UA112156C2 - ТРАНСГЕННА РОСЛИНА, ЯКА МІСТИТЬ ДНК, ЩО КОДУЄ ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Сry1Ca, І ДНК, ЩО КОДУЄ ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Сry1Fa, ДЛЯ ВИРОБЛЕННЯ РЕЗИСТЕНТНОСТІ ДО КОМАХ - Google Patents

Abstract

Даний винахід описує рослини, стійкі до лускокрилих шкідників, та способи боротьби з цими шкідниками, де вказані рослини містять інсектицидний білок Cry1Fa і інсектицидний білок Сrу1Са. Запропонований винахід дозволяє сповільнювати або попереджувати вироблення резистентності у комахи совки трав′яної до токсину Cry.

Description

Попередній рівень техніки

Людина вирощує кукурудзу для вживання в їжу і для енергетичних цілей. Людина також вирощує множину інших культур, включаючи сою і бавовну. Комахи поїдають і пошкоджують рослини, і тим самим наносять збиток діяльності людини. Для боротьби з комахами-шкідниками щорічно витрачаються мільярди доларів, і ще мільярди йдуть на відшкодування збитку, що наноситься цими шкідниками. Інсектициди, синтезовані методами органічної хімії, Є головним інструментом, що використовується для боротьби з комахами-шкідниками, але в деяких регіонах, в боротьбі з комахами-шкідниками важливу роль грають біологічні інсектициди, такі як інсектицидні білки, що походять від Васійи5 Пигіпдіепбіз (ВО). Можливість культивувати резистентні до комах рослини за допомогою трансформації цих рослин генами інсектицидних білків ВІ була революцією в сучасному сільському господарстві і довела важливість і цінність інсектицидних білків і їх генів.

Деякі білки Ві були використані для створення резистентних до комах трансгенних рослин, які успішно пройшли випробування, і в цей час їх виготовляють в промисловому масштабі.

Такими білками є СтутАБ, СтутАс, СтуїЕ ії СтуЗзВьЬ, що вводяться в кукурудзу, Сту1Ас і Стуг2АБ, що вводяться в бавовну, і СтуЗА, що вводиться в картоплю.

Комерційно доступні продукти, експресуючі ці білки, експресують тільки один з цих білків, за винятком випадків, коли бажано отримати комбінований інсектицидний спектр з 2 білків (наприклад, в кукурудзі, СтутАб ії СтуЗзВЬ об'єднані для вироблення резистентності до лускокрилих шкідників і кореневих личинок, відповідно), або випадків, коли незалежна дія цих білків робить їх цінним інструментом для сповільнення розвитку резистентності до інсектицидів у сприйнятливих популяцій комах (наприклад, СтуїТАс і Сту2АБ в бавовнику об'єднують з метою вироблення у рослин резистентності до тютюнової листовійки).

Тобто, деякі сорти резистентних до комах трансгенних рослин, які швидко і повсюдно пристосовуються до цієї технології, також мають той недолік, що популяції шкідників виробляють резистентність до інсектицидних білків, що продукується цими рослинами. Було запропоновано декілька стратегій для збереження цінних ознак резистентності до Ві-комах, де вказані стратегії включають використання у високих доз білків в комбінації із збереженням площ "сховищ" нетрансгенних рослин, і чергування або спільного використання різних токсинів (МесСацонеу єї а!.(1998), "ВІ-Везізтапсе Мападетепі" Майте Віоїтеснпої. 16: 144-146).

Необхідно, щоб білки, відібрані для використання в ІКМ-кластерах, мали незалежну інсектицидну дію, при якій резистентність, що виробляється до одного білка, не розповсюджувалася на інший білок (тобто, не спостерігалася перехресна резистентність до білок). Так, наприклад, якщо популяція комах, вибраних на резистентність до "білка А", є сприйнятливою до "білка В", то можна зробити висновок, що в цьому випадку перехресна резистентність відсутня, і комбінація "білок А і білок В" буде ефективною для сповільнення вироблення резистентності до одного білка А.

У випадку відсутності популяції резистентних комах, оцінка може бути зроблена виходячи з інших характеристик, які, як передбачається, стосуються механізму дії і можливої перехресної резистентності. Було висловлене припущення, що застосування опосередкованого рецептором зв'язування при ідентифікації інсектицидних білків, очевидно, не буде приводити до вироблення перехресної резистентності. (мап МейПаетг еї аі. 1999). Ключовим прогностичним фактором відсутності перехресної резистентності, що з'являється при такому підході, є те, що інсектицидні білки не конкурують за зв'язування з рецепторами у сприйнятливих видів комах.

У випадку, коли два токсини Ві конкурують за зв'язування з одним і тим же рецептором, і якщо цей рецептор мутує у комахи так, що один з токсинів більше не зв'язується з цим рецептором, а тому не має інсектицидної дії проти комахи, то така комаха може набувати резистентності до другого токсину (який конкурентно зв'язується з тим же рецептором). Тобто, можна сказати, що така комаха буде мати перехресну резистентність до обох токсинів Ві. Однак якщо два токсини зв'язуються з двома різними рецепторами, то це означає, що така комаха не має одночасної резистентності до цих двох токсинів.

СтуїРа може бути використаний для боротьби з лускокрилими шкідниками багатьох видів, включаючи європейського кукурудзяного трача (ЕСВ; О5ігіпіа пибіїаіїй5 (Нибпег)) і совку трав'яну (ЕАМУ; бродорієга Пидірегда), і має активність проти бурякового трача (ЗСВ; Оіаїгаєа засснагаї в).

Білок Сту!Ба, що продукується в рослинах кукурудзи, що містять модифікацію ТС1507, відповідальний за вироблення ознаки резистентності до комах, і цей білок застосовується у провідних галузях промисловості для боротьби з совкою трав'яною (БАММ). Сту!Ра також використовується в продуктах НегсшехФб), Зтанеах м і М/аезігіке "М,

Можливість провести дослідження на зв'язування з рецептором (конкурентне або гомологічне) з використанням білка СгуїБа має певні обмеження, оскільки при застосуванні більшості методів мічення білків для детектування в аналізах на зв'язування з рецептором відбувається інактивація інсектицидної активності білка Стуї1 Га.

Додаткові токсини Стгу перераховані На мжер-сайті офісу Комітету по номенклатурі В. (СтісКтоге еї аї; ІМевзсі.зиб5зех.ас.ик/поте/Меї! СтісКтоге/ВІ/). ДИВ. Додаток А в даній заявці. У цей час відоме приблизно 60 основних груп токсинів "Сту" (Сту1!-Сту59), і крім того, існують інші токсини, такі як токсини Суї і токсини МІР і т. п. Багато токсинів з кожної пронумерованої групи мають підгрупи, позначені великими буквами, а підгрупи, позначені великими буквами, в свою чергу, поділяються на підгрупи (суб-підгрупи), позначені малими буквами (наприклад, Сту! має підгрупу А-Ї, а СтутА має підгрупу а-і).

Короткий опис суті винаходу

Даний винахід частково оснований на несподіваному виявленні того факту, що популяція трав'яної совки (Зродорієега їидірегаа; ЕАММ), відібрана на резистентність до інсектицидної активності білка Сту!Ра, не є резистентною до інсектицидної активності білка СтуїСа. Для фахівця в даній галузі очевидно, що перевага такого відкриття полягає в тому, що рослини, експресуючі ці два інсектицидні білки або їх інсектицидні частини, можуть бути використані для сповільнення або попередження розвитку резистентності до будь-якого з цих окремо взятих інсектицидних білків.

Даний винахід також підтверджується виявленням того факту, що Сту!Ра і СгуїСа не конкурують один з одним за зв'язування з кишковими рецепторами совки трав'яної (ЕАМУ) (або ріаггаєа засспагаїїх (бурякового трача; 5СВ)).

Даний винахід також стосується, зокрема, трикомпонентних кластерів або "пірамід" з трьох (або більше) токсинів, де токсини СгуїРа і Сту1!С являє собою базову пару. Одна з переважних пірамід включає щонайменше два білки, що не мають перехресної резистентності до двох шкідників до совки трав'яної і до ЕСВ (Європейського кукурудзяного трача; Об5ігіпіа пибійаїйїв5);

СтуїБа плюс СтгуїСа плюс один або декілька анти-ЕСВ токсинів, таких як СтутАб. У деяких переважних варіантах піраміди, вибрані токсини мають три різні механізми дії проти ЕАМУ.

Переважними пірамідними комбінаціями є СтуїбРа плюс СтуїСа плюс інший токсин/ген, вибраний з групи, що складається з МірзАБ, Сту!10, Стгу1!Ве і СгуїЕ. Рослини (і посівні площі, засіяні такими рослинами), які продукують ці три токсини, входять в об'єм даного винаходу.

Можуть бути також додані додаткові токсини/гени, але ці конкретні трикомпонентні кластери, відповідно до даного винаходу, будуть, як несподівано було виявлено, переважно діяти проти

ЕАММ по трьох механізмах. Це допоможе знизити або взагалі уникнути потреби в площах- "сховищах" нетрансгенних культур. У загальних рисах, даний винахід також стосується застосування трьох інсектицидних білків (в деяких переважних варіантах, білків Сгу), які не конкурують один з одним проти одного шкідника-мішені.

Короткий опис графічного матеріалу

Фігура 1: Оцінка ступеня пошкодження кукурудзи, заражені іп міго щойно личинками совки трав'яної, що вилупилися (РАМУ), і совки трав'яної, резистентної до СтутЕ (гТЕАУМ). Трансгенні рослини ТО, відібрані після трансформації плазмідою ррА55162, були розділені на дві групи за допомогою імуноблот-скринінгу з використанням антитіла БІС152КРС1: на рослини, які не продукують 01ІС-109 (на фігурі, з лівого боку), і на рослини, які не мають детектовані рівні ОІСс- 109 (в центрі фігури). 0ІС-109-позитивні рослини ранжували по рівню експресії (зліва направо; від найменшого до найбільшого). НР-аналіз на О5М2 здійснювали на 36 ррдБ5162- трансформованих лініях. У 95 95 зразків була детектована проста подія інтеграції, визначена як 1-2 копії цього гена. Результати біологічного аналізу рослин, що використовуються як позитивний і негативний контроль, представлені на правій стороні фігури.

Фігура 2: Конкурування за зв'язування ВВММ 5родоріега їШтидірегаа з коровим токсином

СтуїРа, з коровим токсином СтгуїСа і з 125І-міченим коровим токсином СгуїСа.

Короткий опис послідовностей

ЗЕО І МОЛ - Химерний білок "коровий Сту!Са/протоксин СтутАБр", що складається з 1164 амінокислот (016-152) (варіант РМУС2547)

ЗЕО І МОС2 - Другий химерний білок "коровий СтуїСа/протоксин СгуТтАБ", що складається з 1164 амінокислот (010-109) (сорт кукурудзи)

ЗЕО ІО МОЗ - Оптимізована для кукурудзи послідовність СО5, що кодує 3492 п. н. 012-109

ЗЕО І МО:4 - коровий токсин СтгуїРа.

ЗЕО ІО МО:5 - коровий токсин СтгуїСа.

Докладний опис винаходу

Як повідомляється в даний заявці, токсин СтгуїСа, що продукується в трансгенній кукурудзі і в інших рослинах (наприклад, в бавовнику і сої), виявляє високу ефективність в боротьбі проти совки трав'яної (ГАМУ; 5родорієга ігидірегада), у якої виробляється резистентність до активності

СтгуїРа. Таким чином, даний винахід частково оснований на несподіваному виявленні того факту, що совка трав'яна, резистентна до дії Стуїба, є сприйнятливою (тобто, не має перехресної резистентності) до дії Сту1Са.

Даний винахід також частково оснований на несподіваному виявленні того факту, що токсин

СтуїСа є ефективним для захисту рослин (таких як рослини кукурудзи) від ураження СгуїЕа- резистентної совки трав'яної. Обговорення цього шкідника приводиться, наприклад, в публікації

Табравнпік, РМАБ (2008), мої. 105 по. 49, 19029-19030.

Даний винахід включає застосування токсину СтуїСа для захисту кукурудзи і інших економічно цінних видів рослин від ураження шкідниками і зниження врожайності, що викликається поїданням цих рослин совкою трав'яною або популяціями совки трав'яної, у яких виробляється резистентність до Стуї1ГЕа.

Даний винахід також стосується кластера ІЕМ, що використовується для попередження або сповільнення розвитку резистентності совки трав'яної до СтуїРа і/або Стгуї1Са.

Даний винахід також стосується композицій, що використовуються для боротьби з лускокрилими шкідниками, в клітинах яких продукується білок, що містить коровий токсин

Стгуї Га, і білок, що містить коровий токсин СгуїСа.

Даний винахід також стосується хазяїна, трансформованого так, щоб він продукував білок, що містить коровий токсин Сгуї1Ра, і білок, що містить коровий токсин СгуїСа, де вказаним хазяїном є клітина мікроорганізму або рослини. Полінуклеотид(и), що розглядається(ються) переважно присутній(ї) в генетичній конструкції під контролем промотору, що не є промотором

Васійи5 ІВПигіпдіепзіз (функціонально приєднаний() до цього промотору/містить(ять) цей промотор). Полінуклеотиди, що розглядаються, можуть містити звичайно кодони, що зустрічаються в цій рослині, сприяючі підвищенню рівня експресії в рослині.

Даний винахід також стосується способу боротьби з лускокрилими шкідниками, що включає контактування вказаних шкідників або середовища їх проживання з ефективною кількістю композиції, що містить білок, який включає коровий токсин СтгуїРа, а також білок, який включає коровий токсин Сгуї1Са.

У одному зі своїх варіантів, даний винахід стосується рослини кукурудзи (і інших рослин, наприклад, бавовнику і сої), що включає експресований в цій рослині ген, який кодує білок, що містить коровий токсин СгуїСа, і експресований в цій рослині ген, який кодує білок, що містить коровий токсин Стуї Ра, і насіння такої рослини.

У іншому своєму варіанті, даний винахід стосується рослини кукурудзи (і інших рослин, наприклад, бавовнику і сої), де експресований в цій рослині ген, який кодує білок, що містить коровий токсин Сгу!ї Са, і експресований в цій рослині ген, який кодує білок, що містить коровий токсин Сту!Ра, були введені у вказані рослини кукурудзи і в насіння таких рослин шляхом інтрогресії. (Опис Сту1сС, що використовується в рослинах як потенційний біоісектицид, приводиться в публікації Амізаг еї аІ. 2009). Амізаг О, ЕПепрего Н, КеїПЇег М, Вегпік М, зедаї! М, 5пенй В, АіІрегвівїп

А (2009) Тне Васіив ІпПигіпдієпві5 аДепа-епдоїохіп Сту1С ав а роїепіа! ріоіпзесіїсіде іп ріапів. Ріапі

Зсієпсе 176:315-324).

Рецептори комах. Як описано в прикладах, дослідження на конкурентне зв'язування з рецептором, що проводиться з використанням радіоактивно міченого білка корового токсину

СтуїСа, показало, що цей білок корового токсину Сту!Ра не конкурує за високоафінне зв'язування з сайтом, присутнім в тканинах комахи ЕАМУ, з яким зв'язується СтуіїСа. Ці результати показали, що комбінація білків СтуїРа і СтуїСа являє собою ефективний засіб для послаблення вироблення резистентності у популяції БАМ/ до Сту!Ра (ії аналогічно, для послаблення вироблення резистентності до СтуіСа) а також для підвищення рівня резистентності рослин кукурудзи, експресуючих обидва ці білки, до вказаного шкідника.

Таким чином, частково на основі даних, описаних вище, і даних, представлених в літературі, можна зробити висновок, що спільне продукування (у вигляді кластера) білків СгуїСа і СгтуїРа може бути застосоване для отримання високої дози ІЕМ-кластера, що використовується для боротьби з РАМУ. У цю комбінацію можуть бути додані і інші білки для розширення спектра комах-шкідників, що знищуються. Так, наприклад, для кукурудзи, додавання СтутАр дозволить створити ІЕМ-піраміду, що використовується для боротьби з європейським кукурудзяним трачем.

У іншому своєму варіанті, даний винахід стосується застосування одного або двох білків 60 СтуїРа і СтуїСа в комбінації з білюом СтгутАбБ для послаблення вироблення резистентності у комах. Таким чином, в іншому своєму варіанті, даний винахід стосується застосування одного або двох білків Стуї!Ра і СтгуїСа в сільськогосподарських регіонах, в яких застосування білка

СгулАБ стає неефективним для боротьби зі буряковим трачем, що зумовлено розвитком резистентності у таких популяцій шкідників. Відповідно до цього, переважного "грикомпонентного кластера" або "пірамідної" комбінації, що застосовується відповідно до даного винаходу, є Сту1Е плюс Сту1С плюс Стут Ар.

Даний винахід також стосується, зокрема, трикомпонентних кластерів або "пірамід" з трьох (або більше) токсинів, де токсини СтгуїРа і Сту1!С являє собою базову пару. Одна з переважних пірамід включає щонайменше два білки, що не мають перехресної резистентності до двох шкідників - до РАМУ і до ЕСВ (Європейського кукурудзяного трача; О5ігіпіа пибіїаі|ї5); СтуїРа плюс

СтуїСа плюс один або декілька анти-ЕСВ токсинів, таких як СтутАб (див. заявку США 20080311096), оскільки Стуї1Е має активність проти обох комах. Іншими токсинами проти ЕСВ є

СтгуїВе (див. заявку США реєстр. Мо 61/284290, подану 16 грудня, 2009), Сгу ІІ (див. заявку США реєстр. Мо 61/284278, подану 16 грудня, 2009), Стуг2Аа (див. заявку США реєстр. Мо 61/284278, подану 16 грудня 2009) і 0БІС-3 (див. заявку США 201000269223). У деяких переважних варіантах "піраміди", вибрані токсини мають три різні механізми дії проти ЕАМУ, і такими переважними пірамідними комбінаціями є Сту1!Ра плюс СгтуїСа плюс інший токсин/ген, вибраний з групи, що складається з МірзАр, Сту1О (див. заявку США реєстр. Мо 61/284252, подану 16 грудня, 2009), Сту1Ве і СтутЕ (див. заявку США реєстр. Мо 61/284278, подану 16 грудня 2009).

Рослини (і посівні площі, засіяні такими рослинами), які продукують ці три токсини, входять в об'єм даного винаходу. Можуть бути також додані додаткові токсини/гени, і ці конкретні трикомпонентні кластери, відповідно до даного винаходу, будуть, як несподівано було виявлено, переважно діяти проти РАМУ по трьох механізмах. Це дозволяє знизити або уникнути потреби в площах-"сховищах" нетрансгенних культур. Таким чином, в даному винаході розглядається висівна площа понад 10 акрів.

Інші токсини, наприклад, Мір3, перераховані в Додатку А. Ці номери СЕМВАМК можуть бути також використані для ідентифікації послідовностей будь-яких описаних і згаданих тут генів і білків.

У патенті США Мо. 5188960 і в патенті США Мо. 5827514 описані білки, які містять коровий токсин СгуїРа, і які можуть бути використані для здійснення даного винаходу. У патенті США Мо 6218188 описані оптимізовані для рослини послідовності ДНК, що кодують білки, які містять коровий токсин Стгуї Ра, і які можуть бути використані в даному винаході.

Комбінації токсинів, описаних в даному винаході, можуть бути використані для боротьби з лускокрилими шкідниками. Дорослі лускокрилі, наприклад, метелики і молі, харчуються, головним чином, нектаром і відіграють значну роль в запиленні Майже всі личинки лускокрилих, тобто, гусениці, поїдають рослини, і багато з них є небезпечними шкідниками.

Гусениці живуть на листі або поїдають внутрішню частину листя, або вони пошкоджують коріння або стебла рослини, що приводить до виснаження поживних речовин у рослини, і в більшості випадків, до руйнування основної фізичної структури рослини. Крім того, гусениці пошкоджують плоди, тканини і зерно, що зберігається, і борошно, в результаті чого продукти або взагалі стають непридатними для продажу, або їх комерційна цінність значно знижується.

Використовуваний тут термін "лускокрилі шкідники" також стосується різних стадій життєвого циклу шкідника, включаючи стадії розвитку личинок.

Деякі химерні токсини згідно з винаходом містять повнорозмірну частину М-кінцевого корового токсину Ві, і в певному положенні, розташованому за межами частини корового токсину, цей білок переходить в гетерологічну послідовність протоксину. М-кінцева, інсектицидно активна частина токсину Ві називається "коровим токсином". Перехід від корового сегмента токсину в гетерологічний сегмент протоксину може відбуватися приблизно в області стику токсин/протоксин, або альтернативно, частина нативного протоксину (що простягається за межі коровою частини токсину) може зберігатися, причому, перехід в гетерологічну частину протоксину може відбуватися нижче.

Одним з прикладів може служити один химерний токсин згідно з винаходом, який являє собою повнорозмірну частину корового токсину СтуїРа (амінокислоти 1-601) і гетерологічний протоксин (амінокислоти від положення 602 до С-кінця). У одному переважному варіанті винаходу, частина химерного токсину, що містить протоксин, походить від токсину білка СтутАб.

Другим прикладом може служити другий химерний токсин згідно з винаходом, який описаний в

ЗЕО І МО і являє собою частину повнорозмірного корового токсину Сту1!Са (амінокислоти 1- 619) і гетерологічний протоксин (амінокислоти від положення 620 до С-кінця). У переважному варіанті винаходу, частина химерного токсину, що містить протоксин, походить від токсину білка 60 СтутАБ.

Для фахівців в даній галузі очевидно, що токсини Ві, навіть токсини, які належать до певного класу, такого як Стуї1Е, можуть до деякої міри варіюватися по своїй довжині і точній локалізації переходу від частини корового токсину в частину протоксину. Звичайно, токсини СгуїСа і

Сту1їРа мають довжину приблизно від 1150 до 1200 амінокислот. Перехід від частини корового токсину в частину протоксину звичайно відбувається на ділянці між частинами, що складають приблизно від 50 95 і приблизно до 60 95 від всієї довжини токсину. Химерний токсин згідно з винаходом включає повнорозмірну область цієї М-кінцевої частини корового токсину. Таким чином, химерний токсин містить щонайменше приблизно 50 95 повнорозмірного білка СтуїЕа токсину Ві або щонайменше приблизно 50 95 повнорозмірного білка токсину Сгу!Са. Цей білок має довжину, що звичайно складає щонайменше приблизно 590 амінокислот. Що стосується частини протоксину, то повнорозмірна область частини протоксину СтутАБб простягається від кінця частини корового токсину до С-кінця молекули.

Гени і токсини. Гени і токсини, що використовуються в даному винаході, включають не тільки описані тут повнорозмірні послідовності, але також і фрагменти цих послідовностей, варіанти, мутанти і гібридні білки, які зберігають характерну пестицидну активність токсинів, конкретно описаних в даний заявці. Використовувані тут термін "варіанти" або "модифікації" генів означають нуклеотидні послідовності, які кодують ті ж самі токсини або токсини, еквівалентні токсинам, що мають пестицидну активність. Використовуваний тут термін "еквівалентні токсини" означає токсини, що мають таку же або, по суті, таку ж біологічну активність проти шкідників- мішеней, як і заявлені токсини.

Межі ідентичності, що використовуються тут, становлять приблизно 95 95 (СтуїРа і СтуїСа), 78956 (СтутБ ї Стгу!С) і 4595 (Сту!) відповідно до "змін номенклатури для пестицидних кристалічних білків Васіїйй5 ІПигіпдівепвіє" ("Аемівіоп ої Ше Мотепсіайте ог Ше ВасіПшив5

Іишгіпдієпвів Ревіїсіда! Стувіа! Ргоївїп5", М. СтісКктоге, О.В. 2 еїдіег, у. Рейеі5оп, Е. ЗсеНпері, у. Мап

Віє, 0. І егесійв, У. Вайт, апа О.Н. Оєап. Місторіоїоду апа МоїІесшаг Віоіоду Неміємжв (1998) Мої! 62: 807-813). Такі межі можуть бути також застосовані тільки для корових токсинів (для токсинів

СтуїЕ і Сту1с).

Для фахівців в даній галузі очевидно, що гени, які кодують активні токсини, можуть бути ідентифіковані і отримані декількома способами. Специфічні гени або частини генів, описані в даний заявці, можуть бути отримані з ізолятів, депонованих в депозитаріях культур. Ці гени або їх частини або варіанти можуть бути також сконструйовані шляхом синтезу, наприклад, на синтезаторі генів. Варіанти генів можуть бути легко сконструйовані стандартними методами отримання точкових мутацій. Крім того, фрагменти цих генів можуть бути отримані з використанням комерційно доступних екзонуклеаз або ендонуклеаз відповідно до стандартних процедур. Так, наприклад, для систематичного відщеплення нуклеотидів від кінців цих генів можуть бути використані ферменти, такі як ВаЇ3З!, або може бути застосований сайт- направлений мутагенез. Гени, що кодують активні фрагменти, можуть бути також отримані з використанням різних рестриктуючих ферментів. Для безпосереднього отримання активних фрагментів цих білків-токсинів можуть бути використані протеази.

Фрагменти і еквіваленти, які зберігають пестицидну активність описаних тут токсинів, входять в об'єм даного винаходу. Крім того, внаслідок надлишковості генетичного коду, ряд різних послідовностей ДНК може кодувати описані тут амінокислотні послідовності. Фахівець в даній галузі може легко отримати такі альтернативні послідовності ДНК, що кодують ті ж самі або, по суті, ті ж самі токсини. Такі варіанти послідовностей ДНК входять в об'єм даного винаходу. Використовуваний тут термін "по суті, ті ж самі" послідовності означає послідовності, які мають амінокислотні заміни, делеції, додавання або інсерції, які фактично не чинять впливу на пестицидну активність. У це визначення також входять фрагменти генів, що кодують білки, які зберігають пестицидну активність.

Іншим методом ідентифікації генів, що кодують токсини і частини генів, що використовуються в даному винаході, є застосування олігонуклеотидних зондів. Такими зондами є нуклеотидні послідовності, що детектуються. Такі послідовності можуть бути детектовані за допомогою відповідної мітки, або вони можуть бути спочатку зроблені флуоресцентними, як описано в Міжнародній заявці Мо. М/093/16094. Як добре відомо фахівцям, якщо молекула-зонд і зразок нуклеїнової кислоти гібридизуються за допомогою утворення міцного зв'язку між двома молекулами, то розумно передбачити, що такий зонд і зразок будуть мати значну гомологію. Гібридизацію, переважно, проводять в жорстких умовах із застосуванням методів, добре відомих фахівцям, наприклад, описаних КеїЇег, с. Н., М. М.

