RU2583288C2 - Применение cry1ab в комбинации с cry1be для управления резистентностью насекомых - Google Patents
Применение cry1ab в комбинации с cry1be для управления резистентностью насекомых Download PDFInfo
- Publication number
- RU2583288C2 RU2583288C2 RU2012129901/10A RU2012129901A RU2583288C2 RU 2583288 C2 RU2583288 C2 RU 2583288C2 RU 2012129901/10 A RU2012129901/10 A RU 2012129901/10A RU 2012129901 A RU2012129901 A RU 2012129901A RU 2583288 C2 RU2583288 C2 RU 2583288C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- plants
- plant
- protein
- cry1ab
- cry1be
- Prior art date
Links
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 200
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 145
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 113
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 claims abstract description 38
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 27
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 14
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 claims abstract description 11
- 241001147398 Ostrinia nubilalis Species 0.000 claims abstract description 9
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 claims abstract description 8
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 38
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 37
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 32
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 32
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 24
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 8
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 claims description 8
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 6
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 6
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 claims description 5
- ZHVOBYWXERUHMN-KVJKMEBSSA-N 3-[(3s,5r,8r,9s,10s,13s,14s,17s)-10,13-dimethyl-3-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2h-furan-5-one Chemical compound O([C@@H]1C[C@H]2CC[C@@H]3[C@@H]([C@]2(CC1)C)CC[C@]1([C@H]3CC[C@@H]1C=1COC(=O)C=1)C)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O ZHVOBYWXERUHMN-KVJKMEBSSA-N 0.000 claims description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 7
- 230000001934 delay Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 117
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 103
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 99
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 91
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 229920005618 ethylene copolymer bitumen Polymers 0.000 description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 241000724266 Broad bean mottle virus Species 0.000 description 22
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 19
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 19
- 230000009471 action Effects 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 12
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 9
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 5
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 5
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 4
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 1,3,4,6-tetrachloro-3a,6a-diphenylimidazo[4,5-d]imidazole-2,5-dione Chemical compound ClN1C(=O)N(Cl)C2(C=3C=CC=CC=3)N(Cl)C(=O)N(Cl)C12C1=CC=CC=C1 FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 3
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 3
- 108700003918 Bacillus Thuringiensis insecticidal crystal Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 3
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 3
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 3
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 2
- 241000223651 Aureobasidium Species 0.000 description 2
- 101150102464 Cry1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000122106 Diatraea saccharalis Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241000255967 Helicoverpa zea Species 0.000 description 2
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 2
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 2
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 241000190932 Rhodopseudomonas Species 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000011539 homogenization buffer Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589220 Acetobacter Species 0.000 description 1
- 244000235858 Acetobacter xylinum Species 0.000 description 1
- 235000002837 Acetobacter xylinum Nutrition 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 244000208874 Althaea officinalis Species 0.000 description 1
- 235000006576 Althaea officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N Bestatin Chemical compound CC(C)C[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N Bestatin Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 229920002799 BoPET Polymers 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 101150078024 CRY2 gene Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000190714 Gymnosporangium clavipes Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- DKNPRRRKHAEUMW-UHFFFAOYSA-N Iodine aqueous Chemical compound [K+].I[I-]I DKNPRRRKHAEUMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000005041 Mylar™ Substances 0.000 description 1
- 241001443590 Naganishia albida Species 0.000 description 1
- 241000033319 Naganishia diffluens Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 241001012098 Omiodes indicata Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000222051 Papiliotrema laurentii Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000500437 Plutella xylostella Species 0.000 description 1
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- 241000589615 Pseudomonas syringae Species 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 1
- 241000223253 Rhodotorula glutinis Species 0.000 description 1
- 241000223254 Rhodotorula mucilaginosa Species 0.000 description 1
- 241000080930 Robertkochia marina Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241001479507 Senecio odorus Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000222068 Sporobolomyces <Sporidiobolaceae> Species 0.000 description 1
- 241000123675 Sporobolomyces roseus Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000802194 Targalla delatrix Species 0.000 description 1
- 244000288561 Torulaspora delbrueckii Species 0.000 description 1
- 235000014681 Torulaspora delbrueckii Nutrition 0.000 description 1
- 241001495125 Torulaspora pretoriensis Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- 241000589636 Xanthomonas campestris Species 0.000 description 1
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N aebsf Chemical compound NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000005667 attractant Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000000853 biopesticidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M cetylpyridinium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+]1=CC=CC=C1 YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960001927 cetylpyridinium chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 230000031902 chemoattractant activity Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000004495 emulsifiable concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 244000037666 field crops Species 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- -1 fusion Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002346 iodo group Chemical group I* 0.000 description 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N isopropyl alcohol Natural products CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- 235000014666 liquid concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000003750 lower gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 235000001035 marshmallow Nutrition 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052615 phyllosilicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000006254 rheological additive Substances 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229950009811 ubenimex Drugs 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 239000004563 wettable powder Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Cultivation Of Plants (AREA)
- Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению, которое обладает инсектицидной активностью в отношении кукурузной листовой совки и кукурузного стеблевого мотылька, содержащему ДНК, кодирующую белок Cry1Ab, и ДНК, кодирующую белок Cry1Be и семени, а также к способу понижения развития устойчивости к белку Cry1Ab и Cry1Be у кукурузной листовой совки и кукурузного стеблевого мотылька с его использованием. Также раскрыта совокупность растений в поле, содержащая множество вышеуказанных трансгенных растений и растений, не являющихся Bacillus thuringiensis (не-Bt растения), и смесь семян, содержащая семена от не-Bt растений и множество вышеуказанных семян. Изобретение также относится к способу борьбы с кукурузным стеблевым мотыльком приведением в контакт указанного насекомого с белком Cry1Be и белком Cry1Ab, а также к способу получения растительных клеток, экспрессирующих белок Cry1Ab и белок Cry1Be. Изобретение позволяет эффективно бороться c кукурузной листовой совкой и кукурузным стеблевым мотыльком. 7 н. и 13 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 4 пр.
Description
Уровень техники
Люди выращивают кукурузу для получения продуктов питания и энергии. Люди также возделывают многие другие сельскохозяйственные культуры, включая соевые бобы и хлопчатник. Ежегодно миллиарды долларов тратятся на борьбу с насекомыми-вредителями, и еще миллиарды долларов теряются за счет ущерба, который они наносят. Синтетические органические химические инсектициды были основными инструментами, которые использовались для борьбы с насекомыми-вредителями, но биологические инсектициды, такие как инсектицидные белки, полученные из Bacillus thuringiensis (Bt), в некоторых областях сыграли весьма важную роль. Возможность получения устойчивых к насекомым растений посредством трансформации генов инсектицидных Bt-белков, привела к революционным преобразованиям в современном сельском хозяйстве, и подчеркнула важность и значение инсектицидных белков и их генов.
Некоторые Bt-белки использовали для создания устойчивых к насекомым трансгенных растений, которые к настоящему времени были успешно зарегистрированы и стали промышленно доступными. Они включают Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Fа и Cry3Bb в кукурузе, Cry1Aс и Cry2Ab в хлопчатнике и Cry3A в картофеле.
Промышленно-доступные продукты, экспрессирующие данные белки, экспрессируют один белок, за исключением тех случаев, когда желателен комбинированный спектр 2 инсектицидных белков (например, Cry1Ab и Cry3Bb в комбинации в кукурузе для обеспечения устойчивости соответственно к чешуекрылым вредителям и корневым нематодам), или когда независимое действие белков делает их пригодными в качестве инструмента для задержки развития резистентности у чувствительных популяций насекомых (например, Cry1Aс и Cry2Аb в комбинации в хлопчатнике для обеспечения управления резистентностью у табачной листовертки). Смотри также публикацию заявки на патент США № 2009/0313717, которая относится к белку Cry2 плюс Vip3Aa, Cry1F или Cry1A для борьбы с Helicoverpa zea или armigerain. Международная заявка WO 2009/132850 относится к Cry1F или Cry1A и Vip3Aa для борьбы с Spodoptera frugiperda. Публикация заявки на патент США № 2008/0311096 частично относится к Cry1Ab для борьбы с кукурузным стеблевым мотыльком, резистентным к Cry1F (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)).
То есть, некоторые свойства устойчивых к насекомым трансгенных растений, которые привели к быстрому и широкому внедрению данной технологии, также дали основание полагать, что в популяциях насекомых будет развиваться резистентность к инсектицидным белкам, продуцированным такими растениями. Было предложено несколько стратегий для того, чтобы сохранить применение Bt-признаков устойчивости к насекомым, которые включают применение действующих белков в высокой дозе в комбинации с «убежищем» и альтернативно с совместным размещением других токсинов (McGaughey et al. (1998) «B.t. Resistance Management», Nature Biotechnol., 16:144-146).
Для белков, выбранных для применения в стеках управления резистентностью насекомых (IRM), требуется проявлять их инсектицидный эффект независимо, так, чтобы резистентность, возникшая к одному белку, не придавала резистентности ко второму белку (т.е. отсутствовала перекрестная резистентность к белкам). Если, например, популяция вредителей, выбранная за счет наличия резистентности к «белку А», одновременно является восприимчивой к «белку В», то заявители утверждают, что отсутствует перекрестная резистентность и что комбинация белка А и белка В будет эффективной в задержке развития резистентности к одному белку А.
При отсутствии резистентных популяций насекомых можно провести прогностические оценки, основанные на других характеристиках, предположительно связанных с механизмом действия и возможностью развития перекрестной резистентности. Было предложено использовать опосредованное рецептором связывание для идентификации инсектицидных белков, для которых, вероятно, не характерна перекрестная резистентность (van Mellaert et al., 1999). Ключевым прогностическим показателем отсутствия перекрестной резистентности в данном подходе является тот факт, что инсектицидные белки не конкурируют за рецепторы у восприимчивых видов насекомых.
В том случае, когда два Bt-токсина конкурируют у насекомых за один и тот же рецептор, и если рецептор мутирует у этого насекомого таким образом, что один из токсинов больше не связывается с рецептором и в результате больше не проявляет инсектицидной активности против этого насекомого, то это может быть случаем, когда у насекомого также будет развиваться резистентность ко второму токсину (который конкурентно связан с тем же рецептором). То есть, насекомое обладает перекрестной резистентностью к обоим Bt-токсинам. Однако если два токсина связываются с двумя различными рецепторами, то это может быть показателем того, что насекомое не будет одновременно обладать резистентностью к этим двум токсинам.
Например, белок Cry1Fa используется для борьбы со многими чешуекрылыми насекомыми, включая кукурузного стеблевого мотылька (Hübner) и кукурузную листовую совку (FAW; Spodoptera frugiperda), и белок активен против огневки сахарного тростника (SCB; Diatraea saccharalis). Белок Cry1Fa, продуцированный в трансгенных растениях кукурузы, содержащий событие TC1507, ответственен за ведущий в отрасли признак резистентности насекомых в мероприятиях для борьбы с FAW. Белок Cry1Fa также входит в состав продуктов Herculex®, SmartStaxTM и WideStrikeTM.
Возможность проводить исследования, основанные на связывании (конкурентном или гомологичном) с рецептором с использованием белка Cry1Fa была ограничена, поскольку доступный обычный метод введения метки в белки для детектирования в тестах связывания с рецептором приводил к инактивации инсектицидной активности белка Cry1Fa.
