CN102869244B - 用晶体1be和晶体1f(cry1be和cry1f)蛋白的组合进行的昆虫抗性管理 - Google Patents
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Abstract
本发明部分地涉及叠加Cry1Be蛋白和Cry1Fa蛋白以防止昆虫通过自身而发展针对任意一种毒素的抗性。如本文中更详细的讨论，提供的蛋白对是特别有利的组合，因为没有已知的其它蛋白对能提供对秋粘虫(Spodoptera frugiperda，FAW)和欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis，ECB)害虫两者的高水平的控制和非交叉抗性。这种双重的非交叉抗性也是有利的，因为这能减少多种非交叉抗性蛋白靶向这些昆虫时所需要的蛋白/基因的数量。这能减少或消除避难所面积的需要。从而，本发明也通常地涉及使用四种基因以提供三种蛋白的对第一种昆虫的非交叉抗性控制和三种蛋白的对第二种昆虫的非交叉抗性。在优选的实施方式里，靶标昆虫是FAW和ECB。
Description
发明背景
人类种植玉米以用于食物和能量的供应。昆虫吃并损害植物从而破坏这些人类的努力。
目前已经通过植物表达编码来自苏云金芽孢杆菌的Cry1Fa蛋白的晶体（Cry）δ内毒素基因而实现了这些害虫的植物内转基因控制。Cry1Fa是目前Dow AgroSciences的HerculexTM品牌下的转基因玉米种子(Herculex，Herculex-Extra，和Herculex-RW)中的毒素蛋白，其对秋粘虫(FAW，Spodoptera frugiperda)和欧洲玉米螟(ECB，Ostrinia nubilalis)昆虫害虫有抗性。该蛋白通过结合至位于昆虫中肠内的特定受体并在肠细胞上形成孔而起作用。这些孔的形成阻止昆虫调节渗透压平衡并导致其死亡。
然而，存在一些情况，即昆虫可能能够通过其肠道中结合Cry1Fa的受体的遗传改变而发展对Cry1Fa活性的抗性。产生具有降低的结合Cry1Fa能力的受体的昆虫会对Cry1Fa的活性有抗性，从而在表达该蛋白的植物中存活。
当植物在生长状态期间持续表达单一的Cry毒素时，有这种情况，即昆虫可以通过昆虫肠道内的结合Cry1Fa毒素的受体的遗传改变而发展对该蛋白的活性的抗性。由受体的这些改变而引起的毒素结合的降低会导致Cry1Fa毒性的降低，并可能导致最终作物中表达的蛋白的效力降低。参见例如US 2009 0313717，其涉及Cry2蛋白加Vip3Aa，Cry1F或Cry1A以控制玉米夜蛾(Helicoverpa zea)或棉铃虫(armigera)。WO 2009132850涉及Cry1F或Cry1A和Vip3Aa以控制草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)。US 2008 0311096涉及Cry1Ab以控制Cry1F-抗性的ECB。
其它Cry毒素列在官方B.t.命名委员会的网站上(Crickmore et al.；lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。参见所附的附录A。目前有近60种主要的组的“Cry”毒素(Cry1-Cry59)，和其它Cyt毒素和VIP毒素等等。各个数字组的很多具有大写字母的亚组，而大写字母亚组具有小写字母的亚-亚组。(例如，Cry1具有A-L，而Cry1A具有a-i)。
参考文献van Frankenhuyzen(2009)(J.Invert.Pathol.101:1-16)，例如，阐