Мапак (1987) ОМА Ргобез, БіосКіоп Ргез5, Мем МогКк, М.У., рр. 169-170. Нижче приводяться деякі приклади комбінацій концентрацій солі і температур (в порядку зростання жорсткості): 2 х ЗОРЕ 60 або 55С при кімнатній температурі; 1 х 55РЕ або 55С при 42"; 01 х 55РЕ або 55: при

427С; 01 х 55РЕ або 55: при 65 "С. Детектування зонда являє собою відомий метод, що застосовується для того, щоб визначити, відбувається гібридизація чи ні. Такий аналіз з використанням зонда являє собою швидкий метод ідентифікації токсин-кодуючих генів згідно з винаходом. Нуклеотидні сегменти, що використовуються як зонди згідно з винаходом, можуть бути синтезовані на синтезаторі ДНК відповідно до стандартних процедур. Ці нуклеотидні послідовності можуть бути також використані як ПЛР-праймери для ампліфікації генів згідно з винаходом.

Варіанти токсинів. Деякі токсини згідно з винаходом конкретно описані в даний заявці.

Оскільки ці токсини приводяться тут просто як приклади токсинів згідно з винаходом, то потрібно зазначити, що даний винахід включає варіанти токсинів або еквівалентні токсини (їі нуклеотидні послідовності, що кодують еквівалентні токсини), що мають таку ж пестицидну активність, як і представлений тут токсин, або аналогічну активність. Еквівалентні токсини мають амінокислотну послідовність, гомологічну амінокислотну послідовності представленого тут токсину. Така гомологія амінокислотних послідовностей звичайно складає більше ніж 75 95, переважно, більше ніж 90 95, а найбільш переважно, більше ніж 95 95. Гомологія амінокислотних послідовностей є найвищою в критичних областях токсину, що відповідають за біологічну активність або визначають тривимірну конфігурацію, яка, зрештою, відповідальна за біологічну активність. Відповідно до цього, деякі амінокислотні заміни є допустимими і можуть бути присутнім в тих областях, які не грають важливої ролі в повідомленні активності, або є консервативними амінокислотними замінами, які не впливають на тривимірну конфігурацію молекули. Так, наприклад, амінокислоти можуть бути поділені на наступні класи: неполярні, незаряджені полярні, основні і кислотні. Таким чином, при консервативних замінах, амінокислоту одного класу замінюють іншою амінокислотою того ж типу, і така заміна входить в об'єм даного винаходу, при умові, що вона, фактично, не буде впливати на біологічну активність сполуки. У таблиці 1 представлений список прикладів амінокислот, що належать до кожного класу.

Таблиця 1 й Приклади амінокислот амінокислот . Аа, Маї, І єи, Пе, Рго, Меї, полярні Сип

У деяких випадках можуть бути також зроблені неконсервативні заміни. Важливим фактором є те, що такі заміни не повинні значно знижувати біологічну активність токсину.

Рекомбінантні хазяї. Гени, що кодують токсини згідно з винаходом, можуть бути введені мікробним або рослинним хазяїнам широкого ряду. Експресія гена токсину приводить, прямо або опосередковано, до продукування пестициду всередині клітин і його збереження в цих клітинах. Для отримання штаму Ві, що експресує обидва токсини згідно з винаходом, може бути застосоване кон'югативне і рекомбінантне перенесення. Інші організми-хазяїни можуть бути також трансформовані одним або обома генами токсинів, що використовуються для досягнення синергічного ефекту. З використанням прийнятних мікробів-хазяїнів, наприклад, Рзхейдотопав, ці мікроби можуть бути внесені в місця проживання шкідників, де вони можуть розмножуватися і поїдати ці мікроби. Це буде приводити до знищення шкідників. Альтернативно, мікроб, що містить ген токсину, може бути оброблений в умовах, сприяючих пролонгуванню активності токсину і стабілізації клітини. Оброблена клітина, яка зберігає токсичну активність, може бути потім внесена в середовище проживання шкідників-мішеней.

Якщо ген токсину Ві вводять мікробу-хазяїну за допомогою прийнятного вектора, і якщо вказаного хазяїна вносять в середовище проживання в живому вигляді, то важливо, щоб були використані певні мікроби-хазяїни. При цьому, вибирають такі мікроорганізми-хазяїни, які, як відомо, займають певну "фітосферу" (філоплан, філосферу, ризосферу і/або ризоплан) однієї або декількох представляючих інтерес культур. Ці мікроорганізми вибирають так, щоб вони мали здатність успішно конкурувати в конкретних умовах (в культурі і в іншому середовищі проживання комах) з мікроорганізмами дикого типу, забезпечували стабільне збереження і експресію генів, що кодують поліпептид-пестицид, і бажано, забезпечували кращий захист пестициду від руйнування і інактивації в умовах навколишнього середовища.

Відомо, що велике число мікроорганізмів проживає на філоплані (на поверхні листя рослин) іабо на ризосфері (в грунті, що оточує коріння рослин) цінних сільськогосподарських культур широкого ряду. Такими мікроорганізмами є бактерії, водорості і гриби. Особливий інтерес представляють такі мікроорганізми, як бактерії, наприклад, бактерії роду Рзендотопав, Егм/іпіа,

Зеїтаїйа, КіерзієПа, Хапіпотопавх, бБігеріотусевз, ВПі2обішт, Вподорзейдотопаз, МеїНпуІорпіїив5,

Адгорасієпит, Асейобасіег, І асіорасійи5, Агійгорасіег, А2оїобасієег, І еисоповіос і Аїсаїїдепев; гриби, а зокрема, дріжджі, наприклад, дріжджі роду Засспаготусе5, Стгуріососсив,

Кісухеготусевз, ЗрогороІоптусевз, Кподогогціа і Ачйгеобавзідішт. Особливий інтерес представляють такі види бактерій фітосфер, як Рзейдотопа5 5угіпдає, Рзхепдотопах Пиогезсеп5, Зе!їтайа тагсеб5сепз5, Асеїобрасієї хуїпит, Адгобрасієпішт їштеїасіеп5, Аподорзепдотопав 5рпегоїідев,

Хапіпотопах сатребігі5, КПі2орішт пеїйоїї, АІсаїїдепе5 епігорпи5 і А7оіорасіег міпіапаіїї; і дріжджів-фітосфер, таких як Кпоадоїогиа гибга, К. дішіпів, К. тагіпа, К. ашгапіаса, Стуріососси5 аірідиє5, С. айиеп5, С. Іацгепії, бЗасснаготусев говеї, 5. ргеюгієпвіб5, 5. сегемівіає,

Зрогороіотусев гозеив5, 5. одоги5, Кішумеготусев мегопає і Ацгеобавзідіит роїїшап5. Особливий інтерес представляють пігментовані мікроорганізми.

Для введення гена Ві, що кодує токсин, мікроорганізму-хазяїну в умовах, що забезпечують стабільне збереження гена і стабільну експресію гена, можуть бути застосовані методи широкого ряду. Такі методи добре відомі фахівцям в даній галузі і описані, наприклад, в патенті

США Мо. 5135867, який вводиться в даний опис за допомогою посилання.

Обробка клітин. Васійн5 «Пигіпдіепбіє або рекомбінантні клітини, експресуючі токсини ВІ, можуть бути оброблені з метою пролонгування активності токсину і стабілізації клітин.

Пестицидна мікрокапсула, що утворюється, містить токсин або токсини ВІ в клітинній структурі, яка стабілізує і захищає токсин у випадку, коли цю мікрокапсулу вносять в середовище проживання шкідника-мішені. Відповідними клітинами-хазяїнами можуть бути прокаріоти або еукаріоти, і такими клітинами звичайно є, але не обмежуються ними, клітини, які не продукують речовини, що є токсичними для вищих організмів, таких як ссавці. Однак можуть бути також використані і мікроорганізми, які продукують речовини, токсичні для вищих організмів, але, при цьому, ці токсичні речовини є нестабільними, або рівень їх введення є досить низьким, що виключає можливість якого-небудь токсичного впливу на ссавця-хазяїна. Як хазяїни, особливий інтерес представляють прокаріоти і нижчі еукаріоти, такі як гриби.

Клітини, що обробляються, звичайно є інтактними і, по суті, знаходяться в проліферативній формі, а не в формі спор, хоча, в деяких випадках можуть використовуватися і спори.

Обробка мікробних клітин, наприклад, мікробів, що містять ген або гени токсину Ві, може бути здійснена хімічними і/або фізичними методами, або комбінацією хімічних і фізичних методів, при умові, що такий метод не буде чинити негативного впливу на властивості токсину і не буде приводити до зниження здатності клітин захищати токсин. Прикладами хімічних реагентів є галогенуючі агенти, а зокрема, галогени з атомними номерами 17-80. Більш конкретно, може бути використаний йод в м'яких реакційних умовах протягом певного періоду часу, достатнього для досягнення бажаних результатів. Іншими відповідними методами є обробка альдегідами, такими як глутаральдегід; протиінфекційними агентами, такими як хлорид зефірану і хлорид цетилпіридинію; спиртами, такими як ізопропіловий спирт і етанол; різними гістологічними фіксаторами, такими як йод Люголя, фіксатор Боуїна; різні кислоти і фіксатор

Хеллі (див: Нитавзоп, Сгеїспеп Г.., Апітаї! Тізвцие Тесппідцев, МУ. Н. Егеетап апа Сотрапу, 1967); або комбінацією фізичного методу (нагрівання) і хімічних агентів, які зберігають і пролонгують активність токсину, що продукується в клітинах, введених в середовище проживання хазяїна.

Прикладами фізичних методів є короткохвильове випромінювання, таке як гамма- випромінювання і рентгенівське випромінювання, заморожування, УФ-опромінення, ліофілізація і т. п. Методи обробки мікробних клітин описані в патентах США МоМо 4695455 і 4695462, які вводяться в даний опис за допомогою посилання.

Ці клітини звичайно мають підвищену структурну стабільність, що приводить до збільшення резистентності до умов навколишнього середовища. Якщо пестицид присутній в формі попередника, то спосіб обробки клітин повинен бути вибраний так, щоб він не приводив до інгібування процесингу попередника з утворенням зрілої форми пестициду під дією патогена шкідника-мішені. Так, наприклад, формальдегід буде забезпечувати перехресне зшиття з білками, і тим самим інгібувати процесинг попередника поліпептидного пестициду. Спосіб обробки повинен зберігати щонайменше значну міру біологічної доступності або біологічної активності токсину.

Властивостями, що представляють особливий інтерес для продукування при виборі клітини- хазяїна, є простота введення гена або генів Ві хазяїну, доступність експресійних систем, ефективність експресії, стабільність пестициду в хазяїни і наявність додаткових генетичних ознак. Технологічними властивостями пестицидних мікрокапсул, які представляють інтерес, є їх захисна здатність відносно пестициду, наприклад, товщина клітинних стінок, пігментація і внутрішньоклітинна упаковка або здатність утворювати тільця включення; виживаність у водному середовищі; відсутність токсичності для ссавців; привабливість з точки зору поїдання шкідниками; простота утилізації; фіксація без пошкодження токсину і т. п. Іншими властивостями, що розглядаються, є простота приготування препарату і його транспортування, матеріальні витрати, стабільність при зберіганні і т.п.

Культивування клітин. Клітини-хазяїни, що містять інсектицидний ген або гени В.., можуть бути вирощені в будь-якому прийнятному поживному середовищі, в якому ДНК-конструкція буде забезпечувати селективну перевагу, тобто, забезпечувати селективне середовище, в якому всі або майже всі клітини будуть зберігати ген В.І. Потім ці клітини можуть бути зібрані звичайними способами. Альтернативно, ці клітини можуть бути оброблені до їх збирання.

Клітини Ві., що продукують токсини згідно з винаходом, можуть бути культивовані з використанням стандартних середовищ і методом ферментації. Після завершення циклу ферментації, бактерії можуть бути зібрані спочатку шляхом відділення спор і кристалів В. від зброджуваного бульйону стандартними методами. Виділені спори і кристали В. можуть бути приготовані у вигляді змочуваного порошку, рідкого концентрату, гранул або інших препаратів, отриманих шляхом додавання поверхнево-активних речовин, диспергуючих речовин, інертних носіїв і інших компонентів, що полегшують транспортування, і обробку ними конкретних шкідників-мішеней. Такі процедури приготування і застосування добре відомі фахівцям.

Препарати. Приготовані гранули-приманки, що містять атрактант і спори, кристали і токсини ізолятів В.І, або рекомбінантні мікроби, що містять гени, отримані з описаних тут ізолятів В.ї., можуть бути внесені в грунт. Приготований продукт може бути застосований у вигляді покриття, що наноситься на насіння, або препарату для обробки коріння або всієї рослини на останніх стадіях циклу вирощування сільськогосподарської культури. Для обробки рослин і грунту, клітини ВІ. можуть бути приготовані у вигляді змочуваних порошків, гранул або дустів, шляхом змішування з різними інертними матеріалами, такими як неорганічні мінеральні речовини (філосилікати, карбонати, сульфати, фосфати і т. п.) або рослинні матеріали (подрібнені в порошок качани кукурудзи, рисове лушпиння, шкаралупа волоського горіха і т. п.). Такі препарати можуть включати ад'юванти типу "розпилювачів-зв'язувальних речовин", стабілізуючі агенти, інші пестицидні добавки або поверхнево-активні речовини. Рідкі препарати можуть бути водними або безводними, і можуть бути використані у вигляді пін, гелів, суспензій, емульгованих концентратів або т. п. Інгредієнтами можуть бути реологічні агенти, поверхнево- активні речовини, емульгатори, диспергуючі речовини або полімери.

Як відомо фахівцям в даній галузі, концентрація пестициду може значно варіюватися залежно від природи конкретного препарату, а зокрема, залежно від того, чи використовується він у вигляді концентрату або в чистому вигляді. Пестицид складає щонайменше 1 95 по масі, а може становити 100 95 по масі. Сухі препарати можуть становити приблизно 1-95 95 по масі пестициду, а рідкі препарати звичайно становлять приблизно 1-60 95 по масі твердих речовин в рідкій фазі. Ці препарати звичайно містять приблизно від 102 до 107 клітин/мг. Ці препарати можуть бути введені в кількості приблизно від 50 мг (в рідкому або в сухому вигляді) до 1 кг або більше на гектар.

Препарати можуть бути внесені в середовище проживання лускокрилих шкідників, наприклад, нанесені на листя або грунт шляхом розпилення, опилення, зрошування або т. п.

Трансформація рослин. Переважними рекомбінантними хазяїнами, які можуть бути використані для продукування інсектицидних білків згідно з винаходом, є трансформовані рослини. Гени, що кодують описані тут білки токсинів Ві, можуть бути введені в рослинні клітини із застосуванням різних методів, добре відомих фахівцям. Так, наприклад, існує велике число клонуючих векторів, що містять систему реплікації в Е5спегіспіа соїї, і маркер, що дозволяє провести відбір трансформованих клітин, і ці вектори можуть бути використані з метою отримання препарату для інсерції чужорідних генів у вищі рослини. Вектори містять, наприклад, іптег аа рВвКз322, серії рос, серії МІЗтр, рАСУС184. Відповідно до цього, ДНК-фрагмент, що має послідовність, яка кодує білок токсину Ві, може бути вбудований у вектор у прийнятний рестрикційний сайт. Отриману плазміду використовують для трансформації Е. соїї. Клітини Е. соїї культивують у прийнятному поживному середовищі, а потім збирають і піддають лізису.

Потім цю плазміду виділяють. Методами аналізу звичайно є аналіз послідовності, рестрикційний 60 аналіз, електрофорез і інші методи, що застосовуються в біохімії і молекулярній біології. Після кожної маніпуляції, послідовність ДНК, що використовується, може бути розщеплена і приєднана до наступної послідовності ДНК. Кожна послідовність плазміди може бути клонована в одній і тій же або в інших плазмідах. Залежно від методу вбудовування потрібних генів в рослину, можуть виявитися необхідними і інші послідовності ДНК. Так, наприклад, якщо плазміду Ті або Кі використовують для трансформації клітин рослини, то щонайменше правий кордон, а в більшості випадків, правий і лівий кордони Т-ДНК-плазміди Ті або Кі приєднують як фланкуючі області генів, що вбудовуються. Використання Т-ДНК для трансформації клітин рослин було ретельно досліджене і детально описане в ЕР 120516, ее апа СеМміп (2008),

НоеКета (1985), Егаїеу еї а!., (1986), і Ап еї аї., (1985), і добре відомо фахівцям.

Після інтеграції вбудованої ДНК у геном рослини, така ДНК стає відносно стабільною.

Трансформуючий вектор звичайно містить селективний маркер, що повідомляє трансформованим клітинам рослини резистентність до біоциду або антибіотика, такими як біалафос, канаміцин, 5418, блеоміцин або гігроміцин, іпіег аа. З використанням окремо узятого маркера можна, відповідно, здійснювати відбір трансформованих клітин, а не клітин, що не містять вбудовану ДНК.

Існує багато методів, що підходять для вбудовування ДНК у клітини рослин-хазяїнів. Такими методами є трансформація молекулою Т-ДНК із використанням Адгобасієгійт ішптегасієп5 або

Адгорасіегішт гпігодепе5 як трансформуючих агентів, злиття, інжекція, біобалістичні методи (бомбардування мікрочастинками) або електропорація, а також інші можливі методи. Якщо для трансформації використовуються агробактерії, то вбудовувану ДНК клонують у конкретні плазміди, а саме, у проміжний або вектор у бінарний вектор. Проміжні вектори можуть бути інтегровані в плазміду Ті або Кі за допомогою гомологічної рекомбінації з використанням послідовностей, гомологічних послідовностям, що є присутніми у Т-ДНК. Плазміда Ті або Кі також містить область міг, необхідну для переносу Т-ДНК. Проміжні вектори не можуть самі реплікуватися в агробактеріях. Проміжний вектор може бути перенесений у Адгобасіегійт

Імтеїасіеєп5е за допомогою хелперної плазміди (кон'югування). Бінарні вектори можуть самі реплікуватися як у Е. сої, так і в агробактеріях. Вони містять селективний маркерний ген і лінкер або полілінкер, що замикають праву і ліву приграничні області Т-ДНК. Вони можуть бути трансформовані безпосередньо в агробактерії (Ноїбієг5 еї аїЇ., 1978). Агробактерія, використовувана як клітина-хазяїна, містить плазміду, що несе область міг. Область міг необхідна для перенесення Т-ДНК у клітину рослини. Може також бути присутньою і додаткова

Т-ДНК. Трансформовану в такий спосіб бактерію використовують для трансформації клітин рослин. Рослинні експлантати можуть бути переважно культивовані з Адгобасіегішт ішптегасіеп5 або Адгорасіегішт гпігодепе5 для перенесення ДНК у клітину рослини. Потім цілі рослини можуть бути вирощені з інфікованого рослинного матеріалу (наприклад, зі шматочків листя, сегментів стебел, коренів, а також протопластів або клітин, культивованих суспензійним методом) у придатному середовищі, що може містити антибіотики або біоциди для відбору.

Потім вирощені в такий спосіб рослини можуть бути протестовані на присутність вбудованої

ДНК. У випадку інжекції і електропорації, яких-небудь спеціальних вимог до одержання плазмід не пред'являється. При цьому, можуть бути використані стандартні плазміди, такі як, наприклад, похідні РОС.

Трансформовані клітини розвиваються в рослині як звичайно. Вони можуть утворювати зародкові клітини і передавати трансформовану(ії) ознаку(и) потомству. Такі рослини можуть бути вирощені звичайним способом і схрещені з рослинами, що мають трансформовані наслідувані фактори або інші наслідувані фактори. Отримані гібридні рослини мають відповідні фенотипічні властивості.

У переважному варіанті винаходу, рослини трансформують генами, у яких зустрічальність кодонів оптимізована для рослин. Див, наприклад, патент США Мо. 5380831, що вводиться в даний опис за допомогою посилання. Хоча в даній заявці описані деякі зрізані токсини, однак, фахівцям з ВІ добре відомо, що токсини, які належать до типу токсинів довжиною 130 кДа (повнорозмірні), мають М-кінцеву половину, що являє собою коровий токсин, і С-кінцеву половину, що являє собою протоксиновий "хвіст". Таким чином, відповідні "хвости" можуть бути використані разом із зрізаними/коровими токсинами відповідно до винаходу. Див., наприклад, патент США Мо 6218188 і патент США Мо 6673990. Крім того, методи створення синтетичних генів Ві для їхнього використання в рослинах відомі фахівцям (5іемагї апа Вигдіп, 2007). Одним з необмежуючих прикладів переважної трансформованої рослини є фертильна рослина кукурудзи, що містить експресований у рослині ген, що кодує білок Стгу1Ра, а також другий експресований у рослині ген, що кодує білок Сту1 Са.

Перенесення (або інтрогресія) Сту1Ра- і Стуї!Са-детермінованої(их) ознаки(к) в інбредні лінії 60 кукурудзи може бути досягнуть шляхом рекурентного селективного схрещування, наприклад,

зворотного схрещування. У цьому випадку, потрібну рекурентну рослину спочатку схрещують з інбредним донором (нерекурентним батьком), що несе відповідний) ген(и), що повідомляє(ють)

СтуїЕ- ії Сту!С-детерміновані ознаки. Потім потомство цього кроса піддають зворотному схрещуванню з рекурентним рослиною з наступним відбором отриманого потомства на потрібну(ї) ознаку(и), перенесену(і) від нерекурентного батька. Через три, переважно, чотири, а ще більш переважно, через п'ять або більше поколінь "бекросів" з рекурентним батьком з відбором на потрібну(ї) ознаку(и), потомство буде гетерозиготним по локусах, що контролює перенесену(ї) ознаку(и), але воно буде аналогічно рекурентному батьку по більшості або майже по всіх інших генах (див., наприклад, Роепітап 8. Зіерег (1995) Вгеедіпд Ріє Сторв, 4 Еа., 172- 10175; БеНг (1987) Ргіпсіріеє5 ої Сийімаг ОєемеІортепі, Мої. 1: Тнеогу апа Тесппідие, 360-376).

Стратегії вирощування культур, резистентних до комах (ІЕМ). Наприклад, Коив5п і співробітниками були описані стратегії з використанням двох токсинів, що також називаються створенням "пірамід" або "кластерів" для вирощування трансгенних культур, що мають інсектицидні властивості. (Тпе Коуаї Зосієїу. РП. Тгап5. К. 5об. І опа. В. (1998) 353, 1777-1786). 15 На жер-сайті Агентства США по захисту навколишнього середовища (ерагдом/оррбрраї/ріоревіісідев/рір5/рі согп гейіде 2006. піт) опубліковані наступні вимоги по забезпеченню площ-сховищ з нетрансгенними культурами (тобто, не-ВІ) культурами (земельної ділянки або блоку із сільськогосподарськими не-ві-культурами/кукурудзою) для їхнього використання під трансгенні культури, що продукують один білок Ві, що має активність 20 проти шкідників-мішеней. "Конкретними структурними вимогами до продуктів з Ві-кукурудзи (СгутАб або СгуїБК), захищеної від кукурудзяного трача, є:

Структурні площі--сховища": 2095 площі-сховища під Ві-кукурудзу, не захищену від

Лускокрилих у Кукурудзяному поясі; 25 50 95 площі-сховища під Ві-бавовник, не захищений від Лускокрилих у Бавовняному поясі;

Блоки:

Внутрішні (тобто, у полях з ВЮ)

Зовнішні (тобто, окремі поля в межах У милі (по можливості М милі) від Ві-поля для максимізації вільного схрещування) 30 Смужки регулярно оброблюваних сільськогосподарських земель:

Ці смужки повинні мати ширину щонайменше в 4 ряди (переважно, 6 рядів) для зниження числа випадків міграції личинок".

Крім того, Національна асоціація виробників кукурудзи, на своєму уер-сайті (псда.сот/іпзесі-гезізтапсе-тападетепі-гасі-зпеєї-Бі-согп) також опублікувала аналогічний 35 посібник з вимог для площ-сховищ. Так, наприклад: "Вимоги до ІКМ у випадку кукурудзяного трача: - Засівати щонайменше 20 95 акрів кукурудзою для збереження нетрансгенних гібридів - У регіонах вирощування бавовнику, повинно залишатися 50 95 площі-сховища - Повинно бути засіяно 1/2 милі нетрансгенними гібридами 40 - Площі-сховища можуть бути засіяні смугами на Ві-поля; площі-сховища повинні бути засіяні у вигляді смуг, що повинні мати ширину щонайменше в 4 ряди - Площі-сховища можуть бути оброблені стандартними пестицидами тільки, якщо досягаються економічні пороги для комах-мішеней - розпилювані інсектициди на основі Ві не можуть бути використані на площах-сховищах під 45 кукурудзу - відповідне сховище повинне бути засіяне Ві-кукурудзою на кожній фермі"

Як указували Коибп і співробітники (наприклад, на сторінках 1780 і 1784 у правому стовпчику), або кластери піраміди з двох різних білків, кожний з який є ефективним проти шкідників-мішеней з мінімальною перехресною резистентністю або з відсутністю такої 50 резистентності, можуть бути використані на дрібніших "сховищах" нетрансгенних рослин. Кои5п висловив припущення, що для успішного використання кластерів, площа-притулок, розмір якого складає менше ніж 10 956, може бути оброблений культурою з резистентністю, порівнянною з резистентністю культур, оброблюваною приблизно на 50 95 площі-сховища для одного (не- пірамідного) токсину. Що стосується доступних у даний час продуктів з кукурудзи, що містять 55 "пірамідні" Ві, то Агентство США по захисту навколишнього середовища вимагає, щоб значно менша (звичайно 595) площа структурного сховища була засіяна не-ВіІ кукурудзою, а не культурою з одним токсином (звичайно 20 95).

Існують різні шляхи забезпечення ІНМ-ефектів використання площ-сховищ, включаючи різні геометричні схеми засівання на поля (як згадувалося вище) і суміші насіння в одному пакеті, що 60 також обговорюється Коб і ін. (див. вище), і в патенті США Мо 6551962.

Вищевказані відсотки або аналогічні співвідношення площ-сховищ можуть бути використані для розглянутих двокомпонентних або трикомпонентних кластерів або пірамід. Для трикомпонентних кластерів із трьома механізмами дії проти однієї шкідника-мішені, сховища взагалі бути не повинно (або наприклад, площа-притулок повинний бути меншим 5 95). Це особливо справедливо для площ під комерційні культури - наприклад, понад 10 акрів.

Усі патенти, патентні заявки, попередні заявки і публікації або цитовані в них роботи у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання в тій мірі, у якій вони відповідають детальному опису даної заявки.

Нижче приводяться приклади, що ілюструють способи практичного здійснення даного винаходу.

Ці приклади не повинні розглядатися як обмеження обсягу винаходу. Усі відсотки дані по масі, а всі співвідношення сумішей розчинників дані по обсязі, якщо це не обговорено особливо.

Усі температури дані в градусах Цельсія.

Якщо це не зазначено або не мається на увазі конкретно, то використовувані тут артиклі "а", "ап" і "Пе" означають "щонайменше один".

