиММУвМИМих, інн ій нйн в

КОРОК шкі пн нні ЗНО ЕВ | Кн птн ненні тт шин ши ши ПЕКИ Ки З ; ї ши ШИ нт ше шо шшш ши шшиншинни шнни шк ши пиши ши кни шин нн нн нн нн и нн

М ШИ ШИ а ше У. нан НН шк тт пЕтУК .- ШИ ше о оде ох й й й шик ший а овсня ші Я смути фе тиху и пу їх список ПОСЛІДОВНО СтТеИ 1 тхиди ТЕТ тот іх бом АшЕНСТВМСВВ БО аа пази уми зт МО г тега Му зу рт рт бле ту ЮА ФІТО ПрИКУТАИ ТЕ их нь ше Вам САМ ОВ ЖОМОІйАцІМ МОос їВЕ Мій КЕеУМОККя СБЕБИСТЕЯКНАСТЮ

ПТУ

Кот бр. хз тий Зп аа. уУни «Ал» ПЕ БО19-АИ5 нене ТТ

КЕ Я

Шу ЄЗгужсзуу тий и ТК

АХ касет ул ок ве и и З ше М М оо-лиьо що «кі МД це туя зм «їй» РК «ій» РУЧНА ПОСЛІДОВНІ ШТЬ бю «ших

Лек ж їх «кита оОожу зе вх «й мук ї мак бро ми бек ую З лям Аж ту Гуз дур Ух рі З т1 пе йшня В мо т окми п

Ми ОМ УМО УЗ І КО УЖ АХ рої зу МАТ УА БУТ. хх кл дак КК А А ОК

В Я зв яке ї ше Ми яку лах лани УЗ хи «дню ух зіЯ де тт их ди сек т, Уесує пог їв ово Аів Уві беж Ашю цій Бех ліз сій Меб дЕм оСе)з Бех ТБХ ЛУ зе -к - о а о м ши нн з он ЧУ - ср бути тота Вр, гії ше с Мамую ММЗ нео Мои

Аіва Ахо Тіє сію Бр оБех Беб сСеж Ще АТ шій Бі Ашл Лях Хе АЩЮ

Зенон М я я ув рин няних я, ста тугі ТИ тла г ко вп: виь зек ій Бек жхпх во би фл ошах У ав осв ЗА ВАВ іх -- -ї пох

Зі З З

Хе гу Жора точ ях у. тус шия х ше дл кре

Ахсеа їі без сау Мі бе) пу Уві Руоз Бе бі су сіл оїЛе Аза ех щш ст; те па 75 ЕЕ ва

Жірчєу є кісули УМ гом я Хр ик ги ях куб дю дет Я и дует буму у

Не Ж Оу Вис іїєм3 Зі пі ім їм ТЕО Ко Кон сії У АК АЮ шЕО се хЕ

З зо Зх пет ГЛ Ка ке ва у кат ьяк зх хи кл ж гаму У у прощ ол НК ту За шле їн сі) Я ов М с без ТІ кз сіті ма я ж не чт

АН хаб ло теруує ІЛ и Можу ум, Уж Мити Урі Ж г и Мали шву и ню ха я

Тахо біч Алі; Тйк АжФе дао» Тахо Вів Бем Аза вх цей; бів Зі Беж ЗУ ех ва жа ей х15 ши Як

КЯ мк зує жур чо пе тик ул їн жк соки я АЖ р ча тощо Й Тс да мех Рце ду Фо АЖ КУАХ МАЖЮ лах Бий Ам ОАЕ Я Яма бла АВ

ІСау ЗЕ аг їз 1535 153 не ех бух пло мих Туя, дою суще у ож ряска ер ЕМ ж тю Ж лох

Ах дю Ащо ав Ажч СИ»х дк беж тд Бей Гук ЩЕ сів тую Хі хів 155 МО БЕ БО кос ле жк Мих ТЕ т ет Ми перо гу тс Жалу: Мат з ем пев оси Бе двояке Бай АВ К і Мей ВУЗ їзвю Би дів 18 ач кВ їа5 ї7а 175 кл т т схе Яру СХ мису о (ЖА стмтую дово си М дв т іх сСЗавоАч ущ вхо пеб ей Мер Уа. т Ух дів Зіб вів дів о АБа їм, Я зви Б: кри