述了由很多靶标害虫和大量毒素，可以潜在的选择来控制靶标害虫。参见例如van Frankenhuyzen的图3。可以作为靶标的(很多种之中的)一种害虫可以包含欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，对于该昆虫，van Frankenhuyzen的图3显示了对ECB活性的17种毒素，和一种可能有活性。没有这些选项的完全列表。
van Frankenhuyzen的图3也阐明了每种Cry蛋白具有独特的活性谱——其对一些昆虫有活性而不是其它的。Cry蛋白典型地结合昆虫肠中细胞的的受体，并且这是影响活性谱的一个因素。一种Cry蛋白的受体可以在一些昆虫中找到而不是其它的；一种给定的昆虫可能具有一或多种Cry蛋白而不是其它Cry蛋白的受体。
已知有很多可能的靶标昆虫，并且有针对任意给定昆虫的活性的很多可能的Cry蛋白，单独的数字证明了抗性控制问题的复杂性。考虑到van Frankenhuyzen鉴别出仅18种蛋白对ECB有或可能有活性，这将使得数百种可能的毒素对以测试其组合。
另外，竞争性/非竞争性结合分析不是一个容易的任务。这会涉及放射性标记和放射性标记的蛋白的取代的分析。这本身是一种复杂的技术。
尝试直接使用抗性昆虫也是很复杂的。昆虫的抗性株必须经发展针对给定蛋白的抗性。Siqueira(June 2004；J.Econ.Entomol.，97(3):1049-1057)陈述了(在摘要中)“不同毒素之间的交叉抗性的测试受限于缺乏抗性克隆”。这表明了获得用于分析蛋白的抗性管理潜力的抗性昆虫株的困难性。当涉及蛋白对时，可以使用任一蛋白以尝试筛选抗性昆虫的发展。
Siqueira等也在摘要中陈述了Cry1Ab筛选(即，发展对Cry1Ab抗性的ECB克隆)“…导致多种其它毒素的敏感性的降低…”。这表明了交叉抗性的现象。Cry1Ab抗性ECB对“多种其它毒素”有交叉抗性。
从而，选择对同一种(非抗性)昆虫有活性的两种蛋白仅仅是解决问题的起始点，如果致力于抗性主题。对非抗性昆虫的活性水平是另一个因素。vanFrankenhuyzen的图11显示即使在选择用于测试针对ECB(非抗性)的12种毒素的组之间，其它Cry蛋白(例如Cry1Ac，Cry1Bb，和Cry2Aa)会比现在声明控制ECB的这些更有活性。
发明概述
本发明部分地涉及叠加Cry1Be蛋白和Cry1Fa蛋白以使得植物更持久并 更少的倾向于昆虫通过蛋白自身而发展对这任意一种蛋白的抗性。这些叠加可以特别用于靶标欧洲玉米螟(ECB)。
如本文中更详细的讨论，提供的蛋白对是特别有利的组合，因为没有已知的其它蛋白对能提供对秋粘虫(Spodoptera frugiperda，FAW)和欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis，ECB)害虫两者的高水平的控制和非交叉抗性。
这种双重的非交叉抗性也是有利的，因为这能减少多种非交叉抗性蛋白靶向这些昆虫时所需要的蛋白/基因的数量。这能减少或消除避难所面积的需要。从而，本发明也通常地涉及使用四种基因以提供三种蛋白的对FAW的非交叉抗性控制和三种蛋白的对ECB的非交叉抗性。
发明详述
本发明包括Cry1Be蛋白和Cry1Fa蛋白成对的应用。本发明也部分地涉及三倍叠加或三种(或更多)毒素的“金字塔”，以Cry1Fa和Cry1Be蛋白作为基础对。本发明的蛋白的基础对提供了两种蛋白，其提供对两种昆虫的非交叉抗性活性——秋粘虫(FAW；Spodoptera frugiperda)和欧洲玉米螟(ECB；Ostrinia nubilalis)。这使得该蛋白基础对称为尤其有利的组合，因为没有已知的其它蛋白对能提供对这两种昆虫的高水平的控制和非交叉抗性。
在一些优选的金字塔实施方式里，可以向该基础对加入另一个蛋白以提供具有针对ECB的活性的第三种蛋白。这些优选的金字塔组合的一些是Cry1Fa蛋白加Cry1Be蛋白加另一种选自Cry1Ab，Cry2Aa，Cry1I，和DIG-3蛋白的蛋白毒素/基因。
