UA118082C2

UA118082C2 - Конструкція, що містить ген, що кодує білок, який має пестицидну активність проти лускокрилого шкідника, та спосіб її застосування

Info

Publication number: UA118082C2
Application number: UAA201400799A
Authority: UA
Inventors: Кімберлі С. Сампсон; Дуан А. Лехтінен
Original assignee: Атенікс Корп.
Priority date: 2011-07-28
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2018-11-26
Also published as: AR087367A1; CN103974972A; MX363910B; RU2014107672A; MX2014000993A; ZA201400563B; EP2736923A1; CN103974972B; UY34227A; CA2844357A1; BR112014001909A2; US9528122B2; WO2013016622A1; US20140223598A1

Abstract

Винахід стосується конструкції, яка містить гетерологічний промотор, функціонально пов'язаний з нуклеотидною послідовністю, яка кодує амінокислотну послідовність, що має пестицидну активність проти лускокрилого шкідника, вектора, що містить вказану конструкцію, клітини-хазяїна, що містить вказану конструкцію, трасгенної рослини та насіння, що містять вказану конструкцію, способу одержання поліпептиду з пестицидною активністю та способу захисту рослини від лускокрилого шкідника.

Description

Перехресне посилання на споріднені заявки

Дана заявка заявляє пріоритет за попередньою заявкою на патент США реєстраційний

Мо 61/512536, поданої 28 липня 2011 року, вміст якої включено у даний документ посиланням у всій своїй повноті.

Посилання на перелік послідовностей, поданий у електронній формі

Офіційну копію переліку послідовностей подано у електронній формі за допомогою ЕЕ5-Мер у вигляді АЗСІІ-відформатованого переліку послідовностей з назвою файлу "АРА1160305ЕО1 І5Т.ТХТ", створеного 19 липня 2012 року, розміром 24,9 кілобайт, який подано одночасно з описом. Перелік послідовностей, що міститься у даному АЗСІІ-відформатованому документі, являє собою частину опису, вміст якого включено у даний документ посиланням у всій своїй повноті.

Галузь винаходу

Даний винахід відноситься до галузі молекулярної біології. У даному документі забезпечуються нові гени, які кодують пестицидні білки. Дані білки та нуклеотидні послідовності, що їх кодують, застосовуються для приготування пестицидних складів та при отриманні трансгенних рослин, стійких до сільськогосподарських шкідників.

Передумови винаходу

Васійи5 ІпПигіпдіепзі5 являє собою грампозитивну спороутворювальну грунтову бактерію, яка має здатність продукувати кристалічні включення, що проявляють специфічну токсичність щодо деяких рядів та видів комах, але є нешкідливими для рослин та інших нецільових організмів. У зв'язку з цим композиції, що містять штами Васіїйи5 «пигіпдіепбоіє або їх інсектицидні білки, можуть застосовуватися в якості екологічно прийнятних інсектицидів для контролю сільськогосподарських комах-шкідників або комах-переносників різних захворювань людей та тварин.

Кристалічні (Сгу) білки (дельта-ендотоксини) від Васійи5 Пигіпдіепбіз мають потужну інсектицидну активність щодо переважно личинок лускокрилих, напівтвердокрилих, двокрилих та твердокрилих. Дані білки також продемонстрували активність щодо шкідників рядів

Нутепоріега, Ноторіеєега, Ріфіігаріега, МаПорнада та Асагі, а також інших рядів безхребетних, таких як МетаїВпеїтіпіпез, РіагупеІтіп(пе5 та Загсотавіїдогрпога (РейеІзоп (1993) Тпе Васійив5

Тпигіпдіепві5 Татійу ігее. Іп Адмапсейд Епдіпеегей Резіїсідез5, Магсе! Оеккег, Іпс., Мем/ МогК, М.М.).

Дані білки первісно класифікували як СгуІ-Стум, переважно на основі їх інсектицидної активності. Основними класами були І ерідоріега-специфічні (І), Герідоріега-специфічні та

Ріріега-специфічні (І), СоіІеорієга-специфічні (І), Оіріега-специфічні (ІМ) та нематода- специфічні (М) та (МІ). Додатково білки класифікували в підродини; більш спорідненим білкам у складі кожної родини надали кодові позначення СгуїА, Стгу!В, Стуї!С тощо. Ще більш спорідненим білкам в рамках кожної групи надали такі позначення як Сгу1С1, Сту1С2 тощо.

Нещодавно було описано нову номенклатуру для генів Сгу, яка більше базується на основі гомології амінокислотних послідовностей, ніж специфічності щодо комахи-мішені (Стісктоге еї а!. (1998) Місгобіої. Мої. ВіоїЇ. Кему. 62:807-813). У новій класифікації кожному токсину надається унікальна назва, що включає первинний ієрархічний рівень (арабська цифра), вторинний ієрархічний рівень (велика літера), третинний ієрархічний рівень (мала літера) та четвертинний ієрархічний рівень (друга арабська цифра). У новій класифікації римські цифри замінено арабськими цифрами у первинному ієрархічному рівні. Білки з ідентичністю послідовностей менше 4595 мають різні первинні ієрархічні рівні, а критеріями для вторинних та третинних ієрархічних рівнів є ідентичність 7895 та 9595, відповідно.

Кристалічний білок не проявляє інсектицидної активності до моменту його поглинання та розчинення у середній кишці комахи. Поглинений протоксин зазнає гідролізу протеазами у травному тракті комахи з утворенням активних токсичних молекул. (НОПе апа УмпіеїІєеу (1989)

Місгобріої. Кем. 53:242-255). Даний токсин зв'язується з апікальними рецепторами щіткової облямівки у середній кишці личинок-мішеней та вбудовується в апікальну мембрану, утворюючи іонні канали або пори, що у результаті приводить до загибелі личинки.

Дельта-ендотоксини загалом мають п'ять консервативних доменів послідовностей та три консервативні структурні домена (див., наприклад, ЗФе Маада еї аї. (2001) Тгепа5 Сепеїйіс5 17:193-199). Перший консервативний структурний домен складається із семи альфа-спіралей та бере участь у проникненні через мембрану та пороутворенні. Домен ЇЇ складається з трьох складчастих бета-шарів, які упорядковані в структурі грецького ключа, а домен ЇЇ складається з двох анти-паралельних складчастих бета-шарів у структурі типу "ІїеПу-тої!" (ае Маадоа еї аї., 2001, зирга). Домени ІІ та ІШ беруть участь у розпізнаванні та зв'язуванні рецепторів та тому вважаються детермінантами специфічності токсину. 60 Через спустошення, яке можуть спричинити комахи, та для покращення урожайності шляхом контролю комах-шкідників, існує постійна потреба у відкритті нових форм пестицидних токсинів.

Стислий опис винаходу

Забезпечуються композиції та способи для надання пестицидної активності бактеріям, рослинам, рослинним клітинам, тканинам та насінню рослин. Композиції містять молекули нуклеїнових кислот, послідовності яких кодують пестицидні та інсектицидні поліпептидів, вектори, які містять дані молекули нуклеїнових кислот, та клітини-хазяїни, які містять такі вектори. Композиції також містять послідовності пестицидних поліпептидів та антитіла до даних поліпептидів. Нуклеотидні послідовності можуть застосовуватися в ДНК-конструктах або експресійних касетах для трансформації та експресії в організмах, у тому числі мікроорганізмах та рослинах. Нуклеотидні або амінокислотні послідовності можуть являти собою синтетичні послідовності, які було сконструйовано для експресії в організмі, включаючи, але без обмежень, мікроорганізм або рослину. Композиції також містять бактерії, рослини, рослинні клітини, тканини та насіння рослин, що містять нуклеотидну послідовність даного винаходу.

Зокрема, забезпечуються виділені молекули нуклеїнових кислот, які кодують пестицидний білок. Крім того, охоплені амінокислотні послідовності, що відповідають пестицидному білку.

Зокрема, даний винахід забезпечує виділену або рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотну послідовність, показану в ЗЕО

ІЮО МО:3-5 або нуклеотидну послідовність, викладену в 5ЕО ІЮ МО:2, а також їх біологічно- активні варіанти та фрагменти. Нуклеотидні послідовності, що є комплементарними нуклеотидній послідовності даного винаходу, або які гибридизуються з послідовністю даного винаходу або комплементарним їй ланцюгом, також охоплюються. Додатково забезпечуються вектори, клітини-хазяїни, рослини та насіння, які містять нуклеотидні послідовності даного винаходу, або нуклеотидні послідовності, які кодують амінокислотні послідовності даного винаходу, а також їх біологічно-активні варіанти та фрагменти.

Забезпечуються способи одержання поліпептидів даного винаходу та застосування даних поліпептидів для контролю або знищення комах, що відносяться до рядів лускокрилі, напівтвердокрилі, твердокрилі, нематоди або двокрилі. Також включено способи та набори для виявлення у зразку нуклеїнових кислот та поліпептидів даного винаходу.

Композиції та способи даного винаходу придатні для одержання організмів з підвищеною стійкістю або резистентністю до шкідників. Дані організми та композиції, що містять ці організми, є придатними для сільськогосподарських цілей. Композиції даного винаходу також придатні для створення змінених або покращених білків, які мають пестицидну активність, або для виявлення присутності пестицидних білків або нуклеїнових кислот у продуктах або організмах.

Детальний опис

Даний винахід відноситься до композицій та способів регулювання резистентності або стійкості до шкідників у організмах, зокрема, рослинах або рослинних клітинах. Під "резистентністю" мають на увазі, що шкідник (наприклад, комаха) гине при поглинанні або іншому контакті з поліпептидами даного винаходу. Під "толерантністю" мають на увазі порушення або пригнічування функцій руху, живлення, розмноження або інших функцій організму шкідника. Способи включають трансформування організмів із застосуванням нуклеотидної послідовності, яка кодує пестицидний білок даного винаходу. Зокрема, нуклеотидні послідовності даного винаходу застосовуються для одержання рослин та мікроорганізмів, які мають пестицидну активність. Таким чином, забезпечуються трансформовані бактерії, рослини, рослинні клітини, тканини та насіння рослин. Композиції являють собою пестицидні нуклеїнові кислоти та білки від Васій5 або інших видів.

Послідовності знаходять застосування в конструюванні векторів експресії для наступної трансформації в організми, що представляють інтерес, у якості зондів для виділення інших гомологічних (або частково гомологічних) генів та для створення змінених пестицидних білків із застосуванням способів, відомих у даній галузі техніки, таких як переміщення доменних блоків або перестановка в ДНК, наприклад, з використанням представників родин ендотоксинів Стут,

Сгу2 та Сгуб9. Білки знаходять застосування у здійсненні контролю або винищенню популяцій шкідників з рядів популяцій лускокрилого, напівтвердокрилого, твердокрилого, двокрилого або нематоди шкідника та для одержання композицій з пестицидною активністю.

Під виразом "пестицидний токсин" або "пестицидний білок" мають на увазі токсин, який має токсичну активність щодо одного або декількох шкідників, включаючи, але без обмежень, представників рядів І ерідорієга, Оіріега та СоІеорієга або типу Метаїйода, або білок, який характеризується гомологією до такого білка. Пестицидні білки було виділено з організмів, які включають, наприклад, Васійи5 5р., Сіовігідійт рітегтепіап5з та Раєпібасіїйи5 роріїйае. Пестицидні 60 білки містять амінокислотні послідовності, виведені від нуклеотидних послідовностей повної довжини, що розкриваються в даному документі, та амінокислотні послідовності, які коротше послідовностей повної довжини або за рахунок використання альтернативної нижче розташованої ділянки початку трансляції, або за рахунок процесингу, який приводить до утворення більш короткого білка, що характеризується пестицидною активністю. Процесинг може мати місце у тому організмі, у якому експресується білок, або у організмі шкідника після поглинання білка.

Пестицидні білки охоплюють дельта-ендотоксини. Дельта-ендотоксини охоплюють білки, які позначено як сгу! до сгу43, су! та суї2, та Суї-подібний токсин. Нині відомо більше 250 видів дельта-ендотоксинів з широким діапазоном специфічностей та токсичностей. Розширений список див. у СгісКтоге еї а). (1998), МісгоБіої. Мої. ВіоЇ. Кем. 62:807-813, а регулярні відновлення див. у СпгісКтоге еї аїЇ. (2003) "Васійн5 Шигіпдіепві5 їохіп потепсіаїшге," аї милим. ріої5.5и5х.ас.ик/Ноте/Меїй Стісктоге/Ві/іпаех.

Таким чином, у даному документі забезпечуються нові виділені або рекомбінантні нуклеотидні послідовності, які забезпечують пестицидну активність. Дані нуклеотидні послідовності кодують поліпептиди з гомологією до відомих дельта-ендотоксинів або бінарних токсинів. Також забезпечуються амінокислотні послідовності пестицидних білків. Білок, синтезований у результаті трансляції даного гена, дозволяє клітинам контролювати або знищувати шкідників, які його поглинають.

Виділені молекули нуклеїнових кислот та їх варіанти та фрагменти

Один аспект даного винаходу відноситься до виділених або рекомбінантних молекул нуклеїнових кислот, які містять нуклеотидні послідовності, що кодують пестицидні білки та поліпептиди або їх біологічно активні частини, а також молекули нуклеїнових кислот, що підходять для застосування в якості гібридизаційних зондів для ідентифікації молекул нуклеїнових кислот, які кодують білки з ділянками гомології послідовностей. Також у даному документі охоплені нуклеотидні послідовності, що здатні до гібридизації з нуклеотидними послідовностями даного винаходу у жорстких умовах, як визначено у іншому розділі даного документа. Як використовується у даному документі, вираз "молекула нуклеїнової кислоти" включає молекули ДНК (наприклад, рекомбінантну ДНК, кКДНК або геномну ДНК) та молекули

РНК (наприклад, ІРНК) та аналоги ДНК або РНК, які створено із застосуванням аналогів

Зо нуклеотидів. Молекула нуклеїнової кислоти може бути одноланцюговою або дволанцюговою, але переважно є дволанцюговою ДНК.

Вираз "виділена" або "рекомбінантна" нуклеотидна послідовність (або ДНК) використовується в даному документі для позначення нуклеотидної послідовності (або ДНК), яка більше не перебуває в природному для неї середовищі, наприклад, перебуває у системі іп мійго або у рекомбінантній бактеріальній або рослинній клітині-хазяїні У деяких варіантах здійснення виділена або рекомбінантна нуклеїнова кислота не містить послідовностей (переважно послідовностей, що кодують білок), які у природних умовах фланкують нуклеїнову кислоту (тобто, послідовностей, які розташовані в 5' та 3' кінцях нуклеїнової кислоти) у геномній

ДНК організму, з якого отримана нуклеїнова кислота. У контексті даного винаходу вираз "виділені", при використанні щодо молекул нуклеїнових кислот, виключає виділені хромосоми.

Наприклад, у різних варіантах здійснення виділений дельта-ендотоксин, що кодує молекулу нуклеїнової кислоти, може містити нуклеотидні послідовності довжиною менше приблизно 5 т.п.о., 4 т.п.о., З т.п.о., 2 т.п.о., 1 т.п.о., 0,5 т.п.о. або 0,1 т.п.о., які у природних умовах фланкують молекулу нуклеїнової кислоти у геномній ДНК клітини, з якої було отримано нуклеїнову кислоту. У різних варіантах здійснення білок дельта-ендотоксин, який практично не містить клітинного матеріалу, включає склади білка, що містять менше приблизно 3095, 2095, 1095 або 595 (на суху масу) білка дельта-ендотоксину (також називається у даному документі "білок, що забруднює").

Нуклеотидні послідовності, що кодують білки даного винаходу, містять у своєму складі послідовність, викладену в 5ЕО ІЮ МО:2, та її варіанти, фрагменти та комплементарні ланцюги.

Під "комплементарною" мають на увазі нуклеотидну послідовність, яка є досить комплементарною даній нуклеотидній послідовності, щоб вона могла гібридизуватися із заданою нуклеотидною послідовністю з утворенням стабільного дуплекса. Відповідні амінокислотні послідовності пестицидних білків, які кодуються даними нуклеотидними послідовностями, викладені в ЗЕО ІЮ МО:3-5.

Молекули нуклеїнових кислот, що являють собою фрагменти даних нуклеотидних послідовностей, які кодують пестицидні білки, також включено у даний винахід. Під "фрагментом" мають на увазі частину нуклеотидної послідовності, яка кодує пестицидний білок.

Фрагмент нуклеотидної послідовності може кодувати біологічно активну частину пестицидного 60 білка, або це може бути фрагмент, який може використовуватися у якості гібридизаційного зонда або ПЛР-праймера із застосуванням способів, які розкрито нижче. Молекули нуклеїнових кислот, які являють собою фрагменти нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний білок, містять щонайменше приблизно 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400 суміжних нуклеотидів, або число нуклеотидів, що досягає числа нуклеотидів, присутніх у нуклеотидній послідовності повної довжини, яка кодує пестицидний білок, розкритий у даному документі, залежно від передбачуваного застосування. Під "суміжними" нуклеотидами мають на увазі нуклеотидні залишки, які безпосередньо прилягають один до одного. Фрагменти нуклеотидних послідовностей даного винаходу будуть кодувати фрагменти білків, які зберігають біологічну активність пестицидного білка і, отже, зберігають пестицидну активність. Таким чином, біологічно-активні фрагменти поліпептидів, розкритих у даному документі, також включені у даний винахід. Під виразом "зберігає активність" мають на увазі, що фрагмент буде мати щонайменше приблизно 3095, щонайменше приблизно 5095, щонайменше приблизно 70905, 8095, 9095, 9595 або більш високу пестицидну активність щодо пестицидного білка. У одному варіанті здійснення пестицидна активність являє собою активність щодо твердокрилих. В іншому варіанті здійснення пестицидна активність являє собою активність щодо лускокрилих. В іншому варіанті здійснення пестицидна активність являє собою активність щодо нематод. В іншому варіанті здійснення пестицидна активність являє собою активність щодо двокрилих. В іншому варіанті здійснення пестицидна активність являє собою активність щодо напівтвердокрилих. Способи вимірювання пестицидної активності добре відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, С7аріа апа Гапд (1990) У. Есоп. Епіотої. 83:2480-2485; Апагемув вї аї. (1988) Віоспет. 9. 252:199-206; Ма!їтопе еї аї. (1985) 9. ої Есопотіс Епіотоїоду 78:290-293; та патент США Мо 5743477, усі з яких включено у даний документ у повному обсязі за допомогою посилання.

Фрагмент нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний білок, який кодує біологічно активну частину білка даного винаходу, буде кодувати щонайменше приблизно 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 суміжних амінокислот, або число амінокислот, величиною до загального числа амінокислот, що присутні у пестицидному білку повної довжини даного винаходу. У деяких варіантах здійснення фрагмент являє собою фрагмент, що утворюється у результаті протеолітичного розщеплення. Наприклад, фрагмент,

Зо що утворюється у результаті протеолітичного розщеплення, може мати М-кінцеве або С-кінцеве відсікання довжиною щонайменше приблизно 100 амінокислот, приблизно 120, приблизно 130, приблизно 140, приблизно 150 або приблизно 160 амінокислот відносно 5ЕО ІЮ МО:3-5. У деяких варіантах здійснення фрагменти, які включено у даний документ, утворені у результаті видалення С-кінцевого домену кристалізації, наприклад, за допомогою протеолізу або за допомогою вставки стоп-кодону у кодуючу послідовність.

Переважні пестицидні білки даного винаходу кодуються нуклеотидною послідовністю, яка є достатньо ідентичною нуклеотидній послідовності 5ЕО ІЮ МО:2, або пестицидні білки є достатньо ідентичними амінокислотній послідовності, викладеній у БЕО ІЮО МО:3-5. Під виразом "досить ідентична" мають на увазі амінокислотну або нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше приблизно 6095 або 6595 ідентичність послідовності, приблизно 7095 або 7595 ідентичність послідовності, приблизно 8095 або 8595 ідентичність послідовності, приблизно 9095, 9195, 9295, 9390, 9495, 9595, 9695, 9790, 9895, 9995 або більш високу ідентичність послідовності у порівнянні з еталонною послідовністю, як показано із застосуванням однієї з програм вирівнювання, описаних у даному документі, із застосуванням стандартних параметрів.

Фахівцеві у даній галузі техніки буде зрозуміло, що ці значення можуть бути відповідним чином скоректовані для визначення відповідної ідентичності білків, які кодуються двома нуклеотидними послідовностями, з урахуванням виродженості кодонів, подібності амінокислот, позиціонування рамки зчитування тощо.

Для визначення відсотка ідентичності двох амінокислотних послідовностей або двох нуклеїнових кислот, послідовності вирівнюють з метою оптимального порівняння. Відсоток ідентичності між двома послідовностями є функцією від числа ідентичних положень, спільних для послідовностей (тобто, відсоток ідентичності - число ідентичних положень/загальне число положень (наприклад положення, що перекриваються) х 100). В одному варіанті здійснення дві послідовності мають однакову довжину. У іншому варіанті здійснення відсоток ідентичності розраховується по усій довжині еталонної послідовності (тобто, послідовності, що розкриваються у даному документі, у якості будь-якої з послідовностей ЗЕО ІЮ МО:3-5).

Відсоток ідентичності між двома послідовностями може бути визначено із застосуванням методик, подібних до тих, які описано нижче, з дозволом або без дозволу гепів. При розрахунках відсотка ідентичності, зазвичай підраховується число точних збігів. Геп, тобто бо положення при вирівнюванні, у якому залишок присутній в одній послідовності, але не в іншій,

розглядається як положення з неідентичними залишками.