Іво Ми АЗМ на о АННИ Мом М га оо бдічн т тілах іх» бі у туш Тк дач ев лев фей би 5ха Бер лів мех бе виб бу се осад же соку Бей ка ре лм 155 кий М тиж. Є оку кейяя чт ен мянух я ЧА К меж а и жду ру тане о бпех шій сії їзе сь душ тух ТУЖ сх Акту бів УЮ сід МуУв о ТВЕ т т ц ска її ло ХУ хто чию У слух сих М тодуая бут ЛЬ досту: трат сх Мохіу МУ КЛ ЕН дат

Ахч зі тує Бех Ав ту СУБ аа Ах Тхр о Тух Азваотоає ЗКу їхні Авлу кре по ща тод

ОВ о ах 259 спо Х ошкчу уче око Км п шо и Схещоюєпр ун Жонути бич фу ет ія ХУрих дет ПО АК іо пу тпх зви одів сла шех тЕ подей лет т ух ви мА ЕТВЕ зац зча УК шу ди о хоче чит Злі вуєю ко Тодало Ут ЗуУдо Ж ок: долу Ти ху В то ЮК

Адже АжУ Айр пеб Ж ом сажу Уа Мец варом ад Аза бем о впав о Бко чу ак щей о ЕЕ ва у - ту пн ин в у и в НН а у у ЗА чЧУмрих о біду З що жу оякя фр ях век отУк АЮ тих дхФф Уві ЖУК РЖОУ Меб Аво жли ех Ада бо Ума тах тутри сус «Вк ях 2-30 ана сук г я Мчую брід їУхе г гля ок мтгру че ве тужних повах Фі ху дже ім т ТУ тпж о Ал рус Її їв щу вже тах дви) зів ж Беж 5 ХЕ 338 225 яви їз К ши беру да чеку Сх З пе дев Мо що аку без Юцщ блум В впе Аза бек Тр два тгр о Ебе Алло о дкп два Аіфа бро ех Біне Чех дів чи я зак пе за з зі зо

ЧА шо чо Гдиня пи Її ех о Жокухі Тихі Ле ФтТриУ бен УЖ її лів 51 діа Уві їе де Фо Ео Рюоз ців їж Пепі ДЛ ШОЕ пе ЕЖО СД зв аб за х той ту: т Мн ко декан ЛУ тод ки нею туя зкіче о Мк і у г стяг

Зіп без То їіЗіе Біе ех УДО це Ве дуб Ткро беж Аа Твк обі тТуж за зах КО ох Н шому и и НЕ НА яоючи Коко ик бшкя Ж очрчич пи чу це Золя ях

Ме бЗдл Тух Тк оЗазї сиу МНів Акч о бед сли бек жа тах тів ке Ку

Туш облі У і дня Її 53 - й 5 ВУ

З55 У 563

Єрки Йо он ро на ни НН ок ною дану АР кум С що устя БУК

Сех йвв Беж Тр бех ТЕ нів о МУ ава ІК ЛюЕВА ТВО Беж аж АЕВООМКО з те зо 27 З зво ьо триеч о ХХ щу винне о ков нь и а ник ов не о ОНА Обрзах о ХУ:

Уві тиж Бей сіб ВпЄ тиж Бек ДЕ Фо У КУХ Аж КК Ап о сОвеЖ ЕХ ср З: чец ль: зв 33 295 по йлдо я тах дач СТ Такі Тохі: Міри: срои суки ЗА о Ве сіб ЗХ тру тре аа Її уче» Ашжи ЇТ4ее їм Пец тТплх ци Бл Ал дБ о МУ УВО БКО КЖО

В щі ії таз ет рих Мзт 7бжжя. ск, еіжу Ту а оценки ою дну ол із вже све дав) отТкоО Бжка йМмиЗ жо їжи Авг чих ем Мк ФО У Ж о зн а Зх 45 с за ху п ее и НН єря уч ся Й жу йти нє мм УЖ т имя їУюуя хх «дух іїЇ-ей о тТуУух ТПх Хіє ЗУ Туш ТЕЖ лу Завї ку Жак бій Сем по Алробех що 5 ги че ШАНИ ШУ мона урни Є я у руч АТ Мою я Може ЖМасич Ку з др біта бій беб; жо рЖжЖОо Бім лиж жв Фома виш вже АжЖт жук мала ех ко ня дош жа ЩЕ БИ тус оч НК кл єю я бачив ж пу гії ху егту бу У хх