在一些优选的金字塔实施方式里，可以向该基础对加入另一个蛋白以提供具有针对FAW的活性的第三种蛋白。这些优选的金字塔组合的一些是Cry1Fa蛋白加Cry1Be蛋白加另一种选自Vip3A，Cry1C，Cry1D，和Cry1E的蛋白毒素/基因。
在一些优选的金字塔实施方式里，根据Cry1F和Cry1Be两者针对ECB和FAW两者的活性，本发明允许使用第四种蛋白，其中这四种蛋白的三种提供针对ECB的非交叉抗性行为，并且这四种蛋白的三种提供针对FAW的非交叉抗性行为。优选的四倍叠加是Cry1Fa加Cry1Be加：Cry1C，Cry1D，Cry1E，或Vip3(靶向FAW)，加Cry1Ab，Cry2A，Cry1I，或DIG-3(靶向ECB)。
同时提交的题目为“Vip3Ab用于抗性昆虫管理的用途”提供的数据显示 Vip3Ab可用于与Cry1F一起管理FAW抗性的杀虫蛋白，并且Vip3Ab和Cry1F不竞争性结合FAW膜制备物。
USSN 61/284,281(2009年12月16日提交)显示了Cry1C对Cry1F抗性FAW是有活性的，而USSN 61/284,252(2009年12月16日提交)显示了Cry1D对Cry1F抗性FAW是有活性的。这两个申请也显示Cry1C不与Cry1F竞争结合FAW膜制备物，并且Cry1D不与Cry1F竞争结合FAW膜制备物。
USSN 61/284,278(2009年12月16日提交)显示了Cry2A对Cry1F抗性ECB有活性。
Cry1Ab在US 20080311096中被公开用于控制Cry1F抗性ECB。
DIG-3在US 20100269223中公开。
例如，Vip3毒素，(在一些优选实施方式里包括Vip3Ab)列在所附的附录A中。Cry蛋白也被列出。那些GENBANK号也可以用于获得本文公开或提及的任何基因和蛋白的序列。
本发明也常规地涉及三种杀虫蛋白的用途(在一些优选实施方式里是Cry蛋白)，所述杀虫蛋白不引起相互之间针对单一靶标害虫的交叉抗性。本发明也常规地涉及四种杀虫蛋白的用途(在一些优选实施方式里是Cry和Vip蛋白)，其组合以提供针对两种靶标昆虫的高水平控制和非交叉抗性活性。
生产本发明的蛋白的组合的植物(和种植该植物的面积)也包含在本发明的范围之内。也可以加入其它的毒素/基因，但是优选的三倍和四倍(四种蛋白/基因)叠加根据本发明可以便利地和令人惊讶地提供针对FAW和/或ECB非竞争性活性的三种蛋白。这会有助于减少或消除对避难所面积的需求(即，少于40%，少于20%，少于10%，少于5%，或甚至0%的避难所)。从而种植了超过10英亩的田地也包含在本发明之内。
提供的多核苷酸优选在遗传构建体中并在非苏云金芽孢杆菌启动子的控制(可操作地连接/包含)之下。提供的多核苷酸可以包含用于在植物中增强表达的密码子。
为了阻碍昆虫发展针对Cry1Fa蛋白的抗性的能力，我们鉴别了不竞争性(与Cry1Fa)结合至蛋白受体的Cry毒素。Cry1Fa不取代结合至位于FAW和ECB幼虫的昆虫肠道中的受体的Cry1Be。我们发现Cry1Be Cry蛋白或者完全结合不同受体，或者在其受体结合相比于Cry1Fa中仅部分重叠。这些Cry1Be毒素对FAW和ECB幼虫的能力，尽管不完全结合于Cry1Fa相同的受***点，显示 了其毒性将不会受到这样的昆虫的影响，所述昆虫发展了Cry1Fa受体的遗传改变，以作为变得对Cry1Fa毒性有抗性的机制。从而通过降低肠道受体结合Cry1Fa的能力而发展了对Cry1Fa抗性的昆虫将仍然对Cyr1Be蛋白敏感，后者结合其它的受***点。我们获得了生物化学数据支持这点。
从而转基因植物中表达的这些蛋白的组合提供了有用的和有价值的机制以减少田地中昆虫抗性的发展的可能性，并从而导致对避难所的需求减少。已经研究了这些Cry1Be蛋白对其它主要昆虫害虫的活性，包括对Cry1Fa敏感的和抗性的(rFAW和rECB)，如表1所示，Cry1Be对抗性和敏感ECB幼虫均有活性。这些数据显示了Cry1Be毒素相比于Cry1Fa在昆虫肠道中与分离的靶标位点作用——从而成为优秀的叠加成员。