Приклад 1

Конструювання химерних білків, що містять корові токсини СтгуїСа і протоксини СтутАБ

Химерні токсини. Химерні білки, що містять домен корового токсину одного Сгу, приєднаного до протоксинового сегмента іншого токсину Сгу, були вже описані, наприклад, у патенті США Мо 5593881 і в патенті США Мо 5932209. Послідовність білка ендотоксину Стгу1!СаЗ-дельта депонована у СепВапК під реєстраційним номером ААА22343 під застарілим позначенням

Стут Сб).

Варіантами химерних білків Стгу1!Са відповідно до винаходу є химерні токсини, що містять М- кінцевий сегмент корового токсину, що походить від інсектицидного токсину СгуїСаЗ, приєднаного до гетерологічного протоксинового сегмента ендотоксину дельта у визначеному положенні, розташованому за межами сегмента корового токсину. Перехід від корового токсину в гетерологічний сегмент протоксину може відбуватися приблизно в природній області стику токсин/протоксин, або альтернативно, частина нативного протоксину (що простягається за межі сегмента корового токсину) може зберігатися, причому, перехід у гетерологічний протоксин може відбуватися нижче. В одному з варіантів, сегменти корового токсину і протоксину можуть включати точно таку ж амінокислотну послідовність нативних токсинів, від яких вони походять, або вони можуть включати амінокислотні додавання, делеції або заміни, що не погіршують, а можуть навіть поліпшувати біологічну функцію сегментів, зв'язаних один з одним.

Так, наприклад, химерний токсин відповідно до винаходу містить сегмент корового токсину, що походить від СтуїСазЗ, і гетерологічний протоксин. У переважному варіанті винаходу, сегмент корового токсину, що походить від СтуїСазЗ (619 амінокислот), приєднаний до гетерологічного сегмента, який містить сегмент протоксину, що походить від дельта- ендотоксину СтутАб (545 амінокислот). Послідовність химерного білка з 1164 амінокислот, позначеного тут 016-152, представлена як 5ЕО ІЮ МО:1. Другий переважний варіант винаходу включає химерний білок, у якому сегмент корового токсину СтуїСа (619 амінокислот) приєднаний до другого сегмента протоксину з 545 амінокислот, що походить від СтутАбБ.

Послідовність другого химерного білка з 1164 амінокислот, позначеного тут 01ІС-109, представлена як 5ЕО ІЮ МО:2 (варіант, оптимізований для кукурудзи). Слід зазначити, що в об'єм даного винаходу входять і інші химерні гібриди, що містять варіанти корового токсину

СтуїСа і протоксини, що походять від СтутАб.

Слід зазначити, що химерні білки 0ІС-152 і БІС-109, по суті, функціонально еквівалентні один одному, і відрізняються тільки в одному положенні послідовності (у положенні амінокислоти 620, що є положенням приєднання сегмента корового токсину СтуїСа до сегмента протоксину СтуТтАбБ).

Приклад 2

Конструювання експресійних плазмід, що кодують химерні білки "коровий токсин

СтгуїСа/протоксин СтуТт Ар", і їх експресія в Рхоендотопа5

Для створення експресійної конструкції РМУС2547 Рзхеийдотопах Пиогезсепз (РІ), отриманої з метою продукування повнорозмірного химерного білка БІС-152 (представленого в 5ЕО ІЮ

МО:1) біли застосовані стандартні методи клонування (описані, наприклад, у посібнику

Затрьгоок еї аї, (1989) ї А!,зибеї еї аїЇ, (1995), і в більш пізніх виданнях). Продукування білка здійснювали в штамі МВ214 Рхейдотопах Пиогезсеп5 (похідному штаму МВ101; Р. Пиогезсепв, біовар 1), що має інсерцію модифікованого оперону Іас, як описано в патенті США Мо 5169760.

Основна стратегія клонування включає субклонування фрагмента ДНК, що кодує 0ІС-152, у 60 плазмідні вектори, у результаті чого цей фрагмент буде поміщений під експресійний контроль промотору Ріас і термінатора гпВТІ2, що походить від плазміди рКкК223-3 (РІ. РНаптасіа,

Міммашкее, УМІ). Одна з таких плазмід позначається РМУС2547, а ізолят МВ214, що містить цю плазміду, позначається Орів.

Аналіз на ріст і експресію в шейкерних колбах

Продукування білка 0ІС-152 для характеризації і біологічного аналізу на його дію проти комах здійснювали з використанням штаму ЮрпП108 Р. Ппогезсеп5, вирощеного в шейкерних колбах. Продукування білка 010-152, що знаходиться під контролем промотору Ріас, здійснювали, як описано раніше в патенті США Мо. 5527883. Докладний опис мікробіологічних маніпуляцій приводиться в публікації 5дпігез еї аї!., (2004), у заявці на патент США 20060008877, у заявці на патент США 20080193974 і в заявці на патент США 20080058262, що вводяться в даний опис за допомогою посилання. Експресія була індукована шляхом додавання ізопропіл-рД- р-1-тіогалактопіранозиду (ІРТО) після першого інкубування протягом 24 годин при 30 С зі струшуванням. Зразки культур брали під час індукування й у різні періоди часу після індукування. Клітинну густину вимірювали по оптичній густині на 600 нм (ОЮОвоо).

Фракціонування клітин і аналіз зразків у шейкерних колбах, проведений за допомогою електрофорезу в ПААГ із ДСН. При кожному взятті зразка, клітинну густину зразків доводили до

ООвоо-20, і 1 мл-аліквоти центрифугували при 14000 х д протягом п'яти хвилин. Клітинний осад заморожували при -80 "С. Розчинні і нерозчинні фракції, узяті з заморожених зразків клітинного осаду в шейкерних колбах, одержували з використанням розчину для екстракції бактеріального білка ЕазуЇ усе (ЕРІСЕМТКЕФ ВіоїесппоЇодіех5х, Майдібоп, Ум). Кожен клітинний осад ресуспендували в 1 мл розчину ЕазуЇ узе"М, а потім розводили 1:4 у буфері для лізису і інкубували зі струшуванням при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Лізат центрифугували при 14000 об/хв протягом 20 хвилин при 40сС, і супернатант виділяли у виді розчинної фракції. Потім осад (нерозчинну фракцію) ресуспендували в рівному обсязі забуференого фосфатом фізіологічного розчину (РВ5; 11,9 мМ МагНРО», 137 мМ Масі, 2,7 мм

КСІ, рН 74).

Зразки змішували у відношенні 1:11 з 2 х буфером для зразків Лемлі, що містить Д- меркаптоетанол (ЗатбргооК еї аі, див. вище), і кип'ятили протягом 5 хвилин, а потім завантажували на 12 95 біс-тріс-гель Стйегіоп ХТ (Віо-Кай Іпс., Негсціе5, СА). Електрофорез здійснювали в ХТ-буфері МОР5, рекомендованому виробником. Гелі офарблювали кумасі синім

Віо-Заге відповідно до протоколу, рекомендованим виробником (Віо-Кай), і візуалізували з використанням візуалізуючої системи Аїрпа Іппоїесйі (зап І еапаго, СА).

Одержання тілець включення. Одержання тілець включення білка БІС-152 (ІВ) здійснювали в клітинах, отриманих шляхом реакції ферментації Р. Пиогезсеп5, що продукували нерозчинний інсектицидний Ві-білок, як показав аналіз, проведений за допомогою електрофорезу в ПААГ із

ДСН і МАГОІ-М5 (матрична лазерна десорбція/онізуюча мас-спектрометрія). Гранули, отримані шляхом ферментації Р. Пиогезсеп5, відтавали на водяній бані при 37 "С. Клітини ресуспендували до 25 95 мас/об у буфері для лізису |50 мм трісу, рН 7,5, 200 мм Масі, 20 мм

ЕОТА-динатрієвої солі (етилендіамінтетраоцтової кислоти), 195 тритону Х-100 і 5 мм дитіотреїтолу (ОТТ); 5 мл/л "коктейлю" інгібіторів бактеріальної протеази (Саїаіюод Ж Р8465;

Зідта-Аїдгісп, 5. І оці5, МО), що додавали безпосередньо перед застосуванням). Клітини суспендували на гомогенізаторі з ручним керуванням з установкою шкали найменшого значення (Тізвце Теагог, Віозрес Ргодисів, Іпс., Вапевміе, ОК). Лізоцим (25 мг Зідта 17651, виділеного з білка курячих яєць) додавали до клітинної суспензії шляхом змішування металевим шпателем, і суспензію інкубували при кімнатній температурі протягом однієї години. Суспензію прохолоджували на льоду протягом 15 хвилин, а потім обробляли ультразвуком на ультразвуковому генераторі Вгапзоп Зопійег 250 (два раунди по 1 хвилині, 50 95 черговий цикл, 30 95 вихід). Лізис клітин підтверджували за допомогою мікроскопії. При необхідності додавали 25 мг лізоциму, а потім інкубування й обробку ультразвуком повторювали. Після підтвердження лізису клітин під мікроскопом, лізат центрифугували при 11500 х д протягом 25 хвилин (4 "С) з одержанням осаду тілець включення (ІВ), і супернатант відкидали. Осад ІВ ресуспендували з 100 мл буфера для лізису, гомогенізували в міксері з ручним керуванням і центрифугували як описані вище. Осад ІВ повторно промивали шляхом ресуспендування (у 50 мл буфери для лізису), гомогенізації, обробки ультразвуком і центрифугування доти, доки супернатант не ставав безбарвним, а осад ІВ твердим і не зовсім білим. Для кінцевого промивання, осад ІВ ресуспендували в стерильно відфільтрованій (на фільтрі 0,22 мкм) дистильованій воді, що містить 2 мМ ЕОТА, і центрифугували. Кінцевий осад ресуспендували в стерильно відфільтрованій дистильованій воді, що містить 2 мМ ЕОТА, і зберігали у вигляді 1 мл-аліквот при -80 "С.

Аналіз, проведений за допомогою електрофорезу в ПААГ із ДСН, і кількісну оцінку білка в препаратах ІВ здійснювали шляхом відтавання 1 мл-аліквоти осаду ІВ і розведення 1:20 стерильно відфільтрованою дистильованою водою. Потім розведений зразок кип'ятили з 4 х відновним буфером для зразків (250 мм тріс, рН 6,8, 4095 гліцерину (об/об), 0,495 бромфенолового синього (мас/об), 895 ДСН (мас/об) і 895 ДВ-меркаптоетанолу (об/об),| і завантажували на 4-20 95 тріс-гліцин МомехФ у гелі в ямках 12-42 (Іпмігодеп), обробленому 1 х трісом/гліцином/ДСН-буфером (ВіоКад). Гель піддавали електрофорезу протягом 60 хвилин при 200 вольт, а потім забарвлювали кумасі синім (50 95 с-250/50 95 ЩВ-250 у 45 95 металолі, 10 95 оцтовій кислоті), і знебарвлювали 7 95 оцтовою кислотою, 5 956 метанолом у дистильованій воді.

Кількісну оцінку смуг-мішеней здійснювали шляхом порівняння денситометиричних величин для смуг зі стандартними зразками альбуміну бичачої сироватки (ВЗА), проаналізованих на тому же гелі для побудови стандартної кривої.

Солюбілізація тілець включення. б мл суспензії тілець включення 0ІС-152 від клону Рі,

ОРПОВ8, центрифугували на мікроцентрифузі Еппендорфа моделі 5415С, установленої на найвище значення (приблизно 14000 х д), у результаті чого одержували осад тілець включення.

Супернатант буфера для збереження видаляли і замінювали 25 мл 100 мМ натрійкарбонатного буфера, рН 11, у конічній 50 мл-пробірці. Тельця включення ресуспендували піпеткою і піддавали вихровому перемішуванню до одержання однорідної суміші. Пробірку поміщали на платформу, що повільно обертається, і залишали на ніч при 4 "С для екстракції білка-мішені.

Екстракт центрифугували при 30000 х уд протягом 30 хвилин при 4 "С, і отриманий супернатант

Б-кратно концентрували на центрифугальному фільтруючому пристрої з регенерованою целюлозою Атісоп Ойга-15 (з відсіканням молекулярної маси 30000; МіПроге). Буфер для зразків замінювали 10 мМ САРЗ |ІЗ-(циклогексаміно)-1-пропансульфоновою кислотою), рН 10, з використанням одноразових стовпчиків РО-10 (СЕ Неайнсаге, Різсаїажау, М).

Солюбілізація білка тілець включення і їх активація трипсином. У деяких випадках, суспензію 0Іс-152 тілець включення від клону РІ, ОРТО8, центрифугували на мікроцентрифузі

Еппендорфа моделі 5415С, установленій на найвище значення (приблизно 14000 х 9), у результаті чого одержували осад тілець включення. Супернатант буфера для збереження видаляли і замінювали 100 мМ САРБ, рН 11, з одержанням білка, концентрація якого складала приблизно 50 мг/мл. Пробірку обертали при кімнатній температурі протягом трьох годин до повної солюбілізації білка. Потім додавали трипсин у рівних кількостях до 5 95-10 95 (мас. 95, по вихідній масі порошку ІВ) і здійснювали гідроліз шляхом інкубування при обертанні протягом ночі при 4 "С або обертанні протягом 90-120 хвилин при кімнатній температурі. Нерозчинний матеріал видаляли шляхом центрифугування при 10000 х д протягом 15 хвилин, і супернатант наносили на аніонообмінну колонку Мопос) (10 мм х 10 див). Активований білок 0БІС-152 елюювали (як було визначено за допомогою електрофорезу в ПААГ із ДСН) 25 колонковими об'ємами 0 сь - 100 95 1М градієнта Масі. Фракції, що містять активований білок, поєднували, і при необхідності, концентрували до менше ніж 10 мл на центрифугальному фільтруючому пристрої з регенерованою целюлозою Атісоп ШКга-15 як описано вище. Потім матеріал пропускали через стовпчик з Зирегдех 200 (16 мм х 60 см) у буфері, що містить 100 мм масі, 10 95 гліцерину, 0,5 Фо твіну-20 і 1 мМ ЕОТА. Аналіз, проведений за допомогою електрофорезу в

ПААГ із ДСН, показав, що активований (ферментативно зрізаний) білок елююється при 65-70 мл. Фракції, що містять активований білок, збирали і концентрували на центрифугальному концентраторі як описано вище.

Гель-електрофорез. Препарати концентрованого білка одержували для проведення електрофорезу шляхом розведення 1:50 у буфері для зразків 05 МиРАСЕФ (Іпмігодеп), що містить 5 ММ ОТ як відновник, і нагрівали при 95 "С протягом 4 хвилин. Зразок завантажували на доріжки-дублікати з 4-12 95 гелем МиИРАСЕФ разом з п'ятьма ВЗА-стандартами в кількості від 0,2 мкг до 2 мкг/доріжку (для побудови стандартної кривої). Потім подавали напругу в 200 В з використанням буфера МОР5З для електрофорезу з ДНС (Іпмігодеп) доти, доки барвник-"свідок" не досягав основи гелю. Гель забарвлювали 0,2 95 кумасі синім (-250 у 45 95 метанолі, 10 95 оцтовою кислотою, і знебарвлювали спочатку шляхом швидкої обробки 45 95 металолом, 10 95 оцтовою кислотою, а потім шляхом тривалої обробки 7 95 оцтовою кислотою, 5 95 метанолом до появи прозорого тла. Після знебарвлення, гель сканували на мультивізуалізаторі ВіоКай Ріног- 5. Для одержання об'ємів пофарбованих смуг білка з вирахуванням тла і для побудови стандартної кривої ВА, що була використана для обчислення концентрації химерного білка рІС-152 у маточному розчині, використовували комп'ютерну програму Очапійу Опе Боймаге м.4.5.2.

Приклад З 60 Інсектицидна активність білка БІС-152, що продукується в Рзейдотопавх Ппогезсепьо

Інсектицидна активність білка БІС-152 була продемонстрована на личинках совки трав'яної (ЕАМУ, зродорієга їгидірегаа (У.Е. Зтійй)) і на личинках Сту! Е-резистентною ЕАМУ (ГЕАУМ).

Приготування і біоаналізи зразків. Препарати тілець включення (нативного повнорозмірного білка або білка, активованого трипсином) переносили в 10 мМ САРЗ-буфер, рНІ1О, методами заміни буфера, такими як діаліз, або на колонках РО-10. Потім зразки відповідним чином розводили в 10 мМ САР5Б, рН 10, ї всі біоаналітичні препарати містили контроль, що складається з цього буфера, який служив як фон для підтвердження загибелі комах або інгібування їх розвитку.

Концентрації білків в буфері для біоаналізу оцінювали за допомогою гель-електрофорезу з використанням В5А з метою побудови стандартної денситометричної кривої для гелю, і цей аналіз проводили з використанням системи візуалізації ВіоКай, як описано вище. Білки в гелевій матриці забарвлювали барвником на основі кумасі синього, і перед прочитанням знебарвлювали.

Очищені білки тестували на інсектицидну активність за допомогою біоаналізів, що проводяться з використанням щойно личинок, що вилупилися лускокрилих, яким давали штучний корм для комах. Личинки БАМУ вилуплювалися з яєць, отриманих з колоній, що зберігаються в комерційно доступному інсектарії (Веп2оп Кезеагсп! Іпс., Сапівіє, РА). Личинки

ГЕАМУ вилуплювалися з яєць, отриманих з непромислових колоній (Оом/ Адгозсіепсев5,

Іпаіапарої в, ІМ).

Біоаналізи проводили в 128-ямкових пластикових планшетах, спеціально виготовлених для біоаналізів комах (С-ЮО Іпіегпайопа!Ї, Рійтап, МУ). Кожна ямка містила 1,0 мл корму для лускокрилих багатьох видів (Зоцїйіапа Ргодисі5, їаКе МіПаде, АК). 40 аліквот зразка білка наносили піпеткою на поверхню в 1,5 см? кожної ямка з кормом (тобто, 26 мкл/смг).

Концентрацію корму обчислювали як кількість (нг) білка ФБІС-152 на квадратний сантиметр площі поверхні в ямку. Оброблена ямка витримувала у витяжному шафі доти, поки рідина на поверхні корму не випаровувалася або не вбиралася в цьому кормі.

Протягом декількох часів розмноження, окремі личинки збирали зволоженою щіткою з верблюжої вовни і вміщували на оброблений корм, одну личинку на ямку. Потім заражену ямку герметично закривали клейкими прозорими пластиковими пластинами, і забезпечувала отвором для газообміну (С-О Іпіегпайопа). Планшети для біоаналізу витримували в регульованих умовах навколишнього середовища (28", відносна вологість приблизно 40 95 (ВВ), 16 год.:8 год. (день:ніч)| протягом 5 днів, після чого реєстрували загальне число комах, оброблених кожним зразком білка, число загиблих комах і масу комах, що вижили. Процент загиблих комах і процент інгібування їх росту обчислювали для кожної обробки. На кожній стадії обробки обчислювали процент загиблих комах і процент інгібування їх росту. Процент інгібування росту (СІ) обчислювали таким чином: вес - 1 - (СТУМ'Т/Т МІ 4 ТУМІВС/ТМІВС)Ї х 100, де ТУМІТ означає загальну масу комах для даної обробки (Тоїаі! МУеідні ої Іпзесів іп Ше

Тгеаїтепіу),

ТМІТ означає загальне число комах для даної обробки (Тоїаї Митбрег ої Іпзесів іп Ше

Тгеаїтепіу),

ТМ/ІВС означає загальну масу комах в фоновому контролі (Тоїа! М/єїЇдні ої Іпзесів іп Ше

Васкагоипа Спеск) (буфер-контроль), і

ТМІВС означає загальне число комах в фоновому контролі (Тоїа! Митьег ої Іпзесів іп Ше

ВасКагоипа Спеск) (буфер-контроль).

СіІво визначали як концентрацію химерного білка БІС-152 в кормі, де величина 950 дорівнює 50. І Со (50 95 летальну концентрацію) реєстрували як концентрацію білка БІс-152 в кормі, при якій гинуло 50 95 тестованих комах. Статистичний аналіз (односторонній АМОМА) проводили з використанням комп'ютерної програми УМР (5А5, Сагу, МО).

У таблиці 2 представлені результати біоаналізів білка 0ІС-152 на його поїдання личинками комахи совки трав'яної.

Таблиця 2

Величини сво і І Со (в нг/см-), обчислені для корму комах, на верхню частину якого був нанесений білок БІС-152

Відмітною ознакою білка 0БІС-152 згідно з винаходом є те, що ріст личинок совки трав'яної, які щойно вилупилися (Зродоріега ігидірегаа), інгібується після поїдання білка або 0ІС-152. Крім того, личинки совки трав'яної, які є резистентними до інтоксикації білком Сту1!Ра, залишаються сприйнятливими до активності 0ІС-152, як і личинки совки трав'яної дикого типу. Значущість сприйнятливості цих Сгтгу1!Ра-резистентних комах до Сгту!Са детальніше обговорювалася вище.

Приклад 4

Конструювання послідовності, що оптимізована по кодонах кукурудзи і кодує білок Б0ІС-109

Фахівцеві в галузі молекулярної біології рослин відомо, що множина послідовностей ДНК може бути сконструйована так, щоб вони кодували одну амінокислотну послідовність.

Загальновідомий спосіб підвищення рівня експресії області, що кодує що представляє інтерес білок, полягає в створенні такої кодуючої області, в якій склад кодонів аналогічний загальному складу кодонів хазяїна, в якому повинна бути досягнута експресія генів. Посібник по конструюванню і продукуванню синтетичних генів можна знайти, наприклад, в заявці МО 1997/13402 і в патенті США Мо 5380831.

Послідовність ДНК, що має зміщення кодонів кукурудзи, конструювали і синтезували так, щоб вона продукувала химерний інсектицидний білок БІС-109 в трансгенних однодольних рослинах. Таблицю зустрічання кодонів в кукурудзі (7єеа тауз І.) складали виходячи з 706 білок- кодуючих послідовностей, виведених з послідовностей, депонованих в СепВапк (могій м/ае мер: пебі.піт.пій.дом). Середньоваговий набір кукурудзяних кодонів обчислювали шляхом виключення будь-якого надлишкового кодону, кількість якого складає приблизно менше ніж 10 95 від загального зустрічання кодонів для даної амінокислоти. Середньовагове уявлення для кожного кодону обчислювали за формулою:

Середньоваговий 95 С1-1/95С1--9502-95С3-т.п.) х 951 х 100, де С1 являє собою кодон, що розглядається, а 9502, 9523 і т. п. означає середній 95 зустрічання інших синонімічних кодонів.

Для отримання послідовності ДНК, яка оптимізована по кодонах кукурудзи і кодує білок БІС- 109 5ЕО ІЮО МО:2, що складається з 1164 амінокислот, були зроблені заміни кодонів в нативній послідовності ДНК сгуЇСа, що кодує сегмент корового токсину Сту1!Са, в результаті чого була отримана послідовність ДНК, що має загальний склад оптимізованих для кукурудзи кодонів, представлена в таблиці зміщення кодонів. Аналогічним чином, заміни кодонів в нативній послідовності ДНК сгуЇїАйб, що кодує сегмент протоксину СтгутїАбр були зроблені так, щоб отримана послідовність ДНК мала загальний склад оптимізованих для кукурудзи кодонів, представлені в таблиці зміщення кодонів. Додаткові уточнення послідовностей були зроблені для усунення небажаних сайтів розпізнавання рестриктуючих ферментів, потенційних сайтів сплайсингу інтронів рослин, довгих ділянок залишків А/Т або С/с, і інших мотивів, які можуть негативно впливати на стабільність РНК, транскрипцію або трансляцію кодуючої області в клітинах рослин. Для введення потрібних сайтів розпізнавання рестриктуючих ферментів і для видалення довгих внутрішніх відкритих рамок зчитування (крім рамок 41) були зроблені потрібні заміни. Всі ці заміни були зроблені на ділянках, в межах яких приблизно залишалося зміщення кодонів в порівнянні зі складом кодонів кукурудзи. Повна оптимізована по кодонам кукурудзу послідовність (що кодує білок БІС-109) представлена в 5ЕО ІЮ МО:3. Синтез фрагмента ДНК здійснювали відповідно до інструкцій постачальника (ОМА2.0, Мепіо РагкК, СА).

Приклад 5

Конструювання рослинних трансформуючих векторів, що містять експресовані в рослині гени, що кодують білки 0ІС-109

Для трансформації однодольних рослин-хазяїнів звичайно використовується супербінарна система Адгорасієгішт (Чарап Торассо, ТоКуо, УР). У такій супербінарній системі використовується човниковий плазмідний вектор реВІЇї, що містить послідовності повторів правого кордону Т-ДНК (КВ) і повторів лівого кордону Т-ДНК (18), розділений сайтами множинного клонування. Похідне ревВі! (що позначається ррАВ7б691) отримували стандартними методами клонування ДНК. Плазміда ррАВ7б691 містить оптимізовану для кукурудзи 0ІС-109- кодуючу послідовність (СО5; тобто, ЗЕО ІЮО МО:3), що знаходиться під транскрипційним контролем промотору убіхітину 1 кукурудзи з приєднаним інтроном 1 (патент США Мо 5510474) і з приєднаною 3'-нетрансльованою областю Рег5о кукурудзи (3 ТЕ) (патент США Мо 7179902).

Крім того, рОАВ7691 містить рослинний селективний маркерний ген, що включає послідовність сор5 05М2 Оом/ АдгозЗсіепсе5 (МО 2008/070845 А2), що знаходиться під транскрипційним контролем промотору актину 1 рису з приєднаним інтроном 1 (патент США Мо 5641876), ії з

З'СТК ліпази кукурудзи (патент США Мо 7179902). Фізичне розташування компонентів Т-області рорАВ7691 можна представити як:

КВ» промотор ШріїЇ кукурудзи:СО5 0ІС-109:3'0ТК Рего5 кукурудзи » промотор АСсИ рису:СО5

О5М2:З'СТК ліпази кукурудзи гі В.

Друге похідне ре5В11 (що позначається ррАВ100276) отримували стандартними методами клонування ДНК. Плазміда ррАВ100276 містить оптимізовану по кодонах кукурудзи 0ІС-109- кодуючу послідовність (СО; тобто, ЗЕО ІЮО МО:3), що знаходиться під транскрипційним контролем промотору убіхітину 1 кукурудзи з приєднаними інтроном 1 і З'ОТЕ Рег5 кукурудзи.

Крім того, плазміда рРОАВ100276 містить рослинний селективний маркерний ген, що включає послідовність СО ААОІТ ЮОом/ АдгоЗсіепсе5 (заявка на патент США Мо 20090093366), що знаходиться під транскрипційним контролем промотору убіхітину 1 кукурудзи з приєднаними інтроном 1 і З'ОТЕ ліпази кукурудзи. Фізичне розташування компонентів Т-області РОАВІ100276 можна представити як:

КВ»промотор Шрі о кукурудзиСбО5 0ІС-109:3'ШТК Рег5 кукурудзипромотор /- ОБії кукурудзи:СО5 ААО-1:3'ОТК ліпази кукурудзи гі В.

