UA122114C2

UA122114C2 - Рекомбінантний поліпептид axmi205 з інсектицидною активністю та його застосування

Info

Publication number: UA122114C2
Application number: UAA201402009A
Authority: UA
Inventors: Фолькер Хінріхс; Фолькер Хинрихс; Джеймі Вільямс; Джэйми Вильямс
Original assignee: Атенікс Корп.; Атеникс Корп.
Priority date: 2011-07-28
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2020-09-25
Also published as: EP2737069B1; EP2737069A1; US10875897B2; EA033285B1; WO2013016617A1; CA2842530C; BR112014001978A2; AR088746A1; PL2737069T3; RS56642B1; MX2014001069A; ZA201400562B; US9862965B2; MX351526B; ES2647596T3; HUE037346T2; CN103975066B; CA2842530A1; BR112014001978B8; CN103975066A

Abstract

Винахід стосується конструкції, яка містить молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, який являє собою варіант SEQ ID NO: 2, де зазначений поліпептид має поліпшену пестицидну активність порівняно з SEQ ID NO: 2; де нуклеотидна послідовність вибрана з SEQ ID NO: 4, 5 або 6, або нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 або 12, де зазначена нуклеотидна послідовність є функціонально зв'язаною з промотором, здатним керувати експресією зазначеної нуклеотидної послідовності у рослинній клітині. Винахід також стосується способу боротьби або знищення популяції лускокрилих або твердокрилих комах та способу захисту рослини від комахи-шкідника.

Description

ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ

Дана заявка заявляє пріоритет за попередньою заявкою на патент США з реєстраційним номером 61/512539, поданою 28 липня 2011 р., зміст якої включено у даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті.

ПОСИЛАННЯ НА ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ, НАДІСЛАНИЙ В ЕЛЕКТРОННОМУ

ВИГЛЯДІ

Дану офіційну копію переліку послідовностей надіслано в електронному вигляді за допомогою ЕЕ5-Уер як відформатований під АЗСІЇ перелік послідовностей у файлі з назвою "АРА1160295ЕБО1 ІЗТ АХ, створеному 19 липня 2012 року та який має розмір 45,8 кілобайта, і подано одночасно з описом. Перелік послідовностей, що міститься у даному відформатованому під АЗСІЇ документі, є частиною опису, та його включено у даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті.

ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ

Даний винахід відноситься до галузі молекулярної біології. Забезпечуються варіанти пестицидних білків, які мають активність проти шкідників, що є кореневими черв'яками. Ці білки та послідовності нуклеїнових кислот, що їх кодують, застосовні в отриманні пестицидних складів та в отриманні трансгенних рослин, стійких до кореневих черв'яків.

ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ

Впровадження ООТ (дихлордифенілтрихлоретану) і наступний рух у напрямку до невибіркового застосування синтетичних хімічних інсектицидів призвели до забруднення водних і харчових джерел, до отруєння нецільових корисних комах і до розвитку комах-шкідників, стійких до дії хімічних інсектицидів. Підвищене суспільне занепокоєння щодо негативного впливу невибіркового застосування хімічних інсектицидів на довкілля спонукало до пошуку альтернативних способів боротьби з комахами-шкідниками.

Однією з перспективних альтернатив було застосування засобів біологічної боротьби. Існує переконливо підтверджена документальними доказами інформація про безпечне застосування

ВІ (В. Шигіпдіепві5, грампозитивної грунтової бактерії) як ефективних біопестицидів, і Є низка повідомлень про експресію гена (генів) дельта-ендотоксину у сільськогосподарських культурах.

Для трансгенних Ві-культур необхідними є лише кілька інсектицидних розпорошуваних розчинів,

Зо що не тільки заощаджує ресурси та час, але також знижує ризики для здоров'я. У деяких випадках комахи можуть розвивати стійкість до різних інсектицидних сполук, що ставить питання необхідності ідентифікації альтернативних засобів біологічної боротьби для боротьби зі шкідниками.

СТИСЛИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Забезпечуються композиції та способи для надання пестицидної активності бактеріям, рослинам, рослинним клітинам, тканинам та насінню. Композиції містять молекули нуклеїнових кислот, які кодують послідовності пестицидних та інсектицидних поліпептидів, вектори, які містять такі молекули нуклеїнових кислот, та клітини-хазяїни, які містять ці вектори. Композиції також містять послідовності пестицидних поліпептидів та антитіла до таких поліпептидів.

Нуклеотидні послідовності можна застосовувати у ДНК-конструктах або експресійних касетах для трансформації та експресії в організмах, у тому числі у мікроорганізмах та рослинах.

Нуклеотидні або амінокислотні послідовності можуть бути синтетичними послідовностями, сконструйованими для експресії в організмі, у тому числі, без обмежень, у мікроорганізмі або рослині. Композиції також містять трансформовані бактерії, рослини, рослинні клітини, тканини та насіння.

Зокрема, забезпечуються молекули виділених або рекомбінантних нуклеїнових кислот, які кодують пестицидний білок. Крім того, охоплено амінокислотні послідовності, що відповідають пестицидному білку. Зокрема, даний винахід забезпечує молекулу виділеної нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотну послідовність,

БО показану в ЗЕО ІЮ Мео:7, 8, 9, 10, 11 або 12, або нуклеотидну послідовність, наведену під ЗЕО ІЮ

Мо:4, 5 або 6, а також їх варіанти та фрагменти. Також охоплено нуклеотидні послідовності, комплементарні нуклеотидній послідовності за даним винаходом або такі, що гібридизуються з послідовністю за даним винаходом.

Забезпечуються способи отримання поліпептидів за даним винаходом та застосування цих поліпептидів для боротьби зі шкідниками, що є лускокрилими, твердокрилими комахами, нематодами або двокрилими комахами, або їх знищення. Також включено способи та набори для виявлення нуклеїнових кислот та поліпептидів за даним винаходом у зразку.

Композиції та способи за даним винаходом застосовні для отримання організмів з підвищеною стійкістю або толерантністю до шкідників. Ці організми та композиції, які містять 60 організми, є бажаними для сільськогосподарських цілей. Композиції за даним винаходом також застосовні для утворення змінених або поліпшених білків, які мають пестицидну активність, або для виявлення наявності пестицидних білків або нуклеїнових кислот у продуктах або організмах.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС

Даний винахід спрямовано на композиції та способи для регуляції стійкості або толерантності організмів, зокрема, рослин або рослинних клітин, до шкідників. Під "стійкістю" мається на увазі, що шкідник (наприклад, комаха) знищується під час поглинання поліпептидів за даним винаходом або під час іншого контакту з ними. Під "толерантністю" мається на увазі порушення або ослаблення пересування, харчування, розмноження або інших функцій шкідника. Способи включають трансформацію організмів за допомогою нуклеотидної послідовності, яка кодує пестицидний білок за даним винаходом. Зокрема, нуклеотидні послідовності за даним винаходом застосовні для отримання рослин та мікроорганізмів, що мають пестицидну активність. Таким чином, забезпечуються трансформовані бактерії, рослини, рослинні клітини, тканини рослин та насіння. Композиції являють собою пестицидні нуклеїнові кислоти та білки видів бактерій. Послідовності знаходять застосування у конструюванні векторів експресії для наступного введення в організми, що становлять інтерес, шляхом трансформації як зондів для виділення інших гомологічних (або частково гомологічних) генів та для утворення змінених пестицидних білків за допомогою способів, відомих у даній галузі техніки, таких як перестановка доменів або ДНК-шафлінг. Білки знаходять застосування у боротьбі з популяцією шкідників, що є лускокрилими, твердокрилими, двокрилими комахами та нематодами, або її знищенні, а також в отриманні композицій з пестицидною активністю.

Під "пестицидним токсином" або "пестицидним білком" мається на увазі токсин, який має токсичну активність проти одного або декількох шкідників, включаючи, без обмеження, представників рядів І ерідорієга, Ріріега і СоІеорієга або типу Метаїйода, або білок, гомологічний такому білку. Пестицидні білки були виділені з організмів, у тому числі, наприклад, Васійи5 5р.,

Сіозігідіит Бітегптепіап5 та Раепірасійи5 роріййає. Пестицидні білки містять амінокислотні послідовності, розшифровані на основі нуклеотидних послідовностей повної довжини, розкритих у даному документі, і амінокислотні послідовності, які Є коротшими, ніж послідовності повної довжини, внаслідок застосування альтернативного сайту ініціації, розташованого нижче,

Зо або внаслідок процесингу, за якого утворюється коротший білок, що має пестицидну активність.

Процесинг може мати місце в організмі, у якому експресується білок, або в шкіднику після поглинання білка.

Таким чином, у даному документі представлено родини нових виділених або рекомбінантних нуклеотидних послідовностей, що надають пестицидну активність. Також у даному документі представлено амінокислотні послідовності пестицидних білків. Білок, отримуваний у результаті трансляції цього гена, забезпечує клітинам можливість боротьби зі шкідниками, які поглинають його, або знищення таких.

Молекули виділених нуклеїнових кислот, а також їх варіанти та фрагменти

Один аспект даного винаходу відноситься до молекул виділених або рекомбінантних нуклеїнових кислот, що містять нуклеотидні послідовності, які кодують пестицидні білки та поліпептиди або їх біологічно активні частини, а також належних молекул нуклеїнових кислот для застосування як гібридизаційних зондів для ідентифікації молекул нуклеїнових кислот, які кодують білки з ділянками гомології послідовностей. Застосовуваний у даному документі вираз "молекула нуклеїнової кислоти" включає молекули ДНК (наприклад, рекомбінантні ДНК, кКдаНК або геномні ДНК) та молекули РНК (наприклад, мРНК), а також аналоги ДНК або РНК, утворені за допомогою аналогів нуклеотидів. Молекула нуклеїнової кислоти може бути одноланцюговою або дволанцюговою, але переважно є двонитковою ДНК. "Виділена" послідовність нуклеїнової кислоти (або ДНК) застосовується у даному документі для позначення послідовності нуклеїнової кислоти (або ДНК), яка більше не перебуває у своєму природному середовищі, наприклад, перебуває в умовах іп мійго або у рекомбінантній бактеріальній або рослинній клітині-хазяїні. У деяких варіантах здійснення "виділена" нуклеїнова кислота не містить послідовностей (тобто послідовностей, які кодують білки), що зазвичай фланкують нуклеїнову кислоту (тобто послідовностей, розташованих на 5'- та 3'-кінцях нуклеїнової кислоти) у геномній ДНК організму, з якого отримана нуклеїнова кислота. Щодо даного винаходу вираз "виділена", застосовуваний для позначення молекул нуклеїнових кислот, виключає виділені хромосоми. Наприклад, у різних варіантах здійснення молекула виділеної нуклеїнової кислоти, яка кодує пестицидний білок, може містити нуклеотидні послідовності завдовжки менше ніж приблизно 5 т.п.о., 4 т.п.о., З т.п.о., 2 т.п.о., 1 т.п.о.,0,5 т.п.о. або 0,1 т.п.о., які зазвичай фланкують молекулу нуклеїнової кислоти у геномній ДНК клітини, з якої отримана бо ця нуклеїнова кислота. Пестицидний білок, практично вільний від клітинного матеріалу, включає білкові препарати, що мають менше ніж приблизно 30 95, 20 Фо, 10 95 або 5 95 (у перерахунку на суху вагу) непестицидного білка (який також згадується у даному документі як "забруднювальний білок").

Нуклеотидні послідовності, які кодують білки, за даним винаходом включають послідовність, наведену під ЗЕО ІЮО Мос4, 5 або б, та її варіанти, фрагменти та комплементарні їй послідовності. Під "комплементарною послідовністю" мається на увазі нуклеотидна послідовність, що є достатньою мірою комплементарна даній нуклеотидній послідовності, а отже, вона може гібридизуватися з даною нуклеотидною послідовністю з формуванням, таким чином, стабільного дуплекса. Відповідні амінокислотні послідовності пестицидного білка, кодованого даною нуклеотидною послідовністю, наведено під 5ЕО ІЮ Мо: 7, 8, 9, 10, 11 або 12.

Молекули нуклеїнових кислот, які являють собою фрагменти цих нуклеотидних послідовностей, що кодують пестицидні білки, також охоплено даним винаходом. Під "фрагментом" мається на увазі частина нуклеотидної послідовності, яка кодує пестицидний білок. Фрагмент нуклеотидної послідовності може кодувати біологічно активну частину пестицидного білка, або він може являти собою фрагмент, який можна застосовувати як гібридизаційний зонд або праймер для ПЛР за допомогою способів, розкритих нижче. Молекули нуклеїнових кислот, що є фрагментами нуклеотидної послідовності, яка кодує пестицидний білок, містять щонайменше приблизно 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600 суміжних нуклеотидів або кількість нуклеотидів аж до такої, у якій вони присутні в нуклеотидній послідовності повної довжини, яка кодує пестицидний білок, розкритий у даному документі, залежно від передбачуваного застосування. Під "суміжними" нуклеотидами маються на увазі нуклеотидні залишки, що безпосередньо прилягають один до одного. Фрагменти нуклеотидних послідовностей за даним винаходом будуть кодувати білкові фрагменти, які зберігають або підвищують біологічну активність пестицидного білка й, таким чином, зберігають або підвищують пестицидну активність порівняно з пестицидною активністю Ахіті205 (ЗЕО ІЮ Мое:2). Під виразом "зберігає активність" мається на увазі, що фрагмент буде мати пестицидну активність, що становить щонайменше приблизно 30 95, щонайменше приблизно 50 956, щонайменше приблизно 70 95, 80 Зо, 90 95, 95 95 або вище від такої пестицидного білка. Під виразом "поліпшена активність"

Зо мається на увазі підвищення, що становить щонайменше приблизно 1095, щонайменше приблизно 15 95, щонайменше приблизно 20 95, щонайменше приблизно 25 95, щонайменше приблизно 30 95, щонайменше приблизно 35 95, щонайменше приблизно 40 95, щонайменше приблизно 50 95, 60 9, 70 Фо, 80 9», 90 95 або вище, або підвищення щонайменше у приблизно 1,5 рази, щонайменше у приблизно 2 рази, щонайменше у приблизно 2,5 рази, щонайменше у приблизно З рази або вище, пестицидної активності варіанта білка порівняно з пестицидною активністю Ахіті205. У деяких варіантах здійснення поліпшення полягає у зменшенні ЇС50 порівняно з І С50 для Ахті205, наприклад, у зменшенні, що становить щонайменше приблизно 10 95, щонайменше приблизно 20 95, щонайменше приблизно 30 95, щонайменше приблизно 965, щонайменше приблизно 50 9565, щонайменше приблизно 55 95, щонайменше приблизно 40 60 95, або у більшому зниженні І С50.

У різних варіантах здійснення активність являє собою активність проти лускокрилих комах. У деяких варіантах здійснення активність являє собою активність проти кореневих черв'яків, наприклад, західного кукурудзяного жука. Способи вимірювання пестицидної активності добре відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, С7аріа апа І апу (1990) 93. Есоп. Епіотої. 83:2480- 2485; Апагемує еї аІ. (1988) Віоспет. У. 252:199-206; Магтопе еї аїЇ. (1985) 9. ої Есопотіс

Етотоїіоду 78:290-293; та патент США Мо 5743477, усі з яких включено у даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті.

Фрагмент нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний білок, який кодує біологічно активну частину білка за даним винаходом, буде кодувати щонайменше приблизно 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 або 600 суміжних амінокислот або кількість амінокислот аж до загальної такої, у якій вони присутні в пестицидному білку повної довжини за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення фрагмент характеризується М-кінцевим або С-кінцевим усіканням щонайменше приблизно 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 або більше амінокислот порівняно з ЗЕО ІЮ

Мо:7, 8, 9, 10, 11 або 12. У деяких варіантах здійснення фрагменти, охоплювані у даному документі, отримують як результат видалення С-кінцевих 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 або більше амінокислот, наприклад, шляхом протеолізу або шляхом вставки стоп-кодона у послідовність, яка кодує.

Переважні пестицидні білки за даним винаходом кодуються нуклеотидною послідовністю, 60 яка є достатньою мірою ідентичною щодо нуклеотидної послідовності ЗЕО ІЮО Мо:4, 5 або 6. Під

"достатньою мірою ідентичною" мається на увазі амінокислотна або нуклеотидна послідовність, яка має ідентичність послідовності, що становить щонайменше приблизно 60 95 або 65 95, ідентичність послідовності, що становить приблизно 70 95 або 75 95, ідентичність послідовності, що становить приблизно 80 95 або 85 95, ідентичність послідовності, що становить приблизно 90 Фо, 91 о, 92 95, 93 Фо, 94 9, 95 о, 96 95, 97 Фо, 98 У, 99 95 або більше порівняно з еталонною послідовністю, визначену за допомогою однієї з програм вирівнювання, описаних у даному документі, із застосуванням стандартних параметрів. Фахівець у даній галузі візьме до уваги, що ці значення можна відповідним чином коригувати для визначення відповідної ідентичності білків, кюодованих двома нуклеотидними послідовностями, з урахуванням виродженості кодонів, подібності амінокислот, положення рамки зчитування тощо.

Для визначення відсоткової ідентичності двох амінокислотних послідовностей або двох нуклеїнових кислот послідовності вирівнюють із метою оптимального порівняння. Відсоткова ідентичність двох послідовностей залежить від кількості ідентичних положень, спільних для послідовностей (тобто відсоткова ідентичність - кількість ідентичних положень/загальна кількість положень (наприклад, положень, що перекриваються) х 100). В одному варіанті здійснення дві послідовності мають однакову довжину. В іншому варіанті здійснення порівняння здійснюють по всій еталонній послідовності (наприклад, по всій одній з зЗЕО ІЮ Мо:4, 5 або 6 або по всій одній з 5ЕО ІЮ Мо:7, 8, 9, 10, 11 або 12). Відсоткову ідентичність двох послідовностей можна визначити за допомогою методик, подібних до описаних нижче, дозволяючи або не дозволяючи гепи. Розраховуючи відсоткову ідентичність, зазвичай підраховують точні збіги.

Визначення відсоткової ідентичності двох послідовностей можна виконати із застосуванням математичного алгоритму. Необмежувальним прикладом математичного алгоритму, використовуваного для порівняння двох послідовностей, є алгоритм за Капіп апа Аїїбспиї (1990)

Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 87:2264 у модифікації Капіп апа Айвеспи! (1993) Ргос. Маї!. Асад. 5сі.

ИБА 90:5873-5877. Такий алгоритм включено у програми ВІ АТМ та ВІ АЗТХ за Айбспці еї аї. (1990) 9. Мої. ВіоЇ. 215:403. Операції пошуку нуклеотидів за допомогою ВІАБТ можна здійснювати у програмі ВГА5ТМ, результат підрахунку - 100, довжина слова - 12, з отриманням нуклеотидних послідовностей, гомологічних молекулам нуклеїнових кислот, подібних пестицидним, за даним винаходом. Операції пошуку білків за допомогою ВІА5БТ можна

Зо здійснювати у програмі ВГА5ТХ, результат підрахунку - 50, довжина слова - 3, з отриманням амінокислотних послідовностей, гомологічних молекулам пестицидних білків за даним винаходом. Для отримання вирівнювання з гепами з метою порівняння можна використовувати

ВГ А5Т з гепами (у ВІ А5Т 2.0) відповідно до описаного в Ай5спПиЇ еї аї. (1997) Мисівїс Асіа5 Кезв. 25:3389. Альтернативно, можна застосовувати РБІ-Віаб5ї для здійснення ітеративного пошуку, який виявляє віддалену спорідненість між молекулами. Див. Айб5спи! еї а. (1997) 5ирга.

Використовуючи програми ВІАБТ, ВГАБТ з гепами та РБІ-Віабї можна застосовувати параметри за замовчуванням відповідних програм (наприклад, ВІАБТХ та ВІА5ЗТМ).

Вирівнювання можна також здійснювати вручну шляхом добору.

Іншим необмежувальним прикладом математичного алгоритму, використовуваного для порівняння послідовностей, є алгоритм СіивіаМУ (Ніддіпвь еї аї. (1994) Мисівїс Асіа5 Кез. 22:4673- 4680). У Сіиєтаму порівнюються послідовності та проводиться вирівнювання всієї амінокислотної послідовності або послідовності ДНК, і у ньому, таким чином, можуть забезпечуватися дані про консервативність послідовності, властиву усій амінокислотній послідовності. Алгоритм Сіивіаму застосовують у деяких комерційно доступних пакетах програмного забезпечення для аналізу ДНК/амінокислот, таких як модуль АГІОМХ комплекту програм Месіог МТ! (Іпмйгодеп Согрогайоп, Карлобад, Каліфорнія). Після вирівнювання амінокислотних послідовностей за допомогою СіивіаїммуУ можна провести оцінку відсоткової ідентичності амінокислот. Необмежувальним прикладом програми із системи програмного забезпечення, застосовної в аналізі вирівнювань за допомогою СіивзіаїмМуМ, є СЕМЕрОС м,

СЕМЕБОС "м (Кагі Міспоїа5) дозволяє проводити оцінку подібності та ідентичності амінокислот (або ДНК) між декількома білками. Іншим необмежувальним прикладом математичного алгоритму, використовуваного для порівняння послідовностей, є алгоритм за Муег5 апа МіПег (1988) САВІО5 4211-17. Такий алгоритм включено до програми АГІОМ (версія 2.0), яка є частиною пакета програмного забезпечення СО Умізсопвіп сепеїіс5, версія 10 (доступного від

Ассеїгув, Іпс., 9685 5огапіоп Ка., Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Використовуючи програму АСГІСМ для порівняння амінокислотних послідовностей, можна застосовувати таблицю ваг замін амінокислотних залишків РАМ120, штраф за продовження гепа, що дорівнює 12, та штраф за відкриття гепа, що дорівнює 4.