Визначення відсотка ідентичності між двома послідовностями можна здійснити з використанням математичного алгоритму. Необмежувальним прикладом математичного алгоритму, використовуваним для порівняння двох послідовностей, є алгоритм за Кагіїп апа

Аїїзсепи! (1990) Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 87:2264, модифіковано як у Кагіїп апа Ак5спи! (1993)

Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 90:5873-5877. Такий алгоритм включено до програми ВІГА5ТМ та

ВІАБТХ за АйЙйбспи! еї а). (1990) 9У. Мої. ВіоІї. 215:403. Пошуки нуклеотидів ВАТ можна здійснювати за допомогою програми ВГА5ТМ, оцінка - 100, довжина слова - 12, для одержання нуклеотидних послідовностей, гомологічних пестицидо-подібним молекулам нуклеїнових кислот даного винаходу. ВГ А5Т-пошуки білків можна здійснювати за допомогою програми ВІАБ5ТХ, оцінка - 50, довжина слова - 3, для одержання амінокислотних послідовностей, гомологічних молекулам пестицидних білків даного винаходу. Для одержання вирівнювань з гепами з метою порівняння можна застосовувати програму Сарреа ВГА5Т (в ВГА5Т 2.0) як описано у Аїї5сопи! єї а!. (1997) Мисівїс Асіа5 Нев. 25:3389. У якості альтернативи можна застосовувати програму РБІ-

Віазії для ітераційного проведення повторного пошуку, який виявляє віддалені зв'язки між молекулами. Див. Ай5спиі еї а!. (1997) зирга. При роботі з програмами ВІ А5Т, Сарреа ВГ АЗТ та

РБІ-Віазї можуть застосовуватися параметри за умовчуванням, встановлені для відповідних програм (наприклад, ВГАЗ5ТХ та ВІ АЗТМ). Вирівнювання можна також проводити вручну шляхом звіряння.

Іншим необмежувальним прикладом математичного алгоритму, використовуваним для порівняння послідовності, є алгоритм СіизіаіМмм (Ніддіп5 еї аї. (1994) Мисівїс Асіаз Кез. 22:4673- 4680). СіІивіаМмуУ порівнює послідовності та вирівнює цілісну амінокислотну або ДНК- послідовність та в такий спосіб може надати дані про консервативність для усієї амінокислотної послідовності. Алгоритм СіІивіагМму застосовується у декількох наявних на ринку пакетах програмного забезпечення для аналізу ДНК/амінокислот, у таких як модуль АГІСМХ, що входить у пакет програм Месіог МТІ (Іпмігодеп Согрогайоп, Карлобад, Каліфорнія). Після вирівнювання амінокислотних послідовностей за допомогою програми СіивіаіМу, може бути оцінений відсоток ідентичності амінокислот. Необмежувальний приклад комп'ютерних програм, які застосовуються для аналізу вирівнювань СіивіїаіМуУ, включає ЗЕМЕВОС м, ЗЕМЕБОС "м (Каїгі Міспоїаз) дозволяє

Зо провести оцінку подібності та ідентичності амінокислот (або ДНК) у численних білків. Іншим необмежувальним прикладом математичного алгоритму, використовуваного для порівняння послідовності, є алгоритм Муегх5 апа МіПег (1988) САВІО5 4:11-17. Такий алгоритм, інтегрований у програму АГІСМ (мегвіоп 2.0), яка є частиною пакета програм СО Умізсопвіп сСепеїййс5, Мегвіоп 10 (можна придбати у Ассеїгув, Іпс., 9685 5сгапіоп Ка., Сан-Дієго, Каліфорнія, США). При роботі з програмою АСОМ для порівняння амінокислотних послідовностей можна використовувати таблицю замін залишків РАМ120, штраф за продовження гепа, що дорівнює 12, та штраф за відкриття гепа, що дорівнює 4.

Якщо не зазначено інше, програма САР Мегзіоп 10, яка використовує алгоритм за

Меєдієтап апа УУипвсй (1970) 9. Мої. Віої. 48(3):443-453, буде використовуватися для того, щоб визначити ідентичність або подібність послідовностей із застосуванням наступних параметрів:

Фо ідентичності та 95 подібності для нуклеотидної послідовності із застосуванням штрафу за відкриття гепа, рівного 50 та штрафу за продовження, рівного 3, та матриці ваг вирівнювання пм/уздарапа.стр; 95 ідентичності або 95 подібності для амінокислотної послідовності із застосуванням штрафу за відкриття гепа, рівного 8, і штрафу за продовження, рівного 2, та програми підрахунку балів В ОЗИМБб2. Також можуть використовуватися еквівалентні програми.

Під "еквівалентною програмою" мають на увазі кожну програму для порівняння послідовностей, яка для будь-яких двох порівнюваних послідовностей створює вирівнювання, що має ідентичні збіги нуклеотидних залишків та ідентичний відсоток ідентичності послідовностей у порівнянні з відповідним вирівнюванням, отриманим з використанням САР Мегзіоп 10.

Даний винахід також охоплює варіанти молекул нуклеїнових кислот. "Варіанти" нуклеотидних послідовностей, що кодують пестицидні білки, включають ті послідовності, які кодують пестицидні білки, що розкриваються у даному документі, але які різняться консервативно у зв'язку з виродженістю генетичного коду, а також ті послідовності, які Є досить ідентичними, як обговорювалося вище. Алельні варіанти, що виникають у природних умовах, можуть бути ідентифіковані із застосуванням добре відомих молекулярно-біологічних методик, таких як методики полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та гібридизації, які описані нижче.

Варіанти нуклеотидних послідовностей також включають отримані синтетичним шляхом нуклеотидні послідовності, які були створені, наприклад, із застосуванням сайт-специфічного мутагенезу, але які ще кодують пестицидні білки, що розкриваються у даному документі, як 60 обговорюється нижче. Варіанти білків, які включені у даний винахід, є біологічно активними, що означає, що вони продовжують проявляти необхідну біологічну активність нативного білка, тобто, пестицидну активність. Під виразом "зберігає активність" мають на увазі, що варіант буде мати щонайменше приблизно 3095, щонайменше приблизно 5095, щонайменше приблизно 7095 або щонайменше приблизно 8095 пестицидної активності нативного білка. Способи визначення пестицидної активності добре відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, С7аріа апа І апд (1990) У. Есоп. Епіотої. 83:2480-2485; Апагемух 6вї аї. (1988) Віоспет. 9. 252:199-206; Маїтопе єї а!. (1985) 9. ої Есопотіс ЕпіотоїЇоду 78:290-293; та патент США Мо 5743477, усі з яких включені у даний документ у повному обсязі за допомогою посилання.

Досвідченому фахівцю також буде зрозуміло, що зміни можуть бути введені за рахунок мутацій нуклеотидних послідовностей даного винаходу, що тим самим приведе до змін в амінокислотній послідовності, що кодує пестицидні білки, не змінюючи біологічну активність білків. Отже, варіанти виділених молекул нуклеїнових кислот можуть бути створені шляхом введення однієї або декількох нуклеотидних замін, вставок або делецій у відповідну нуклеотидну послідовність, що розкривається у даному документі, таким чином, щоб одна або декілька замін, вставок або делецій амінокислот були введені у кодований білок. Мутації можуть бути введені із застосуванням стандартних методик, таких як сайт-специфічний мутагенез та

ПЛР-опосередкований мутагенез. Такі варіанти нуклеотидних послідовностей також включені у даний винахід.

Наприклад, консервативні амінокислотні заміни можуть бути здійснені у одному або декількох, передбачених, замінних амінокислотних залишках. "Замінний" амінокислотний залишок являє собою залишок, який може бути змінений у послідовності дикого типу пестицидного білка без змінення біологічної активності, тоді як "незамінний" амінокислотний залишок необхідний для здійснення біологічної активності. "Консервативна амінокислотна заміна" є такою, при якій амінокислотний залишок заміняється амінокислотним залишком, що має подібний бічний ланцюг. Родини амінокислотних залишків, що мають подібні бічні ланцюги, були визначені у даній галузі техніки. Дані родини включають амінокислоти з основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотними бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланин, метіонін, триптофан), бета-розгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) та ароматичними бічними ланцюгами (наприклад, тірозин, фенілаланин, триптофан, гістидин).

Дельта-ендотоксини, як правило, мають п'ять консервативних доменів послідовностей та три консервативні структурні домени (див., наприклад, Зе Маада еї аї. (2001) Тгтепаз Сепеїйсв5 17:1193-199). Перший консервативний структурний домен містить сім альфа-спіралей та зв'язаний із вбудовуванням у мембрану та пороутворенням. Домен ІІ складається із трьох складчастих бета-шарів, які упорядковані в структурі грецького ключа, а домен ЇІЇ складається з двох анти-паралельних складчастих бета-шарів у структурі типу "|їеПу-тої!" (ае Маадоа еї аї., 2001, зирга). Домени ІІ ії ПІ беруть участь у розпізнаванні та зв'язуванні рецепторів і, отже, вважаються детермінантами специфічності токсину.

Амінокислотні заміни можуть бути здійснені в неконсервативних ділянках, які зберігають функцію. Загалом, такі заміни не здійснюють для консервативних амінокислотних залишків, або для амінокислотних залишків, що перебувають усередині консервативного мотиву, де такі залишки є незамінними для активності білка. Приклади залишків, які є консервативними та які можуть бути незамінні для активності білка, включають, наприклад, залишки, які є ідентичними для усіх білків, включених у вирівнювання послідовностей подібних або споріднених токсинів щодо послідовності даного винаходу (наприклад, залишки, які ідентичні при вирівнюванні гомологічних білків). Приклади залишків, які є консервативними, але які можуть дозволяти консервативні амінокислотні заміни і при цьому зберігати активність, включають, наприклад, залишки які мають тільки консервативні заміни для усіх білків, включених у вирівнювання послідовностей подібних або споріднених токсинів щодо послідовності даного винаходу (наприклад, залишки, які мають тільки консервативні заміни для усіх включених у вирівнювання гомологічних білків). Однак фахівцеві у даній галузі техніки буде зрозуміло, що функціональні варіанти можуть мати незначні консервативні або неконсервативні альтерації у консервативних залишках.

У якості альтернативи, варіанти нуклеотидних послідовностей можуть бути отримані шляхом введення випадкових мутацій протягом усієї або частини кодуючої послідовності, як наприклад, із застосуванням насичувального мутагенезу, та отримані у результаті мутанти можуть бути піддані скринінгу щодо їх здатності забезпечувати пестицидну активність для бо виявлення мутантів, що зберігають активність. Після мутагенезу білок, що кодується, може експресуватися рекомбінантно, а активність цього білка можна визначити з використання стандартних методик аналізу.

Із застосуванням таких способів як ПЛР, гібридизація тощо можна ідентифікувати відповідні пестицидні послідовності, такі послідовності, які мають значну ідентичність до послідовності даного винаходу. Див., наприклад, Затргоок апа Киззеї! (2001) МоїІесшціаг Сіопіпу: А Гарогайогу

Мапциаї!. (Соїа бргіпд Нагбог І арогафогу Ргез5, Соїд Зргіпд Нагрог, МУ) та Іппів, єї а). (1990) РСВ

Ргогосо!5: А цідае о Меїтпод5 апа Арріїсайопз5 (Асадетіс Ргев5, МУ).

При використанні способу гібридизації вся пестицидна нуклеотидна послідовність або її частина можуть використовуватися для скринінгу КДНК або геномних бібліотек. Способи конструювання такої кКДНК та геномних бібліотек загалом відомі у даній галузі техніки та розкриті у Затргоок апа КиззеїЇї, 2001, вирга. У якості так званих гібридизаційних зондів можуть виступати фрагменти геномної ДНК, фрагменти кКДНК, фрагменти РНК або інші олігонуклеотиди, та вони можуть бути мічені групою,що детектується, такою як З2Р, або будь-яким іншим маркером,що детектується, таким як інші радіоактивні ізотопи, флуоресцентна сполука, фермент або кофактор ферменту. Зонди для гібридизації можуть бути отримані шляхом введення мітки у синтетичні олігонуклеотиди на основі відомої нуклеотидної послідовності, яка кодує пестицидний білок, що розкривається у даному документі. Додатково можуть використовуватися вироджені праймери, сконструйовані на основі консервативних нуклеотидів або амінокислотних залишків у нуклеотидній послідовності або кодованій амінокислотній послідовності. Зонд, зазвичай, містить ділянку нуклеотидної послідовності, яка гібридизується у жорстких умовах із щонайменше приблизно 12, щонайменше приблизно 25, щонайменше приблизно 50, 75, 100, 125, 150, 175 або 200 послідовними нуклеотидами нуклеотидної послідовності, яка кодує пестицидний білок даного винаходу або його фрагмент або варіант.

Способи одержання зондів для гібридизації загалом відомі у даній галузі техніки і розкриті у зЗатьгоокК апа Виззеї, 2001, зирга, включено у даному документі за допомогою посилання.

Наприклад, ціла послідовність, що визначає пестицидну активність, яка розкривається у даному документі, або одна або декілька її частин можуть використовуватися у якості зонда, здатного до специфічної гібридизації з відповідними пестицидними білок-подібними послідовностями та молекулами інформаційних РНК. Для досягнення специфічної гібридизації

Зо за різних умов, такі зонди містять послідовності, які є унікальними та переважно мають у довжину щонайменше приблизно 10 нуклеотидів або щонайменше приблизно 20 нуклеотидів.

Такі зонди можуть використовуватися для ампліфікації відповідних пестицидних послідовностей з вибраного організму за допомогою ПЛР. Дану методику можна застосовувати для виділення додаткових кодуючих послідовностей з необхідного організму або у якості діагностичного аналізу для визначення присутності кодуючої послідовності у організмі. Методики гібридизації включають гібридизаційний скринінг висіяних на чашки бібліотек ДНК (у вигляді бляшок або колоній; див., наприклад, затьгоок еї аї!. (1989) МоїІесшаг Сіопіпд: А Гарогагу Мапаиаї! (2а еад.,

Со 5ргіпд Нагброг І арогафогу Ргез5, Соїй 5ргіпд Нагрог, Мем/ МогК).

Таким чином, даний винахід охоплює зонди для гібридизації а також нуклеотидні послідовності, що здатні до гібридизації усієї або частини нуклеотидної послідовності даного винаходу (наприклад, довжиною щонайменше приблизно 300 нуклеотидів, щонайменше приблизно 400, щонайменше приблизно 500, 1000, 1200, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 або нуклеотидні послідовності повної довжини, що розкривається у даному документі). Гібридизація таких послідовностей може здійснюватися у жорстких умовах. Під виразом "жорсткі умови" або "жорсткі умови гібридизації" мають на увазі умови, за яких зонд буде гібридизуватися із своєю цільовою послідовністю до більш високого ступеня, який можна детектувати, ніж з іншими послідовностями (наприклад, щонайменше у 2 рази вище фонового рівня). Жорсткі умови залежать від послідовності та будуть різнитися за різних обставин. Контролюванням жорсткості умов гібридизації та/або відмивання можуть бути ідентифіковані цільові послідовності, які на 10095 комплементарні зонду (гомологічне зондування). У якості альтернативи, умови жорсткості можуть бути скоректовані для надання можливості виникнення невідповідності у послідовності для того, щоб більш низькі ступені подібності можна було детектувати (гетерологічне зондування). Загалом, зонд має довжину менше приблизно 1000 нуклеотидів, переважно менше 500 нуклеотидів.

Як правило, жорсткими умовами будуть такі, за яких концентрація солей становить менше приблизно 1,5 М іонів Ма, зазвичай, від приблизно 0,01 до 1,0 М іонів Ма (або інших солей) при

РН від 7,0 до 8,3, а температура становить щонайменше приблизно 30"С для коротких зондів (наприклад, від 10 до 50 нуклеотидів) та щонайменше приблизно 60"С для довгих зондів (наприклад, більше 50 нуклеотидів). Жорстких умов можна також досягти додаванням засобів, бо що дестабілізують, таких як формамід. Ілюстративні умови низької жорсткості включають гібридизацію з буферним розчином, що містить від 30 до 3595 формаміду, 1 М Масі, 195 505 (додецилсульфат натрію) при 37"С, та відмивання в 55(С від 1Х до 2Х (20Х 5502-30 М

МмМасі/0,3 М тринатрійцитрат) при 50 до 55"С. Ілюстративні умови середньої жорсткості включають гібридизацію з розчином, що містить від 40 до 4595 формаміду, 1,0 М масі, 195 505 при 37"С, та відмивання в 55С від 0,5Х до 1Х 55С при 55 до 60"С. Типові умови високої жорсткості включають гібридизацію з розчином, що містить 5095 формаміду, 1 М Масі, 195 505 при температурі 37"С, та відмивання в 0,1Х 55С при 60 до 65"С. Необов'язково, буфери для відмивання можуть містити від приблизно 0,195 до приблизно 195 505. Тривалість гібридизації становить загалом менше приблизно 24 годин, зазвичай, від приблизно 4 до приблизно 12 годин.

Специфічність, як правило, залежить від постгібридизаційних відмивань, при яких найбільш важливими факторами є іонна сила та температура кінцевого розчину для відмивання. Для

ДНКЕ-ДНК гібридів, значення Тт може бути апроксимовано з рівняння МеїпКоїй апа Умапйі (1984)

Апаї. Віоспет. 138:267-284: Ти - 81,57 ж 16,6 (09 М) ж 0,41 (дос) - 0,61 (95 тогт) - БО0/Л ; де М - молярність моновалентних катіонів, У003С - процентний вміст гуанозинових та цитозинових нуклеотидів ДНК, 95 Топт - це процентний вміст формаміду у розчині для гібридизації, а Ї. - довжина гібрида у парі основ. Тт - температура (при заданій іонній силі та рН), при якій 5095 комплементарної цільової послідовності гібридизується з ідеально відповідним зондом. Тт знижується приблизно на 17"С при невідповідності на кожний 195; таким чином, Тт, умови гіоридизації та/"або відмивання можуть бути скоректовані для гібридизації з послідовностями необхідної ідентичності. Наприклад, при проведенні пошуку послідовностей з 29095 ідентичністю, Тт може бути знижена на 10"С. Загалом, жорсткі умови вибирають таким чином, щоб температура була приблизно на 5"С нижче температури плавлення (Тт) для специфічної послідовності та комплементарному їй ланцюгові при заданих значеннях іонної сили та рн.

Однак дуже жорсткі умови можуть використовувати гібридизацію та/або відмивання при температурі на 1, 2, З або 4"С нижче температури плавлення (Тт); умови середньої жорсткості можуть використовувати гібридизацію та/або відмивання при температурі на 6, 7, 8, 9 або 107С нижче температури плавлення (Тт); умови низької жорсткості можуть використовувати гібридизацію та/або відмивання при температурі на 11, 12, 13, 14, 15 або 20"С нижче

Зо температури плавлення (Тт). Із застосуванням рівняння, композицій для гібридизації та відмивання та необхідної Тя середньому фахівцеві у даній галузі техніки буде зрозуміло, що варіації у жорсткості розчинів для гібридизації та/або відмивання, за своєю суттю, описані. Якщо необхідний ступінь невідповідності приводить до Тт менше 45"С (водний розчин) або 32" (розчин формаміду), то переважним є підвищення концентрації 55С для того, щоб могла використовуватися більш висока температура. Детальний посібник з гібридизації нуклеїнових кислот наведено у Ті)ї55еп (1993) І арогаюгу Тесппідцев5 іп Віоспетізігу апа Моїесшціаг Віоїоду-

Нубгіаігайоп м/йп Мисіеєїс Асіа Ргобев, Рагі І, Спарієг 2 (ЕІбемівег, Мем МогК); та А!,зибеї еї аї., єдв. (1995) Сигтепі Ргоосої5 іп МоїІесціаг Віоіоду, Спаріег 2 (ОСгеєпе Рибіїзпіпуд апа Уміеу-Іпіегзсіепсе,

Мем уогКк). Див. затьгоок еї а!. (1989) МоїІесшаг СіІопіпд: А Гарогаюгу Мапаиаї (249 єа., Соїа Зргіпд

Нагброг І арогаїогу Ргез5, Соїй Зргіпд Нагбог, Мем/ УогкК).

Виділені білки та їх фрагменти

Пестицидні білки також охоплено у даному винаході. Під "пестицидним білком" мають на увазі білок, що має амінокислотну послідовність, викладену в ЗЕО ІЮ МО:3-5. Їх фрагменти, біологічно активні частини та варіанти також представлені і можуть використовуватися для здійснення на практиці способів даного винаходу. "Виділений білок" або "рекомбінантний білок" застосовують щодо білка, який більше не перебуває у природних умовах, а перебуває, наприклад, у системі іп міго або у рекомбінантній бактеріальній або рослинній клітині-хазяїні. "Фрагменти" або "біологічно активні частини" містять фрагменти поліпептиду, який містить амінокислотні послідовності, що достатньо ідентичні амінокислотній послідовності, викладеній в

ЗБО ІЮ МО:3-5, і які проявляють пестицидну активність. Біологічно активною частиною пестицидного білка може бути поліпептид довжиною, наприклад, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 00, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 або більше амінокислот. Такі біологічно активні частини можуть бути отримані з використанням рекомбінантних методик та оцінені щодо пестицидної активності. Способи визначення пестицидної активності добре відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, С7аріа апа Гапд (1990) У. Есоп. Епютої. 83:2480-2485; Апагемув5 єї аї. (1988) Віоспет. 9. 252:199-206;

Ма!топе есеї а!. (1985) 9. ої Есопотіс Епіотоіоду 78:290-293; та патент США Мо 5743477, усі з яких включено у даний документ у повному обсязі за допомогою посилання. Як використовується у даному документі, фрагмент містить щонайменше 8 суміжних амінокислот з БЕО ІЮО МО:3-5. бо Разом з тим, даний винахід охоплює інші фрагменти, такі як будь-який фрагмент у білку,

довжиною більше приблизно 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 або більше амінокислот.

Під "варіантами" мають на увазі білки або поліпептиди, що мають амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 6095, 6595, приблизно на 7095, 7595, приблизно на 8095, 8595, приблизно на 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895 або 9995 ідентична амінокислотній послідовності будь-якій з БО 10 МО:3-5. Варіанти також включають поліпептиди, які кодуються молекулою нуклеїнової кислоти, що гібридизується з молекулою нуклеїнової кислоти з ЗЕО ІЮ МО:2 або комплементарному їй ланцюгом, у жорстких умовах.

Варіанти включають поліпептиди, які різняться амінокислотними послідовностями у результаті мутагенезу. Варіанти білків, які охоплені у даному винаході, є біологічно активними, тобто вони продовжують мати необхідну біологічну активність нативного білка, тобто, зберігають пестицидну активність. У деяких варіантах здійснення варіанти мають покращену активність щодо нативного білка. Способи визначення пестицидної активності добре відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, С7аріа апа Гапд (1990) У. Есоп. Епіотої. 83:2480-2485; Апагемув вї аї. (1988) Віоспет. 9. 252:199-206; Ма!їтопе еї аї. (1985) 9. ої Есопотіс Епіотоїоду 78:290-293; та патент США Мо 5743477, усі з яких включені у даний документ у повному обсязі за допомогою посилання.