Дополнительные Cry-токсины приводятся на веб-сайте официального комитета по номенклатуре B.t. (Crickmore et al., lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). В настоящее время известно почти 60 основных групп «Cry»-токсинов (Cry1-Cry59) с дополнительными Cyt- и VIP-токсинами и тому подобное. Многие из каждой нумерационной группы подразделяются на подгруппы под заглавной буквой, и подгруппы под заглавной буквой подразделяются на подподгруппы, обозначенные строчной буквой (например, Cry1 имеет A-L, и Cry1A имеет a-i).
Сущность изобретения
Настоящее изобретение частично относится к удивительному открытию того, что Cry1Ab и Cry1Be не конкурируют за сайты связывания в мембранных препаратах клеток кишечника кукурузного стеблевого мотылька (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)) или кукурузной листовой совки (FAW; Spodoptera frugiperda). Как это будет понятно специалистам в данной области с помощью данного раскрытия, растения, которые продуцируют два эти белка (включая инсектицидные фрагменты полноразмерных белков), могут задерживать или предупреждать развитие резистентности к любому одному из данных инсектицидных белков. Кукуруза и соевые бобы являются только некоторыми предпочтительными растениями. ECB представляет предпочтительный вредитель-мишень для данной пары токсинов.
Таким образом, настоящее изобретение частично относится к применению белка Cry1Ab в комбинации с белком Cry1Be. Растения (и территории, засаженные такими растениями), которые продуцируют оба таких белка, включены в объем настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также относится к тройным стекам или «пирамидам» из трех (или более) токсинов, в которых белки Cry1Ab и Cry1Be являются основной парой. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пирамид комбинация выбранных токсинов обеспечивает три сайта действия против ECB. Некоторые предпочтительные пирамидные комбинации с «тремя местами действия» включают основную пару белков по настоящему изобретению плюс Cry2A, Cry1I и DIG-3 в качестве третьего белка для целенаправленного действия на ECB. Такие конкретные тройные стеки будут, по настоящему изобретению, преимущественно и поразительно обеспечивать три сайта действия против ECB. Это может помочь снизить или элиминировать необходимость в территориях-«убежищах».
Несмотря на то, что настоящее изобретение раскрывается в данном документе в виде пары токсинов Cry1Ab и Cry1Be, которые по отдельности или в «пирамиде» из трех или более токсинов, которые обеспечивают устойчивость кукурузы к ECB, очевидно, понятно, что комбинации Cry1Ab и Cry1Be, описанные в данном документе, также можно использовать с дополнительными белками для целенаправленного воздействия на FAW на соевых бобах и кукурузе.
Также по настоящему изобретению можно добавить дополнительные токсины/гены. Например, если Cry1Fa подвергают стекингу с парой белков по настоящему изобретению (Cry1Fa и Cry1Be оба активны против FAW и ECB), то добавление одного дополнительного белка к данному тройному стеку, где четвертый добавленный белок направлен против ECB, будет обеспечивать три сайта действия против FAW, и три сайта действия против ECB. Такой добавленный белок (четвертый белок для направленного действия против FAW) можно выбрать из группы, состоящей из Cry1Fa, Vip3Ab и Cry1E. Это будет приводить к обеспечению стека из четырех белков, имеющего три сайта действия против двух насекомых (ECB и FAW).
Краткое описание таблиц
Таблица 1: приводятся примеры аминокислот из четырех классов аминокислот.
Краткое описание фигур
Фиг.1: представлен график, показывающий связывание в процентах меченого Cry1Ab с ECB BBMV по сравнению с Cry1Be.
Фиг.2: представлен график, показывающий связывание в процентах меченого Cry1Ab с FAW BBMV по сравнению с Cry1Be.
Фиг.3: представлен график, показывающий связывание в процентах меченого Cry1Be с FAW BBMV по сравнению с Cry1Ab.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение частично относится к удивительному открытию того, что Cry1Ab и Cry1Be не конкурируют друг с другом за сайты связывания в кишечнике кукурузного стеблевого мотылька (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)) или кукурузной листовой совки (FAW; Spodoptera frugiperda). Таким образом, белок Cry1Ab можно использовать в комбинации с белком Cry1Be в трансгенной кукурузе (и других растениях, например, хлопчатнике и соевых бобах) для задержки и предупреждения развития резистентности у ECB к любому одному из данных белков. Пара белков по настоящему изобретению может быть эффективной в защите растений (таких как растения кукурузы) от повреждения ECB с резистентностью к Cry. То есть, одним применением настоящего изобретения является зашита кукурузы и других экономически важных видов сельскохозяйственных культур от повреждения и потерь урожая, вызванных популяциями ECB, у которых может развиться резистентность к Cry1Ab или Cry1Be.
Таким образом, настоящее изобретение относится к стеку для управления резистентностью у насекомых (IRM), включающему Cry1Ab и Cry1Be, для предупреждения или подавления развития резистентности ECB к одному или обоим данным белкам.
Кроме того, несмотря на то, что настоящее изобретение, раскрытое в данном документе, относится к стеку IRM, содержащему Cry1Ab и Cry1Be, для предупреждения резистентности ECB к одному или обоим данным белкам, в объеме изобретения, раскрытого в данном документе, находится то, что один или оба Cry1Ab и Cry1Be можно адаптировать, самостоятельно или в комбинации, для предупреждения резистентности FAW к одному или обоим данным белкам.
Настоящее изобретение относится к композициям для борьбы с чешуекрылыми вредителями, содержащим клетки, которые продуцируют истинный токсин-содержащий белок Cry1Ab и истинный токсин-содержащий белок Cry1Be.
Изобретение дополнительно включает хозяина, трансформированного для продукции как инсектицидного белка Cry1Ab, так и инсектицидного белка Cry1Be, где указанный хозяин является микроорганизмом или растительной клеткой. Полинуклеотид(ы) по настоящему изобретению предпочтительно находится в генетической конструкции под контролем не-Bacillus thuringiensis промотора(ов). Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут содержать кодон, предпочтительный для применения в растениях для повышенной экспрессии.
Дополнительно предполагается, что изобретение относится к способу борьбы с чешуекрылыми вредителями, включающему контактирование указанных вредителей или окружающей среды указанных вредителей с эффективным количеством композиции, которая содержит инсектицидный белок Cry1Ab и дополнительно содержит инсектицидный белок Cry1Be.
Вариант осуществления изобретения относится к растению кукурузы, содержащему экспрессируемый в растении ген, кодирующий истинный токсин-содержащий белок Cry1Be, и экспрессируемый в растении ген, кодирующий истинный токсин-содержащий белок Cry1Ab, и семя такого растения.
Дополнительный вариант осуществления изобретения относится к растению кукурузы, где экспрессируемый в растении ген, кодирующий истинный токсин-содержащий белок Cry1Be, и экспрессируемый в растении ген, кодирующий истинный токсин-содержащий белок Cry1Ab, интрогрессированы в указанное растение кукурузы, и семени такого растения.
Как описано в примерах, опыты с конкурентным связыванием с рецептором с использованием меченных радиоактивной меткой белков Cry1Ab и Cry1Be показывают, что белок Cry1Be не конкурирует за связывание в тканях ECB или FAW, с которыми связывается Cry1Ab. Данные результаты также указывают на то, что комбинация белков Cry1Ab и Cry1Be может быть эффективным средством для подавления развития резистентности в популяциях ECB и FAW к одному из двух данных белков. Таким образом, основываясь частично на данных, описанных в настоящем документе, полагается, что совместная продукция (стекинг) белков Cry1Ab и Cry1Be может использоваться для высокоэффективного стека IRM для ECB.
К этой паре можно добавить другие белки. Например, настоящее изобретение также частично относится к тройным стекам или «пирамидам» из трех (или более) токсинов, в которых Cry1Ab и Cry1Be являются основной парой. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пирамид выбранные токсины имеют три отдельных сайта действия против FAW. Некоторые предпочтительные пирамидные комбинации с «тремя сайтами действия» включают основную пару по настоящему изобретению плюс Cry1Fa, Vip3Ab, Cry1C, Cry1D или Cry1E в качестве третьего белка для целенаправленного действия на FAW. Данные конкретные тройные стеки по настоящему изобретению будут преимущественно и поразительно обеспечивать три места сайта против FAW. Это поможет снизить или элиминировать потребность в территориях-убежищах. Под выражением «отдельные сайты действия» понимается, что любой из данных белков не вызывает перекрестной резистентности в другом.
К настоящему изобретению также можно добавить дополнительные токсины/гены. Например, если Cry1Fa входит в состав стека с парой белков по настоящему изобретению (оба Cry1Ab и Cry1Be активны против обоих FAW и кукурузного стеблевого мотылька (ECB)), то добавление одного дополнительного белка к данному тройному стеку, где четвертый добавленный белок направлен против ECB, будет обеспечиваться три сайта действия против FAW и три сайта действия против ECB. Данный добавленный белок (четвертый белок) можно выбрать из группы, состоящей из Cry2A, Cry1I и DIG-3 (смотри заявку на патент США № 61/284278 (поданную 16 декабря 2009) и заявку на патент США № 2010/00269223). Это будет приводить к получению стека из четырех белков, содержащего три сайта действия против насекомых (ECB и FAW).
Таким образом, одной возможностью внедрения является применение пары белков по настоящему изобретению в комбинации с третьим токсином/геном и применение данного тройного стека для подавления развития резистентности у ECB и/или FAW к любому из данных токсинов. Следовательно, настоящее изобретение также частично относится к тройным стекам или «пирамидам» из трех (или более) токсинов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пирамид выбранные токсины имеют три отдельных сайта действия против ECB и/или FAW.
Среди возможностей внедрения по настоящему изобретению будет применение двух, трех или более белков из белков по настоящему изобретению в районах с возделыванием сельскохозяйственных культур, где могут развиться резистентные популяции ECB и/или FAW.
Руководство по применению Cry1Fa и Cry1Be (для борьбы с ECB и/или FAW) смотри в заявке на патент США № 61/284290 (поданной 16 декабря 2009). С Cry1Fa, активным против ECB (и FAW), Cry1Ab плюс Cry1Be, плюс Cry1Be по настоящему изобретению преимущественно и удивительно обеспечиваются три сайта действия против ECB. Это может помочь снизить или элиминировать потребность в территориях-убежищах.
Белок Cry1Fa входит в состав продуктов Herculex®, SmartStaxTM и WideStrikeTM. Пару генов по настоящему изобретению (Cry1Ab и Cry1Be) можно объединить, например, в продукте на основе Cry1Fa, таком как Herculex®, SmartStaxTM и WideStrikeTM. Следовательно, пара белков по настоящему изобретению может быть эффективной в снижении давления отбора на данные и другие белки. Таким образом, пару белков по настоящему изобретению можно использовать в комбинациях из трех генов для кукурузы и других растений (например, хлопчатника и соевых бобов).
Как уже обсуждалось выше, к настоящему изобретению также можно добавить дополнительные токсины/гены. Для целенаправленного воздействия на ECB можно использовать Cry2A, Cry1I и/или DIG-3. Смотри, например, заявку на патент США № 61/284278 (поданную 16 декабря 2009) и заявку на патент США № 2010/00269223. Информацию по комбинации Cry1F и Cry1Ab (для борьбы с ECB) смотри в публикации заявки на патент США № 2008/0311096.