具有一或多种额外的Cry基因的表达叠加的Cry1Fa的作物，例如表达Cry1Be蛋白毒素的那些，会导致防止昆虫发展对表达这些蛋白毒素的转基因植物的活性的耐受性的能力的有效管理策略。由于我们显示了Cry1Be蛋白相比于Cry1Fa在不同的位点作用，如果抗性通过结合至Cry毒素的昆虫肠受体的亲和力的变化而发生，该变化必须同时发生在至少两个不同的受体上以使得昆虫在表达多种蛋白的植物上存活。发生这种情况的可能性是非常小的，从而增加了转基因产物的持久性以防止昆虫能够发展对蛋白的耐受性。
我们放射性碘标记了Cry1Be蛋白的胰蛋白酶截短形式并用放射性受体结合分析技术来测量其与位于昆虫肠膜中的推定受体蛋白的结合作用。肠膜通过Wolfersberger的方法制备为刷状缘膜囊(BBMV)。毒素的碘化作用通过来自Pierce Chemicals的碘珠或碘处理的试管来进行。放射性标记毒素的特定活性为约1-4μCi/μg蛋白。基本上通过Liang(1995)的流程进行了结合研究。
使用标记的Cry1Fa的其它竞争性结合数据也展示在下文的实施例部分。这些数据也显示出Cry1Fa和Cry1Be对ECB和FAW两者的非交叉抗性活性。
本文展现的数据显示相比于Cry1Fa，Cry1Be蛋白结合昆虫肠中的分离的靶标位点。从而，这两种蛋白会成为优秀的叠加成员。
根据本发明有用的基因和毒素包括但不仅是公开的全长序列而且包括这些序列的片段，变体，突变，和融合蛋白，其保留本文特别示例的毒素的特征性杀虫活性。如本文所用，术语基因的“变体”或“变异”指这样的核苷酸序列，其编码相同的毒素或者编码具有杀虫活性的等价毒素。如本文所用，术语“等价毒素”是指具有与所要求的毒素相同或基本上相同的针对目标害 虫的生物活性的毒素。
如本文所用，边界展现约95%(Cry1Fa的和1Be的)，78%(Cry1F的和Cry1B的)，和45%(Cry1)序列同一性，参考“Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins”，N.Crickmore，D.R.Zeigler，J.Feitelson，E.Schnepf，J.Van Rie，D.Lereclus，J.Baum，and D.H.Dean.Microbiology and Molecular Biology Reviews(1998)Vol 62:807-813。这些切断也可以仅提供于核心蛋白(例如，Cry1Fa和Cry1Be核心蛋白)。
示例的毒素的保留杀虫活性的片段或等价物也在本发明的范围之内。同样，由于遗传密码子的冗余性，多种不同DNA序列可以编码本文公开的氨基酸序列。本领域技术人员能建立这些编码同样的，或基本上同样的毒素的可选的DNA序列。这些变体DNA序列在本发明的范围之内。如本文所用，涉及“基本上相同”的序列是指具有氨基酸取代、删除、添加或***而不从本质上影响杀虫活性的序列。编码保留杀虫活性蛋白的基因的片段也包括在该定义之内。
根据本发明的鉴别编码毒素的基因和基因部分的进一步的方法是通过使用寡核苷酸探针。这些探针是可探测的核苷酸序列。这些序列可以通过依靠合适的放射性标记或可以通过固有的荧光来实现可探测性，描述于国际申请号WO93/16094。本领域公知，如果探针分子和核酸样品通过形成两个分子间强烈的碱基配对键而杂交，则可以推定该探针和样品具有基本的序列同源性。优选地，杂交是在严紧条件下通过本领域公知的技术来进行，描述于例如Keller，G.H.，M.M.Manak(1987)DNA Probes，Stockton Press，New York，N.Y.，pp.169-170。盐浓度和温度组合的一些实例如下(为了增加严紧度)：2X SSPE或SSC在室温下；1X SSPE或SSC在42℃；0.1X SSPE或SSC在42℃；0.1X SSPE或SSC在65℃。探针的检测提供了用已知方式确定杂交是否发生的方法。这样的探针分析提供了鉴别本发明的毒素编码基因的快速方法。根据本发明的用作探针的核苷酸片段可以使用DNA合成器和标准过程来合成。这些核苷酸序列也可以用做PCR引物以扩增本发明的基因。