Бактеріальні гени, такі як гени ахті даного винаходу, доволі часто мають декілька метіонінових ініціаторних кодонів, розташованих поблизу початку відкритої рамки зчитування.

Часто ініціація трансляції у одному або декількох з даних стартових кодонів буде приводити до утворення функціонального білка. Дані стартові кодони можуть мати у своєму складі АТО- кодони. Однак бактерії, такі як Васійй5 5р., також розпізнають кодон СТО у якості стартового кодону, та білки, які ініціюють трансляцію в (ТО-кодонах, містять метіонін як першу амінокислоту. У рідких випадках трансляція у бактеріальних системах може починатися у ТТО- кодоні, хоча у цьому випадку ТО кодує метіонін. Крім того, часто з самого початку не визначено, які з даних кодонів використовуються у природних умовах у бактерії. Таким чином, зрозуміло, що застосування одного з альтернативних метіонінових кодонів може також приводити до утворення пестицидних білків. Дані пестицидні білки охоплені у даному винаході

Зо та можуть застосовуватися у способах даного винаходу. Буде зрозуміло, що за експресії у рослинах, необхідно буде змінити альтернативний стартовий кодон на АТО для проходження трансляції відповідним чином.

У різних варіантах здійснення даного винаходу пестицидні білки містять послідовності, виведені від нуклеотидних послідовностей повної довжини, що розкриваються у даному документі, та амінокислотні послідовності, які коротше послідовностей повної довжини за рахунок використання розташованої нижче альтернативної ділянки початку трансляції. Таким чином, нуклеотидна послідовність даного винаходу та/або вектори, клітини-хазяїни і рослини, що містять нуклеотидну послідовність даного винаходу (і способи одержання та застосування нуклеотидної послідовності згідно з даним винаходом), можуть містити нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність, що відповідає залишкам 20-687 з 5ЕО ІЮ

МО:З (викладеним в 5ЕО ІЮ МО:4) або залишкам 22-687 з 5ЕО ІЮО МО:З (викладеним в 5ЕО ІЮ

МО:5).

Також охоплено антитіла до поліпептидів даного винаходу або до їх варіантів або фрагментів. Способи одержання антитіл добре відомі у даній галузі техніки (див., наприклад,

Напом апа ІГапе (1988) Апііроаіе5: А І арогаїогу МапиаїЇ, Соїй Зргіпд Нагбог І арогафогу, Соїй зргіпд Нагбог, МУ; патент США Мо 4196265).

Таким чином, один аспект даного винаходу стосується антитіл, одноланцюгових молекул, що зв'язують антиген, або інших білків, які специфічно зв'язуються з одним або декількома білками або пептидними молекулами даного винаходу та їх гомологами, гібридами або фрагментами. В особливо переважному варіанті здійснення антитіло специфічно зв'язується з білком, що має амінокислотну послідовність, викладену в ЗЕО ІЮ МО:3, 4 або 5, або її фрагмент. В іншому варіанті здійснення антитіло специфічно зв'язується з гібридним білком, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з амінокислотної послідовності, викладеної в ЗЕО

ІО МО:3, 4 або 5, або її фрагмент.

Антитіла даного винаходу можуть застосовуватися для кількісного або якісного визначення вмісту білка або пептидної молекули даного винаходу, або детекції посттрансляційних модифікацій білків. Як використовується у даному документі, про антитіло або пептид кажуть, що вони "специфічно зв'язуються" з молекулою білка або пептиду даного винаходу, якщо таке зв'язування не повністю інгібується присутністю неспоріднених молекул. 60 Змінені або покращені варіанти

Відомо, що послідовності ДНК пестицидного білка можуть бути змінені з використанням різних способів, а також, що ці альтерації можуть привести до утворення послідовності ДНК, яка кодує білки з амінокислотними послідовностями, що відрізняються від тих, які кодують пестицидні білки згідно з даним винаходом. Даний білок може бути змінений різними способами, у тому числі амінокислотні заміни, делеції, відсікання та вставки однієї або декількох амінокислотних послідовностей з 5ЕО ІЮ МО:3-5, включаючи до приблизно 2, приблизно 3, приблизно 4, приблизно 5, приблизно 6, приблизно 7, приблизно 8, приблизно 9, приблизно 10, приблизно 15, приблизно 20, приблизно 25, приблизно 30, приблизно 35, приблизно 40, приблизно 45, приблизно 50, приблизно 55, приблизно 60, приблизно 65, приблизно 70, приблизно 75, приблизно 80, приблизно 85, приблизно 90, приблизно 100, приблизно 105, приблизно 110, приблизно 115, приблизно 120, приблизно 125, приблизно 130, приблизно 135, приблизно 140, приблизно 145, приблизно 150, приблизно 155 або більш амінокислотних замін, делецій або вставок. Способи проведення таких маніпуляцій загалом відомі у даній галузі техніки. Наприклад, варіанти амінокислотної послідовності пестицидного білка можуть бути отримані із застосуванням мутацій у ДНК. Це може також бути досягнуто із застосуванням одного з декількох різновидів мутагенезу талабо шляхом спрямованого розвитку. У деяких аспектах зміни, що кодуються амінокислотними послідовностями, не будуть суттєво впливати на функцію білка. Такі варіанти будують мати необхідну пестицидну активність. Однак зрозуміло, що здатність пестицидного білка забезпечувати пестицидну активність може бути покращена шляхом застосування таких методик щодо композицій даного винаходу. Наприклад, можна експресувати пестицидний білок у клітинах-хазяїнах, які проявляють високі рівні Помилок вбудовування основ при реплікації ДНК, такі як ХІ-1 Кей (5ігаїадепе, Ла-Холла, Каліфорнія).

Після розмноження в таких штамах можна виділити ДНК (наприклад, шляхом одержання плазмідної ДНК або шляхом ампліфікування за допомогою ПЛР та клонування отриманого у результаті ПЛ;-фрагмента у векторі), провести культивування пестицидного білка з мутаціями у немутагенному штамі, та ідентифікувати гени з пестицидною активністю, що зазнали мутації, наприклад шляхом проведення аналізу для дослідження пестицидної активності. Загалом, білок змішується і застосовується в аналізах із згодовуванням. Див., наприклад Магтгопе еї аї!. (1985) у. ої Есопотіс Епіотоїоду 78:290-293. Такі аналізи можуть включати приведення рослини в контакт з одним або декількома шкідниками та визначення здатності рослини до виживання та/або здатності викликати загибель шкідників. Приклади мутацій, які приводять до підвищення токсичності, вказані в Зсппері еї а!. (1998) Місгобіої. Мої. ВіоїЇ. Кем. 62:775-806.

У якості альтернативи, можуть бути введені альтерації у послідовність багатьох білків у аміно-або карбокси-кінцях, не справляючи при цьому істотного впливу на активність. Такі зміни можуть включати вставки, делеції або зміни, індуковані застосуванням сучасних молекулярних способів, таких як ПЛР, у тому числі ПЛР-ампліфікації, які змінюють або подовжують послідовність, що кодує білок, за рахунок вставок послідовностей, що кодують амінокислоти, в олігонуклеотиди, використовувані в ПЛР-ампліфікації. У якості альтернативи, додані послідовності білків можуть містити цілі послідовності, що кодують білок, такі як ті, які зазвичай застосовуються у даній галузі техніки для одержання гібридних білків. Такі гібридні білки часто використовують для (1) підвищення експресії білка, що представляє інтерес, (2) введення домена зв'язування, ферментативної активності або епітопа для того, щоб полегшити очищення білка, детектування білка або для інших експериментальних застосувань, відомих у даній галузі техніки, (3) спрямовування секреції або трансляції білка в субклітинну органеллу, таку як периплазматичний простір грамнегативних бактерій, ендоплазматичний ретикулум еукаріотичних клітин, при цьому останнє часто приводить до глікозілювання білка.

Варіанти нуклеотидних та амінокислотних послідовностей даного винаходу також охоплюють послідовності, отримані із застосуванням процедур, що приводять до рекомбінації, і викликають утворення мутацій, таких як перестановка в ДНК. При виконанні такої методики можуть використовуватися одна або декілька різних ділянок, що кодують пестицидні білки, для створення нового пестицидного білка, що має необхідні властивості. Таким чином, бібліотеки рекомбінантних полінуклеотидів створюють з популяції споріднених послідовностей полінуклеотидів, які містять ділянки послідовності, що мають суттєві ідентичності та можуть бути гомологічно рекомбіновані іп міго або іп мімо. Наприклад, при застосуванні даного підходу мотиви послідовностей, що кодують домен, який представляє інтерес, можуть бути піддані перестановці між геном за даним винаходом, що визначає пестицидну активність, та іншими відомими генами, що визначають пестицидну активність, для одержання нового гена, який кодує послідовність білка, що представляє інтерес, з покращеною властивістю, як, наприклад, з підвищеною інсектицидною активністю. Стратегії такої перестановки в ДНК відомі у даній галузі

Ге) техніки. Див., наприклад, біеттег (1994) Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 91:10747-10751; біеттег

(1994) Маїште 370:389-391; Статеті єї а. (1997) Маїиге Віоїесп. 15:436-438; Мооге 6ї аї!. (1997) У.

МОЇ. Вісі. 272:336-347; 7папаод еї а. (1997) Ргос. Май. Асай. 5сі. ОБА 94:4504-4509; Статегі еї а. (1998) Майшге 391:288-291; та патенти США МоМо 5605793 та 5837458.

Переміщення або перестановка доменів є ще одним механізмом створення змінених пестицидних білків. Домени можна переміщати між пестицидними білками, що приводить до утворення гібридних або хімерних токсинів з покращеною пестицидною активністю або різними цільовими характеристиками. Способи створення рекомбінантних білків та їх дослідження щодо пестицидної активності добре відомі у даній галузі техніки (див., наприклад, Маїтом еї аї. (2001)

Аррі. Епмігоп. Місгобіо!. 67:5328-5330; де Маада еї аї. (1996) Аррі. Епмігоп. Місгоріої. 62:1537- 1543; Се єї аї. (1991) 9. Віої. Спет. 266:17954-17958; 5сипері єї аІ. (1990) 9. ВіоЇ. Спет. 265:20923-20930; Напа евї аї. (1999) Аррі. Епмігоп. Місгобіо!. 65:2918-2925).

Вектори

Послідовність даного винаходу, яка визначає пестицидну активність, може бути представлена в експресійній касеті для експресії у рослині, що представляє інтерес. Під "рослинною експресійною касетою" мають на увазі ДНК-конструкт, який здатний приводити до експресії білка з відкритої рамки зчитування у клітині рослини. Зазвичай вони містять промотор та кодуючу послідовність. Часто такі конструкти будують також містити 3'-нетрансльовану ділянку. Такі конструкти можуть містити "сигнальну послідовність" або "лідерну послідовність" для полегшення котрансляційного або посттрансляційного транспорту пептиду до певних внутрішньоклітинних структур, таких як хлоропласт (або інша пластида), ендоплазматичний ретикулум або комплекс Гольджі.

Під "сигнальною послідовністю" мають на увазі послідовність, для якої відомо або передбачається, що вона приводить до котрансляційного або посттрансляційного транспорту пептидів через клітинну мембрану. У еукаріот вона зазвичай пов'язана з секрецією у апараті

Гольджі з деяким у результаті глікозілюванням. Інсектицидні токсини бактерій часто синтезуються у якості протоксинів, які протеолітично активуються у кишечнику цільової комахи (Спапд (1987) Мештоадв Епгутої. 153:507-516). У деяких варіантах здійснення даного винаходу сигнальна послідовність локалізована у нативній послідовності, або може бути отримана з послідовності даного винаходу. Під "лідерною послідовністю" мають на увазі будь-яку послідовність, яка при трансляції приводить до утворення амінокислотної послідовності, достатньої для запуску котрансляційного транспорту пептидного ланцюга до субклітинної органели. Таким чином, лідерні послідовності містять у своєму складі лідерні послідовності, що виявляють спрямований вплив на транспорт та/або глікозілювання за рахунок проходження в ендоплазматичний ретикулум, проходження у вакуолі, пластиди, у тому числі хлоропласти, мітохондрії та їм подібні.

Під "рослинним трансформаційним вектором" мають на увазі молекулу ДНК, яка необхідна для ефективної трансформації клітини рослини. Така молекула може містити одну або декілька рослинних експресійних касет та може бути організованою у більше ніж одну "векторну" молекулу ДНК. Наприклад, бінарні вектори являють собою рослинні трансформаційні вектори, які використовують два несуміжних ДНК-вектори для кодування усіх необхідних функцій з активністю в цис- та транс-положеннях для трансформації рослинних клітин (НейПеп5 апа

Миїйпеацйх (2000) Тгепаз іп Ріапі Зсіепсе 5:446-451). Вираз "вектор" відноситься до конструкта нуклеїнової кислоти, призначеного для переносу між різними хазяїнами. "Експресійним вектором" називається вектор, який має здатність вводити, інтегрувати та експресувати послідовності гетерологічної ДНК або її фрагменти у чужорідній клітині. Касета буде мати у своєму складі 5' та/або 3' регуляторні послідовності, функціонально зв'язані з послідовністю даного винаходу. Під "функціонально зв'язаним" мають на увазі функціональний зв'язок між послідовністю промотору та другою послідовністю, де послідовність промотору ініціює і опосередковує транскрипцію послідовності ДНК, відповідної другій послідовності. Загалом, вираз "функціонально зв'язаний" означає, що зв'язані нуклеотидні послідовності є суміжними і, У тих випадках, коли необхідно об'єднати дві ділянки, що кодують білок, вони є суміжними та перебувають в одній і тій же рамці зчитування. Касета може додатково містити щонайменше один додатковий ген, що підлягає котрансформації у організм. У якості альтернативи, додатковий ген(и) забезпечують за допомогою численних експресійних касет.

У різних варіантах здійснення нуклеотидна послідовність даного винаходу є функціонально зв'язаною з промотором, наприклад, з рослинним промотором. "Промотором" називається нуклеотидна послідовність, функція якої полягає у керуванні транскрипцією нижче розташованої кодуючої послідовності. Промотор разом з іншими транскрипційними та трансляційними регуляторними нуклеотидними послідовностями (які також називаються "контрольними 60 послідовностями") необхідні для експресії послідовності ДНК, що представляє інтерес.

Така експресійна касета забезпечується численними ділянками рестрикції для вставки послідовності, яка забезпечує пестицидну активність, що підлягає транскрипційній регуляції регуляторними ділянками.

Експресійна касета буде мати у своєму складі в 5-3" напрямку транскрипції ділянку ініціації транскрипції і трансляції (тобто, промотор), ДНК-послідовність даного винаходу та ділянку термінації трансляції і транскрипції (тобто, ділянка термінації), що функціонує у рослині.

Промотор може бути нативним або аналогічним, або може бути чужорідним або гетерологічним щодо рослини-хазяїна та/або щодо послідовності ДНК даного винаходу. Додатково, промотор може являти собою природну послідовність або, у якості альтернативи, синтетичну послідовність. Там, де промотор є "нативним" або "гомологічним" щодо рослини-хазяїна, мають на увазі, що промотор виявляють у нативній рослині, у яку цей промотор вводять. Там, де промотор є "чужорідним" або "гетерологічним" щодо послідовності ДНК даного винаходу, мають на увазі, що промотор не є нативним або є таким, що виникає у природних умовах, для функціонально зв'язаної послідовності ДНК даного винаходу.

Ділянка термінації може бути нативною з ділянкою ініціації транскрипції, може бути нативною з функціонально зв'язаною послідовністю ДНК, що представляє інтерес, може бути нативною з рослиною-хазяїном, або може бути отримана з іншого джерела (тобто, чужорідного або гетерологічного щодо промотору, послідовності ДНК, що представляє інтерес, рослини- хазяїна або будь-якої їх комбінації). Придатні ділянки термінації можуть бути отримані з Ті- плазміди А. ішптегасіеп5, такі як ділянки термінації октопінсинтази та нопалінсинтази. Див. також

Спегіпеаи еї аї. (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 262:141-144; Ргоцагоої (1991) Сеї! 64:671-674; Ззапіасоп еї аі. (1991) Сепе5 Ювєум. 5:141-149; Модеп вї а). (1990) Ріапі Сеї!І 2:1261-1272; Мипговє вї аї. (1990)

Сепе 91:151-158; ВаїІаз евї а!. (1989) Мисівїс Асіаз Кев. 17:7891-7903; та довпі еї аї. (1987) Мисівїс

Асіа Кез. 15:9627-9639.

У необхідних випадках ген(и) можуть бути оптимізовані для підвищення експресії у трансформованій клітині-хазяїні. Таким чином, гени можуть бути синтезовані з використанням переважних для клітини-хазяїна кодонів для покращення експресії, або можуть бути синтезовані з використанням кодонів за частоти використання кодонів, переважних для хазяїна. У цілому, вміст ОС у гені підвищиться. Див., наприклад, Сатрреї!Ї апа Сом/гі (1990) Ріапі Рпузіої. 92:1-11,

Зо де обговорюється застосування переважних для хазяїна кодонів. У даній галузі техніки існують способи синтезу переважних для рослини генів. Див., наприклад, патенти США МоМо 5380831 та 5436391, публікацію патенту США Мо 20090137409 та Мигау єї аї. (1989) Мисіеїс Асід5 Кезв. 17:477-498, які включено у даний документ за допомогою посилання.

У одному варіанті здійснення пестицидний білок спрямовують у хлоропласт для експресії.

Таким чином, у тих випадках, де пестицидний білок не вводиться безпосередньо в хлоропласт, експресійна касета буде додатково містити нуклеїнову кислоту, що кодує транзитний пептид, який спрямовує пестицидний білок у хлоропласти. Такі транзитні пептиди відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, Моп Неї)пе еї аї. (1991) Ріапі Мої. Віо!. Кер. 9:104-126; СіагК єї а!. (1989)

У. Віої. Спет. 264:17544-17550; РеМПа-Сіорра єї а! (1987) Ріапі Рпузіої. 84:965-968; Нотег еї аї. (1993) Віоспет. Віорпуз. Ке5. Соттип. 196:1414-1421; та пап єї а!. (1986) 5сіеєпсе 233:478-481.

Ген, що визначає пестицидну активність, який повинен бути спрямований у хлоропласт, може бути оптимізований для експресії у хлоропласті для обліку відмінностей між ядром рослини і даної органели при використанні кодону. Таким чином, нуклеїнові кислоти, що представляють інтерес, можуть бути синтезовані з використанням кодонів, переважних для хлоропластів. Див., наприклад, патент США Мо 5380831, який включено у даний документ за допомогою посилання.

Трансформація рослин

Способи даного винаходу включають введення нуклеотидного конструкта у рослину. Під "введенням" мають на увазі забезпечення рослини нуклеотидним конструктом таким чином, щоб конструкт одержав доступ до внутрішнього простору клітини рослини. Способи даного винаходу не вимагають застосування конкретного способу введення нуклеотидного конструкта у рослину, а лише, щоб даний нуклеотидний конструкт одержав доступ до внутрішнього простору щонайменше однієї клітини рослини. У даній галузі техніки відомі способи введення нуклеотидних конструктів у рослини, включаючи, але без обмежень, способи стабільної трансформації, способи тимчасової трансформації та способи, опосередковані вірусами.

Під "рослиною" мають на увазі цілі рослини, органі рослини (наприклад, листя, стебла, коріння тощо), насіння, рослинні клітини, паростки, зародки та потомство даних рослин.

Рослинні клітини можуть бути диференційованими або недиференційованими (наприклад, калюс, суспензія культури клітин, протопласти, клітини листя, клітини кореня, клітини флоеми, бо пилок).

"Трансгенні рослини" або "трансформовані рослини" або "стабільно трансформовані" рослини або клітини або тканини відносяться до рослин, які мають введені або інтегровані в рослинну клітину екзогенні нуклеотидні послідовності або фрагменти ДНК. Дані нуклеотидні послідовності мають у своєму складі такі, які є екзогенними, або не представлені у нетрансформованій рослинній клітині, а також такі, які можуть бути ендогенними, або бути присутніми у нетрансформованій рослинній клітині. "Гетерологічний" загалом відноситься до нуклеотидних послідовностей, які не є ендогенними щодо клітини або не є частиною нативного генома, у якому вони присутні, та які були внесені в клітину шляхом зараження, трансфекції, мікроїін'єкції, електропорації, бомбардування мікрочастинками тощо.

Трансгенні рослини даного винаходу експресують одну або декілька нових послідовностей токсинів, що розкриваються у даному документі. У різних варіантах здійснення трансгенна рослина додатково містить один або декілька додаткових генів стійкості до комах (наприклад,

Сту!, такі як представники родин СтутА, Сту1В, Сту1С, Сту1!О, Сту1Е та Стуї1Е; Сгу2, такі як представники родин СтгугА; Стгуб9, такі як представники родин СтгузА, Сту9В, Сту9С, Стуб9О, Сту9Е та Сгу9Е тощо). Фахівцеві у даній галузі техніки буде зрозуміло, що трансгенні рослини можуть містити будь-який ген, який наділяє сільськогосподарською ознакою, що представляє інтерес.

Трансформацію рослинних клітин може бути здійснено із застосуванням одного або декількох методів, відомих у даній галузі техніки. Ген, що визначає пестицидну активність, згідно з даним винаходом може бути модифікований для одержання або підвищення експресії у клітинах рослин. Як правило, конструкт, який експресує такий білок, містить промотор, що регулює транскрипцію гена, а також 3' нетрансльовану ділянку, яка забезпечує термінацію транскрипції та поліаденілювання. Структура таких конструктів добре відома у даній галузі техніки. У деяких випадках доцільним може бути конструювання гена таким чином, що це буде приводити до секреції синтезованого у результаті пептиду або іншої спрямованої дії у клітині рослини. Наприклад, ген може бути сконструйований таким чином, щоб містити сигнальний пептид для полегшення переносу пептиду в ендоплазматичний ретикулум. Також переважним може бути конструювання експресійної касети, що містить інтрон, таким чином, що іРНК- процесинг даного інтрона необхідний для експресії.