Тухк шак пів Ажщч ім) Шех два Обіє вхо їжа Тіфіе шех Ко бею В їм

У то ЕН о пе таку У тиху их мб ру че є Я жу нн р пити вха вів хо Уаї ТУук бек Тхр ТВх Мій дк бек вла АБО Ако ТЛ Авй лих я ад ах ряеІН ї85

У сш - оте сив Ж ді Тр КЕ че тру їохії вечЕ блю дує Бі а хім жшж мак ше Ап оса АОС п бій Ха Бко цей Уа 5 У ших Ба к шт до

Зоб ШЕУ УНК дн т окхч йауї ба рих Чруує ух у Хущ о хуп оЮ Фбдгчя я ФТуюех рія хи сту рах

АЖ. мжш ЕХ же У у Вк обех ві Уві беж с з обхс іш Бе ЛЕ у се 5 5 пі пло п шу ши и ше ни АН А ВШ зу си дж т се х жест

РУ Аве її Ті Ага тТрЖж дак о УВІ Аза ощіУу Бет щі цеб бЕЖ Мет 019 «л « ка

ЗО 535 5

Хол г турні Ж Мом Сіра бум сх кух он нн НН ще АК ж їмжхі2 во це Авр ой Три Бех їео ЗІ Ач Тух йкч Уві Ахб Уві АКЧ как учи ни де

Ба вас 555 5ео чу М с ЛЕ пуху г тр лю ху ря зол о: нн З КН З УНК сн сті чх

ТУТ дів Аївз Бек Зі тТвЄ Межб Уві їер Акоз Уві Тк Уа) бі СТУ Бех

Ех ОН. вче су Ух аку о кх. У пі х ХУ жит. й що хфуже ге ше Уют еВ р

ТтВх о тТнпЕ рРпе Авр осів біт БИе Бу» бек ТЕ МебЄ бех бів ВЗ) бі; дех

Том ба уза гія рою Мухи в й що ча ЗВ Тудтну тлу міх ті сбущу їеч Трх бек сбіп Бех Бе йху Бо Аза сід Бе о бко Уві осжУу Ів бах

БЯяЕ що вах у аж юю фс КЛ тин Ж що тік т сю СМ жк Вигук що зл

Акдвонек сожу ше бат ла Але бу пав шех йлє ЩеХ Ав дв вла сує

В; БІ5 Бий овальну 2 У схе ї х ХЕ жу я у то ол ж ис чи Ки жк Мрію Ох жа сію Тв Бе нів Бе Адро Було їте 410 Бе Т12е Бко їде ЖВжЕ дів вах Зо З я тих ер м 7 «Ах жк г ша «вм ОВУ пен пу «кі ок Ро слу пн нн и Я «шАйт ШеУЧНЯ оо дОоВвНа ХЕ

«ай» панич ре Ту «ШИ» СЕМА сх й тжи що Ту га хат ду а Ко но о а Журн из бе мух «ух щех вВЮ Ал АВ КО вд» за Авбоска СУ со шо у УК о лЕТ СУ Тех 4 щ КИ Ка па щі ї Б ям безу ойшлту бен ФР: худ їз дод Тнзіз ся» 1 хя КРІТ; тік ЗЛУ: ср мія ззвх Ана жо Сі бві ста Уа) Гей бі У шу щшаАМм'луЯ лАш зММ МКС слу ке ша 3

Бут Туя Вус т Зв й бі Шк Тел бах б ге у ве Там тич) Беж

УЖ БАХ Оу АФ УЮ Я ВК ВА ЯН Х цИВБ АХМКО ЧЕТ ОГімА КамУ це слеж

В 40 Я бору УбЯчх: ху. тУюиу ух Я що Ж ях ух ХЛ т гаях ти сі булачо шт хх зів ів бві реа сі ід сіу Бім» Уа їмпа піу бшмо ув Варе ТІ ТіЄ тиж о Ті: Ве су фр беж сіб т туз дДеюо Дід шШтнз бл мі і ХЛ

ЩІ У ДАЕ ЕІ СУ ча ошЖ Бай гу яр лід Іа Бе УМ бат

То ТЕ Зо иг13з й тиха лим Валтух МТ я сту ух ія 0734 Указ Ал Тк пе Ух ХО піп сій ей Ті дв обагю ду ях ЩЗе о жма щі бБе іа дк З БВ СА Аля па пе ви ах зо ак з Ужух сим Тая ТА Сбгтях о бальну ує нин нн нн и а НН