Для трансформації АдгоБбасіегішт, клітини клонуючого штаму ЮОН5ба ЕзспПегіспіа соїї, що містить плазміду РОАВ7691 або плазміду РОАВ100276, культивували при 37 "С протягом ночі на середовищі з агаром ІВ (г/л: триптон Васіо, 10; дріжджовий екстракт Васіо, 5; масі, 10; агар, 15), містили спектиноміцин (100 мкг/мл). Клітини штаму ОН5ба, що містять кон'югативну мобілізуючу плазміду рЕКК2013, культивували на агарі ЇВ, що містить канаміцин (50 мкг/мл).

Після інкубування, планшети вміщували при 4 "С для забезпечення доступності штаму І ВА4404

Адгорасіегішт їшптетгасіеп5, що містить плазміду реВІ.

Приклад 6

Трансформація Адгобасіегішт для отримання супербінарних векторів

Супербінарна система Адгобасіегішт, в якій використовується штам І ВА4404 Адгобасіегішт

Імтеїасієп5, що містить плазміду рОВІ!, звичайно застосовується для трансформації однодольних рослин-хазяїнів. Методика конструювання і підтвердження створення супербінарних векторів добре описана в Технічному посібнику для роВІ1 (дарап Тобассо). Для генерування і підтвердження створення супербінарної плазміди ррА55162, яка являє собою до- інтегровану плазміду, що містить плазміди рОВІ і ррАВ7б691, і супербінарної плазміди ррАБ5848, яка являє собою до-інтегровану плазміду, що містить плазміди рзВІ і рОАВ100276, застосовували стандартні методи мікробіології молекулярної біології.

Приклад 7

Продукування білка 0ІС-109 в рослинах кукурудзу

Адгорасіегіийт-опосередкована трансформація кукурудзи. Насіння від кросів Е1 Ні-ІЇ (Агіт5ігопу еї аї., 1991) висівало в 5-галлонні горщики, що містять суміш 95 95 культурального середовища Меїго-Міх 360 без грунту (Зип Сго Ногіісиниге, ВеМПемие, УМА) і 5 95 грунту з глиною/вапном. Рослини вирощували в теплиці з використанням комбінації натрієвих і галогенових ламп високого тиску в режимі освітлення 16 годин день: 8 годин ніч. Для отримання незрілих ембріонів 2, що використовуються для трансформації, здійснювали контрольоване запилення сибсів. Качани кукурудзи збирали приблизно через 8-10 днів після запилення, коли незрілі ембріони мали розмір від 1,0 мм до 2,0 мм.

Інфікування і спільне культивування. З качанів кукурудза знімала листя, і поверхню стерилізували шляхом очищення рідким милом, просоченим в 20 95 комерційно доступному відбілювачі (що містить 5 95 гіпохлорит натрію), залишали приблизно на 20 хвилин, а потім три рази промивали стерильною водою. Суспензію клітин Адгобасієгішт їшптегїасіеп5, що містять ррАБ5162, супербінарний вектор, що включає ген, який кодує білок 0ІС-109, і рослинний селективний маркерний ген О5М2, отримували шляхом перенесення 1 або 2 петель бактерій культивовані протягом 2-3 днів при 28 "С на твердому середовищі МЕР (г/л: дріжджовий екстракт Васіюо, 10; пептон Васіо, 10; масі, 5; агар, 15), що містить 100 мг/л спектиноміцину, 10 мг/л тетрацикліну і 250 мг/л стрептоміцину) в 5 мл рідкого інфекційного середовища |базального середовища 5 (І іпбітайег апа 5Коод, 1965), вітаміни Мб (Спи еї аї., 1975), 1,5 мг/л 2,4-

дихлорфеноксіоцтової кислоти (2,4-О0)), 68,5 г/л сахарози, 36,0 г/л глюкози, 6 мМ І -проліну, рн 5.21, що містить 100 мкК ацетосирінгону.

Альтернативно, суспензію клітин Адгобрасіегішт їшптеїтасіеп5, що містять ррАдАБ5848, супербінарний вектор, що включає ген, кодуючий білок 0ІС-109 і рослинний селективний маркерний ген ААО-1, отримували шляхом перенесення 1 або 2 петель бактерії, культивовані як описано вище, в 5 мл рідких інфекційного середовища, що містить 100-200 мкм ацетосирингону.

У обох випадках, розчин струшували до отримання однорідної суспензії, і її концентрацію доводили до кінцевої густини 200 одиниць Клетта за допомогою колориметра Клетта-

Саммерсона з використанням пурпурного фільтра (для трансформації рраА55162), або до оптичної густини 1,2 на 550 нм (для трансформації рраА55848). Незрілі ембріони виділяли безпосередньо в мікроцентрифугальну пробірку, що містить 2 мл інфекційного середовища.

Потім середовище видаляли і замінювали 1 мл розчину Адгобасіегішт, після чого розчин

Адгорасіегішт/ембріон інкубували протягом 5-10 хвилин при кімнатній температурі. Потім ембріони переносили в середовище для спільного культивування І|базальне середовище |І5, вітаміни Мб, 1,5 мг/л 2,4-О0, 30,0 г/л сахарози, 6 мМ І -проліну, 0,85 мг/л АОМО», 2,8 г/л геланової камеді (РпуоТесппоїоду І арогайогіє5, І епеха, К5), рН 5,81, що містить 100 мкМ ацетосирингону (для трансформантів рОАбБ5162) або 100-200 мкК ацетосирингону (для трансформантів ррАБЗ5848), і спільно культивували протягом 3-4 днів при 20 "С в темряві.

Після спільного культивування, ембріони переносили в регенеруюче середовище, що містить солі М5 і вітаміни, 6 мМ І-проліну, 100 мг/г міо-інозиту, 500 мг/г МЕ5, 30 г/л сахарози, 1,5 мг/г 2,4-О0, 0,85 мг/г АЯМОз, 250 мг/г цефотаксиму, 2,8 г/л геланової камеді, рН 5,8.

Приблизно через 7 днів, ембріони переносили в те ж саме середовище, в яке було додано З мг/г біалофосу (для трансформантів ррА55162) або 100 нМ галоксифопу (для трансформантів ррАБЗ5848) (селективне середовище). Трансформовані ізоляти ідентифікували приблизно через 8 тижнів і об'єднували в загальну масу шляхом перенесення на свіже селективне середовище з 2г-тижневими інтервалами для регенерації і аналізу.

Регенерація і продукування насіння. Для регенерації, культури переносили в індукційну середовище "28" (солі М5 і вітаміни, 30 г/л сахарози, 5 мг/г бензиламінопурину, 1,5 мг/г 2,4-0, 250 мг/г цефотаксиму, 2,8 г/л геланової камеді, рН 5,7), в яку було додано З мг/г біалофосу (для трансформанів ррАБЗ5162) або 100 нМ галоксифопу (для трансформанів ррАБЗБ5848).

Інкубування проводили протягом 1 тижня в умовах слабкого освітлення (14 мкЕм- с"), а потім протягом 1 тижня в умовах сильного освітлення (приблизно 89 мкЕм'?с"). Потім тканини переносили в середовище для регенерації "36" (середовище, аналогічне індукційному середовищу, за винятком того, що воно не містило регуляторів росту рослини). Коли паростки досягали 3-5 см в довжину, рослини переносили в скляні пробірки для культивування, що містять середовище ЗНОА |((Зспепк апа Ніідебгапайї (1972), заїй5 апа міатіп5; РпуїоТесппо!одіеб

ІГарг.), що містить 1,0 г/л міо-інозиту, 10 г/л сахарози і 2,0 г/л геланової камеді, рН 5,8) для подальшого культивування і розвитку пагонів і коріння. Рослини пересаджували в ту ж саму суміш грунту, описану раніше, і культивували в теплиці до початку цвітіння. Для отримання насіння проводили штучне запилення.

Для фахівця в галузі трансформації кукурудзи очевидно, що для трансформації кукурудзи і для відбирання трансформованих рослин можуть бути застосовані і інші методи у випадку використання інших експресованих в рослині селективних маркерних генів (наприклад, генів толерантності до гербіцидів).

Приклад 8

Біохімічний аналіз і бідсаналізи рослин кукурудзи, продукуючих білок БІС-109, на токсичність для комах

Продукування білка 0ІС-109 в трансгенних рослинах кукурудзи оцінювали по білках, екстрагованих з листя молодих рослин (генерація ТО). Два диски листя кукурудзи діаметром 6 мм вміщували в пробірку для зразків, взяту з глибокого 9б6-ямкового планшета з набором пробірок (Совіаг Сай 3957), і заморожували до -80" і зберігали до початку аналізу. У день аналізу, два 4,5-мілілітрових покритих цинком ВВ ЮОаїзу"Мм додавали в кожну (заморожену) пробірку разом з 200 мкл буфера для екстракції, що складається з РВ5 (забуференого фосфатом розчину; Ріхпег Сай ВРБб5-1) і 0,05 95 твіну 20. Кожну пробірку закривали кришкою, і планшет вміщували в кульовий млин (КіІесо"м 4-96 Риїмегігег; Сагсіа Мапитасіцгіпоу, Мізаійа, СА) максимум на три хвилини. Подрібнені в порошок зразки центрифугували протягом 5 хвилин при 2500 х д, і супернатант, що містить розчинні білки, використовували в імуноаналізах.

Імуноблот-аналіз білків, екстрагованих з листя кукурудзи, показав, що поліклональне 60 антитіло проти БІС152ЕРСІ (отримане у кроликів, імунізованих активованим трипсином білком,

що містить коровий токсин СгуїСа) не вступає в перехресну реакцію з білками, екстрагованими з листя нетрансгенних рослин. У екстрактах рослин, трансформованих ррА55162, білки деяких видів були детектовані з використанням антитіла проти 0ІС152РЕСІ1.

Очевидно, що незважаючи на те, що трансген, введений в кукурудзу шляхом трансформації рорАБ5162, буде кодувати повнорозмірний білок 0ІС-109, однак, протеолітична активність клітин кукурудзи буде приводити до зростання ланцюга білка з утворенням надмірної кількості стабільних молекул з меншою молекулярною масою.

Листя, зібране від незалежно отриманих трансгенних рослин кукурудзи, трансформованих конструкцією рраА55162, тестували іп міго на токсичність для комах з використанням щойно личинок совки трав'яної, що вилупилися (РАМУ, Зродоріега Ігидірегча (9У.Е. Зтійй)), ії СтутЕ- резистентною ЕАМУ (ГРАММ). Яйця ЕАММ були отримані з комерційно доступного інсектарію (Веп2оБ), а яйця ГРАММ були отримані від непромислових популяцій (Юом/ Адгозсіепсев5). Зразки сегментів листя були взяті для біоаналізів вирощених в теплиці рослин ТО на токсичність для комах, і приблизно через два тижні, рослини переносили з лабораторії в теплицю. Для шматочка листя від кожної рослини (приблизно 1 кв. дюйм кожні) вміщували в окрему ямку 32- ямкового планшета (СО Іпіегпайопаї), поверхня якого була покрита З мл отвердженого 2 95 агару. З яєць вилуплювалися личинки, яким давали корм, прийнятний для лускокрилих багатьох видів (Зошційіапа Ргодисів5), і менше ніж через 24 години личинки відбирали. Приблизно 10 личинок на сегмент листя обережно вміщували в кожну ямку щіткою з верблюжої вовни.

Інфіковані планшети герметично закривали перфорованими кришками, що поставляються разом з планшетами, а потім зберігали при 28 "С, при відносній вологості (ВВ) 40 95, в режимі освітлення 16 год.: 8 год. (день:ніч)| протягом трьох днів. Процент ураження (96 САМ) кожного шматочка листа реєстрували по закінченні тесту. Ступінь ураження усереднювали і використовували для того, щоб визначити, які рослини мали найменше ураження комахами кожного тестованого типу. Тести повторювали декілька разів для всіх комах.

Дані аналізували з використанням статистичної комп'ютерної програми УМР (ЗА5, Сагу, МС) шляхом усереднення величин 96 ЮБАМ для кожної рослини і для кожного типу комахи. Для одностороннього аналізу АМОМА використовували модель "Бй У х Х". Якщо це необхідно, то для оцінки значущої відмінності середніх величин 9200АМ для кожної обробки застосовували метод розділення середніх Тьюкі-Крамера. Порівняння проводили для величин 950бАМ, отриманих від контрольних рослини одного і того ж віку. Рослини позитивного контролю вирощували з насіння комерційно доступного гібрида Негсшціех ІМ, продукуючого токсин СтуїРа

ВІ. Негативний контроль (тобто, нетрансформовані рослини) був представлений лініями Ні І! і

В104, і ізолінією Негсшціех 1"М (батько-гібрид Негсціех ІМ, що не містить Сгу).

На фігурі 1 систематизовані результати, отримані в таких тестах за допомогою біоаналізу комах. Була несподівано виявлена позитивна кореляція між продукуванням 0ІС-109 в листі трансгенних рослин і 9?60АМ. Для РАМУ, Г-35,3; а.ї. (ступінь свободи) -1,33; Р«0,0001; г2-0,52, а для ГРАММ, Е-25,3; аї-1,33; Р«0,0001; г--0,43. Було також несподівано і уперше виявлено, що личинки совки трав'яної, які є резистентними до інтоксикації токсином СтуїРа ВІ., вже гинули після поїдання ними листя з токсином ОІС-109 В.

Потрібно зазначити, що інші комахи-шкідники кукурудзи можуть бути протестовані аналогічним чином. Такими шкідниками є, але не обмежуються ними: Адготула рагмісогпів (кукурудзяна мінуюча муха), Адгоїї5 ірзіоп (совка-іпсилон), Апіїсагзіа деттагаїї5 (совка квасоляна), Оіаїгаєа дгапаїозеїПа (американський кукурудзяний трач), Оіаїгаєа засспагаїї5 (трач буряковий), ЕІазтораїри5 ІдпозеПйи5 (шашіль зернова), Неїїсомегра 7еа (совка кукурудзяна),

Неїйоїті5 мігезсепз5 (совка тютюнова), О5ігіпіа пибіїіаі5 (європейський кукурудзяний трач), Стуї1 Е- резистентні О. пибіїавй5, Рішейа хуїов5іейа (моль капустяна), Стгу!-резистентна Р. хуїозіеїПа,

Зродоріеєга ехідца (совка бурякова) і Тгіспоріивіа пі (п'ядун капустяний).

Трансгенні рослини кукурудзи, трансформовані ррадА55848 (генерація ТО), також піддавали біоаналізу на резистентність до комах і імуноаналізам. Кількість білка 0ІС-109 в екстрактах листя кількісно оцінювали з використанням комерційно доступного набору для детектування

Стуї!С за допомогою ЕЕГ ІЗА-аналізу (Епмігоїодіх"М, Рогапа, МА; Са АРОО7), і рівень детектованого білка БІС-109 виражали в мільйонних частках (м. ч.; 1 м. ч. означає 1 нг білка ріа-109 на мг загального розчинного білка в екстракті).

Ступінь ураження шкідниками ЕАМУ і ГЕАМУ оцінювали по наступних балах: 0 - відсутність ураження або декілька помітних дірок, 1-25-50 95 ураження листя, і 2 - з'їдений майже весь лист або з'їдена ліва частина листа. Захищеною від шкідників рослиною є рослина, ступінь ураження якої становить 0,67 або нижче.

Дані, представлені в таблиці 3, вказували на позитивну кореляцію між присутністю білка 60 рІС-109, детектованого за допомогою ЕГІБА в рослинах ТО, і зниженням рівня ураження личинкою совки трав'яної в іп міго біоаналізах. Рослини з найвищим детектованим рівнем білка ріа-109 (рослина 5848-005.4) мали найнижчу оцінку ступеня поїдання листя. Листя від рослин з більш низькими рівнями детектованого білка 0ІС-109 в межах концентрацій 190-230 м. ч. було також менше уражене, ніж листя рослин негативного контролю (тобто, нетрансформованого контролю ВТ104 і Ні Ії), яке мало середні оцінки ураження 1,7 і 1,8. У всьому оціненому листі з ррАБ5848 переважав детектований білок типу БІС-109, який містив дублет з пептидів розміром приблизно 60 кДа і 55 кДа.

Таблиця З

Рівні білка БІС-109 в екстрактах ррА55848-трансформованого листя трансгенної кукурудзи і зниження ступеня ураження личинками совки трав'яної

ПЕТЯ о ПОН 1: Те ООН КОН» ПО

Бен і ШИТИ діння ші

РІС-109, м. ч. тестованих рослин) зОр а) МА не прийнятне; р) 5О - стандартне відхилення середнього

Таким чином, відмітною ознакою даного винаходу є те, що білок БІС-109, при його продукуванні в рослинах кукурудзи, повідомляє рослинам резистентність до ураження личинками совки трав'яної і личинками Сту1Р-резистентної совки трав'яної.

Приклад 9

Експерименти по конкурентому зв'язуванню білків, що містять корові токсини СтгуїРа і

СтуїСа, з виділеними мембранними везикулами щіткової облямівки Зродорієга пидірегда

У нижченаведених прикладах описана оцінка конкурентного зв'язування білків, що містять коровий токсин Стгу!, з передбачуваними рецепторами в тканині кишечнику комахи. Було показано, що 12»І-мічений білок, який містить коровий токсин Стуї!Са, зв'язується з високої афінністю з мембранними везикулами щіткової облямівки (ВВММ), отриманими від 5родоріега їгтидірегда (совки трав'яної), і що білок, який містить коровий токсин Сту!Ра, не конкурує за зв'язування з цими везикулами.

Очищення білків Сту. Ген, що кодує химерний білок, який містить коровий токсин СгуїСа і протоксин СтуТтАб, експресували в експресійному штамі Рзхенидотопах Ппогезсеп5 як описано в прикладі 2. Аналогічним чином, ген, що кодує химерний білок, який містить коровий токсин

СтуїРа (603 амінокислоти) і протоксин СтутАБ (545 амінокислот), експресували в системі Рі.

Білки очищали методами, описаними в прикладі 2, і здійснювали гідроліз трипсином з отриманням активованих корових токсинів з повнорозмірних білків, а потім ці продукти очищали методами, описаними в прикладі 2. Препарати оброблених трипсином білків (що містять активований коровий токсин) мали чистоту 295 95, а їх молекулярна маса становила приблизно 65 кДа як було експериментально визначено за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ.

Стандартні методи кількісної оцінки білка і електрофорезу в поліакриламідному гелі з ДСН проводили як описано, наприклад, в посібнику Затрьгоок еї аї. (1989) і А!Мзибеї еї аї. (1995), їі в більш пізніх виданнях.

Отримання і фракціонування солюбілізованих ВВМУ. Личинки бродорієга їПидірегаа в останній віковій стадії витримували в умовах голодування протягом ночі, а потім, після охолоджування на льоду протягом 15 хвилин, розкривали. Тканину середньої частини кишечнику видаляли з порожнини тіла, а задню частину кишечнику залишали приєднаною до покривного шару. Середню частину кишечнику вміщували в 9 х об'єм охолодженого льодом гомогенізуючого буфера (300 мМ маніт, 5 мМ ЕСТА, 17 мМ основи тріс, рН 7,5), в який була додана суміш інгібіторів протеази (бЗідта-Аїагіспй Р-2714), розведена відповідно до рекомендації постачальників. Тканину гомогенізували 15-а імпульсами, що подаються скляним гомогенізатором тканини. ВВММ отримували методом МосСіг преципітації, описаним

УМоїгГегрегдег (1993). Коротко, однаковий об'єм 24 мМ розчину МоСі» в 300 мМ маніту змішували з гомогенатом, виділеним з середньої частини кишки, перемішували протягом 5 хвилин і залишали на льоду на 15 хвилин. Розчин центрифугували при 2500 х д протягом 15 хвилин при 40С. Супернатант зберігали, і осад суспендували у вихідному об'ємі 0,5 х розведеного гомогенізуючого буфера, а потім знову центрифугували. Два супернатанти об'єднували і центрифугували при 27000 х д протягом 30 хвилин при 4 "С з отриманням фракції ВВММУ. Осад суспендували в буфері для зберігання ВВММ (10 мМ НЕРЕЗ5, 130 мМ КСІ, 10 95 гліцерин, рН 7,4) до отримання концентрації білка приблизно З мг/мл. Концентрацію білка визначали з використанням альбуміну бичачої сироватки (В5БА) як стандарт. Визначення рівня лужної фосфатази (ферменту-маркера для фракції ВВММ) проводили до заморожування зразків з використанням набору для аналізу лужної фосфатази ОцапіСпгот"мМм рАЇГР-250 (Сепіеаицйг

Моїесшіаг Ргодисі5, Катреппоці, ВЕ) відповідно до інструкцій виробників. Питома активність цього ферменту звичайно зростала в 7 разів в порівнянні з активністю, що виявляється у вихідній фракції гомогенату середньої частини кишки. ВВММ розділяли на зразки-аліквоти по 250 мкл, швидко заморожували в рідкому азоті і зберігали при -80 "С.

Електрофорез. Аналіз білків за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ проводили у відновних умовах (тобто, в 5 95 Д-меркаптоетанолі, ВМЕ) і в денатуруючих умовах (тобто, при нагріванні протягом 5 хвилин, при 90 "С в присутності 2 95 ДСН). Білки завантажували на ямку з 4-20 95 тріс-гліциновим поліакриламідним гелем (ВіоКаєй; Негсшез, СА) і розділяли під напругою 200 вольт протягом 60 хвилин. Смуги білка детектували шляхом фарбування кумасі діамантовим блакитним К-250 (ВіоКкад) протягом однієї години, і знебарвлювали розчином 5 95 метанолу в 7 95 оцтовій кислоті. Гелі візуалізували і аналізували на візуалізаторі Віокай РіІйго-5

Мийні Ітадег"м, Відносну молекулярну масу смуг білка визначала шляхом порівняння з рухливістю білків з відомою молекулярною масою, що спостерігаються в зразку ледера білка

ВепспМагк "м (І Те Тесппоїодіє5х, КосКміПе, МО), завантаженого на одну ямку гелю.

Йодування білка, що містить коровий токсин СгуїСа. Очищений білок, що містить коровий токсин СтуїСа, піддавали реакції йодування з використанням йодуючих сфер Ріегсе Іодіпайоп

Веаа5 (Тпепто Рі5пег Зсіепійіс, Косктога, І). Коротко, дві йодуючі сфери два рази промивали 500 мкл РВ5 (20 мМ фосфат натрію, 0,15 М Масі, рнН7,5), і вміщували в центрифугальну 1,5 мл- пробірку, що містить 100 мкл РВ5. Потім додавали 0,5 мкКі 725І-міченого йодиду натрію, після чого компоненти залишали для реакції на 5 хвилин при кімнатній температурі, а потім до розчину додавали 1 мкг білки, що містить коровий токсин СтгуїСа, і суміш залишали для реакції ще на 3-5 хвилин. Реакцію завершували шляхом піпетування розчину з йодуючих сфер і наносили на центрифугальну колонку 2еба "м (Іпмігодеп), урівноважену в 50 мМ САРБ, рН 10,0, 1 мМ ОТ (дитіотреїтол), 1 мМ ЕОТА і 5 95 гліцерині. Йодуючі сфери два рази промивали 10 мкл

РВЗ ї промивальний розчин також наносили на знесолюючу колонку 2ера"м. Радіоактивний розчин елюювали з центрифугальної колонки шляхом центрифугування при 1000 х д протягом 2 хвилин. Потім, білок, що містить коровий токсин СгуїСа і мічену радіоактивну "І, діалізували проти 50 мМ САРБ, рН 10,0,1 ммоОТТтТ, 1 мм ЕОТА і 5 95 гліцерину.

Візуалізація. Нерадіоактивний йодований білок, що містить коровий токсин СгуїСа, визначали за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ |і візуалізації рлуоресцентним методом.

Коротко, ДСН-ПААГ-гелі сушили з використанням апарату для сушіння гелю ВіоКаа відповідно до інструкцій виробників. Осушені гелі візуалізували шляхом їх загортання в плівку Муїаг (товщиною в 12 мкм) і експонування під флуоресцуючим екраном з накопиченням МоїІесшаг

Оупатіс5 (35 см хх 43 см) протягом 1 години. Планшети виявляли за допомогою флуоресцентного візуалізатора МоІесшаг ЮБупатіся 5іогпт 820, і зображення аналізували за допомогою комп'ютерної програми ІтадеОцапі м,

Приклад 10

Зв'язування /"22І-міченого білка, що містить коровий токсин Сту!ї, з ВВММ від бродорієга

Тгидірегда

З метою визначення оптимальної кількості білка ВВММ для його використання в аналізах на зв'язування з білками, що містять корові токсини СгуїСа і Сгу1!Ра, будували криву насичення з використанням 725І-міченого білка, що містить коровий токсин Стгу1Ас. 0,5 нМ 725І-міченого білка, що містить коровий токсин СтуТАс, інкубували протягом 1 години при 28 "С в буфері для зв'язування (8 мМ МаНРоОх», 2 мМ КНеРО», 150 мМ Масі, 0,1 95 В5А, рн7,4) з білюм ВВММ в 60 кількості, що складає від 0 мкг/мл до 500 мкг/мл (загальний об'єм 0,5 мл). 125І- мічений білок, що містить коровий токсин СтуїАс і зв'язаний з білеами ВВМУ, відділяли від незв'язаної фракції шляхом взяття зразків 150 мкл реакційної суміші з трьома повторностями, які вміщували в окремі центрифугальні 1,5 мл-пробірки і центрифугували при 14000 х д протягом 8 хвилин при кімнатній температурі. Супернатант обережно видаляли, і осад три рази промивали охолодженим льодом буфером для зв'язування. Дно центрифугальної пробірки, що містить осад, відрізали, вміщували в скляну пробірку для культивування розміром 13 х 75 мм, і кожний зразок підраховували протягом 5 хвилин в гамма-лічильнику. Потім будували графік залежності

СРМ (число імпульсів в хвилину) мінус фоновий СРМ (за відсутності реакції з білюоом ВВММУ) від концентрації білела ВВММ. Крім того, відповідно до результатів, отриманих в іншому аналізі, оптимальна концентрація білка ВВМУ, що використовується в аналізах на зв'язування, становила 150 мкг/мл.

Приклад 11

Аналізи на конкурентне зв'язування ВВММ від 5. їгидірегда з білками, що містять корові токсини СтуїСа і Сту1гРа

Аналізи на гомологічне і гетерологічне конкурентне зв'язування проводили з використанням 150 мкг/мл білка ВВММ і 0,5 нм !722чІ-мічені білки, що містить коровий токсин СтуїСа. До реакційної суміші додавали конкурентний нерадіоактивний білок, що містить коровий токсин

СтгуїРа в концентраціях від 0,045 нМ до 1000 нМ і одночасно додавали радіоактивний білок, що містить коровий токсин СтгуїСа, для гарантії істинного конкурентного зв'язування. Інкубування проводили протягом 1 години при 28 "С і вимірювали кількість 722І-міченого білка, що містить коровий токсин СтуїСа і зв'язаного з ВВММ (специфічно зв'язаного) як описано вище.