Якщо не вказане інше, буде застосовуватися САР версії 10, у якому застосовується бо алгоритм за Меєдієтап апа МУМУйпосй (1970) У. Мої. Віої. 48(3):443-453, для визначення ідентичності або подібності послідовностей із застосуванням наступних параметрів: 95 ідентичності та 95 подібності для нуклеотидної послідовності із застосуванням ваги гепа, що дорівнює 50, і ваги довжини, що дорівнює 3, ії матриці замін пуузхдарапа.стр; 95 ідентичності або 95 подібності для амінокислотної послідовності із застосуванням ваги гепа, що дорівнює 8, і ваги довжини, що дорівнює 2, і програми підрахунку ВГОБИОМб2. Також можна застосовувати еквівалентні програми. Під "еквівалентною програмою" мається на увазі будь-яка програма для порівняння послідовностей, у якій для будь-яких двох розглянутих послідовностей здійснюється побудова вирівнювання, яке характеризується ідентичними збігами нуклеотидних залишків та ідентичною відсотковою ідентичністю послідовностей порівняно з відповідними вирівнюваннями, побудова яких здійснюється в БАР версії 10. Даний винахід також охоплює молекули варіантів нуклеїнових кислот. "Варіанти" нуклеотидних послідовностей, які кодують пестицидні білки, включають послідовності, які кодують пестицидні білки, розкриті у даному документі, але які мають консервативні відмінності внаслідок виродженості генетичного коду, а також такі, що є достатньою мірою ідентичними, як обговорювалося вище. Алельні варіанти, що трапляються в природі, можуть бути ідентифіковані із застосуванням добре відомих методик молекулярної біології, таких як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) та методики гібридизації, представлені у загальному вигляді нижче. Варіанти нуклеотидних послідовностей також включають нуклеотидні послідовності, отримані синтетично, які були утворені, наприклад, за допомогою застосування сайт-спрямованого мутагенезу, але які, як і раніше, кодують пестицидні білки, розкриті у даному винаході, як обговорюється нижче. Варіанти білків, охоплювані даним винаходом, є біологічно активними, тобто вони продовжують мати бажану біологічну активність нативного білка, тобто зберігати пестицидну активність. У деяких варіантах здійснення активність є поліпшеною порівняно з Ахіті205. Під виразом "зберігає активність" мається на увазі, що варіант буде мати пестицидну активність, яка становить щонайменше приблизно 30 95, щонайменше приблизно 50 95, щонайменше приблизно 70 95 або щонайменше приблизно 80 95 від такої нативного білка. Способи вимірювання пестицидної активності добре відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, Сларіа апа Гапд (1990) 9. Есоп.

Етотої. 83: 2480-2485; Апагемув5 еї а!. (1988) Віоспет. у). 252:199-206; Ма!топе еї аї. (1985) 9. ої

Есопотіс Епіотоіоду 78:290-293; та патент США Мо 5743477, усі з яких включено у даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті.

Фахівець у даній галузі додатково визнає, що за допомогою мутації нуклеотидних послідовностей за даним винаходом можуть бути внесені зміни, що зумовлює, таким чином, зміни в амінокислотній послідовності кодованих пестицидних білків без зміни біологічної активності білків. Таким чином, молекули варіантів виділених нуклеїнових кислот можна створити шляхом впровадження одного або декількох з нуклеотидних замін, додавань або делецій у відповідну нуклеотидну послідовність, розкриту у даному документі, таким чином, що в кодований білок впроваджується одне або декілька з амінокислотних замін, додавань або делецій. Мутації можна впроваджувати за допомогою стандартних методик, таких як сайт- спрямований мутагенез та ПЛР-опосередкований мутагенез. Такі варіанти нуклеотидних послідовностей також охоплено даним винаходом.

Наприклад, консервативні амінокислотні заміни можна зробити щодо одного або декількох передбачених несуттєвих амінокислотних залишків. "Несуттєвий" амінокислотний залишок являє собою залишок, який можна змінити в послідовності дикого типу пестицидного білка без зміни біологічної активності, у той час як "істотний" амінокислотний залишок є необхідним для біологічної активності. "Консервативна амінокислотна заміна" є такою, за якої амінокислотний залишок заміщають амінокислотним залишком, що має подібний бічний ланцюг. Родини амінокислотних залишків, які мають подібні бічні ланцюги, визначено у даній галузі техніки. Ці родини включають амінокислоти з основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислими бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бета-розгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) та ароматичними бічними ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин).

Амінокислотні заміни можна здійснити у неконсервативних ділянках, які зберігають свою функцію. Зазвичай такі заміни не можна здійснити щодо консервативних амінокислотних залишків або щодо амінокислотних залишків, які перебувають у консервативному мотиві, де такі залишки є істотними для активності білка. Приклади залишків, які є консервативними і які можуть бути істотними для активності білка, включають, наприклад, залишки, які є ідентичними бо серед усіх білків, що містяться у вирівнюванні токсинів, подібних або споріднених щодо послідовностей за даним винаходом (наприклад, залишки, які є ідентичними у вирівнюванні гомологічних білків). Приклади залишків, які є консервативними, але щодо яких можна дозволяти консервативні амінокислотні заміни, і які, як і раніше, зберігають активність, включають, наприклад, залишки, що характеризуються тільки консервативними замінами серед усіх білків, які містяться у вирівнюванні токсинів, подібних або споріднених щодо послідовностей за даним винаходом (наприклад, залишки, що характеризуються тільки консервативними замінами серед усіх білків, що містяться у вирівнюванні гомологічних білків). Однак, фахівець у даній галузі зрозуміє, що функціональні варіанти можуть мати мінорні консервативні або неконсервативні зміни консервативних залишків.

Альтернативно, варіанти нуклеотидних послідовностей можна створювати шляхом випадкового впровадження мутацій у всю послідовність, яка кодує, або її частину, як, наприклад, шляхом насичувального мутагенезу, а отриманих мутантів можна піддавати скринінгу щодо їх здатності надавати пестицидну активність, щоб ідентифікувати мутантів, які зберігають активність. Після мутагенезу кодований білок може експресуватися рекомбінантним шляхом, та активність білка можна визначити за допомогою стандартних методик аналізу.

Застосовуючи способи, такі як ПЛР, гібридизація тощо, можна ідентифікувати відповідні пестицидні послідовності, при цьому такі послідовності мають істотну ідентичність стосовно послідовностей за даним винаходом. Див., наприклад, затогооКк апа Киззеї! (2001) МоїІесшаг

СіІопіпд: А ІГарогаїгу Мапиаї! (Соій 5ргіпд Нагбог І арогагогу Рге55, Соїй Зргіпд Нагрог, МУ) та

Іппів єї аї. (1990) РСВ Ргоїосої!5: А Сціає о Меїйносдвз апа Арріісайоп5 (Асадетіс Ргев5, МУ).

У способі гібридизації всю пестицидну нуклеотидну послідовність або її частину можна застосовувати для скринінгу бібліотек КДНК або геномних бібліотек. Способи конструювання таких бібліотек кКДНК та геномних бібліотек, як правило, відомі у даній галузі техніки та розкриті в Ззатрьгоок апа КизхзеїІ, 2001, зирга. Так звані гібридизаційні зонди можуть бути фрагментами геномної ДНК, фрагментами кДНК, фрагментами РНК або іншими олігонуклеотидами й можуть бути міченими детектовною групою, такою як З2Р, або будь-яким іншим детектовним маркером, таким як інші радіоактивні ізотопи, флуоресцентна сполука, фермент або кофактор ферменту.

Зонди для гібридизації можна створити шляхом мічення синтетичних олігонуклеотидів на основі відомої нуклеотидної послідовності, яка кодує пестицидний білок, розкритої у даному документі.

Зо Додатково можна застосовувати вироджені праймери, розроблені на основі консервативних нуклеотидів або амінокислотних залишків у нуклеотидній послідовності або кодованій амінокислотній послідовності. Зонд зазвичай містить ділянку нуклеотидної послідовності, яка гібридизується у жорстких умовах щонайменше із приблизно 12, щонайменше із приблизно 25, щонайменше із приблизно 50, 75, 100, 125, 150, 175 або 200 послідовними нуклеотидами нуклеотидної послідовності, яка кодує пестицидний білок за даним винаходом, або її фрагмента або варіанта. Способи отримання зондів для гібридизації, як правило, відомі у даній галузі техніки та розкриті в ЗатргооК апа КиззеїЇ, 2001, вирга, включеному у даний документ за допомогою посилання.

Наприклад, усю послідовність пестицидного білка, розкриту у даному документі, або одну або декілька її частин можна застосовувати як зонд, здатний до специфічної гібридизації з відповідними послідовностями, подібними до таких пестицидного білка, та матричними РНК.

Для досягнення специфічної гібридизації у різних умовах такі зонди містять у своєму складі послідовності, що є унікальними та переважно мають довжину щонайменше приблизно 10 нуклеотидів або мають довжину щонайменше приблизно 20 нуклеотидів. Такі зонди можна застосовувати для ампліфікації відповідних пестицидних послідовностей з вибраного організму за допомогою ПЛР. Дану методику можна застосовувати для виділення додаткових послідовностей, які кодують, з бажаного організму або як діагностичний аналіз для визначення наявності послідовностей, які кодують, в організмі. Методики гібридизації включають гібридизаційний скринінг бібліотек ДНК, висіяних на чашки (бляшок або колоній; див., наприклад, Затюбгоок еї аІ. (1989) МоїІесшіаг СіІопіпд: А ІГабогаїюгу Мапиаї! (24 ей., Соїд 5ргіпд

Нарог І арогаюгу Ргев5, Соїа Зргіпу Наїбог, Мем/ Могк).

Гібридизація таких послідовностей може бути проведена у жорстких умовах. Під "жорсткими умовами" або "жорсткими умовами гібридизації" маються на увазі умови, у яких зонд буде гібридизуватися з його цільовою послідовністю помітно більшою мірою, ніж з іншими послідовностями (наприклад, з перевищенням фонового рівня щонайменше в 2 рази). Жорсткі умови залежать від послідовності та будуть відрізнятися за різних обставин. Шляхом регуляції жорсткості гібридизації та/або умов промивання можна ідентифікувати цільові послідовності, на 100 96 комплементарні щодо зонда (застосування гомологічного зонда). Альтернативно, умови жорсткості можна коригувати для того, щоб дозволити певний незбіг у послідовностях таким бо чином, що будуть виявлятися нижчі ступені подібності (застосування гетерологічного зонда).

Зонд зазвичай має довжину, що становить менше приблизно ніж 1000 нуклеотидів, переважно має довжину, що становить менше ніж 500 нуклеотидів.

Жорсткі умови звичайно будуть такими, в яких концентрація солі становить менше ніж приблизно 1,5 М іонів Ма, зазвичай будучи концентрацією іонів Ма (або інших солей), яка становить від приблизно 0,01 до 1,0 М при рН від 7,0 до 8,3, а температура становить щонайменше приблизно 30 "С для коротких зондів (наприклад, від 10 до 50 нуклеотидів) та щонайменше приблизно 60 "С для довгих зондів (наприклад, більше 50 нуклеотидів). Жорстких умов також можна досягти шляхом додавання дестабілізувальних засобів, таких як формамід.

Ілюстративні умови зниженої жорсткості включають гібридизацію з буферним розчином, що містить 30-35 95 формамід, 1 М Масі, 195 505 (додецилсульфат натрію), при 37 "С та промивання в 1хХ-2Х 550 (20Х 550-3,0 М Масі/0,3 М цитрат тринатрію) при 50-55 76.

Ілюстративні умови помірної жорсткості включають гібридизацію в 40-45 95 формаміді, 1,0. М

Масі, 195 505 при 37 "С і промивання в 0,5Х-1Х 55С при 55-60 "С. Ілюстративні умови підвищеної жорсткості включають гібридизацію у 50 95 формаміді, 1 М Масі, 1 95 505 при 37 "С та промивання в 0,1Х 55С при 60-65 "С. Промивальні буфери необов'язково можуть містити від приблизно 0,1 95 до приблизно 1 95 505. Тривалість гібридизації, як правило, становить менше ніж приблизно 24 години, зазвичай від приблизно 4 до приблизно 12 годин.

Специфічність звичайно залежить від промивань після гібридизації, при цьому критичними чинниками є іонна сила та температура кінцевого промивального розчину. Для гібридів ДНК-

ДНК Тт можна приблизно визначити з рівняння за МеїіпКкоїй апа У/ані (1984) Апаї. Віоснет. 138:267-284: Тт-81,5 7С-16,6 (09 М) ж 0,41 (до) - 0,61 (95 форм) - 500/л; де М являє собою молярну концентрацію моновалентних катіонів, 9о0С являє собою відсотковий вміст гуанозинових та цитозинових нуклеотидів у ДНК, 96 форм являє собою відсотковий вміст формаміду у гібридизаційному розчині, а Ї являє собою довжину гібрида у парах основ. Тт являє собою температуру (за певних іонної сили та рН), за якої 50 95 комплементарної цільової послідовності гібридизується із зондом, що абсолютно збігається. Тят знижують на приблизно 1"С з кожним 1 95 незбігу; таким чином, Тт, умови гібридизації талабо промивання можна відкоригувати для гібридизації з послідовностями, які мають бажану ідентичність. Наприклад, якщо проводять пошук послідовностей з »90 95 ідентичністю, то Тя можна знизити на 10 "с.

Зо Зазвичай жорсткі умови обирають так, щоб температура була на приблизно 5 "С нижче за точку плавлення (Тт) конкретної послідовності та комплементарної їй послідовності за певних іонної сили та рН. Однак, в умовах надзвичайної жорсткості можна використовувати температуру гібридизації та/або промивання, на 1, 2, З або 4 "С нижчу за точку плавлення (Тт); в умовах помірної жорсткості можна використовувати температуру гібридизації та/або промивання, на 6, 7, 8,9 або 10"С нижчу за точку плавлення (Тт); в умовах зниженої жорсткості можна використовувати температуру гібридизації та/або промивання, на 11, 12, 13, 14, 15 або 207С нижчу за точку плавлення (Тт). Застосовуючи рівняння, гібридизаційні та промивні композиції та бажану Тт, середній фахівець у даній галузі зрозуміє, що зміни жорсткості гібридизаційних та/або промивних розчинів описані по своїй суті. Якщо бажаний ступінь незбігу дає у результаті

Ття менше 45"С (водний розчин) або 32 "С (розчин формаміду), переважно підвищувати концентрацію 55С, так щоб можна було застосовувати вищу температуру. Великий посібник з гібридизації нуклеїнових кислот міститься в Ті)ї55еп (1993) І арогаїогу Тесппіднез іп Віоспетівігу апа Моїесшіаг Віоіоау--Нубгіаіганомп м/йй Мисієїс Асійа Ргобез, Рай І, СНарієг 2 (ЕІземівгї, Мем

УогКк); та А!зибеї еї аї., ей5. (1995) Сигтепі РгоїосоЇ5 іп МоїІесшаг Віоіоду, Спарієг 2 (Сгеепе

Рибіївпіпд апа М/Пеу-Іпіегзсіепсе, Мем/ Могк). Див. затбгоок еї аІ. (1989) МоїІесшаг Сіопіпд: А

І арогаїогу Маппиаї (24 єд., Соїа 5рііпд Натог І арогаїюгу Ргезв, Соїа Зргіпу Нагїбог, Мем/ Моїгк).

Виділені білки, а також їх варіанти та фрагменти

Пестицидні білки також охоплено даним винаходом. Під "пестицидним білком" мається на увазі білок, що має амінокислотну послідовність, наведену під 5ЕО ІЮ Мо:7, 8, 9, 10, 11 або 12.

Також представлено фрагменти, біологічно активні частини та їх варіанти (наприклад, ЗЕО ІЮ

Мо:5, 6, 7 та 8), і вони можуть бути використані для практичного здійснення способів даного винаходу. Вираз "виділений білок" застосовується для позначення білка, який більше не перебуває у своєму природному середовищі, наприклад, перебуває в умовах іп міго або у рекомбінантній бактеріальній або рослинній клітині-хазяїні. "Фрагменти" або "біологічно активні частини" включають фрагменти поліпептидів, які містять амінокислотні послідовності, достатньою мірою ідентичні щодо амінокислотних послідовностей, наведених під 5ЕО ІЮ Мо:7, 8, 9, 10, 11 або 12, та які проявляють пестицидну активність.

Біологічно активна частина пестицидного білка може являти собою поліпептид завдовжки, наприклад, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 або більше амінокислот. Такі біологічно активні 60 частини можна отримати за допомогою методик рекомбінантних молекул та оцінити стосовно пестицидної активності. Способи вимірювання пестицидної активності добре відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, С7аріа апа І апд (1990) У. Есоп. Епіотої. 83:2480-2485; Апагемв еї а!. (1988) Віоспет. У. 252:199-206; Ма!топе еї аї. (1985) 9. ої Есопотіс Епютоіоду 78:290-293; та патент США Мо 5743477, усі з яких включено у даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті. Як застосовується у даному документі, фрагмент містить щонайменше 8 суміжних амінокислот ЗЕ ІЮ Мо:7, 8, 9, 10, 11 або 12. Даний винахід охоплює, однак, інші фрагменти, як, наприклад, будь-який фрагмент білка завдовжки більше ніж приблизно 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 або більше амінокислот.

У деяких варіантах здійснення фрагмент характеризується М-кінцевим або С-кінцевим усіканням щонайменше приблизно 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 або більше амінокислот порівняно з 5ЕО ІЮ Мо:7, 8, 9, 10, 11 або 12. У деяких варіантах здійснення фрагменти, охоплювані у даному документі, отримують як результат видалення С- кінцевих 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 або більше амінокислот, наприклад, шляхом протеолізу або шляхом вставки стоп-кодона в послідовність, яка кодує.

Під "варіантами" маються на увазі білки або поліпептиди, що мають амінокислотну послідовність, щонайменше на приблизно 60 95, 65 95, приблизно 70 95, 75 95, приблизно 80 95, 85 95, приблизно 90 95, 91 9», 92 9», 93 Фо, 94 Фо, 95 9», 96 90, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичну щодо амінокислотної послідовності зХЕО ІЮ Мо:7, 8, 9, 10, 11 або 12, або амінокислотну послідовність з 1,2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 або більше амінокислотними додаваннями, делеціями або замінами порівняно з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ Ме:2. Варіанти також включають поліпептиди, кодовані молекулою нуклеїнової кислоти, яка гібридизується з молекулою нуклеїнової кислоти 5ЕО ІЮ Мо:4, 5 або 6 або з комплементарною їй послідовністю у жорстких умовах. Варіанти включають поліпептиди, що відрізняються за амінокислотною послідовністю у зв'язку з мутагенезом. Варіанти білків, охоплювані даним винаходом, є біологічно активними, тобто вони продовжують мати бажану біологічну активність нативного білка, тобто зберігати пестицидну активність. У деяких варіантах здійснення варіанти мають поліпшену активність порівняно з нативним білком (наприклад, порівняно з Ахті205). Під виразом "зберігає активність" мається на увазі, що фрагмент буде мати пестицидну активність,

Зо що становить щонайменше приблизно 3095, щонайменше приблизно 5095, щонайменше приблизно 7095, 8095, 9095, 9595 або вище від такої пестицидного білка. Під виразом "поліпшена активність" мається на увазі підвищення, що становить щонайменше приблизно 10 95, щонайменше приблизно 15 95, щонайменше приблизно 20 95, щонайменше приблизно 2595, щонайменше приблизно 30 9565, щонайменше приблизно 35 95, щонайменше приблизно 4095, щонайменше приблизно 5095, бО З, 7095, 8095, 9095 або вище, або підвищення щонайменше у приблизно 1,5 рази, щонайменше у приблизно 2 рази, щонайменше у приблизно 2,5 рази, щонайменше у приблизно З рази або вище, пестицидної активності варіанта білка порівняно з пестицидною активністю Ахіті205. У деяких варіантах здійснення поліпшення полягає в зменшенні ЇС50 порівняно з ЇС50 для Ахті205, наприклад, у зменшенні, що становить щонайменше приблизно 1095, щонайменше приблизно 2095, щонайменше приблизно 30 95, щонайменше приблизно 40 95, щонайменше приблизно 50 9565, щонайменше приблизно 5595, щонайменше приблизно 6095, або у більшому зниженні ЇС50. Способи вимірювання пестицидної активності добре відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, С7аріа апа Гапд (1990) У. Есоп. Епіотої. 83:2480-2485; Апагему5 єї аї. (1988) Віоспет. 9. 252:199-206;

Ма!топе еї а!. (1985) 3. ої Есопотіс Епіотоїіоду 78:290-293; та патент США Мо 5743477, усі з яких включено у даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті.

Гени бактерій, такі як гени ахті за даним винаходом, досить часто мають декілька метіонінових ініціаторних кодонів у безпосередній близькості від початку відкритої рамки зчитування. Часто ініціація трансляції на одному або декількох із цих стартових кодонів зумовлює утворення функціонального білка. Ці стартові кодони можуть містити АТО-кодони.

Однак, бактерії, такі як Васійи5 5р., також розпізнають ЗТО-кодон як стартовий кодон, та білки, що ініціюють трансляцію на зТО-кодонах, містять амінокислоту метіонін у першому положенні.

У рідкісних випадках трансляція у бактеріальних системах може ініціюватися на ТТо-кодоні, хоча в цьому випадку ТО кодує метіонін. Крім того, часто не визначено а ргіогі, який з цих кодонів застосовують у бактерії природним чином. Таким чином, зрозуміло, що застосування одного з альтернативних метіонінових кодонів також може зумовлювати утворення пестицидних білків. Ці пестицидні білки охоплено даним винаходом, і їх можна застосовувати у способах за даним винаходом. Буде зрозуміло, що у разі експресії в рослинах буде необхідно змінювати альтернативний стартовий кодон на АТО для належної трансляції.

Також охоплено антитіла до поліпептидів за даним винаходом або до їх варіантів або фрагментів. Способи отримання антитіл добре відомі у даній галузі техніки (див., наприклад,

Напом апа І апе (1988) Апііродієв: А І арогаїютгу Мапиаї, Соїй ріпа Натог Іарогаїогу, Соїа зргіпд Нагбог, МУ; патент США Мо 4196265).

Таким чином, один аспект даного винаходу відноситься до антитіл, одноланцюгових антиген-зв'язувальних молекул або інших білків, що специфічно зв'язуються з однією або декількома молекулами білків або пептидів за даним винаходом та їх гомологами, молекулами злиття або фрагментами. В особливо переважному варіанті здійснення антитіло специфічно зв'язується з білком, який має амінокислотну послідовність, наведену під ЗЕО ІЮ Мо:7, 8, 9, 10, 11 або 12, або з його фрагментом. В іншому варіанті здійснення антитіло специфічно зв'язується з білком злиття, який містить амінокислотну послідовність, обрану з амінокислотної послідовності, наведеної під ЗЕО ІЮ Мо:7, 8, 9, 10, 11 або 12, або з його фрагментом.

Антитіла за даним винаходом можна застосовувати для кількісного або якісного виявлення молекул білків або пептидів за даним винаходом або для виявлення посттрансляційних модифікацій білків. Як застосовується у даному документі, кажуть, що антитіло або пептид "специфічно зв'язуються" з молекулою білка або пептиду за даним винаходом, якщо таке зв'язування не зазнає конкурентного інгібування завдяки наявності неспоріднених молекул.