Ті в Ач іїмпі шіц ба ее лех дво За тух бів же Тух Аза сів -у гу згує чи їп0о Ох о

Хичи ТМнчех бу й Ману ТТ хо йщшн ХУмчу би о еу ух лу з щи Кат. веж вде лк бо УЖЕ за Аа БЮ кЖхО ХОах Лех Ехо бе пед ЖЕч си

ВУ їй па га отв ТТ й «фу Мові боту Меую о мує ллтеуає Мов стиму ран ма в сів Меб Бку іє Біб ве Ава Аво Меб Аква бек Аза їнмі ТВх ТВк о Аій «ор Ух ал

ЛО їз о

З дя суку чо ее ше Шо ен о а ки КН з : "дея Ше

Тіє Без цеб ре Вл Уві б Авв о тую біп Уві вхо їм Гей ех Уві

ОХ кг т 55 чат

Та ВО АВ ве туУможує ур ан ол М ее хх Токовя У С У ень доню В ху ДЖ дивує

ЇїУут чаї БМ вів дів Ми ії) чів їжа Шек Заї їєча дк Бер Ммаї Бех ад гу Фкк

Мах 70 МА ххх жУю Га ко дух ТА оду пр ті разу ША НАВ реч нее рн С дез дн Ту ртия

Уві бе Ж їн ЛУК УЮ Ге й Ме де роМіа Аза тах т іє Ави Беж ду рі ї1в5о 155 ее тркяю ту ДУ Жожуїєт СИ ух Туя Токуя М й шко Мох би ТМфучи ка ую жи Муз муж Аша вно ме жа йдхд Бе ваш оку ЕХ ТУХ ДИЖ ЛЕО ТУЮ вав ОУН з оо 2о5 - я. «оди, и - Їх їмо труни КТ я Я осхх пух и 2: ст нинн, кх тіки Се их ех.

МХха Бтюотух Ав ОжфЕВК слу їж Бу ву і тТжЖЕ Оу БЕ Двю Беж АХ ел з Ула жене лез жахи х лу хи офужих сряхах Мшух 07 Жук: уже они 1345 то тки гухи Три лк

Звротур МА АкЯ тТУХ Ам о шоль пе Ак дхз сій їв Тих бемо Чер Уві ув сл Уру м мк й Кв 35 чо

- ще щ каш кит му ум ря св чн не Я па: Му Вже Ар отльу дво Дшж й вки То х пк їємі й Ті ЗВві Аід Їж; Біпє Вро Аа т Ух ам оса АК ОАКУ ЛУК ЕФ) «Ех я ча Км з45 Фа Гео зах зе : - тд че: - ну в ня - трюки Упр світ ти дл кі що пря кн Же ЛЕ Ан вив еьь ВНЕН ших Не цит Мис чі їт-еа Ахя їх Уві Бек Зір Беш Тв Ащ бах її тТук ТВ дви с й кута ту а ту щ злу ше і ой і м у жи БУ ІМ і я я - й тщо фа бу яю тк КУТА

З її шує ЮШном йцдту 1 брюк ве: уст клею А що по у тів пла їша ЗІ Алі вВпа ем АЖ ОК їх ве УКЧ зу сх ва Ат ау сук «ве зве ат щи кА

Е Ух ТИ фе Си я СВК їнма Мак дат Зк їм шу ж із і шо ле пхо ек Хі Ак Беж РЕ пав о Бей МеЄ АвО Збіг Сей лих Ве :

Щі че турах во ша Зо

З : - См зів ка см тую фУю Ток тер дви ло нів Па аж Тух Тпи вводів Ка вже сам Тук бух Жук Тр ошех СХ БВ -х

У Й юри пак зв 305 о п. КК 305 31 : : 4 х чи т --х ех уч З зі ня уро фиони бхнму хтг піч Бе мпервоспі ро пів біз їЗау ВБжоркО хтів мекв 5іа дек Рут Чаї шуб Ре Бек осіу рус Сів бне тТвх ВВ зеУк с з з 330 з з ; - у паї дач же ід М док же Зх МУбею Мао й Мах В'з АіЗо лат (ія Мія ж т це- Зах міт