Неспецифічне зв'язування виражали як величину, отриману в присутності 1000 нм нерадіоактивного білка, що містить коровий токсин СтгуїСа. 100 95-е загальне зв'язування розглядається як кількість зв'язування за відсутності якого-небудь конкурентно зв'язаного білка, що містить коровий токсин СтгуїГа.

У аналізах на зв'язування з рецептором, що проводяться з використанням 7"22І-міченого білка, що містить коровий токсин Сгу1Са, визначали здатність білка, що містить коровий токсин

СтгуїРа, витісняти цей радіоактивно мічений ліганд з його сайту зв'язування з ВВММ від 5. їгидірегда. Результати (фігура 2) показали, що білок, який містить коровий токсин Стгуї1Ра, не витісняв зв'язаний 725І-мічений білок, що містить коровий токсин СтуїСа, з його рецепторного(их) білка(ів) при концентраціях до 300 нМ (при концентрації, яка в 600 разів перевищувала концентрацію радіоактивного зв'язувального ліганду). Як і передбачалося, немічений білок, що містить коровий токсин СтгуїСа, мав здатність витісняти радіоактивно мічений білок, що містить коровий токсин Сгу! Са, з його білка(ів), що зв'язується(ються), на що вказувала сигмоїдальна крива доза-відповідь, де 50 95-е витіснення відбувалося при 5 НМ.

Таким чином, було показано, що білок, який містить коровий токсин СтуїСа взаємодіє з сайтом зв'язування ВВММУ 5. їидірегаа, який не зв'язується з білком, що містить коровий токсин

Стутга.

Див. фігуру 2: Конкуренція корового токсину Сгуї!Ра, корового токсину СтуїСа і 725|І-міченого корового токсину СтуїСа за зв'язування з ВВММ 5роаоргіега Ігидірегаа.

Приклад 12

Конкурентне зв'язування білка, що містить коровий токсин Сгуї1 Са, і міченого біотином білка, що містить коровий токсин Стуї1Ра, з ВВММ Оіагаєа засспагаїїб

У нижченаведених прикладах описана оцінка конкурентного зв'язування білків, що містять коровий токсин Сту!ї, з передбачуваними рецепторами в тканині кишечнику комахи. Було показано, що мічений біотином білок, який містить коровий токсин Сгуї1Ра зв'язується з високою афінністю з мембранними везикулами щіткової облямівки (ВВММ), отриманими від Оіаїгаєа засепагаїї5 (бурякового трача), і що білок, який містить коровий токсин СтуїСа, не конкурує за зв'язування з цими везикулами.

Отримання і фракціонування солюбілізованих ВВМУ. Личинки О. засспагаїї5 в останній віковій стадії витримували в умовах голодування протягом ночі, а потім, після охолоджування на льоду протягом 15 хвилин, розкривали. Препарати ВВММ отримували методами, описаними в прикладі 10.

Результати, отримані в аналізі на конкурентне зв'язування, що проводиться з використанням 125|-міченого білка, що містить коровий токсин Сту!їРа, можуть мати обмежену біологічну значущість, оскільки йодування білка Стгу!Ба робить цей білок неактивним в біологічних аналізах на поїдання такого білка комахами. У протилежність цьому, було виявлено, що біотинільований білок, який містить коровий токсин Сгуї1Ра, зберігав свою токсичність відносно комах. Крім того, можна виміряти рівень взаємодії цього (біотинільованого) білка з рецепторами 60 в присутності не-біотинільованих (конкуруючих) білків, що містять коровий токсин Сту. Такий експеримент по конкурентному зв'язуванню дозволяє детектувати зв'язування міченого біотином білка, що містить коровий токсин Сгу!Ра з рецепторами в ВВММ 0. зассопагаїї5 після електрофорезу білків ВВММУ і перенесення всього зразка в ПВДФ-мембрану (полівініліденфторидну мембрану). Авідин, кон'юЮгований з пероксидазою хріну, в комбінації з реагентом, що посилює хімічну люмінесценцію, використали для візуалізації міченого біотином білка, що містить коровий токсин СтгуїГа.

Білок, що містить коровий токсин Стгу!Ра мітили біотином з використанням набору для біотинілування сульфо-МНО-ЇС Рієгсе Е2-Кіпко (Тпепто Різпег Зсіепійіс). Коротко, 40 мкл сульфо-МН5О-І С-біотину (10 мг/мл в диметилсульфоксиді) додавали до 500 мкл білки, що містить коровий токсин СтуїРа (2,0 мг/мл), в 0,1 М натрійфосфатного буфера, рН7,2. Реакційну суміш інкубували при 4 "С протягом ночі, а потім сульфо-МН5Б-І С-біотин, що не прореагував, видаляли на знесолювальній колонці 2ерат"м, Рівень включення біотину в білок, що містить коровий токсин Сту1!Ра, вимірювали за допомогою аналізу на витіснення НАВА-авідину Ріегсе (Тпегто Різпег Зсіепійіс) як описано виробником.

Мічений біотином білок, що містить коровий токсин СтуїРа (2,5 нМ), інкубували протягом 1 години при 28 "С з 0,2 мг ВВМУ, отриманого від 0. засспагаїї5 (в загальному об'ємі 1,0 млі в присутності або за відсутності 500-кратного надлишку неміченого білка, що містить коровий токсин Сту!Ра або СтгуїСа. Незв'язаний мічений біотином білок, що містить коровий токсин

СтуїРа видаляли шляхом центрифугування при 16000 х д протягом 10 хвилин, і отриманий осад

З рази промивали охолодженим льодом зв'язувальним буфером. Осад суспендували в 15 мкл 4 х буфера для зразків Лемлі, струшували і обробляли ультразвуком для гарантії повної солюбілізації, а потім нагрівали до 90 "С протягом З хвилин. Весь зразок завантажували на 4 95- 20 95 тріс-гліциновий гель, розділяли за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ, і піддавали електроперенесенню на ПВДФ-мембрану відповідно до інструкцій постачальників (ВіоКад). 1000 нг білка, що містить коровий токсин СтгуїРа і коровий токсин СтуїСа, також піддавали електрофорезу на гелі і використали як негативний контроль. Мічений біотином білок, що містить коровий токсин Стгу1!Ра, візуалізували з використанням кон'югованої з авідином пероксидази хріну при розведенні 1:15000 з активацією хемілюмінесценції з використанням 1:1- суміші пероксидного розчину Зирегзідпакюш Умеві Рісо з люмінальним розчином-підсилювачем (Тниепто Рівзйег Зсієпійіс, номери по каталогу 1859674 і 1859675). Смуги реєстрували на мультивізуалізаторі Віогай Рійог-5 за допомогою комп'ютерної програми Оцапійу Опе м.4.5.2.

Результати вказували на детектування міченого біотином білка, що містить коровий токсин

СтуїБа і зв'язаного з рецепторами в ВВММ 0. бзасспагайбх, а також показали, що небіотинільований білок, що містить коровий токсин СгуїРа, при 500-кратній надмірній концентрації повністю витісняв зв'язаний біотинільований білок, що містить коровий токсин

Стгуї1Ра, з його рецепторай(ів). На противагу цьому, білок, що містить коровий токсин Сту1Са при 500-кратній надмірній концентрації не мав здатності витісняти зв'язаний біотинільований білок, що містить коровий токсин СтгуїБа, що вказує на те, що білок, який містить коровий токсин

Сгтуї1Са, не конкурує за сайт(и) зв'язування білка, що містить коровий токсин Сту1!Ра, в ВВММ 0. засспагаій5. Також було показано, що відповідно до результатів, отриманих для ВВММ 5. їгидірегаа, білок, що містить коровий токсин Сгу! а, і білок, що містить коровий токсин СгуїСа, зв'язувався з окремими сайтами зв'язування ВВММ 0. засспагаїїв5.

Бібліографія

Еіппеу, 0.9. 1971. Ргорії апаїузів. Сатргіддає Опімегейу Ргевз5, Епаїапа.

Ниа, п., Ї. Мавзоп, у). Ї. Чигаї-Риепієв, С. Зспмар, апа М. у. Адапо. Віпаіїпуд апаїузев ої

Васійи5 Іпигіпдієпвів Сту д-епдоїохіп5 ивзіпуд бги5п рогдег тетьгапе мевісіе5 ої Овігіпіа пибіїаїїв.

Арріїєа апа Епмігоптепіа! Місгтобіоіоду 67121, 872-879. 2001.

ГеОга Зоїмаге. 1987. РОГ О-РО. А изегз диїде о ргобії апа події апа|узів. Ве Кеїєу, СА.

МесСацоанеу, МУ. Н., Б. Сбюоцій, апа МУ. Стів. Ві гезібїапсе тападетепі. Майшге

Віотесппо!оду 16121, 144-146. 1998

Магсоп, Р.А.С.О., Ї.9У. Моипд, К. стейеу, апа В.О. 5ієдттієд. 1999. Вазеїїпе зизсеріїрійу ої Те

Егтореап сот бБогег, О5ігіпіа пибіїіаії5 (Нирпег) (І ерідорієга: Ругаїїдає) тю Васійив5 Шитгіпдієпвів їохіп5. У. Есоп. Епіотої. 92 (2): 280-285.

Вобрегізоп, І..). апа Н.К. Ргєїзівсг. 1992. Резіїсіде Біоаззау5 мййп аппгородез. САС Ргезз, Воса

Вапоюп, РІ.

ЗА5Б Іпзійше Іпс. 1988. 5А5 ргоседигез дціде, НеїІєазе 6.03 еайіоп. АБ Іпвійшіе Іпс, Сагу, МО. зЗіопе, В.Р. 1968. А їогтшціа тюг аеїептіпіпд дедгее ої дотіпапсе іп сазе5 ої топоїасіогіа! іпнепапсе ої гезізіапсе о спетісаї!в5. Виїї. М/НО 38:325-329.

Мап Меїаєті, Н., 9. Войегтанп, у. Мап Віє, апа Н. доов5. Тгтапздепіс ріапів Тог Ше ргемепійп ої демеіортепі ої іпзесів гевівїапі то Васіїи5 игіпдієпвів їохіп5. (Ріапі Сепеїїс Зузієтв М.М., Вед. 89-401499|400246), 57-19901205. ЕР. 5-31-1989.

Додаток А

Список дельта-ендотоксинів СтісКктоге еї а!. мер-сайт (вказаний в заявці)

Реєстраційний номер для доступу в МОВІ

Назва Реєстр. Мо Автори Рік Штам-джерело Коментарі

СтуїАаї АдДА2г2353 ЗеНпері еїаї 1985 ВІ Китетакі НОТ

СтуїАа2 ААдАг2552 зЗпібапо еї аї 1985 ВІ зопо

СтуїАаЗз ВААОО257 ЗПпіті?и єї аї 1988 ВІ аігамаї ІРІ 7

Сту!Аа4 СААЗІ1886 Маззоп вї аї 1989 Ві епютосідив

Стуїда5 ВААО4468 п ауавипуви 649940 ВівШ2-7

СтуїАаб АдДАВ8Вб265 Маззоп евї аї 1994 ВІ Китетакі МАЮ-12

СтуїАа7 АА4б6139 Озтагп с! аї 1999 ВІС12

Стутдав 1126149 Пи 1996 нки послІДОВНІСТЬ

СтутАа9 ВАА77213 Мадатаїгви еї аї 1999 Ві депагоїїтив5 Т84А1

СтуїАа10 ААО55382 Нои апа Снеп 1999 ВІ Китеїакі НО-1-02

СтутАа11 САдД70856 Тоицпзі еї а! 1999 ВІ Кигеїакі

СтуїАа12 ААРВ8ВО146 Уао еї аї 2001 ВІ Гузо

СтутАа1!3 ААМ44305 «попа еї аї 2002 ВІ зойцо

СтутАа14 ААР40О639 Веп ег а! 2002 неопублікований

СтутАа15 ААУбб993 зЗаишйка вї а! 2005 ВИМТА Мо!-12

СтутАБІ АдА2г2330 маріко є! аї 1986 ВІ бепіпег 1715

СгтутАр2 АдДА22613 Тногпе еї а! 1986 ВІ Китеїакі

СтутАЬЗ АдА2г2561 Сеівег єї аї 1986 ВІ Китеїакі НОЇ

СтутАбБ4 ВАдО0О1 Копабо ес! аї 1987 ВІ Китеїакі НОЇ

СтутАБ5 САдД2г8405 Нопе ев! аї 1986 ВІ бепіпег 1715

СтутАЬб АдА22420 Непйога евї а! 1987 ВЕ Китеїакі МАО-12

СгтутАр7 СААЗІ1620 Наїдег 8. ЕІПаг 1988 Ві аігамаї ІСІ

СтутАБВ ААА22551 Оеєаа єї аї 1987 Ві аігамаї ІРІ 7

СгтулАро СААЗ8701 Снак 8 деп 1993 Ві аігамаі НО1ТЗЗ

СтулАр10 А29125 Еївснпної є! аї 1987 ВІ Китеїакі НОЇ

СТуТАрІ1 112419 Еуу 8 Тіррей 1995... ВгА2гО ДНК. посліДОВНІСТЬ

СттАрІ2 ААСелООЗ ЗМалуетескої 1998 Вікшвіакі 593

СтулАр13 ААМ76494 Тап ег а! 2002 Віс 005

Мега-Вав5хо 5 . !

СтутАБ14 дДАСІ16877 Тнеодцог 2000 Маїїме Сніїєап ВІ

СтулАр15 ААДО13302 Шегаї 2001 ВІ В-Нт-16

СтулАр16 ААК55546 У егаї 2002 ВІ АС-11

СтулАбБ17 ААТ4і6415 Ниапа 6вї аї 2004 в/в

СтутАЬ18 ААО88259 «еораап с! аї 2004 ВІ

СтулАр19 АдМУЗ1761 7попа с! аї 2005 віх-2

СтулАр20 АВВ72460 Пи еї а! 2006 вісоов

СтутАЬ21 АВ518384 зЗм/есіскКа еї аї 2007 ВИ55О56

СтутАЬ22 АВМ/87320 Ми апа Репа 2008 ВІЗ2491Ар

СтутАБ- Мадагаштіпат єї невизначена їке ААК14336 а! 2001 Ві Кипінаіа НХ24 послідовність

СТУТАВ- оддкі4337 Мабагашіпатеї 02004 Вікупінаіавхов невизначена їКе а! послідовність

СтутАБ- МадагаШіпат єї невизначена їке ААК14338 а! 2001 ВЕ Кипінаіа ВХ27 послідовність

СтутАБ- АВОав88858 Ппеїаї 2006 ВИудаз недостатня

Додаток А

Список дельта-ендотоксинів СтісКктоге еї а!. мер-сайт (вказаний в заявці)

Реєстраційний номер для доступу в МОВІ

Назва Реєстр. Мо Автори Рік Штам-джерело Коментарі їКе послідовність

Стут1Ас1 АдДА22331 Адапа єї аї 1985 Ві Китетакі НО7З

СтулАСс2 ААдА2г2338 Моп Теїзсп еї аї 1991 ВІ Кепуає

СтулАсЗ3 СААЗ8ВО0О98 Рагаеппе еї а! 1990 ВІ ВТ589А

СтутАсі4 АдДА7З077 Еейе!І5оп 1991 ВІ Китеїакі РБ85А1

СтутАс5 АдДА22339 Евіїві5оп 1992 Ві Китгеїакі РВТСС

СтулАсб АААВ8б266 Мав 5о0п еї аї 1994 ВІ Китетакі МАЮ-12

СтутАс7 ААВ46989 Не!їтега єї аї 1994 Ві Китетакі НО7З

СгтутАс8 ААСА4841 Отоїйо єї аї 1997 Ві Китетакі НО7З

СтутАс9 ААВ49768 Сієаме еї а! 1992 ВІЮ5ІН7З2

СтулАс10 САДОБ505 МИп 1997 ВІ Китеїакі УВТ-1520

Макнаоот 4 тільки послідовність

СтулАс11 СААДА10270 Віагиддіп 1998 днк

СтгутАс12 112418 Еу « Тіррей 1995 ВІА2О

СтулАс13 ААОЗ8701 Оіао єї аї 1999 ВІ Китеїакі НОЇ

СтутАс14 ААООб6б6О7 Уао еї а! 2002 ВиГузо

СтулАс15 ААМО7788 Т2епад еї аї 2001 ВИ тот Таїмжмап

СтулАс16 ААИВ7037 2пао сеї аї 2005 ВІ НЗ

СтутАс17 ААХ18704 Ніге вгаї 2005 ВІ Кепуає НОБб49

СтулАс18 ААУ88347 Кашцг с АМПат 2005 ві ЗК-729

СтутАс19 АВОЗ37053 Сао еї а! 2005 ВІ О-33

СтулАс20 АВВ89046 Тап еега! 2005

СтутАс21 АдУбб992 зашка єї аї 2005 ІМТАМО1!-12

Стут1Ас22 АВ7201836 7папад 4 Рапа 2008 ВІ УМ/015-1

СтутАс23 САОЗО0431 Казнуар с! аї 2008 ВІ

СтулАс24 АВІ 01535 Агаподо евї аї 2008 ВІ 146-158-01

СгутАс25 РОБ13324 СуапРепдейа! 2008 Ві Тт37-6 дискові, зареєстр. 09

Стутас2в ЕОб617446 СбиапРепдейа! 02009. ВІ Тт41-4 ливі, зареєстр. 09

СтутАдс27 Е)б17447 СцапРепдейа! 2009 ВІ Тт44-18 пипОВІ. зареєстр. 09

СтутлАс28 АСМ90319 Шеїаї 2009 ВвЮ-12

СтутАаї АдДА22340 Еейе!І5оп 1993 Ві аіїгамжаї РБ81І

Стутда2 СААДО1Т880 Апопутоив5 1995 ВЕ РБЗ8ВІВНА1

СтутАеї АддА22410 Ї еє б. Агопбзоп 1991 ВІ аїезвії

СгтулАйП /ААВ82749 Кап евї а! 1997 Ві МТОо423

СтулАді ААр4і6137 Мивіага 1999

СтутАпї ААОТ4326 Тап еега! 2000

СтутАп2 АВВ7б6664 ОЇ єї аї 2005 Ві аїезії

СтутАйїї | ААОЗО719 Мапа сеї аї 2002 ! Мадагаштіпат єї невизначена

СтутА-їКе ААК1Т4339 а! 9 2001 ВІ Кипіпава падзз3 послідовність

СтуїВаї САдАгоВ898 Му. 1988 ВИйиппдієпвіз НО?

Стуї!Ваг2 СААбБ5ООЗ зоєїаєїї 1996 Ві епіотосіди5 НО110

СтуїВаЗз ААКбЗ251 7 папа єї а! 2001

Сту!Ва4 ААК51084 Маїап еї а! 2001 ВГ епютосіди5 НОЗ

СтуїВа5 АВОгО894 зЗопао 6вї а! 2007 Вівйм-12

Стуї!Ваб АВІ 60921 Мапінз еї аї 2006 ВІ 5бО1

Сту!Ввр1 АдДА22344 ропомап еї аї 1994 ВІЄС5847

Сту!Всі СААВб5бВ Візпор вї аї 1994 ВІ тоїттізопі

Стутваї ААОТО292 Кио єї а! 2000 Ві жипапепвзіз НОБ25

Додаток А

Список дельта-ендотоксинів СтісКктоге еї а!. мер-сайт (вказаний в заявці)

Реєстраційний номер для доступу в МОВІ

Назва Реєстр. Мо Автори Рік Штам-джерело Коментарі

Стуїва?2 ААМО93496 ІваКома вї аї 2002 ВІВЗ34

Сту!Веї ААСЗ2850 Раупе ев! а! 1998 ВІРб5158С2

Сту!Ве2 ААОБб2387 Вайт еї аї 2003

Стуївез 716102 діаосопо Зип 6ї 2009 ві ливі, зареєстр. 09

Суїви САС5О778 Аташці еї а! 2001

Сту!Ві2 ААОБб2З380 Вайт еї аї 2003

Сту!Вдії ААОЗО720 Мапа сеї аї 2002

СтутСа! СААЗОЗ396 Нопеє еї аї 1988 Ві епіотосідив 60.5

СтуїСа?2 СААЗІ1951 запенпів еї аї 1989 Ві аіїгамаї 7.29

СтгуїСаЗз ААА2г2343 Ееїйвівоп 1993 Ві аігажаіР 5811

Сту!Са4 САДО1886 Мап Меїаєг! еї аї 1990 Ві епіотосіди5 НО110

СтуїСаб5 САДб5457 Зігігпом 1996 ВІ аігамаї 7.29

Стуї!Саб ААРЕЗ37224 Уи еї а! 2000 ВІ АБ-2

СтуїСа7 ААС5ОгЗ38 Аїхіпо еї аї 2000 вВгОв

СтутїСав ААМО0264 Спеп еї аї 2001 Ві соб2

СтуїСа9У ААЇї 79362 Као єї а! 2003 ВІ а10-О1А

СтуїСа10 ААМ16462 Ци ега! 2003 ВІ Е05-2ба

СтуїСа1!1 дАХ5ЗО94 Саї еї аї 2005 ВІ 0-33 ! НОгтільки

Сту!Ср1і1 ме97880 Каїтанп єї аї 1993 ВІ даІетіає послідовність ДНК

Сту!Сб52 ААДОИЗ5409 зЗопао 6вї а! 2000 ВІ со01

Сту1бСь3з АСОБО894 Ниапо еї аї 2008 ВІ 087

Сту1ср- Тнаттавійцітпад Й недостатня ке ААХб3901 ега! 2005 ВІТА476-1 послідовність

Стутра! СААЗ8099 Ногпе сеї аї 1990 Ві аїгажмаі НОбЄВ

Стуїра? 176415 Раупе 8 Віск 1997 ДНК. послідовнІСТЬ

Сту1О0р1 СААВОгЗ34 І атреп 1993 ВІ ВТ500349А

Сту10р2 ААКА48937 Пеаї 2001 ВІ В-Рі-88

Стутосі АВКЗБО7А Сетмпуаноло є! 2006 ВУСІ

СтуїЕаї СААЗ7933 Міззег єї аї 1990 ВІіКепуає АЕ1

СтуїЕа2 СААДЗО609 Во556 вї аї 1990 ВІ Кепуає

СтуїЕаЗ АААг2345 Ееїйвівоп 1991 Ві Кепуає РБ8ЯТЕ

СтутБаї дАРОгТЗ2 Бафюогасогюпа 1998 ВіКепуае ІВІТ-147

СтуїЕБаб5 А15535 Воцегттанп єї аї 1994 пи послІДОВНІСТЬ

СтуїЕаб ААЇї 50330 зЗип еї аї 1999 ві Увт-032

СтуЕа7 ААМ/72936 Ниенпе еї аї 2005 Вг9УС190

СтуїЕав АВХ11258 Ниапа 6вї аї 2007 ВІ НАМ2

СтуТЕВІ АдАг2346 Евіїві5оп 1993 Ві аігамжаі РБВТА2

СтуїБаї АдА2г2348 Спатрбрегз еї аї 1991 Ві аігажмаі ЕСсб346

СтуїБа2 АдАг2г2347 Евіїві5оп 1993 Ві аіїгамжаї РБ81І

СтуїгрБ1 СААВОгЗ35 Іатбеп 1993 ВІ ВТ500349А

Сту1гр2 ВААД2г5298 Мазиада є Азапо 1998 ВІ тоїтізопі ІМАб7

СтуїгбБЗ ААДЕ21767 зЗопао 6вї а! 1998 ВІ тоттізопі

Сту1грі4 ААС1ІТОбА1 Раупе еї аї 1997

СтуТРр5 ААО13295 Пеаї 2001 ВІ В-Рі-88

Стутгьб АСОБОВ892 Ниапо еї аї 2008 вюот2

Стутгр7 АСОБО893 Ниапо еї аї 2008 ВвЮ87

Стуї!сбСа! СААВО2г33 Іатбеп 1993 ВІ ВТ50349А

Додаток А

Список дельта-ендотоксинів СтісКктоге еї а!. мер-сайт (вказаний в заявці)

Реєстраційний номер для доступу в МОВІ

Назва Реєстр. Мо Автори Рік Штам-джерело Коментарі

Стуї!сбСа2 САА7ОБ5О06 Зпемвієм сеї аї 1997 Ві мипапепвів

Стутарі ААОТО291 Кио а Спак 1999 Ві мипапепвзіз НОбБ25

Стуїс2р2 ААО13756 Шеїаї 2000 ВІ В-Рі-88

Стутбс ААОБ2381 Вайт еї аї 2003

СтуїНа! СААВО236 Іатбеп 1993 ВІ ВТ502069АА

Стуї!НЬІ АдАА79694 Коо вї а! 1995 ВІ топізопі ВЕ190

Стутн- . недостатня їке ААРО1213 сан вї аї 1999 ВІ ОС291 послідовність

СтуїПа1ї! САА44633 Таїйог єї а! 1992 ВІ Кигеїакі

СтуПа2 о АдА2г2354 СіІеаме еї аї 1993 ВІ Кигеїакі

СтуПазЗз ААСЗб6999 Зпіп єї аї 1995 ВЕ Китгеїакі НОЇ

СтуїПаї4 ААВО0О958 Ковзііїснка еї аї 1996 ВІ АВ88

СтуПаб5 САА7О124 Земарапаїуап 1996 ВІ 61

СтуПаб ААС26910 «попа еї аї 1998 ВІ Китеїакі 5101

СтуПа7 ААМ7З3516 Рогсаг вї а! 2000 ВІ

СтуПав ААКбб742 зопа єї аї 2001

СтуПа9 ААОО8616 Хаос еїаї 2002 ВІ Гузо

СтуПато ААРВ8б782 Езріпаоіа єї а! 2003 ВиИиШПитгіпдієпвів

СтуПаї11! САС85964 Тошпзві еї аї 2003 Ві Китетакі ВМ5З

Ступат? дАУБ3ЗЯО СТОББІ0е Ба 005 ВІ

Сту"Паї!3з АВЕ83202 Мапінз еї аї 2006 ВІ

СтуПа14 АСОб3871 Ши б Со 2008 ви

Ступаї5 БОб17445 СцапРепдеа! 2009. ВІЕ-ІВ лопнові, зареєстр. 09

Ступаїб БОб17448 СцапРепдеа! 2009. ВІЕ-ЛА липові, зареєстр. 09

Стутрі /АдАВ2114 Зпіп еї аї 1995 ВГ епютосіди5 ВР465

Стуїтр2 АВМ/88019 Смцап єї аї 2007 ВІРРб!1

СтутЬьЗз АСО75515 Ши б Со 2008 вавзв

Стутісї ААСб2933 О5тап єї аї 1998 ВІС18

Стутіс2 /ААЕ71691 О5тап єї аї 2001

Стутпаї ААО4А4366 Сної 2000

СтуПеї АдОсі3526 зопа єї аї 2000 ВІ ВТСО007

Су ААОБбБ2гЗ82 Вайт еї аї 2003

Стуті-ЯКе ААСЗ1094 Раупе єї аї 1998 недостатня послідовність

Стуті-ЯКе АВИа88859 Мп 4 Рапд 2006 ВИудаз недостатня послідовність

Стуїуа!ї АдДА22341 ропомап 1994 ВІ Ес5847

Моп Теївсі 8

Стут1ур1 АдА9ВО59 Сопгаїє? 1994 Ві єаа5о92

Стуїусі ААСЗ1092 Раупе єї аї 1998

Стутус2 ААОБ2372 Вайт еї аї 2003

Стутуа!ї САС5О779 Атаці еї а! 2001 ВІ

СтуїКаї ААВОО0ОЗ376 Коо вї а! 1995 ВІ топізопі ВЕ190 ! недостатня

Стуїаї! АА5ББбО191 Уе егаї 2004 ВІ Кигеїакі КІ послідовність

Сту1-ІіКе ААСЗ1091 Раупе с! аї 1998

СтугАаї АдДА2г2335 ропомап евї аї 1989 ВІ Кигеїакі

Міапег є :