Растения (и территории, засаженные такими растениями), которые продуцируют любую из комбинаций белков по настоящему изобретению, включаются в объем настоящего изобретения. Также можно добавить дополнительные токсины/гены, но конкретные стеки, обсужденные выше, преимущественно и поразительно обеспечивают многочисленные сайты действия против ECB и/или FAW. Это может помочь снизить или элиминировать потребность в территориях-убежищах. Таким образом, поле площадью более 10 акров, засаженное такими растениями, включается в объем изобретения.
GENBANK также можно использовать для получения последовательностей любого из генов и белков, которые обсуждаются в данном документе. Смотри Приложение А ниже. Также можно использовать патенты. Например, в патенте США № 5188960 и патенте США № 5827514 описаны истинный токсин-содержащие белки Cry1F, подходящие для применения в осуществлении изобретения. В патенте США № 6218188 описаны ДНК-последовательности, оптимизированные для применения в растениях, кодирующие истинные токсин-содержащие белки Cry1Fa, которые подходят для использования в настоящем изобретении.
Комбинации белков, описанные в данном документе, можно использовать для борьбы с чешуекрылыми вредителями. Взрослые чешуекрылые насекомые, бабочки и мотыльки питаются, главным образом, нектаром цветов и являются основными эффекторами опыления. Почти все личинки чешуекрылых насекомых, т.е. гусеницы, питаются на растениях, и многие из них являются серьезными вредителями. Гусеницы питаются на поверхности и внутри листьев, или на корнях или стебле растений, тем самым лишая растение питательных веществ и часто разрушая физическую поддерживающую структуру растения. Кроме того, гусеницы питаются на фруктах, хлопке и хранящихся зернах, а также цветах, разрушая эти продукты, предназначенные для продажи, или серьезно снижают их качество. В том смысле, в котором в данном документе используется термин «чешуекрылые вредители», он относится к различным стадиям развития вредителя, включая личиночные стадии.
Некоторые химерные токсины по настоящему изобретению включают полный N-концевой фрагмент, соответствующий истинному токсину Bt-токсина, в той же точке после конца фрагмента истинного токсина белок имеет переход в гетерологичную последовательность протоксина. N-концевой, активный в качестве инсектицида фрагмент токсина в Bt-токсине, далее относится к «истинному токсину». Переход сегмента истинного токсина в сегмент гетерологичного протоксина находится примерно в соединении токсина/протоксина, или альтернативно фрагмент нативного протоксина (простирающийся за фрагментом истинного токсина) может сохраниться, с переходом в гетерологичный протоксин, расположенным даунстрим.
В качестве примера один химерный токсин по настоящему изобретению имеет полный фрагмент истинного токсина белка Cry1Ab (аминокислоты 1-601) и/или гетерологичный протоксин (примерно аминокислоты 602 до С-конца). В одном предпочтительном варианте осуществления фрагмент химерного токсина, содержащий протоксин, получают из белка-токсина Cry1Ab. В предпочтительном варианте осуществления фрагмент химерного токсина, содержащий протоксин, получают из белка-токсина Cry1Ab.
Специалистам в данной области, очевидно, понятно, что Bt-токсины, даже внутри определенного класса, такого как Cry1Be, до некоторой степени будут варьировать в длине и точном положении перехода от фрагмента истинного токсина к фрагменту протоксина. Как правило, токсины Cry1Be имеют длину примерно от 1150 до примерно 1200 аминокислот. Обычно переход от фрагмента истинного токсина к фрагменту протоксина составляет примерно от 50% до примерно 60% от полной длины токсина. Химерный токсин по настоящему изобретению будет включать полную экспансию данного N-концевого фрагмента истинного токсина. Таким образом, химерный токсин будет включать, по меньшей мере, примерно 50% от полной длины Cry1Be. Это будет составлять, по меньшей мере, примерно 590 аминокислот. В отношении фрагмента протоксина, то полная экспансия фрагмента протоксина Cry1Ab будет простираться от конца фрагмента истинного токсина до С-конца молекулы.
Гены и токсины. Гены и токсины, пригодные для применения по настоящему изобретению, включают не только раскрытые полноразмерные последовательности, но также фрагменты данных последовательностей, варианты, мутанты и слитые белки, которые сохраняют специфическую пестицидную активность токсинов, конкретно приведенных в качестве примера. В том смысле, в котором в данном документе используются термины «варианты» или «вариации» генов, они относятся к нуклеотидным последовательностям, которые кодируют одни и те же токсины, или которые кодируют эквивалентные токсины, обладающие пестицидной активностью. В том смысле, в котором в данном документе используется термин «эквивалентные токсины», он относится к токсинам, обладающим такой же или по существу такой же биологической активностью против вредителей-мишеней, как и токсины по настоящему изобретению.
В том смысле, в котором в данном документе используется этот термин, границы представляют примерно 95% (Cry1Ab's и Cry1Be's), 78% (Cry1Ab's и Cry1Be's) и 45% (Cry1's) идентичность последовательностей согласно «Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins», N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998), Vol. 62:807-813. Эти пороги отсечения молекулярной массы также могут быть применимы только к истинным токсинам.
Специалистам в данной области, очевидно, понятно, что гены, кодирующие активные токсины, можно идентифицировать и получить несколькими способами. Конкретные гены или фрагменты генов, приведенные в качестве примера, можно получить из изолятов, депозированных в коллекции культур, как описано выше. Данные гены или их фрагменты, или варианты, также можно сконструировать синтетическим путем, например, при использовании синтезатора генов. Вариации генов можно легко сконструировать с использованием обычных способов получения точечных мутаций. Также фрагменты данных генов можно получить с использованием промышленно доступных экзонуклеаз или эндонуклеаз, следуя стандартным процедурам. Например, можно использовать ферменты, такие как Bal31, или сайт-направленный мутагенез для методичного отсечения нуклеотидов от концов таких генов. Также гены, которые кодируют активные фрагменты, можно получить с использованием различных рестриктаз. Протеазы можно использовать для непосредственного получения активных фрагментов данных токсинов.
Фрагменты и эквивалентные варианты, которые сохраняют пестицидную активность приведенных в качестве примера токсинов, будут находиться в объеме настоящего изобретения. Также за счет вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотные последовательности, раскрытые в данном документе. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же или по существу одни и те же токсины. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения. В том смысле, в котором в данном документе используется термин «по существу одни и те же» последовательности, он относится к последовательностям, которые имеют аминокислотные замены, делеции, добавления или инсерции, которые не оказывают существенного отрицательного влияния на пестицидную активность. Фрагменты генов, кодирующих белки, которые сохраняют пестицидную активность, также входят в объем данного определения.
Дополнительным способом идентификации генов, кодирующих токсины, и фрагментов генов, пригодных для настоящего изобретения, является применение олигонуклеотидных зондов. Такие зонды представляют детектируемые нуклеотидные последовательности. Эти последовательности можно детектировать с использованием соответствующей метки или их можно сделать изначально флуоресцентными, как описано в международной заявке WO 93/16094. Как хорошо известно в данной области, если молекула зонда и образец нуклеиновой кислоты гибридизуются с образованием сильной связи между двумя молекулами, то разумно предположить, что зонд и образец имеют значительную гомологию. Предпочтительно гибридизацию проводят в жестких условиях с использованием методов, известных в данной области, описанных, например, Keller G.H., M.M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Некоторые примеры концентраций солей и комбинаций температуры являются следующими (в порядке увеличения жесткости): 2X SSPE или SSC при комнатной температуре; 1X SSPE или SSC при 42°С; 0,1X SSPE или SSC при 42°С; 0,1X SSPE или SSC при 65°С. Детектирование зонда обеспечивает способ определения известным путем того, имела ли место гибридизация. Такой анализ зонда обеспечивает быстрый способ идентификации генов, кодирующих токсины по настоящему изобретению. Нуклеотидные сегменты, которые используются в качестве зондов по изобретению, можно синтезировать с использованием ДНК-синтезатора и стандартных методов. Такие нуклеотидные последовательности также можно использовать в качестве ПЦР-праймеров для амплификации генов по настоящему изобретению.
Вариантные токсины. Некоторые токсины по настоящему изобретению конкретно приводятся в качестве примера в данном документе. Поскольку данные токсины являются только примерами токсинов по настоящему изобретению, то, очевидно, понятно, что настоящее изобретение включает вариантные или эквивалентные токсины (и нуклеотидные последовательности, кодирующие эквивалентные токсины), обладающие такой же или аналогичной пестицидной активностью примерного токсина. Эквивалентные токсины должны обладать аминокислотной гомологией с примерным токсином. Как правило, такая аминокислотная гомология будет составлять более 75%, предпочтительно более 90% и наиболее предпочтительно более 95%. Аминокислотная гомология будет наиболее высокой в наиболее важных областях токсина, которые отвечают за биологическую активность или принимают участие в определении трехмерной конфигурации, которая в конечном итоге ответственна за биологическую активность. В этом отношении приемлемы некоторые аминокислотные замены, и можно ожидать, что такие замены находятся в областях, которые не являются важными для проявления активности, или представляют собой консервативные аминокислотные замены, которые не оказывают отрицательного влияния на трехмерную конфигурацию молекулы. Например, аминокислоты можно разделить на следующие классы: неполярные, незаряженные полярные, основные и кислые. Консервативные замены, посредством которых аминокислота одного класса замещается другой аминокислотой того же типа, находятся в объеме настоящего изобретения, при условии, что замена существенно не изменяет биологическую активность соединения. Ниже приводится перечень примеров аминокислот, относящихся к каждому классу.
В некоторых случаях также можно провести неконсервативные замены. Критическим фактором является то, что такие замены не должны существенно снижать биологическую активность токсина.
Рекомбинантные хозяева. Гены, кодирующие токсины по настоящему изобретению, можно ввести в широкий ряд микробных или растительных хозяев. Экспрессия гена токсина, прямо или опосредованно, приводит к внутриклеточной продукции и сохранению пестицида. Коньюгационный перенос и рекомбинантный перенос можно использовать для получения Bt-штамма, который экспрессирует оба токсина по настоящему изобретению. Также можно трансформировать другие микроорганизмы-хозяева одним или обоими генами токсинов для получения синергического эффекта. Относительно подходящих микроорганизмов-хозяев, например, Pseudomonas, то микробы можно применить в положение вредителя, где они будут пролиферировать и поглощаться. Результатом является борьба с вредителем. Альтернативно микроорганизм, содержащий ген токсина, можно обработать в условиях, которые пролонгируют активность токсина и стабилизируют клетку. Затем на обработанную клетку, которая сохраняет токсическую активность, можно воздействовать средой вредителя-мишени.
В том случае, когда ген Bt-токсина вводят в микроорганизм-хозяин с помощью подходящего вектора, и на указанный хозяин воздействуют средой в живом состоянии, то важно, чтобы использовались определенные микроорганизмы-хозяева. Выбирают микроорганизмы-хозяева, о которых известно, что они обитают в «фитосфере» (филлоплане, филлосфере, ризосфере и/или ризоплане) одной или более интересующих культур. Данные микроорганизмы выбирают таким образом, чтобы они были способны успешно конкурировать в определенной окружающей среде (культура и другие насекомые-обитатели) с микроорганизмами дикого типа для обеспечения стабильного поддержания и экспрессии гена, экспрессирующего полипептид-пестицид, и желательно, обеспечения повышенной защиты пестицида от деградации и инактивации в окружающей среде.