Змінені або поліпшені варіанти

Вважається, що послідовності ДНК, які кодують пестицидний білок, можна додатково змінювати за допомогою різних способів, і що ці зміни можуть давати у результаті послідовності

ДНК, які кодують білки з амінокислотними послідовностями, відмінними від кодованих у пестицидному білку за даним винаходом. Даний білок можна змінювати різними способами, включаючи амінокислотні заміни, делеції, усікання та вставки однієї або декількох амінокислот

ЗЕО ІЮ Мо:2, включаючи до приблизно 2, приблизно 3, приблизно 4, приблизно 5, приблизно 6, приблизно 7, приблизно 8, приблизно 9, приблизно 10, приблизно 15, приблизно 20, приблизно 25, приблизно 30, приблизно 35, приблизно 40, приблизно 45, приблизно 50, приблизно 55, приблизно 60, приблизно 65, приблизно 70, приблизно 75, приблизно 80, приблизно 85, приблизно 90, приблизно 100, приблизно 105, приблизно 110, приблизно 115, приблизно 120, приблизно 125, приблизно 130, приблизно 135, приблизно 140, приблизно 145, приблизно 150,

Ко) приблизно 155 або більше амінокислотних замін, делецій або вставок. У деяких варіантах здійснення заміни мають місце у одному або декількох з амінокислотних положень 464, 465, 466 або 467 порівняно з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО Мо:2. У деяких варіантах здійснення варіант амінокислотної послідовності наведений під ЗЕО ІЮО Мо:7, 8, 9, 10, 11 або 12. Фахівець у даній області візьме до уваги, що у 5ЕО ІЮ Мео:7, 8, 9, 10, 11 або 12 можуть бути впроваджені додаткові амінокислотні додавання, заміни або делеції, як описано у даному документі.

Способи таких дій добре відомі у даній галузі техніки. Наприклад, варіанти амінокислотних послідовностей пестицидного білка можна отримати за допомогою мутацій у ДНК. Це також може бути виконано за допомогою одного або декількох видів мутагенезу та/або під час спрямованого розвитку. У деяких аспектах зміни, кодовані в амінокислотній послідовності, не будуть істотно впливати на функцію білка. Такі варіанти будуть мати бажану пестицидну активність. Проте зрозуміло, що здатність пестицидного білка до надання пестицидної активності можна поліпшити шляхом застосування таких методик щодо композицій за даним винаходом. Наприклад, можна експресувати пестицидний білок у клітинах-хазяїнах, які проявляють високі показники помилкового введденя основ під час реплікації ДНК, таких як ХІ -1

Кеа (5ігаїадепе, Ла-Холла, Каліфорнія). Після розмноження таких штамів можна виділити ДНК (наприклад, шляхом отримання плазмідної ДНК або шляхом ампліфікації за допомогою ПЛР та клонування отриманого у результаті ПЛР фрагмента у вектор), підтримувати мутації пестицидних білків у культурі немутагенного штаму та ідентифікувати мутантні гени з пестицидною активністю, наприклад, шляхом здійснення аналізу для тестування щодо пестицидної активності. Як правило, білок змішують та застосовують в аналізах із згодовуванням. Див., наприклад, Маггопе еї аї. (1985) 9. ої Есопотіс Епіотоіоду 78:290-293. Такі аналізи можуть включати приведення рослин у контакт з одним або декількома шкідниками та визначення здатності рослини до виживання та/або викликання загибелі шкідників.

Альтернативно, у білковій послідовності багатьох білків можуть бути здійснені зміни на аміно- або карбокси-кінці без істотного впливу на активність. Вони можуть включати вставки, делеції або зміни, впроваджувані за допомогою сучасних молекулярних способів, таких як ПЛР, включаючи ПЛР-ампліфікації, які змінюють або подовжують послідовність, що кодує білок, за допомогою включення послідовностей, які кодують амінокислоти, в олігонуклеотиди, використовувані в ПЛР-ампліфікації. Альтернативно, білкові послідовності, що додаються, бо можуть включати цілі послідовності, які кодують білки, такі як широко застосовувані у даній галузі техніки для утворення білків злиття. Такі білки злиття часто застосовують для (1) підвищення рівня експресії білка, що становить інтерес, (2) впровадження зв'язувального домену, ферментативної активності або епітопу для сприяння очищенню білка, виявленню білка або іншим шляхам експериментального застосування, відомим у даній галузі техніки, (3) цільової секреції або трансляції білка в субклітинну органелу, таку як периплазматичний простір грамнегативних бактерій або ендоплазматичний ретикулум еукаріотичних клітин, при цьому остання часто зумовлює глікозилювання білка.

Варіанти нуклеотидних та амінокислотних послідовностей за даним винаходом також охоплюють послідовності, отримані в результаті мутагенних та рекомбіногенних процедур, таких як ДНК-шафлінг. За допомогою такої процедури одну або декілька різних ділянок, які кодують пестицидний білок, можна застосовувати для створення нового пестицидного білка, який має бажані властивості. Таким чином, бібліотеки рекомбінантних полінуклеотидів утворюють із сукупності полінуклеотидів зі спорідненими послідовностями, які містять ділянки послідовностей, що мають значну ідентичність послідовностей та можуть бути піддані гомологічній рекомбінації в умовах іп міго або іп мімо. Наприклад, використовуючи такий підхід, мотиви послідовностей, які кодують домен, що становить інтерес, можна піддати шафлінгу між пестицидним геном за даним винаходом та іншими відомими пестицидними генами з отриманням нових генів, які кодують білок з поліпшеною властивістю, що становить інтерес, такою як підвищена інсектицидна активність. Стратегії такого ДНК-шафлінгу відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, біеттег (1994) Ргос. Май. Асай. сі. ОБА 91:10747-10751; біеттег (1994) Майшге 370:389-391; Статеті єї а. (1997) Маште Віоїесн. 15:436-438; Мооге 6вї аї!. (1997) 3.

Мої. Віої. 272:336-347; 7папо еї а. (1997) Ргос. Маї)!. Асад. 5сі. ОБА 94:4504-4509; Статеті евї аї. (1998) Майшге 391:288-291; та патенти США МоМо 5605793 і 5837458.

Перестановка або шафлінг доменів являє собою інший механізм для утворення змінених пестицидних білків. Домени можна піддати перестановці між пестицидними білками, що дає в результаті гібридні або химерні токсини з поліпшеними пестицидною активністю або спектром дії на цільові організми. Способи утворення рекомбінантних білків та їх тестування щодо пестицидної активності добре відомі у даній галузі техніки (див., наприклад, Маїтом еї аї. (2001)

Аррі. Епмігоп. Містобіої. 67:5328-5330; де Маада еї аї. (1996) Аррі. Епмігоп. Містобріо!. 62:1537- 1543; Се еї аї. (1991) 9. Віої. Спет. 266:17954-17958; ЗсПипері еї аї. (1990) 9. Віої. Спет. 265:20923-20930; Напа еї аї. (1999) Аррі. Епмігоп. Містовіо!. 65:2918-2925).

Вектори

Пестицидну послідовність за даним винаходом можна забезпечити в експресійній касеті для експресії у рослині, яка становить інтерес. Під "експресійною касетою для рослини" мається на увазі ДНК-конструкт, здатний зумовлювати експресію білка з відкритої рамки зчитування у рослинній клітині. Він зазвичай містить промотор та послідовність, яка кодує. Такі конструкти також часто містять 3'-нетрансльовану ділянку. Такі конструкти можуть містити "сигнальну послідовність" або "лідерну послідовність? яка сприяє котрансляційному або посттрансляційному транспорту пептиду в певні внутрішньоклітинні структури, такі як хлоропласт (або інша пластида), ендоплазматичний ретикулум або апарат Гольджі.

Під "сигнальною послідовністю" мається на увазі послідовність, яка, як відомо або як припускають, зумовлює котрансляційний або посттрансляційний транспорт пептидів клітинною мембраною. В еукаріот він зазвичай включає секрецію в апарат Гольджі з певним глікозилюванням, яке відбувається у результаті. Інсектицидні токсини бактерій часто синтезуються як протоксини, які зазнають протеолітичної активації у кишці цільового шкідника (Спапд (1987) Меїйодв Епгутої. 153:507-516). У деяких варіантах здійснення даного винаходу сигнальна послідовність перебуває у нативній послідовності або може бути отримана з послідовності за даним винаходом. Під "лідерною послідовністю" мається на увазі будь-яка послідовність, яка під час трансляції дає у результаті амінокислотну послідовність, достатню для запуску котрансляційного транспорту пептидного ланцюга в субклітинну органелу. Таким чином, це поняття включає лідерні послідовності, які цілеспрямовано впливають на транспорт та/або глікозилювання шляхом проходження в ендоплазматичний ретикулум, проходження у вакуолі, пластиди, у тому числі хлоропласти, мітохондрії тощо.

Під "вектором для трансформації рослин" мається на увазі молекула ДНК, необхідна для ефективної трансформації рослинної клітини. Така молекула може складатися з однієї або декількох експресійних касет для рослин і може бути організованою у більш ніж одну "векторну" молекулу ДНК. Наприклад, бінарні вектори являють собою вектори для трансформації рослин, у яких використовуються два несуміжні ДНК-вектори, які кодують усі необхідні цис- та транс-діючі функції для трансформації рослинних клітин (НеПеп5 апа Миїйїпеаих (2000) Тгепав іп Ріапі бо Зсіепсе 5:446-451). "Вектор" відноситься до конструкта нуклеїнової кислоти, призначеного для перенесення між різними клітинами-хазяїнами. "Вектор експресії" стосується вектора, що має здатність до включення, інтеграції та експресії гетерологічних послідовностей ДНК або фрагментів у чужорідній клітині. Касета буде включати 5'- та 3'-регуляторні послідовності, функціонально пов'язані з послідовностями за даним винаходом. Під "Функціонально пов'язаним" мається на увазі функціональний зв'язок між промотором і другою послідовністю, де промоторна послідовність ініціює та опосередковує транскрипцію послідовності ДНК, відповідної до другої послідовності. Зазвичай "функціонально пов'язаний" означає, що послідовності пов'язаних нуклеїнових кислот є суміжними, та, якщо є необхідність з'єднання двох ділянок, що кодують білок, вони є суміжними та перебувають в одній і тій самій рамці зчитування. Касета може додатково містити щонайменше один додатковий ген для котрансформації в організм. Альтернативно, додатковий ген (гени) можна забезпечувати в декількох експресійних касетах. "Промотор" відноситься до послідовності нуклеїнової кислоти, що функціонує для керування транскрипцією послідовності, яка кодує, розташованої нижче. Промотор, а також інші послідовності нуклеїнових кислот, які регулюють транскрипцію і трансляцію (що також мають назву "контрольних послідовностей"), є необхідними для експресії послідовності ДНК, що становить інтерес.

Така експресійна касета забезпечується з багатьма сайтами рестрикції для вставки пестицидної послідовності, регуляцію транскрипції якої будуть здійснювати регуляторні ділянки.

Експресійна касета у напрямку транскрипції 5-3" буде містити ділянку ініціації транскрипції і трансляції (тобто промотор), послідовність ДНК за даним винаходом та ділянку термінації транскрипції і трансляції (тобто ділянку термінації), що функціонують у рослинах. Промотор може бути нативним або аналогічним, або чужорідним або гетерологічним щодо рослини- хазяїна та/або послідовності ДНК за даним винаходом. Додатково, промотор може являти собою природну послідовність або, альтернативно, синтетичну послідовність. Якщо промотор є "нативним" або "гомологічним" щодо рослини-хазяїна, мається на увазі, що промотор трапляється у нативній рослині, у яку впроваджують промотор. Якщо промотор є "чужорідним" або "гетерологічним" щодо послідовності ДНК за даним винаходом, мається на увазі, що промотор не є нативним або таким, що трапляється у природі, промотором щодо функціонально пов'язаної послідовності ДНК за даним винаходом.

Ділянка термінації може бути нативною щодо ділянки ініціації транскрипції, може бути нативною щодо функціонально пов'язаної послідовності ДНК, що становить інтерес, може бути нативною щодо рослини-хазяїна або може походити з іншого джерела (тобто чужорідного або гетерологічного стосовно промотора, послідовності ДНК, що становить інтерес, рослини-хазяїна або будь-якої їх комбінації). Придатні ділянки термінації доступні з Ті-плазміди А. ішптегасієпв, такі як ділянки термінації генів октопінсинтази та нопалінсинтази. Див. також Спцегіпеаи еї аї. (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 262:141-144; Ргоцагоої (1991) Сеї! 64:671-674; Запіасоп еї аї. (1991)

Сепез Оєм. 5:141-149; Модеп еї аї. (1990) Ріапі Сеї! 2:1261-14272; Мипгоє еї аї. (1990) Сепе 91:151-158; ВаїІаз єї а!. (1989) Мисієїс Асід5 Нев. 17:7891-7903; та дозпі еї аї. (1987) Мисієїс Асій

Вев. 15:9627-9639.

У разі необхідності ген (гени) можна оптимізувати для експресії у трансформованій клітині- хазяїні на підвищеному рівні. Це означає, що гени можна синтезувати за допомогою кодонів, переважних для клітини-хазяїна, для поліпшення експресії або можна синтезувати за допомогою кодонів з частотою використання кодона, переважною для хазяїна. Вміст С у гені зазвичай буде підвищеним. Див., наприклад, СатрбеїЇ апа Соулті (1990) Ріапі Рпувіої. 92:1-11 щодо обговорення частоти використання кодона, переважної для хазяїна. Способи синтезу генів, переважних для рослин, доступні у даній галузі техніки. Див., наприклад, патенти США

МоМо 5380831 та 5436391 та Миїтау еї аї. (1989) Мисієїс Асіаз Кев5. 17:477-498, включені у даний документ за допомогою посилання.

В одному варіанті здійснення пестицидний білок націлений на хлоропласт для експресії.

Таким чином, якщо пестицидний білок не є безпосередньо введеним у хлоропласт, то експресійна касета буде додатково містити нуклеїнову кислоту, яка кодує транзитний пептид для спрямування пестицидного білка у хлоропласти. Такі транзитні пептиди відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, Моп Неї)пе еї аї. (1991) Ріапі Мої. Віо!. Кер. 9:104-126; СіагК єї а!. (1989) 5. Віої. Спет. 264:17544-17550; ОеїМПа-Сіорра еї аї. (1987) Ріапі Рпувзіо!. 84:965-968; НКотег" еї аї. (1993) Віоспет. Віорпуз. Без. Соттип. 196:1414-1421; та 5пай еї а!. (1986) Зсіепсе 233:478-481.

Пестицидний ген, що підлягає націлюванню на хлоропласт, може бути оптимізованим для експресії у хлоропласті для підрахунку відмінностей у частоті використання кодона між рослинним ядром та цією органелою. Таким чином, нуклеїнові кислоти, які становлять інтерес,

можна синтезувати за допомогою кодонів, переважних для хлоропластів. Див., наприклад, патент США Мо 5380831, включений у даний документ за допомогою посилання.

Трансформація рослин

Способи за даним винаходом включають впровадження нуклеотидного конструкта у рослину. Під "впровадженням" мається на увазі представлення нуклеотидного конструкта рослині таким чином, що конструкт отримує доступ до внутрішньої частини клітини рослини.

Способи за даним винаходом не вимагають того, щоб застосовували конкретний спосіб впровадження нуклеотидного конструкта в рослину, а тільки того, щоб нуклеотидний конструкт отримував доступ до внутрішньої частини щонайменше однієї клітини рослини. Способи впровадження нуклеотидних конструктів у рослини відомі в даній галузі техніки, у тому числі, без обмеження, способи стабільної трансформації, способи транзієнтної трансформації та способи, опосередковані вірусами.

Під "рослиною" маються на увазі цілі рослини, органи рослин (наприклад, листя, стебла, коріння тощо), насіння, рослинні клітини, пагони, зародки та їх потомство. Рослинні клітини можуть бути диференційованими або недиференційованими (наприклад, калюс, клітини суспензійної культури, протопласти, клітини листка, клітини кореня, клітини флоеми, пилок). "Трансгенні рослини", або "трансформовані рослини", або "стабільно трансформовані" рослини, або клітини, або тканини відносяться до рослин, що мають включені або інтегровані послідовності екзогенних нуклеїнових кислот або фрагменти ДНК у рослинній клітині. Ці послідовності нуклеїнових кислот включають такі, що є екзогенними або не присутніми у нетрансформованій рослинній клітині, а також такі, які можуть бути ендогенними або присутніми у нетрансформованій рослинній клітині. "Гетерологічний", як правило, відноситься до послідовностей нуклеїнових кислот, які не є ендогенними щодо клітини або частини нативного генома, у якому вони присутні, і додаються в клітину шляхом інфікування, трансфекції, мікроін'єкції, електропорації, бомбардування мікрочастинками або т. ін.

Трансгенні рослини за даним винаходом експресують одну або декілька послідовностей пестициду, розкритих у даному документі. У різних варіантах здійснення трансгенна рослина додатково містить один або декілька додаткових генів стійкості до комах, наприклад, один або декілька додаткових генів для боротьби зі шкідниками, що є твердокрилими, лускокрилими

Зо комахами, клопами або нематодами. Фахівцеві у даній галузі буде зрозуміло, що трансгенна рослина може містити будь-який ген, який надає агрономічну ознаку, що становить інтерес.

Трансформацію рослинних клітин можна виконувати за допомогою однієї з декількох методик, відомих у даній галузі техніки. Пестицидний ген за даним винаходом можна модифікувати з отриманням або посиленням експресії у рослинних клітинах. Конструкт, який експресує такий білок, зазвичай буде містити промотор, який керує транскрипцією гена, а також 3З-нетрансльовану ділянку, яка забезпечує можливість термінації транскрипції та поліаденілювання. Організація таких конструктів добре відома у даній галузі техніки. У деяких випадках може бути корисним таке конструювання гена, що отримуваний у результаті пептид секретується або в інший спосіб націлюється в рослинній клітині. Наприклад, ген може бути сконструйований таким, що містить сигнальний пептид, який сприяє перенесенню пептиду в ендоплазматичний ретикулум. Також може бути переважним таке конструювання експресійної касети для рослини, яка містить інтрон, що для експресії потрібен процесинг мРНК стосовно інтрона.

Зазвичай цю "експресійну касету для рослини" будуть вставляти у "вектор для трансформації рослин". Цей вектор для трансформації рослин може містити один або декілька

ДНК-векторів, необхідних для досягнення трансформації рослин. Наприклад, звичайною практикою у даній галузі техніки є використання векторів для трансформації рослин, які містять більше одного суміжного сегмента ДНК. Ці вектори у даній галузі техніки часто мають назву "бінарних векторів". Бінарні вектори, а також вектори з хелперними плазмідами найчастіше застосовують у трансформації, опосередкованій Адгобасіегіит, де розмір і складність сегментів

ДНК, необхідних для досягнення ефективної трансформації, є досить великими, і переважним є розподіл функцій між окремими молекулами ДНК. Бінарні вектори зазвичай містять плазмідні вектори, які містять цис-діючі послідовності, необхідні для перенесення Т-ДНК (такі як ліва погранична та права погранична), селективний маркер, сконструйований здатним до експресії у рослинній клітині, і "ген, що становить інтерес" (ген, сконструйований здатним до експресії у рослинній клітині, створення трансгенних рослин за яким є бажаним). Також у цьому плазмідному векторі присутні послідовності, необхідні для реплікації у бактерій. Цис-діючі послідовності розташовуються таким чином, щоб забезпечити можливість ефективного перенесення у рослинні клітини та експресії в них. Наприклад, селективний маркерний ген і бо пестицидний ген розташовуються між лівою та правою границями. Часто другий плазмідний вектор містить транс-діючі фактори, які опосередковують перенесення Т-ДНК з Адгобасіегічт у рослинні клітини. Ця плазміда часто містить фактори вірулентності (гени Міг), що забезпечують можливість інфікування рослинних клітин за допомогою Адгорасіегішт та перенесення ДНК шляхом розщеплення за пограничними послідовностями та міг--опосередкованого перенесення

ДНК, як розуміють у даній галузі техніки (НеПеп5 апа Миїййпеаих (2000) Тгепаз іп Ріапі 5сіепсе 5:446-451). Для трансформації рослин можна застосовувати декілька типів штамів

Адгорасієегішт (наприклад, Г/ВА4404, (33101, ЕНА1Т01, ЕНАТО5 тощо). Другий плазмідний вектор не є необхідним для трансформації рослин за допомогою інших способів, таких як бомбардування мікрочастинками, мікроін'єкція, електропорація, застосування поліетиленгліколю тощо.

У цілому, способи трансформації рослин включають перенесення гетерологічної ДНК у цільові рослинні клітини (наприклад, незрілі або зрілі зародки, суспензійні культури, недиференційований калюс, протопласти тощо) з наступним застосуванням відповідної селекції на максимальному граничному рівні (залежно від селективного маркерного гена) для виділення трансформованих рослинних клітин з групи нетрансформованих клітин у масі. Експлантати звичайно переносять у свіжоприготовлений запас того самого середовища та культивують згідно з стандартною методикою. Згодом трансформовані клітини диференціюються у паростки після поміщення у середовище для відновлення, доповнене селективним засобом на максимальному граничному рівні. Паростки потім переносять у селективне середовище для вкорінення для відновлення вкорінених паростків або проростків. З трансгенного проростка потім виростає зріла рослина та виробляє фертильне насіння (наприклад, Ніеєї еї а. (1994) Те

Ріапі уоцта! 6:271-282; ІбПпіда єї аії. (1996) Маїште Віоїесппоіоду 14:745-750). Експлантати зазвичай переносять у свіжоприготовлений запас того самого середовища та культивують згідно з стандартною методикою. Загальний опис методик і способів створення трансгенних рослин міститься в Ауге5 апа Рагк (1994) Стййса! Кемієму5 іп Ріапі Зсіепсе 13:219-239 та в

Воттіпепі апа дашнаг (1997) Маудіса 42:107-120. Оскільки трансформований матеріал містить багато клітин, то у будь-якій ділянці цільових калюсу, або тканини, або групи клітин, що зазнають впливу, присутні як трансформовані, так і нетрансформовані клітини. Здатність до знищення нетрансформованих клітин та забезпечення можливості проліферації

Зо трансформованих клітин дає в результаті культури трансформованих рослин. Здатність до видалення нетрансформованих клітин часто обмежує швидке виділення трансформованих рослинних клітин і вдале створення трансгенних рослин.