СтугАа2 АААВЗ3516 Мупйсіву 1989 ВЕ Китеїакі НОТ

Стугдаз 086064 Зазакі е! а! 1997 Ві 5ойо ДНК. посліДОВНІСТЬ

СтугАа4 ААСО4867 Мівга 6ї аї 1998 ВІіКепуає НОБб4А9

Додаток А

Список дельта-ендотоксинів СтісКктоге еї а!. мер-сайт (вказаний в заявці)

Реєстраційний номер для доступу в МОВІ

Назва Реєстр. Мо Автори Рік Штам-джерело Коментарі

СтугАаб5 САА1ТО671 хи в Рапд 1999 ВІ 5 39

СтугАаб САА1ТО0672 хи в Рапд 1999 ВІ М271

СтугАа7 САА1О0670 хи в Рапд 1999 ві СУ29

СтугАав ААО13734 Меї єї аї 2000 ВІ Оопобеї 66

СтугАа9 ААО13750 «Папа ес! аї 2000

СтугАа10 ААОО4263 Хаос еїаї 2001

СтугАа1!1 ААОБбБ2384 Вайт еї аї 2003

СтугАа12 АВІВ8ВЗ3671 Тап еега! 2006 ВІ Арр39

СтугАа13 АВІ 01536 Агапдо еї аї 2008 ВІ 146-158-01

СтугАа14 АСЕРО4939 Нігє єг а! 2008 ВІ НО-550

СТугАБІ /ААА2г2342 Миті 1989... Ві китеїакі НОЇ

СтугАр2 СААдЗО075 Бапкосзвік еї аї 1990 ВЕ Китгеїакі НОЇ

СтугАЬЗ дАсаЗб762 Спеп еї а! 1999 ві втооо2

СтугАр4 ААО13296 Пеаї 2001 ВІ В-Рі-88

СтугАр5 ААОО4609 Хаос еїаї 2001 ВИузо

СтугАрб ААРБ9457 Мапа еї аї 2003 ВІ М/2-7

СтугАб7 дА766347 п ауавипуви о 2005. Віа

СтугАр8 АВС95996 Ниапа 6вї аї 2006 вЕУув2

СтугАрО9 АВС74968 7папод еї аї 2005 ви ввб

СтугАВ10 ЕР157306 Ци ега! 2006 ві'сур

СтугАр11 САМ84575 Заіеєт еї аї 2007 ВІ СМВІ -ВТ1

СтугАр12 АВМ21764 Пп ега! 2007 ві'сур

Стугар13 АСа76120 7пиеєїаї 2008 ВІ ужмес5-4

СтугАр14 АСОа76121 7пиеєїаї 2008 ВІ Ві

СтугАсі САдД40536 Агопзоп 1991 ВІ 5зпапопаї 51

СтугАс2 Адазбь410 зопа єї аї 2000

Сту2Ас3 АдОБбБ2г385 Вайт еї аї 2003

СтугАсі4 АВС95997 Ниапо ев а! 2006 Ві во

Сту2Ас5 АВС74969 «Папа ес! аї 2005

Сту2Асб АВС74793 Хіа вї а! 2006 Ві мипапепвів

Сту2Ас7 СА 18690 Заіеєт еї аї 2008 ВІ 5В5ВТ-1

Стуг2Ас8 САМО9325 заІєєт еї аї 2007 ВІСМВІ -ВТ1

Сту2гАс9 САМО9326 заІєєт еї аї 2007 ві СМВІ-ВвТ2

Сту2Ас10 АВМ15104 Ваї єї а! 2007 ВГОСІ-1

Сту2Ас11 САМ83895 Заіеєт еї аї 2007 ВІЕНОгО

Сту2Ас12 САМ83896 заІєєт еї аї 2007 ві СМВІ-ВТЗ

СтугАді ААРОЗ9583 Сто еї а! 1999 ВІ ВАЗО

СтугАд2 АВС86927 Ниапо ев а! 2006 ві ув

СтугАаз САК2г9504 заІєєт еї аї 2006 Ві 5 2АСТ(1)

СтугАді САМЗ32331 Заіеєт еї аї 2007 ВІ СМВІ -ВТ2

Стугда5 САО78739 Заіеєт еї аї 2007 ВІЕНОгО

СтугАєї ААОБ2З362 Вайт еї аї 2003

СугАй АВОЗО519 Веага ес! а! 2007 ВІС81

СтугАд /АСНО1610 7пиеєїаї 2008 ВІ ОБг19-2

Стугай Це939453 7Ппапдеї а 2008. ВІ лопнові, зареєстр. 09

СтугАп2 АСІ 80665 «папа еї а! 2009 ВІ ВАС-20І З

Стуглі Е.788388 п ауавипуви еї 2009 ві ніна зареєстр. 09

СтузАаї ААА2г2336 Не!тазіаді еї а! 1987 ВІ зап дієдо

СтузАа2 ААА22541 зекаг єї аї 1987 Ви епебгіопіб

Додаток А

Список дельта-ендотоксинів СтісКктоге еї а!. мер-сайт (вказаний в заявці)

Реєстраційний номер для доступу в МОВІ

Назва Реєстр. Мо Автори Рік Штам-джерело Коментарі

СгузАаЗз САдбВ8482 Нопйе в! а! 1987

СтузАа4 АдДА225842 МеРпПегзоп еї аї 1988 Ви епебгіопіб

СтузАаб5 ААА5БО255 ропомап еї аї 1988 ВІ тоїтізопі ЕС2158

СтузАаб ААС43266 Адатз еї а! 1994 Виепебгіопів

СтуЗзАа7 САВА1411 «Папа ес! аї 1999 Віг2

СтузАав АА5б79487 Сабо апа Саї 2004 ВІ УМ-03

Вшийа апа

СтузАа9У ААМ/05659 Сапаав 2004 ві 0ТО-001

СтузАа10 АДИ2г9411 Спеп еї а! 2004 Ві 886

СтузАа11 ААМ/82872 Кин еї аї 2005 Виепебгіопіз Мт2

СтузАа12 АВУ49136 Зееп еї аї 2008 Ви епебгіопіб

СгтузВаї СААЗ4983 зіск еї аї 1990 Виюїмопні ЗЕ

СтуЗзВа?г2 СААООб45 Реїегоеєп ев! аї 1990 Ві РСОаБІ2ОВ

СтуЗзВЬ1 ААА2г2334 ропомап евї аї 1992 ВІ ЕС4961

СтуЗзВЬ2 ААА74198 ропомап евї аї 1995 ВЕ Ес5144

СтузВоЗ 115475 Реїеговп ві а! 1995 пи послідовнІСТЬ

СтузСаІ! САдД42469 І атрент еї аї 1992 ВІ Китетакі ВИТО9Р

СтудАа! САдАб8485 Мага 5 Еаг 1987 ВІ ізгавієпвів

Студ4Аа2 ВААОО179 Зеп еї аї 1988 ВІ ізтавієпзіз НОБ22

Студ4АаЗз САОЗО148 Ветту єї аї 2002 ВІ ізгавієпвів . МапНаїакепті єї недостатня

Стгуд4А-їКе ААУ96321 а! 2005 ВІ 00-9 послідовність

СтудБаї сСААЗОЗІ2 СПОПСІВІрОтТСМа 3988 ВІ івгавівпвів 402-72

СтудВа? СААЗОЇ14 ди оргаснрки! ої 1988 Віівгасіспвів

СтудВаз ААА2г2337 Уататоїй еї аї 1988 ВІ ізгавіепвів

СтудВа4 ВААОО178 зЗеп еї аї 1988 Ві ізгаєіїепвії НОБ22

Студ4Ва5 САОЗО095 Ветту єї аї 2002 ВІ ізгавієпвів

Стгу4Ва- Магаїакепті єї недостатня

Іке АВвВСА47686 а! 2005 ВІ 00-9 послідовність

Сгуєсаї ЕОбА6202 Зпцеа 2008 дискові, зареєстр. 09

Сстудсь! РО403208 дип 8 РигопО 2008 ВІНВІВ-1 логові, зареєстр. 09

Студсь? РОБУ7622 дип 8 РигопО 2008 ВІ Умс2-8 дискові, зареєстр. 09

Стуйссі БО403207. п в Єигопо 2008. ВІ МС28 дискові, зареєстр. 09

СтубБАа1ї АААб7б694 Магма еї аї 1994 ВІ даттвіадієпвіз РОТ17

СтубБАріІ АдАб7б693 Магуа є! аї 1991 ВІ дагтвіадівепвів РО17

СтувАсі ІЗ4543 Раупе сі а! 1997 ДНК. послідовнІСТЬ

СтубБдАаї АВОВ82087 Ї епапе єї аї 2007 ВІ 366

СтубВа! АААЄВБОВ 0 опоеаса 8 1997 ВЕРОВбОЗ

СтубВаг2 АВМУ/88932 Спо єї а! 2008 УВТ 1518

СтубАаї АдА2г2357 Мага еї а! 1993 ВІ РББ2А!

СтубАа?2 ААМ46849 Ваї єї а! 2001 УВТ 1518

Стгубааз АВНОЗЗ377 Ла єї аї 2006 вІ96418

СтубВа1ї! ААА2г2358 Магма еї аї 1991 ВІРБЗбООІ

Сту7/Ааї АдА2г2351 І атбег! еї аї 1992 ВІ даПетіає РаБІ245

Додаток А

Список дельта-ендотоксинів СтісКктоге еї а!. мер-сайт (вказаний в заявці)

Реєстраційний номер для доступу в МОВІ

Назва Реєстр. Мо Автори Рік Штам-джерело Коментарі

Сту7Арі1 АдДА21120 Магма б Би 1994 ВідакотанО5Б11

Сту7Ар2 АдА21121 Магма й Ри 1994 ВІ Китатоїоеєпвів 867

Сту7АрЗ АВХ24522 зопа еї аї 2008 ВІЕМ/2-9

Сту7АьА ЕОЗ80678 пи еї а! 2008. ВІ липові, зареєстр. 09

СтуТАББ5 АВХ79555 дочителггоїа ії 2008 Ві топіопеу СМ-ЗЗ

Сту7АЬб АСІ44005 Оепа єї а! 2008 ВІНО122

СтутАБ?7 ЕО940776 УМапо ега! Гепа 2009 Мо МСВІ. зареєстр. 09 па липня

СтутАЬВ 00145299 2009 липові, зареєстр. 09

Сту/Ва!ї АВВ70817 «папа еї а 2006 ВІ пиагпопдепвів

Сту7/Са! АВНб7863 Сао євгаї 2007 ВІВТН-1З

Сту7/Оа! АСО99547 Мі егаї 2009 ві н-2

СтувАаї АдА21117 Магма й Ри 1992 ВІ Китатоїоеєпвів

СтуВАБІ БШО44830 Спепдеї а 2007 ВіВХ 0 ле МОВІ, зареєстр. 09

СтувВа! АААг1118 Мага 4 Ги 1993 ВЕігКитатоюепвів

Стувврі САОБ57542 Арає еї аї 2002

Сту8вВсі САО57543 Араєд ев! аї 2002

СтувСаІ! АААг1119 за еї а). 1995 ВІ іаропепвів Виїриї

СтувСа?2 ААНЗОВ8783 зпи єї а! 2004 ВІ НВЕ-1

Стувсаз ЕОб25349... Оса 2008 ВіРТІ-23 0 МИМОВІ, зареєстр. 09

Стувра! ВАСО7226 Азапо 6вї аї 2002 ВІ даІПетіає

Стувраг вор133574 Азапо ві а! 2002 ВІ тільки послідовність ДНК

Стувраз вО133575 Азапо вї а! 2002 ВІ тільки послідовність ДНК

Сту8вОріІ ВАР9З3483 Уатадисні єї аї 2007 ВІ ВВТ2-5

Сту/8вЕаї ААО7З3470 Еоиріпа 6ї аї 2003 ВІ 185

СтувЕа? ЕПО47597. Пеїа 2007 вів 0 Ломов, зареєстр. 09

СтувРаї ААТ4і8690 зпи еї а! 2004 Ві 185 також ААМУ81032

СтувсСа! ААТ4А6073 зпи єї а! 2004 ВІ НВЕ-18

Стувса2 АВСА2043 Уап еї а! 2008 Ві 145

Стувсаз 0198072 Хіаодопо сеї а! 2008 Ві ЕСО114 ніна зареєстр. 09

Стувнаї ЕР465532 Буріпд вії а! 2006. ВІ185 липові, зареєстр. 09

Стувіа! ОЗ81044 Мапеїа 2008. Ві вий липові, зареєстр. 09

Стувуа!ї ЕОб25348 Оса 2008 ВІЕРТ-2 ніна зареєстр. 09

СтувКаї гоО422558 Огцегадо еї аї 2008 ніна зареєстр. 09

СтувКаг2 АСМ87262 Модиега «5 Ібата 2009 ВІіКепуає

Стув8-Ке Б.770571 Модиега є. Ібата 2009 ВІ сападепвів тільки послідовність ДНК

Стув-ІКе АВ55ЗООЗ Мапдепа 6! аї 2007 ві

СтуЗАаї СААД41122 зЗпемеїем еї аї 1991 ВІ даІПетіає

СтуЗзАа?2 САдД4А1425 Сівєаме с! аї 1992 ВЮ5БІВЬ17

Сгуєдаз 00249293... Бивіаї 2009 віБСБ(О2) 0 Ле МОВІ, зареєстр. 09

СтузАа4 спО249294 зиеєїаї 2009 ВІ ТОЗ3С001 Мо МСВІ, зареєстр. 09

Додаток А

Список дельта-ендотоксинів СтісКктоге еї а!. мер-сайт (вказаний в заявці)

Реєстраційний номер для доступу в МОВІ

Назва Реєстр. Мо Автори Рік Штам-джерело Коментарі липня ла: ААОБ2376 Вашт вї а! 2003 неповна послідовність

СтуЗ9Ваї СААБ5б2927 зЗпемеїем еї аї 1993 ВІ даІПетіає

СтуеВрІ ААМг8716 вімауетеск ї 2004 Ві аропепвів

СтуЗбСа! СААВ5764 І атьен 6вї аї 1996 Вино

СтуЗбСа2 ААОБб2375 Вайт ев аї 2003 неповна послідовність

Стузра! ВАА19948 Авапо 1997 ВІ іаропепвів М141

СтуЗзраг2 ААВО7923 М/азапо а Опба 1998 ВІ і(аропепвів

Стузраз 00249295. Зиеіаї 2009 Вітозвоої Ле МОВІ, зареєстр. 09

Стузрад 00249297. Зцеїаї 2009 ВітоЗВО0ї 0 Ме МОВІ, зареєстр. 09

СтуЗОБі ААХ7ВАЗ9 двлоавал 8 2005 Вікигвіакі ОР1019

СтуЗ9Еаї ВААЗ4А908 Мідойн 4 Оуата 1998 Ві аігажаії 55К-10

СтуЗзЕа?2 ААО1Т2908 Шеїаї 2001 Ві В-Нт-16

СтуЗзЕаз АВМ21765 Ци еїаї 2006 ВИУА

СтуЗзЕа4 АСЕ88267 пи егаї 2008 ВІ уме5-4

СтуЗзЕаб5 АСРЕО4743 пи егаї 2008 Вів

СтуЗзЕаб АСаб3872 Ци в Со 2008 ВІ 11

СтуеБа7 РО380927 Бипеїа 2008 липові, зареєстр. 09

СтузБав 00249292. 5йеїаї 2009 сО249292 Ле МОВІ, зареєстр. 09

СтуЗЕБІ САС5О780 Атацйі еї аї 2001

СтуЗЕБ2 00249298 5иеіаї 2009 Вітозвоої Ле МОВІ, зареєстр. 09

СтуЗЕС1Ї ААСб3366 М/азапо еї аї 2003 ВІ даПетіає

СтУЗЕЯ1 ААХ7ВАЛО двлоавал 8 2005 Вікигвіакі ОР1019

СтуеБЕєї 00249296 Бивіаї 2009 ВітозвОої 0 Ле МОВІ, зареєстр. 09

Сту9-іКе ААСб3366 М/азапо вії аї 1998 ВІ даІетіає

СтутбОАаї АдДА22614 ТНогпе еї аї 1986 ВІ ізгавієпвів

ВІ ізгавіепвів : . .

СтутоАа2 ЕО0614 Агап а Тоотавзи 1996 ОМВ-вОА тільки послідовність ДНК

СтутоАаз САЮЗО098 Ве!ту єї аї 2002 ВІ ізгавієпвів м ОА роївт57в мапааквити ої 2006 ви ос-9 неповна послідовність

Сту1т1Ааї АдДА2г2352 ропомап ес! аї 1988 ВІ ізгавієпвів

Сту1т1Аа2 АдА2г2611 Адатз еї а! 1989 ВІ ізгавієпвів

Сту11Ааз САОЗО081 Ве!ту єї аї 2002 ВІ ізгавієпвів

СтуттАа- р Мапнаїакепті єї . . ке 0166531 а! 2007 ві 0С-9 неповна послідовність

Стуї1Ваї СААбОБО4 Оеїесіизе еї аї 1995 ВІ (єдаштезап 367

Сту118р1 ААСУО7162 Огац? еї аї 1998 ВІ теаеїп

Стут2Ааї! АдДАг2г2355 Магма еї аї 1991 Ві РЗЗЗЕ2

СтуїЗзАаї АдДАг22356 Магма еї а! 1992 ВІ РОбЗВ

Стут4Ааї АдДА21516 Мага еї а! 1994 Вібвойо РБВОДОІ

Вгоул 4 :

Стуї5Аа! ААА22333 Мупіївіву 1992 ВиИпотрзопі

Зо

Додаток А

Список дельта-ендотоксинів СтісКктоге еї а!. мер-сайт (вказаний в заявці)

Реєстраційний номер для доступу в МОВІ

Назва Реєстр. Мо Автори Рік Штам-джерело Коментарі

Сту1бАа! СААбЗ860 Вапоу єї аї 1996 СЬ таїіаузіасН1і8

Сту17Аа! СААб7В841 Вапсу є! аї 1998 СЬ таІаузіасН1і8

Сту18Аа!ї СААб75Об «папа егаї 1997 Раепібасіїн5 роріПає

Сту18Ва! ААРГ89667 Раїе! єї а! 1999 Раепірбасійи5 роріїає

Сту1ї8в8Са! ААГ89668 Раїе! єї а! 1999 Раепірбасійи5 роріїає

Воз5о 8 !

Стут9Аа! СААб8875 Оеїесіиве 1996 ВІ едаштезап 367

Стут9Ва! ВААЗ2397 Нулапа с! а! 1998 ВІ підо

СтугоАа!ї ААВО3476 Ї еє в СІЇЇ 1997 Ви тТиКиоКаєпвів

СтугоВа!. АС593601 Модиега 5 Ібата 2009 ВЕ підо І ВІТ-976

Стуго-їке 00144333. - Міегаї 2009. ВГ У-5 дк

Стугідаї 132932 Раупе е! а! 1996 ДНК послІДОВНІСТЬ

Стугіла?. 166477 Еейвівоп 1997 ДНК. послідовнІСТЬ

СтугіВа!ї ВАСОб6484 Заю 4 Авапо 2002 ВІ го5Кіїдієпвів

Стугалаї 134547 Раупе ес! а! 1997 пи послідовнІСТЬ

Стуг2Аа2 САЮ43579 Іваас сеї аї 2002 ВІ

СтуггАаЗз. АСООЗа211 ри єї аї 2008 Ві г2-4

СтуггАріІ ААКБбО456 Вайт е! аї 2000 ВІЕС4140

СтуггАр2 САЮ43577 Іваас сеї аї 2002 ВІ

Стуг2Ва! САЮ43578 Іваас сеї аї 2002 ВІ об'єднаний з

СтугЗзАа! ААЕ76375 ропомап ес! аї 2000 ВІ Стуз7да!

СтугаіАа! ААСб1891 Каумаїек апа сії 1998 ВІ |(еєдаштезап

СтугаіВа!. ВАОЗ2657 Опадисвні еї аї 2004 ВІ зойцо

СтугаіСаї САШ4-З600 Вегоп 4 Заіето 2005 ВІЕСО-41

Стугб5Аа! ААСб1892 Каумаїек апа сії 1998 ВІ |(еєдаштезап

Стугвдат ААПОБОБ СОСеЄСЛОМеКа 3999 ВЕ йпййтив В-1166

Стуг7Аа! ВАдВ2796 зЗайоп 1999 ВІ підо

Стугвдат ААПодІВе СОЄСЛОМеКа 1999 ВЕйпйітив В-1161

Стуг8вАа2 ААдСОб235 МоогеапаОерго 2000 ВІ Ппйітив

СтугЗзАа! САС80985 Оеїесіизе евї аї 2000 ВІ теавіїп

СтузоАа1! САС80986 Оеїесіизе евї аї 2000 ВІ теавіїп

СтузоВаї ВАБОООБ2 по єї аї 2003 ВІ епіотосідив5

СтузоСа! ВАОб67157 Опадисвні еї аї 2004 ВІ зойцо

СтузоСа2 АСИ2г4781 зЗип апа Рак 2009 ВІ |еєдаштезап 367

Стузора! ЕРО95955 зпи єї а! 2006 ВІ Х41 Мо МСВІ, зареєстр. 09 липня

СтузОрЬ1 ВАЕ80088 Кізпіда еї аї 2006 Ві аїгажаї ВОМ1-14

СтузоЕБаї АСС95445 Еапа ев! аї 2007 ВІ 52160-1

СтузоЕа2 гО499389 Умцп еї аї 2008 ВІ Жмус2-8 Мо МСВІ, зареєстр. 09 липня

Стузога! АСІ22625 Тапегаї! 2008 ві МоС28

СтузобСаї! АСОабоого пи егаї 2008 Ві Н5З18-1

СтузіАа!. ВАВІ11757 зайюой 8 Мігикі 2000 Ві 84-Н5-1-11

СтуЗзіАа2 ААЇ 87458 Уцпа апа Соїе 2000 ВІ М15

СтузіАаз ВАЕ79808 Оетоггі єї аї 2006 Ві В0195

СтуЗзіАа4 ВАЕЗ2571 Уазшаке еї аї 2006 ВІ 79-25

СтузіАаб5 ВАЕЗ2572 Уазшаке еї а! 2006 Ві 92-10

СтузІАрІ ВАЕ79809 Оетоггі єї аї 2006 Ві В0195

Додаток А

Список дельта-ендотоксинів СтісКктоге еї а!. мер-сайт (вказаний в заявці)

Реєстраційний номер для доступу в МОВІ

Назва Реєстр. Мо Автори Рік Штам-джерело Коментарі

СтузтАр2 ВАЕЗ32570 Уазшаке еї аї 2006 ВІ 31-5

СтуЗз1Ас! ВАЕЗ34368 Уазшаке еї аї 2006 ВІ 87-29

Стузадаї дАСЗЄ?І! Ваавреататап 2001 Ві упппапепвів

Стуз2Ва! ВАВ78601 ТаКебе еї а! 2001 ВІ

СтуЗзгСа!ї! ВАВ78602 ТаКебе еї аї 2001 ві

Стузгора! ВАВ7860З ТаКебе еї аї 2001 ві

СтузЗАа1 ААЇ 26871 Кіт єї а! 2001 Ві даКоїа

СтузЗзаАа1! ААОсб5БоОЗА1 БІїїв єї аї 2001 ВІ РБВОООЇ об'єднаний з Стуз5Аа!1

СтузаАа2 ААКбА560 Вираг" єї а! 2001 Ві Е25899 об'єднаний з Стузб5Ааг2

СтузаАаЗ ААТ2г9032 ЗеНпері ев! аї 2004 ВЕ РББбОО об'єднаний з Стузб5Ааз

СтузаАа4 ААТ2г9030 ЗеНпері ев! аї 2004 ВІЕРБ1І850С 0/ об'єднаний з Сгузб5Аа4

СтузаАрІ ААСі11671 Моеї!їІепреск еї аї 2001 ВІ РО149ВІ об'єднаний з СтузБАБІ1

СтуЗзаАсі ААС5БО118 БІїїв єї аї 2001 ВІРБІ67Н2 об'єднаний з Сгуз5Ас1

СтуздАс2 ААКбаА5б2 Вираг" єї а! 2001 ВІ Е29444 об'єднаний з СтузБАБ2

СтуздАс3 ААТ2г9029 ЗеНпері ев! аї 2004 ВІ КНАТЗ369 об'єднаний з СтузБАБЗ

СтузаВа! ААКб4565 Вираг" єї а! 2001 ВІ ЕС4851 об'єднаний з СтуЗз5Ва!1

СтузаВа2 ААТ2г9033 ЗеНпері ев! аї 2004 ВЕРБ2гО1І З об'єднаний з СтуЗз5Ваг

СтузаВаЗ ААТ29031 ЗеНпері ев! аї 2004 ВЕРБ2ОТНН2О об'єднаний з Сгу3з5Ваз

Стузб5Ааї ААСБ5ОЗ342 БІїїв єї аї 2001 ВІ РБВОООЇ об'єднаний з СтуЗзаАа1

СтузбБАа2 ААКбаА561 Вираг" єї а! 2001 Ві Е25899 об'єднаний з СтузаАаг2

СтузбБАаЗ ААТ2г9028 ЗеНпері ев! аї 2004 ВЕ РББбОО об'єднаний з СтузаАаз

СтузбБАа4 ААТ2г9025 ЗеНпері ев! аї 2004 ВІЕРБІ1850С 0/ об'єднаний з СгузаіАа4

СтузБАВІ ААСі41672 Моеї!їІепреск еї аї 2001 ВІ РО149ВІ об'єднаний з СтуЗз4а АБ1

СтузБАр2 ААКб4563 Вираг" єї а! 2001 ВІ Е29444 об'єднаний з СтуЗзаАс2

СтузБАВБЗ АУ536891 ААТ29024 2004 ВІ КА1369 об'єднаний з Сту3з4 АБЗ

СтузБАсі АдС5БО117 БІїїв єї аї 2001 ВІРБІ67Н2 об'єднаний з СгуЗзаАс1

Стузб5Ва! ААКб4566 Вираг" єї а! 2001 ВІ ЕС4851 об'єднаний з СтуЗз4Ва!1

СтуЗзб5Ва2 ААТ2г9027 ЗеНпері ев! аї 2004 ВЕРБ2гО1І З об'єднаний з СтуЗз4Ваг2

Стуб5б5Аа2 ААЕЗ33526 Вгааівсни еї аї 2000 ВТ УА

Стувбдаї БОБО7621 0 дип 8 Єигопо 2008 Ві Ммс2-8 ніна зареєстр. 09

Стувбда? 20483512 СцапРепдеа! 2009... ВІС7- липові, зареєстр. 09

Стуб7Аа!. АМС87261 Модиега є. Ібата 2009 Ві Кіт

Стуб5вАа!. АМС87260 Модиега 4. Ібата 2009 Ві епіотосідив

СтубЗаАа!. АСН43758 Модиега 5 Ібата 2009 ВЕ Кіт І ВІТ-980 ши пд оон о о пн: п оМвзлаї Мріла ВАКАШНЕ І Беєпісв гі щ Ки вікон о АВК шо г що ї міра? МірЗАЬ ААСІЮМ о Белюнеаю 1996 ЗАЗ АВад о плит А, пла. Н ЖФеарнраеі є п о сахамють НІ З и АН юю

Ко жк шк Тож я Її я . х Тр Н КУ Ск ще ; й й Н що аю й лвзАВА РЕЗБА Яой ААВЯІОЛО Бейсізопеєві 1998 СУ ЯОЮВ о верезвА ЗАЗ МУ о : ; і ; бе прю

Злнзжає Срорігп ня са кюи поетики пЗвае ОБ бБЗБООВ варто праце тУїраАах РУ Кир ААКНІОВО Бецпеізойстаї 1998 5 3608 ЧИ РБАТЕ ЗАЗ Мау -

Ії г пк СЕ них и о тА, ше и и жк, ПИ що н т МОУ НОГА пІЖ ї . КИ Є Ми пл г : : по 5 с зх Кр: КІ що я є т М ї

СУївіАаб с)нхУО боро СААККТОХІ Бенсізопевряї С1998 «ЦБ БЕК ВЕ ПА Ма

ЕЕ й; : ї В А ЕШЯ 1398 о

ПлрЗАВЯ УЮЗА 0 СААКОЇШЕ оростіюстар 2001 онеопудіютано ВЕТОЇ35 що рія мів ї СААТВЕХ пеічеравіува 200 ме смубліковано В А ї пиши нм нн м по ен и пи, теівзАво ЗУ ААМеИВ ю55еаї 203 рії, 26, 82- В ї Е 00 ї : : "бопе Степ о :

ОМірзАяІЗ МІРА ІААІ6О542 Свегесві. 12002 ХнеВасі8, ВІ 51 ВІ ! ! : | | у УМ - :

СУйЗАВІЯ Мр о 00 ААОІЗ3МЮ оРойшеєйасіві 02003 реопубкованю ВИФОЖЮМН 000000

Пн ноняненях план ПМП НН МИТ кн арія ШЕ ЦИ ПУНК дме МНН МІНІ ин тату кнтннн тт нти ти фена утрат МЕДИ ит,

ОМАН ТМІр3А 00 АРА1ЗІ мне 0002004 сеопубльоване ВЕХЖУВЯЙ

МіМАВІб о МірЗН ААЖОІІО Мевлан на 02005 ї8и4, В і. .