Як правило, дана "рослинна експресійна касета" буде введена у "рослинний

Зо трансформувальний вектор". Даний рослинний трансформувальний вектор може містити один або декілька ДНК-векторів, необхідних для досягнення трансформації рослини. Наприклад, звичайною практикою у даній галузі техніки є використання рослинних трансформувальних векторів, які містять більше одного суміжного сегмента ДНК. У даній галузі техніки ці вектори часто називають "бінарними векторами". Бінарні вектори, як і вектори з хелперними плазмідами найчастіше використовуються для опосередкованої Адгобасієегішт трансформації, де розмір та сумарна довжина сегментів ДНК, необхідних для досягнення ефективної трансформації, є досить великими, та доцільно розділити функції за окремими молекулам ДНК. Бінарні вектори, як правило, містять плазмідний вектор, який містить цис-активні послідовності, необхідні для переносу Т-ОМА (такі як розташовані на лівій межі та на правій межі фрагмента), селективний маркер, який сконструйований таким чином, щоб бути здатним до експресії у клітині рослини, та "ен, що представляє інтерес", (ген, сконструйований таким чином, щоб бути здатним до експресії у рослинній клітині, для якої потрібне створення трансгенних рослин). Також у даному плазмідному векторі присутні послідовності, необхідні для реплікації бактерій. Цис-активні послідовності організовані таким чином, що забезпечує ефективне перенесення у рослинні клітини та експресії в них. Наприклад, ген селективного маркера та ген, що визначає пестицидну активність, локалізовані між лівою та правою межами. Часто другий плазмідний вектор містить транс-активні фактори, які опосередковують перенесення Т-ОМА від

Адгорасіегішт у рослинні клітини. Плазміда часто містить гени вірулентності (гени Міг), які забезпечують інфікування рослинних клітин з використанням Адгобасіегішт та перенесення ДНК шляхом розщеплення межових послідовностей та міг-опосредованому переносі ДНК, як відомо у даній галузі техніки (НеїЇеп5 апа МийПпеаих (2000) Тгепавз іп Ріапі Зсієпсе 5:446-451). Кілька типів штамів Адгобрасіегішт (наприклад, І ВА4404, (ЗМ3101, ЕНАТО1, ЕНАТО5 тощо) можуть бути використані для трансформації рослин. Другий плазмідний вектор не є необхідним для трансформації рослини із застосуванням інших способів, таких як бомбардування мікрочастинками, мікроін'єкція, електропорація, трансфекція за допомогою поліетиленгліколю тощо.

Загалом, способи трансформації рослин включають перенесення гетерологічної ДНК у цільові рослинні клітини (наприклад, у незрілі або зрілі зародки, суспензійні культури, недиференційований калюс, протопласти тощо) з наступним застосуванням відповідного бо відбору з максимальним граничним рівнем відповідного відбору (залежно від селективного маркерного гена) для того, щоб виділити трансформовані рослинні клітини з групи нетрансформованої клітинної маси. Експлантати зазвичай переносять у свіжу порцію такого ж культурального середовища та культивують стандартно. Далі трансформовані клітини диференціюються у пагони після їх поміщення на регенераційне середовище, у яке додано засіб для селекції у концентрації максимального граничного рівня. Пагони потім переносять на селективне середовище для укорінення для укорінення пагона або саджанця. Трансгенний саджанець потім виростає у зрілу рослину та продукує фертильне насіння (наприклад, Нівї еї аї. (1994) Тпе Ріапі Чопа! 6:271-282; Ізпіда еї а. (1996) Маїиге Віоїесппооду 14:745-750).

Експлантати, як правило, переносять у свіжу порцію такого ж культурального середовища і стандартно культивують. Загальний опис методик та способів одержання трансгенних рослин наведено в Аугез апа Рагк (1994) Стййса! Кемему/вз іп Ріапі Зсіепсе 13:219-239 та Воттіпепі апа

Уашнаг (1997) Маудіса 42:107-120. Через те що трансформований матеріал містить численні клітини, як трансформовані, так і нетрансформовані клітини присутні у будь-якій частині обробленого цільового калюса або тканини або групи клітин. Здатність викликати загибель нетрансформованих клітин та дозволяти проліферацію трансформованих клітин дозволяє одержати культури трансформованих рослин. Часто, здатність до видалення нетрансформованих клітин є обмеженням для швидкого виділення трансформованих рослинних клітин та успішного створення трансгенних рослин.

Протоколи трансформації, а також протоколи для введення нуклеотидних послідовностей у рослини можуть варіювати залежно від типу рослини або рослинної клітини, тобто, однодольна або дводольна, призначених для трансформації. Створення трансгенних рослин можна здійснювати із застосуванням одного з декількох способів, включаючи, але без обмежень, мікроін'єкцію, електропорацію, спрямоване перенесення генів, введення гетерологічної ДНК за допомогою Адгобасіегішт у рослинні клітини (опосередкована Адгорасіегішт трансформація), бомбардування рослинних клітин гетерологичною чужорідною ДНК, кон'югованою з частинками, способом прискорених частинок, трансформація із застосуванням аерозольного пучкового інжектора (опублікована заявка на патент США Мо 20010026941; патент США Мо 4945050; міжнародна публікація Мо МУО 91/00915; опублікована заявка на патент США Мо 2002015066),

Ї ес 1-трансформація та різні інші способи переносу ДНК, не опосередковані прямим введенням

Зо часток.

Способи для трансформації хлоропластів відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад,

Зуаь єї аї. (1990) Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 87:8526-8530; мав апа Маїїда (1993) Ргос. Маї).

Асай. Зсі. ОБА 90:913-917; Змаб апа Маїїда (1993) ЕМВО 3. 12:601-606. Даний спосіб базується на використанні генної гармати для доставки ДНК, що містить селективний маркер, та спрямованого введення ДНК у геном пластиди за допомогою гомологічної рекомбінації.

Додатково, трансформація пластид може бути досягнута за допомогою транс-активації мовчазного, пластидного трансгена за рахунок тканино-переважної експресії пластидної, ядерної РНК-полімерази. Таку систему описано у МеВгіде еї а!. (1994) Ргос. Май. Асад. 5сі. ОБА 91:7301-7305.

Після інтеграції гетерологічної чужорідної ДНК у рослинні клітини використовують відповідний відбір з максимальним граничним рівнем відповідного відбору у середовищі, щоб викликати загибель нетрансформованих клітин та відокремити, а також викликати проліферацію передбачувано трансформованих клітин, які виживають у результаті даної селекційної обробки, шляхом регулярного перенесення клітин у свіже середовище. За допомогою безперервного пасажу та введення відповідного засобу для відбору ідентифікують та стимулюють проліферацію клітин, які були трансформовані за допомогою плазмідного вектора. Молекулярні та біохімічні способи потім можуть бути використані для підтвердження присутності інтегрованого гетерологічного гена, що представляє інтерес, у геномі трансгенної рослини.

Клітини, які були трансформовані, можна виростити у рослини відповідно до

БО загальноприйнятих способів. Див., наприклад, МеСогтіск еї аї. (1986) Ріапі Сеї! Рерогів 5:81-84.

Дані рослини потім можна вирощувати та або запилювати такою ж трансформованою лінією, або іншою лінією, а отриманий у результаті гібрид, що має конститутивну експресію необхідної фенотипічної характеристики, може бути ідентифікований. Два або більше поколінь можуть бути вирощені для того, щоб впевнитися, що експресія необхідної фенотипічної ознаки стабільно зберігається та успадковується, а потім насіння збирають для того, щоб впевнитися, що експресія бажаної фенотипічної ознаки була досягнута. Таким чином, даний винахід забезпечує трансформоване насіння (також називають "трансгенне насіння"), що містить нуклеотидний конструкт за даним винаходом, наприклад, експресійну касету за даним винаходом, стабільно вбудований у їх геном. (510)

Оцінка трансформації рослин

Після введення гетерологічної чужорідної ДНК у рослинні клітини, підтверджують трансформацію або інтеграцію гетерологічного гена у геном рослин різними способами, такими як аналіз нуклеїнових кислот, білків та метаболітів, асоційованих з інтегрованим геном.

ПЛР-аналіз являє собою експрес-методику скринінгу трансформованих клітин, тканини або пагонів на присутність введеного гена на більш ранній стадії до пересаджування в грунт (ЗатргоокК апа Вивзеї! (2001) МоїІесшаг Сіопіпд: А ІГарогаїгу МапиаІ. Соїй Зргіпд Нагбог

І арогаїогу Ргез55, Соїй Зргіпд Нагог, МУ). ПЛР здійснюють з використанням олігонуклеотидних праймерів, специфічних до гена, що представляє інтерес, або фону вектора Адгорасіегійт тощо.

Трансформацію рослин можна підтвердити за допомогою Саузерн-блот аналізу геномної

ДНК (Затьгоок апа Киззеїї, 2001, зирга). Загалом, загальну ДНК екстрагують із трансформанта, розщеплюють за допомогою відповідних рестрикційних ферментів, фракціонують в агарозному гелі та переносять на нітроцелюлозну або нейлонову мембрану.

Мембрану або "блот" далі досліджують за допомогою, наприклад, міченого радіоактивним згр фрагментом цільової ДНК для підтвердження інтеграції введеного гена у геном рослин згідно з стандартними методиками (затрьгоок апа Виззеї|, 2001, зирга).

У нозерн-блот аналізі виділяють РНК із спеціальних тканин трансформанта, фракціонують в агарозному гелі, що містить формальдегід, та переносять на нейлоновий фільтр згідно із стандартними процедурами, які регулярно використовують у даній галузі техніки (затрьгоок апа

КиззеїІї, 2001, зирга). Потім досліджують експресію РНК, яка кодується геном, що визначає пестицидну активність, шляхом гібридизації на фільтрі з радіоактивним зондом, отриманої з гена, що визначає пестицидну активність, за допомогою способів, відомих у даній галузі техніки (ЗатбгоокК апа Риззеї, 2001, зирга).

Підтвердження присутності білка, який кодується геном, що визначає пестицидну активність, можна здійснювати на трансгенних рослинах з використанням стандартних процедур вестерн- блота, біохімічних аналізів та ним подібних на трансгенних рослинах (ЗатогоокК апа КиззеїїЇ, 2001, 5ирга) з використанням антитіл, які зв'язуються з одним або декількома епітопами, які присутні на пестицидному білку.

Зо Пестицидна активність у рослин

В іншому аспекті даного винаходу можна створити трансгенні рослини, у яких експресується пестицидний білок, який має пестицидну активність. Для створення трансгенних рослин можна використовувати способи, описані вище як приклад, але спосіб, за яким отримують трансгенні рослинні клітини, не є критично важливим для даного винаходу. На розсуд експериментатора можна застосовувати способи, відомі або описані в даній галузі техніки, такі як опосередкована

Адгорасіегішт трансформація, біолістична трансформація та способи, не опосередковані частинками. Рослини, що експресують пестицидний білок, можна виділити за допомогою загальновідомих способів, описаних у даній галузі технікио, наприклад, за допомогою трансформації калюсу, відбору трансформованого калюсу та регенерації плодоносної рослини з такого трансгенного калюсу. У такому способі можна використовувати будь-який ген у якості селективного маркера за умови, що його експресія у рослинних клітинах надасть можливість для ідентифікації або відбору трансформованих клітин.

Для застосування у рослинних клітинах було розроблено цілий ряд маркерів, таких як стійкість до хлорамфениколу, аміногликозиду 5418, гигроміцину або їм подібним. Також у якості селективних маркерів можна використовувати інші гени, які кодують продукт, залучений до метаболізму хлоропластів. Наприклад, окреме використання можуть знайти гени, які забезпечують стійкість до гербіцидів для рослин, таким як гліфосат, бромоксиніл або імідазолінон. Такі гени було описано (ЗаїКег еї аІ. (1985) 9. Віої. Сет. 263:6310-6314 (ген нітрилази, яка надає стійкість до бромоксинілу); та Заїабімап еї аІ. (1990) Мисі. Асідб5 Кезв. 18:2188 (ген АНА5, який надає стійкість до імідазолінонів). Додатково гени, розкриті у даному документі, є придатними у якості маркерів для оцінки трансформації бактеріальних або рослинних клітин. Способи виявлення присутності трансгена у рослині, органі рослини (наприклад, листі, стеблах, корінні тощо), насінні, рослинній клітині, паростку, зародку або їх потомстві добре відомі у даній галузі техніки. В одному варіанті здійснення присутність трансгена виявляють шляхом дослідження пестицидної активності.

Плодоносні рослини, у яких експресується пестицидний білок, можна досліджувати на пестицидну активність, та для подальшого схрещування можна проводити відбір рослин, у яких проявляється оптимальна активність. У даній галузі техніки доступні способи аналізу на пестицидну активність. Зазвичай білок перемішують та використовують у аналізах із бо згодовуванням. Дивись, наприклад Маїтопе еї аї. (1985) 9. ої Есопотіс Епіотоіоду 78:290-293.

Даний винахід можна застосовувати для трансформації будь-якого виду рослин, включаючи, але без обмежень, однодольні та дводольні рослини. Приклади рослин, які представляють інтерес, включають, але без обмежень, кукурудзу (маїс), сорго, пшеницю, соняшник, помідор, хрестоцвіті, перцеві, картоплю, бавовник, рис, сою, цукровий буряк, цукрову тростину, тютюн, ячмінь та олійний рапс, Вгаззіса 5р., люцерну, жито, просо, сафлор, земляні горіхи, солодку картоплю, маніок, кавове дерево, кокос, ананас, цитрусові дерева, дерево какао, чайний кущ, банан, авокадо, фігове дерево, гуаву, мангове дерево, маслину, папайю, кеш'ю, макадамію, мигдаль, овес, овочі, декоративні рослини та хвоїні.

Овочі включають, але без обмежень, помідори, латук, зелену квасолю, квасолю ліма, види гороху та представників роду Сигсиптів, таких як огірок, канталупа та мускусна диня.

Декоративні рослини включають, але без обмежень, азалію, гортензію, гібіскус, троянди, тюльпани, жовті нарциси, петунію, гвоздику, пуансетію та хризантему. Переважно рослини даного винаходу являють собою культурні рослини (наприклад, маїс, сорго, пшениця, соняшник, помідор, хрестоцвіті, перцеві, картопля, бавовник, рис, соя, цукровий буряк, цукрова тростина, тютюн, ячмінь, олійний рапс тощо).

Застосування у боротьбі зі шкідниками

У даній галузі техніки відомі загальні способи використання штамів, які містять нуклеотидну послідовність даного винаходу або її варіант, у якості пестицидних засобів у боротьбі зі шкідниками або при створенні інших організмів. Дивись, наприклад, патент США Мо 5039523 та

ЕР 0480762А2.

Штами Васіїйй5, що містять нуклеотидну послідовність даного винаходу або її варіант, або мікроорганізми, які генетично змінювали таким чином, щоб вони містили ген, який визначає пестицидну активність, за даним винаходом та білок, можна застосовувати для захисту сільськогосподарських культур та продуктів від шкідників. У одному аспекті даного винаходу, цільні, тобто нелізовані клітини організму, що продукує токсин (пестицид), обробляють реактивами, які пролонгують активність токсину, що продукується у клітині, якщо клітину поміщають у середовище цільового шкідника (шкідників).

У якості альтернативи, пестицид отримують за рахунок введення гена, що визначає пестицидну активність, у клітину-хазяїна. Експресія гена, що визначає пестицидну активність,

Зо прямо або опосередковано приводить до внутрішньоклітинної продукції та підтримці рівня пестициду. У одному аспекті даного винаходу дані клітини потім обробляють в умовах, які пролонгують активність токсину, що продукується у клітині, якщо клітину поміщають у середовище цільового шкідника (шкідників). Отриманий у результаті продукт зберігає токсичність, характерну для токсину. З цих інкапсульованих природним чином пестицидів можна потім скласти препарат відповідно до традиційних методик для внесення в середовище проживання цільового шкідника, наприклад, грунт, воду та на листя рослин. Дивись, наприклад,

ЕРА 0192319 та посилання, які цитуються у ньому. У якості альтернативи, можна скласти препарат з клітин, що екпресують ген згідно з даним винаходом, таким чином, щоб забезпечити застосування отриманого у результаті матеріалу у якості пестициду.

Активні інгредієнти даного винаходу зазвичай наносять у формі композицій, та їх можна наносити одночасно або послідовно з іншими сполуками на посівну площу або рослину, що підлягають обробці. Цими сполуками можуть бути добрива, гербіциди, кріопротектори, поверхнево-активні речовини, детергенти, пестицидні мила, масла, використовувані у період спокою, полімери та/або склади з носіями, що повільно вивільнюються або здатні до біологічного розкладання, які дають можливість довгострокового дозованого вивільнення у цільовій області після разового внесення складу. Вони також можуть являти собою селективні гербіциди, хімічні інсектициди, віруциди, мікробіциди, амебіциди, пестициди, фунгіциди, бактерициди, нематоциди, молюскоциди або суміші декількох даних препаратів, якщо потрібно, разом з додатковими сільськогосподарсько-прийнятними носіями, поверхнево-активними речовинами або допоміжними речовинами, що сприяють нанесенню, які зазвичай використовують у даній галузі складання. Придатні носії та допоміжні речовини можуть бути твердими або рідкими та відповідають речовинам, які зазвичай використовують у технології складання, наприклад, натуральні або відновлені мінеральні речовини, розчинники, диспергувальні речовини, засоби, що змочують, речовини, що надають липкість, речовини, що зв'язують, або добрива. Подібним чином склади можна приготувати у формі їстівних "принад", або їм можна надати форму "пасток" для шкідників, щоб забезпечити можливість згодовування або поглинання пестицидного складу цільовим шкідником.

Способи нанесення активного інгредієнта даного винаходу або агрохімічної композиції даного винаходу, яка містить щонайменше один з пестицидних білків, що продукуються 60 бактеріальними штамами даного винаходу, включають нанесення на листя, покриття насіння та внесення в грунт. Кількість нанесень та норма нанесення залежить від інтенсивності зараження відповідним шкідником.

Композицію можна складати у вигляді порошку, дусту, пелети, гранули, аерозолю емульсії, колоїду, розчину або їм подібних та можна одержати за допомогою таких традиційних способів, як сушіння, ліофілізація, гомогенізація, екстракція, фільтрація, центрифугування, осадження або концентрування культури клітин, що містять поліпептид. В усіх таких композиціях, які містять щонайменше один такий пестицидний поліпептид, даний поліпептид може бути присутнім у концентрації від приблизно 195 до приблизно 9995 за масою.

За допомогою способів даного винаходу на даній площі можна знищувати або зменшувати кількості лускокрилих, напівтвердокрилих, двокрилих або твердокрилих шкідників, або їх можна використовувати профілактично у навколишньому середовищі для запобігання зараженню чутливим шкідником. Переважно шкідник поглинає або контактує з пестицидно-ефективною кількістю поліпептиду. Під "пестицидно-ефективною кількістю" мають на увазі кількість пестициду, що здатна викликати загибель щонайменше одного шкідника або помітно обмежувати ріст шкідника, харчування або нормальний фізіологічний розвиток. Дана кількість буде варіювати залежно від таких факторів, як, наприклад, конкретні цільові шкідники, що підлягають контролю, конкретне навколишнє середовище, місцезнаходження, рослина, культура або сільськогосподарська ділянка, що підлягає обробці, умови навколишнього середовища та спосіб, норма, концентрація, стабільність та кількість нанесення пестицидно- ефективної композиції поліпептиду. Склади можна також варіювати з урахуванням кліматичних умов, впливу на навколишнє середовище та/або частоти нанесення та/або тяжкості зараження шкідниками.

Описані пестицидні композиції можна приготувати шляхом складання препарату або з бактеріальної клітини, кристала та/або суспензії спор, або з виділеного білкового компонента з необхідним сільськогосподарсько-прийнятним носієм. Композиції можна складати перед застосуванням за допомогою відповідних способів, таких як ліофілізація, висушування сублімацією, сушіння, або у водному носії, середовищі або придатному розріджувачі, такому як сольовий розчин або інший буфер. Складені композиції можуть бути у формі дусту або гранульованого матеріалу, або суспензії у олії (рослинній олії або мінеральному маслі), або

Зо водних, або масляних/водних емульсій, або у якості порошку, що змочується, або у комбінації з будь-якою іншою речовиною-носієм, що придатна для застосування у галузі сільського господарства. Придатні носії для сільського господарства можуть бути твердими або рідкими, та вони добре відомі у даній галузі техніки. Вираз "сільськогосподарсько-придатний носій" охоплює усі допоміжні речовини, інертні компоненти, диспергувальні речовини, поверхнево-активні речовини, речовини, що надають липкість, речовини, що зв'язують, тощо, які зазвичай застосовують у технології складання пестицидних препаратів; вони добре відомі фахівцям у даній галузі складання пестицидних препаратів. Дані склади можна змішувати з одним або декількома твердими або рідкими допоміжними речовинами та одержувати різними способами, наприклад, шляхом рівномірного змішування, перемішування та/або подрібнення пестицидної композиції з придатними допоміжними речовинами із застосуванням традиційних методик складання. Придатні склади та способи нанесення описано у патенті США Мо 6468523, який включено у даний документ за допомогою посилання. "Шкідник" включає, але без обмежень, комах, грибів, бактерій, нематод, кліщів, іксодових кліщів та їм подібних. Комахи-шкідники включають комах, вибраних із рядів СоіІеорієга, Рірієга,

Нутепоріега, Іерідоріега, МайПйорпада, Ноторіега, Нетіріега, ОпіПгорієга, Тпузапоріега,

Оептаріега, Ізорієга, Апоріига, Зірпопаріега, Тгіспорієга тощо, зокрема, СоїІеоріега, І ерідоріега та Оіріеєга.

Ряд СоІеоріега включає підряди Адерпада та Роїурпада. Підряд Адерпада включає надродини Сагароїдеа та Сугіпоїдеа, у тої час як підряд РоїЇурпада включає надродини

Нуагорпіоідеа, еарпуїйпоїдеа, Сапіпагоїдеа, СіІегоїдеа, ЕІагегоїдеа, РОазсіПйоідеа, Огуороідеа,

Вуппоїдеа, Сисціоїдеа, Меїоіїдеа, МогаеїІоідеа, Тепебргіопоіїдеа, Вовігіспоіїдеа, Зсагараеєоїадеа,

Сегатрусоїдеа, Спгузотеїоіїдеа та Сигсшіопоіїдеа. Надродина Сагароїдеа включає родини

Сісіпаеїйдає, Сагаріздає та бБуїїзсідаеє Надродина Сугіпоїдеа включає родини сСугіпідає.