Протоколи трансформації, а також протоколи впровадження нуклеотидних послідовностей у рослини можуть відрізнятися залежно від типу рослини або рослинної клітини, тобто однодольних або дводольних, призначених для трансформації. Створення трансгенних рослин можна здійснювати за допомогою одного з декількох способів, включаючи, без обмеження, мікроін'єкцію, електропорацію, пряме перенесення генів, впровадження гетерологічної ДНК за допомогою Адгобасіегішт у рослинні клітини (трансформація, опосередкована Адгорасіегіит), бомбардування рослинних клітин за допомогою гетерологічної чужорідної ДНК, що налипає на частинки, балістичне прискорення частинок, трансформацію за допомогою пучка аерозольних частинок (опублікована заявка на патент США Мо 20010026941; патент США Мо 4945050; міжнародна публікація Мо М/О 91/00915; опублікована заявка на патент США Мо 2002015066), трансформацію за допомогою Гесі та різні інші способи прямого та опосередкованого перенесення ДНК без застосування частинок.

Способи трансформації хлоропластів добре відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, зЗмар еї аї. (1990) Ргос. Маї). Асай. осі. ОБА 87:8526-8530; 5маб апа Маїїда (1993) Ргос. Маї).

Асад. Зсі. ОБА 90:913-917; мар апа Маїїда (1993) ЕМВО 3. 12:601-606. Спосіб базується на доставці ДНК, яка містить селективний маркер, за допомогою генної гармати та цілеспрямованому впливі ДНК на геном пластид за допомогою гомологічної рекомбінації.

Додатково, трансформацію пластид можна виконувати шляхом трансактивації мовчазного пластидного трансгена за допомогою переважної для тканини експресії РНК-полімерази, кодованій у ядрі, яка спрямовується в пластиди. Про таку систему повідомлялося в МеВгіде еї а!. (1994) Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 91:7301-7305.

Після інтеграції гетерологічної чужорідної ДНК у рослинні клітини в середовищі можна застосовувати відповідну селекцію на максимальному граничному рівні для знищення нетрансформованих клітин та відокремлення і забезпечення проліферації передбачуваних трансформованих клітин, що вижили після цієї обробки за типом селекції, шляхом регулярного перенесення у свіжоприготовлене середовище. Шляхом безперервного пасивування та випробування за допомогою відповідної селекції ідентифікують клітини, трансформовані за бо допомогою плазмідного вектора, і забезпечують їх проліферацію. Потім можна застосовувати молекулярні та біохімічні способи для підтвердження наявності інтегрованого гетерологічного гена, що становить інтерес, у геномі трансгенної рослини.

З трансформованих клітин можна вирощувати рослини відповідно до традиційних способів.

Див., наприклад, МеСогтісК еї аї. (1986) Ріапі Сеї! Керогіб5 5:81-84. Ці рослини можна потім вирощувати та навіть запилювати тим самим трансформованим штамом або різними штамами, і можна ідентифікувати отриманий гібрид, що характеризується конститутивною експресією бажаної фенотипової характеристики. Можна вирощувати дві або більше генерації для гарантування стабільної підтримки та наслідування експресії бажаної фенотипової характеристики та потім збирати врожай насіння для гарантування досягнення бажаної фенотипової характеристики. Таким чином, даний винахід забезпечує трансформоване насіння (яке також має назву "трансгенного насіння"), яке має нуклеотидний конструкт за даним винаходом, наприклад, експресійну касету за даним винаходом, стабільно включений у його геном.

Оцінювання трансформації рослин

Після впровадження гетерологічної чужорідної ДНК у рослинні клітини трансформацію або інтеграцію гетерологічного гена у геном рослин підтверджують за допомогою різних способів, таких як аналіз нуклеїнових кислот, білків та метаболітів, асоційованих з інтегрованим геном.

ПЛР-аналіз є швидким способом скринінгу трансформованих клітин, тканин або паростків щодо наявності введеного в них гена на ранній стадії перед пересаджуванням у грунт (бБатргооК апіа Вивзеї! (2001) МоїІесшаг Сіопіпд: А Іарогаїгу МапиаЇ. Соїй Оргіпд Нагбог

ІГарогаїогу Рге55, Соїй Зргіпд Нагрог, МУ). ПЛР проводять за допомогою олігонуклеотидних праймерів, специфічних щодо гена, що становить інтерес, або вектора у середовищі

Адгорасієегішт, тощо.

Трансформацію рослин можна підтвердити за допомогою Саузерн-блот-аналізу геномної

ДНК (Затьгоок апа Киззеїї, 2001, зирга). У цілому, загальну ДНК екстрагують з трансформанту, розщеплюють за допомогою відповідних ферментів рестрикції, фракціонують в агарозному гелі та переносять на нітроцелюлозну або нейлонову мембрану. Мембрану або "блот" потім зондують за допомогою, наприклад, фрагмента цільової ДНК з радіоактивною міткою ЗР для підтвердження інтеграції впровадженого гена в геном рослини згідно зі стандартними методиками (затргоок апа Киззеїї, 2001, вирга).

У нозерн-блот-аналізі РНК виділяють з конкретних тканин трансформанту, фракціонують в агарозному гелі, який містить формальдегід, та блотують на нейлоновому фільтрі згідно з стандартними процедурами, зазвичай застосовуваними у даній галузі техніки (ЗатбгоокК апа

Вивзеїї, 2001, 5ирга). Експресію РНК, кодованої пестицидним геном, потім тестують шляхом гібридизації фільтра з радіоактивним зондом, отриманим з пестицидного гена, за допомогою способів, відомих у даній галузі техніки (ЗатьгоокК апа Киззеї, 2001, вирга).

Вестерн-блотинг, біохімічні аналізи й таке інше можна проводити на трансгенних рослинах для підтвердження наявності білка, кодованого пестицидним геном, за допомогою стандартних процедур (ЗатбгоокК апа Киззеїї, 2001, вирга), застосовуючи антитіла, які зв'язуються з одним або декількома епітопами, присутніми у пестицидному білку.

Пестицидна активність у рослин

В іншому аспекті даного винаходу можна створити трансгенні рослини, у яких експресується пестицидний білок, що має пестицидну активність. Способи, описані вище як приклад, можна використовувати для створення трансгенних рослин, але те, яким чином створюють трансгенні рослинні клітини, не є критично важливим для даного винаходу. Способи, відомі або описані у даній галузі техніки, такі як трансформація, опосередкована Лдгобасіегішт, біобалістична трансформація та способи, не опосередковані частинками, можна застосовувати за бажанням експериментатора. Рослини, у яких експресується пестицидний білок, можна виділяти за допомогою відомих способів, описаних у даній галузі техніки, наприклад, за допомогою трансформації калюсу, селекції трансформованого калюсу та регенерації фертильних рослин з такого трансгенного калюсу. У такому способі можна застосовувати будь-який ген як селективний маркер, оскільки його експресія в рослинних клітинах забезпечує можливість ідентифікації або селекції трансформованих клітин.

Для застосування у рослинних клітинах було розроблено низку маркерів, таких як маркери стійкості до хлорамфеніколу, аміноглікозиду 5418, гігроміцину тощо. Інші гени, які кодують продукт, залучений до метаболізму у хлоропластах, також можна застосовувати як селективні маркери. Наприклад, гени, які забезпечують стійкість до гербіцидів для рослин, таких як гліфосат, бромоксиніл або імідазолінон, можуть знаходити особливе застосування. Про такі гени повідомлялося в ЗіаїЇКег еї аіІ. (1985) У. Віої. Спет. 263:6310-6314 (ген нітрилази, що бо забезпечує стійкість до бромоксинілу) та Заїпавзімап еї аїЇ. (1990) Мисі. Асід5 Ке5. 18:2188 (ген

АНАФ5Б, що забезпечує стійкість до імідазолінону). Додатково, гени, розкриті у даному документі, є застосовними як маркери для оцінки трансформації бактеріальних або рослинних клітин.

Способи виявлення наявності трансгена в рослинах, органах рослин (наприклад, у листі, стеблах, корінні тощо), насінні, рослинних клітинах, пагонах, зародках або їх потомстві добре відомі у даній галузі техніки. В одному варіанті здійснення наявність трансгена виявляють шляхом тестування щодо пестицидної активності.

Фертильні рослини, у яких експресується пестицидний білок, можна тестувати щодо пестицидної активності, а рослини, які показують оптимальну активність, відбирають для подальшої селекції. У даній галузі техніки доступні способи для проведення аналізу активності щодо шкідників. Як правило, білок змішують та застосовують в аналізах із згодовуванням. Див., наприклад, Ма!їтопе еї аї. (1985) 9. ої Есопотіс Епіотоіоду 78:290-293.

Даний винахід можна застосовувати для трансформації будь-яких видів рослин, включаючи, без обмеження, однодольні та дводольні. Приклади рослин, що становлять інтерес, включають, без обмеження, кукурудзу (маїс), сорго, пшеницю, соняшник, томат, хрестоцвіті, види перцю, картоплю, бавовник, рис, сою, цукровий буряк, цукрову тростину, тютюн, ячмінь та олійний рапс,

Вгазвзіса 5р., люцерну, жито, просо, сафлор, земляний горіх, солодку картоплю, маніок, кавове дерево, кокосову пальму, ананас, цитрусові дерева, какао, чай, банан, авокадо, інжир, гуаяву, манго, маслину, папаю, кеш'ю, макадамію, мигдаль, овес, овочі, декоративні рослини і хвойні рослини.

Овочі включають, без обмеження, томат, латук, овочеву зеленостручкову квасолю, лімську квасолю, горох та представників роду Сигситів, таких як огірок, канталупа та мускусна диня.

Декоративні рослини включають, без обмеження, азалію, гортензію, гібіскус, троянду, тюльпан, жовтий нарцис, петунію, гвоздику, пуансетію та хризантему. Рослини за даним винаходом переважно є культурними рослинами (наприклад, маїс, сорго, пшениця, соняшник, томат, хрестоцвіті, види перцю, картопля, бавовник, рис, соя, цукровий буряк, цукрова тростина, тютюн, ячмінь, олійний рапс тощо).

Застосування у боротьбі за допомогою пестицидів

Загальні способи використання штамів, що містять нуклеотидну послідовність за даним винаходом або її варіант, у боротьбі за допомогою пестицидів або у конструюванні інших організмів як пестицидних засобів відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, патент США Мо 5039523 та ЕР 0480762А2.

Штами Васіїйи5, що містять нуклеотидну послідовність за даним винаходом або її варіант, або мікроорганізми, які містять пестицидний ген та білок як результат генної зміни, можна застосовувати у захисті сільськогосподарських культур та продуктів від шкідників. В одному аспекті даного винаходу цілі, тобто нелізовані, клітини організму, який виробляє токсин (пестицид), обробляють реагентами, що продовжують активність токсину, вироблюваного в клітині, у разі внесення клітини в середовище існування цільового шкідника (шкідників).

Альтернативно, пестицид виробляється за допомогою впровадження пестицидного гена в клітинного хазяїна. Експресія пестицидного гена прямо або непрямо зумовлює внутрішньоклітинне вироблення та підтримку рівня пестициду. В одному аспекті даного винаходу ці клітини потім обробляють в умовах, у яких продовжується активність токсину, вироблюваного в клітині, у разі внесення клітини в середовище існування цільового шкідника (шкідників). Отриманий продукт зберігає токсичність токсину. Ці пестициди, інкапсульовані природним чином, можна потім складати відповідно до традиційних методик для внесення у середовище існування, у якому перебуває цільовий шкідник, наприклад, у грунт, воду й листя рослин. Див., наприклад, ЕРА 0192319 та посилання, які наводяться там. Альтернативно, можна складати клітини, які експресують ген за даним винаходом, таким чином, щоб забезпечити можливість застосування отримуваного матеріалу як пестициду.

Пестицидні композиції

Активні інгредієнти за даним винаходом зазвичай вносять у формі композицій, і їх можна вносити на посівну площу або рослину, що підлягають обробці, одночасно або послідовно з іншими сполуками. Ці сполуки можуть являти собою добрива, засоби боротьби з бур'янами, кріопротектори, поверхнево-активні речовини, мийні засоби, пестицидні мила, олії для внесення в період спокою, полімери та/або склади носіїв з уповільненим вивільненням або біорозкладані такі, які дозволяють здійснювати тривале дробове внесення на цільову площу після одноразового внесення складу. Вони також можуть являти собою селективні гербіциди, хімічні інсектициди, віруліциди, мікробіциди, амебіциди, пестициди, фунгіциди, бактерициди, нематициди, молюскоциди або суміші деяких із цих препаратів, за бажання, разом з додатковими носіями, прийнятними у сільському господарстві, поверхнево-активними 60 речовинами або допоміжними засобами, що стимулюють внесення, зазвичай використовуваними в галузі отримання складів. Придатні носії та допоміжні засоби можуть бути твердими або рідкими та відповідати речовинам, звичайно використовуваним у технології отримання складів, наприклад, природним або регенерованим мінеральним речовинам, розчинникам, диспергувальним засобам, змочувальним засобам, речовинам для підвищення клейкості, зв'язувальним речовинам або добривам. Подібним чином, склади можна отримати у формі їстівних "приманок" або надати їм вид "пасток" для шкідників, щоб дозволити згодовування цільовому шкіднику або поглинання таким пестицидного складу.

Способи застосування активного інгредієнта за даним винаходом або агрохімічної композиції за даним винаходом, яка містить щонайменше один опестицидний білок, вироблюваний бактеріальними штамами за даним винаходом, включають нанесення на листя, дражирування насіння і внесення в грунт. Число внесень та норма внесення залежать від інтенсивності зараження відповідним шкідником.

Композицію можна скласти у формі порошку, пилоподібного препарату, пелети, гранули, розпорошуваного розчину, емульсії, колоїдного розчину, істинного розчину або т. ін. і можна отримати за допомогою таких традиційних способів, як висушування, ліофілізація, гомогенізація, екстракція, фільтрація, центрифугування, седиментація або концентрування культури клітин, що містять поліпептид. У всіх таких композиціях, які містять щонайменше один такий пестицидний поліпептид, поліпептид може бути присутнім у концентрації від приблизно 1 95 до приблизно 99 95 за масою.

Шкідників, що є лускокрилими, двокрилими комахами, клопами, нематодами або твердокрилими комахами, можна знищити, або їх чисельність на даній площі можна скоротити за допомогою способів за даним винаходом, або можна здійснювати профілактичне застосування цих способів щодо ділянки довкілля для попередження зараження сприйнятливим шкідником. Переважно, шкідник поглинає пестицидно ефективну кількість поліпептиду або контактує з нею. Під "пестицидно ефективною кількістю" мається на увазі кількість пестициду, здатна викликати загибель щонайменше одного шкідника або значно послаблювати ріст, харчування або нормальний фізіологічний розвиток шкідників. Ця кількість буде варіювати залежно від таких чинників, як, наприклад, конкретні цільові шкідники, з якими слід боротися, конкретне середовище існування, місце розташування, рослина, сільськогосподарська культура

Ко) або сільськогосподарська ділянка, що підлягають обробці, умови довкілля та спосіб, норма, концентрація, стабільність і кількість внесень композиції пестицидно ефективного поліпептиду.

Склади також можуть варіювати з урахуванням кліматичних умов, міркувань, пов'язаних із забрудненням довкілля, та/або частоти внесення, та/або тяжкості зараження шкідниками.

Розкриті пестицидні композиції можна отримувати шляхом складання або бактеріальної клітини, кристалічної суспензії та/або суспензії спор, або виділеного білкового компонента з бажаним носієм, прийнятним з точки зору сільського господарства. Композиції можна складати перед уведенням за допомогою відповідних способів, таких як ліофілізація, сублімаційне сушіння, висушування, або у водному носії, середовищі або придатному розріджувачі, такому як сольовий розчин або інший буфер. Складені композиції можуть бути у формі пилоподібного або гранулярного матеріалу, або суспензії в олії (рослинній або мінеральній), або водної емульсії, або емульсії типу олія у воді, або у формі змочуваного порошку, або в комбінації з будь-яким іншим матеріалом-носієм, придатним для застосування у сільському господарстві. Придатні носії, застосовувані у сільському господарстві, можуть бути твердими або рідкими та добре відомі у даній галузі техніки. Вираз "носій, придатний у сільському господарстві" охоплює всі допоміжні засоби, інертні компоненти, диспергувальні засоби, поверхнево-активні речовини, речовини для підвищення клейкості, зв'язувальні речовини тощо, зазвичай застосовувані у технології складання пестицидів; вони добре відомі фахівцеві у галузі складання пестицидів.

Склади можна змішувати з одним або декількома твердими або рідкими допоміжними засобами та отримувати за допомогою різних способів, наприклад, шляхом гомогенного змішування, розмішування та/або подрібнювання пестицидної композиції з придатними допоміжними засобами за допомогою традиційних методик складання. Придатні склади та способи застосування описано у патенті США Мо 6468523, включеному у даний документ за допомогою посилання.

Рослини також можна обробляти за допомогою однієї або декількох хімічних композицій, у тому числі одним або декількома гербіцидами, інсектицидами та фунгіцидами. Ілюстративні хімічні композиції включають: гербіциди для фруктів/овочів: атразин, бромацил, діурон, гліфосат, лінурон, метрибузин, симазин, трифлуралін, рлуазифоп, глюфосинат, галосульфурон

Соулап, паракват, пропізамід, сетоксидим, бутафенацил, галосульфурон, індазифлам; інсектициди для фруктів/овочів: альдикарб, Васійи5 (игіепдіепвіз5, карбарил, карбофуран, бо хлорпірифос, циперметрин, дельтаметрин, діазинон, малатіон, абамектин, цифлутрин/бета-

цифлутрин, есфенвалерат, лямбда-цигалотрин, ацеквіноцил, біфеназат, метоксифенозид, новалурон, хромафенозид, тіаклоприд, динотефуран, флуакрипірим, толфенпірад, клотіанідин, спіродиклофен, гамма-цигалотрин, спіромезифен, спіносад, ринаксипір, ціазипір, трифлумурон, спіротетрамат, імідаклоприд, флубендіамід, тіодикарб, метафлумізон, сульфоксафлор, цифлуметофен, ціанопірафен, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, спіноторам, тіодикарб, флонікамід, метіокарб, бензоат емамектину, індоксакарб, фозтіазат, фенаміфос, кадусафос, пірипроксифен, фенбутатиноксид, гекстіазокс, метоміл, 4-((б-хлорпіридин-3-ілуметилі|(2,2- дифторетил)аміно|фуран-2(5Н)-он; фунгіциди для фруктів/овочів: карбендазим, хлорталоніл,

ЕВОС, сірку, тіофанат-метил, азоксистробін, цимоксаніл, флуазинам, фосетил, іпродіон, крезоксим-метил, металаксил/у"мефеноксам, трифлоксистробин, етабоксам, іпровалікарб, трифлоксистробін, фенгексамід, фумарат окспоконазолу, ціазофамід, фенамідон, зоксамід, пікоксистробін, піраклостробін, цифлуфенамід, боскалід; гербіциди для злаків: ізопротурон, бромоксиніл, іоксиніл, феноксильні гербіциди, хлорсульфурон, клодинафоп, диклофоп, дифлуфенікан, феноксапроп, флорасулам, флуроксипір, метсульфурон, тріасульфурон, флукарбазон, іодсульфурон, пропоксикарбазон, піколінафен, мезосульфурон, бефлубутамід, піноксаден, амідосульфурон, тифенсульфурон, трибенурон, флупірсульфурон, сульфосульфурон, пірасульфотол, піроксулам, флуфенацет, тралкоксидим, піроксасульфон; фунгіциди для злаків: карбендазим, хлорталоніл, азоксистробін, ципроконазол, ципродиніл, фенпропіморф, епоксиконазол, крезоксим-метил, квіноксифен, тебуконазол, трифлоксистробін, симеконазол, пікоксистробін, піраклостробін, димоксистробін, протіоконазол, флуоксастробін; інсектициди для злаків: диметоат, лямбда-цигалотрин, дельтаметрин, альфа-циперметрин, 0- цифлутрин, біфентрин, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, хлорпірифос, метамідофос, оксидеметон-метил, піримікарб, метіокарб; гербіциди для маїсу: атразин, алахлор, бромоксиніл, ацетохлор, дикамба, клопіралід, (5-)диметенамід, глюфосинат, гліфосат, ізоксафлютол, (5-)метолахлор, мезотріон, нікосульфурон, примісульфурон, римсульфурон, сулкотріон, форамсульфурон, топрамезон, темботріон, сафлуфенацил, тієнкарбазон, флуфенацет, піроксасульфон; інсектициди для маїсу: карбофуран, хлорпірифос, біфентрин, фіпроніл, імідаклоприд, лямбда-цигалотрин, тефлутрин, тербуфос, тіаметоксам, клотіанідин, спіромезифен, флубендіамід, трифлумурон, ринаксипір,

Зо дельтаметрин, тіодикарб, б-цифлутрин, циперметрин, біфентрин, люфенурон, трифлуморон, тефлутрин, тебупіримфос, етипрол, ціазипір, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, авермектин, метіокарб, спіродиклофен, спіротетрамат; фунгіциди для маїсу: фенітропан, тирам, протіоконазол, тебуконазол, трифлоксистробін; гербіциди для рису: бутахлор, пропаніл, азимсульфурон, бенсульфурон, цигалофоп, даімурон, фентразамід, імазосульфурон, мефенацет, оксазикломефон, піразосульфурон, пірибутикарб, квінклорак, тіобенкарб, інданофан, флуфенацет, фентразамід, галосульфурон, оксазикломефон, бензобіциклон, пірифталід, пеноксулам, біспірибак, оксадіаргіл, етоксисульфурон, претилахлор, мезотріон, тефурилтріон, оксадіазон, феноксапроп, піримісульфан; інсектициди для рису: діазинон, фенітротіон, фенобукарб, монокротофос, бенфуракарб, бупрофезин, динотефуран, фіпроніл, імідаклоприд, ізопрокарб, тіаклоприд, хромафенозид, тіаклоприд, дінотефуран, клотіанідин, етипрол, флубендіамід, ринаксипір, дельтаметрин, ацетаміприд, тіаметоксам, ціазипір, спіносад, спіноторам, бензоат емамектину, циперметрин, хлорпірифос, картап, метамідофос, етофенпрокс, триазофос, 4-((б-хлорпіридин-3-іл)уметил|(2,2-дифторетил)аміно|фуран-2(5Н)-он, карбофуран, бенфуракарб; фунгіциди для рису: тіофанат-метил, азоксистробін, карпропамід, едифенфос, феримзон, іпробенфос, ізопротіолан, пенцикурон, пробеназол, піроквілон, трициклазол, трифлоксистробін, диклоцимет, феноксаніл, симеконазол, тіадиніл; гербіциди для бавовнику: діурон, флуометурон, М5МА, оксифлуорфен, прометрин, трифлуралін, карфентразон, клетодим, флуазифоп-бутил, гліфосат, норфлуразон, пендиметалін, піритіобак- натрій, трифлоксисульфурон, тепралоксидим, глюфосинат, флуміоксазин, тидіазурон; інсектициди для бавовнику: ацефат, альдикарб, хлорпірифос, циперметрин, дельтаметрин, малатіон, монокротофос, абамектин, ацетаміприд, бензоат емамектину, імідаклоприд, індоксакарб, лямбда-цигалотрин, спіносад, тіодикарб, гамма-цигалотрин, спіромезифен, піридаліл, флонікамід, флубендіамід, трифлумурон, ринаксипір, бета-цифлутрин, спіротетрамат, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, динетофуран, флубендіамід, ціазипір, спіносад, спіноторам, гамма-цигалотрин, 4-І(б-хлорпіридин-3-іл)метилі(2,2- дифторетил)аміно|фуран-2(5Н)-он, тіодикарб, авермектин, флонікамід, піридаліл, спіромезифен, сульфоксафлор, профенофос, триазофос, ендосульфан; фунгіциди для бавовнику: етридіазол, металаксил, квінтозен; гербіциди для сої: алахлор, бентазон, трифлуралін, хлоримурон-етил, клорансулам-метил, феноксапроп, фомесафен, флуазифоп, 60 гліфосат, імазамокс, імазаквін, імазетапір, (5-)метолахлор, метрибузин, пендиметалін,