СМірзАВІ? аю Бейсізопера 1999 55006) еуени 1900 ЛАЗ) МОУ

ЕН ї | Її ще Ан Хї НЕ:

Мем 000000 МИ сктіхю 5 жене НЕО

Уірзлаюю МірзА РОБЗОВАВ Напераі 0000006 пнеовбнюмюо!

Міра! Мр 0 АВОВМЦО Рапрапртй 2006 опубліковано Віайажай 1

СМір3Аа?? МірЗА-ВІ ААУЯМОЇ Плері 00002005 неопубліковаю ВІЇ 03000000

МіріАє МІРЗАТЯЮ ААУЛЯОВ лезі 0002005 реовуєлювню ВИЇЯЯ ОО (МірзАа)Я 000000 ОВОВВОФІЗ опера! 002007 уеопбліювно ВМ (МірзАа?я 0 ВР6ОВБОЇ (Нвієнсья 02007 неопубліююваної ШЕ

МірзАВОЄ 00000000 БО294496 бепаваСтю 012007 чеопубліквноїВІ ТЕО 0000000

ОМірзАВІ? 000000 ВОЗ32І67 БбепапфОмо 2007 неопубліювнюо ВИІЄ 01 ірзляВ 0 БІМОЯВІ? ХіипеіУю 2008 наеотубліювюВІКОЗЯ І

СМірзАя?У 00000000 0БІ6О6674 Хівштейсса! 2000 неопубліковано, ВЕУКОЇНЯ 3000

ФМірздаЗО 000 ЕУ6Л6ЄТ5 Хісштвісіа! 2009 неопубліюваю! МОЇ

МірзАаЗ г Авель ! РІ626676 л. І Хісштеї еї я що Ї 2009 інеопубніковано ЛЕ2СІ ик ШИ ши йраАн ! пд БІ Хілшеісаї 3009 ув МОЛ ш нн і ! Е І ШИ п рр и я (МірЗАВІ Мір3В о ААВЖООВЯ Бейсівюпсаї 01999 я ВІКВ59АЯ-6 2,АЗ) МОУ З ї і : ! ї оАшЕ003 41999 В. : пн ЕК Во нти ДЕМО ЗМК иркокя ІУДОДНх про ОогогЕгдрі нікель недок ПЕДНАМОММ М ММ КІМ Пе ТЕЛогроднок, Пор іенн і ковннккн оо

Міра ш МРЗО ои АХ ВВОЯУ Бспрапібнст 2006 не опублікованої ВІ пн пи па зи п по пон нини нння па пишне пиши ким пис ня п УСни пвно син

В Ей ї | ще патент США. і :

МрзАсі РОС і Мичає а! ї (2004012871 с . ; шк ПАМ Я Ї шив БАХА, що іш дей вени анна: шик шпдккии шко би лих. ! , «АММАЛА ВІЛ нвім и що хх ШИ фепиниицйнемні вини венивенивеннй вишивані иипици нен винонинівйивинийниницивиннійониививки инші

В 1 й і В і: заяака на ї : 5

МІрЗАНІ ОРБІ5ВСІ Ма нір і ; Іра і. зі58С2 : Магуа ек ві г г004012871.- ї .

ОУірзАй? ІВРАВ САМОМУ Мапвієстя! 02005 свеопубікювно ви

Грздеї ВРОС САЇЗ327) МепВівесаї 02005 (неолублютно ВЕ 000

У ши МИ ПОН УНН ин НИМ КОХАН "МірЗАє БРА 0 ССАВООІ5 Увпбіееєн! 02005 чеопублювано ВЕ !

ТУтрз гм : ; ї. вух і ї ї

НН А а НН НЯ пе нн ЯК егеЕе сей й лев АРМ пом п о з о пол олрваді ХРО ОАОМОВТ Бупена ва

ОМірзАНІ 0000000000Е9536803 Ашбюєтаї 2005 етно ів 1

Пкостенннан нена нн нн РАМКУ ААУ ден УТ лока АЕН їт- ж Ерні тя анна суір3ваї Є ТАДУЛОВІЇ Вавксгаї м В | Е

Енн на Нині пін вв З сис ління зн нні пенні ев

Мівзвьі У о АЮМОВІЄЇ бупестя ше МО ни ши спибок ПОСЛІДОВНОСТЕЙ «110ж реж АФВОВБСІЕМСКВ ТІ «120 КОМБІНОВАНЕ ЗАСТОСУВАННЯ БІЛКІВ СКУІСя 1 СЕЖі1Ка для вивОБблЛЕННЯ РЕЗИСТЕНТНОСТІ ДО КОМАХ «ізо пав -РОТесепЕ-Ої «50 5 ділу БасстйсІй стехвісоп Зх -иТа з «8115 1155 «ЕД. ВК «гіЗрР Щкучна веейдідаовнасть

КеКАе я «ил? Кіимерний білок ВІВ-155 «ФАЙЛ С

Мебс дЕроАБИ ВЕЛО РКО дБА Те Авп обі Сув 132 ро ТУ АвопоСув о Пей ї 5 їй Ку пек Ав Рге 5; бІб Маї Мей ва Ав оїУу біз аха їТї6 Бех Тобк о б1У 20 25 за йза цех ет Тіе Ар оїівє Бек Гей дек Мем Уа1ї1 Сів РБе пес; Маї бер 35 49 45

Ази гне Маї ро бі сіу сіу Рце о пев Уві піу Бей тЗ- дев Рпе сУаї

Во ха 55 тТев о шіу К18 Уві пьу Беб Бех Сів ТЕбБ АзБ о Аза Ре цевоМаї їй тве еВ та в во сі бів Беш лів Ап ст АжЯ ї1е Аза Зі Бе Аза Ага йвА Ага о Ата ах за За

Кхе Аза вет рецосін су Без о біу Авт Вап оре Ав отів Тую уаї пі

То 105. 119

Ала Ре пувобіюш ТЕр обі Сто АвроБко Буш Аз) Беєе діа Тв Ато ТИХЕ т15 ї2го І25 лоз чаї тіє йо Ака Бие Акт ї1іес їцез Авр бі їБву Ген о б310 Ак АВр. 135 то ттіє вто ех рРБе дкс тіє Зах стю ре сію Уа! веб Цей пен Век май 145 їча ї55 і50

Тут Аза Ії вів Аїа Ап о цес Кіш Пео Алаоїїе ви Ба Аве оБех Уві яп ї75 їт8

Ії вне Бім піз Ах хто ЗКУ рез Тс ТНК ЇІ1єЄ Ав Уві ДвпобіМа деп 185 І85 ее

Тух Ав Ага Мел тТіє Ако Ні Те Ар об1о Тус Аа Ав пів був Аза 188: 250 255

Вві ТНІ Тук Ав Ак б51У Пез дам йо оїей гео уз ех ТЕ отут бів й їй дег

АБр отТЕв Ї15 Тв тус о Авп ойху Мем о дкФ дко Дяр Мей ТїБЕ Пеа ТЕ Уві 225 235 и 249 тей олЕр БІ АБКа Аве о вйвояре Бса Ав ТУЮ Аво вавпоАха АХха лук Ко ча аа

Іїв бів Рхо Уді Бі іп Бе ТК оба біо Маї ТукК Тв Авв ОР ва ке) 2вЕ 20

Тїз Аза вва Ай Бгб біп обсем ОЇ дей Хві сАізіа бів бен Бус ТБ впе 275 ФВ Ва

Авиоуаі Меб сій Авт бек Аіз Ті Агу Ави Бо нів ін Рпє дДароїіа «Во 255 зба

Без оАвп Ази оіївн о ТвЕ оїТТе Ба Тако Аве фер ББе ек уві саАу Ахур Аап

ЗВ зо 315 320 вна Тух бТев 1У Пру Вів Ахла Уві їіе бек де Бей оїїв 519 Б3)у сіу 325 за 335 два пе Тих ах вк їі Тук біу аку бій Аза дя» бій біб вро вкго

З4О 345 350 дез Бек Рпеотах ра Двппобіу Рто Маї Ей одгЯ Тв Бей; Єву Авт хо 350 Зоя тн їв Ак цей Гву стй бій Ро Ткробко Аза Бго Ркс о РБе Ав цей

Ук 378 зво

Ва яку Маї біб зту чаї щшіз ВВеобех ТЕ Бтоа Тв деп беж Бе тТвЕ 85 заа 395 «о тУук Аа о біу бо біу Тве Маї Авробах реп Тв біб Ге; го Рекс бій 205 410 515 зр ода дек Маї Бго Рго Ака бій 01у Тує бек ніз Аж бе сСуво Нія 4хо 25 250 діа КрЕсВНе Уаї бій Акт Векобіу Те о Бко БйБ о Без Тр Лк сту уд «35 яко Ен

Увзх ВБе ев ТтроТчх Біж Жкф о бях вів Те Бец Твк Аве Тк Бе Дер ші з 460

БрБ піп дко Ті лап осзій тів БЕбоїей Ма) бує піу ВБре Ахо Ууаі ТВ 355 р) ЕВ АВо сі» щі тпк обБеат Уві Т1е тр обі БсЗз о Зту рпе Тк обу сіу БО Те «5 та 19 іс вкЧ яку сАВи тиж Блеа СУ Аво» Бре Маї беж Бей б1іп о Удь Авто Тіа зав | вав а

Авпо«вх рРЖО ї5о ТЕ Бій Акф ТУ Аку пай Ака Ре Ако ТтК АтТа Зак

ІА в 525

Вк Всч Двролів дта Уа І1їе МЕР Гви о тТвкосіу Кіа Аза Бек тВі бі

Кай ке НМ ой. й я

Ууаїосіу біу біп баї Зеб Маї Авто Меб Бо пеш бів Буз Тх Меб сти 545 550 255 Зев

Тів 'біу бій Авл лем Тк обак дха Тех Ве Ак Лук ТБх АБІх ВНе БЕ ах 570 ЗВ

ЛвопоБуо Вбе Бест ВБе Агу АТа Авт Рго Авроіїв ї1з 51 ТТе Бек ств

БВ 565 550 під бе Бей Ббе 01» Дів біу бек Тіс бек Бек обіч 013 би Ту Тів 595 800 вО5 дев Був їі пі) її8 Ії Їїва Ат АвроАїа Тло ре зія Аре поль обох

ІЗ бух а бе іа біз АкщоАїв бів був АТа Уві Авя ВІ фей Ре Тих бекоБех 630 835 вів

Ав ошіа Її біу ви Гу Так овер Уа1 ТБеоАво ТУ онНів ї1е Ар БЕ па Б Ба

Магобек Аяв бен о уаї дів сСув сей беж Авробга ро Су ей пав Ого

БО вб5 ето птє ув СІЯ рез Бек бра пул уві ру вів Аїа Був Або Те цех АзЗр 25 бвб 685 бій ака дви щез обва сія двровсо Ав РБе Ажа сту її ЯБподжч бій є80 Ге 7о0

Пежо Аяр о Дха б1іу ТкЕбБ Вк сплАу бех Тв азв тів Тл те сО1й сту сю тах па 715 То

Авр о АБв Уаї вне буд осі; бвИи тТук ївЕ тв са іо Ту тех Ре Авр і 85 730 З вій сСув тут Вко Тк о Тую ем жує Сів ув тла дз обра бек Бйуз Бе т43 745 то пув Віа ТУкК ТлжЖ Акад о Тук сій Тез дк ст Тук Ті бі АвБроЗвр СІЙ то 750 тех

ДЕБро бак іш Тік Туї бен ї16 Аку Тук даБодів Був Вів сій ТЯкоУуаї 0 тах тво

Азпоуві рев бі ТчНЕ біу шеж їТен ТЕр ру Бе: бат А) Бжо пех РЕ тва тво 758 85 її Ппіу був Сув Аіа ціє Нів бек Ніє Ні Ве Ззх Бе бБИ Ї1є Авр ваз ТО ІЗ

Уві сь Су ТВх бар опею а8п бів Аве це біу Хаї ТК тах ії6 Ба 2 ве ЗО

Був ої18 Бу ТВу бій вро ші Ні йІвз вкш оїєо 5Зіу Ав о бец біц Вре

ІБ ре їх їн обі біз Був Роо пес Уві б1іу бій йза ей діа Ахку Маї Був Ах 855 855 в5о

Аза 013 уз Був Тхр Аре Ао опув вка біз рузв бе біз Тх5 за тех то 875 а вва отіе Уві тую був С1с Аїа пув бів бек Уві АвроАїа без РАЄ Уві

Авт о бет З)іп о Тук Авр о Ахо Тен біб дДтіа дер о Тпродлв Т1є Ада Мек Тїє 00 за5 що із А1а іа дев руз Ак Уаї Ніз бев Ії ко біз йтіа Ту цем осо 5 во пев сі пйез бек Уві Біє Ро біу Уві йепойкіа Аза Ме Бе бтм Ота Гей з30 За 340 сіз біу ке Ії Рне Тк діа брє бет їйва Тур Аз Ага Ак АБИ Уві за 155 з55 зво 115 Пув Кзпопіу двроВБе дви два ЗІу без детї Сув ТкроАви Ууаї Був

Зе5 пло 5

З1у нів Маї Бзр уаї 51 О1М бій АяйоАап Нів о Аго бек Уві їи Уаї

З53 585 зай

Чаї Беоо ЗІ Ттробра Аза біо чаї Бакобів біо У«і Ах уаї був гко 595 1050 1005 зЗіу АкЯ біу Тук Ті Пец Джо оУаї Тк ойіз Ту пуб о бій біс Тує вето 1015 ї1020 сі сів» біу Сув чаї Тв її біз бій Тфе Бій дай о Ахи Ту Аври х925 то тп35 сій вен о Був вне вех Ав Су Уві 510 Сі) зів Уаії бук Рео Ал ; 14 1945 55 азпотТвс аз ТнгоСув дян бе о Тук Тих Аза ТВх обі біб бі тує то55 1650 1055 пра ові ТВ Тук Тих Яех Аква АВ оОАтУ бі жк ово сіу АБа тує 1 Вт ІБбБ

Січ Бех Азп бе Беж Уа ко Віа двр тую Аїв беж Аза сухо міц

Тта5 тозо їо095 та зуз Аїв Тух Тих Атросіу дкЗ Аг дароАва бко був бів Зв віпо 1105 МІЯ авпойту біу Тує біб дДяр Тук ТИР Боб ієнї Рій дід піу Тут тВї1

МТВ 1350 іт

ТБЕ о Буз Бій (во бів тує ББе БкКо ЗА ТБкодвроБув о бві тер її 1135 М140 п тря лу бів То 71 ЗіУу Тве о РБе ТІе Уа) аБе о бек Уві Ід 145 1150 1155 бец опцей!о реп оМекобіз; ср

«ій» й «тії». 3164 «Т1925. РР «РІЗ» Штучна послідовність «Во» «га» ЖХимеврний Білпож Пісні «НН» 2

Ммеї АДввобзп Ав оБхо Ап оті Авпосі; Суб ІТ Рро Жух Ав Сув ВУ 1 йо ло ї5 бекоАві Бгто бій бій уаї Ппехж бей Аврозіу СТІН АкЯ гі шек Тв обу «о мо Зо

Аа Бет бек ІЗїе Авр Т1і8 бек ївс бек без Уаї бій ре їв) уві Ше

В. їй « чо 45 даповпе узі ге сі Біу бїу Ве цен уаї біу пеїшт її Азв о гйє Уві

БО ЗА 5

ТЕвБ хум тів Уаї Сіу Бо бех бій Тер оАяр о АтТа ЕБе оПеві МБ ів Тіє

В 70 75 на бій ія Без її Авлобін Ага ї112е Аза сіб ве Аза Аєя Ази АТ ЛІВ 85 за 58 її Аїа Ази реб БІ Су та Зіх АБа дви кре Аво ї18а тТук Ууаї Бий їде 05 їїй та виє Був б: Ххр лі бли аво Бго Му джин Бо Б18 Та во Тв їТ5 ї2о т25 дк заї іа Авродхе5 РОЗ дк їз іно Ар ослу цез їед бій дКа Авр ї3За 135 ї«0

І1хе вх Бек рРпе ДкЯ Тіє Беж п1у РНе бій Уаї Рко пво без бех Маї

МЕ М І59 162 тут пів ій діа АКа Авлобен Нув оцей Ата ті цей Ака Аво Бех дії 165 7 т тла Бле бі зЗІіс Асу хкрвошту ей; тн тах хіе Аяхп Уяі Аа За Ав

Ко 155 чу тУК ВЕпо ов тем тіс дб Ніз тів Авробіц Тук 514 АвроНів Сув Ауя 155 оо га дво оту Тук др обра Сім Бей Аве Авпобео БЕБ дуз безе Тв тук їй зі іх 28

Кар оттрогіє Твт Тук Авповтп пез вхо Вку Аав їв) Твробеш Ту Ма1 «З 80о З 4

Пес дво гії АТя АіВ8 Не Бчє Бхо во оТук двробла дя ха Ту ВЕо 245 252 255 ї1є біпорко Уві ЗУ Зі рез ТБУу Агу біз Уві тую ТВЕ Авевр ко це гео ЗЕ зо тіесАвп рне вай овко Іл Із; бій бек отаї Аїа бІпо рено то Тдковве

У шЕУ 285 дя уаї Ме біз Авп дек А1а ТБре Ак Авпорто Ніз Лев Ре Ар ої зо 235 Зп еп Авт Азпосїна ТУ ттТ6 ре ТЬгоавротТжр вне Бех Уа бІуУ АкУу до

Зах 30 З15 Зо на Тук тер обі» 51 Вів Аху Уві її дех бек меч дів біт бі ху з25 330 335 дз З1е тре Ввгореб ї1а тує біу Аке 514 Ата вва о Сіп о сій Бко БЕе 340 Зах 30

Ако бек вне ТЕ Ре Ав птфу рго баї Бе о Аха Ту без Бежт Авпо жо

З Зо Ба

Так Гез Ак їжа Без Зі Бій Бо Ткр о РЕ Аза ро Бк РНе Ав Бе

ЗО 75 зно дуч вію уаї віз сіу і бі: ре бдех Те Бха тиж ДЕшпо беж Вбе те

Зя 330 35 по тек Ака біу Ака бі Тк ові вер о Зек Мен Так Бій бец вхо го бі 455 2 її дар оазп о бевт Чаї реко Бко Аха піч біу Ту ак нів Ах БПец Сув нів аУй ік 3

Аза Те вне Уві бів Вуд бек Біу То Зко Бе емо Твро тк бЗіУу Мах 35 з4о 445

Уа1 вле бак Тер отвк Ні Ак бек АТів Тр Пед тп Ави Тв Т3е Ар 150 455 а

Рте біч йку Ї18 дви озіп тів Бто цеєс Узі ув біу Бве Ат Зах отр 465 470 ал 80

Зі Зіу ТВгобЗес Май Ї1е так біу Бко біу РБе Трх Сіу б1у АвроТ1є з 450 53 іївз Ах ака Ав тТвх ре сіу Ашрорне уаї Жет без бія Маї Дяво Ге

ЗИ 50 10

Авпобек Бко ії Тпеобіп Ахо Тут Ака Ге) Ака ре оДАка ТуєЄ Аза бах 52О 275

Зет о йхо взройіа ку Чаї Тіз уаї Гей отвк сіу Ата Ака Бех ТВ і 5ЗО 535 5 хі Бі біу ста Маї Бех баї Ап. Мак вто пем обі був ТК оМек бів па БО ЗБ ово тів 51У біо двп Без Твх Зек вхо тах гне Вод Ту Тк дзро вве дек 355 7 В. дЕп ово бе лек НЕ йха Ата Ази оРго Авроб18 їре піу ті Щек ШТ

ЗВО ях 590 тп РК ес; вне п1у бів с1у БЕХ ТІ шщетх ек сф Біб бе) тую Те 555 во 05

Ав пуз Тіє« пів Ії т1є ву діа двводівз ТБ їей ось; АТа спір бах 610 515 626 дво ун спів Аку діа сій був Ала Мах Ав дія Бею Бпе ТароЗек Ва

525 вла 535 б4о

Ввип бій (1е зі бей уз ТАгоАВр ої ТБжх о Аво ТукоНів її Две АкФ вї5 556 555

Маї бек Авопоївц Уві бі Сув Пеп обех Авр обі) Вче Сув реа АвроБуу зн 565 тв

Тув о Ппуз Зір Бей Бек піз Буз ува о Ббуз НІВ йїа дув Ажу ПМ бек Азб 675 вва БяЗ

Сі де Ав осез їз бів Аєр Кто Ашб о БНе о дса ОБУ 112 Авповбку іп 550 ках то цес Дар оАка Зіу ТЕр Аа Сру бек Те взр о Іт1е тлю пів Бій зі Фу та5 7 715 Т2О дар оазр уві Рне їув Стій Али Тук о Маї Твг о цез беі бу Тв БнНе Авр

Тйа З ТІВ

Вій Сув тук ркО ТВЕ Тух Без Тук Сі бу5 Х1іе йБв сли бек обу Бей то та 50

Туз Аїв Тух ТЕ Ата о Тук бій ей Ах зіу Тух Її 514 Авробек бій 7ва теп 755

ВероТенвозіч стіє Тех Бем о т1їе дж Тук деп Вів ев Нів бі тТнЕ хмах

НІ 5, 780

Авия Уаії го БІу ТВ сту бек осбецо ТЕр о Бхо їсо ет вів Бто Щек Рло т8а т5а 735 БО їїе бі цу був Вів вів Нтя Бек оНув Ніз Рпе Явег Бей йврот1ів Аве 505 816 515

Чуаї ху Су тп АЗор оцет Ап СІ» АвроБей оту Ма1і Тер омаі тів РК 829 ваз 835

Був їЇХе був Тс ів йБр о біу Нав овіз Аку рей 51у Авй ем бій ра 35 й ще

Мем сіль щі Був РКО Бей щі сіу бі) Віа бейповув йкЯ Ух Був Ах 850 як НІ

Аїно бів уз був тТхр дк Ввроцух ВХЯ 1) дув Бей і То ока ТоХ пох ло ТЕ ва звпотіє тай тТУуК Му С бБіц Аа був ші Зех о Улі Др о Вів Пед Бе та

ЗИ а

Знпобет бій Туг Ашр оАгоер пев піп о йга Аво Тк Ав 118 Азв Мев Те о ВОоб ЗО ЗО

Нів вія діа Азробук Ак Уві Нів бет 118 Ага оБа біа Тук о пеп Бко

ЗІ15 з8о0 За

Бім лам век Уві їїе Бкро сту тах Аж ді Бла Те Раве зі біз Бей 36 35 ЗІ зі бі вка їі Бе о твкК дія Рос бех Без ТУї двровів пха Аза та 5 Ба 955 Зв

Ії Груг Авп оБіу Авробне Влподйвпобіу Гей бетх був Тур АБ Уві пуд

Зо З вІіу нів Уаз Аво о уні пїб сто біб дБ Ави Ні Або бек о Маї Тев о маії 58 55 зе