МА БУХ її Му ЖЕ ме Ух у Ап вів дДіз о тКо бій піп Ак З й кю - Й м о з Кк гу їй 145 359 з Е Я но те віта Же піді ан я дура рун ях чіп о їжн й У бів і ді тек Вже тв Гі ек йеж Ту їла ТУЮ Ддко зіп їжа стіу зи піу Уві Тек джа Те Сей шШек пех н зм о п мне ди вк же З 355 НИ 385

У ке ри ря тт я Е дип ім сі їні бе Злюії зба й

МЕЧ о ВкОа ве два тіє БУ сое Ав о Авп осів о ів їета пес чаї ем де Е

Щ Й т дж ятки ях :пв ї7О 75 Зно

З те ї с ою тЖодеяо Жунну бкую о Мов у їй

З ях Мн Ух я Ха чую ія сту р гу Мн Її я хо йпех Ді сарі

ТвЕ сій Вле Ада БУух бАУ ЖЖ бек шекК Авоб пев РКО дез ї т зе ап

ЗЕ ХУ ДА кує и зЗии ав й до й с ко студен му пл г ще пості ря тру хх Випуу бі с-м й 33: їла бух Ши г тТук Ах БУ Бех слу Так Уві Авю о Бех Без АвВр оз) їі ко ко бра

І й й ни Сг ах

СЯНУ 7 зо ЕЕ - ще спричи я пен а теп Рух зт лем хх тиж ї Ми Моє (Ле гл ху Те йде Мі де Тита ах мах дю Аши вВшу аа Бжо Ехо Ах са ба Бде йех Нів ге її й мотлу і Б юр 28 ав 3 т- о ш - У т : ;. Ух поч он или ТУ пек де ех Щек Уві Мел Ту Гігтх чаї ех Мей: бе Ажеа бех бі Бе бек Аз Бек дек Маі Щек ше їе

СІ речоя 0 ЗУ

Ж : 4 : - її Фі йти т пе же Ві: дах Тко» їі Нів дже бах діа дій бе дви дк

Ажшсча Вів ко Мет Вр дек Ткр обі Бів ахо йех Аза бій Бе АБоп А дп ати ака

А 2 ч і м ча У рони А я гів їі: рЕвз Шик пал ощімй лів ТВУ пів їз бує бер Яр Був де у Тих і маш ВЕС БЕЖ БЕЖ ММ Дає ЛК бло А ЕХО йВи З Гуд у ; Сех щу Ал Ту іо

Я са у х : чан не че З м с КУлку тиху Ор Кр ях

Же: її Так бю бут Стр бду ля ХК пив ЗЕ вхо сі шизе Тк гріх

Ав ой о МУ пах МАМ АЖ ЖУ УВ В МУ ОЮУ ХО о сАУ Кл ЛЕ жу й оз хх до сеї ах и пл

Зі вшю ї1е еб» дже ха Ттвкобек Без ЗУ ЗіБ Ті Беж Тех іжнїі ДУ во 505 за зв. вий ї1е ТВ Бій Бус цебо беж бів» дк тет вч Увї бу ї1в ду тТук Аза Ббех ТВ ТБ Ав» Без сій Ере нів ТБ век Щі двросіу ДухЗ

ЗО 535 5ІТО

Бхо 12 дв ослю слу вва виш Бек АІ)а ТБ Ме дек бек 5БіУ вет вах зав ВО ВУ Ей

Бец о плвп деко Сі деж РЕ дк ие обві сіу Бпє ТВХ ТВЕ рхо Ббе деп

Бе Зеж Айва ослу шШеЕх Беж Уві іже ЖЖ ієпьр їх Діаз нів ді Бе бай

Бех піу зво бі Уаї Тук діє бар Ах іє Бі) вве узі вже Або За

БЕ «00 55

Уві тТнх вне о

Claims (22)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Трансгенна рослина, яка містить ДНК, що кодує інсектицидний білок Стут АБ, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Сгу1Ве.

2. Трансгенна рослина за п. 1, де вказана рослина додатково містить ДНК, що кодує третій інсектицидний білок, де вказаний третій білок вибраний з групи, що складається з Стуг2А, Сгтуті і ріа-3.

З. Трансгенна рослина за п. 2, де вказана рослина додатково містить ДНК, що кодує інсектицидний білок Сгу! Ра, і ДНК, що кодує четвертий інсектицидний білок, вибраний з групи, яка складається з Сту1!Ра, МірзАБ, СтгуїСа і СтутЕ.