тепралоксидим, глюфосинат; інсектициди для сої: лямбда-цигалотрин, метоміл, паратіон, тіокарб, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, флубендіамід, ринаксипір, ціазипір, спіносад, спіноторам, бензоат емамектину, фіпроніл, етипрол, дельтаметрин, йБ-цифлутрин, гамма- та лямбда-цигалотрин, 4-((б-хлорпіридин-3- іл)уметил|(2,2-дифторетил)аміно|фуран-2(5Н)-он, спіротетрамат, спінодиклофен, трифлумурон, флонікамід, тіодикарб, бета-цифлутрин; фунгіциди для сої: азоксистробін, ципроконазол, епоксиконазол, флутриафол, піраклостробін, тебуконазол, трифлоксистробін, протіоконазол, тетраконазол; гербіциди для цукрового буряка: хлоридазон, десмедифам, етофумезат, фенмедифам, триаллат, клопіралід, флуазифоп, ленацил, метамітрон, квінмерак, циклоксидим, трифлусульфурон, тепралоксидим, квізалофоп; інсектициди для цукрового буряка: імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, дельтаметрин, -цифлутрин, гамма/лямбда-цигалотрин, 4-І(б-хлорпіридин-3-іл)метилі(2,2- дифторетил)аміно|фуран-2(5Н)-он, тефлутрин, ринаксипір, ціаксипір, фіпроніл, карбофуран; гербіциди для каноли: клопіралід, диклофоп, флуазифоп, глюфосинат, гліфосат, метазахлор, трифлуралін, етаметсульфурон, квінмерак, квізалофоп, клетодим, тепралоксидим; фунгіциди для каноли: азоксистробін, карбендазим, флудіоксоніл, іпродіон, прохлораз, вінклозолін; інсектициди для каноли: карбофуран, фосфорорганічні сполуки, піретроїди, тіаклоприд, дельтаметрин, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, ацетаміприд, динетофуран, б- цифлутрин, гамма- і лямбда-цигалотрин, тау-флювалінат, етипрол, спіносад, спіноторам, флубендіамід, ринаксипір, ціазипір, 4-((б-хлорпіридин-3-іл)уметил|(2,2-дифторетил)аміно|фуран- 2(5Н)-он. "Шкідник" включає, без обмеження, комах, гриби, бактерії, нематод, кліщиків, іксодових кліщів тощо. Комахи-шкідники включають комах, обраних з рядів СоіІеорієга, Оірієга,

Нутепорієга, Іерідорієга, МаїЇорнада, Ноторієга, Нетірієга, ОпПгорієга, Тнузапоріега,

Регтаріега, Ізорієга, Апоріига, зірпопаріега, Тгіспоріега тощо, зокрема, СоіІеорієга, І ерідорієга та Оіріеєга.

Ряд СоІеоріега включає підряди Адерпада та РоїІурпада. Підряд Адерпада включає надродини Сагароїдеа та Сугіпоїдеа, а підряд Роїурпада включає надродини Нуагорпйоідеа, еарнуїїпоіїдеа, Сапінагоіїдєа, Сієгоіїдеа, ЕЇІаієегоїдеа, ОазсПоїдеа, Огуороіїдеа, Вуппоїіаєа,

Зо Сисціоідеа, Меїіоїдеа, Могаеіоідеа, Тепебгіопоіїдеа, Возіпсноїдва, Зсагараєсідеа, Сегатбрусоїдеа,

Спгузотеїоідеа та Сигсшіопоїдеа. Надродина Сагабоїдеа включає родини Сісіпаеїїдає,

Сагарідає та бБуїзсідае. Надродина Сугіпоїддеа включає родину Сугіпідае. Надродина

Нуагорпійоідеа включає родину НуагорпПіййдає. Надродина б5біарпуїйпоїдеа включає родини зіїрпідає та зіарпуїіпідає. Надродина Сапіпагоїдеа включає родини Сапіпагідає та І атругідає.

Надродина Сіегоїдеа включає родини Сіегідаеє та Оегтевзійдає. Надродина ЕпІагегоїддеа включає родини ЕПІагегідае та Виргевідає. Надродина Сисціоїдеа включає родину СоссіпейПаае.

Надродина Меїоідеа включає родину Меїоідає. Надродина Тепебгіопоїдеа включає родину

Тепергпопічає. Надродина Зсагараеоїдеа включає родини Рабззаїйдаеє та Зсагабраєїдає.

Надродина Сегатбрусоїдеа включає родину Сегатрусідає. Надродина СпгузотеїоіЇдеа включає родину Спгузотеїїдає. Надродина Сигсціопоїдеа включає родини Сигсціопідає та 5соїуйаавє.

Ряд бОіріега включає підряди Метаїйосега, Вгаспусега та Сусіоппарпа. Підряд Метаїйосега включає родини Тіршідає, Рзусподідає, Спиїсідає, Сегаюродопідає, Спіюопотідає, бітиїїадає,

Вібіопідае та Сесідоптуїійає. Підряд Вгаспусега включає родини З5ігайотуідає, Тарапідає,

Тпегемідає, Азійдає, Муадаідає, Вотрбуїйдає та Роїїспородідає. Підряд Сусіогпарнпа включає секції

Азспіга та Азсопіга. Секція Азспіга включає родини РІогідає, 5угрпідає та Сопорідає. Секція

Азспілга включає підсекції АсаїІурігаїае та Саїурігаїаеє. Підсекція Асаїурігаїає включає родини

Оїшідає, Терпгйаає, Адготуідає та Огозорпййдае. Підсекція Саїурігаїає включає родини

Нірробозсідає, Оеєзігідає, Таспіпідає, Апіпотуїдає, Мизсідає, Саїрпогідає та Ззагсорпадідає.

Ряд Іерідоріега включає родини Раріїопідає, Рієегідає, Гусаєпідає, Мутрпаїйдаеє, бапаїдає, Зайїупадає, Незрегіїдає, Зрпіпдідає, Заштіїдає, Сеотеїідає, Агсійдає, Мосіцідає, І утапінідає, зевіїдає та Тіпеідає.

Комахи-шкідники за даним винаходом, які пошкоджують основні сільськогосподарські культури, включають: маїс: Об5ігіпіа пибріїаійх, кукурудзяного метелика; Аагоїі5 ірзіп, совку- іпсилон; Неїїсомегра 7еа, кукурудзяну совку; З5родорієега їгидірегда, кукурудзяну листяну совку;

Оіайгаєа дгапаїозеМйа, південно-західну кукурудзяну вогнівку; ЕІазтораїри5 Іідпозеї5, кукурудзяну стеблову вогнівку; Оіаїгаєа зассвагаїї5, стеблового точильника цукрової тростини;

Оіабгоїїса мігуіїєга, західного кукурудзяного жука; Оіаргоїїса Іопдісогпі5 бБагрегі, північного кукурудзяного жука; Оіаргоїїса ипаесітрипсіаїа Поугагді, південного кукурудзяного жука;

Меїапогиз 5рр., дротяників; дупляка Сусіосерпаїйа рогеаїї5 (личинку хруща); дупляка Сусіосерпаїа бо іттасціа(а (личинку хруща); Роріїйа |іаропіса, японського жука; Спаеїоспета риїсагіа, земляну блішку; брпепорпоги5 таїдіє, кукурудзяного довгоносика; КПораЇозірпит тпаїдіє, соргову попелицю; Апигарйпіз таїйадігадісіх, кукурудзяну кореневу попелицю; Віїбзби5 Іеисоріеги5

Іеисоріеги5, північноамериканського пшеничного клопа-ч-ерепашку; Меїапоріи5 Тетигибгит, червононогу кобилку; МеїЇІапоріи5 заподціпіре5, перелітну кобилку; Нуіїетуа ріайга, паросткову муху; Адготу?а рагмісогпі5, кукурудзяну мінуючу муху; Апарпоїйгір5 орзсиги5, злакового трипса; зоІепорзіб5 тоїезіа, мурашку-злодія; Теїгапуспив5 ипісає, звичайного павутинного кліща; сорго: вогнівку-трав'янку Спіо рагпеїн5, зродоріеєега Іїгидірегда, кукурудзяну листяну совку; Неїїсомегра 7ва, кукурудзяну совку; ЕіІазтораїрих Іїщдпозеїйш5, кукурудзяну стеблову вогнівку; совку РеКа зуБіетапеа; РпуїПорпада сгіпіа, личинку хруща; ЕІеоде5, Соподеги5 та АеоїЇи5 5рр., дротяників;

Ошета теїапорих, червоногруду п'явицю; Спаеіспета риїїсагіа, земляну блішку; Зрпепорпоги5 таїйаі5, кукурудзяного довгоносика; КПпораїозірпит таїйдіб5, соргову попелицю; 5Зірпа Пама, жовту попелицю цукрової тростини; Віїз5и5 Іеисоріеги5 Іеисоріеги5, північноамериканського пшеничного клопа--ерепашку; Сопіагіпіа зогопісоїа, соргову галицю; Теїгапуспи5 сіппабагіпив, червоного павутинного кліща; Теїгапуспи5 ипісає, звичайного павутинного кліща; пшениця:

Рзецда|єйца ипірипсіаїа, лугову совку; Зродорієга ІПгидірегда, кукурудзяну листяну совку;

ЕІазтораїрих ІдпозеПи5, малого стеблового точильника кукурудзи; Адгоїї5 огіподопіа, личинку західної озимої совки; ЕІазтораїри5 Іідпозеїйй5, малого стеблового точильника кукурудзи;

Ошета теїЇапорих, червоногруду п'явицю; Нурега рипсіаїа, листового бобового довгоносика;

Оіабгоїїса ипаесітрипсіаїа Поуагаі), південного кукурудзяного жука; російську пшеничну попелицю; ЗсПпігарпіз дгатіпит, звичайну злакову попелицю; Масгозірпит амепає, велику злакову попелицю; МеїЇапоріи5 Тетиггиргит, червононогу кобилку; МеїЇапоріиє5 айегепціаїв, відмітну кобилку; МеїЇапоріи5 5аподиіпіре5, перелітну кобилку; МауєеєїййоЇа аевігисіог, гесенську муху; Зйодіріобіз тозеПапа, помаранчевого злакового комарика; Меготуа атегісапа, личинку американської меромізи; Нуіетуа соагсіага, озиму муху; ЕгапкіїпіенНа тТизса, тютюнового трипса;

Серпи5 сіпсіи5, американського пшеничного пильщика; Асегіа ішіірає, кореневого цибулевого кліща; соняшник: бБицієйта Пеїїапійапа, соняшникову брунькову листокрутку; Нотоеозота еІесієїйшт, соняшникову вогнівку; 2удодгатта ехсіатайопіх5, соняшникову окличну совку;

Воїпуги5 дірбози5, морквяного жука; МеоїІазіоріега тигеКіапа, соняшникову галицю; бавовник:

Неїйоїпів мігезсеп5, бавовникову совку; Неїїсомегра 7еа, бавовникового коробочкового черв'яка;

Зо зЗродорієега ехідца, наземну малу совку; Ресііпорпога доззуріеЇІа, бавовняну міль; Апіпопотив дгапаіє, бавовняного довгоносика; Арпі5 дов5зурії, баштанну попелицю; Рзецйдатобзсеїї5 зепайб5, блошицю бавовни; Тгіаєєнгоде5 аршійопеа, облямовану білокрилку; Гудив Ііпеоїагів, польового клопа; МеїЇапоріих Тептиггибгит, червононогу кобилку; Меїапоріиє айегепіаїїв, відмітну кобилку; ТПгір5 їабасі, цибулевого трипса; ЕгапкКіїпівіа їибзса, тютюнового трипса;

Теїгапуспиз сіппабрагіпих, червоного павутинного кліща; Теїгапуспи5 цпісає, звичайного павутинного кліща; рис: Оіаїаєа засспагарйб5, стеблового точильника цукрової тростини; зродорієга Іїгидірегда, кукурудзяну листяну совку; Неїїсомегра 7еа, кукурудзяну совку; Соїазріб

Бгиппеа, виноградного коласпіса; І і55огпоріги5 огугорпйи5, рисового водяного довгоносика; зЗйорнийие оогулає, рисового довгоносика; Мерпоїеніх підгорісйи5, рисову цикадку; Вії55и5

Іеисоріегиз Іеисоріеги5, північноамериканського пшеничного клопа-черепашку; Асгов5іегпит пПйаге, звичайного щитника; соя: Рзецйдоріизіа іпсіцдеп5, соєву совку; гусінь совки Апіїсагвіа деттагаїй5; вусатку Ріаїйурепа 5сабга; Оз5ігіпіа пибіїаій5, кукурудзяного метелика; Адгоїї5 ірзіїоп, совку-іпсилон; Зродоріега ехідча, наземну малу совку; Неїїоїві5 мігезсеп5, бавовникову совку;

Неїїсомегра 7еа, бавовникового коробочкового черв'яка; Еріїасппа магімевії5, мексиканську бобову зернівку; Мули5 регзісає, персикову попелицю; Етроазса їарає, картопляну цикадку;

Асгобієгтит пійаге, звичайного щитника; Меїапоріи5 Тетиггибгит, червононогу кобилку;

Меїапоріих айгегепіа|йх, відмітну кобилку; Нуіетуа ріашга, паросткову муху; Зегісоїпгір5 магіабіїє, соєвого трипса; ТПгір5 їарасі, цибулевого трипса; Теїгапуспи5 ішгкевіапі, суничного кліща; Теїгапуспи5 шгіїсає, звичайного павутинного кліща; ячмінь: Об5ігіпіа пибіїзаїйв, кукурудзяного метелика; Адгоїї5 ірзіоп, совку-іпсилон; ЗСопігарнпі5 дгатіпит, звичайну злакову попелицю; Вії5и5 Іеисорієги5 Іеисоріеги5, північноамериканського пшеничного клопа- черепашку; Асгозіегпит Піаге, звичайного щитника; Еи5спібіи5 5егми5, коричневого щитника;

Оеїїа ріашгта, паросткову муху; Мауейоїа дезігисіог, гесенську муху; Реїгобіа Іа(еп5, коричневого пшеничного кліща; олійний рапс: Вгемісогупе бБгаззісае, капустяну попелицю; РПуїПоїгеїа сгисітегае, звичайну хрестоцвіту блішку; Матезвіга сопіїдигага, совку латукову; РішеїІа хуїовівїПІа, капустяну міль; Оеїїа 5рр., личинки кореневих мух.

Нематоди включають паразитичних нематод, таких як бульбочкові, цистоутворювальні та проникаючі нематоди, у том числі Неїегодега 5рр., МеІоідодупе 5рр. та Сіородега 5рр.; зокрема, представників цистоутворювальних нематод, включаючи, без обмеження, Неїегодега діусіпе5 бо (соєва цистоутворювальна нематода); Неїегодега 5спаспйї (бурякова цистоутворювальна нематода); Неїегодега амепає (злакова цистоутворювальна нематода) та СіІородега го5іоспіепвів і Сіородега раїїйда (картопляні цистоутворювальні нематоди). Проникаючі нематоди включають Ргаїуепспиз 5рр.

Способи збільшення врожайності рослин

Забезпечуються способи збільшення врожайності рослин. Способи включають забезпечення рослини або рослинної клітини, у яких відбувається експресія полінуклеотиду, який кодує послідовність пестицидного поліпептиду, розкриту в даному документі, та вирощування рослини або її насінини у полі, зараженому шкідником, пестицидну активність проти якого має зазначений поліпептид. У деяких варіантах здійснення поліпептид має пестицидну активність проти шкідника, що є лускокрилою, твердокрилою, двокрилою, напівтвердокрилою комахою або нематодою, і зазначене поле заражене шкідником, що є лускокрилою, напівтвердокрилою, твердокрилою, двокрилою комахою або нематодою.

Як визначено у даному документі, "врожайність" рослини відноситься до якості та/або кількості біомаси, що виробляється рослиною. Під "біомасою" мається на увазі будь-який вимірюваний продукт рослини. Збільшення виробництва біомаси являє собою будь-яке поліпшення врожаю вимірюваного продукту рослини. Збільшення врожайності рослин має кілька шляхів комерційного застосування. Наприклад, збільшення біомаси листя рослин може збільшувати врожай листових овочів, споживаних людиною або тваринами. Додатково, збільшення біомаси листя можна застосовувати для збільшення виробництва рослинних фармацевтичних або промислових продуктів. Збільшення врожайності може включати будь-яке статистично значуще збільшення, у тому числі, без обмеження, збільшення щонайменше на 195, збільшення щонайменше на 3595, збільшення щонайменше на 595, збільшення щонайменше на 10 95, збільшення щонайменше на 20 9565, щонайменше на 30 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 70 95, щонайменше на 100 95 або більше збільшення врожайності порівняно з такою рослини, у якій не відбувається експресія пестицидної послідовності.

У конкретних способах врожайність рослини збільшується як результат поліпшення стійкості рослини, у якій відбувається експресія пестицидного білка, розкритого у даному документі, до шкідників. Експресія пестицидного білка зумовлює послаблення здатності шкідника до зараження або харчування рослиною, що, таким чином, поліпшує врожайність рослини.

Зо Наступні приклади пропонуються як ілюстрація, а не як обмеження.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

Приклад 1. Мутагенез М-кінцевої частини Ахіті205

Ахіті205 являє собою токсин, активний стосовно личинки західного кукурудзяного жука (МУСКУМ) (див. патентну публікацію США Мо 20110023184, включену у даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті). Нуклеотидна послідовність для Ахті205 наведена під ЗЕО ІЮ Ме:1. Амінокислотна послідовність Ахіті205 наведена під 5ЕО ІЮ Мо:2.

Тривимірне моделювання та вирівнювання послідовностей показують, що М-кінцева половина Ахті205 є гомологічною пороутворювальним доменам перфоринів. С-кінцева половина Ахіті205 не виявляє гомології, і її функція невідома. Інші білкові ендотоксини, що є активними щодо комах, містять пороутворювальний домен та рецептор-зв'язувальний домен.

Можливо, що С-кінцева половина Ахіті205 залучена в націлювання Ахті205 на місця розташування в МУСКМУ, де відбувається пороутворення.

Бібліотеку точкових мутацій, що зачіпає 30 положень у С-кінцевій частині Ахті205, створювали за допомогою набору для полегшеного мутагенезу ОШІКСНАМОЕФ (5ігаіадепе).

Плазміду рАХ7011, що кодує нативний Ахіті205 в рЕ5ЕТБЬ, піддавали мутагенезу. Бібліотека мала загальну складність, що становила 506.

Об'єднаних мутантів, а також рАХ7011, уводили в клітини ВІ 21"0ЕЗ шляхом трансформації та висівали на середовище Лурія-Бертані ї канаміцин (100 мкг/мл). Свіжоотримані колонії збирали в 8 мл рідкого середовища І В « канаміцин (100 мкг/мл) та вирощували в блоках з 24 глибокими лунками при 37 градусах С та 300 об./хв. до досягнення ОО при 600 нм, що становила 0,3. Додавали ІРТО до кінцевої концентрації 0,5 мМ, і культури інкубували протягом додаткових 18 годин при 20 градусах С. Визначали ОО при 600 нм, і клітини збирали за допомогою центрифугування (10 хвилин при 4000 об./хв., 4 градуси С). Клітинні осади ресуспендували в 20 мМ Ттіз/НеСІ, рН 7,4, 150 мМ Масі, 1 мм ОТ за щільності 20 00600/мл.

Клітини руйнували шляхом розмелювання за допомогою гранул, і після центрифугування при 4500 об./хв. протягом 15 хвилин при 4 градусах С отримували розчинні екстракти.

Екстракти аналізували щодо активності проти УУСКУМ у чотирьох повторах на варіант. Через 5 і 6 днів визначали показник токсичності для кореневого черв'яка шляхом усереднювання показників від чотирьох повторностей. Під час цього первинного скринінгу одну тисячу сто 60 тридцять дев'ять варіантів піддавали скринінгу, що давало 2,2х охоплення бібліотеки. Варіанти з вищими показниками, ніж в Ахті205 дикого типу, секвенували та повторно аналізували. Потім здійснювали масштабні аналізи для ранжування мутантів стосовно до Ахті205 та

Ахіті205(емо25) дикого типу (патентна публікація США Мо 20110023184 та наведена у даному документі 5ЕО ІО Мое:3). Дані масштабного аналізу показано в таблицях 1 і 2 для кращих варіантів, показники яких переважали над такими Ахіті205 дикого типу у первинному аналізі, повторному аналізі та обох масштабних аналізах.