本文特别示例了本发明的某些毒素。由于这些毒素仅仅是本发明的毒素的示例，很显然本发明包含变体或等价毒素(和编码等价毒素的核苷酸序列)，所述等价毒素具有与示例毒素相同或类似的杀虫活性。等价毒素具有与示例 毒素的氨基酸同源性。这种氨基酸同源性典型地大于75%，优选大于90%，最优选大于95%。氨基酸序列的同源性在毒素的关键区域是最高的，所述关键区域对生物学活性起作用或者涉及三维构象的确定，其最终也为生物活***。在这点上，某些氨基酸取代是可接受的并且是被期望的，如果这些取代在对活性不关键的区域或者是不影响分子的三维构象的保守氨基酸取代。例如，氨基酸可以位于下列类别中：非极性；不带电极性，碱性，和酸性。保守性取代，即其中一类的一个氨基酸替换为同样类型的另一个氨基酸，也在本发明的范围内，只要该取代不本质上改变该化合物的生物活性。下面是属于每个类的氨基酸的实例的列表。在一些情况下，非保守取代也可以进行。一个重要事实是这些取代必须不显著损害蛋白的生物活性。
植物转化。一种用于生成本发明的杀虫蛋白的优选的重组宿主是经转化的植物。可以使用本领域中公知的多种技术来将如本文中所公开的编码Bt毒素蛋白的基因***植物细胞中。例如，包含大肠杆菌(Escherichia coli)中的复制***和容许选择经转化的细胞的标志物的大量克隆载体可用于准备好将外来基因***高等植物中。例如，载体包括pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184，等等。因而，可以将具有编码Bt毒素蛋白的序列的DNA片段在合适的限制性位点***载体中。可以使用所得的质粒对大肠杆菌转化将大肠杆菌细胞在合适的营养培养基中培养，然后收获并裂解。将质粒回收。序列分析、限制性分析、电泳、和其它生物化学-分子生物学方法一般作为分析方法实施。在每次操作后，可以将使用的DNA序列切割，并与下一DNA序列连接。可以在同一或其它质粒中克隆每个质粒序列。根据将期望的基因***植物中的方法，其它DNA序列可以是必要的。如果例如使用Ti或Ri质粒转化植物细胞，那么至少Ti或Ri质粒T-DNA的右侧边界，但是经常是右侧和左侧边界必须作为要***的基因的侧翼区连接。T-DNA转化植物细胞的用途已经透彻研究，并且充分记载于EP 120516,Lee和Gelvin(2008),Hoekema (1985),Fraley等,(1986),及An等,(1985)，而且是本领域中完善建立的。
一旦将***的DNA在植物基因组中整合，它便是相对稳定的。转化载体通常含有选择标志，其对经转化的植物细胞赋予对抗微生物剂或抗生素诸如Bialaphos、卡那霉素、G418、博来霉素、或潮霉素等的抗性。因而，个别采用的标志物应当容许选择经转化的细胞，而不是不含***的DNA的细胞。
大量技术可用于将DNA***植物宿主细胞中。那些技术包括使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化剂用T-DNA的转化、融合、注射、生物射弹(微粒轰击)、或电穿孔以及其它可能的方法。若使用土壤杆菌进行转化，则必须将要***的DNA克隆入特殊的质粒中，即克隆入中间载体中或克隆入二元载体中。可以通过由于与T-DNA中的序列同源的序列所致的同源重组将中间载体整合入Ti或Ri质粒中。Ti或Ri质粒还包含转移T-DNA必需的vir区。中间载体不能在土壤杆菌中自身复制。