Уа вхо ші отТео осі Аіа біз Мах бак бій зі Уаї Ак Уві Сувосвго 1290 1205

Стіу вх біу ту їїє ей Ак о бяі ТВкоАТа тут пу са Зі Тух

Мо ї15і5 вого

Фу біз бі Сух Маі ТвЕ їіє нів осіз 116 Бій Аво оддп ТНІ АвБо хо 163 035

Єіїза Бей о Був Ббе Взх Ап обув о оМаі бій зіз біз ча| тТух Бе Аз, 1840; ї1545 1050 йзп оТвж Хаі Тйхобув дал о Авро тує Ту дта тях бів о біб Ма отук 1055 1358 1065 їі ві жає Тух Тлт охех ака саза-АкКа сі Тух в5р о БІ Аза Ту 178 1075 сне біз обеї Ав Зх бе Уаї рез Іа АВо Ту Аля бек ВАЄ тТУХ ОЗ 1555 тоз0 1055 с-іш Був АТа Тук ТНК АВроБкУу йг3 Ак Ар Ав БО був сіб беж 1таб 155 Мо

Ази вка о біУу Тух бі Авротук суп РКО Бем о ВБгсо АТїа бію Тух чаї

Ви 117565 1525

ТБ обу біз оцей їм ТУух ве Бро бі) Те Азрозуз Уві тТжро ті 1130 135 1150 ій Іїее оіу сії тв обі біУу ТБ вве Т1е о Уаі Азо дек оуаї ви щі45 1155 1155

Бех о без о бецд Меє бій їй

ТЕО српж З «вії (заз хаїйх ЩНК «се132 Штучна песлідовністьх кох се» дпвимізовача для кукурудзи дідника, йка кодую ПІО-Зп5 «Оп» 3 аслцдаїваса вссссазвсат Маасдвобас всісссЗвса астсстьстіс давбєсвова би даачедесев птацасцоасдв двсзагхсся асіодлстдаєа пепесвестза савеЕсссве ма шсесвочесс аастссскою опсотвасиісс зксесвчсся Часом касЕсУсЕВЕ 1855 ебсласктсЯ восячалзає кехсспясос соссаченао абведесксх собдевчвса 235 лачсевбстза ссвасововУ даессовокоая гссасоадая атдсесчсває сассвнеосея 05

Чаайусська ЗбавезвссЕ свзсаєстао сслоавачеую ссзадчадеу буаеЗасоас 355 сесвасавес свасодассво австазчезек асасатсоуї Сесоцсзесоес спаццасовх 20 скччазезуу асабсесодаз сеЕсесзовІ пеузавсвіа впапокесесх пексвсвоте 85 сасустсвад стдесвавої довела єс аксстдалоач асссадксає сссвБосесаз Зо састачачЕс брасзастає спасокоаве Чадавнскаса абсадсеазк гсудсасаса 500 пасзасевоя содассаєьу гдссавсасвс свсаасадцоя чбобавасая сепусстазн б

Ебвзойтесо зацасбучаЄ вассвасваЄ ачостсаяас содасововес хетбавсчеу 72о стдзасатяе скуєстешее Єседааскас дасавссуда чабасоскає зевассоцех то зесадцоста сспусчадех обасесоуат песспесарса вопосвайоєе ссазссусав я бпасесосзо адосдессав сессвакуву абоЗаваасв садосатося паасссосає ЗО срстсвтаса басусазасва сстсаствсс стеассзчатт са: ссаче пудаслсває ЗВО гіссхососо бЗапсповсвоа адечаеессв адесесвькЯ Чачсазапзав савани ся Того сссвосівеог Чавосочуайос савассгацач ссяссвадує сетссасек саасзасссу їоцо чкнсксачва сасссадска Ссосасатва сЗстсцоЗс ватазсеячся зосводсасея. т149й сиавсесвнавс сдазччоавас зезапасцея чЧацувссооа сеосрасаев свослерацу 200 гасайзвочеа чазчозасачі здастсасе асадаяасоос сасстдалча сабо 250 сексесдевзсу ваузссастс зусяссзаась сбуссаечеса сбстЕсоссса чадуссооах 1350 асдосусете сляссастцо ач оск воссазвсст абсоососаде часзсеЕваса 50 авсасеагсЯ асссададзу Забсавесва зптссосоїда паавоалевт везе Есад т443 чаксцнсасла чептовссас сочасстдк КессвесосУ саЧезаксост свдасусад Ії апукктазсоа вссіІсаговЯ ссстсавако аасатсвааст бессавтсай ссбеадезавах і550 сачетседов Єсауасясяє стсаєссаза дасозсвачЧчао бсвуспеове сасіодчадее 1659 дстацслссео бдзазссадчаце ссваЧчЕвазс десавсвіЗс спрсусацва дасзасасаа їде асооузкзаза всопсвссвоа садавсоско суссасясво абутсвусаз сВсевЕссес їтай гбоздзчцоса асссаавсає забсозсака бссозасато собу зехелу бускчудесе їв акссоеггоса дсзузоссета сяссуасвато вгбцазаєса бусточевав гцетасово ії85а зчзачзассдває подасссхов авозасасас зазоасаався асссеоссссв сассвастся 1920 свгсацакта дезктаводає беріг таєе пцаставовса Собасаавстх поставок 1880 півоадедес стесдабцца сЕКокабеко звсзванача вочвассекс бчядвевасу 20248 задсвозсуа адозостскс дазечассоЗ пасе уевос вадавсславаа сгссвчадас ато аспаазкосчнс аЗкксавіва аудсссчаоо павссваєсо чоасвасеші севадчастою 2150 ласеасаєук бедвоузава стгабуедаса біостдуссй сбіксувеца беоскявесе го аспоасасссст зсбадвезчає бдасовоавес азесусваву ссбвовоаса стяг сзЗске кейи зчивчастасз сЕдапцассс гсавовссоо зазавстаєс сбозгсазчаса свасосовад 8380 састачвсчу спзасціссе Боодассаач севепчучяас сасозроаає ассоточиса пад врсзрчпазачь дочвісассв седподосас вессесссо асазкгазавУє сеавгУусасу збо чассезазея азчасстову зе асссєсаяасз Ссвачасссв аа 252а чесачасісу длайсоскоа чЧеЕтссвесав сацчавочости КЧососпровоя засасецасе «БНО сачочУсцпавце Заасгдадав ззавіучасс чвсвзазаоЗу звався чеЗдзавасес дев вепасаспсеає асласєчачзас Свесчачеса збодводсас сосьсчксва Ебоссвутгає 270 чвчначсі с пачесовлат заасяхосдес кода ловку сСвосовасав зачсзьссях 2760 сшсактачодчо адзссьассє босолвасою ксазчизвело сошоодсесва спивосевимє ях їстчалоаак споалазочаз заегсхесасое зобі стскс Бубвслпасоай сспдвастеє вв аксвазвасо чів ксяа свасочаєюс азесеочослоум везкдвавог ссакакеда АНЯ чІсдзаацавс зцаасвакса сспсазчозчо сіпагоадекс созазьуаа ацссуваяе ЗО. квасавачаву ссадчачеясяЯ соссвсузача здвссвасавев Басов срає еубесасває 505 іїзачасгтатЯ зозазчзссЯ їсксвассвос сасцацасо завасавсяас валася 3129 зедксрЕсва аскстассов здеазацедчсс басдпасааса врата зсуусласове 3180. сасасадсса сібсласвоза чбасчасаоєс аскрасасес сусочсвасеч ачостасгае за сзсЯсствсЯ азбсзвасаз стссаЕцеса дсадассаст соседасттв соуадвсвоаає 35050

Чедгасарся всчасспого ууаєвасссо счсцячачся абадпасувсов доодастає 360 зскевсстсв бадсїтоазсова сесопссвая заз кучаяо зстевсозлза чЧасадвЗсава чаго

Чисто Ея азадосоавоВ засачаачяє асевссався судзаекує гтузасесеко зав ссцассавоз ву за «8105 4 «йТЕ 55 «али БЕ «2185 Шиучна посдідсовністе «ев «ай» штуїка

САЛО

Ме опіс АБ олЛЕл Те бів о Ава зів був Уві рЕОо Тух да? ста Бела вай

Її М 16 15 лап Був пу Уаї сій тіе ва Два зі бій Ака бек Тк оБУу Де Ге 73 25 за втс їні АВротіє бек о пейп З ек Бей Так одте Бе їж Пед бек ба» рНе ка Як чаї Вт біу Уві піу Мві АТ Ттве спіу Гц Бе дво Бей ТІє ТЕ у що 5 5

З : -д,

ВНе їі ТрЕ Бже баг оввротТкробеає еп РБе без оцей обуп пі шк: БІЙ 55 70 ТУ о пем Ті бів З)іт АК іє 62 тТвБЕ Пемш о зіч йо дай Аке Аза Тї185 ТвЕ

Зо 5

ТВі бе) вра лу Кеб Аїз Авбобек Тек осі Те тує ТТ бі Ахастец

Таб 105 115 йта бій Ткробів АіасАєп Бксе Ав АвпоАів бів Цей Ах сій АвшоМаї 115 Пи: Бе дея тів джу вве дів Ав ТВк о Аяр АврВоАзя їв 116 Тпж Аза 18 Ав 130 І25 40

АвапоБЦце ЇБЕ Це ТВЕ Звк РнНе січ тів Бтб їео Гео бек уаї Тук Маї 345 150 НО 169 сів оАТа Ата Ав Бей оНів Бей обет Її Фей йгу йзр бів Увт Бех РНе 165 То 175 сту стул аху ТЕроЧЕу їм Азр ї1ї6 Вів Так оУ«їі вва ДЛапоНія ТУ Авт 18550 185 199 дкЯа сем ті Ап Бей Ті нів вч ТУЮ Тв Був НІЗ був о їви Ав ХК 155 258 га тус ов бІпо сту бен б Авт Бех о АкФ о біу ТВЄ Ана Таж одкЯ бів ттр шо 15 Бк

Аха дра рпе Ав ОСІБ ве Ава Ако двробен Три Бен Тахо Уві цей дБ 275 230 235 249 іа уаї Віа на бла Рко АБа тує дар уаі Ат тТнЕ тТукорго тів 6125 кч5 ви ЗЕ

Тих Щек беїх сій пев отих Ага біз ї1е Тук ТВЕ бек беє тах тів СТО 255 Я 255 275

Авш бак орто Уві век від Авй її Бгто Авт біу Ре Лялп Ах АтТа обі за 280 285

Ра ошту Маї Два Рко Бк Нів без Меб Авю вре Меє дзо бех бед о вве 280 235 зп

Уві Трж вів сла ТБ оУаії йо бек зів Ту Узі Тр обіу віу пря Гев зох о ЗІ ЗО

Уві ек Бак Ако бат Тв АТа СЬу Депо Бта Т31фе Ден Ре вро з оту «АР 358 ї35 сІу У«ї Ве Зап ро сїУу зіу Аїа 116 тТКвроЇ1ї8 Аз Аве обі Ак оБКо 340 зав 356

ДАкач Зх гре Тук Ак Тахо без шех дав обо Чаї Бе Уа) Ако піу бу

ЗЕ -ЗБи зЗЕ5

Бпа шіу АвпорЕо пПі« Тух Заї їву сі ей дгу бі» Ма Атв пе б1й

Зо ЗБ Зо сім Таж сі Таб одлмй вів ТБгоОАту ТБ Бе Ака Аве бе бе ТБУ тів

Зк: 3985 355 403

Яви бет обу дяробіа ї1ї-е Бо Бо біп До Веп обЗвг бі» Атв го Ткр в 410 415

Авподзр Тк Шек Ніш Уаї Цез й Нія Уві ТВрорне Заї Аква Теробго 476 425 450 шоу біл те бек сбіу бек йзр бер Тхв Ахо Аза Ртз Меб Бпє Зак Трр 435 А 415

Твх Кіз ба ех Аїа ЇТбг о Рро ТБ Ап отр Ії дДвровБєз 01п АкФ 11

Ахо 5 486

ТВ Бій тіє Яко ТПемй Уа1ї Гуз Віа Нів Ти без (Піп оБетопіу ТВю Жвх 465 то ТЕ щ95 уеї Мві Ага обіу Бро біу Рае Те біу біт Азр їів Тез Аг Ага Ту 85 «9 35

Зак піу Ф1іу Рхо ре АТа Тук ТЕ Ті Чаї Вело 118 Двпосоту вій 185 505 о

Бко біл дко Ту Аху Аїва Ак Т18 Ака Тух Аїд бек Тахо Ту Ав о беб

БІБ 20 55

Акеа їїє Тук Чаї Тчк УуЩі АТа ср біз Або Її ББе Діта діу бій вве о лап о гУуВ ШЖВкЕ Меб дво Тйкобрфу деБ о Рго беш ТЕ БВе бів бек РНе дек 345 55Оо 558 Б

Тукє Аїв Твх Іїе дБ Твж Атв РБа ТИХ РБе Бто Ме бек сіп бек бек

ЗБЕ 510 75 пре Тйх Заї БІТУу із Ар оТБк о рпе бек Бак біт Ав осіб ба! Тук Пе 589 БНЬ 595

Аз о Ако Бе бій земої1є Бре УаА ТЕ овла Так Тв Біб 5 Бай вп5 ких 5 «2112 615 «ві» РКТ. «813» Штучив послідовність

ЕТО чаї СЕУуїсСе кадОох 8;

Мес Авровац Ав о Бко Ав і11ієбє вБд о бЗіч сш 116 Бій Тую АвпосСув Ге

Н в то 15 беходео Бко біб біпш Уві ем оцей Варобіу бій Ат І16 бер Тк с1у из 25 ло дви обех Звк Т3іе Аврої1е бех Ген бек Пец уяї бій бе Пец Уві бех 35 40 45 дві бра УаЗі Бко біу Шіє біу Ве во худі 01х деп те олаво Баеотуаї чо ча 65

ТЕр сту Іїв о Хаї жі вто Зах іп Тв Аве оАТа Ре без Уві біп І1є

53 та ТЗ що біз бів лей Т1е Ап осЗРш Аг тів с АТа бій ре Аза Яка Авбо Аза Аїа 85 ща 35

Ше дів Ап ев сія ЗРу беб біу два Азп Ре Авпоїїе Тк так шли

Тов то5 13 літа ве пув біз Тер біб біз дер обто Був Авп о рРхо Дів ТБг о Аво ТЕ 115 1575 155

Кха Уаії Тіесввр о Ака пе дку Те цей Авробіу без пев біз Ага аво ї50 135 155

Ті Бко бек Біб Аква ТїТіє Бак бу де бій Маї бує без Гей бех май 45 15 155 160

Тк Аза сій іа лів дя рей нів о Зев АТа Ї16 Ге; дх3 двр Бех Хаї 165 170 175

Те Бе біу 19 б Ткробіу їва Та Трек діє двдоЗаї дав Під Ай 130 185 198 тук Ав тд Пец тів вто Ні Її дер біс тую Дів Авв нія був діа та 25 295 зи ОтТНчкЕ о Тук Авп до біу цЦез Дай оАєк Бе БгйоБує бек ТВ отух ОМ

Ка. тІ5 й2й

Авеотжв 116 ТВЕ отТух Азп ак рей АкЯ Або дво Бей тнє рей ТАК Уві ра 230 235 59 пев Авоа Ії Лів Віа Ре ре Бко Ав Тут Авролвй Ат Аку Тух РК 45 25 255 те сія ро Уувь шу 31о Теза Теж Ккеа ки Уві Тук Ту Авровхо Тео ши а 20

Тіє Аз» Бпе дей Бхо ати Баш спі бек Уа1! Аа біп Теб РЕо Тих голе ту 280 85 дви уві Мес бій Авпобек Атїв о Ї11е Ак о А5Ь ргОо ніз По. рпв дврогіє 280 235 КІ ії ДепоАвп о пей ТБ ї1е Рве тТБкодвв ТткроРБе дер уві оду Ак ад 305 з18 15 390

Епе Тук о тТкр бу шху снів джу туах Хі бер бак Пи її спі бі оту 325 335 БК

Авпот1е Тбгобеє Бк 11їє Тух о01у Ак біз Аза Авя бій сі Ро вка

ЗІБ 355 ажхсодех Рве Те Впе сдяр осі ро Узі Бе Ага Ту Се бек о йви Бра 335 збо 355

ТВ обес Аго Баш Без бій б1п Бко їгрорхо АБа вхо Рко Рае Авт цец 37 375 ЗО

Ака сіу Узі бій БіУу Уві біз Ре Зак Ту Вхо ТК обер обеїт Епе Те

Зв 390 95 105

Тух йха пі духа бі Тве таї вро Бех Бец Ток обі ей бко Бге 01

ЯЗ 4хо АВ

Авс о бвй Бех уві ВЕО Втс АБУ Сів БЕУу Тух Бех НІВ о Джа ви Сув пі до 455 435

Віа тах вве уді піп Аха век Оу ТВж о Бка вве їз ТМЖ ТНх бу Меї «35 й й чад

Уві БнВ о деу Тв Тв Нів Аг бат овів Тот Мед тик ода ТнЖ сте Авр ї50 155 Ай ис 0Оліх Ака тка Ав біт Те Рко Беб Уа) був біб вве Аг УВА Тр

ЕВ 470 ЕВ 8о сі 535Уу ТЕ Бек Уаї їтіє тТЬЕ о б1іу рхо біу Вреотне обі бі Ав ве «85, 480 455. ікси дгч Аку дз ТУ Рв біу Авр о БА о уаї ЯвЕ Гецч бів Уяі двп Те ков 510

Кві бек БЕ; хів ТАЖ сій дже тує АкКЯа ев йо ре дк о Тук Аівн Бах

БІВ 520 ск: ШИ бек вка дев АТа Ах чаї їтїз тах тез Тато су ді ді Зек трж 1 вза 5 54д чаї шіуУу біу щі Уві) Бек хХаї Яни Меї руб рей шій Був ЖЕ МеХ бтв 545 вай 585 ко тії іх Бі ввп Без ТП ес Ак ТБЕ БАе Аку ТУЮ ТПт Аве Ре Бек ба ЕТО 575

Де) Рко Ве беє РНе дк діа дей ро дев Ї18 ї15 біу її6стек Щи 580 585 ква дій ркб Пец Ене О1у діа пе дек Ї12 дек бек сіу 010 Ба Тук ї1Є 595 вО00 во

Ар Гуз 118 пт ЇТїе Тієе Цей АтТа Авд олія ТЕ й 815

Claims (34)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Трансгенна рослина, яка містить ДНК, що кодує інсектицидний білок СтуїСа, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Сту! Га.

2. Трансгенне насіння рослини за п. 1, яке містить ДНК, що кодує інсектицидний білок СтуїСа, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Сту1 Га.

3. Трансгенна рослина за п. 1, де ДНК, що кодує інсектицидний білок Сту1Са, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Сту! Ра, були введені у вказану рослину шляхом інтрогресії.

4. Трансгенне насіння рослини за п. 3, яке містить ДНК, що кодує інсектицидний білок СтуїСа, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Сту1 Га.

5. Сукупність рослин в полі, що містить не-Васив ІПпиппдіепії5 (не-ВО)О рослини-сховища, які не експресують трансгенні інсектицидні білки, і сукупність трансгенних рослин за п. 1, де вказані трансгенні рослини містять ДНК, що кодує інсектицидний білок СтуїСа, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Стуї!Ра, де вказані не-ВІ рослини-сховища складають менше ніж 40 95 від всіх сільськогосподарських культур в указаній сукупності рослин.

6. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини-сховища складають менше ніж 30 95 від всіх сільськогосподарських культур в указаній сукупності рослин.

7. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини-сховища складають менше ніж 20 95 від всіх сільськогосподарських культур в указаній сукупності рослин.

8. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини-сховища складають менше ніж 10 95 від всіх сільськогосподарських культур в указаній сукупності рослин.

9. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини-сховища складають менше ніж 5 95 від всіх сільськогосподарських культур в указаній сукупності рослин.

10. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини-сховища розташовані у вигляді блоків або смуг.

11. Суміш насіння, що містить насіння не-ВІ рослин-сховищ і сукупність трансгенного насіння за п. 4, яке містить ДНК, що кодує інсектицидний білок СтуїСа, і ДНК, що кодує інсектицидний білок СтуїРа, де вказане насіння рослин-сховищ складає менше ніж 40 95 від всього насіння у вказаній суміші.

12. Суміш насіння за п. 11, де вказане насіння рослин-сховищ складає менше ніж 30 90 від всього насіння у вказаній суміші.

13. Суміш насіння за п. 11, де вказане насіння рослин-сховищ складає менше ніж 20 90 від всього насіння у вказаній суміші.

14. Суміш насіння за п. 11, де вказане насіння рослин-сховищ складає менше ніж 10 90 від всього насіння у вказаній суміші.

15. Суміш насіння за п. 11, де вказане насіння рослин-сховищ складає менше ніж 5 90 від всього насіння у вказаній суміші.

16. Спосіб запобігання виробленню у комахи совки трав'яної (БАМУ; бродорієга тТидірегда) резистентності до токсину Сгу, де вказаний спосіб включає висівання насіння для отримання сукупності трансгенних рослин, які містять ДНК, що кодує інсектицидний білок СтуїСа, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Сту!Ра, і контактування вказаної комахи з указаною сукупністю трансгенних рослин.

17. Трансгенна рослина за п. 1, де вказана рослина також включає ДНК, що кодує білок, який містить коровий токсин СтуТАб.

18. Сукупність рослин в полі, що містить не-ВІ рослини-сховища і сукупність трансгенних рослин за п. 17, де вказані рослини-сховища складають приблизно менше ніж 20 95 від всіх сільськогосподарських культур в указаній сукупності рослин.

19. Сукупність рослин в полі, що містить не-ВІ рослини-сховища і сукупність рослин за п. 17, де вказана сукупність рослин-сховищ складає приблизно менше ніж 10 95 від всіх сільськогосподарських культур на вказаному полі.

20. Спосіб запобігання виробленню у комахи совки трав'яної резистентності до токсину Сгу, де вказаний спосіб включає висівання насіння для отримання сукупності рослин за п. 19 і контактування вказаної комахи з указаною сукупністю трансгенних рослин.

21. Композиція для боротьби з лускокрилими шкідниками, що містить клітини, які експресують інсектицидно активну кількість білка, що містить коровий токсин СтгуїРа, і білка, що містить коровий токсин Стуї1Са.

22. Композиція за п. 21, що містить хазяїна, трансформованого так, щоб він експресував білок, що містить коровий токсин Сгу!Ра, і білок, що містить коровий токсин Сгуї!Са, де вказаним хазяїном є мікроорганізм або клітина рослини.

23. Спосіб боротьби з лускокрилими шкідниками, що включає обробку вказаних шкідників або середовища проживання цих шкідників інсектицидно активною кількістю композиції за п. 21.

24. Трансгенна рослина, що продукує білок Сту!БРа плюс білок Сту!їСа, плюс третій білок, вибраний з групи, що складається з білків МірзА, Сгу10, Стгу1Ве і СтутЕ.

25. Спосіб запобігання виробленню у комахи совки трав'яної резистентності до токсину Сгу, де вказаний спосіб включає висівання насіння для отримання сукупності рослин за п. 24, контактування вказаної комахи з указаною сукупністю трансгенних рослин.

26. Сукупність рослин в полі, що містить не-Ві рослини-сховища і сукупність трансгенних рослин за п. 24, де вказані не-ВІ рослини-сховища складають менше ніж приблизно 10 95 від всіх сільськогосподарських культур в указаній сукупності рослин.

27. Сукупність рослин за п. 26, де вказана сукупність рослин містить менше ніж 5 90 рослин-сховищ.

28. Спосіб запобігання виробленню у комахи совки трав'яної резистентності до токсину Сгу, де вказаний спосіб включає висівання насіння для отримання сукупності рослин за п. 26 або 27 і контактування вказаної комахи з указаною сукупністю трансгенних рослин.

29. Суміш насіння, що містить насіння не-ВІ рослин-сховищ і сукупність трансгенного насіння рослин за п. 24, де вказане насіння рослин-сховищ складає менше ніж 10 95 від всього насіння у вказаній суміші.

30. Сукупність рослин за будь-яким з пп. 5, 18 і 26, де вказані рослини займають площу понад 10 акрів.

31. Трансгенна рослина за будь-яким з пп. 1, 17 і 24, де вказана рослина вибрана з групи, що складається з кукурудзи, сої і бавовнику.

32. Трансгенна рослина за будь-яким з пп. 1, 17 і 24, де вказаною рослиною є рослина кукурудзи.

33. Клітина рослини за будь-яким з пп. 1, 17, 31 і 32, де вказана клітина рослини містить вказану ДНК, що кодує вказаний інсектицидний білок Стгу1 Са, і вказану ДНК, що кодує вказаний інсектицидний білок СтуїРа, і де вказаний інсектицидний білок Стуїба щонайменше на 99 95 ідентичний послідовності ЗЕО ІЮ МО:4, а вказаний інсектицидний білок Сгуї!Са щонайменше на 99 95 ідентичний послідовності ЗЕО ІЮ МО:5.

34. Трансгенна рослина за будь-яким з пп. 1, 17, 24, 31 і 32, де вказаний інсектицидний білок СтуїРа містить 5ЕО ІО МО:4, а вказаний інсектицидний білок Сту!Са містить 5ЕО ІЮО МО:5. ря їй дн ТЕ-ростти зр БУВ КАМ і ШРАМ! 5 угеотюрокінесмі віником нку ркма конт ЕМ Ку КедЖ жом Кенія ит ка ккеукех МІЯ КІМ ееКТКІяКетх Ме івек ех ченка МУК МТ Кот кін туе кв іІ Не Ія йАК с иівкі хну КТК ас ут кат ін ная ямка Мі Ка майки КК укрі ні жеута не мткзвтя і о наомем ех; ши п аа аа пт по а В І г Ко ме 34 з Ам х ванна звононв но пі ван МЕ вен маю нн ння: а вх ве 5 с вк ні Ен ше Моіанннни: виш шк нн: ми нини нн нн ША ї Щі 1 КІ є «Конні .Нх їі х мк а М ен ХВ я кни н ЗВ пес снід т ко Ві зеросественафения Дій ; З Я НЕ Ен ве же кед му не В Ми й жо нх ше Ж ж шен ня хво м» НАШ Шин ше В вм ак шк У БАН т ін УМ ДІВ ІН ННЯ МН ай МВ Вл ЧЕ І; я сожа й Шок т - со з о. й с жі Гея ЗЛЕ. -о ГП Е5Б518 ЕСЕ 28838288 885588 б: Ж й вв що я Б 5 ях 54 не НЕ БВ ши НН в НН вза БЕБО88: 55855 55335 в до Ж В я се з и со не и и п ВИ п и м В Си и с ЗВО ! Рослина, негативна ве ОТО 09 Росинна; позитивна по АН Контрольні рослини фіг. 1 о ак, в що - й че-СлуїСа я во Селва Їх В, - ре я З у я В ще ч 8-20 х. хх я Концентрація (нм)

Фіг. 7