Таблиця 1 шк ЗЕД | нен

МСА відхилення

Варіант Ахіті205(емо30) демонстрував поліпшену активність порівняно 3 такою

Ахті205(емо25). Він несе мутацію У4671. Нуклеотидна послідовність, що кодує Ахіті205(емо30), наведена під БЕО ІЮ Мо:4. Амінокислотна послідовність наведена під 5ЕО ІЮ Мо:7. Наступними найактивнішими варіантами є Ахіті205 РМІЇЙІ Роо! 152 ра2а11 (мутація 54681: 5ЕО ІЮО Мео:10),

Ахті205 РМІЇЙІ Роої! 152 р1с1 (мутація М467Т; 5ЕО ІО Мое:11) та Ахті205 РМІЇБІ Рос! 152 рад (мутація К464М; 5ЕО ІЮ Ме:12). При тому, що мутагенезу зазнали 30 положень, поліпшені варіанти несли мутації, які утворюють кластер з Ахті205(емо25) (мутація М467А). Ці результати дозволяють припустити, що положення 467 та 468 пов'язані з поліпшеною активністю в

Ахтіг205.

Приклад 2. Випадковий мутагенез Ахті205

Цілий ген:

Здійснювали випадковий ПЛР-мутагенез усього білка Ахіті205. Одну тисячу сто шістдесят шість варіантів аналізували на рівні чотирьох повторностей, повторно аналізували та піддавали масштабному аналізу для ідентифікації того, що варіант Ахіті205(емо35) має поліпшені властивості (таблиця 2). Нуклеотидна послідовність, що кодує Ахті205(емо35), наведена під

ЗЕО ІЮО Мое:б. Амінокислотна послідовність наведена під 5ЕО ІЮ Мео:9.

Приклад 3. Мутагенез С-кінцевої частини Ахті205

Відомо, що у М-кінцевому пороутворювальному домені токсинів типу перфорину кілька альфа-спіралей взаємодіють із мембраною цільових організмів. Ці спіралі перебудовуються з утворенням трансмембранного каналу токсинів типу перфорину. Ці спіралі піддавали спрямованому мутагенезу. Мутагенезу піддавали тридцять дев'ять положень із загальною

Зо різноманітністю, що становила 648. Одну тисячу п'ятдесят п'ять варіантів піддавали скринінгу, 116 попадань аналізували повторно, і 34 попадання піддавали масштабному аналізу. Серед цих варіантів Ахіті205(емо34) був найактивнішим варіантом (таблиця 2) і демонстрував поліпшену експресію порівняно з експресією Ахіті2О05ул. Нуклеотидна послідовність, що кодує

Ахіті205(емо34), наведена під 5ЕО ІЮ Мо:5. Амінокислотна послідовність наведена під 5ЕО ІЮ

Мо:8.

Таблиця 2

ЗЕО ІЮ Мо ЗЕО ІЮО Мо Середній показник Середня нуклеотидної амінокислотної зупинки росту смертність послідовності послідовності М САМ М САМУ (96

Ахтігоб(емо34). 17777715 Ї771717171717811717171717111111094. | 1946

Ахтігоб(вмо3б). 17777716 Ї1111117191117111171111111075.. | 208

Ше те її |» | в» контроль) "

Приклад 4. Додаткові аналізи пестицидної активності

Нуклеотидні послідовності за даним винаходом можна тестувати щодо їх здатності виробляти пестицидні білки. Здатність пестицидного білка діяти на шкідника як пестицид часто оцінюється за допомогою ряду способів. Одним способом, добре відомим у даній галузі техніки, є здійснення аналізу із згодовуванням. У такому аналізі із згодовуванням шкідника піддають впливу зразка, який містить сполуки, що підлягають тестуванню, або контрольні зразки. Часто його здійснюють шляхом поміщення матеріалу, що підлягає тестуванню, або такого матеріалу в придатному розведенні на матеріал, який буде поглинений шкідником, такий як штучне поживне середовище. Матеріал, що підлягає тестуванню, може складатися з рідини, твердої речовини або кашки. Матеріал, що підлягає тестуванню, можна помістити на поверхню, а потім дозволити йому висохнути. Альтернативно, матеріал, що підлягає тестуванню, можна змішати з розплавленим поживним середовищем і потім розподілити в камеру для аналізу. Камера для аналізу може, наприклад, являти собою склянку, чашку або лунку титраційного мікропланшета.

Аналізи щодо сисних шкідників (наприклад, попелиць) можуть включати відокремлення тестованого матеріалу від комахи частинами, в ідеальному варіанті порціями, які може проколоти сисний ротовий апарат сисної комахи, щоб забезпечити можливість поглинання тестованого матеріалу. Часто матеріал, що тестується, змішують зі стимулятором харчування, таким як сахароза, для стимуляції поглинання тестованої сполуки.

Інші типи аналізів можуть включати мікроіїн'єкцію тестованого матеріалу в рот або кишку шкідника, а також розвиток трансгенних рослин з наступним тестуванням здатності шкідника до харчування трансгенною рослиною. Тестування рослин може включати ізолювання зазвичай споживаних частин рослини, наприклад, за допомогою невеликих кошиків, що прикріплюються до листка, або ізолювання цілих рослин у кошиках, що містять комах.

Інші способи та підходи для оцінки шкідників відомі у даній галузі техніки і містяться, наприклад, у Кобегізоп апа Ргеїзієг, еа5. (1992) Резіісіде ріоаззау5 м/йп агіпгород5, СКС, Воса

Кап, РІ. Альтернативно, аналізи у загальному вигляді описано в журналах Агіпгород

Мападетепі Тевбі5 та ЧдЧоигпаи! ої Есопотіс Епіотоіїоду або шляхом обговорення з членами

Ентомологічного товариства Америки (ЕБЗА).

Приклад 5. Перенос генів за допомогою вектора для експресії у рослинах

Кодуючі ділянки за даним винаходом з'єднують із відповідними промоторними та

Зо термінаторними послідовностями для експресії у рослинах. Такі послідовності добре відомі у даній галузі техніки та можуть містити промотор гена актину рису або промотор гена убіквітину маїсу для експресії в однодольних рослинах, промотор ОВОЗ Агарідорзіх або промотор 355

Самм для експресії у дводольних рослинах та термінатори поз або Ріпії. Методики отримання та підтвердження конструктів промотор - ген - термінатор також добре відомі у даній галузі техніки.

В одному аспекті даного винаходу розробляють і створюють синтетичні послідовності ДНК.

Ці синтетичні послідовності є зміненими нуклеотидними послідовностями порівняно з вихідною послідовністю, але кодують білки, які є практично ідентичними щодо вихідного білка (наприклад,

ЗЕО ІЮ Мо:7-12).

В іншому аспекті даного винаходу модифіковані варіанти синтетичних генів розробляють таким чином, що отримуваний у результаті пептид націлюється на рослинні органели, такі як ендоплазматичний ретикулум та апопласт. Послідовності пептидів, про які відомо, що вони обумовлюють націлювання білків злиття на рослинні органели, відомі в даній галузі техніки.

Наприклад, у даній галузі техніки відомо, що М-кінцева ділянка гена кислої фосфатази білого люпину Гиріпи5 аіриз (ЗЕМВАМКО ІО 01:14276838, Міїег єї аї. (2001) Ріапі Рпузіоіоду 127: 594- 606) обумовлює націлювання гетерологічних білків на ендоплазматичний ретикулум. Якщо отриманий білок злиття також містить послідовність, відповідальну за утримання в ендоплазматичному ретикулумі, яка містить пептид М-кінець-лізин-аспарагінова кислота- глутамінова кислота-лейцин (тобто мотив "КОЕЇ", ЗЕО ІЮ Ме:13) на С-кінці, то білок злиття буде націлено на ендоплазматичний ретикулум. Якщо у білку злиття немає послідовності, яка націлюється на ендоплазматичний ретикулум, на С-кінці, білок буде націлено на ендоплазматичний ретикулум, але в кінцевому підсумку буде секвестровано в апопласті.

Таким чином, цей ген кодує білок злиття, що містить тридцять одну М-кінцеву амінокислоту гена кислої фосфатази білого люпину І иріпи5 аби (ЗЕМВАМКФ ІЮ С01І:14276838, МіШег еї аї., 2001, вирга), злиту з М-кінцем амінокислотної послідовності за даним винаходом, а також послідовність КОЕЇ. на С-кінці. Таким чином, передбачається, що отриманий білок націлюється на ендоплазматичний ретикулум рослини під час експресії у рослинній клітині.

Експресійні касети для рослин, описані вище, поєднують з відповідним селективним маркером для рослин для сприяння селекції трансформованих рослинних клітин і тканин та бо лігують у вектори для трансформації рослин. Вони можуть містити бінарні вектори для трансформації, опосередкованої Адгобасіегішт, або прості плазмідні вектори для трансформації за допомогою аерозолю або біобалістичної трансформації.

Приклад 6. Перенос генів за допомогою вектора для експресії у рослинах

ДНК кодуючої ділянки генів за даним винаходом функціонально з'єднують із відповідними промоторними та термінаторними послідовностями для експресії в рослинах. Такі послідовності добре відомі в даній галузі техніки та можуть включати в себе промотор гена актину рису або промотор гена убіквітину маїсу для експресії в однодольних рослинах, промотор, ВОЗ

Агарідорзі5 або промотор 355 Саму для експресії у дводольних рослинах та термінатори по5 або Ріпії. Методики отримання та підтвердження конструктів промотор - ген - термінатор також добре відомі у даній галузі техніки.

Експресійні касети для рослин, описані вище, поєднують з відповідним селективним маркером для рослин для сприяння селекції трансформованих рослинних клітин і тканин та лігують у вектори для трансформації рослин. Вони можуть містити бінарні вектори для трансформації, опосередкованої Адгобасіегішт, або прості плазмідні вектори для трансформації за допомогою аерозолю або біобалістичної трансформації.

Приклад 7. Трансформація клітин маїсу за допомогою генів, що кодують пестицидні білки, описаних у даному документі

Качани маїсу найкраще збирати через 8-12 днів після запилення. Зародки виділяють із качанів, і такі зародки розміром 0,8-1,5 мм є переважними для застосування у трансформації.

Зародки висівають щитком догори на придатне інкубаційне середовище, таке як середовище

ОМб62А55 (3,98 г/л солей Мб; 1 мл/л (з 1000х вихідного розчину) вітамінів Мб; 800 мг/л І- аспарагіну; 100 мг/л міоіїнозитолу; 1,4 г/л І-проліну; 100 мг/л казамінових кислот; 50 г/л сахарози; 1 мл/л (з 1 мг/мл вихідного розчину) 2,4-О0). Середовища та солі, відмінні від рмба2А55, однак, є придатними та відомі у даній галузі техніки. Зародки інкубують протягом ночі при 25 "С у темряві. Однак, інкубування зародків протягом ночі як таке не є необхідним.

Отримані експлантати переносять на сітку із квадратними отворами (30-40 на пластину), переносять в осмотичне середовище на приблизно 30-45 хвилин, потім переносять на пластину для інжекції (див., наприклад, публікацію згідно з РСТ Мо М/О/0138514 та патент США Мо 5240842).

ДНКЕ-конструкти, призначені для генів за даним винаходом у рослинних клітинах, попадають за рахунок прискорення у рослинну тканину за допомогою прискорювача пучка аерозолю із застосуванням умов, переважно описаних у публікації згідно з РСТ Мо УУО/0138514. Після інжекції зародки інкубують протягом приблизно 30 хв. в осмотичному середовищі та поміщають в інкубаційне середовище, витримуючи протягом ночі при 25 "С у темряві. Щоб уникнути надмірного ушкодження експлантатів, які зазнають інжекції, їх інкубують протягом щонайменше 24 годин перед перенесенням у відновне середовище. Зародки потім вносять середовище для відновлення на період, що складає приблизно 5 днів, при 25 "С у темряві, а потім переносять на селективне середовище. Експлантати інкубують у селективному середовищі протягом до восьми тижнів залежно від природи та характеристик конкретного використовуваного способу селекції. Після періоду селекції отриманий калюс переносять у середовище для дозрівання зародків, поки не буде спостерігатися утворення зрілих соматичних зародків. Отримані зрілі соматичні зародки потім поміщають в умови слабкого освітлення, і процес регенерації ініціюють за допомогою способів, відомих у даній галузі техніки. Отриманим паросткам дозволяють вкоренитися у середовищі для вкорінення, і отримані рослини переносять у горщики для розсади і розмножують як трансгенні рослини.

Матеріали

Середовище ОМб2А55

Розчин вітамінів Чу Мб (номер) 1 мл/л (з 1000х вихідного 1 мл/л (з 1 мг/мл вихідного .

рН розчину доводять до рН 5,8 за допомогою 1 М КОН/1 М КСІ, додають Сеїйе (Зідта) у концентрації до З г/л, і середовище автоклавують. Після охолодження до 50 "С додають 2 мл/л нітрату срібла з 5 мг/мл вихідного розчину (Рпуіоїесппоіоду І абз).

Приклад 8. Трансформація генів за даним винаходом у рослинних клітинах за допомогою трансформації, опосередкованої Адгорасіегійт

Качани найкраще збирати через 8-12 днів після запилення. Зародки виділяють із качанів, і такі зародки розміром 0,8-1,5 мм є переважними для застосування в трансформації. Зародки висівають щитком догори на придатне інкубаційне середовище та інкубують протягом ночі при 25" у темряві. Однак, інкубування зародків протягом ночі як таке не є необхідним. Зародки приводять у контакт зі штамом Адгорасіегіит, який містить відповідні вектори для перенесення, опосередкованого Ті-плазмідою, на приблизно 5-10 хвилин, а потім висівають на середовище для спільного культивування протягом приблизно З днів (25 "С у темряві). Після спільного культивування експлантати переносять у відновне середовище на період, що складає приблизно п'ять днів (при 25 "С у темряві). Експлантати інкубують у селективному середовищі протягом до восьми тижнів залежно від природи та характеристик конкретного використовуваного способу селекції. Після періоду селекції отриманий калюс переносять у середовище для дозрівання зародків, поки не буде спостерігатися утворення зрілих соматичних зародків. Отримані зрілі соматичні зародки потім поміщають в умови слабкого освітлення, і процес регенерації ініціюють так, як відомо в даній галузі техніки.

Усі публікації та заявки на патенти, що згадуються у даному описі, свідчать про рівень компетентності фахівців в галузі, до якої належить даний винахід. Усі публікації та заявки на патенти включено у даний документ за допомогою посилання такою ж мірою, як якби кожну конкретну публікацію або заявку на патент було конкретно й окремо зазначено як включену за допомогою посилання.

Хоча викладений вище винахід був достатньо докладно описаний за допомогою ілюстрації та прикладів з метою ясності розуміння, буде очевидно, що у межах обсягу прикладеної формули винаходу можна на практиці здійснювати певні зміни та модифікації.

Коо)

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Конструкція, яка містить молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, який являє собою варіант 5ЕО ІЮО МО: 2, де зазначений поліпептид має поліпшену пестицидну активність порівняно з 5ЕО ІЮО МО: 2; де нуклеотидна послідовність вибрана з 5ЕО ІЮО МО: 4, 5 або 6, або нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІЮО МО: 7, 8, 9, 10, 11 або 12, де зазначена нуклеотидна послідовність є функціонально зв'язаною з промотором, здатним керувати експресією зазначеної нуклеотидної послідовності у рослинній клітині.

2. Клітина-хазяїн, яка містить молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 1, яка є переважно бактеріальною клітиною-хазяїном або рослинною клітиною.

3. Трансгенна рослина, яка містить клітину-хазяїна за п. 2, де зазначена рослина вибрана з групи, яка складається з маїсу сорго, пшениці, капусти, соняшника, томата, хрестоцвітих, видів перцю, картоплі, бавовнику, рису, сої, цукрового буряка, цукрової тростини, тютюну, ячменю та олійного рапсу.

4. Рекомбінантний поліпептид з інсектицидною активністю, де зазначений поліпептид являє собою варіант 5ЕО ІО МО: 2, і де зазначений поліпептид має поліпшену інсектицидну активність порівняно з БЕО ІО МО: 2 та містить амінокислотну послідовність, вибрану з ФЕО І МО: 7, 8, 9, 10, 11 або 12.

5. Композиція, яка містить поліпептид за п. 4, яка: (а) вибрана з групи, яка складається з порошку, пилоподібного препарату, пелети, гранули, розпорошуваного розчину, емульсії, колоїдного розчину та істинного розчину; (б) одержана шляхом висушування, ліофілізації, гомогенізації, екстракції, фільтрації, центрифугування, седиментації або концентрування культури клітин Васйив ШПиппдіепвів; (с) містить інсектицидно ефективну кількість зазначеного поліпептиду.

б. Спосіб боротьби або знищення популяції лускокрилих або твердокрилих комах, який включає надання в раціон зазначеній популяції інсектицидно ефективної кількості поліпептиду зап. 4.

7. Спосіб одержання поліпептиду з інсектицидною активністю, який включає культивування клітини-хазяїна за п. 2 в умовах, у яких експресується молекула нуклеїнової кислоти, що кодує 60 поліпептид.

8. Рослина, яка має у своєму геномі стабільно включений ДНК-конструкт, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, що являє собою варіант 5ЕО ІО МО: 2, яка відрізняється тим, що зазначений поліпептид має поліпшену інсектицидну активність порівняно з 5ЕО ІЮ МО: 2, де зазначена нуклеотидна послідовність вибирана з 5ЕО ІЮО МО: 4, 5 або 6, або нуклеотидної послідовності, яка кодує амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІО МО: 7, 8, 9, 10, 11 або 12, де зазначена нуклеотидна послідовність є функціонально зв'язаною з промотором, що керує експресією кодуючої послідовності, у рослинній клітині, переважно коли зазначена рослина є рослинною клітиною.

9. Трансгенна насінина рослини за п. 8, яка відрізняється тим, що зазначена насінина містить нуклеотидну послідовність, вибрану з 5ЕО ІО МО: 4, 5 або б або нуклеотидної послідовності, яка кодує амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІО МО: 7, 8, 9, 10, 11 або 12.

10. Спосіб захисту рослини від комахи-шкідника, який включає експресію у рослині або її клітині нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид, що являє собою варіант 5ЕО 10 МО: 2, який відрізняється тим, що зазначений поліпептид має поліпшену інсектицидну активність порівняно з 5БЕО ІЮО МО: 2, де зазначену нуклеотидну послідовність вибирають із 5ЕО ОО МО: 4, 5 або 6 або нуклеотидної послідовності, що кодує амінокислотну послідовність, вибрану з БЕО ІО МО: 7, 8, 9, 10, 11 або 12.

11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що зазначена рослина виробляє інсектицидний поліпептид, який має інсектицидну активність проти шкідника, що є лускокрилою або твердокрилою комахою. йКщЯлТХ БОСОІдоУНВИСТКЕ Б ой тихо ВМІВ МІМОКІЖКАЕ вИиМІХМІ Ух писуски їх ЗАлуссУВАННХ суд Кт В МУкхну майкохойом оцей дихамстих сама хе тшоВіцеце ве зипррохаку сага ми МІСЦІ куту ех ЗшМІМЧИЩацу; подо пи фосчитЕсох дилеми ї опосвалихо дтаесттиц зтсЧпочека лип юхстЕ о етпчхамоці спицях мохом пемечуат мохмуднсв спрею У Усна міх «ус ажеух суимпійнопо омохоцюме опееенахое сукднімого ХА капотом сспахадои пліч МечійтюоОх зе мІМає писане ЯМ тишмекемат шести ФизлтУ фі зехмюлеоха плит ї5 кхідакатидт пехачищицх подив цвсвухЕ у: ХП ЧИТИ: УЗ мепуаемус флак сода свьеиї ЗМУ полапизовос Чис еКохсо НО аитосизадяотіенсемолей пит заст жиио злети крах МАХ кІпФавда м: гцілояІивц міч итиам яхт МІЇИТя ЧІСНИ ЕФ татами Пд оуФнм мом: зпомалсм бухта слизу енойа пп рт зале ТЕХ хентІМмоМму мами цямМ мус міцем либифцаумау литі мломоу оцохое З Бе сявлтиих дфрихюномеУ мас оцеме Фихоцепана імцецечІМО ПрфеНЕМІХ г, З Мем уєж поему чатах. спбечесехич чехи УТ о лУ ПЕ ЧИЖ слова сеПОТМЯтИ деле МКУ, мох зхрнемом и псонфєучтцало сатана Фифитцемий чтизнашлит зМІМшМ ХЕ пи дог мримла манту пурутачеду зеуалеснау зітре ЕЕ дихелотк ем ІМ Міста ЄУтечехо пі хОошосое пух. ДЮ пише па пе М око секти т.

Те тдакем МУК ПЩЕМІ Іх сиемемидп кине КуВугатои сусвавхст ооо заз їж висо еламе тм бидсттжащ созсичухка еосчахсує дугу шт РНЕХаЕтІНа сслиМакеВ КУМ ОМВИХ Чамемолюв етика НУ ТЕМИ Кат вОжато ЄУКадаемеик псдечахеу пути. хукееЗАму хи ХиДОМТЕНО пемедовисх шле чеше ум стики 1Кох каш хіх БА хтів ост хою ЗЖудх стервом са сІДВх Ох Ми овхєк лох хі Мат демо Змій оомЕ ХІМ пк Фу лох зо до міх УкІ У ря 17 Не тТаМожис йемоціт ВМ ЖжоУ туї Ах ОХ Ве о ФлУ Цех УУу: Мід похо Же її ї- Ах тів ожхе ще обев СА бух ке ото Ще деу МО см піт баса КЕ ХЕ Б їх ІМК іш Сі її мів уж Ж ЖІ ТУЄ ТАЖ Хйо вхо Ясз КФК Магтаія т Зі КЗ ТМХІОЩІх Хні те ЖЖ пійосет кер Че ФУТІВ Мк ФАф Хемому? Фі КУ ги тя ху те пі цій стум яатлю міх пже мен Вел се ія Мі) Фу Жах ме жу Кк хо Ух Ме о туомух кс оове меколло бек зму Витобах Моро гиФ отв хеМ оте ця хх ії левом лук Вест міх ЇМ нс ух ВХ: СМ ТВХ зхо бік міх КАК м дм Уге Жех пжхе Можу: ТАв люх мо УФ ОПУЮ Ж) Міс лює мб АТО сту Уч УМ ї55 її що кхо ль дат Ха Му ем дтооіле ВЧ АХА КО ЕХ МЕМ пл лк ж ІМ Іх2 її сх МІМоМміб пМбУ ших жо ЖЖ МІЖ Же тус Тим жів ліх під хе тку у зх кефіру ли вис мом ар шусє лют о МімоВіх ше пух вх ФО ПУ ОМ ЕТ АЖ у якос сВмии хв Жехолем стек Тит о тем віх мім их о бзжео тут ІіЖЖ ЖІх. хх ша тах пес сути міцно тм иж Аш ФА МІХ ОВІХ йо АЮ ЗР Піх БЕЖ ЛІ» Я оо М иа мем одежа ВМ вемо Мам Мах те 1 лу; пеш тв дій тихо КІ Б АХ й тІт ШРу Кук Ім лю Ми отву Вер одкя Ті хх міх йпіЖ КієолжвооМк са Ки Ко їх МіпОоДІСВеМ ШКТ МЗФ тою йзяожре шкі ЛЄи Мец одем ех АФОТКІ п же Ух ли КЕ СВВЕОМИиОМ МОХ ТВ бЕб о бжЕО 1У ЦІМ оХІ? (БО тив ові ОВ мій АХ. їх БЖНИ так пЕбОВУО сі хХгц лу жи охо пен йпімоАМе ало ис Шо ЩІ Ж бе шаМ а лок пЕжВОМІВОСПОК бімошхл ми ІМ бі дух УМО Акиа мух МУуд обамоцмке му ХХХ ЕЗЯУ те тв. хорові вищ о ру уст Мо хат што мів діж пімо дм бхт СХжоКеМо п.