可以依靠辅助质粒将中间载体转移入根癌土壤杆菌中(接合)。二元载体在大肠杆菌和土壤杆菌中都能自身复制。它们包含选择标志基因和接头或多接头，其以右侧和左侧T-DNA边界区为框。可以将它们直接转化入土壤杆菌中(Holsters等,1978)。用作宿主细胞的土壤杆菌包含携带vir区的质粒。vir区是将T-DNA转移入植物细胞中必需的。可以含有别的T-DNA。使用如此转化的细菌来转化植物细胞。有利地，可以将植物外植体与根癌土壤杆菌或毛根土壤杆菌一起培养以将DNA转移入植物细胞中。然后，可以在可含有供选择用的抗生素或抗微生物剂的选择培养基中自感染的植物材料(例如，叶块、柄(stalk)段、根，而且还有原生质体或悬浮培养的细胞)再生全植物。然后，可以对如此获得的植物测试***的DNA的存在。在注射和电穿孔的情况中质粒没有特殊需要。有可能使用普通的质粒，诸如例如pUC衍生物。
经转化的细胞以常见的方式在植物内部生长。它们可以形成生殖细胞，并且将转化的性状传递给后代植物。可以将此类植物以正常的方式培养，并且与具有相同转化遗传因子或其它遗传因子的植物杂交。所得的杂种个体具有相应的表型特性。
在本发明的一个优选的实施方案中，会用基因转化植物，其中已经对植物优化密码子选择。见例如美国专利No.5380831，在此通过提及而将其收录。虽然在本文中例示了一些截短的毒素，但是Bt领域中公知的是，130kDa型(全 长)毒素具有作为核心毒素的N端半部分和作为原毒素“尾部”的C端半部分。如此，合适的“尾部”可以与本发明的截短的/核心毒素一起使用。见例如美国专利No.6218188和美国专利No.6673990。另外，用于创建用于植物的合成Bt基因的方法是本领域中已知的(Stewart和Burgin,2007)。优选的转化植物的一个非限制性例子是能育的玉米植物，其包含编码Cry1Fa蛋白的植物可表达基因，而且进一步包含编码Cry1Da蛋白的第二植物可表达基因。
可以通过轮回选择育种，例如通过回交来实现Cry1Fa-和Cry1Ca-决定性状对近交玉米系的转移(或基因渗入。在此情况中，首先将期望的轮回亲本与携带适合于Cry1F-和Cry1C-决定性状的基因的供体近交物(非轮回亲本)杂交。然后，将此杂交的后代与轮回亲本回交(mate back)，接着在所得的后代中选择要自非轮回亲本转移的期望的性状。在与轮回亲本回交及选择期望的性状的3个，优选地4个，更优选地5个或更多个世代后，后代在控制所转移的性状的基因座方面会是杂合的，但是在大多数或几乎所有其它基因方面会与轮回亲本一样(见例如Poehlman和Sleper(1995)Breeding Field Crops,第4版,172-175;Fehr(1987)Principles of Cultivar Development,第1卷:Theory and Technique,360-376)。
昆虫抗性管理(IRM)策略。例如，Roush等概述了2毒素策略，又称作“金字塔化(pyramiding)”或“叠加”，用于管理杀虫转基因作物。(The Royal Society.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.(1998)353,1777-1786)。
在其网站上，美国环境保护局(epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm)公布了提供与生成针对靶害虫有活性的单一Bt蛋白的转基因作物一起使用的非转基因(即，非B.t.)避难所(非Bt作物/玉米的部分)的下列要求。
“玉米螟防护的Bt(Cry1Ab或Cry1F)玉米产品的特定结构化需要如下：
结构化避难所：玉米带中20%非鳞翅目Bt玉米避难所；
棉花带中50%非鳞翅目Bt避难所
区组
内部(即，在Bt田内)
外部(即，在1/2英里(若可能的话，1/4英里)Bt田内的不同田地以使随机杂交最大化)