Надродина Нуагорпйоіїдеа включає родину Нуагорпійїдає. Надродина 5(арпуїїпоїдеа включає родини 5іїрпідає та 5іарпуїїпідае. Надродина Сапіпагоїдеа включає родини Сапіпагідає та

ІГатругідае. Надродина Сіегоїдеа включає родини Сіегдає та Оегптевзіійає. Надродина

ЕІаіегоїдеа включає родини ЕПІагегідае та Виргезідає. Надродина Сисціоідеа включає родину

СоссіпеїПдаеє. Надродина Меїоідеа включає родину Меїоіїдає. Надродина Тепебгіопоїдеа включає родину Тепебгіопічдае. Надродина Зсагараєоїдеа включає родини Рабззаїїдає та бо зЗсагараєідає. Надродина Сегатрусоїдеа включає родину Сегатбрусідає. Надродина

Спгузотеїоідеа включає родину СПпгузотеїїдає. Надродина Сигсціопоїдеа включає родини

Сигсцшіопідає та зсоїуїаае.

Ряд бОіріега включає підряди Метаїйосега, Вгаспусега та Сусіоппарпа. Підряд Метаїйосега включає родини Тіриїїдає, Рзусподідає, Сшисідаеє, Сега(ородопідає, СВпігопотідає, Зітиїїааєеє,

Віріопідає та Сесідотуйдає. Підряд Вгаспусегта включає родини 5ігайотуідає, Табапідає,

Тпегемідає, Азійдає, Муадідає, Вотрбуїйаає та Роїїспородідає. Підряд Сусіоітпарпа включає секції

Азспіга та Азспіга. Секція Азспіга включає родини РПогідає, Ззугрпідає та Сопорідає. Секція

Азспілга включає підсекції Асаїурігаїае та Саїпурігаїає. Секція Асаїурігаїає включає родини

Оїщшідає, Терпгйідає, Адготулідае та Огозорпййдає. Секція Саїурігаїае включає родини

Нірробозсідає, Оеєзігідає, Таспіпідає, Апіпотуїдає, Мизсідає, СапПірпогідає та Загсорпацдідав.

Ряд Іерідоріега включає родини Раріїопідає, Ріегідає, Гусаєпідає, Мутрпаїйдає, бапаїдає, заїугідає, Незрегіїдає, Зрпіпдідає, Зашгпіїдає, сСеотеїгідає, Агсійдає, Мосіцідає, Сутапігідає, зевіїдає та Тіпеідає.

Комахи-шкідники згідно з даним винаходом для основних культур включають: маїс: О5ігіпіа пибіїаій5, європейського кукурудзяного метелика; Адгоїї5 ірзіоп, совку-іпсилон;

Неїїсомегра 7еа, кукурудзяну совку; Зродоріега їгидірегада, совку трав'яну; Оіаїгаєа дгапаїіозеїІа, вогнівку кукурудзяну південно-західну; ЕіІазтораїриз Іщдпозеїйш5, зернового точильника; Оіайгаєа засспагаїї5, вогнівку цукрового очерету; Ріаргоїйса мігдітега, західного кукурудзяного кореневого жука; Оіаргоїїса Іопдісогпі5 бБагбегі, північного кукурудзяного кореневого жука; бБіабгоїїса ипаесітрипсіаїа Ппомагді, південного кукурудзяного кореневого жука; Меїапоїи5 5рр., жуків- коваликів; Сусіосерпаїа Богеаїї5, хрущика північного (личинку хруща); Сусіосерпаїа іттасшагца, хрущика південного (личинку хруща); РорійШа |аропіса, хрущика японського; Спаетюспета риїїсагіа, земляну кукурудзяну блішку; Зрпепорпоги5 таїдіх, кукурудзяного довгоносика;

КПпора!озірпит таїйдіх, кукурудзяну листову попелицю; Апигарпі5 таїйдігадісіх, кукурудзяну кореневу попелицю; Віїз5и5 Іеисорієги5 Іеисоріеги5, клопа-ч-ерепашку пшеничного північноамериканського; МеїІапоріих5 Тетиггибгит, червононогу кобилку; МеїІапоріи5 запдиіпіре5, кобилку, що мігрує; Нуїетуа ріайшга, личинку паросткової мухи; Адготуа рагмісогпіб5, міль- пістрянку кукурудзяну; Апарпоїпгір5 обз5сгиги5, трипса злакового; ЗоІепорзіз теза, мураху- крадія; Теїгапуспив5 игіісає, звичайного павутинного кліща; сорго: Спіо рагейПив5, соргового

Зо точильника; Зродорієга Ігидірегда, совку трав'яну; Неїїсомегра 7еа, кукурудзяну совку;

ЕІазтораїрих5 ІщдпозеїПййи5, маленького точильника кукурядзяного стебла; ЕРеша 5и,иБбіегтапеа, гусеницю озимої совки; РпуїПорпада сгіпіа, личинку хруща; ЕІеоде5, Соподеги5 та Аеоїи5 5рр., дротяників; ОшШета теїапори5, п'явицу червоногруду; Спаеіоспета риїїсагіа, кукурудзяну блішку; 5рпепорпоги5 таїйдіє, кукурудзяного довгоносика; КпораїЇозірпит таїйдіє; кукурудзяну листову попелицю; Зірпа Пама, жовту попелицю цукрового очерету; Віїззи5 Іеисоріеги5

Іеисоріеги5, клопа-черепашку пшеничного північноамериканського; Сопіагіпіа 5огопісоїа, галівницю соргову; Теїгапуспи5 сіппабагіпи5, червоного павутинного кліща; Теїгапуспив игіісає, звичайного павутинного кліща; пшениця: Рзецйда|енца ипірипсіаїа, совку лугову; Зродоріега їпидірегда, совку трав'яну; ЕІазтораїри5 Іішдпозеїйи5, маленького точильника кукурудзяного стебла; Адгоїї5 огіподопіа, прямокутну совку; ЕІазтораїризх Ідпозеїш5, маленького точильника кукурудзяного стебла; ОшШета теїапорих, п'явицу червоногруду; Нурега рипсіаїа, довгоносика листяного конюшинового; ОЮіаргоїїса иипаесітрипсіага Ппоугагді, південного кукурудзяного кореневого жука; російську пшеничну попелицю; ЗсПпігарпізє дгатіпит, звичайну злакову попелицю; Масгозірпит амепає, велику злакову попелицю; Меїапоріи5 Тетиггиргит, червононогу кобилку; МеЇІапоріиз айегепііаїй5, кобилку виду; МеІапоріи5 запдиіпіре5 кобилку, що мігрує; Мауеїйоїа дезігисіог, гесенську муху; зЗйоаіріозі5 тозеїапа, оранжеву злакову галівницю;

Меготуа атегісапа, личинку американської меромізи; НуїЇетуа соагсіаїа, озиму муху;

ЕгапкіїпіеПа Тиса, тютюнового трипса; Серпи5 сіпсій5, хлібного пильщика; Асепа шіїрає, кліщ цибульний чотириногий; соняшник: Зцйцієїта Пеїапійапа, соняшникову брунькову листовійку;

Нотоеозота еїесіеІїшт, соняшникову вогнівку; 72удодгатта ехсіатайопі5, соняшникову окличну совку; Воїпуги5 діррозив5, моркв'яного жука; Меоіазіоріега тигпеапа, галицю соняшникового насіння; бавовник: Неїйоїпіб5 мігезсеп5, бавовникову листовійку; Неїїсомегра 7єа, бавовникову совку; Зродорієга ехідца, совку малу; Ресііпорпога доззуріеЇІа, рожевого бавовникового хробака;

Апіпопоти5 дгапаіїх, бавовникового довгоносика; Арпі5 до55урії, бавовникову попелицю;

Рзецдаютозвзсеїї5 з5егіа5, бавовникового гедзя; Тгіаі-еигоде5 арбшіопеа, бавовникову білокрилку;

Гудив Ііпеоїагіх, трав'яного клопа; МеїЇапоріи5 Тетигтиргит, червононогу кобилку; МеїЇапоріи5 аїйнегепійіа|йє, кобилку виду; ТПгір5 їарасі, цибулевого трипса; ЕгапкКіїпіеєйа їибса, тютюнового трипса; Теїігапуспи5 сіппарврагіпи5, червоного павутинного кліща; Теїгапуспи5 пигіїсає, звичайного павутинного кліща; рис: Оіайїаєа засспагарйб5, точильника цукрового очерету; Зродоріега бо їгидірегда, совку трав'яну; Неїїсомегра 7єа, кукурудзяну совку; листоїда виду СоЇазрі5 Бгиппеа;

Гів5о г поріги5 огулорпйи5, рисового водяного довгоносика; ЗйЙОорпйи5 огулає, рисового довгоносика; Мерпоїейніх підгоріс(и5, рисову цикадку; Вії55и5 Іеисоріеги5 Іеисоріеги5, клопа- черепашку пшеничного північноамериканського; Асго5зіетит Піаге, зеленого клопа-щитника; соя: Рзхецдоріивіа іпсіцаеп5, соєвого п'ядака; Апіїсагзіа деттаїаїї5, гусеницю совки оксамитових бобів; Ріаїйтурепа з5сабга, зеленого шкідника конюшини; Об5ігіпіа пибіїаійє5, європейського кукурудзяного метелика; Адгоїї5 ірзіоп, совку-іпсилон; Зродоріега ехідча, совку малу; Неїоїтів мігезсеп5, бавовникову листовійку; Неїїсомегра 7еа, кукурудзяну совку; Еріасппа магімевії5, мексиканську бобову зерновку; Му7и5 регзісає, зелену персикову попелицю; Етроазса Тарає, цикадку картопляну; Асгов5іегпит Пійаге, зеленого клопа-щитника; Меїапоріи5 Тетиггибгит, червононогу кобилку; МеїЇапоріих айегепііаійв, кобилку виду, Нуетуа ріаїшга, личинку паросткової мухи; 5Зегісоїйгір5 магіаріїє, трипса соєвого; ТПгір5 їабасі, трипса цибульного;

Теїмгапуспиб5 ШштКевіапі, туркестанського павутинного кліща; Теїйгапуспи5 игіїсає, звичайного павутинного кліща; ячмінь: Оз5ігіпіа пибіїаіййє, європейського кукурудзяного метелика; Аадгоїі5 ірзіоп, совку-іпсилон; Зспігарнпіх дгатіпит, звичайну злакову попелицю; Віїз5и5 Іеисоріеги5

Іеисоріеги5, клопа--ерепашку пшеничного північноамериканського; Асгозіегпит Ппіаге, зеленого клопа-щитника; Еиб5спізійи5 5егми5, коричневого клопа-щитника; ОЮОеїйЇйа ріайшга, личинку паросткової мухи; Мауеїййоїа девігисіог, гесенську муху; Реїгобріа Іаїеп5, петробію багатоїдна; олійний рапс: Вгемісогупе Бгаззісає, попільницю; РПуїоїгега сгисітегає, блішку хрестоцвітну;

Матевзіга сопіїдигага, совку латукову; Рішейа хуїозіеНйа, капустяну совку; Оеїїа 55р., личинок весняної капустяної мухи.

Нематоди включають паразитичні нематоди, такі як бульбочкові, цистоутворювальні та нематоди, що ранять, які включають Неї(егодега 5рр., МеІоідодупе 5рр. та СіІородега 5рр.; зокрема, представників цистоутворювальних нематод, включаючи, але без обмежень,

Неїегодега діусіпе5 (соєву цистоутворювальну нематоду); Неїегодега 5спаснійї (бурякову цистоутворювальну нематоду); Неїегодега амепає (зернову цистоутворювальну нематоду); та

Сіородега го5іоспіепзіз та СіІородега раййа (картопляні цистоутворювальні нематоди).

Нематоди, що ранять, включають Ргагуепсвпиз 5рр.

Способи підвищення урожайності рослин

Забезпечуються способи підвищення урожайності рослин. Способи включають

Зо забезпечення рослини або рослинної клітини, які експресують полінуклеотид, що кодує послідовність пестицидного поліпептиду, розкритого у даному документі, та вирощування рослини або отриманого з неї насіння у полі, ураженому (або сприйнятливого до ураження) шкідником, щодо якого зазначений поліпептид має пестицидну активність. У деяких варіантах здійснення поліпептид володіє пестицидною активністю щодо лускокрилого, твердокрилого, двокрилого, напівтвердокрилого шкідника або нематоди-шкідника, а зазначене поле уражено лускокрилим, напівтвердокрилим, твердокрилим, двокрилим шкідником або нематодом- шкідником. Як визначено у даному документі, "Урожайність" рослини відноситься до якості та/або кількості біомаси, що продукується рослиною. Під "біомасою" мають на увазі будь-який визначуваний продукт рослинного походження. Підвищення продукції біомаси являє собою будь-яке покращення визначуваного виходу продукту рослинного походження. Підвищення урожайності рослин має кілька комерційних застосувань. Наприклад, підвищення біомаси листя рослин може підвищувати урожайність листяних овочів для споживання людиною або твариною. Додатково підвищення біомаси листя можна застосовувати для підвищення виробництва фармацевтичних або промислових продуктів рослинного походження. Підвищення урожайності може включати будь-яке статистично значуще підвищення, включаючи, але без обмежень, підвищення щонайменше на 195, підвищення щонайменше на 395, підвищення щонайменше на 595, підвищення щонайменше на 1095, підвищення щонайменше на 20965, щонайменше на 3095, щонайменше на 5095, щонайменше на 7095, щонайменше на 10095 або більше підвищення урожайності у порівнянні з рослиною, у якій не експресується послідовність, що визначає пестицидну активність. При використанні конкретних способів урожайність рослин підвищується у результаті підвищення стійкості до шкідників рослини, яка експресує пестицидний білок, розкритий у даному документі. Експресія пестицидного білка приводить до зниження здатності шкідника до зараження або поїдання.

Рослини можна також обробляти одним або декількома хімічними композиціями, що містять один або кілька гербіцидів, інсектицидів або фунгіцидів. ілюстративні хімічні композиції включають: гербіциди для фруктів/овочів: атразин, бромацил, діурон, гліфосат, лінурон, метрибузин, симазин, трифлуралін, флуазифоп, глюфосинат, галосульфурон Сомап, паракват, пропізамід, сетоксидим, бутафенацил, галосульфурон, індазифлам; інсектициди для фруктів/овочів: алдікарб, Васійиє5 (пигіепдіепсіх, карбарил, карбофуран, хлорпірифос, бо циперметрин, дельтаметрин, абамектин, цифлутрин/бета-цифлутрин, есфенвалерат, лямбда-

цигалотрин, ацеквіноцил, біфеназат, метоксифенозид, новалурон, хромафенозид, тіаклоприд, динотефуран, флуакрипірим, спіродиклофен, гамма-цигалотрин, спіромезифен, спіносад, ринаксипір, ціазипір, трифлумурон, спіротетрамат, імідаклоприд, флубендіамід, тіодікарб, метафлумізон, сульфоксафлор, цифлуметофен, ціанопірафен, клотіанідин, тіаметоксам, спінеторам, тіодікарб, флонікамід, метіокарб, емамектин бензоат, індоксакарб, фенаміфос, піріпроксифен, фенбутатин-оксид; фунгіциди для Ффруктів/овочів: аметоктрадин, азоксистробін, бентіавалікарб, боскалід, каптан, карбендазим, хлороталоніл, мідь, ціазофамід, цифлуфенамід, цимоксаніл, ципроконазол, ципродиніл, дифеноконазол, диметоморф, дитіанон, фенамідон, фенгексамід, флуазинам, флудіоксоніл, флуопіколід, Ффлуопірам, флуоксастробін, флуксапіроксад, фолпет, фосетил, іпродіон, іпровалікарб, ізопіразам, крезоксим-метил, манкоцеб, мандіпропамід, металаксил/"мефеноксам, метирам, метрафенон, міклобутаніл, пенконазол, пентіопірад, пікоксистробін, пропамокарб, пропіконазол, пропінеб, проквіназид, протіоконазол, піраклостробін, піриметаніл, квіноксифен, спіроксамін, сірка, тебуконазол, тіофанат-метил, трифлоксистробін; гербіциди для зернових: 2,4-О0, амідосульфурон, бромоксиніл, карфентразон-Е, хлоротолурон, хлорсульфурон, клодинафоп-Р, клопіралід, дикамба, диклофоп-М, дифлуфенікан, феноксапроп, флорасулам, флукарбазон-МА, флуфенацет, флупіросульфурон-М, флуроксипір, флуртамон, глифосат, іодосульфурон, іоксиніл, ізопротурон, МСРА, мезосульфурон, метсульфурон, пендиметалін, піноксаден, пропоксикарбазон, просульфокарб, піроксулам, сульфосульфурон, тифенсульфурон, тралкоксидим, тріасульфурон, трибенурон, трифлуралін, тритосульфурон; фунгіциди для зернових: азоксистробін, біксафен, боскалід, карбендазим, хлороталоніл, цифлуфенамід, ципроконазол, ципродиніл, димоксистробін, епоксиконазол, фенпропідин, фенпропіморф, флуопірам, флуоксастробін, флуквінконазол, флуксапіроксад, ізопіразам, крезоксим-метил, метконазол, метрафенон, пентіопірад, пікоксистробін, прохлораз, пропіконазол, проквіназид, протіоконазол, піраклостробін, квіноксифен, спіроксамін, тебуконазол, тіофанат-метил, трифлоксистробін; инсектициди для зернових: диметоат, лямбда-цигалотрин, дельтаметрин, альфа- циперметрин, р-цифлутрин, біфентрин, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, хлорпірифос, піримікарб, метіокарб, сульфоксафлор; гербіциди для маїсу: атразин, алахлор, бромоксиніл, ацетохлор, дикамба, клопіралід, (5-)диметенамід, глюфосинат, гліфосат, ізоксафлютол, (5-)метолахлор, мезотріон, нікосульфурон, примісульфурон, римсульфурон, сулкотріон, форамсульфурон, топрамезон, темботріон, сафлуфенацил, тієнкарбазон, флуфенацет, піроксасульфон; інсектициди для маїсу: карбофуран, хлорпірифос, біфентрин, фіпроніл, імідаклоприд, лямбда-цигалотрин, тефлутрин, тербуфос, тіаметоксам, клотіанідин, спіромезифен, флубендіамід, трифлумурон, ринаксипір, дельтаметрин, тіодікарб, Д-дифлутрин, циперметрин, біфентрин, луфенурон, тебупіримфос, етіпрол, ціазипір, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, авермектин; фунгіциди для маїсу: азоксистробін, біксафен, боскалід, ципроконазол, димоксистробін, епоксиконазол, фенітропан, флуопірам, флуоксастробін, флуксапіроксад, ізопіразам, метконазол, пентіопірад, пікоксистробін, пропіконазол, протіоконазол, піраклостробін, тебуконазол, трифлоксистробін; гербіциди для рису: бутахлор, пропаніл, азимсульфурон, бенсульфурон, цигалофоп, даімурон, фентразамід, імазосульфурон, мефенацет, оксазикломефон, піразосульфурон, пірибутикарб, квінклорак, тіобенкарб, інданофан, флуфенацет, фентразамід, галосульфурон, оксазикломефон, бензобіциклон, пірифталід, пеноксулам, биспірибак, оксадіаргіл, етоксисульфурон, претилахлор, мезотріон, тефурилтріон, оксадіазон, феноксапроп, піримісульфан; інсектициди для рису: діазинон, фенобукарб, бенфуракарб, бупрофезин, динотефуран, фіпроніл, імідаклоприд, ізопрокарб, тіаклоприд, хромафенозид, клотіанідин, етипрол, флубендіамід, ринаксипір, дельтаметрин, ацетаміприд, тіаметоксам, ціазипір, спіносад, спінеторам, емамектин-бензоат, циперметрин, хлорпірифос, етофенпрокс, карбофуран, бенфуракарб, сульфоксафлор; фунгіциди для рису: азоксистробін, карбендазим, карпропамід, диклоцимет, дифеноконазол, едифенфос, феримзон, гентаміцин, гексаконазол, гімексазол, іпробенфос (ІВР), ізопротіолан, ізотіаніл, касугаміцин, манкоцеб, метоміностробін, оризастробін, пенцикурон, пробеназол, пропіконазол, пропінеб, піроквілон, тебуконазол, тіофанат-метил, тіадиніл, трициклазол, трифлоксистробін, валідаміцин; гербіциди для бавовнику: діурон, флуометурон, МЗМА, оксифлуорфен, прометрин, трифлуралін, карфентразон, клетодим, флуазифоп-бутил, гліфосат, норфлуразон, пендиметалін, піритіобак- натрій, трифлоксисульфурон, тепралоксидим, глюфосинат, флуміоксазин, тидіазурон; інсектициди для бавовнику: ацефат, алдікарб, хлорпірифос, циперметрин, дельтаметрин, абамектин, ацетаміприд, емамектин бензоат, імідаклоприд, індоксакарб, лямбда-цигалотрин, 60 спіносад, тіодікарб, гамма-цигалотрин, спіромезифен, піридаліл, флонікамід, флубендіамід,

трифлумурон, ринаксипір, бета-цифлутрин, спіротетрамат, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, динетофуран, флубендіамід, ціазипір, спіносад, спінеторам, гамма-цигалотрин, 4-

І(б-хлорпіридин-3-іл)метил|(2,2-дифторетил)аміно|фуран-2(5Н)-он, тіодікарб, авермектин, флонікамід, піридаліл, спіромезифен, сульфоксафлор; фунгіциди для бавовнику: азоксистробін, біксафен, боскалід, карбендазим, хлороталоніл, мідь, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробін, епоксиконазол, фенамідон, флуазинам, флуопірам, флуоксастробін, флуксапіроксад, іпродіон, ізопіразам, ізотіаніл, манкоцеб, манеб, метоміностробін, пентіопірад, пікоксистробін, пропінеб, протіоконазол, піраклостробін, квінтозен, тебуконазол, тетраконазол, тіофанат-метил, трифлоксистробін; гербіциди для сої: алахлор, бентазон, трифлуралін, хлорімурон-етил, хлорансулам-метил, феноксапроп, фомезафен, флуазифоп, гліфосат, імазамокс, імазаквін, імазетапір, (5-)метолахлор, метрибузин, пендиметалін, тепралоксидим, глюфосинат; інсектициди для сої: лямбда-цигалотрин, метоміл, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, флубендіамід, ринаксипір, ціазипір, спіносад, спінеторам, емамектин-бензоат, фіпроніл, етіпрол, дельтаметрин, Д-цифлутрин, гама- та лямбда-цигалотрин, 4-І((б-хлорпіридин-3-іл)уметил|(2,2-дифторетил)аміно|фуран-2(5Н)-он, спіротетрамат, спінодиклофен, трифлумурон, флонікамід, тіодікарб, бета-цифлутрин; фунгіциди для сої: азоксистробін, біксафен, боскалід, карбендазим, хлороталоніл, мідь, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробін, епоксиконазол, флуазинам, флуопірам, флуоксастробін, флутріафол, флуксапіроксад, ізопіразам, іпродіон, ізотіаніл, манкоцеб, манеб, метконазол, метоміностробін, міклобутаніл, пентіопірад, пікоксистробін, пропіконазол, пропінеб, протіоконазол, піраклостробін, тебуконазол, тетраконазол, тіофанат-метил, трифлоксистробін; гербіциди для цукрового буряка: хлоридазон, десмедифам, етофумезат, фенмедифам, тріаллат, клопіралід, флуазифоп, ленацил, метамитрон, квінмерак, циклоксидим, трифлусульфурон, тепралоксидим, хізалофоп; інсектициди для цукрового буряка: імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, дельтаметрин, р-цифлутрин, гама/лямбда-цигалотрин, 4-((б-хлорпіридин-3-ілуметил|(2,2-дифторетил)аміно|фуран-2(5Н)-он, тефлутрин, ринаксипір, ціаксипір, фіпроніл, карбофуран; гербіциди для каноли: клопіралід, диклофоп, флуазифоп, глюфосинат, гліфосат, метазахлор, трифлуралін етаметсульфурон, квінмерак, хізалофоп, клетодим, тепралоксидим; фунгіциди для каноли: азоксистробін,

Ко) біксафен, боскалід, карбендазим, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробін, епоксиконазол, флуазинам, флуопірам, флуоксастробін, флусилазол, флуксапіроксад, іпродіон, ізопіразам, мепікват-хлорид, метконазол, метоміностробін, паклобутразол, пентіопірад., пікоксистробін, прохлораз, протіоконазол, піраклостробін, тебуконазол, тіофанат-метил, трифлоксистробін, вінклозолін; інсектициди для каноли: карбофуран, тіаклоприд, дельтаметрин, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, ацетаміприд, динетофуран, р-цифлутрин, гама- та лямбда-цигалотрин, тау-флувалеріат, етіпрол, спіносад, спінеторам, флубендіамід, ринаксипір, ціазипір, 4-((б-хлорпіридин-3-іл)уметил|(2,2-дифторетил)аміно|фуран-2(5Н)-он.