Известно большое количество микроорганизмов, которые обитают в филлоплане (на поверхности листьев растений) и/или ризосфере (в почве, окружающей корни растений) широкого ряда важных сельскохозяйственных культур. Такие микроорганизмы включают бактерии, водоросли и грибы. Особый интерес представляют микроорганизмы, такие как бактерии, например, родов Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophillius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azobacter, Leuconostoc и Alacaligenes; грибы, в частности, дрожжи, например, родов Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula и Aureobasidium. Особый интерес представляют такие виды бактерий, которые обитают в фитосфере, как Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroids, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus и Azotobacter vinlandii, и виды дрожжей фитосферы, такие как Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae и Aureobasidium pollulans. Особый интерес представляют пигментированные микроорганизмы.
Имеется большое количество способов интродукции Bt-гена, кодирующего токсин, в микроорганизм-хозяин в условиях, которые обеспечивают стабильное сохранение и экспрессию гена. Эти способы хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, в патенте США № 5135867, который включен в данный документ для сведения.
Обработка клеток. Bacillus thuringiensis или рекомбинантные клетки, экспрессирующие Bt-токсины, можно обработать для пролонгирования активности токсинов и стабилизации клетки. Пестицидная микрокапсула, которая образуется, содержит Bt-токсин или Bt-токсины в клеточной структуре, которая стабилизирована и будет защищать токсин, когда микрокапсула подвергается воздействию окружающей среды вредителя-мишени. Подходящие клетки-хозяева могут включать прокариоты или эукариоты, и обычно ограничиваются клетками, которые не продуцируют веществ, токсичных для высших организмов, таких как млекопитающие. Однако можно использовать микроорганизмы, которые продуцируют вещества, токсичные для высших организмов, в том случае, когда токсичные вещества являются нестабильными, или их содержание является достаточно низким для того, чтобы избежать проявления любой возможной токсичности для млекопитающего-хозяина. В качестве хозяев особый интерес представляют прокариоты и низшие эукариоты, такие как грибы.
При обработке обычно клетки должны быть интактными и в основном находиться в пролиферативной форме, лучше не в форме спор, хотя, в некоторых случаях можно использовать споры.
Обработку клетки микроорганизма, например, микроорганизма, содержащего ген или гены Bt-токсина, можно проводить химическим или физическим методами, или комбинацией химического и/или физического методов, при условии, что метод не оказывает отрицательного влияния на свойства токсина и не снижает способности клеток защищать токсин. Примерами химических реагентов являются галогенированные соединения, в частности, галогенсодержащие соединения с 17-80 атомами. Конкретнее, можно использовать иод в мягких условиях и в течение достаточного периода времени для достижения желаемых результатов. Другие подходящие способы включают обработку альдегидами, такими как глутаральдегид; противоинфекционными препаратами, такими как зефиран хлорид и цетилпиридиний хлорид; спиртами, такими как изопропиловый и этиловый спирт; различными гистологическими фиксаторами, такими как иодный раствор Люголя, фиксатор Буэна, различные кислоты и фиксатор Хелли (смотри Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman and Company, 1967) или обработку комбинацией физического (нагревание) и химического агентов, которые сохраняют и пролонгируют активность токсина, продуцированного в клетке, когда клетку вводят в среду хозяина. Примерами физических методов являются коротковолновое облучение, такое как гамма-облучение, и рентгеновское облучение, УФ-облучение, лиофилизация и тому подобное. Способы обработки клеток микроорганизмов раскрыты в патентах США № 4695455 и 4695462, которые включены в данный документ для сведения.
Как правило, клетки имеют повышенную стабильность структуры, которая повышает устойчивость к воздействию условий окружающей среды. В тех случаях, когда пестицид находится в проформе, то метод обработки клеток следует выбрать таким образом, чтобы не ингибировать процессинг проформы в зрелую форму пестицида под действием патогена вредителя-мишени. Например, формальдегид будет поперечно сшивать белки и может ингибировать процессинг проформы полипептида-пестицида. Способ обработки должен сохранять, по меньшей мере, значительную часть биологической доступности или биологической активности токсина.
Характеристики, представляющие особый интерес при выборе клетки-хозяина для целей продукции, включают простоту введения Bt-гена или Bt-генов хозяину, доступность экспрессионных систем, эффективность экспрессии, стабильность пестицида в хозяине и наличие дополнительных генетических свойств. Характеристики, представляющие особый интерес для применения в качестве микрокапсулы пестицида, включают защитные свойства для пестицида, такие как толщина клеточных стенок, пигментация и внутриклеточная упаковка или образование телец включения; выживаемость в водной среде; отсутствие токсичности для млекопитающих; привлекательность для захвата вредителями; простота в индукции гибели и фиксации без повреждения токсина и тому подобное. Другие факторы включают простоту формуляции и обращения, экономические соображения, стабильность при хранении и тому подобное.
Рост клеток. Клетку-хозяин, содержащую инсектицидный Bt-ген или Bt-гены, можно культивировать в любой обычной питательной среде, в которой ДНК-конструкция обеспечивает избирательное преимущество, обеспечивая селективную среду, в которой по существу все или все клетки сохраняют Bt-ген. Затем можно собрать такие клетки с использованием обычных методов. Альтернативно клетки можно обработать до сбора.
Bt-клетки, продуцирующие токсины по изобретению, можно культивировать с использованием обычных в данной области сред и методов ферментации. После осуществления цикла ферментации бактерии можно собрать первым отделением спор и кристаллов Bt из культурального бульона способами, известными в данной области. Выделенные споры и кристаллы Bt можно формулировать в виде смачиваемого порошка, жидкого концентрата, гранул и других препаративных форм с добавлением поверхностно-активных веществ, диспергаторов, инертных носителей и других компонентов для облегчения обращения с ними и их применения против конкретных вредителей-мишеней. Такие препаративные формы и способы применения известны в данной области.
Препаративные формы. Формулированные гранулы-приманки, содержащие аттрактант и споры, кристаллы и токсины Bt-изолятов, или рекомбинантные микроорганизмы, содержащие гены, полученные из Bt-изолятов, раскрытых в данном документе, можно вносить в почву. Формулированный продукт также можно применять в виде покрытия семен или агента для обработки корней, общей обработки растений на более поздних стадиях вегетационного периода. Для обработки растений и почвы Bt-клетками можно использовать смачиваемые порошки, гранулы или дусты, которые получают смешением с различными инертными веществами, такими как неорганические минеральные вещества (филлосиликаты, карбонаты, сульфаты, фосфаты и тому подобное) или материалы растительного происхождения (такие как измельченная сердцевина кукурузного початка, рисовая шелуха, скорлупа орехов и тому подобное). Препаративные формы могут включать адъюванты прилипатели, стабилизирующие агенты, другие пестицидные добавки или поверхностно-активные вещества. Жидкие препаративные формы могут быть на водной или неводной основе, и их можно применять в виде пен, гелей, суспензий, эмульгируемых концентратов или тому подобное. Ингредиенты могут включать реологическую добавку, поверхностно-активные вещества, диспергаторы или полимеры.
Специалистам в данной области, очевидно, понятно, что концентрация пестицида будет варьировать в широких пределах в зависимости от природы конкретной формуляции, в частности, является ли она концентратом или предназначена для непосредственного применения. Пестицид будет находиться в концентрации, составляющей, по меньшей мере, 1% мас., или концентрация может равняться 100% мас. Сухие препаративные формы будут содержать примерно 1-95% мас. пестицида, в то время как жидкие препаративные формы обычно будут содержать примерно 1-60% мас. твердых частиц в жидкой фазе. В препаративных формах обычно будет находиться примерно от 102 до примерно 104 клеток/мг. Такие препаративные формы будут применяться в количествах примерно от 50 мг (жидкость или сухое вещество) до 1 кг или более на га.
Препаративные формы можно применять в среде обитания чешуекрылого вредителя, например, на листья или в почву, опрыскиванием, опылением, поливом или тому подобное.
Трансформация растений. Предпочтительный рекомбинантный хозяин для продукции инсектицидных белков по настоящему изобретению представляет собой трансформированное растение. Гены, кодирующие Bt-белки токсины, раскрытые в данном документе, можно вставить в растительные клетки с использованием различных способов, хорошо известных в данной области. Например, имеется большое количество клонирующих векторов, содержащих репликационную систему Escherichia coli, и маркер, который позволяет отобрать трансформированные клетки для проведения инсерции чужеродных генов в высшие растения. Векторы включают, среди прочего, например, pBR322, серии pUC, серии M13mp, pACYC184. Следовательно, фрагмент ДНК, содержащий последовательность, кодирующую Bt-белок токсин, можно вставить в вектор в подходящем сайте рестрикции. Полученную плазмиду используют для трансформации E. coli. Клетки E. coli культивируют в подходящей питательной среде, затем собирают и лизируют. Плазмиду выделяют. Как правило, проводят анализ последовательности, рестрикционный анализ, электрофорез и используют другие биохимические-молекулярные биологические методы в качестве методов анализа. После каждой манипуляции используемую ДНК-последовательность можно расщепить и присоединить к следующей ДНК-последовательности. Каждую последовательность плазмиды можно клонировать в одну и ту же или разные плазмиды. В зависимости от способа вставки желаемых генов в растение, могут быть необходимы другие ДНК-последовательности. Например, если для трансформации растительной клетки используют Ti- или Ri-плазмиду, то, по меньшей мере, правую границу, но часто правую и левую границу Т-ДНК Ti- или Ri-плазмиды, следует соединить в виде фланкирующей области генов, предназначенных для вставки. Применение Т-ДНК для трансформации растительных клеток интенсивно исследовалось и в достаточной мере описано в Европейском патенте 120516, Lee and Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al. (1986) и An et al. (1985), и хорошо известно в данной области.
После интеграции вставленной ДНК в геном растения она является относительно стабильной. Обычно вектор для трансформации содержит селектируемый маркер, который придает трансформированным растительным клеткам резистентность, среди прочего, к биоциду или антибиотику, такому как биалафос, канамицин, G418, блеомицин или гигромицин. Индивидуально используемый маркер, следовательно, позволит отобрать трансформированные клетки лучше, чем клетки, которые не содержат вставленную ДНК.