田间条(Strip)
条必须宽至少4行(优选地6行)以降低幼虫运动的效果”
另外，国家玉米种植者协会(National Corn Growers Association)，在其网站上：
(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)
还提供关于避难所需要的类似指导。例如：
“玉米螟IRM的要求：
-以避难杂种种植至少20%的玉米地
-在棉花生产区中，避难所必须是50%
-必须在1/2英里的避难杂种内种植
-避难所可以在Bt田内以条种植；避难条必须宽至少4行
-只有当对靶昆虫达到经济阈值时，可以用常规的杀虫剂处理避难所
-基于Bt的可喷射的杀虫剂不能对避难玉米使用
-必须在有Bt玉米的每个农场种植合适的避难所”
如由Roush等(例如第1780和1784右栏)所述，各自针对靶害虫有效的且具有很少或没有交叉抗性的两种不同蛋白质的叠加或金字塔化可以容许使用更小的避难所。Roush提示，对于成功的叠加，小于10%避难所的避难所大小可以提供与单一(非金字塔化)性状的约50%避难所相当的抗性管理。对于目前可用的金字塔化Bt玉米产品，美国环境保护局要求比对于单一性状产品(一般为20%)显著更少(一般为5%)的非Bt玉米的结构化避难所。
存在有提供避难所的IRM效果的多种方式，包括田间的各种几何种植样式(如上文所提及的)和袋中种子混合物，如由Roush等(见上文)及美国专利No.6,551,962进一步讨论的。
可以对主题双重或三重叠加或金字塔使用上述百分比、或类似的避难所比率。对于具有针对单一靶害虫的三种作用模式的三重叠加，目的会是0避难所(或例如小于5%避难所)。这特别适用于商业面积—例如超过10英亩的。
本文涉及或引用的所有专利，专利申请，临时申请，和公开均以其整体至其与本说明的直接教导不矛盾的范围并入作为参考。除非特别声明或暗示，本文所用的术语“一”，“一个”和“这个”表示“至少一个”。
参考文献
Wolfersberger，M.G.，(1993)，Preparation and Partial Characterization of Amino Acid Transporting Brush Border Membrane Vesicles from the Larval Midgut of the Gypsy Moth(Lymantria Dispar).Arch.Insect Biochem.Physiol.24:139-147.
Liang，Y.，Patel，S.S.，and Dean，D.H.，(1995)，Irreversible Binding Kinetics of Bacillus thuringiensis Cry1A Delta-Endotoxins to Gypsy Moth Brush Border Membrane Vesicles is Directly Correlated to Toxicity.J.Biol.Chem.，270，24719-24724.
实施例
实施例1–生物活性
提供的Cry蛋白作用于FAW，ECB，和Cry1Fa抗性的FAW和ECB昆虫的生物分析结果显示在表1中。两种蛋白均对FAW幼虫有高活性。(关于该害虫的讨论，参见例如Tabashnik，PNAS(2008)，vol.105 no.49，19029-19030。)Cry1Fa对于对Cry1Fa的毒性有抗性的FAW(rFAW)有非常低的活性，相比于敏感FAW。Cry1Be对rFAW同样活性，或更高活性，相比于敏感FAW。
表1.Cry蛋白针对四种不同昆虫类型和Cry1Fa抗性的FAW和ECB幼虫的生物活性。未划线的绿色数值是LC-50值，以多次测定获得数值的范围表示。划线数值是GI-50值，其中的蛋白不导致针对特定昆虫的死亡。数值以ng/cm2计。
表1.