Наступні приклади запропоновано з метою ілюстрації, а не з метою обмеження.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ ПРИКЛАДИ

Приклад 1. Виявлення нових генів, що визначають пестицидну активність, у ВасйШив5

ІШигіпдіепвів

Ідентифікували новий ген, що визначає пестицидну активність, у бактеріального штаму

АТХ47350 із застосуванням наступних етапів: " Одержання загальної ДНК з штаму. Загальна ДНК містить як геномну ДНК, так і позахромосомну ДНК. Позахромосомна ДНК містить суміш деяких або усіх з наступного: плазміди різного розміру; фагові хромосоми; інші неохарактеризовані позахромосомні молекули. " Секвенування ДНК. Загальну ДНК секвенують за допомогою способів секвенування наступного покоління. " Ідентифікація передбачуваних генів токсинів за допомогою аналізів гомології та/або інших комп'ютерних аналізів. " Одержання остаточної уточненої послідовності гена, що представляє інтерес, за допомогою однієї з декількох стратегій ПЛР або клонування (наприклад, ТА -РСЕ), якщо необхідно.

Таблиця 1

Новий ген, ідентифікований у штаму АТХ14785 маса (кДа) ЗЕО ІЮ МО ЗЕО ІЮ МО

Ахті270 1

Ахіті27О0(укорочений) 78,3 57,595 Сту1Аеє (укорочений) 2 З

Ахті270(тп айетапт) А

Ахті270(тип айеїапг) 5

Ахті270(тгип аївіанз б

АХМІ270 ампліфікують за допомогою ПЛР з рАХУ8О, а ПЛР-продукт клонують у вектор експресії в Васійи5 рАХ916 або інший придатний вектор за допомогою способів, добре відомих з рівня техніки. Отриманий у результаті штам Васійн5, що містить вектор з геном ахпті, культивують на традиційному ростовому середовищі, такому як середовище СУЗ (10 г/л Васіо- сазйопе; З г/л дріжджового екстракту; 6 г/л КНгРОх; 14 г/л К"НнНРО»4; 0,5 мМ Ма950О54; 0,05 мМ

Мпсі2; 0,05 мМ БРезозй), доти, поки спороутворення не підтвердиться шляхом мікроскопічного дослідження. Отримують зразки і досліджують щодо активності у біологічних аналізах.

Приклад 2. Пестицидна активність Ахті270

Ахта270 (5ЕО І МО:2) експресували і аналізували щодо біологічної активності. Ген із штаму

АТХ47350 АШепіх ампліфікували шляхом ПЛР із застосуванням полімерази Негсшіазе з праймерами, які вбудовують лінкер Мої! на 5'-кінці та лінкер Авсі на 3'-кінці. Ампліфікований

ПЛР-продукт розщеплювали за допомогою Абсі та лігували у вектор рМаЇІС4Х для утворення плазміди рАХ7177. Клонування підтверджували шляхом секвенування і трансформували рАХ7177 у компетентні клітини ВІ21. Окрему колонію інокулювали у середовище Лурія-Бертані, і вирощували при 37"С до Іод-фази, і індукували 0,5 мМ ІРТО при 20"7С протягом 16 годин.

Очищений Ахіті270 розщеплювали за допомогою фактора Ха при співвідношенні 1:50 при кімнатній температурі протягом ночі.

Біологічний аналіз експресованого гена (генів) Ахті приводив у результаті до спостереження наступних активностей щодо комах-шкідників:

Таблиця 2

Активність експресованих білків при біологічному аналізі

Приклад 3. Додаткові аналізи пестицидної активності

Нуклеотидні послідовності згідно з даним винаходом можна досліджувати щодо їх здатності виробляти пестицидні білки. Здатність пестицидного білка діяти на шкідника у якості пестициду часто аналізують за допомогою ряду методів. Один метод, добре відомий у даній галузі техніки, полягає у здійсненні аналізу із згодовуванням. У ході такого аналізу із згодовуванням шкідника піддають впливу зразка, що містить або сполуку, яку необхідно досліджувати, або контрольні зразки. Часто його здійснюють при поміщенні матеріалу, який необхідно досліджувати, або придатного розчину такого матеріалу на матеріал, який шкідник буде поглинати, як наприклад, штучне живильне середовище. Матеріал, який необхідно досліджувати, може складатися з рідини, твердої речовини або суспензії. Матеріал, який необхідно досліджувати, можна помістити на поверхню і потім надати йому можливість висохнути. У якості альтернативи, матеріал, який необхідно досліджувати, можна змішати з розплавленим штучним живильним середовищем і потім розподілити у камері для аналізу. Камерою для аналізу може бути, наприклад, чашка, тарілка або лунка мікротитрувального планшета.

Аналізи із сисними шкідниками (наприклад, попелиць) можуть включати відділення матеріалу, що тестують, від комахи перегородкою, в ідеальному випадку секцією, яку сисна комаха може проколоти частинами сисного ротового апарату, щоб забезпечити поглинання досліджуваного матеріалу. Часто досліджуваний матеріал змішують із стимулятором поїдання, таким як сахароза, щоб сприяти поглинанню досліджуваної сполуки.

Інші типи аналізів можуть включати мікроіїн'єкцію досліджуваного матеріалу у ротову порожнину або кишечник шкідника, а також розробку трансгенних рослин з наступним дослідженням здатності шкідника харчуватися на трансгенній рослині. Дослідження рослин може включати ізоляцію частин рослин, які зазвичай споживають, наприклад, у невеликі камери, прикріплені до аркуша, або ізоляцію цілих рослин у камерах, у яких утримуються комахи.

З рівня техніки відомі інші способи та підходи до аналізу шкідників, і їх можна знайти, наприклад, в Кобегізоп апа Ргеїзіег, ед5. (1992) Резііїсіде ріоаззауз м/йп аппгороаз, СКС, Воса

Каюп, Р... У якості альтернативи, аналізи зазвичай описано в журналах Агійгород Мападетепі

Тевіб5 та доигпа! ої Есопотіс Епіотоіоду, або їх обговорюють з членами Ентомологічного суспільства Америки (ЕБА).

У деяких варіантах здійснення ділянки ДНК, що кодують ділянку токсину в пестицидних білках, розкритих у даному документі, клонують у вектор експресії РМАГ-Са4х БЕ. соїї за геном та!ІЕ, що кодує мальтоза-зв'язувальний білок (МВР). Ці гібриди усередині рамки приводять у результаті до експресії гібридних білків МВР-Ахпі в Е. соїї.

Для експресії в Е. соїї ВГ21"0ОЕЗ трансформують окремими плазмідами. Окремі колонії інокулюють у середовище Лурія-Бертані, доповнене карбеніциліном і глюкозою, і вирощують протягом ночі при 37"С. Наступної доби свіже середовище інокулюють 195 добової культури і вирощують при 37"С до логарифмічної фази росту. Потім культури індукують 0,3 мМ ІРТО протягом ночі при 20"С. Кожний осад клітин суспендують в 20 мМ буфері Ттгіб5-СІ, рН 7,4 ж 200

ММ Масі «ж 1 мМ ОТ ч« інгібітори протеаз і руйнують ультразвуком. Для підтвердження експресії

Ко) гібридних білків можна застосовувати аналіз за допомогою 505-РАСЕ.

Усі безклітинні екстракти потім пропускають через стовпчик з амілозою, що приєднаний до хроматографа для рідинної експрес-хроматографії білків (ЕРГС) для афінного очищення гібридних білків МВР-ахті. Зв'язані гібридні білки елюють із смоли за допомогою 10 мМ розчину мальтози. Очищені гібридні білки потім розщеплюють або фактором Ха, або трипсином для видалення амінокінцевої МВР-мітки з білка Ахіті. Розщеплення та розчинність білків можна визначити за допомогою 505-РАСЕ.

Приклад 4. Перенос генів за допомогою вектора для експресії у рослинах

Кодуючі ділянки згідно з даним винаходом з'єднують з відповідними послідовностями промоторів і термінаторів для експресії в рослинах. Такі послідовності добре відомі з рівня техніки і можуть містити актиновий промотор рису або убіквитиновий промотор маїсу для експресії в однодольних рослинах, промотор ШВОЗ Агарідорзіх або промотор Самм 355 для експресії у дводольних рослинах і термінатори по5 або Ріпії. Методики одержання і підтвердження конструктів промотор - ген - термінатор також добре відомі з рівня техніки.

В одному аспекті даного винаходу конструюють і створюють синтетичні послідовності ДНК.

Ці синтетичні послідовності мають змінену нуклеотидну послідовність у порівнянні з вихідної послідовністю, але кодують білки, які, по суті, ідентичні вихідній послідовності.

В іншому аспекті даного винаходу конструюють модифіковані варіанти синтетичних генів таким чином, щоб отриманий у результаті пептид був націлений на органелу рослини, таку як ендоплазматичний ретикулум або апопласт. З рівня техніки відомі послідовності пептидів, які, як відомо, приводять до націлювання гібридних білків на органелу рослини. Наприклад, з рівня техніки відомо, що М-кінцева ділянка білка, який кодується геном кислої фосфатази білого люпину Гиріпи5 аіїби5 (ЗЕМВАМКФ ІО С1:14276838, Мійег еї аї. (2001) Ріапі Рпузіоіюду 127:594- 606), приводить до націлювання гетерологичних білків на ендоплазматичний ретикулум. Якщо отриманий у результаті гібридний білок також містить на С-кінці послідовність для утримання в ендоплазматичному ретикулумі, яка містить з М-кінця пептиду лізин-аспарагінову кислоту- глутамінову кислоту-лейцин (тобто мотив "КОЕЇ", ЗЕО ІО МО:6), то гібридний білок буде націлений на ендоплазматичний ретикулум. Якщо в гібридному білку на С-кінці відсутня послідовність що націлює на ендоплазматичний ретикулум, білок буде націлений на ендоплазматичний ретикулум, але в остаточному підсумку буде зв'язаний в апопласті. 60 Таким чином, даний ген кодує гібридний білок, який містить на М-кінці тридцять одну амінокислоту з гена кислої фосфатази білого люпину І иріпи5 аірби5 (ЗЕМВАМКФ ІЮ 01:14276838,

МіПег еї аїІ., 2001, 5ирга), злиту з М-кінцем амінокислотної послідовності даного винаходу, а також послідовність КОЕГ. на С-кінці. Таким чином, передбачається, що отриманий у результаті білок націлений на ендоплазматичний ретикулум рослини при експресії у рослинній клітині.

Рослинні експресійні касети, описані вище, поєднують з придатним для рослини селективним маркером, щоб полегшити відбір трансформованих клітин і тканин, і лігують у вектори для трансформації рослин. Вони можуть містити бінарні вектори для опосередкованої

Адгобасієгішт трансформації або прості плазмідні вектори для трансформації з використанням аерозолю або біолістичної трансформації.

Приклад 5. Трансформація клітин маїсу генами пестицидного білка, описаними в даному документі

Качани маїсу найкраще збирати через 8-12 діб після запилення. Зародки виділяють з качанів і при трансформації переважно використовують зародки розміром 0,8-1,5 мм. Зародки висаджують щитком угору у придатне середовище для інкубації, таке як середовище ЮОМб62А55 (3,98 г/л солей Мб; 1 мл/л (1000х маточного розчину), вітаміни Мб; 800 мг/л І -аспарагіну; 100 мг/л міоіїнозиту; 1,4 г/л І-проліну; 100 мг/л казамінових кислот; 50 г/л сахарози; 1 мл/л (маточного розчину з концентрацією 1 мг/мол) 2,4-0). Проте, придатні середовища і солі, що відмінні від ОМбЄ2А55 і відомі з рівня техніки. Зародки інкубують протягом ночі при 25"7С у темряві. Хоча інкубація зародків протягом ночі як така не є необхідною.

Отримані у результаті експлантати переносять у комірки сітки (30-40 на чашку), переносять на осмотичне середовище приблизно на 30-45 хвилин, потім переносять на пластину для аерозольної інжекції (див., наприклад, РСТ публікацію Мо УУО/0138514 і патент США Мо 5240842).

ДНК-конструкти, сконструйовані для експресії генів згідно з даним винаходом у рослинних клітинах, попадають за рахунок прискорення у рослинну тканину із застосуванням прискорювача пучка аерозолю, із застосуванням умов, які, по суті, описані в РСТ публікації Мо

ММО/0138514. Після аерозольної інжекції зародки інкубують протягом приблизно 30 хвилин на осмотичному середовищі і поміщають в середовище для інкубації на ніч при 25"С у темряві.

Щоб уникнути зайвого ушкодження експлантів, підданих аерозольній інжекції, їх інкубують

Зо протягом щонайменше 24 годин до переносу в середовище для відновлення. Зародки потім розподіляють у середовищі на період відновлення тривалістю приблизно 5 діб при 25"С у темряві, потім переносять на селективне середовище. Експлантати інкубують у селективному середовищі протягом періоду тривалістю до восьми тижнів залежно від природи і характеристик конкретного використовуваного методу відбору. Після періоду відбору отриманий у результаті калюс переносять на середовище для дозрівання зародків і культивируют доти, поки не спостерігається утворення зрілих соматичних зародків. Отримані у результаті зрілі соматичні зародки потім поміщають в умови з низьким рівнем освітленості та ініціюють процес регенерації за допомогою способів, відомих з рівня техніки. Отриманим у результаті пагонам дають можливість укоренитися на середовищі для укорінення, а отримані у результаті рослини переносять у горщики для розсади і розмножують як трансгенні рослини.

Матеріали

Середовище ОМб2А55 продукту С 149) розчину) У У 1 мол/л (маточний розчин з ! рН розчину доводять до рН 5,8 за допомогою 1М КОН/ЛМ КС, додають Сеїгйе (Зідта) у концентрації до З г/л і середовище автоклавують. Після охолодження до 50"С додають 2 мол/л маточного розчину нітрату срібла з концентрацією 5 мг/мол (Рпуіоїесппоіоду І абз).

Приклад 6. Трансформація генами згідно з даним винаходом рослинних клітин шляхом опосередкованої Адгорасіегішт трансформації

Качани найкраще збирати через 8-12 діб після запилення. Зародки виділяють з качанів і при трансформації переважно застосовують зародки розміром 0,8-1,5 мм. Зародки висаджують щитком угору у придатне середовище для інкубації та інкубують протягом ночі при 257С у темряві. Хоча інкубація зародків протягом ночі як така не є необхідною. Зародки приводять у контакт зі штаммом Адгобасіегішт, що містить придатні для опосередкованого Ті-плазмідою переносу вектори, протягом приблизно 5-10 хвилин і потім поміщають у середовище для спільного культивування приблизно на З доби (25"С у темряві). Після спільного культивування експланти переносять у середовище на період відновлення тривалістю приблизно п'ять діб (при 25"С у темряві). Експланти інкубують у селективному середовищі протягом періоду тривалістю вісім тижнів залежно від природи і характеристик конкретного використовуваного методу відбору. Після періоду відбору отриманий у результаті калюс переносять у середовище для дозрівання зародка та культивують доти, поки не спостерігається утворення зрілих соматичних зародків. Отримані у результаті зрілі соматичні зародки потім поміщають в умови 3 низьким рівнем освітленості та ініціюють процес регенерації, як відомо з рівня техніки.

Усі публікації і заявки на патент, згадані у даному описі, свідчать про кваліфікацію фахівців у даній галузі техніки, до якої належить даний винахід. Усі публікації і заявки на патент включені у даний документ за допомогою посилання тією самою мірою, як якби малося на увазі, що кожна окрема публікація або заявка на патент конкретно і окремо включена за допомогою посилання.

Хоча вищевикладений винахід був досить детально описаний з метою ілюстрації, а також у якості прикладу для чіткості розуміння, очевидно, що при практичному здійсненні можна вносити певні зміни та модифікації у межах обсягу прикладеної формули винаходу.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІЛОВНОСТЕИЙ

«Бір» сАМИСОВ, Кімбеврлі с.

ЛЕХТІНЕН, Дуан А. «ійо» БЕН ТОКСИНА ЖХМІСЛО та СПОСОБИ його ЗАСТОСУВАННЯ «РЗИУ АвАТ1ЛЛИ «во» 817/512536 «151 001-07-98 «БО 6 «302 РБаїсевиїо версія ЗУ сіб її «гії ЗБ558 сті дНЕ «ій» Басіїіав попу кісвівДйнів сади 1 вакчксвахми сасососокс зсазааачсво сосваастава засозеЕсаса астачаскча Бл хтіжацсевес ас Есас псезчєасво аблссзазаєх апеатанаве бедра вв 15

ЕЕЗВЕСсЦВтає вЕсбасвача їаспезласво агесвозуєа чзсвуаваазе гастасаво 150 зак«карвавасоц седулчавсс всздавасоа аватгтсавцч соввасвіаса соспсвиаве зо чЕстчЗаатав ссстовазкд сазасассна абацасачач забсвзчасзка заузобоачка зо вквсссостаавї спдакасекез сгазссцостоа саслвіїтоех сбебазавава готУукеося а5О чкзкосзахї: касове Ссвассзвов пеатасоаза аскссЕЄтая ссбеспклтв: ра; зозарусасе бобкочазсавй весла Бзагрсацса пааавсвова давства 55 спачесссгроче пекла своя сбзазаааЧо басчоцвась вевтаанаь Бакобасньая о сактсталавоа стбсааоєз сассосзаста абсосазесасх авдачазовв агзочкасас вип ввсїсавіва сагоавоваи зсчессоасвева васлокавссо пОЕСсовВаЗ слава БИ азкозаваскис виІсассаксов сс саїаисо воуоссосава кокасябсєа саке еав Ка чазасасгтс ач зазаавлитпасз затгевагтах восовалуяеє аатадісаюе тво зЕасіФЧчнасе паспіоваавввто зсессвовосб акастоаєов Сітка аост боптасрачня 155 ччечастава точ ооссовз Уччссотавек Сесвісазво зЗатазазезе ази та 00 чавсасзаєи аасвссвасе чЧтассзчаса КЧОдЕсхсок весессваа Кастассошкв 855 часквівтсес заг одайся боассоссвут тгвасасочеза арсЕсаєков заст тх іп0жо скачевгавосст васобочУуєе совавзосвоа ставок еаща КЕтспвВеачь ашосвеаєса 1085 чалядостсв Бобавсево кроасчеасцає вгасблочах баса тлоеЗв сцарасаточ і155 спавссатаса свлакокаєтес єЗзаЗстосевс абсваватавї посовЕкозе гесусачу їі чЕчасвикав схтаєсерове аапозінях свобадаавс падало шпость яевасстаєав іх чЧчсостадняч ЕссаЗссуЄє здаваєтеее сваєпосте вчора єЄвяв поуасливаєско 132 сазсотссосчс свассвоцаа спек сгочЧац счуасалоєчс сбасибсооов возазвтетац і1355 чЗазссзчеве сзахтсзисов «асчаскея асазачаває: сайзсаспкка оссзавссаку 845 тащечала кЗзЕжачепах сстачасчав асвВеосаве счасовосадос веде ссльаа Ї1555 павссчаєйзеасє боевосявє зер есівпоа сдсасваач сзсяуачисв спсавасавва іо ктгкгастооса рачзакстасо саваєсссяс сУуптавачес асасвссякт сокЕсвоашоа іБхо5 сттоссасвак сасодаласов доз васаз дазчачатаст сосссзаача зсозасцсєсУ 1589 час сота васавакгоасав чсанасавса асзсвссви асбоссвзвавав сакедпеоєова 1745 плавтсчЕса состссвасЄ доваасстає азвссссасавас гссвзашеаве сучас 1825 озактовцчє саабеебсстов дсаассовесв авазаазаача чавеесяай ботадавиве іно стачваяссок вадсссвтасї вохсстжкеаз асітсссває бесссавачї акасксзвсвах їла тчзаооасска чааєссивсов созовогсзасєцв част татає ачасссваєа часове 12385 і подо : шо срицяи : зп сзчсваваз взвсвсктчає досечаакно асссазчазвс зЗововчаноа Фосасеевая ФО сскакокав вкспасцчавю чалечеасаяс савазасоза го пчасацах Сваесавают шо збевачаоако свчссивяса щавЕчЕскве счданававК сечесесльяє садах во ес запсЧчЕкстча лаеаааслстава сзросозавс чпасстсовасса Сдчалолпавае БезстесоцУ деко авксствавівс саєсаьссаєь звічочсавс садассхсав асзазсвсда зага сУцив вия їхасзаттова восзазачає зчзасесгаїтісх аловозахев сопхсвекска годчоелдаєиє 230 ссдассаозвор стагосавес айв Есасе ззазваєвов заз ссЕва гтазавасесї запо звпгаросабта БбБгдаассСстьвома дасшізовтесст авпеасачксяа часте коса ак ета асеа сеосставасає зазассства взоУстасаедче сбассаоавос богу дасас пк сло свасчЧа авасосавс аспазачечсяа чЧезавастаа созазсаова соска 25ВО частЕчіссз зсазззатач аспесатлеяс апссвсввЕе кетесетоза савБссвнеаса ав заазкчеасво чоставасав чув е: Севасчассяє даосзстаУ зЧесводеода це чЧастеаччаяйа босгадванео зксозаозда ачобчсвак лесачаааса врасросчО во сувачасас слесазававзаа сочЧсазозса австлтчайая ассвсааєса здзазовсвя еВЕМ база воввосавав чосссе возив сусводаніск сао во ваббцевавос Бзасасайеає зроостатча сосвтчсово Зувсзаасас пресаховаа 28430 поравчавас стябстзссв чааріссси бчасєкосязия бобяиакоєо все со Мо зацавесася сосдатттанє сгтзсвосоо асекосгяка бдаблеватв введтсатад збо завдодчсча сЕссразевак азаианео чесаависсі бавгазозови забав З2о авсвчвакса БсзвксЗзкод зсоскеаєн Сссевувау зЗавоусвоваеа сКоковнив ЗІяО дуржжиті кит юри ри спек уче В фор Р дулю й сон у С о от впзичзеЕчЕЧЕ гос сачУє сс оесата сопособ БсоцБеає гасачесУкис алададлаве ве зІчочавнооа аКоесасаьноя воспсвісаза боеспгегаанчсча СТасасасявав подавав лсв ЗО чсаоссічечЧЕ ачааслачев сакссааЗзеа Зсчататачо Чсссаалтав сзКосиусув зо шетитриєехв о вочудедІви зи е ес щвезтичвиличхІ Басоессгадо арени З й т