Имеется большое количество методов для инсерции ДНК в растительную клетку-хозяин. Такие методы включают трансформацию Т-ДНК с использованием Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes в качестве трансформирующего агента, слияние, инъекцию, биологическую баллистику (бомбардировку микрочастицами) или электропорацию, а также другие возможные методы. Если для трансформации используют Agrobacteria, то ДНК, предназначенную для вставки, клонируют в специальные плазмиды, а именно в промежуточный вектор или бинарный вектор. Промежуточные векторы можно интегрировать в Ti- или Ri-плазмиду гомологичной рекомбинацией благодаря последовательностям, которые являются гомологичными к последовательностям Т-ДНК. Ti- или Ri-плазмида также содержит vir-область, необходимую для переноса Т-ДНК. Промежуточные векторы не могут реплицироваться самостоятельно в Agrobacteria. Промежуточный вектор можно перенести в Agrobacterium tumefaciens с помощью плазмиды-хелпера (конъюгацией). Бинарные векторы могут реплицироваться в E. coli и Agrobacteria. Они включают селективный ген-маркер и линкер или полилинкер, который вставлен в рамку правой и левой пограничных областей Т-ДНК. Их можно непосредственно трансформировать в Agrobacteria (Holsters et al., 1978). При использовании в качестве клетки-хозяина Agrobacterium должны содержать плазмиду, несущую vir-область. Vir-область необходима для переноса Т-ДНК в растительную клетку. Могут содержаться дополнительные Т-ДНК. Трансформированную таким образом бактерию используют для трансформации растительных клеток. Экспланты растений преимущественно можно культивировать с Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes для переноса ДНК в растительную клетку. Затем можно регенерировать целые растения из инфицированного растительного материала (например, кусочков листа, сегментов стебля, корней, а также протопластов или культивированных в суспензии клеток) в подходящей среде, которая может содержать антибиотики или биоциды по изобретению. Затем полученные таким образом растения можно тестировать на присутствие вставленной ДНК. Отсутствуют особые требования в отношении плазмид в случае методов инъекции и электропорации. Можно использовать обычные плазмиды, например, такие как производные pUC.
Трансформированные клетки развиваются в растениях обычным путем. Они могут образовать зародышевые клетки и передать трансформированный признак(и) потомству растений. Такие растения можно выращивать обычным путем и скрещивать с растениями, которые имеют те же трансформированные наследственные факторы или другие наследственные факторы. Полученные гибриды имеют соответствующие фенотипические свойства.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения растения следует трансформировать генами, в которых кодон предпочтительно оптимизирован для применения в растениях. Смотри, например, патент США № 5380831, который включен в данный документ для сведения. Несмотря на то, что в данном документе в качестве примера приводятся усеченные токсины, хорошо известно в области Bt-токсинов, что токсины массой 130 kDa (полная длина) имеют N-концевой фрагмент, который является истинным токсином, и С-концевой фрагмент является «хвостом» протоксина. Таким образом, соответствующие «хвосты» можно использовать с усеченными/истинными токсинами по настоящему изобретению. Смотри, например, патент США № 6218188 и патент США № 6673990. Кроме того, в данной области известны способы получения синтетических Bt-генов для применения в растениях (Stewart and Burgin, 2007). Одним неограничивающим примером предпочтительного трансформированного растения является фертильное растение кукурузы, содержащее экспрессируемый в растении ген, кодирующий белок Cry1Ab, и дополнительно содержащий второй экспрессируемый в растении ген, кодирующий белок Cry1Be.
Перенос (или интрогрессию) признака(ов), определяемого Cry1Ab и Cry1Be, в инбредные линии кукурузы можно осуществить рекуррентной селекцией, например, обратным скрещиванием. В этом случае требуемую рекуррентную родительскую форму вначале скрещивают с инбредным донором (нерекуррентной родительской формой), который несет соответствующий ген(ы) для признаков, определяемых Cry1Ab и Cry1Be. Потомство данного гибрида затем обратно скрещивают с рекуррентной родительской формой с последующей селекцией полученного потомства на требуемый признак(признаки), который предназначен для переноса от нерекуррентной родительской формы. После трех, предпочтительно, четырех, более предпочтительно пяти и более поколений обратных гибридов с рекуррентной родительской формой с селекцией на требуемый признак(и), потомство будет гетерозиготным в отношении локусов, контролирующих признак(и), который переносится, но будет таким же как рекуррентная родительская форма в отношении большинства или почти всех других генов (смотри, например, Poehlman&Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376).
Стратегии управления резистентностью насекомых (IRM). Например, Roush et al. описывают стратегии, основанные на двух токсинах, так называемое «нагромождение» или «стекинг» для контроля инсектицидных трансгенных культур (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).
На веб-сайте Агентства по защите окружающей среды США (epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) приводятся следующие требования для обеспечения нетрансгенных (т.е. не-Bt) убежищ (раздел не-Bt культуры/кукуруза) для применения с трансгенными культурами, продуцирующими один Bt-белок, активный против вредителей-мишеней.
«Специфическими структурированными требованиями для Bt-защищенной (Cry1Ab и Cry1Fa) кукурузы от кукурузного стеблевого мотылька продукты являются следующими:
структурированные убежища: 20% убежищ не-чешуекрылых с Bt-кукурузой в Кукурузном поясе; 50% убежищ не-чешуекрылых с Bt-кукурузой в кукурузном поясе
Блоки
1. Внутренний (т.е. в Bt-поле)
2. Внешний (т.е. отдельные поля в пределах 1/2 мили (1/4 мили, если возможно) от Bt-поля для максимального произвольного скрещивания)
Полосы в поле
Полосы должны иметь ширину, по меньшей мере, 4 ряда (предпочтительно 6 рядов) для снижения эффектов, связанных с передвижением личинок».
Кроме того, Национальная Ассоциация производителей кукурузы на их веб-сайте (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) также приводит аналогичные указания в отношении требований для убежищ. Например:
«Требования в отношении IRM кукурузного стеблевого мотылька:
засадить, по меньшей мере, 20% территорий с кукурузой гибридами убежища;
в районах с производством хлопка убежище должно составлять 50%;
должны высаживаться в пределах 1/2 мили от гибридов убежища;
убежище можно засевать в виде полос в Bt-поле; полосы убежища должны быть шириной, по меньшей мере, 4 ряда
убежище можно обработать обычными пестицидами только, если достигаются экономические пороги для вредителя-мишени;
нельзя использовать опрыскиваемые инсектициды на основе Bt на кукурузе убежища;
соответствующее убежище должно быть засажено в каждом хозяйстве с Bt-кукурузой».
Как утверждает Roush et al. (на страницах 1780 и 1784 правой колонки, например), «стекинг» или «нагромождение» двух различных белков, где каждый эффективен против вредителей-мишеней и с низкой или отсутствием перекрестной резистентности, позволяет использовать меньшее убежище. Roush предлагает, что при наличии успешного стека размер убежища менее 10% может обеспечить сравнимое с примерно 50% убежищем управление резистентностью для одного (непирамидного) признака. Для имеющихся в настоящее время пирамидированных продуктов Bt-кукурузы Агентство по охране окружающей среды требует наличия значительно меньшего (в общем 5%) структурированного убежища для засевания не-Bt-кукурузой по сравнению с продуктами с одним признаком (в общем 20%).
Имеются различные пути обеспечения эффектов IRM убежища, включая различные геометрические паттерны высадки в полях (упомянутые выше) и смеси семян в мешках, как дополнительно обсуждается Roush et al. (выше) и в патенте США № 6551962.
Все приведенные выше или аналогичные соотношения убежища можно использовать для настоящих двойных или тройных стеков или пирамид. Для тройных стеков с тремя сайтами действия против одного вредителя-мишени целью будет нулевое убежище (или, например, менее чем 5% убежище). Это особенно верно для производственных земель, например, площадью более 10 акров.
Все патенты, заявки на патент, предварительные заявки и публикации, относящиеся к или цитированные в данном документе, в полном объеме включены в данный документ для сведения в той степени, до которой они не противоречат положениям данной заявки.
Если не указано или не подразумевается иначе, то в том смысле, в котором в данном документе используются термины «а», «an» и «the», они означают, «по меньшей мере, один».
Последующие примеры иллюстрируют способы осуществления изобретения. Примеры не следует рассматривать в качестве ограничивающих изобретение. Все проценты выражены в % мас., и все соотношения смесей растворителей выражены в объемных соотношениях, если не указано иначе. Все значения температуры выражены в градусах Цельсия.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Мечение
125
I Cry-белков
Иодирование Cry-токсинов. Очищенные усеченные Cry-токсины иодировали с использованием иодогранул или иодогена (Pierce). Вкратце, две иодогранулы дважды промывали 500 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора PBS (20 мМ фосфата натрия, 0,15М NaCl, рН 7,5) и помещали в центрифужную пробирку емкостью 1,5 мл за свинцовым экраном. К этому добавляли 100 мкл PBS. В вытяжном шкафу и с использованием необходимых приемов работы с радиоактивными веществами 0,5 мкюри Na125I (17,4 кюри/мг, серия 0114, Amersham) добавляли к раствору иодогранул в PBS. Компоненты повергали взаимодействию в течение 5 мин при комнатной температуре, затем к раствору добавляли 2-25 мкг высокоочищенного усеченного Cry-белка и подвергали взаимодействию еще в течение 3-5 мин. Реакцию останавливали удалением раствора с иодогранулами и реакционную смесь наносили на спин-колонку Zeba емкостью 0,5 мл для обессоливания (InVitrogen), уравновешенную PBS. Иодогранулы дважды промывали каждый раз по 10 мкл PBS и промывной раствор также наносили на колонку для обессоливания. Радиоактивный раствор элюировали через колонку для обессоливания центрифугированием при 1000×g в течение 2 мин. В случае Cry1Da для введения радиоактивной метки использовали метод с иодогеном. При использовании данного метода Cry-токсин в 100 мМ фосфатном буфере (рН 8) вначале очищали от полисахаридов (LPS) пропусканием несколько раз через небольшую колонку с полимиксином емкостью 0,5 мл. В пробирку с иодогеном (Pierce Chem., Co) добавляли 20 мкг LPS-несодержащего Cry1Da-токсина, затем 0,5 мкюри Na125I. Реакционную смесь встряхивали в течение 15 мин при 25°С. Раствор удаляли из пробирки и добавляли 0,2М нерадиоактивного NaI для гашения реакции. Белок диализировали против PBS с 3 сменами буфера для удаления несвязанного 125I.
Радиоактивную чистоту иодированных Cry-белков определяли электрофорезом SDS-PAGE, визуализировали с использованием фосфорного экрана и анализировали на гамма-счетчике. Вкратце, 2 мкл радиоактивного белка разделяли SDS-PAGE. После разделения гели высушивали с использованием аппарата для высушивания гелей BioRad, следуя инструкциям изготовителя. Высушенные гели визуализировали, обернув их в пленку Mylar (толщиной 12 мкм) и экспонировали на многоразовых фосфорных экранах Dynamics (35×43 см) в течение 1 ч. Пластинки визуализировали с использованием прибора Molecular Dynamics Storm 820 phosphoroimager и визуализированные изображения анализировали с использованием программного обеспечения ImageQuantTM. Радиоактивную полосу вместе с зонами непосредственно выше и ниже полосы вырезали из геля с использованием лезвия для бритвы и определяли радиоактивность на гамма-счетчике. Радиоактивность обнаруживали только в полосе Cry-белка и в зонах ниже полосы. Радиоактивность не детектировали выше полосы, указывая на то, что все радиоактивные примеси состояли из более мелких белковых компонентов по сравнению с Cry-белком. Возможно, данные компоненты представляли собой продукты деградации.