4. Трансгенна насінина рослини за будь-яким з пп. 1-3, яка містить ДНК, що кодує інсектицидний білок СгтуТАБб, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Сту1Ве.

5. Сукупність рослин, що містить не-ВІі-рослини в сховищі і сукупність трансгенних рослин за будь-яким з пп. 1-3, де вказані рослини в сховищі складають менше ніж 40 95 від всіх злакових рослин у вказаній сукупності рослин.

6. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини в сховищі складають менше ніж 30 95 від всіх злакових рослин у вказаній сукупності рослин.

7. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини в сховищі складають менше ніж 20 9о від всіх злакових рослин у вказаній сукупності рослин.

8. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини в сховищі складають менше ніж 10 95 від всіх злакових рослин у вказаній сукупності рослин.

9. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини в сховищі складають менше ніж 5 95 від всіх злакових рослин у вказаній сукупності рослин.

10. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини в сховищі знаходяться в блоках або смугах.

11. Суміш насіння, що містить насіння сховища від не-Ві-рослин в сховищі, і сукупність трансгенного насіння за п. 4, яке містить ДНК, що кодує інсектицидний білок СтуТАБб, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Стгу1Ве, в якій вказане насіння сховища складає менше ніж 40 95 від Зо всього насіння в суміші.

12. Суміш насіння за п. 11, в якій вказане насіння сховища складає менше ніж 30 95 від всього насіння в суміші.

13. Суміш насіння за п. 11, в якій вказане насіння сховища складає менше ніж 20 95 від всього насіння в суміші.

14. Суміш насіння за п. 11, в якій вказане насіння сховища складає менше ніж 10 95 від всього насіння в суміші.

15. Суміш насіння за п. 11, в якій вказане насіння сховища складає менше ніж 5 95 від всього насіння в суміші.

16. Спосіб запобігання розвитку резистентності до Сту-білка у комахи, де вказаний спосіб включає висівання насіння для отримання сукупності рослин за будь-яким з пп. 5-10, і приведення вказаної комахи в контакт із вказаною сукупністю рослин.

17. Сукупність рослин за будь-яким з пп. 5-10, де вказані рослини займають площу більше 10 акрів.

18. Трансгенна рослина за будь-яким з пп. 1-3, де вказана рослина вибрана з групи, що складається з кукурудзи, соєвих бобів і бавовнику.

19. Трансгенна рослина за п. 18, де вказана рослина являє собою рослину кукурудзи.

20. Рослинна клітина трансгенної рослини за будь-яким з пп. 1-3, де вказана рослинна клітина містить вказану ДНК, що кодує вказаний інсектицидний білок Сту1Ве, і вказану ДНК, що кодує вказаний інсектицидний білок СтутАб, де вказаний інсектицидний білок Сту!Ве щонайменше на 99 95 ідентичний послідовності ЗЕО 10 МО:1, і вказаний інсектицидний білок СтутАБ щонайменше на 99 95 ідентичний послідовності ЗЕО ІЮ МО:2.

21. Трансгенна рослина за будь-яким з пп. 1-3, де вказаний інсектицидний білок Сту1Ве містить послідовність зЗЕО ІЮО МО':1, і вказаний інсектицидний білок СтутАБб містить послідовність зХЕО ІО МО:2.

22. Спосіб боротьби з кукурудзяним стебловим метеликом шляхом приведення вказаної комахи в контакт з інсектицидним білком Стгу1Ве і інсектицидним білком Сту1т АБ. Ко ; ж й Х св 80 М вч я | у - хо ВОЯ н х АХ Х 5 За ій за ех уТАВ х М Б оон стуїве а к БО 0 а ї 10 100 10 Козцентомця (вм чне.

« ден и нь ши ю 5 ом «де М "цффюккого сі т- М к З «к 28 Е ее стуїАВ У У Оу несууїне я, хх Ще ц ккд о я Ялти Ж. щу Я клей 4 вва его В 8. уся дю де НЯ ї ш 100 ОО Концентрація (М Жук Чо І 3 Х . щ пошани ри - х Ї ее с т ще і чо й г " Е- і ї І У Іза ооо ех ще в ни В и В НО НА ВД З 10 100 не Коннентрацін деганлу СВ

Фіг. 3