Ко патАВИЯЄ. восашаеціь часа чесчє стату сому каста бак оу шк но статева Бавкоисттид сасостофрсос агнапазсвсв ппсптаспас часах 2455 тазасачаз гпазоссосса чЧеастстеяс ДІВ СВСяСоС посту аосовк силь с|су ки ще трико стро котру пу фо ут их ї тобою ци уки ду и ту чи А зізазазкак зассачочся васасласваоа адазсзрача аассататає са Сасзвавис шу дих ово ід; пра ци а п а о п дроті ту я пи а по п пп я пиши спчпрасоака васдашлсднає сеатавсвее сссасппнасвв дасте оаатацах ЗО а в у НН В НИКИ вк д пи кичЧазчевасл здвачиадасває созкозсаоа сазчетачеав Севосгсоска зов 3655 «і «ВІЇ ва джряогух сеітах «ек днк шила тий Зятш к р о дія іа» Бас ЗіБ свиті палепві з «Ох г техно зе руедк -о ре с-кету т с я. ух - Е шк ск ро сти г. -е ша віІдблпаевсоев ввасссачо псваоа са осстсасавво ЧЕстчавкдд ЕссстчААт т спазапчгокаа асячизчнзя часасатаста зпвавостеєсв ба мсвнало сома ках їла 125 пізссзосба сесавеестоло скказоозаєв сибасосово часа БоасвекасУг 155

ДОоюомоз фея І. іх сдду й су я кити шин НА НАННЯ ори о ой фо туя пах ксваєстчасс свататоазца ЗЕВС заУ сиесесстах чадасшовк: боБсшаоюев «ВУ ов пола ж чи чи - ср ст ія око ще зк уодь щи чи шим - фо ких

Сини ват тав чаштра пали ал Я, ЕТ сор коро век аа яе ВУ ШІ скзазсаасцас взучсчааси агакайвасо БаБшедозав састтачаву соосадавоса зво чЧапссоагосюь акссачеасс звазадозвова занос сесяо закохана пат ча

Чецоссасяла авлосастсс сект цацв чогааваняиксо аспааеєке кЕазЕсатоя за чисвсовсш волосгоовав пегабагая їсзевїї став сазасєривиос зок ВУ яв щу ШК ге еру ну кору колу рик и о прю яю при Нор ккд лю ка зх я ях и лаванди сес пажтеватає ассоавпотасс али звЕзстпаакЕ паса ви) грві тюрч и рано щреижлимроріатно еЯеич и гу ти ж тт Ко цо сичкживу т Воду Іти руху вол зЕсосзкзесг абасячнЕся ЧЕ чсаачс сбаопсасвака Сеча бос тро йо

ЧаткставкЕ ЕсСсаїсвахтя зЗЧоЗіззазтає аваквесЕсря слон васвегаде ЖИ шо в фе учеитрогі В з, іє сив и щі іхиклютодовО Кк одер итщовоодогодої: дого еконо пам чеессцчака бас тої зсссосваво гаЕчасоста пассвствссс авсссоавосв то поимотжк дня уч м св с пах зу тлу и шт и КК Ж и МК іму дими алу тихе ножик тра уч ик пах їла щу ї єЗзаса шапиБ ос КТ т Е ср ОЄНАС Є СІК їх оащОпеаасокоя пе пазах я

ЖЖ пу и я то сх куска вояк ер я сив с ЩЕ па Я уж сю с штуку хоч ж ем тлу ее сут

СИХІВ ЕсВв осла Е чЕача ТЕ сни паз ода нав завад СЕ тапсача ня ОО

Щ-рот- ту ж ик прин вот сич ху КІ оосихиж ап пд кдд падежу ті о сиіпатазвеаве агасеасдах ствІвссосво сзвосасвзасч сяазчсвачасв саатематих а де вт иеннкюя шк й 7 ооо и З и Ки Сн Сорок пун - з дюозаен є рих ж В юс, гу тцчастосст абсаватаат шосозкечас токФщоегоно чзЕзчавастя стае реа їжу спрею меч в В у тд, дж ювО о потич у п риф у «З і Я ок и пу тиж их ЕК Кути Ол вахичсацка сазлдсачавеох созазсУусєся зчасосабсава сасстазчава Босак Увх ЗО кину рт Ме ри см ск ку тю у хек яке ж ик те ки ик ке чек склу вим 5 р я фр чн ї дог павастєлеає бсзаавнсостлоає абессзіжза зчассваєстя саасшюкас сачорикенаг Т18О пон кущ ер НН в в в НН и в Но ни в НН и НК ог

БЕБІ ЕцовВОУ Говсавчечю ссаскЕссї асвазсвЕяч чзазссячио ославсассаа іо гужжучиткр Ко аж щра елект ж ді сл ке жи дехто тв дує ут иуия нн і дяту ОН зчЧчедавсоска аклажУаяє Сех ї оан їв о ччоссп С ч ач Заст Та ас тра че

ОК ов о прак ря Ки НА ще оч «дово ечрнн ших ач км и пуху рн В Іх, тЕкаЧасоваа йветоссвас зосзсвосває Сага уусаав саствасавоа Кассесаке ТО се у друк росв ек щон сих иа кр во и чи соиетюту 0 кое тв пулу зба чЕссссотоазча сзсвзизосац сосачачсоса ссавйасваєшв грат тспоаа сатлаабивпсо 38 дить ту є дожив во фе ті опрнв ня тре р ти нят ЖЕ ит гу ит пор ик кою ю в и, му ев учи Ка сазвзаслосає Бадсавачас асасекесюо «Ф«ассваава свкескцсоУє сСасчачасов ЯКО а некииня висная жпфжвизии тив три о пе кт у ту ик нижня и ем ник нен мч пк Ел чвЕктасат сс араєс косо асовапоавооя спасе вита кує. шо еиювю юю от ср биту ану тк ау. хи хх др ооо етениу рт фут ю В о іижіх ї у. фор воднеу чок чізазкаста асссваєсатії асссонзача сезгсососзча чевсїсякка сгоастксгсаєх мУво вілужирщ В нодих ож охо ов оо дове фетою. дерми І фс Я дю одфетия в ке пи ун й всвчасссовс австетатас сксавестнає зсожаавосав ссзассзазе пава вксв 1659 сецоту пиву ФІ мукою г оту ті іт ект гг зр з шкоккту жін он тот 5 о зчовассатсла азачазсвзуа сзавевацай Сссалдавсво стзсзвосвЗ адсосстгаосох ї680 вшижссосипа асЕписевао гочсссяввя: ататтсасав о каачиечесо опа КУ : прик дуб т ри : пон а п зи ан у п ре З що верог и савоптваст авчсстабас взчассоуваса зчезоссзгво сстФечсвстя васала. 150 кожи ту тк пу речи и. путі гу рати ни они пана явку и ж фев им й хи т щі дезозакавз астачавал айсасвааво ссазчкЗнатз хоста собою ї855 моя тік; ик ик зв о Же тю ік жьситі ні жи р. плж є свою че у киов він зісит ж пох ож - єї чазачачазе свазавовиа ассапвзосатчас ЄвсоатасєсУ втсвавевнес сечиогавем хЕВЗ2О сг У и у поВодм турою ар тр гу ху пору ї- няття лі. бр пули гу 5: чаабчестає соесзтчавее стуссесао звааввавчач зваксаткссза зале скава БаВО фі ужееужс що оновив шани 4 ту екв дич ли дих т в дети рі А часосовавс ззопосакче слаасоазчавь ббастоссвоаа зсосав шесесесате КО засососавс бчивзосссав ос ові кої» ке 887 «рій БАЛОК жк я тегу З яд ілі рр вит шк кіт Басеїіїав дикі вЧулапша лан З «Фото

Яну Дт пкт че й і 21 пдящо шо Хадету бика Жулоуу йти сті ла

Месб йвротТвКЕ їувш Те піп Бі сіп оСув їі Бро Теж Аша був Кева Авап 1 У і ся брат жу лох о ее Дика жи ча дошки ЕТ ю Жодним М СМ у вну спла

Ави РЕжсо Бі мес сіра Мебє ем оАвБИй АкФ осі йхя СІ Авросів бій типє го й за сі Ав оїВвг о Бго іє Ащроїїів дах цеб озек без ТБ БІ да Бела о жщей хо з - шина Кен Ту ли хау АЛІ Жак Вт у г Зоух в па Жоицкл дк БЕ вве ува вто пі Уві бі вне АК де сту ев Хіє дев 'бец

Зо 7 6 ря спо. ут рен Для жу Фу Феуня шує. ще со то кп що Талет Тощууч кри ож те тер ошіж Бе ве Бук о Руо Бех Бо ТтроАвр Аза Ейе Белсій сів

КИ г з. рин тоечУ вл ек КІ ту т т 1 Го. Гея Ф ся їх г т. Те 1

Тіе 5іч Зі Тем їїве Авр Зіп Пув їТЇв Бі Сід ра бек Аха Аів Пец у 2 ц?е их що з5 ях рук хи Мою и Жовква З ую Ит жо рю кл кб бок ЗЛ о В. о тя

Ажа її бех Ака Беч сій Оту їм біу зва іп Тек беж щі КУЄ Аа я як яв 90 оо Я

А не Ук ни о нн Ше х в В Ул пи ет У ни ке тва Мун

ЩО уп Кпе Аж дек ТтЕролМій АзЗз вврожо Тис дей Во Ала плей ду - с ва ль

МІВ В а я шу Дт др пт КІТ ун я ШИН Я Ас с слу ни НК п а ол бі щі Мес Аку ТвБЕ ціп бре Аві дя Мат аай бек Аа їз ТТ Ту Ув хи МІВ їа0 пе м о суч Жов Ж жху я точи мч хо хто сих -х тоже біжу іа їїе ко Пец Без Ат Мало мув во мів ши Маз пбеж Фев) іє БАХ зи еп в з шт,

М ї50 1585 ї5О в УНКІ Пп ни Ж ше поло А сх повиті жо Туя Юрик ТТ кт г пом бог 2-5 чаї тук ТЕЖ СЕ біз Аівз Ап Бей Нід Бе обак ТІі6 Збев до Бр ОУну я шк дою ке а 170 175 а ех клщ шо тк й хі титан У М Толу. ти т до пи Зі шо шт У пех Хаї Бе бі зій пу тр обіу Рпе дво т11е Аїд Ще ті Аеа обер 159 і І8І дови тн БИ Я : рю тож ла Сл Зк я и В Мотя Аз у ач бужЖ ТЕЖ бБвфш ей тТвх М ВБімБ6 Гі Не о ТвЕ т чЕ їЛпЕ БЕ пів СУ їзхї шИ оо «й Фу Меч смаки А друю про гир ук ок с ох жи. Е йо хи ин дк ніх таї пак ТЕротук ази тТпж сіб бе Аа АКка бей Ак осі бе АвпоБопа як І 215 ее хо 18 ко

Жря їз сою ізн 1-5 хо ст ки кед спр ль са Зола діях Ху пря лож худу тує

Щі ав укр очах МУш ТУКХ йзп оС РІ ка Ака Хар обемо т ВЕ Бе ТИХ псук ск тк пот

В ЗИ еВ 40 що т м з т ху яса ТЕ. о вч х Хттує е пе По т пз ч"аї ем йдю ЇБе Уві 5ек рем ріс рЕсо Ал о тух авр РгоОо ака ел тує гуд ри тк 245 ши ша жу кур пу усю біз Мія ти докт слу Защо уюио брюк ля то тів ой ТЕ бек де сій інші ТпПх одхка бід Уа тую бе Алро лей ще дк яв 28 й ати

ПО шЛь АБ я р Те с т нан лу пз ха ех нн: їжа їн Адв о АВ ко Зекоші У мах Ам ле Ре ТВбх дви о Уві АБЮ Бі а в Ж На

Б'є Отут нує 71 о ее то дитині Ж до тої Ме шин р ВО уч ух азрв обБех Т1іе Бей біє йсу пу Бо Міз Мей Мек АвБроблеа Меб Аюу Тух ту са сук У ххкх 29 ай НЯ!

Млин а Сороки рух ких жи СХД оте ярок и на ная то; Тов алею

СТіе ТЕЖ о їве Теж ТБ дар оАха чів Ав ів Беж да Ніш Ап окбей пе

Я Зі зи ЗО соя зх Гу ха лу и дю ГО а Ж - уст СК С до Ж ха ою, Жди. сх

ТЕ Ав шіУу нів бів тіє тіє Від її Аз ек діз Бі Бкч АвБЮ 112

Злц З св 350 Бон хат яко Хр ти - ут пз Юди й м ше тк УБьукх їТ ик нка ще дуг зві тТук БкоОо МаЗі Аяросіу Бех із віз 510 Ббе біс Меї Бус Ах Ро 7апй ЗА вх 4 АВ зем чолом Дом ні нет є оче ченко кн и ня суне шк лок Жан отр її Ахку Ре ойху екобгз Уяі Уві Зіц лі Ах Сек вве о гко Уві Тер ше щи пк 555 зво Ба ог фо я бух рю й У АЛ жк сих ква Й з их то ет тек вер ока су мах о тлХх їі тк Аій 1 У веж ту сСллі вк пе Стб Ух ат пк дет то З зо тео ббаує т расу Жтбуих Торт пр Во Ти Лл хАщо я ен Дама ки що тк бек Аіа Ні Бе Б Твж Ака іїзмі пі баї бі» Бек Авро гуд Ах ке зав за дв 3845 380 за 00

Шен їі що Моцу;р Теж б: бал ви й до бах; ж бек Мр шо ді Ха ек ех осіу Бек о Аши Му а таї ХБхЕ Аза бец Бе Ар оНіз таї Уві) дек два чу ще пп ЗО 55 іл шо тру у бу ня щоки Воно шк Бе У у бр и гя о лу одн Тит до

Нів 115 біу Тух пе Аку Ажч Аа ТБ Аза ТБтІ бі бек Аа ТУуд Дух

А отує вач Сея 425 ти: ев ан нта Ин ий те я Ха тину ПИЛ и що Собко ба АТ сСіпотТвЕ їТеш Тр;Е бек АтТа вхо Іїв Уві дер Ткр тіж Нів Бек пех дів

ЗАВ 240 «ча

Анни т їз Мих тож СТ М«ї тла веж Доки тот ни шок УЛ У хлдка ячна ста жо ве дп о цпув її1Е ОбУкК БК ер ВЕ їтТе ТЕХ паб Меб о био бе а 455 Би чаї цпув вів Нв ті Бе о сіу ех Ту ТБ обек Маї уаї Ажеа сбпру Ко

Бе аб ав ви

АНЯ Хівию Чим ж хг тод т - помив з греч ок ху кт тУрри Жврих сі вве Тве білу бі Авр о ТБ Тео да Ак с йза в піу ЖБЕ Бе

ОС ох Ок з по хаБ5 итрую Тр. Яма и вед ни сни м Не як кут бружо ж Воюмею пхтяно ду азу бли Мей: пів Узі Ап ті Аа Афв Ро Бей бек бій Акз тТух Ахщ

Кк ше я

ЗО ВАННИ 55 ал дошк кю плююих Ою Фк Си оно де тл- С жу Юре я "й сн х б"аі вка їїе Ага тує Ба ех ТЕ Тпк о Авгрорвм сім Рпе Мія: твБЕ о зек кл ше стре

З 529 рн тла ов йти ния Вт Те тк у Ар ет сах В до на Ма хи іже Ав сь ДЗ віз її вБй сля вів Ази о кпе ех діа ЖБК Ме Ду тир тх пла с дї

ЩО З Вл ож Ух и ве ит ж дужі жи их и ою и кача сту Ум ух дата сіу РО АБИ пем біб паж Ак Тв пе АгУ те ді бек КБавотТНЕ

ЗА БО пив зва пе Таичит УК их ту ше Ск ує ра ННЯ Кр ж Се че чих іерич тифу Я ех 7 -

Тк оБко Бе Ап КНе бек Бек йіа бій Бех їі Бпе Тк о Пебо ек Аа гу ач вах 5655 ПО п лине, ет ло я щ З у рЛКу юю чт я ко бах Яд ос Рожик ТО жк й у 31 ттв о Ав РБе Зех бат бі Ажи са Уві Тук тів Аворобжле ТІ біг вра зво 5 550 ща жЖіких А що й дя рн їх 1 ла я жах ему ТЛ хи В чаї Вко Аїа сім Уаї Твх Рбе о буя Аза бід тує Аврвобей пі) Аха Аза те ж пет 5ПТО БО трав боях х що бод тич Же не Тосг я. Щфонию Ж СТ йхта бій пу овгв Уві АБ Атїя беч Рі їЇсе5 бе ХВЕ Аа біз Ак ОБУ пе ял я ко бли Зашл 5

Тож мне ді ли йдем г - я Хек ау тА її хости чу ів ТЕ ав» озаі Те вер Тух Азев ї1їе ввзр бій ді вер ляж меш Уві 7, оче доз ї

БЕ Ва Ба 53 з. їх ши же. ро хх. тре клшукх тодуха я й т - Може, -- . с Хуикя сте о без пек осдх Го. спа БЕ Є чвоїєМ А ароша пу дх Фо хе кош ва5 пи вУй спі їм тва бод ток дія БУ дже їі щеїт дв а ка Аи інше їй -жалі пу ока ОБ ХУ АЖ шо Мвхху Мем св БІ За Ка т хна димі я я пгт

Бай Б 5

Кз Фосх Же Моск НИ Фі са на оч НН р р Яке

Ск М БО. ЛАТ РТ: Тпк о шт ї136 ДАЕ іх ше вм Ав Ов муУВ кре сі хе о по ВХ

Ко жаК ; ча ВІ сення Бе сеї ОБ «І» БІЛОК шою ни а А хі Басіїіїцав опипгіпцієпвів от З «800» 4

КА с : ме що ех Мк ект У же х. 1 «5 Ав Її Зк я Чркрує Й хи оо Мр

ТРЕКУ и ЕК МО сажа М ЖЕК УЖ заваА вх а АБО хаАш ША ОкаАЖж Оу АЛ АТХ

З ц и я тт РЕ: о дошеро тех має сторхті Шуми тезі Литри Жан рову тоажла Ти дою туїех вто жІіє Аяротів Бак їв Шев оте ТБ о біп ВНе ої їво аку сво вип ре -д лю ко й л 3 Ко, дн пи пав нь а я нь НН НН оои тех Б поз Жодач т СТО лях: пря

Чаї вхо піу Уві 5 19 ВБе Аза інв ПІ У мяеМЛ дав вв ем кш ТжЕ су 35 0 45 троса Жака тм Же біде - досл Ж що лан: Таз (Ля (Ла ж до ру кре Вне Буш вжо ех Ро ТЕроАзо Аів бе Фед біз біз ї1е 51 51 м що Бак 5 тк

Жошля уь йаю й тахдо То йбрар Шнх біду уми АЛ до из ЛК що то бю їча іде Азр осіп Був Ті Зім сі ВБпе цех Аха діз Бей дів Ті Бек 5 яКВ. 5 БУ они ИН тах я ок ТЛ хх хх лих ба Ж СУ 1 Вик УТро Уж Бо зх зр

Ахя ей сі шту ем бу са ій ТУук бУуз Бі Тек АТа Біч ТБ вде ща ВО ЗУ пеалнр о пдуде птчеру ЇХ г пиву пифтяє де дяки дл стві дою т кеух вд валч леж кшро ск Ра авр евро ги Ай Вжо дів Бей ду Ба ги Мат лк як я 150 155 МО