Пример 2. Протокол приготовления BBMV
Получение и фракционирование солюбилизированных BBMV. Личинки последней стадии развития Spodoptera frugiperda, Ostrinia nubilalis или Heleothis. zea выдерживали без корма в течение ночи и затем утром измельчали после охлаждения на льду в течение 15 мин. Извлекали ткань средней кишки из полости тела, оставляя заднюю кишку, присоединенную к интегументу. Среднюю кишку помещали в 9× объем охлажденного на льду буфера для гомогенизации (300 мМ маннита, 5 мМ ЭГТА, 17 мМ Трис основания, рН 7,5) с добавлением смеси ингибиторов протеаз (конечная концентрация компонентов смеси (в мкМ) составляет AEBSF (500), EDTA (250 мМ), бестатин (32), Е-64 (0,35), лейпептин (0,25) и апротинин (0,075) (Sigma P-2714), разбавленной согласно рекомендациям изготовителя. Ткань гомогенизировали 15 ходами стеклянного гомогенизатора для тканей. BBMV готовили осаждением с помощью MgCl2 по методу Wolfersberger (1993). Вкратце, равный объем 24 мМ раствора MgCl2 в 300 мМ растворе маннита смешивали с гомогенатом средней кишки, перемешивали в течение 5 мин и выдерживали на льду в течение 15 мин. Раствор центрифугировали при 2500×g в течение 15 мин при 4°С. Супернатант оставляли и осадок суспендировали в исходном объеме 0,5× разбавленного буфера для гомогенизации и вновь центрифугировали. Два супернатанта объединяли, центрифугировали при 27000×g в течение 30 мин при 4°С с получением фракции BBMV. Осадок суспендировали в 10 мл буфера для гомогенизации и добавляли ингибиторы протеаз и вновь центрифугировали при 27000×g в течение 30 мин при 4°С для отмывки BBMV. Полученный осадок суспендировали в буфере для хранения BBMV (10 мМ HEPES, 130 мМ KCl, 10% глицерина, рН 7,4) до концентрации примерно 3 мг/мл белка. Концентрацию белка определяли с использованием метода Брэдфорда (1976) с бычьим сывороточным альбумином (BSA) в качестве стандарта. Определение активности щелочной фосфатазы проводили до замораживания проб с использованием метода Sigma, следуя инструкциям изготовителя. Специфическая активность данного фермента-маркера во фракции BBMV, как правило, была в 7 раз выше по сравнению с фракцией гомогената средней кишки. BBMV разливали на аликвотные порции по 250 мкл, быстро замораживали в жидком N2 и хранили при -80°С.
Пример 3. Способ оценки связывания
125
I-меченных Cry-белков с белками BBMV
Связывание 125 I-меченных Cry-белков с белками BBMV. Для определения оптимального количества белка BBMV в тестах по оценке связывания строили кривую насыщения. 125I-меченный Cry-белок (0,5 нМ) инкубировали в течение 1 ч при 28°С с различными количествами белка BBMV в пределах 0-500 мкг/мл в буфере для связывания (8 мМ NaHPO4, 2 мМ KH2PO4, 150 мМ NaCl, 0,1% бычьего сывороточного альбумина, рН 7,4). Общий объем составлял 0,5 мл. Связанный с 125I Cry-белок отделяли от несвязанного белка отбором 150 мкл реакционной смеси в трех параллелях из центрифужной пробирки емкостью 1,5 мл в центрифужную пробирку емкостью 500 мкл и центрифугированием проб при 14000×g в течение 6 мин при комнатной температуре. Супернатант осторожно удаляли и осадок осторожно промывали три раза буфером для связывания, охлажденным на льду. Дно центрифужной пробирки, содержащее осадок, отрезали и помещали в стеклянную культуральную пробирку размером 13×75 мм. Определяли радиоактивность проб в течение 5 мин на гамма-счетчике. Из значения радиоактивности пробы вычитали фоновую радиоактивность (в данном случае реакцию проводили с любым белком) и строили график зависимости от концентрации белка BBMV. Оптимальное количество белка, которое использовали, составило 0,15 мг/мл белка BBMV.
Для определения кинетики связывания строили кривую насыщения. Вкратце, BBMV (150 мкг/мл) инкубировали в течение 1 ч при 28°С с возрастающими концентрациями 125I-меченного Cry-токсина в пределах от 0,01 до 10 нМ. Общее связывание определяли отбором аликвотных порций 150 мкл каждой концентрации в трех параллелях, центрифугированием пробы и определением радиоактивности, как описано выше. Аналогичным образом определяли неспецифическое связывание с добавлением к реакционной смеси 1000 нМ гомологичного трипсинизированного нерадиоактивного Cry-токсина для насыщения всех неспецифических сайтов связывания рецептора. Специфическое связывание рассчитывали, как разницу между общим связыванием и неспецифическим связыванием.
Тесты гомологичного и гетерологичного конкурентного связывания проводили с использованием 150 мкг/мл белка BBMV и 0,5 нМ 125I-меченного Cry-белка. Концентрация конкурентного немеченого Cry-токсина, добавленного в реакционную смесь, находилась в пределах от 0,045 до 1000 нМ и его добавляли одновременно с радиоактивным лигандом для гарантии реального конкурентного связывания. Инкубацию проводили в течение 1 ч при 28°С и определяли количество 125I-меченного Cry-белка, связанного с рецептором токсина, как описано выше, с вычитанием неспецифического связывания. При полном отсутствии лиганда-конкурента детектировали 100% общее связывание. По результатам анализа строили полулогарифмический график зависимости общего специфического связывания в процентах от концентрации добавленного конкурентного лиганда.
Пример 4. Резюме по результатам
На фиг.1 показано специфическое связывание в процентах 125I Cry1Ab (0,5 нМ) в BBMV из ECB с конкуренцией немеченым гомологичным Cry1Ab (♦) и гетерологичным Cry1Be (•). Кривая вытеснения для гомологичной конкуренции с Cry1Ab представляет сигмоидальную по форме кривую, показывающую 50% вытеснение радиоактивного лиганда примерно при 0,5 нМ Cry1Ab. Cry1Be также вытесняет 125I Cry1Be из сайта связывания, но для этого требуется концентрация примерно 40 нМ (в 80 раз выше по сравнению с необходимой концентрацией Cry1Ab) для вытеснения 50% 125I Cry1Ab из сайта связывания.
На фиг.2 показано специфическое связывание в процентах 125I Cry1Ab (0,5 нМ) в BBMV из FAW с конкуренцией немеченым гомологичным Cry1Ab (♦) и гетерологичным Cry1Be (•). Кривая вытеснения для гомологичной конкуренции с Cry1Ab представляет сигмоидальную по форме кривую, показывающую 50% вытеснение радиоактивного лиганда примерно при 0,3 нМ Cry1Ab. Cry1Be вытесняет 125I Cry1Ab из сайта связывания на 50% в концентрации примерно 300 нМ или примерно в 1000 раз выше по сравнению с необходимой концентрацией для Cry1Ab. Ошибки в виде черточек представляют пределы значений, полученных по данным двойных параллельных определений.
На фиг.3 показано специфическое связывание в процентах 125I Cry1Be (0,5 нМ) в BBMV из FAW с конкуренцией немеченым гомологичным Cry1Be (♦) и гетерологичным Cry1Ab (•). Кривая вытеснения для гомологичной конкуренции с Cry1Be представляет сигмоидальную по форме кривую, показывающую 50% вытеснение радиоактивного лиганда примерно при 2 нМ Cry1Be. Cry1Ab в концентрации 1000 нМ (в 2000 раз выше по сравнению с вытесненным 125I Cry1Be) приводит примерно к 50% вытеснению. Имеется примерно в 500 раз более низкая аффинность Cry1Ab в конкуренции за связывание Cry1Be. Ошибки в виде черточек представляют пределы значений, полученных по данным трех параллельных определений.
Литература
Heckel, D.G., Gahan, L.J., Baxter, S.W., Zhao, J.Z., Shelton, A.M., Gould, F., and Tabashnik. B.E. (2007). The diversity of Bt resistance genes in species of Lepidoptera. J Invertebr Pathol 95, 192-197.
Luo, K., Banks, D., and Adang, M.J. (1999). Toxicity, binding, and permeability analyses of four bacillus thuringiensis cryl delta-endotoxins using brush border membrane vesicles of spodoptera exigua and spodoptera frugiperda. Appl. Environ. Microbiol. 65, 457-464.
Palmer, M, Buchkremer, M, Valeva, A, and Bhakdi, S. Cysteine-specific radioiodination of proteins with fluorescein maleimide. Analytical Biochemistry 253, 175-179. 1997. Ref Type: Journal (Full)
Sambrook, J. and Russell, D.W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory).
Schlenz, M. L., Babcock, J. M., and Storer, N. P. Response of Cry1F-resistant and Susceptible European Corn Borer and Fall Armyworm Colonies to Cry1A.105 and Cry12Ab2. DAI 0830, 2008. Indianapolis, Dow AgroSciences. Derbi Report.
Sheets, J.J. and Storer, N.P. Analysis of Cry1Ac Binding to Proteins in Brush Border Membrane Vesicles of Corn Earworm Larvae (Heleothis zed). Interactions with Cry1F Proteins and Its Implication for Resistance in the Field. DAI-0417, 1-26. 2001. Indianapolis, Dow AgroSciences.
Tabashnik, B.E., Liu, Y.B., Finson. N., Masson, L., and Heckel, D.G. (1997). One gene in diamondback moth confers resistance to four Bacillus thuringiensis toxins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94, 1640-1644.
Tabashnik, B.E., Malvar, T., Liu, Y.B., Finson. N., Borthakur, D., Shin, B.S., Park, S.H., Masson. L., de Maagd, R.A., and Bosch, D. (1996). Cross-resistance of the diamondback moth indicates altered interactions with domain II of Bacillus thuringiensis toxins. Appl. Environ. Microbiol. 62, 2839-2844.
Tabashnik, B.E., Roush, R.T., Earle, E.D., and Shelton, A.M. (2000). Resistance to Bt toxins. Science 287, 42.
Wolfersberger, M.G. (1993). Preparation and partial characterization of amino acid transporting brush border membrane vesicles from the larval midgut of the gypsy moth (Lymantria dispar). Arch. Insect Biochem. Physiol 24, 139-147.
Xu, X., Yu, L., and Wu, Y. (2005). Disruption of acadherin gene associated with resistance to Cry 1 Ac {delta}-endotoxin of Bacillus thuringiensis in Helicoverpa armigera. Appl Environ Microbiol 71, 948-954.
Claims (20)
1. Трансгенное растение, содержащее ДНК, кодирующую инсектицидный белок Cry1Ab, состоящий из SEQ ID NO: 2, и ДНК, кодирующую инсектицидный белок Cry1Be, состоящий из SEQ ID NO: 1, где указанное трансгенное растение обладает инсектицидной активностью в отношении насекомых кукурузной листовой совки (FAW; Spodoptera frugiperda) и кукурузного стеблевого мотылька (ЕСВ; Ostrinia nubilalis), устойчивых к белку Cry.
2. Трансгенное растение по п. 1, где указанное растение дополнительно содержит ДНК, кодирующую третий инсектицидный белок, где указанный третий белок выбран из группы, состоящей из Cry2A, Cry1I и DIG-3.
3. Трансгенное растение по п. 2, где указанное растение дополнительно содержит ДНК, кодирующую инсектицидный белок Cry1Fa, и ДНК, кодирующую четвертый инсектицидный белок, выбранный из группы, состоящей из Cry1Fa, Vip3Ab, Cry1Ca и Cry1E.