ІЖУ 232 їЖхи ділом с кевовокх І оХхі Ме Ме жіно йдем мс Фк: ж ОЦІЖ Жох : зх тк з зах ах штук овху хі щіу шІмовно ми, Фіп о біч йви опе хх ше ох ди Мк ХА; За Ух іх ків кід бгбТ ІЛО Би ух дае ол Не хів о ВБеномУж Жх шо Ж т ат ахе Між остсм охо жшку їжи щДІМ ДІЛ УМ Ту. ме ти дя міх Одну БІУ мук пЕ ха ях їх сжросжЕЖо ен ух оаке хо ке хоешохіх 15 охо тхео цій ПІУ Пух йха іту ЗЕ зІ5 муси ніж доро мк мхі Мет ем овіа усе Же пу жук Вже ве ти ай ХХ БІ

Ши еб ФО вВІроВує ХОХ сух мех сх Зісемт мае сус МІЖ БЖХВОМОЇ ря ян «ІК МлУуСтТВгоМЕХ тім ЖЕ ОяІЙ ЖІ ТІВ ТкО лев ух ТУ ТОМУ ВІЗОВІ Х я т ха мух лю ОМо Шк дом їхЮ ЧіМорух ЖТУ ВМАФОДІХ ПАХ ДІМ ОУЖІ ДІЖОШХЕ хх Що ях «М пах пух вве віМ су хох йхо хеховже хддовне хом фут хе МАК лІх ках У Кая пхостім ІЙ ВІ ба піч БІРОВеУ хо Ук же ШМу мулотвко дю: ВУ?

хек. КУ тк. ІтВокдо жах ме ХТКобдо ую мус лем Мевогомовжо сумо кім ошіМ ВУ ЗІ ше: ЗІх схе міпсАнои МеховАЖ лок оїке ах УхУ пк ди сх «жд ІК МВ СИДЖУ ЖІ ВМ У сни МеКОЖклокогопій хіх хо МІХ СЕ МІВ хо ту зо оз ВМО ст оУкУ. : Ух її ху лк. межи хх МІ їх МІВ КАФ МІ т ау ММ ТЖе МІЖ ОВЖт о ТІМ ти їх Ук пк вхо ех ВІіМ шим ЕХО ум оБле лю тво ху ліх маше» АХ їх че Ук Жекстже міх ва бін хуй Зм вет Мито тпт ВК бе лем Ме МУК ОМІХ Ск я «5. мкложтю їЇМестим МнФобумовм а лжрожее сумопів о лекожт) М МуМ ах 3 т З пвоує мілоувс тру ЦІМ Обух МеВ ох ційобох Мемоору Хо ФиХ. МІК, хх з зх мушОлжт МужО Ка Мле дакоміФ ау вМтгозву Ми) дхрохемовмх хх Мо. з ІчЕ иа ФЕМ МІТОМУе вх Ті кто тло тує ох Мем тм лю іч АЖ ОВАО. п їїа 11: Хі плести жк Ци о шах мо жо іх міх Мі отв: фемок:я Жег схе 1-х 155 хат МУ ому дме ДЖ ХМ о ЖХод Мхроджр з хом Ме Фе дез МеМ Кров ТХх їхУ їх а ув ОошіУ се ех ув Кто тує аку ог Му тує Ще СдеМ Піо хів Хіх їх. ї7о ХЕ МЕЛОВІК шу йод бе Ахо Лук лек дух ОВІМ Шхє дух Ж гхФогує ОХ зах зах їхе джі Зк похо ЗІХ Же: Мхо ШУ ТЬХ ТВ МІФ біси Хек УХЬ Бус. дХ 125 ко їз пс оті оту міх хікогуб ївеомій Між цін Фхт б: Межі хо Ук Жтх іх мно сова олех УФкомхху бетодму мех о лог 342 Мк му т Мід тьму Зх ххх. КУ пе ЗЕ АЖ біт пуу МЕЖ ТЬВходам ой Міф орке пїх ЗІіУ Ехо Ме дах ЧІ їм У ХВ ше вл Жах вето хе суді півоВхтФ хе ем ЖемотТуТ Дю ЛЕх КК їх Щек т свіду БОМ кт лвтожІімо Мам Ме бівотм» дзх Хом озміз шмеУ дулохзи Мх їЖе їх шухобето цій АФ Мом ЗМО пім Мт ори Фу дух Ух КУЄ ХО Ом Мо їх зх У дштЖопі Бхх уде шум МеУ Хі сухе Мує ТА дн мух кі демо бом мех ах І ке тко дош Оодуіх Мк) йке ТІМ МОм Усі мус Хі ЧУ Чі бхо шиє ЩЛУ Кох оМміх їх Ба Зах лук хОУ пі. Ах ших дів млі ке вм віх ЖОХУ ХП жМе Ах Ух ту. 1 їх КК мух УК Флу ж ВМ іх сі овуч лем Міх ЗІ ОжМе хх ДЖОН Зк лит. 455

ФшУУ БОЖІ ВМО КУМ бо бух дю ЗО ТММ сх Фу мех фехо то У Ух, Зо іж вт мж тіи іх бАтовс ЖАХ Тхе дом Мерів Рухи У: вух Зах уко їх І155 пехжоМуко ор тує із сам отую дев віх оКіє бт бум зі ім тТуко ху У 2 ххх

ІМ ВІЇ Вемоиві Хемоюхм.

ТжоКАІВМ ТУ песо Я3у ТУхоВХе ТІ Ух

«1 хі 32 хдео Мом ОФк У АХ Ух УМІ пуб ххУ Мах мій Зхх Мей бух Дхч хе то їУх ЗІ: 5 помозАт МюВ Фаложне жі УЖ Тер Мр оАяю ЗУЖ Зк У МІ; тя Му МУ ух кт пехсе лодожха хеУукоїом Укус МАСОВУ ДІіжЖ я1ж мк Міг йУух УХІОЖІЖ бах їх св АТХ Ех ОВО В МЕ омуу сх ВО Мом туУк Же ЯМ гФУєОКко пух ВМ КІ МІХ ко хх депо їх піз вт ус жу су Вже ізо дха Суфо ту Вухо Хитсвех ЗІ кох хо зі Тео АВК ОВО ХеФ ЧІ іє Хто ух Вже Хе Бех хх: ІВ Бах лів ту пат бле КМУ Мас Хе та бух ле «Ми з зялаи аву АХ «ДУ ВМІЄ тп дит ххх ШАХТУ смозидтамий лики сек ке вух МеКУВИХ ІЮМСМГІ ЖУТЕ ХІМ дУЄОЙ стече Ееє ЗУЄ міутамтеттс топчоюяи ЗреПеМИУХ кі секр леюсу птах КІВ УМНеМ ЗЧоБлоулох ФибтусТМО ехо Мю, ТЕ хшдаткикИх ХУТРОВИХ КОТ ЖаЄЖие помсти птедеМаТх еАФЕХІВНОК хх пасе кока ск УкЕмК хопеВиїтиМ сек Ує Ме ЧМх вхо: сеідаханяг кеди лахі Мивцооссву плЄзунчех ВМОСКЧамев соках ТУ КЕподиаЕкХ па. учи ти Фоловтудми Фу КИ Зк ЕХ НМ МслдеВЖели: ШУсИМуКІКО Хости ДМК Я неви їх пупком Оу макс Моюх ФАФАНЮкЧО ЗФаЖтоКНОХ ФИхФИММУ «м Зоо КНЕ Кен УЄМУ МДЕ погхтАнсюМ ФХПЄУЦОУЄ МИМИДИтК хе а А и їх тапшусмовя ВХістсанео чок мом пах о сзмтахоєх ВУМеКОВО Зк ЗХ лОМую лусомкоху тМеоМоєхує ОКхоРхетА ІМОФМСЕРле Мао Моюие ла сало уючую пптгутєляо педмокеюу Слгпуєвих Чеки щемеМх ЧЕСТІ тех САМИМ ВТ уд сахКиКОим еф УмО жочзкіхчеАх полки хи ПД КЄК думок оу ММопМодмює дУуусеиИх МОФаЖУЮКО пфаттюм в пепНеЖиеКХ ЕЛов у дено екм змо хи. дала ах.

Зк плоди де о ковку Вк Поу мимо меті ооо рот. зІЄ зЕщнмікОх кахелхюхлєю плбоховяатх дохо ЗОН ФММ хдан. салом мухє мстою мег Фахсадеохе мон чтаххЕт сехлюжнтьх УМхспщеМикО тп УСТИМ тах спинку со гхии Хедакаеху піку Ми Ки Хепнадчаши КОР АСОМИУ Іде: спмепчеяіу ЗСВЕКтиту дек іх дУхопмоує чилі ФучтьхІВе хе хит ІУсФУдтехи ХУ МУ ТЕ хХІїмІВАОВ ФОН хо Мч сс оМхтУю еф ЕИХОИ Фа: кІЖт Фет нети: ПРИ АТАХ ВХ ЧУЄ пет уив а КТ МКР М тиха знижуємо жа Туюовно Хосе тех Усе ТЕМАХ. ше січе дотичне мто мечем осх мусом хагмкуєчох дике ух ІМ ІИтОМУМИК уотхемтох одуюхух поалтат сглоднсма пи защю яхутв ТУКУ пази ВИХ.

Жук ЗМж Ум» ПЖУМІВОТВІТЕХ хг ХАМЕМ хутетеюнтвч п МмеюТихтотує г. опа» ФфиХІКТІриХолЯ салі ю Хо ЛФТМОх Кук.

АЧаЄМИМО Й домефмтмо ХУДУМУЮИВ ДМК і срхешкчоМх нак деато ВУ ВАєает ВЛ есе Фе еМиУ МЕ тевахек чеше иогшеес ТОКІО ХИ ПЧОМУТЬДМХО ОБЛІКИ ЩЕ пеки вич ямесйх.

ІДУ: ЛИботсЕт хаскі тух гм ХУ ве очах зіохцаземх нждУцегхо зеситроууце Майсе дет МТМО Х Іду.

Ем ЕВ Мем рчет Кот АТЕВАМО может АТ КНЕУ ке МАФи ХНЕУ Меп сих демо «іх сРЕНФУКОЖХ ТЕМ усдМно мохківлоох охеожюююцо «тсахеемеКкх вхо. хе МОМ птоЖадедті ЗМЦЕпИСкАс звемо мух гадепчее Чим тиХ Кк схе осами о ЗАРАЗ То КУ В ДАУДМтло сх соКЖетЧохЕ КУТ КЧЕХ МУМОа ЗМ Юх жені ХХ СВК кх холі саме всю тинвопомевниойя УчжУМеТККО пвиаиммкх ТІ елЕО ух ДОМУ ЧЕИОМ кедто меми МАЧО ВиВУ ЗЕхсФиядико вухо т хау т з иищи ТІВ тИ педерорсіуй МЕТИ пек п пед ктт еще СМОПЕМея. еПЄТИТИВИМ пу ее ух ДИТИ Ме споді че доході х Чех ке жереха ФО хк. МОЖЕ сх ДІЄ ант хоу ХІМИчевям Федак ахя МТМ не Вч аАухх. КУ; УЧИ ТЕП Тихо ог ІА тИКХ дже Фо це ВУСВУФЕНИИ НУ соелхстато ссзчелком: ЗУЄ ЧеИЯХ чеше пев Моєму ох. ДЕ ИМАТМЯ, Ух час охкох знксвмсі хоуссоуках озмознтимо хохеачком ФУКО ле тхтожцеані ходу Мх чої моамоомовм ФикУхма ЗКУХМУМУХ ЕЕ. плухедмеди Вазспавеку пухом ном тОмхе ЗМУ МИя Туч ММ их хх спе зжет ІА ХОЧЕ лу УТОМИ ВМО ИТ» ТАТ. зхсчеотее может зМФоттохда оМуєт яю пиши мухи іже сохкунхсам ле жею ОХ КамовМ Зловхмсо свУкощею ЖХЕоЖМа ТТ. Уха. Мити. емо уєоуи гпозходжне сохне пусто хазеотже; тт ХЕтТЕДИНсм: и тИМеетиТВ. Тадея пиши дакох пемчамх М МОТУЖОКНО їж ФК цоМХ КІМ еаМКТУ ЛАМИ УХЕ УК У ВЕК МО Т, ЗИ клоцкоицсХ сих мості хнсх ФАХЕКоУКЕ МИбтКФрМех ЄДХФІИТИТИВ седя вкл ЖК прху япужо в еКудх ої ох ХЕММО МИ а куміте ТЕХ, ЕЕ вих СИМ Тиси МО чЧИИ МеВ ехо ХХ АКОТ. птихсохеох джеми кмО хейкоУетх диво мевжеВЕУг МУК м. КЕ м мус ме о уча ее амомх ФУ ТиМ межи п тмсилЕкеме Хоменко хаит: цпіохічоче ЧехеМмедпіх схо меие Зх сисвдехІНЕ ХІМІК ФМлУЧІНеЄМИ МооЩУХОтМОУ салом ах вхахекоки. я зшсцезчУчі ридає ЗМІ ЧеМе МФ УМ фахезаиов хх ію. хх тре Мого ДОЗИ. шт ую ЗМайАЧЕМЦИТ ПИКА. Зк сОМІННЕМОА ситуа МоМмлИиео су АСМИМ ПИФУЧИСІІЯ пода сАта кт паж х здемошуєия МіМіТУеКце дисплея МсеАФКЄОЄМО самих ке «Ійфх ам ІіхОхерИоМо ХОУсИМоМИг гхпйхоМмовх МсоугуєвІ УВС УЧИ ЗЕ «іщахчткеМ кохохсохо хождахехум Зхдикацомк тиме ок УЄДУЄТХИХ БвАя гамети Молот Чт ВЕ пеивлаиио дет АТМ. МИМО ВМАВ, кох хеоддаМлеме ловив сиди пог могоМ МТМ ВИеМетеєуо, йо хх чекіЗослам кпамттлоЗа пойпоусемоу омссзоежчех цем еМотля І. мтохончедо лахоховчех осмос чахя лоецеьнохем амехіхемк мемаоцкохо. ХУ ПОМОЩЬ т помеуео гом тимохо МХоЧОшеи махи е Оман ете ов песмажриса кис печу то пкт сво змахсАшочІ ЧИ ТВИКИ ла Чепчехлкки спекти пеаМті Фа тКищев ее еНе ЦІМ цех пБІ сходи тухдх Момівпємид самомоснох дусчІлацо хамон омсм фени Я схеми птичехеусо зані х подо МИ МЕ «ехо хоче метм АХ даси мк хан фета ах несзІкіичо сомохаоюм схохчахоке ТА пишно Ке МІК ти дищеМОчах Перо чека ВУФАТКИМОХ ШЕУ. ЗАМ. пкаетоткце пато СКИТ МСакю тсустхтМ МИСМЯдяЕнІ ЗаХЕКНеу хМиє ПЕеЖИИ КОЖ Мй ЗЕМСТВ КНек Ме пефмамооуу дахехеких ІУКХ семчдишичк о вмохацедх пеки акму охогезуцич немохаєе зиск ех, 155 «ее чом спомсошмо пежевлемте ожммоамемяа МІ вмомємУ ємкеа іти стщецеаех ппохсвиохО кехожеажет дусі хеухсохутесо ах їла Іпкшухдикох псожеккгмо созохтомох зсахіукоі хек зах ху хів. Мах З лк, Кр окиюсвнуоче УЖЕ ПФ ик мі док хан М о шоу мих Дік Ва лУмоМуМ шею Ме Ма уж ока фе ож МІФ УМ ; х 15 15

ІАхОдОог ВкЕОУ у МОМ оВку ух же УдІ ше цім сш оту: Вій ДИКОЖХ ПО под те мумІкеМогка ле: піс см Сг ЗМюв Ко домо 02 Ж ЛІВ ШІ КМ АТ т5 ях зх сехохівсвже тіхо між АРМ МОГ Ту ОВ кое гу кеВ шже ВО КІ Я Бан ке ЖК о МівСтТИг тує Кам омувоювх дор Ве фу цуМ ВХ УА хего гу МУ ра м ї5 хе туж лу а тує ке птівстух Мох ож ФМ ОКІВ УХІ Ж сек оф МІХ хх З я МЕФОТЕМОМЖХ Мем отихОВКІ МХЖ о ЖФУ МФО Бе жу) ВЖАодьк ЖОХОТМІТЬХ п Ух ТІ хеМ Фу и ех ЛКЄ мів ЗіФозБу бук мг лох КК Ахе бух КІХ іє У ї2ї 115 СХЕМ ОрАЧ ФероМуг Іа ЛеУОМчс біт Й3У МІі2 лм ВК бе ву КК МИ М їх я ТМеУАОМНЮахУ МОВ ОЗМт ФР МОрозхус де Ком Мем біз ВеУ МФОКТИ МІ ІК зле 175 ІК хакосхо сі ках вує ху тую віт охо мук МЕТ 11 оЖеМ Ффюо юн оКух ТЯ Іо Уть ХАКІ Фвусмтм іти ВхрохуУ Ммто ЗК міх Мит ж ОХОМ хе фут МЕМ І Мк їхї жеровитошве лімо ви: хм оМеМмоУбк їмо йти Міо йх Хек ЗУ сут ух. ХЖЖ тпх. ту їомо Уа шхж шІічо й БуБ о іїхо піз сМих дію Векойхо Яб пі фук ЖОх ме ЕЗУ ТУТ УпІ ОВК МОУ ПНО Фут МшУ Мах ба ВУ УФ аку Ома УК Фут ХУХ ФК шк з й ХУ: пів дм Біхопі» Вхе ТУ ххй ох 1Іхосзог Вже МІУ йхо Ух йоМ пд дах ТЕ У сеокІотТве йек фі ЖіКОАТХ Діє Фехсюєь дм МК Ж МКВОтМх ДЖ пед ех Ууе пехоВнЕО ВМ оКаМ хе мІмсВм Во еноців Хо ХІМ ОКХ ОДІХ п КЕКС

Кт. Я їх УК ОЖМасж мое вич хе пт Мем пів хе АЛ ВИС бЕНОоВІВоВнЮ МОМ. с нннне хз ще ІдкОМуАсМНХ ТУ Ма Вих йо Ме хукоухі лешомув Ухі дейсржесисх.

Ук. пт ІБ. ХЕ ЗХВОЛЕх ди ПМ Кто МиЕ хм МУФТА СМІХ ШЮ др ВеК УМЕО МеМОшОХ Зх У ЗУ КІМОвФХ пу Миша МІВ жуВХ о КВесдхосттн ВХІД КОгОВЖю МТУ: ВУХ зх 33 яки ХХХ ОЖЕОМІЖ ХО СКМ КІМ ділодеу МКМ ОМІіЖ о ЖІ ЗКУ УМ Ми оКЕ хт 28 Ух шкі диоКІ г ІсВк Муз аж зим МлюЮсжамо верстку Ха орч ух ня п Зх від скки о уМу йтТустЕФе сік ЖенозАУ ІК ЖерРСВХКОКУЮ ДАХ ХОМ о пІК Юух, аж лМм Зх дя де шу тату дТА Суг сту кта МУ 138 ВУО Філ МІЖ бу ВУХО та хх хі хх ЖІіІЖСШФЧТОМІЖО МИВ ЖЖ МОМ оВвкЕ Мем овіМ тю коК су Ух люта дує жом ж 1-х Ух Жопошже ІМ ОожЕжеотТує Хом був пох омів дао Кох бе стух ЖІЖ часта їх г 35 сій мом піно вхх о вгя ЕІ тив р ож рБх ОЛІх Тег опзу КІЖ ОВУа зо Ук хкх ТЕО АОНОІМТ ДЖ Мем УМЖ СУ Кс ку ДІ ЛАТ» ФУЖоКІМ жу свтж ВК х6Е ще т СКУ Жкт дух ки Клод ту хе фо деп тує дух вем Вухо ВХ ТпЄ ЛКХ ях як ге дароуіІш окт тя сту Міг пяс дім ОоЖіВ сухомек о руножВиовиг Лук, У ев Же ре шіх ВЕ Ток лі БІЄ беховує дат шхк мов вах мій БІЖОВОМ ККУ. хх 59 ВУ

ЖекОНМХ Ву жи джему о нях ре МИ»