Де р я ЖІ. боже б Мр о дом общяе В доожуся ТЛ дм тн то жор що дея ха тах сов Бе Ап А Ме Ази Бах вів пйейпо обі Бе Ав лі Ка ї15 тіки 125 п тих нн Че ше сту сраку ит чт Хек бом о стол ду чна ось ен ол»лем дже Уві пук о ав нів оСіяй Ущоі бер о іфнацо лим Бек обаї рук тик я ять ча

ЛОЛИ Не: Іа ан ни Лот Мо товтажт роєм Си Тр ех: 7 Мол хи Фо Ек їн спіопп о Аїв Аза дво зер пів бем Беж ЇЇ Ле» Ах АвБр о Уді беж Уві Біле дя че я кА 145 159 ї53 з Ба оь мА сроюже. піт г - ска Ж ж я чно ті пов ори ям средяци кі в шу дів БУВвоткв бі вив Али ті дів о тТвк фі АвБп зе овжщ УЖ ТК їй ло 175 хе Кох тт ях ж вит сх ха ТИКИ балу ТИ сх, Щіня т У яз Фу і іх їж вх ри Кп Я Був тк беж тТвЕ Ар Но М Уві шен тр во 155 192 са дек трун пло т ояухт Крдумх о Же ке полин ож а кох ж ШІ шо врехуч п чик тук ви Те діє їм бай Аж ев Ах бі бек Ав» вве Мі Аню тт ще пак Ак

Га о 205 хте сх Тл Же ту 53 З ОА жи Мізух о нуту СИМ де сно ло : тури таїі бує ТУ йБи Су ВБо Ах Аха Авр»ро Бей ТЕ їм ТБ очЧаї пело о Авр 210 2718 й вика на а Фу кут Же ку лк моду тен Мов ТУ утих я Як кб ку ж бю чи ШО сю їїє Уа сек їви Бе бжо Ап о тує Авр Ру дк ви Тух Кхо бі Аку ех ЗО ра ап

Утреня МО кт пон Вр их ну ен йп а сту М ж біси додеюто Хо ки Кз А й 150 їв оБек беБлтоСімй Зм ТвкЕ АутЯ силу Уві тТук о шекс АБЮ ем о дей без вів аб ЗО я о тилу би Кук уз я дк Те Сх Мк хи сер Крюк ду блуд С дя

Авт БО ех сту Уді піу дви бе Та ВавоУаї 5 КЕ Не вар свв тТ1е зе уко тт

БИ а ко М

Ки бів Акч бив ржо ная Бен Мет АвВроБве Мек о дкз тТУЄ 118 ТЕ 118 як рИщи тек «ГЕ БО Ей

Тех Пе сов. До ЕТ вм Мт божа Ті іоє Мам Том Зфе бж 1 ОТ вх

ТтУк ТЕ др Ах НЕ Аз Діва 5ве вка Ніж Авт ілед РБе Тер АМЧа пі 255 28 з гоже поь т з АТО ті пак рун ЛЮ ах ли дожтиж бовуту 1 й що тріо дея

Ні сп ї1е Ті бін Ті жо шмаХ їв т У дх ж азр кв мам че вже ст ка дя сулул

КН аз не ай ж й дн и у б Тр вла й: ту А ди те су Ст Ле р; ОК Й чаї дей сі Важ бів Афа Сів кПа бі Меб Бго Ага ржо їЩМе Ахо вро

Зал З аа жо 2 ко ше ха І не и ни ша НЯ Ше ра фо 1 хх кка бек Ехо Уві Уа) сті бі Ас бек йоп ВЕ Уві Тхр АБр дк Су прах вен ж 345 зав 350 бек ТЕ діа ТЕ Ат біт бек отук пі ВБе пе Сі Мді ТБж беж А1д яки ди дик

З зво лай

Пре я тор Дт д - с юю дих р Ан м «є шоб ху с

Ні Рлє ії-е6л ТвВу азп опе Сію мні 01» Беж Аяро Туш Аху бет сСіу 5ег я 375 38 пока АН кт пим од кв ї Фдднч м жі хи рт и ла шо "з хе авп овув 1 Маї Те Ата ік Бхо аАвронів ві Маї Зет нав ЗТе 51у спро зай У яма їх 359 За5 00 іх ЖИ ож же Ву Яру дощ лежу підт Жшеях бйхвяи Жено су тон ттж вве Аж Ах АВ Тву Аза Тк бі» век Анни ТУЮ Ак сей жВх пев

А сія як що 410 з геї си в но а і и и НК НО с с 2 - і в дж б дови ух чи ух їпЕ Щек дів РЕ Ті ЗА шек ТЕр ЛбНЕ Нів хек зе АТ БІД РКО ВЕ 420 ай а беж М духа ЧОЛ и сх - З . мохи Ту ПІ но ви що х ше и иа на НЯ дви ої їі ТУЮ ех Авр Ак Ті тво сій Меї Реб5 бза дії був ІЗ 414о ЗА

Ге ние ее им ДАЧ с но а КН яд дея МЛ дж маю КМ пря

НішБ Тіє цею сіє бек бі ТвЕ бек УВІ Уаї Ак СіУу БкО о б1у вве ТБЕ 5 455 415 ве, Али поджж лечо То ту затох - тром пост, т 1 жа. Пл нечии Пт Чак м Ми пі бі» АвротТакє іа Аку АкУу Твк два о Уді 01» Ти Ба сту біл Ме че я Ал 480 гак й ох от о -х. я Ти ажих Ж ку Ж отим. од та. Ки як ОТО спіпоуай аз їі ВЗ вів ко ієц пек біп Ах Тук вка УМаі Акса Зі 48ва по 49585 ти біду що бле ке бу Дрю т г м ЗЕ Ті пар бле Ох вх тло, дха тек Аїв шеж ТЕЖ ть ЯЗзр осей біта Бе нів таж Беж ЛЕ Аза Бту шив к що

Од Зо а оче че СЕ ее й ЮК ом кети ок сі у Ах їх Тори Вож. а ПЕН АННИ

Ат вів Тіе Ба пів Аза дво бро беє Аїв Ту МЕ був Ахкассіу се щей доле: п1Е вхо 525 дзпобеп озіц 5ег Ат тк орпе Ах тпх Уаї хег рпв отр; тпЕ орто вве 550 по Зло а Яд: беж беж л го Фе ТЛ аву ТИ Ук ду А Сей Др Тр ят вип Бе Беж Беж й сбіп бек їт1 БЕ ле Ппей пек Ада Тур о Ав Бас па З их 260 с фіхає клт я й г Пен ЩЕ тиху ж сих щ-к т т з тц-ї жи ше ек ожех спіу йзп осів Маї тїчю її Ар оАгу З1е ів ре маї вго Від еВ УТ ТЗН т яти тА Журі ие ух КЯк анна т то ї Щі дах Зв Фор Ж бЗімй мадз теж Вне сімщ АТ сі ук АвроБею бій Аж Аж сі дув Ав кв яд ках 580 БЕХ зи р ин х Кк чи роя т би ТТЛ ше ря божий КУ тех Кя У ОМДУв кю Мк тах зи АТа цей ре сте Бек ТВ Анни єба Аа бі бей ДУБ ТК Адо ві БИЙ Бах хуя под Пк пошко У рою су ня я 2-31 сФбружо б дю жо лвщі роко кит - чаї тп Авр отут Ан тів сАвВвВ обій Уві зех бек бе Мі бій сСув тей д; как я

БО 15 ся

А ода Я У Гак ї гот. 5-21 т. шо рих. я т "ет та Я ча п од, хи бЗег Авю біз Бе буз цей АвросіЗ) був Ага бій ей ЕБе ста був Уві

БЕЛА 535 535 БІО ях я НО ге їх Ж жи й де хх ж ра скраЖх о ка те

Гу ТУух АїЗз пу бу без пек Авр обій Акч ав би Без біз де Ру да 853 щи з с м у тот : х оне ке пев жи ох двпоБре Твж Бек їі Айва У біл обо Ав Акоа Буш

БУ 5

«фе 8 «гук пк «ж обо «ій» БІЛОК туту» хижі Бо азаю ж ія зе што -2іЗз: вар; єпУкіпчівпвів вт «

КН Бо кри аниеннини че позда Сита ще я шою я ел тую я дя сову перу оз ж

Меї їєюв Авп одкчЧ оіло АжУ її АЗр Її 10 Тв обі дев бвж вжа Ії і а іп ї5 дов Ж тож ду ток стеж ую о пвх о оку т Ршш-к куски ле ту її гуіжтию

Акро жБіш йеж Бей ошШех дев ТВ о бТ1Є Біне Її Здема ЖЕСЯ са Ве Уаї ВК бот с зл щи иа Зо сх що чи ня КА Тл У ши уши т ОО до плину ЙО ур о Ві шу чаї СУ пе А Та Ге см їжі ТІ й роде ТТе Ер сі ЕнНае ББе тд до ак о 45

Ж оку Жіночі Ви Ва ло ву бот КІ ши ше Не Гокні НН г. ч г шия

Був жо беє Всо їхроАвр вів пе без Бі сів» її бів іп сео 1Т1е п щи Ще

ЗУ 55 и де вро сжхудо Ж з й йо Юр уулею ЗУ у жовч АТ до то я и тут

АввБій Був Т1е 5ів сіб ББе орех дуб Аїів ей оАїз Ті БЕК Акч Бей я то а ко серії кю Тошт Ируу Яра радо чехи срлюдо Тр що пек водо ти рат Нд а дю єди пів сі Бей біб зва сій тТук був зів ТУкК АТ 1 їв Ба Ах За їх ЩО 55 ет ях хе Лог жі ре бик МВ ях. у - ще Же ект кул Мпа ик сил ни їж ов дів Авр вхо нг дз ро дід їх й ІЗ спе Ме о Ажа тт

Зол зл 5 4 що АРХ 118 пів ве дво о Ан Мех Ади ес сАїв їевв їі ев Аа Т1е жа Гей о їм

КН ДН їх:

Ку ММ Ка о ки Маму Жіч м й Ху би Жумк буму ую У их 7 в і джу Мак був Ази біз СІ Уві бек Без їз Бест а Тух Хв бла А1а ду я - Ак дя 150 135 НЯ

З Ах тлоиухя СЛ ше шо що То тиж Туя яхт рум ЦІ шану Мр

КУ Хо хе ДУХт х жен КІ ким Ше зар ка жхЄх их хо КА ем ня ше ши ий тА

Аа оАВви Бей Нія гемо ех є Шви втя Дар оуаї бек Уа Ка сім ві ик г Й хи оту

Кен) 55 її

Чака пн хі Юних век ЩО Ки Уа ень УНН Ми и я Мн НН сто КОЗА НКУ СЬКУ Зо був їтрошіу ВКе дзпої1е Аів ТЕ тів Ав бес АтУ Тук Зх пла ей

З ї780 ДЛ ру сук Мр тк ло ТИЛ Тих в ух З ля ха щої бере о пахву. бЧихук у т

ТВЕ бу ЕДе їі Пів Жпс жує ТБ Бар ноз СУБ Уаї бек кр оТує вай ди рені За їВО і55 їз

Нидноюо Й т 4хо Жодух ен оду Мои их їі ее шк КІ (ряди си оф їх бі бем Аж дсч їви вич сіУу дек вва Бе НУЄ Аз оїхрв ові пуд час КТК сил 135 ою о тку Мк чук ШУ Моне Мои Мн У я ОТ Ту ук ие ба Ся т

Її Ана Сув Бе хз вйкч ЗО дез Тве пев їх ВА пев вро тіє Уді пря й р рух шк Б я

Шек їбендп Бе о Бко ди Ус АВхроБу ду що обехл пдек Бало ж і жа тн баг

«ту ач ват шля З 5 чО й х г. ту «с, ча жо спо м па ощі го ер оАй їшір їз їй дів дДаа вхо зак сій Бем ТьЕ Ак бЗіа мав ТУхХ бек оАвр о іши пПехз пем дід Аза РЕ

А: 250 ло шо веж су Уві Єємзу дви оце ТНК Ап оМаі Ар ові о Авродек ТР зб ТІЄ

І 280 за8 27 2 МХ ле х сь Ї. є т пр Пк. сь й ря чия її що тов бхо іє Та меж жи Юкх Меж ди ток тТіФф тв оте тую то

Аха Був Бко і о їец Ме Ач ББе Ме вка жук Ті Ти обі ту їх 278 сам ж; ; ді - - ті до їх ще тя роя -х ко Брі ож Те Бе б ему Ав щі т в'ізіє

Ар оАкя Ні зп вва дек Аа Ні Ай Бенц Рпе Ттровів спа у Вів бів кан 2385 зо и: ; - ще г г кре ох деко ДА у Б ко ст до и: ки шт кг щі ТЯ їїа гле Аза діє йвр оце Ада Сім Ак йвр о їле Уа) ТУкК Бка Уді дез й село в чек з2й 05 за: 315 БУ ча 1 в х з бра. Дер, іх Олія Ме о лікуу акту еену З х Деех Вна дух Ек

ЗБ Сех Аа АТ БТ Бе бі Ме Бко о Аку го їі Ажхщ вне Б пе стук сту з ве ЗИ 335 гро туваї уаї сій тів Аку беж Ая Ро уаї Тур дар вхо сіу Зек о тнЕ вжО Уві Уаї сі іє вку бЕшБ Ап Ро Уаї тТжр дар Аху сту : щу аг тА зу 34 хх З5О . - ре Е постери ди ях пірхх Кт лі: мщЩай ли деаж Та вах вве пів жвеЕ Аква біб веж ТУЮ біл вБе Рпе слу чаї Твс оБеє АТа нія ЕНе к ї ре ЗЕ

З Мв 5 о ВІ мо у г Я Тв пі баз іє бек днк тою ду бту (|У Ек й ев

Бач ТВ о Ахп пес; сіу Уаї і Бес АБроїв Ася бек біу бек ви У

НИХ з75 од

ЗО 375 ЗО зів Уа ТВ ві без жо Авр ой оУуаї Уві) Зек Яке іє бі тую ББее пів'Маї ТЕ Аза їжа жо вЕр опжЕ мах оах сек м. : Я і: я ї ож зу х й ха БІ звА КЕ в. шо, Я жк 11 Фавор о лу ву ю о тафти ях Сбор пі за ТтиЕ Щек вкч йха Ав ТВ Вів Трх шШіу Зек Ап тує ву ля Тв Тв тю ЗЕ

У т ше до 5 ах 410 41 соч «ш я хат жив реж т - ні - пи ек ко дії з з ВЕ а тку дах пуд вів Ехо їзїе Уві ек гр отпжх ніш бек ше лів ша БЕОо я и шу зи Не 8 их ЗО ня т г х т " кх МЕМ Талтра Туш; ЛА охух їв щі ті хе ТУуК бе Ав вжч їїе ТпЕ Стів Мек ро без чаї Буш вів НІВ се у і: : я ж. заг Река че ЗО ТЯ

Й т з «: у ті бек хлор хх Ма шлях ШЕ тТвк оці ц ї сх іл вуУ шах біу ТпкК Бек Узі Уаі Акоп ві те піу КБпе їпробіу сі»

І Е т и я 1855 З5О кв й ох ка хі Кк - ник уч фу

Н т Же дсп вж хну ді р вк о Ове о м Мет пп ді хвр оТвс ей бке Ага Твх Алл Уві піу ТВЕ Бо 01 біз Меї ; дв І ще жх 475 дод 458 то та 50 т р дер ки Дар ох дз З Аж те Аа пою

АЖ їі Аква аїа вхо пев о 5Зев зіп Акоа тує Аа У вх Її1е дк тек

Ал. до ж ав що тах кто оч н п т. пас в и о Ко и КК Не я Тез т ее си ЩЕ

Аїв Бех Тв о ТБк Авзп о Бех біт БІ Ні тв бе їїе о Ава щі Акс лі

Зоо ЗО О то ок ши ях жк шт не горя Ка є - ММ того Ти СИТІ у, ушу тоеутя

І1ї1е Авп бій ліз чай Рпе беж діа ту Мет Був Ака спі сі АІУ Пец що ц воли ще

В'о вжи жи он ше шк ШИ ко Кр Моюит о Ме Хр дач ЖУК но Мб ях Моя ду ше Мостя тал сма Беж АКа тТвх Кпе дко тТпк о Уаїх Беж Ре Тв Тл ЕЖОо Бпе Авп о впеє сл що со пе З ЩО ев 7 З 1 ун ни пн - лу й до Мат до Кал біде ру

Чек бек Вів сій бЗеї їТ1іє Рв ТБк о Бвиа бек о д1із Тер ав Ре беж ще

ЗА зай У. о пани чне я рити р Ту Пи НЕ рт Жим дин кни ше кр БОЖА НМ бі» Ач Сім Уві Тух Сів двроАху Ті бум Бе Уді хо Аів бій Уві пет о кс

Зах З ОТ «т - ї тр. р НН кан т з щи з дк щ кт дою Лоти. Ра

ТВх Рьео сій Аївз о щШій ТУуюк варю о Ббец осблічц Ат АТв о Сів Мув АТ Маї Ав хво За ЖИ со о др ДО но Сб вом пухкою Го А пера ожухі Жозе трек дк Зк рузе

Атів зе вірш їз шеж ТУ Авпосц ду Бк - У ем оьБУух ТЕ ав очав ХЕ пл мус я

ЗО вис то че ї - тку Ж Тс ж бій бідно и ТТ текла т осул Зк бек

Авр о Тук двр її Авросів Уві беж век їі У бів був би дек Ар я як кут що БЕЗ Би щи я гздуст - шо Тр ян токах зи кт: тор тех т тка ЗР то Х сій Бе сСув Ббем Аво бі пу Аа пів бе) бпе о бій пу У пу Тук ик мг Ох ш Й 5605 ву 515 -о

Ток й с пихи ще - Ма ох о нки НАННЯ Хот БТ 7 ж Того ТЛ дз іа ста жа Мем бек дар біб дго ей пед ем Пій вар о Бкос зви ве

А Ат щ ця БИ 5535 м - пд ша НАННЯ о м иЬ на 2 пох

ТВ шет Ті Авт Сі біп оцеч Ап Ах Був моя ошижки

Бе 55 ака їх хіт М о кет Я бю теж труд я ЗА К штулоту, зм ктуги рухи ер учи, ше ЦО учния послідов ть слк тю, ие «вва» лЛішптид, шо націлюється на сндоплзазкнатичний ретикулум дО Сук ля «00 в пув йвю шва цен

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Конструкція, яка містить гетерологічний промотор, функціонально пов'язаний з нуклеотидною послідовністю, яка кодує амінокислотну послідовність, що має пестицидну активність проти лускокрилого шкідника, де зазаначена нуклеотидна послідовність вибрана з групи, яка складається з: а) нуклеотидної послідовності, викладеної в 5ЕО ІО МО:2; р) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність будь-якої з ФЕО ІЮ МО:3-5.

2. Конструкція за п. 1, в якій зазначена нуклеотидна послідовність є синтетичною послідовністю, яку було сконструйовано для експресії у рослині.

З. Конструкція за п. 1, в якій зазначений промотор здатний керувати експресією зазначеної нуклеотидної послідовності у рослинній клітині.

4. Вектор, що містить конструкцію за п. 1.

5. Вектор за п. 4, який додатково містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує гетерологічний поліпептид.

6. Клітина-хазяїн, що містить конструкцію за п. 1.

1. Клітина-хазяїн за п. 6, яка є бактеріальною клітиною-хазяїна.

8. Клітина-хазяїн за п. 6, яка є рослинною клітиною.

9. Трансгенна рослина, що містить клітину-хазяїн за п. 8.

10. Трансгенна рослина за п. 9, яка відрізняється тим, що зазначена рослина вибрана з групи, що складається з маїсу, сорго, пшениці, капусти, соняшника, помідора, хрестоцвітих, перцевих, картоплі, бавовнику, рису, сої, цукрового буряку, цукрової тростини, тютюну, ячменю та олійного рапсу.

11. Трансгенне насіння, що містить конструкцію за п. 1.

12. Рекомбінантний поліпептид з пестицидною активністю проти лускокрилого шкідника, де зазначений поліпептид містить гетерологічну лідерну послідовність або транзитний пептид, фунціонально пов'язаний з поліпептидом, що містить амінокислотну послідовність будь-якої з ЗЕО ІЮ МО:3-5.

13. Поліпептид за п. 12, який додатково містить гетерологічні амінокислотні послідовності.

14. Композиція, що містить поліпептид за п. 12.

15. Композиція за п. 14, яка відрізняється тим, що зазначена композиція вибрана з групи, яка складається з порошку, дусту, пелети, гранули, аерозолю, емульсії, колоїду та розчину.

16. Композиція за п. 14, яка відрізняється тим, що зазначена композиція отримана за допомогою сушіння, ліофілізації, гомогенізації, екстракції, фільтрації, центрифугування, осадження або концентрування культури бактеріальних клітин.

17. Композиція за п. 14, яка містить від приблизно 1 95 до приблизно 99 95 за масою зазначеного поліпептиду.

18. Спосіб контролю популяції лускокрилого шкідника, що включає приведення зазначеної популяції у контакт з пестицидно-ефективною кількістю поліпептиду за п. 12.

19. Спосіб знищення лускокрилого шкідника, що включає приведення зазначеного шкідника у контакт з або згодовування зазначеному шкідникові пестицидно-ефективної кількості поліпептиду за п. 12.

20. Спосіб одержання поліпептиду з пестицидною активністю, що включає культивування клітини-хазяїна за п. 6 в умовах, за яких експресується молекула нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид.

21. Рослина із стабільно вбудованим в її геном ДНК-конструктом, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує білок, що має пестицидну активність проти лускокрилого шкідника, яка відрізняється тим, що зазначена нуклеотидна послідовність вибрана з групи, яка складається 3: а) нуклеотидної послідовності, викладеної в 5ЕО ІО МО:2; р) нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність будь-якої з ФЕО ІЮ МО:3-5.

22. Рослина за п. 21, яка відрізняється тим, що зазначена рослина є рослинною клітиною.

23. Спосіб захисту рослини від шкідника, який включає експресію в рослині або її клітині нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний поліпептид, який має пестицидну активність проти лускокрилого шкідника, де зазначену нуклеотидну послідовність вибрано з групи, яка складається з: а) нуклеотидної послідовності, викладеної в ЕС ІО МО:2;

р) нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність будь-якої з ФЕО ІЮ МО:3-5.