4. Семя растения по любому из пп. 1-3, где указанное семя содержит ДНК, кодирующую инсектицидный белок Cry1Ab, состоящий из SEQ ID NO: 2, и ДНК, кодирующую инсектицидный белок Cry1Be, состоящий из SEQ ID NO: 1, где указанное семя обладает устойчивостью к насекомым FAW и ЕСВ.
5. Совокупность растений в поле, включающая растения, не являющиеся растениями Bacillus thuringiensis (не-Bt растения), которые не экспрессируют трансгенные инсектицидные белки, и совокупность трансгенных растений по любому из пп. 1-3, которые обладают устойчивостью к насекомым-вредителям FAW и ЕСВ, где указанные трансгенные растения содержат ДНК, кодирующую инсектицидный белок Cry1Ab, состоящий из SEQ ID NO: 2, и ДНК, кодирующую инсектицидный белок Cry1Be, состоящий из SEQ ID NO: 1, где указанные не-Bt растения составляют менее чем 40% от всех злаковых растений в указанной совокупности растений, где указанная совокупность растений задерживает развитие устойчивости к белку Cry насекомыми FAW и ЕСВ, где указанная совокупность растений содержит по меньшей мере одно не-Bt растение.
6. Совокупность растений по п. 5, где указанные не-Bt растения составляют менее чем 30% от всех злаковых растений на указанном поле.
7. Совокупность растений по п. 5, где указанные не-Bt растения составляют менее чем 20% от всех злаковых растений на указанном поле.
8. Совокупность растений по п. 5, где указанные не-Bt растения составляют менее чем 10% от всех злаковых растений на указанном поле.
9. Совокупность растений по п. 5, где указанные не-Bt растения составляют менее чем 5% от всех злаковых растений на указанном поле.
10. Совокупность растений по п. 5, где указанные не-Bt растения находятся в блоках или полосах.
11. Смесь семян, содержащая семена от не-Bt-растений, не зкспрессирующих трансгенный инсектицидный белок, и совокупность семян по п. 4, в которой указанные семена от не-Bt-растений составляют 40% от всех семян в смеси; где указанную смесь семян высаживают для контроля развития кукурузной листовой совки и кукурузного стеблевого мотылька, резистентных к белкам Cry1Ab и Cry1Be, где указанная смесь семян содержит по меньшей мере одно не-Bt семя.
12. Смесь семян по п. 11, в которой указанные не-Bt семена составляют 30% от всех семян в смеси.
13. Смесь семян по п. 11, в которой указанные не-Bt семена составляют 20% от всех семян в смеси.
14. Смесь семян по п. 11, в которой указанные не-Bt семена составляют 10% от всех семян в смеси.
15. Смесь семян по п. 11, в которой указанные не-Bt семена составляют 5% от всех семян в смеси.
16. Способ понижения развития устойчивости к белку Cry1Ab или Cry1Be у кукурузной листовой совки и кукурузного стеблевого мотылька, где указанный способ включает
посев семян с получением поля не-Bt растений и трансгенных растений, содержащих ДНК, кодирующую инсектицидный белок Cry1Ab, состоящий из SEQ ID NO: 2, и ДНК, кодирующую инсектицидный белок Cry1Be, состоящий из SEQ ID NO: 1; и
приведение указанных насекомых в контакт с указанными не-Bt растениями и указанными трансгенными растениями.
посев семян с получением поля не-Bt растений и трансгенных растений, содержащих ДНК, кодирующую инсектицидный белок Cry1Ab, состоящий из SEQ ID NO: 2, и ДНК, кодирующую инсектицидный белок Cry1Be, состоящий из SEQ ID NO: 1; и
приведение указанных насекомых в контакт с указанными не-Bt растениями и указанными трансгенными растениями.
17. Растение по любому из пп. 1-3, где указанное растение выбрано из группы, состоящей из кукурузы, соевых бобов и хлопчатника.
18. Растение по п. 17, где указанное растение представляет собой растение кукурузы.
19. Способ получения растительных клеток, экспрессирующих инсектицидный белок Cry1Ab и инсектицидный белок Cry1Be, включающий процесс трансформирования указанных клеток ДНК, кодирующей SEQ ID NO: 2, и ДНК, кодирующей SEQ ID NO: 1, где указанные ДНК, кодирующие SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 1, находятся в генетической конструкции под контролем промоторов не-Bacillus thuringiensis; где указанные ДНК содержат кодоны, предпочтительные для применения в растениях для повышенной экспрессии.
20. Способ борьбы с кукурузным стеблевым мотыльком, устойчивым к Cry1Ab и Cry1Be, где указанный способ включает приведение указанного насекомого в контакт с инсектицидным белком Cry1Be, состоящим из SEQ ID NO: 1, и инсектицидным белком Cry1Ab, состоящим из SEQ ID NO: 2.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US28429009P | 2009-12-16 | 2009-12-16 | |
US61/284,290 | 2009-12-16 | ||
PCT/US2010/060830 WO2011084631A1 (en) | 2009-12-16 | 2010-12-16 | Use of cry1ab in combination with cry1be for management of resistant insects |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2012129901A RU2012129901A (ru) | 2014-01-27 |
RU2583288C2 true RU2583288C2 (ru) | 2016-05-10 |
Family
ID=44167700
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012129901/10A RU2583288C2 (ru) | 2009-12-16 | 2010-12-16 | Применение cry1ab в комбинации с cry1be для управления резистентностью насекомых |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9556453B2 (ru) |
EP (2) | EP2513318B1 (ru) |
JP (2) | JP5908407B2 (ru) |
KR (2) | KR101841297B1 (ru) |
CN (2) | CN102753695B (ru) |
AR (2) | AR079507A1 (ru) |
AU (2) | AU2010330913B2 (ru) |
BR (2) | BR112012014879A2 (ru) |
CA (2) | CA2782626A1 (ru) |
CL (2) | CL2012001630A1 (ru) |
CO (2) | CO6602144A2 (ru) |
IL (1) | IL220337A (ru) |
MX (2) | MX348994B (ru) |
NZ (2) | NZ601097A (ru) |
RU (1) | RU2583288C2 (ru) |
UA (3) | UA113385C2 (ru) |
WO (2) | WO2011084631A1 (ru) |
ZA (2) | ZA201204924B (ru) |
Families Citing this family (62)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107937434A (zh) * | 2010-12-16 | 2018-04-20 | 陶氏益农公司 | Vip3Ab和Cry1Ab用于管理抗性昆虫的组合用途 |
AU2012294678B2 (en) * | 2011-08-05 | 2017-10-05 | Dow Agrosciences Llc | Use of DIG3 insecticidal crystal protein in combination with Cry1Ab |
US10119149B2 (en) | 2011-08-05 | 2018-11-06 | Dow Agrosciences Llc | Use of DIG3 insecticidal crystal protein in combination with cry1Ab for management of resistance in european cornborer |
WO2014071182A1 (en) | 2012-11-01 | 2014-05-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Directed evolution of synthetic gene cluster |
CN102972427B (zh) * | 2012-12-11 | 2014-07-09 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 控制害虫的方法 |
WO2014150914A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Phi-4 polypeptides and methods for their use |
EA030896B1 (ru) | 2013-08-16 | 2018-10-31 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Инсектицидные белки и способы их применения |
BR122020001770B1 (pt) | 2013-09-13 | 2022-11-29 | Pioneer Hi-Bred International, Inc | Construto de dna, método de obtenção de planta transgênica, proteína de fusão, método para controlar uma população de praga de inseto, método para inibir o crescimento ou matar uma praga de inseto |
US10227608B2 (en) | 2014-02-07 | 2019-03-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
CN106232620B (zh) | 2014-02-07 | 2022-05-13 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
WO2016000237A1 (en) | 2014-07-03 | 2016-01-07 | Pioneer Overseas Corporation | Plants having enhanced tolerance to insect pests and related constructs and methods involving insect tolerance genes |
EP3207050A4 (en) * | 2014-10-16 | 2018-09-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof |
US10435706B2 (en) | 2014-10-16 | 2019-10-08 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
TW201615095A (zh) * | 2014-10-31 | 2016-05-01 | 陶氏農業科學公司 | Dig-303殺蟲cry毒素 |
CN104798802B (zh) * | 2015-03-04 | 2017-03-22 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 杀虫蛋白的用途 |
CN107529763B (zh) | 2015-03-11 | 2021-08-20 | 先锋国际良种公司 | Pip-72的杀昆虫组合及使用方法 |
CN104744575B (zh) * | 2015-04-16 | 2023-10-27 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 对东方粘虫有杀虫活性的Bt蛋白及其应用 |
CN108064233B (zh) | 2015-05-19 | 2022-07-15 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
CA2986265A1 (en) | 2015-06-16 | 2016-12-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
MX2018000615A (es) | 2015-07-13 | 2018-08-01 | Pivot Bio Inc | Metodos y composiciones para mejorar atributos de plantas. |
US11840700B2 (en) * | 2015-07-23 | 2023-12-12 | Monsanto Technology Llc | Multi functional toxins |
CA2994676A1 (en) | 2015-08-06 | 2017-02-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant derived insecticidal proteins and methods for their use |
ES2773072T3 (es) | 2015-08-28 | 2020-07-09 | Pioneer Hi Bred Int | Transformación de plantas mediada por Ochrobactrum |
US11479516B2 (en) | 2015-10-05 | 2022-10-25 | Massachusetts Institute Of Technology | Nitrogen fixation using refactored NIF clusters |
CN108575091A (zh) | 2015-12-18 | 2018-09-25 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
CN117003840A (zh) | 2016-04-14 | 2023-11-07 | 先锋国际良种公司 | 具有改善的活性谱的杀昆虫多肽及其用途 |
WO2017184673A1 (en) | 2016-04-19 | 2017-10-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal combinations of polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof |
EA201892293A1 (ru) | 2016-05-04 | 2019-04-30 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Инсектицидные белки и способы их применения |
CN109312359A (zh) | 2016-06-16 | 2019-02-05 | 先锋国际良种公司 | 用以防治昆虫有害生物的组合物和方法 |
MX2018015900A (es) | 2016-06-24 | 2019-04-04 | Pioneer Hi Bred Int | Elementos reguladores de planta y metodos para usarlos. |
EP3954202A1 (en) | 2016-07-01 | 2022-02-16 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
US20210292778A1 (en) | 2016-07-12 | 2021-09-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
US11140902B2 (en) | 2016-09-27 | 2021-10-12 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Insect toxin delivery mediated by a densovirus coat protein |
CN117025637A (zh) | 2016-10-10 | 2023-11-10 | 孟山都技术公司 | 新型昆虫抑制蛋白 |
CN109863167B (zh) | 2016-11-01 | 2022-12-23 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
CN106749566B (zh) * | 2016-11-21 | 2020-05-05 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 杀虫蛋白组合及其管理昆虫抗性的方法 |
US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
EP3550961A4 (en) | 2016-12-12 | 2020-11-04 | Syngenta Participations AG | ENGINEERED PROTEIN PESTICIDES AND METHODS FOR CONTROLLING PLANT PESTS |