хай. ЖИ Щмити ки ХШЕЛУТМІМИ ФЕДМКОШ ун ти МИ ВЩЦе ХІІЛ мули КеМОКИЗ Ії хви ок МеКОМУМ ет ОІВ МіІє фам ОІВ пу МІК ат Ви ОКОМ ЛФ ВІУ КА ї 1 в Ах жхІ тк мех віхи ШтТМ жує вхю о таї Моз пі» мих отих іЖОСЖЕ ВІх Ук У Ко міх дит пої мій Хм бе еко лжовам ЖИ ЕЕ ЧУ ух змо А. ЗІ ях зх Жкеоіяю піч лі шХє КІУ кемовВМІ ТУХО ТОУ БиФ о фУФф дід оКег ВХ пак хе т че уж снхх Тих тут Ви МІХ Ворожмеж ж бух пів хв Хох о кек ого дім ху за т я хажоміх тих оухК оду їх дух о жми ЖмеойУм Щі М о шуюкотИ Ве Ту, У -е І ка Пуск тюЬ ШМмео бе кл тю: фхо пох че) дхо Мб ожОм ти: ТхЄ Не мк 15 пек фаз. ХІМ мем тм шуУх ІМ ТиФстує йех дю? Ткт Аме ЗМ ОМІа Ба УЗ Ге Зх. МАФОдмо ЧІМ ОХУМОТЛО Зб мом ок ФАЖ СЛ Міх Тит фичй ем ок СМхЕ хУх УТУ їУх епоха лід жом мне свя хорожер МО вам мох пйхо вхо УмегоМютМХ о. т ХУ З о МК опІо там жУХОМко Ву Тих ЩІУ Пк тує ШИХ жі ше уч духові дк НУ г ХЕ БАК ЗУ Мі еп сАХЮ Ту ХОМ ому Вуеойех Му тт ОЩиМо бух ХХ ех їх: Уа МІЖОЛЖК Ме іо важ м ШК ТВ ТКУ жін сплю ок ове ТЕгсВуМ Кук. ЖЕ її Сх пемотжа міфу шиє ік му 10 Бі йехойі охо бі МокоФхм шШУкОТЗУХ хв Я їз ет овах жи ЖижО вич де АХ ШЦеЄ ТВУСЇ1а Хуб пецотеМ ВІЗУ шХ У тт ЖІ 234 ху шіх шок бобах би тихо Кк й цїмомже Бхо ШІУ Ж ах жо іх Кая ше ХЕ. пійсвлж о бив Мт ОІВ; Кім піс демо же хо ВУЮ Ту кі оте ах ЗКУ що КУ Жов оливок Ме Уго бме ша» ух фл обте КТ Убе ВМ сус КІМ ВЖК ВІЗ зхо чех муж злю Фред му умі туз їта віт оав іх ЕЛ ЕТ пе Мих МхЕ Ком КУ тп муж сів йме міпоніг ват тує ть зЕжПОтЖІ доро вмув уві шахт омеи мит хі: лій клея І ХЗМОВІМ Ума бгмоксх кВ оФМі мух МІМоФлю тім КОМ БетгосМу ХаМм ощІії Уй Ук хх ШІ Же сію даром МІХ ФА: Кр жОм:ІУХО би ТВ дог хе у ЖЕХ ХЕ У зут шпухо Мох о УхІ ду Міхов ФЖ М: Ат ХМ рЖе Дух хо МІ ух одеє зх КО зх бух ких Мій сет (зх о клвоїжо ому шец кох зкиопенм ПІЩ УЮ ОШеМ мех Учо їх хле оахаоутА соми ху ФРроців до стхі бтрохтродхв лує під кг отму ЖИх Ех Ук зах а. лехомух о жтр о ву дулопух Уха уд піл хікоїже дує ліх опи тукобім, І 2і8 чт хівсках Чі Мер укі Мек Мем пхо діє ТУХ Же: Шу Тух Я Ху ВХю КУ 425 ЩІ ху іх тб де Тут УВІ бо уех хів ще бФехоїжа суж вза дфроч к3х ха чах

МІМОТКЕ ВМО ЧУМИ лі я ги Ул поро Му Фуко МОВУ МІВ МЕ шк хх Б шДЖ МЕЖ И АЖ НВН ОМ МІілоВ тІ1У хе КМ ціх ків ТВі ух век, КУ «їм хІЖ їх ЗАЖОМУутОтВх Віз ос0лу Ж із офкА тТум деоолем Ме емо А мк ПУХ «Ух зо ще КжИТІІК Піо ДІЙ Ло йтм о біфсбех УФ дія пу сок: муро тк Хот ЗУ я ех Мік тІЖ Між Хек ВК ЧІВ хе Же» Бушобемо МУ до Кн 31 Міє З23п МІХ. ХУ рен щІ ик олІО МЕЖ ОМ Мох оВмІ. бух по. мо ту «шах сх Мета «Ж МІВ ЗЖІЖ. СВТумУтє ТЦ Мох. зажих

ЄВ. МЕТКИ КМІУ пек» ХЕБ дух хег сію МіМ лах КІМ ДУХ Бі Вч МІФ бкч че ФМУЗОМІФ УМ : 2 м їх ЖптІСЖЖКОМеВ ФіЖ МКУ Фдх ХуМо хе хол хо ФУ рхо Тух МАО дех хо їх їх зе щимОоМех хо Мехозну лів пхб Моя ВО Арон МІЖ Мох о піМормю ахр КІ Ух Як ти їв пає дж опіх джу вхо дах туї: ТВх обра бух Афу што хю Піх хо) їх З ХХ ОЖкк ТоХ тує КОХ БІО дФУ др Єжи МУФоФем хх УМХ Кег о фух о хї Бу й хо тло ліх ФлютиМ зе жіно ус ми кер ФІ НІЖ УЩі Чі» ЮРА ОМ КК -х ж хі ДЕЖОЖе ХИх бжж тВЖ ВЕУ ДІА Фе о сехо Кот ХМУ Мировхе УктомМюМ ХЕ М Бо НК Вжу лід їм ух змо пІМ МОМ и ус дає ЕТ ОМУС АТ ВМО МІВ ВХ її зл їх ЖуснедО МОУ Ве КІі2о Кс шен все ВІЖ ДІ МІВ Те ден ха лем ех 535 хх У тхВОМЕлІМЕОВКр жи ми ЗВТ арці Вти вЖо дж Кт ДМ МОМ ому Ву хх 1 хх зак зкЕопи межи се пух жу тух ЛОХ УтХ тую Хуг КІВ ах МІХ ОО МІХ Уже х іже УХІСМШІХ ЩІ ли цем ожеистує ютє ЖИМ ме ехо Хув тк лм тка хе хх ІЖЕ У ах шеж Жемойхе Мезлмю хо Те ТОМ міом ом» бхоотих МеВ ОДХО тя мога хх. пехи жах ЩІ вало їз о яуМ ВАК міх о ШУУ Фех ол КеБОШУХ Було шо Ка її 2 хжАОКЖИ ЗА КК Муч ФЖУ Вхпо Зк ТКУ КЗ Муш Фач ЖИ Мі ТВУ ПК ХА їх ххх. ІК лу Муєстут тів МЕ Ткж кр окхо фїхо ве Кашу ке Ве овак піх їхї їло я Філомух пМФолах МІЖ ТК ук мів кт дм пе дв бух жіх ТКЖ Ос ше це ще дих ЖФшО МНЕ дже Ми ба» сх Ми пів дкбохух Укр дуло МОм МІХ пи тУх. ко пвх уже ово пі сект Дт МАУ димом ців ЖЖ ДІ ЛУ ВУ ДНО ММ, 282 йУк Тит фУлолІМ КК ФОМІН Же: о ібюостги Му тхі леромуМ жу мм Би тик З зів мх Б ххволіх ска хост Метожхто вух вівобау Ім одер Ше СУ ЯХТ ах НЯ Ке3У І ХІХ ОЗЖЮ ВУЄ ЖЕ ІЖУ ФіяоМох Мих юти о Мкт ЖМх мех оМке ск ЖЕК о їх БУ ЖЖ офАіспІЖ КІМ ме смІту Бізодуф вах оМмім ВАК СйОМ УлІ вахе йУЕ. їхк ве Зх сУуснів мій веж сії ВЕФОІВЖОВОИ БЖ ВАХ держ бхЖ ЄВА Мее ТК КУ «їх їхо дЕОЖЖНОИМ ЖК ТІ ПІД ОМ МО Суха хе КОМ Ол УЖ Как ФУ тих. дах їх Ух в дктошткожео ту віч гу ток АДО Іі сУуФц ЕК ОКО МУУ ЖОВ. 42 її їх МЕМОТВЧМ ОВУ КК ЖІ МОВ омиЕ щем Кун отмесжох Вій тує дам хе дУю Я за їх Кедоркс хром ТЕС Ха ОИЮМ ТМ лік БІМ бе жи бу дач оди ми ЖЛх їх яки; думсткс сам оміМ Ко й охак о тУкомі КТК ТЖО Ух кед Ху А ЖИ 4їуї їх: КО Мувсжр хіснекмогмо ттроцік охо сху хіх лів сусід ди оМох ЗКУ хх «ЗЕ Ко Хоуссма мові пу Ж ЖІН вхо Інх Ай МИ оОКО Кепомни пех мух ах КУ ІВ епосу юю дтн Ме Уч йІУ Ви 1 Ав сжо ші МУК ОТНТІ СВКОКІТХ НУ Ук ІЗ. І оміжсвхе мех окст ше Мех о муй пХо МОц бют Же МІМІКИ ТІ дих ТАЙ, яку ПЕЖО ТІЛАХ ОУ ОХ КК Ме Дух хе ах хх хх ак жи І шИик ІРД Ми ших МИ ДеВКІ І пав Уиуш : Іза санітна се за ват Хата осжутнт вжи сомітнвісож лази; хдайтотух; Мао же Між ОМЕМ ле Жук ФАКСИ ММ КАУ ЛІ ЗИМЮСЕМУ УЖ ОЖеХ В х Но їх тМУскХІ сни ДІусКЕи МУ уко Вв юку ат МІ Бе ВИМОВУ Ж бття о Її ув.

сх. ле хе шжтомІЖ ЩІФОпУє Меп Ме одпже жекокеу му БІИСЛУме кар. Рая и. ьо еХ КІФ ВІ ЛЕВ Ба ШУ АТЗ МІ ТЕМ ОЖИ: ВМ Ой о бхеа лох Мак А пк М ко ПУКОМіЖМсУухЕ тах бе Міхо йеК кедових лезо сіє ойи УРОК Кух хо пл т ТУ ах ІЛЮОМІМ ОІВ ТЕХ АВ МІЙ Фуко МеХ Зах СУМУ КіеоУхі бід МУ Фау мох Ух т чу дхкдотих БуВсько ск ке: іє пек Бер бхже ХаМ Ме Єв ЖИВ ІМ Мах ца ма Но ха фо ів оїжхо їй МІВ тА ШВУ Уувобхк оХМОК Жир ож МІВ ку Ух 1хЗ хх 515 мих ши бсй ожуї зх бе же о вІім З3у Мі дію Хиг ехо хе Же сУщУє НОЯ її5 355 пемомеу зуЯомои де Зб ти АМЕ ото Мяг ВХ бот жи Ве оКеаотУх Ух ЖИ зах їЖ зех о пупосьхе вх омМух УМ Хех бі» ту тм Тут ї1іх йог Фах МІХ їх ту ут МКК ОФру о Вхм АВИ АХО ум йо ув діх ЕХ фужх Око рм Дух ке їх. ї82 152 лигобаьюжо кот Мілодшх лодки ТВ Хтї Міо Ме Деу ЖЖлОМУЄ да їжу хх їх Мат умі міх цій іме хиж Мом ФК: МІіл о Ффіу бах мій ссже мін Мухо мно лій 35 То хексахо пох жов пуф онех Же ше тОх У18 ом ономМ ХМе взято: ОЖу їх Кн о ХУ? лу шує гіхотіу МЖК їВЕодеМ АХ їж мезо Мі бу Ко Льв ОВех гі 331 1-х жк сво кова ово під Усю ут МІЙ Бе? деч ме АМрожуК МІВ Ме мох ех тех та ха жи Ера Ме Ух лів смс хом осів Ліх ХУмо дз охМе пло вою т І5Е Ех ЗДКОКМУМ Кі кто МУд Ота ЦІЙ ФАмобуз же Фиш бе КхЄ ФМх хін: МЕ. їх зч5 то.

МЕЗОМУМ СВОЄ ШівОофке ШО Ме сухо меродхвоМмух ЗАДОМ Є Мб КУ ІВ З Ж деромІіш ЕТ ВхО Рій жит ХеХ муг вх Мід опоо дом кт між хеКОСУХ ЗУ ЗВ хх. шудоВкт м ожеюг їво дій УМІ ФВ Ме Фі Же ТИХ Жег ом пух Ту.

Ух. ех їх фужсхек Уві ту то твх піт бує окем хе Між ло лекоУлІ вує МІВ Ся КІ хх пітауж МІМОВИО ФІЖ СЮ Фут Мче гбх МО йсюота ХУ Мем хо шк хх ХхІХ хо ІМ ож то САУ ЖтвОМІао ля МОУ ТМ демо лк втх Му осех о ціу гУх У ха «ух хто Мут ММЕ ХУЄ МІЯ СЕК УХЮ ІхХ Мі Важ буде Рітобій Фу. бук Мих їх кі МИ пд біжслвн тити МеХОрлю МІ т Лемоців тео та Фут оЕхаА КІ зу їх Хей цймохте АВК о Жух ху ТтоУЖу піх обу о дех степ Сук ух Дхе ЖУК зчї їх 15 Мі откоохов сій шххокев тлі Хер о УМу яп омую бух Жог Фу Атом Ух її Хі тт жесВА ем оухк ЖеМ ПА гІХ ОйІ» Від ві тку щіх Уві йІх Вт пох ту ат їхо пис самок дія охіу МІ Хто жо Фу кет дапохха Фу? дев вто іх зх се «Ук хат опій ах Зм хе мту иФотіж Мій сухо мо) стує ВУ ВхФОКІд пха хх ХВ тім МіІДСОЖЮ МеКоОФеМ ЧІйОМЖ бухохех охе Мо ВАЖОЧІА ВХ ОМОЦІХ ЩІ це БУ Мешоі Має меУ МІ дехомжшо рех. МІ хх Бен пит Зх Еш КІЦОК ПДК Пд емитю ПМК ТВ вра ХІМ смумиемє зхежтні УйУ(ВІ Ус ЛЮЖ юх жала хеМи сід скох о вів ха спам вів иу ФІЩО Ме Фу лах ВУ Ше МІЖ МАУ техожте похо тік Мф МОУ Ух вх Жод Аст злу ох жу» вблєощоМ КК. її ха 3 шІчомер песо Піт хе бо ЗХ гКходорокио (зу піу віх дох ОАЕ чх Ук шк хів шлсоле Мій іт ошиц МОГ отук тах бе Вт шт Жог пах ких х хі п ТКУ МІК Оуйг їх ХУхО МІФ сяє о Аоцм вче ТУЮ МІВ МРОФМІ Кех ВЕЖ Об хх та зх хі тиф ошую ух отусє лін Муз гує ем око пух мух желе). Флу мохи скх хх зх р уко тухобувоїВкУу Їм Бе хле йех оби хе ЧУ Меродхе ЖЕМОЖи: ЛЬ її :1Л3 їх керомакотіховеа УМОВІ. ХЦУ С Уве фу хг Шмт ТвУ Вкфоіх дЕЖ НІМ хи Месобу Хуг їхх бау мо Куб Фу ІЗ хів СстТМу Му Муш ОКОМ еХ НОЯ мо КжчУ пюосмух ВІ ромом о АЖЦ ЖнО ЦЯ аелоМмее Вт вжи Мет 2гб міх. м «ль хх їхе Зк ОНцІй отв ЗБЕ Му дхя ух МТФ ВХ тує мух те лех ців ойхе ши.

Не. І їх медом Ку вУуч мех Вхе тує йо хіх ЗУ хом отже ти зам пе Мхк. КВ: їла тя Уже ЕИК МЖІСФАЄ жом жо пек ТВ УлІ Ле Чіз ХМ сук тох ВХ МІВ. цк М ке тат ліу бІЮ Щїж пе ХУ З опІВОМІі: дах ММ Ме смт жа ВІХ ліх ше т ма оче пе КО» хека сем мом вит ої дІх ххдо демо пф ло ІВ ціх ТУ Хте ї3я ТЕ су Мукокте ху Мем ОоМех ЗхБ ост ж їх ЗІ Міф віх дере Ж їх ІМ їх шим ОАЛАСУНЖ ШКЖОМІМ МОУ Вл ЛЮ Кт їМУ лю АЖ мух о Кі хг ох ех Зк ше ЯкЕойороМл вит ом Пій Вкт жи Мійогио ї3ж сажки сюи віх Ху їм КО пх тУшстІМОМі вхо бом МК се Же оМІЛОАХеОСУЮ: МВА СУХУ УКЛ ХМ ОМА, ха ск уко ВУС ОшІНОВеК Ос юм КШХ гл км уж УМО хе ЗиЖ УтІ Ф: хИше МЕ Зх зу км т ЗхислІД ЖеЖ М бує Мою.

Уч ме іх щі хо АФИ де ОЗАЖ ех ОМА ЗЕ 1 ЗЛЕ вла леж лам щує ЕУт іх УК Ме'данохо Ффхх шВХ о МегодхО МУ ХуХ БУ ЕЕ У ТУЄОКЖ Уа ФХЖОтТКТ Кфх піуУ би жжц мл сю дій КетоЛМі ЯМ ВХ Зх хек Ук під Пій сі спе тає тв зум охо ехо хом дв ляє нія Ух вх Ех КЯ за щ жі бі ОУеХ щу Тк мам лох Ухі сіМоксв пло й ціх МІ ФКу ху їХт Б зх ут хемокутойом ту ха сум стен бху елодім бхесамо й тіи ТУ йтх ще зії ЩІ бімотне Фу кед омкхІі сома» пе Ба ТВх йетгоФХу шах хкасжує Жжім ї25 вич ї5е «що кад Віт ши Хто ша) бом бат віп б йоюет утиск ока ккал петедме ТІ ожом ХУЄ ЖВЇ був кт Ві мін Ек: Шхє Лех оМівсвхо Ух тах ке УГУ дув жк дибр оті МО ки МУ ТУ Тер ТУ ВК бум пт Тих пі АТМ Вих; 359 УТ їк пух Кжи Жку ох би жує бий бе ШАХ Му ЕВОМІіс МІФ УЖ КІМ Кке хх хх Б її дих олих УК КМ ТКУ МО» Фо шФаб ЗуМовчо вже кспомуо Шхослех ВК ХЕ т її сажкОотітомІМОВешоКам о ЖЕлю МУ Фе цесів о МуфУвІ им уп МІС до хо З зхІвЕковхтІ МЖК щем оті МЖК пух ояех мех ка пак пух муж дО ху. шт хе 2. штук в Ж хе Ух КеЯ нано хатах в МДЖ НТИНУК.

УЖУДУ САКФУХ ВК МЛ ІМ ТИХ: Би хЕлУуЄс жиМІЙУух.

КІВ кові соми віх ве окон я яепткіМ Ве ОВ: дія ока АЖ оку бів МА щі ему пеио хх ФфУжо Ме 1 5 Но у: сишо МОХ с мев му Юм оМВІії Кук Вар тех ХХХ ВІ о Хуг МАЮ МОВІ то їх Ух Зуройег цуе о їВО ТУ МІК З бомо МВВ Ач ВУЖ Чу Мі» МІЗОШВО ЩОЙ ТУ 55 їх дах хім фі ум ома шву пок тем ЖИ ЕМО гомокермомУу иМмЕТДІК. т: 25 ве. хех сні ТАЄ тих жом кхо вес АВМОУЮВ ПжИ КИ ложе оВМтО Дух «їх те І хЕ Жтж сіб ошхе тТумОМсм хі сс мех лем піймав хо пі УмІ ляже пту: хк У їх Моустут пую лак: КОМ МетоОймУ ШемхоЗимх Кот ТХІ дароКОК зт тк Ку. хх тях Ко до КІно пл сє тВх ДІБОРЖЖ МИ ЖУХ Хе. вх ВВ Ма Б УК У ух з дл ехо ме сут Ід охох о грахо Ві МІЖ КАША МОВ Лют ОМеЖ АХ ВМ ті зх зах хемоме пи Зж свк Жех хе яжх хом Кот Мхто пуском МеКОрл Я МІХ Нео І55. се

МУ ЛК гне ше Тих ЧІ мує остуХ.

ЖХТ іє Ве підсВак жу З ж АЛ лю БИ АТЯ бе ху Жук похо Має Мк лих Бус ТАМ ло мук КУХ їх їж іх5 дхВОЖМ КОМ ів ом Меп же ФМб МагоМУв ом Ме: бах жує МЕЖ мя ІК шле Ух. тт Ат МІУ пів 1хкомжУ ТА ОЛАМ МІХ лю ех Мій ВЕТО М ЗХ ОСЛО. ку: п 15 УяхоВж: йомоупе ЗМОЖУ вхо лах тем Зї2о2)м зм кто й МОУ ФА Кая 239 йту тк.

ЗіфОуЄ ЖІпОВУ.

ЖМО Ух хе мух Іїмобюо Жіх о Яьж КкФосме йах ІВ їх їх КО саповіз беж док пІК ту щі ФІЗ Вех меч Мо лах ТУ МІЯ ТЕХ б КУ їх в Желожхо ВХ ВОХ ті ШІ ЖОМУ МХО З5М тес хіх тт дії Ме віх окоту їх їх 25: шух ЖЕи цію ФК4 АРХ МОМ ФУ: мой ВІЗ йх? ях Уч ФУє МІхОВеВ ОКУ тка пух тп ПЕ ів жає ФУ би ЖЕО ТА Бім фут тАїодои Му обхі мехопюнсвхе Зах У: хо ди ох міхожеу У тт Мем ох отех міх Фу ім омжероВио ЧІУ ОМ СлЮ Кн зУт зх Зх ехо чів о ама фих хіх Ум Мого хо євжо жу хх ам ліу Тут вТУ 5 Зх пе пФ жо літ бе Тьх лій ШУ? йіч Жех Вхе дм м: УЖУ ДуховжЖо КОЗУ леї то «УУ КІФ дже бо Хі йо шрх Аж) во Ух хо Івт обу Мам Бех сух Ух хТ мк виожжт Ух ФХЮ ТВ оців вк МаА тукасзахо мецожмих іх окех пук ук де за ЗУ Б Же дим ми тусоліх бу Тке дк хів тах тем бе Зіпссьу бух ту ох КК Зх НЄ Мак ВІМ ккд вхо кю МенпоВіх уп ШФу тЖу УуктАХВ ХО КЄ ПЕ їх о. дкоіма Вудс Аме тУМ Ж3А бук Уулі с йде дій сах Мох пуг КМУ Зхрохоу Б їй хх тіжхожнЕ жа Ом АВ АТОМ МЯМ КХЖ Тв ОК Му пі мі Оу ВМІОАКИ У їх чко мує сим отак бе мету отхе шле Во діу віх ВіМ ВІЙ Мує умі діховог їх ай ха Кй. бе сукоувкоміх ід ухі ФКО дак Мух жом Хле Ффже Фк АЖНОМТЮ Ці її Ж ха Жов ів ФІ Ва цк Лі ЛІ ВОГО Лос Фуко хадобяв УМІ хто іє Бен тих ле піхожіж вет Вхжовкео мух Мах мух оплот акт фе: мех пі Міз схе ку 28 ЗЕ Ех Мекопіє Ві шах МеВ БОМ о МУВ їх хе тях тати ою «ахимося ПІШЛО МІНОВ кашах ЛИЕт о сехлУЄЦ.

Мо бАТЛОМОМУТХ МУ Хом ІМОХеми фтежемо сф слу пу вх юч лях П