实施例2-结合研究
图1显示了125I Cry1Fa对Cry1Fa或Cry1Be的与来自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(秋粘虫，FAW)的刷状缘膜囊的竞争性结合。分析用下拉法(pull-down method)双份中进行。FAW-0表示125I Cry1Fa在不存在任何竞争性 配体的情况下结合至受体（对照）。FAW-1,000nM Cry1Fa表示在同源未标记Cry1Fa存在下获得的大为降低的结合水平，后者从其受体上取代结合的放射性标记的Cry1Fa。FAW-1,000nM Cry1Be表示在未标记Cry1Be存在下获得的结合，后者不能从其受体上取代结合的放射性标记的Cry1Fa。
图2显示了125I Cry1Fa对Cry1Fa或Cry1Be的与来自Ostrinia nubilalis(欧洲玉米螟，ECB)的刷状缘膜囊的竞争性结合。分析用下拉法(pull-down method)双份中进行。“对照Rxn”表示125I Cry1Fa在不存在任何竞争性配体的情况下结合至受体。1,000nM Cry1Fa表示在同源未标记Cry1Fa存在下获得的大为降低的结合水平，后者从其受体上取代结合的放射性标记的Cry1Fa。1,000nM Cry1Be表示在未标记Cry1Be存在下获得的结合，后者不能从其受体上取代结合的放射性标记的Cry1Fa。
图3显示了25I Cry1Be与来自秋粘虫的刷状缘膜囊的结合的Cry1Fa(▲)和Cry1Be(●)的竞争性取代。Cry1Fa仅在大于100nM的浓度(用于分析的放射性标记的Cry1Be的浓度的200倍)下有效地取代0.5nM 125I Cry1Be的结合。相比于Cry1Fa，Cry1Be在取代其自身时有效得多，尽管Cry1Fa比Cry1Be对该害虫更有活性。
附录A
delta-内毒素的列表-来自Crickmore等网站(申请中引用)
登录号是NCBI条目(若可获得的话)
Claims (15)
1.产生转基因植物的方法，其包含用编码SEQ ID NO:2的Cry1Be杀虫蛋白的DNA和编码SEQ ID NO:1的Cry1Fa杀虫蛋白的DNA转化宿主植物。
2.权利要求1的方法，其中编码SEQ ID NO:2的Cry1Be杀虫蛋白的DNA和编码SEQ ID NO:1的Cry1Fa杀虫蛋白的DNA被渐渗入所述宿主植物。
3.管理秋粘虫和/或欧洲玉米螟昆虫对Cry毒素形成抗性的方法，所述方法包括种植种子以产生植物田地，其中所述田地包括多个植物，所述植物包含编码SEQ ID NO:2的Cry1Be杀虫蛋白的DNA和编码SEQ ID NO:1的Cry1Fa杀虫蛋白的DNA。
4.权利要求3的方法，其中所述植物田地包含非-Bt避难所植物，其中所述避难所植物包含所述田地中所有作物植物的少于40％。
5.权利要求3的方法，其中所述植物田地包含非-Bt避难所植物，所述避难所植物占所述田地中所有作物植物的少于30％。
6.权利要求3的方法，其中所述植物田地包含非-Bt避难所植物，所述避难所植物占所述田地中所有作物植物的少于20％。
7.权利要求3的方法，其中所述植物田地包含非-Bt避难所植物，所述避难所植物占所述田地中所有作物植物的少于10％。
8.权利要求3的方法，其中所述植物田地包含非-Bt避难所植物，所述避难所植物占所述田地中所有作物植物的少于5％。
9.权利要求3的方法，其中所述植物田地包含非-Bt避难所植物，所述避难所植物是块状或条带。
10.一种控制选自欧洲玉米螟和秋粘虫的昆虫的组合物，所述组合物包含微生物细胞，所述细胞表达有效量的SEQ ID NO:1的Cry1Fa蛋白和SEQ IDNO:2的Cry1Be蛋白。
11.权利要求10的组合物，其包含宿主微生物，所述宿主经转化以表达SEQ ID NO:1的Cry1Fa蛋白和SEQ ID NO:2的Cry1Be蛋白。
12.控制选自欧洲玉米螟和秋粘虫的昆虫的方法，所述方法包括对所述昆虫或对所述昆虫的环境提供有效量的权利要求10的组合物。
13.权利要求1和2中任意一项的方法，其中所述宿主植物选自玉米，大豆和棉花。
14.权利要求1和2中任意一项的方法，其中所述宿主植物是玉米植物。
15.控制选自欧洲玉米螟和秋粘虫的昆虫的方法，所述方法包括使所述昆虫接触SEQ ID NO:2的Cry1Be杀虫蛋白和SEQ ID NO:1的Cry1Fa杀虫蛋白。
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