US11174295B2 (en) | 2016-12-14 | 2021-11-16 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
US11213028B2 (en) | 2016-12-22 | 2022-01-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
CN110799474B (zh) | 2017-01-12 | 2022-07-26 | 皮沃特生物公司 | 用于改良植物性状的方法及组合物 |
WO2018140214A1 (en) | 2017-01-24 | 2018-08-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Nematicidal protein from pseudomonas |
MX2019009371A (es) | 2017-02-08 | 2019-09-23 | Pionner Hi Bred Int Inc | Combinaciones insecticidas de proteinas insecticidas derivadas de plantas y metodos para su uso. |
RU2019140646A (ru) | 2017-05-11 | 2021-06-11 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Инсектицидные белки и способы их применения |
UA126971C2 (uk) | 2017-05-26 | 2023-03-01 | Піонір Хай-Бред Інтернешнл, Інк. | Інсектицидний поліпептид з поліпшеним спектром активності і його застосування |
WO2019074598A1 (en) | 2017-10-13 | 2019-04-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | VIRUS-INDUCED GENETIC SILENCING TECHNOLOGY FOR THE CONTROL OF INSECTS IN MAIZE |
CA3079955A1 (en) | 2017-10-25 | 2019-05-02 | Pivot Bio, Inc. | Methods and compositions for improving engineered microbes that fix nitrogen |
EP3755797A1 (en) | 2018-02-22 | 2020-12-30 | Zymergen, Inc. | Method for creating a genomic library enriched for bacillus and identification of novel cry toxins |
WO2019169150A1 (en) | 2018-03-02 | 2019-09-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant health assay |
CA3088011A1 (en) | 2018-03-02 | 2019-09-06 | Zymergen Inc. | Insecticidal protein discovery platform and insecticidal proteins discovered therefrom |
WO2019178042A1 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
CA3092075A1 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
US11702668B2 (en) | 2018-05-22 | 2023-07-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant regulatory elements and methods of use thereof |
CA3103977A1 (en) | 2018-06-27 | 2020-01-02 | Pivot Bio, Inc. | Agricultural compositions comprising remodeled nitrogen fixing microbes |
MX2021002290A (es) | 2018-08-29 | 2021-04-28 | Pioneer Hi Bred Int | Proteinas insecticidas y metodos para su uso. |
WO2021076346A1 (en) | 2019-10-18 | 2021-04-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize event dp-202216-6 and dp-023211-2 stack |
CN110982829B (zh) * | 2019-12-23 | 2021-10-29 | 隆平生物技术(海南)有限公司 | 一种用于作物抗虫害的基因组合及其载体和应用 |
WO2021221690A1 (en) | 2020-05-01 | 2021-11-04 | Pivot Bio, Inc. | Modified bacterial strains for improved fixation of nitrogen |
EP4143211A2 (en) | 2020-05-01 | 2023-03-08 | Pivot Bio, Inc. | Modified bacterial strains for improved fixation of nitrogen |
US20230235352A1 (en) | 2020-07-14 | 2023-07-27 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
BR112023002603A2 (pt) | 2020-08-10 | 2023-04-04 | Pioneer Hi Bred Int | Elementos reguladores de plantas e métodos de uso dos mesmos |
MX2024000026A (es) | 2021-07-02 | 2024-02-20 | Pivot Bio Inc | Cepas bacterianas dise?adas por ingenieria genetica para fijacion de nitrogeno mejorada. |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2210593C2 (ru) * | 1993-09-02 | 2003-08-20 | Новартис Аг | ФРАГМЕНТ ГИБРИДНОГО ТОКСИНА Bacillus thuringiensis, ОБЛАДАЮЩИЙ ИНСЕКТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, КОДИРУЮЩАЯ ЕГО РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК, СПОСОБ БОРЬБЫ С НАСЕКОМЫМИ |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0400246A1 (en) * | 1989-05-31 | 1990-12-05 | Plant Genetic Systems, N.V. | Prevention of Bt resistance development |
US6777589B1 (en) * | 1990-01-22 | 2004-08-17 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
US5723758A (en) | 1991-09-13 | 1998-03-03 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis genes encoding lepidopteran-active toxins |
US5508264A (en) | 1994-12-06 | 1996-04-16 | Mycogen Corporation | Pesticidal compositions |
US5942664A (en) * | 1996-11-27 | 1999-08-24 | Ecogen, Inc. | Bacillus thuringiensis Cry1C compositions toxic to lepidopteran insects and methods for making Cry1C mutants |
US6218188B1 (en) | 1997-11-12 | 2001-04-17 | Mycogen Corporation | Plant-optimized genes encoding pesticidal toxins |
US6500617B1 (en) | 1998-05-01 | 2002-12-31 | Maxygen, Inc. | Optimization of pest resistance genes using DNA shuffling |
US6489542B1 (en) * | 1998-11-04 | 2002-12-03 | Monsanto Technology Llc | Methods for transforming plants to express Cry2Ab δ-endotoxins targeted to the plastids |
BR0014516A (pt) * | 1999-09-15 | 2002-07-02 | Monsanto Technology Llc | Composições e métodos de uso de delta-endotoxina do bacilo thuringiensis ativo de lepidopteran |
WO2001021821A2 (en) * | 1999-09-17 | 2001-03-29 | Aventis Cropscience N.V. | Insect-resistant rice plants |
US6551962B1 (en) * | 2000-10-06 | 2003-04-22 | Monsanto Technology Llc | Method for deploying a transgenic refuge |
AU2003265637A1 (en) * | 2002-08-29 | 2004-03-19 | Natalia N. Bogdanova | Nucleotide sequences encoding cry1bb proteins for enhanced expression in plants |
AR048747A1 (es) * | 2004-03-05 | 2006-05-24 | Agrigenetics Inc | Combinaciones de cry1ab y cry1fa como una herramienta para el control de la resistencia de los insectos |
EP1737964A1 (en) | 2004-03-26 | 2007-01-03 | Dow AgroSciences LLC | Cry1f and cry1ac transgenic cotton lines and event-specific identification thereof |
MX2010011925A (es) * | 2008-05-01 | 2010-11-30 | Bayer Bioscience Nv | Manejo en plantas transgenicas de la resistencia de la oruga militar tardia. |
CA2758885C (en) | 2009-04-17 | 2018-09-11 | Dow Agrosciences Llc | Dig-3 insecticidal cry toxins |
-
2010
- 2010-12-16 CA CA2782626A patent/CA2782626A1/en not_active Abandoned
- 2010-12-16 BR BR112012014879A patent/BR112012014879A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-12-16 US US13/516,629 patent/US9556453B2/en active Active
- 2010-12-16 CA CA2782568A patent/CA2782568A1/en not_active Abandoned
- 2010-12-16 AU AU2010330913A patent/AU2010330913B2/en not_active Ceased
- 2010-12-16 WO PCT/US2010/060830 patent/WO2011084631A1/en active Application Filing
- 2010-12-16 NZ NZ601097A patent/NZ601097A/en not_active IP Right Cessation
- 2010-12-16 UA UAA201208654A patent/UA113385C2/uk unknown
- 2010-12-16 UA UAA201208655A patent/UA111935C2/uk unknown
- 2010-12-16 JP JP2012544834A patent/JP5908407B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-12-16 EP EP10842620.6A patent/EP2513318B1/en active Active
- 2010-12-16 CN CN201080063906.8A patent/CN102753695B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2010-12-16 NZ NZ601106A patent/NZ601106A/en not_active IP Right Cessation
- 2010-12-16 WO PCT/US2010/060808 patent/WO2011075584A1/en active Application Filing
- 2010-12-16 AU AU2010339920A patent/AU2010339920B2/en not_active Ceased
- 2010-12-16 MX MX2012007137A patent/MX348994B/es active IP Right Grant
- 2010-12-16 UA UAA201208558A patent/UA111934C2/uk unknown
- 2010-12-16 KR KR1020127018339A patent/KR101841297B1/ko active IP Right Grant
- 2010-12-16 JP JP2012544846A patent/JP5907892B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-12-16 MX MX2012007128A patent/MX350004B/es active IP Right Grant
- 2010-12-16 BR BRBR112012014796-0A patent/BR112012014796A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2010-12-16 AR ARP100104680A patent/AR079507A1/es unknown
- 2010-12-16 EP EP10838256.5A patent/EP2512218B1/en active Active
- 2010-12-16 US US13/516,668 patent/US9663795B2/en active Active
- 2010-12-16 CN CN201080064020.5A patent/CN102869244B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2010-12-16 AR ARP100104676A patent/AR079503A1/es unknown
- 2010-12-16 KR KR1020127018330A patent/KR20120112555A/ko active IP Right Grant
- 2010-12-16 RU RU2012129901/10A patent/RU2583288C2/ru not_active IP Right Cessation
-
2012
- 2012-06-12 IL IL220337A patent/IL220337A/en not_active IP Right Cessation
- 2012-06-15 CL CL2012001630A patent/CL2012001630A1/es unknown
- 2012-06-15 CL CL2012001629A patent/CL2012001629A1/es unknown
- 2012-07-02 ZA ZA2012/04924A patent/ZA201204924B/en unknown
- 2012-07-02 ZA ZA2012/04919A patent/ZA201204919B/en unknown
- 2012-07-16 CO CO12119354A patent/CO6602144A2/es not_active Application Discontinuation
- 2012-07-16 CO CO12119358A patent/CO6561804A2/es not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2210593C2 (ru) * | 1993-09-02 | 2003-08-20 | Новартис Аг | ФРАГМЕНТ ГИБРИДНОГО ТОКСИНА Bacillus thuringiensis, ОБЛАДАЮЩИЙ ИНСЕКТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, КОДИРУЮЩАЯ ЕГО РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК, СПОСОБ БОРЬБЫ С НАСЕКОМЫМИ |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BRAVO A.et al., How to cope with insect resistance to Bt toxins?, 2008, Vol. 26, Issue 10, pp. 573-579;PARDO-LOPEZ L. et al., Strategies to improve the insecticidal activity of Cry toxins from Bacillus thuringiensis, Peptides. 2009, Vol.30, N.3, pp. 589-595. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2583288C2 (ru) | Применение cry1ab в комбинации с cry1be для управления резистентностью насекомых | |
US9499835B2 (en) | Use of Cry1Da in combination with Cry1Be for management of resistant insects | |
US20120317682A1 (en) | Combined use of vip3ab and cry1fa for management of resistant insects | |
US9796982B2 (en) | Use of Cry1Da in combination with Cry1Ca for management of resistant insects | |
WO2011075587A1 (en) | Combined use of cry1da and cry1fa proteins for insect resistance management | |
US9045766B2 (en) | Combined use of Vip3Ab and Cry1Ab for management of resistant insects | |
US20140109263A1 (en) | USE OF Cry1Ea IN COMBINATIONS FOR MANAGEMENT OF RESISTANT FALL ARMYWORM INSECTS | |
MX2012007122A (es) | Uso de v1p3ab en combinacion con cry1ca para el manejo de insectos resistentes. | |
RU2624031C2 (ru) | Применение инсектицидного кристаллического белка dig3 в комбинации с cry1ab для регулирования устойчивости к кукурузному мотыльку | |
US10119149B2 (en) | Use of DIG3 insecticidal crystal protein in combination with cry1Ab for management of resistance in european cornborer |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20181217 |